TWI836486B

TWI836486B - 二甲基取代的噻唑並內醯胺類化合物及其應用

Info

Publication number: TWI836486B
Application number: TW111123761A
Authority: TW
Inventors: 李翼; 于濤; 劉寧; 吳成德; 曙輝陳
Original assignee: 大陸商德昇濟醫藥（無錫）有限公司
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2024-03-21

Abstract

二甲基取代的噻唑並內醯胺類化合物，及其在製備治療相關疾病的藥物中的應用，具體公開了式（I）所示化合物及其藥學上可接受的鹽。

Description

二甲基取代的噻唑並內醯胺類化合物及其應用

本發明涉及一類二甲基取代的噻唑並內醯胺類化合物，及其在製備治療相關疾病的藥物中的應用。具體涉及式（I）所示化合物及其藥學上可接受的鹽。

本申請主張如下優先權： CN202110723288.5，申請日：2021年06月28日； CN202111669920.9，申請日：2021年12月31日； CN202210693547.9，申請日：2022年06月17日。

Ras/Raf/MEK/ERK通路是一條經典的有絲***原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信號級聯通路，參與各種生長因子、細胞因子、絲裂原以及激素受體活化後的信號傳導，是控制細胞生長、分化和存活最重要的信號傳導途徑之一。

研究表明，突變或擴增引起的Ras/Raf/MEK/ERK通路異常活化是多種癌症發生的決定因素。在人類腫瘤中，RAS突變發生率約為22%，BRAF突變發生率約為7%，MEK突變發生率約為1%，因此，該通路上的關鍵節點蛋白已成為癌症治療的重要靶點( Cancer Discov. 2019, 9, 329-341)。目前，已有多個BRAF抑制劑和MEK1/2抑制劑，以及它們的聯用方案，被美國FDA批准用於黑色素瘤、BRAFV600E突變型非小細胞肺癌等癌症的治療。然而，使用這些上游節點的BRAF和MEK抑制劑後，由於突變或通路重新激活，會快速導致耐藥性問題，極大地限制了它們的臨床應用。

細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)，特別是ERK1和ERK2激酶，是Ras/Raf/MEK/ERK通路的主要參與者和下游關鍵節點，在許多人類的癌症中都可發現它們的過度激活。ERK作為該通路的末端信號激酶，目前尚未發現有耐藥突變，因此，靶向ERK激酶的藥物有望克服上游靶點抑制劑治療後產生的耐藥性問題，成為更具潛力的治療策略。但迄今為止，關於ERK抑制劑的研究仍處於臨床階段，還沒有ERK抑制劑作為藥物批准上市。

綜上所述，迫切需要研發出安全、有效的ERK抑制劑藥物滿足腫瘤治療的需要。

本發明提供了式（Ⅰ）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中， R ₁和R ₂分別獨立地選自H和C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _a取代；各R ₄獨立地選自H、F、Cl、Br、I和C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _c取代； n選自1和2；環A選自吡唑基和四氫吡喃基，所述吡唑基和四氫吡喃基任選被1、2或3個R _d取代； R _a和R _c分別獨立地選自D、F、Cl、Br和I； R _d選自F、Cl、Br、I、C _1-3烷基和C _1-3烷氧基，所述C _1-3烷基和C _1-3烷氧基任選被1、2或3個R取代； R選自F、Cl、Br和I。

本發明提供了式（Ⅰ）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中， R ₁和R ₂分別獨立地選自H和C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _a取代；各R ₄獨立地選自H、F、Cl、Br、I和C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _c取代； n選自1和2；環A選自吡唑基和四氫吡喃基，所述吡唑基和四氫吡喃基任選被1、2或3個R _d取代； R _a和R _c分別獨立地選自D、F、Cl、Br和I； R _d選自F、Cl、Br、I、C _1-3烷基和C _1-3烷氧基，所述C _1-3烷基和C _1-3烷氧基任選被1、2或3個R取代； R選自F、Cl和Br。

本發明的一些方案中，上述R ₁和R ₂分別獨立地選自H、CH ₃和CH ₂CH ₃，所述CH ₃和CH ₂CH ₃任選被1、2或3個R _a取代，其他變量如本發明所定義。

本發明的一些方案中，上述R ₁和R ₂分別獨立地選自H 、CH ₃、CHF ₂、CD ₃和CH ₂CH ₃，其他變量如本發明所定義。

本發明的一些方案中，上述R ₄獨立地選自H、F、Cl、Br、I和CH ₃，所述CH ₃任選被1、2或3個R _c取代，其他變量如本發明所定義。

本發明的一些方案中，上述R ₄獨立地選自H、F、Cl、Br、I和CH ₃，其他變量如本發明所定義。

本發明的一些方案中，上述R _d選自F、Cl、Br、I、CH ₃和OCH ₃，所述CH ₃和OCH ₃任選被1、2或3個R取代，其他變量如本發明所定義。

本發明的一些方案中，上述R _d選自CH ₃和OCH ₃，其他變量如本發明所定義。

本發明的一些方案中，上述環A選自、和，所述、和任選被1、2或3個R _d取代，其他變量如本發明所定義。

本發明的一些方案中，上述環A選自、和，其他變量如本發明所定義。

本發明的一些方案中，上述結構單元選自，其他變量如本發明所定義。

本發明還有一些方案由上述變量任意組合而來。

本發明的一些方案中，上述化合物或其藥學上可接受的鹽，其選自：，其中，R ₂和R ₄如本發明所定義。

本發明還提供了下式所示化合物或其藥學上可接受的鹽，。

本發明還提供了上述化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療實體瘤的藥物中的應用。技術效果

本發明化合物表現出較優的對ERK1和ERK2酶抑制活性；本發明化合物表現出較優的對HT29細胞增殖抑制活性；本發明化合物在不同pH條件下具有較好的溶解度；本發明化合物具有優異的藥代動力學性質和抑瘤效果；本發明化合物對hERG鉀通道電流抑制作用弱，心臟毒性風險更低，安全性更高；本發明化合物具有中等到高血漿蛋白結合度。定義和說明

除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。

這裡所採用的術語「藥學上可接受的」，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。

術語「藥學上可接受的鹽」是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或鹼製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的鹼與這類化合物接觸的方式獲得鹼加成鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物接觸的方式獲得酸加成鹽。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能團，從而可以被轉換成任一鹼或酸加成鹽。

本發明的藥學上可接受的鹽可由含有酸根或鹼基的母體化合物通過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由游離酸或鹼形式的這些化合物與化學計量的適當的鹼或酸反應來製備。

除非另有說明，術語「異構體」意在包括幾何異構體、順反異構體、立體異構體、對映異構體、旋光異構體、非對映異構體和互變異構體。

本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本發明設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)- 和 (+)-對映體、( R)- 和 ( S)-對映體、非對映異構體、( D)-異構體、( L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬於本發明的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本發明的範圍之內。

除非另有說明，術語「對映異構體」或者「旋光異構體」是指互為鏡像關係的立體異構體。

除非另有說明，術語「順反異構體」或者「幾何異構體」系由因雙鍵或者成環碳原子單鍵不能自由旋轉而引起。

除非另有說明，術語「非對映異構體」是指分子具有兩個或多個手性中心，並且分子間為非鏡像的關係的立體異構體。

除非另有說明，“(+)”表示右旋，“(-)”表示左旋，“(±)”表示外消旋。

除非另有說明，用楔形實線鍵（）和楔形虛線鍵（）表示一個立體中心的絕對構型，用直形實線鍵（）和直形虛線鍵（）表示立體中心的相對構型，用波浪線（）表示楔形實線鍵（）或楔形虛線鍵（），或用波浪線（）表示直形實線鍵（）或直形虛線鍵（）。

除非另有說明，術語「互變異構體」或「互變異構體形式」是指在室溫下，不同官能團異構體處於動態平衡，並能很快的相互轉化。若互變異構體是可能的 (如在溶液中)，則可以達到互變異構體的化學平衡。例如，質子互變異構體 (proton tautomer) (也稱質子轉移互變異構體 (prototropic tautomer)) 包括通過質子遷移來進行的互相轉化，如酮-烯醇異構化和亞胺-烯胺異構化。價鍵異構體 (valence tautomer) 包括一些成鍵電子的重組來進行的相互轉化。其中酮-烯醇互變異構化的具體實例是戊烷-2,4-二酮與4-羥基戊-3-烯-2-酮兩個互變異構體之間的互變。

除非另有說明，術語「富含一種異構體」、「異構體富集」、「富含一種對映體」或者「對映體富集」指其中一種異構體或對映體的含量小於100%，並且，該異構體或對映體的含量大於等於60%，或者大於等於70%，或者大於等於80%，或者大於等於90%，或者大於等於95%，或者大於等於96%，或者大於等於97%，或者大於等於98%，或者大於等於99%，或者大於等於99.5%，或者大於等於99.6%，或者大於等於99.7%，或者大於等於99.8%，或者大於等於99.9%。

除非另有說明，術語「異構體過量」或「對映體過量」指兩種異構體或兩種對映體相對百分數之間的差值。例如，其中一種異構體或對映體的含量為90%，另一種異構體或對映體的含量為10%，則異構體或對映體過量（ee值）為80%。

可以通過的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的( R)-和( S)-異構體以及 D和 L異構體。如果想得到本發明某化合物的一種對映體，可以通過不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有鹼性官能團（如氨基）或酸性官能團（如羧基）時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後通過本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是通過使用色譜法完成的，所述色譜法採用手性固定相，並任選地與化學衍生法相結合（例如由胺生成氨基甲酸鹽）。

本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚（ ³H），碘-125（ ¹²⁵I）或C-14（ ¹⁴C）。又例如，可用重氫取代氫形成氘代藥物，氘與碳構成的鍵比普通氫與碳構成的鍵更堅固，相比於未氘化藥物，氘代藥物有降低毒副作用、增加藥物穩定性、增強療效、延長藥物生物半衰期等優勢。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。

術語「任選」或「任選地」指的是隨後描述的事件或狀況可能但不是必需出現的，並且該描述包括其中所述事件或狀況發生的情況以及所述事件或狀況不發生的情況。

術語「被取代的」是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，取代基可以包括重氫和氫的變體，只要特定原子的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為氧（即=O）時，意味著兩個氫原子被取代。氧取代不會發生在芳香基上。術語「任選被取代的」是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有規定，取代基的種類和數目在化學上可以實現的基礎上可以是任意的。

當任何變量（例如R）在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義都是獨立的。因此，例如，如果一個基團被0-2個R所取代，則所述基團可以任選地至多被兩個R所取代，並且每種情況下的R都有獨立的選項。此外，取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。

當一個連接基團的數量為0時，比如-(CRR) ₀-，表示該連接基團為單鍵。

當一個取代基數量為0時，表示該取代基是不存在的，比如-A-(R) ₀表示該結構實際上是-A。

當一個取代基為空缺時，表示該取代基是不存在的，比如A-X中X為空缺時表示該結構實際上是A。

當其中一個變量選自單鍵時，表示其連接的兩個基團直接相連，比如A-L-Z中L代表單鍵時表示該結構實際上是A-Z。

當一個取代基的鍵可以交叉連接到一個環上的兩一個以上原子時，這種取代基可以與這個環上的任意原子相鍵合，例如，結構單元或表示其取代基R可在環己基或者環己二烯上的任意一個位置發生取代。當所列舉的取代基中沒有指明其通過哪一個原子連接到被取代的基團上時，這種取代基可以通過其任何原子相鍵合，例如，吡啶基作為取代基可以通過吡啶環上任意一個碳原子連接到被取代的基團上。

當所列舉的連接基團沒有指明其連接方向，其連接方向是任意的，例如，中連接基團L為-M-W-，此時-M-W-既可以按與從左往右的讀取順序相同的方向連接環A和環B構成，也可以按照與從左往右的讀取順序相反的方向連接環A和環B構成。所述連接基團、取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。

除非另有規定，當某一基團具有一個或多個可連接位點時，該基團的任意一個或多個位點可以通過化學鍵與其他基團相連。當該化學鍵的連接方式是不定位的，且可連接位點存在H原子時，則連接化學鍵時，該位點的H原子的個數會隨所連接化學鍵的個數而對應減少變成相應價數的基團。所述位點與其他基團連接的化學鍵可以用直形實線鍵（）、直形虛線鍵（）、或波浪線（）表示。例如-OCH ₃中的直形實線鍵表示通過該基團中的氧原子與其他基團相連；中的直形虛線鍵表示通過該基團中的氮原子的兩端與其他基團相連；中的波浪線表示通過該苯基基團中的1和2位碳原子與其他基團相連；表示該哌啶基上的任意可連接位點可以通過1個化學鍵與其他基團相連，至少包括、、、這4種連接方式，即使-N-上畫出了H原子，但是仍包括這種連接方式的基團，只是在連接1個化學鍵時，該位點的H會對應減少1個變成相應的一價哌啶基。

除非另有規定，環上原子的數目通常被定義為環的元數，例如，「5-7元環」是指環繞排列5-7個原子的「環」。

除非另有規定，術語「C _1-3烷基」用於表示直鏈或支鏈的由1至3個碳原子組成的飽和碳氫基團。所述C _1-3烷基包括C _1-2和C _2-3烷基等；其可以是一價（如甲基）、二價（如亞甲基）或者多價（如次甲基）。C _1-3烷基的實例包括但不限於甲基 (Me)、乙基 (Et)、丙基 (包括 n-丙基和異丙基)等。

除非另有規定，術語「C _1-3烷氧基」表示通過一個氧原子連接到分子的其餘部分的那些包含1至3個碳原子的烷基基團。所述C _1-3烷氧基包括C _1-2、C _2-3、C ₃和C ₂烷氧基等。C _1-3烷氧基的實例包括但不限於甲氧基、乙氧基、丙氧基 (包括正丙氧基和異丙氧基)等。

本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明所使用的溶劑可經市售獲得。

本發明採用下述縮略詞：aq代表水；eq代表當量、等量；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DMSO代表二甲亞碸；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；Cbz代表苄氧羰基，是一種胺保護基團；BOC代表三級丁氧羰基是一種胺保護基團；r.t.代表室溫；O/N代表過夜；THF代表四氫呋喃；Boc ₂O代表二三級丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸；DIPEA代表二異丙基乙基胺；iPrOH代表2-丙醇；mp代表熔點。

化合物依據本領域常規命名原則或者使用ChemDraw®軟件命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。

下面通過實施例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發明任何不利限制。本文已經詳細地描述了本發明，其中也公開了其具體實施例方式，對本發明所屬技術領域具有通常知識者而言，在不脫離本發明精神和範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。

參考例1

步驟1：化合物A-1-2的合成。

向反應瓶中加入A-1-1 (500 g, 2.12 mol, 1 eq)、水(1875 mL)和四氫呋喃(1875 mL)，抽換氮氣後加入氫氧化鋰一水合物 (97.76 g, 2.33 mol, 1.1 eq)，25℃下混合液反應3小時。反應完畢後，先濃縮去除有機溶劑，再加入冰水(2 L)，然後再緩慢加入濃度為 4 N的鹽酸溶液(600 mL)，調節pH至2-3。攪拌20分鐘後，過濾，濾餅用水(1 L)和乙腈(500 mL)洗滌，收集濾餅。濾餅加入乙腈(1 L)，攪拌0.5小時。過濾，濾餅用乙腈(500 mL)洗滌，收集濾餅烘乾得到A-1-2。 ¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 13.32 (br s, 1H), 8.46 (s, 1H)。

步驟2：化合物A-1-3的合成。

向反應瓶中加入A-1-2 (175 g, 823.55 mmol, 97.9% 純度, 1 eq)和2-甲基四氫呋喃(1.75 L)，抽換氮氣後降溫至-30℃，緩慢滴入二異丙基胺基鋰(2 M, 905.90 mL, 2.2 eq)，-30℃再攪拌1小時。隨後緩慢滴入丙酮(95.66 g, 1.65 mol, 121.09 mL, 2 eq)和2-甲基四氫呋喃(175 mL)溶液，-30℃下混合液反應1小時。反應完畢後，反應液用飽和氯化銨水溶液(1750 mL)淬滅，4 N鹽酸(大約2 L)調節pH至3-4。分液，水相用乙酸乙酯( 3000 mL x 2)萃取。有機相用飽和食鹽水(1500 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，收集濾液，濾液減壓濃縮幹得粗品。向粗品中加入甲基三級丁基醚(3.5 L)，攪拌30 分鐘，再加入正己烷(3.5 L)，繼續攪拌4 小時。過濾，收集濾餅得到A-1-3。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 13.28 (br s, 1H), 6.67-5.90 (br s, 1H), 1.62 (s, 6H)。

步驟3：化合物A-1-4的合成。

向反應瓶中加入A-1-3 (200 g, 668.89 mmol, 89% 純度, 1 eq)和乙腈(2 L)，抽換氮氣後加入三氟化硼***溶液(265.82 g, 1.87 mol, 231.15 mL, 2.8 eq)，60℃下混合液反應8小時。反應完畢後，向反應液中加入乙醇(200 mL)，減壓濃縮，得到粗品。隨後將粗品緩慢倒入水(2000 mL)中，攪拌30分鐘，過濾，收集濾餅。濾餅中加入無水乙醇(600 mL)，攪拌30分鐘，過濾，濾餅用乙醇(200 mL)洗滌，收集濾餅乾燥得A-1-4。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 2.49 (s, 3H), 1.77 (s, 6H)。

步驟4：化合物A-1的合成。

向反應瓶中加入A-1-4 (150 g, 481.93 mmol, 92.9% 純度, 1 eq)和乙醇 (750 mL)，抽換氮氣後緩慢滴入氫溴酸(1.07 kg, 5.30 mol, 719.67 mL, 40% 純度, 11 eq)，50℃下混合液反應24小時。反應完畢後，向反應液中加入二氯甲烷(1.5 L)、冰水(500 mL)，再用4 N氫氧化鈉水溶液(大約1500 mL)調節pH至7-8。分液，水相用二氯甲烷(1000 mL x 2)萃取得到有機相，有機相用飽和食鹽水(1000 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮得粗品。向粗品中加入乙酸乙酯(225 mL)和正己烷(225 mL)，攪拌2 小時。過濾，收集濾餅得到A-1。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.88 (s, 1H), 1.51 (s, 6H)。

參考例2

步驟1：化合物B-1-2的合成。

向反應瓶中加入氫氧化鈉(590.8 g, 14.8 mol, 1.05 eq)和水(20 L)、B-1-1 (2000.00 g, 14.07mol, 1 eq)，然後加入碘甲烷(2495.80 g，17.59mol，1.25 eq)，在25℃下反應2小時。反應完畢後，將6N的冰鹽酸水溶液緩慢加入反應瓶中，調節pH至6~7，攪拌0.5小時。過濾，收集濾餅。向濾餅中加入乙腈(500 mL)，攪拌0.5小時，過濾，收集濾餅，烘乾得到B-1-2。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 12.69 (br s, 1H), 7.74 (br s, 1H), 2.45 (s, 3H), 1.86 (s, 3H)。

步驟2：化合物B-1-3的合成。

25℃下向反應瓶中加入乙腈(15 L)、B-1-2 (1500.00 g, 9.60mol, 1 eq)，然後再加入三氯氧磷(1840.00 g, 12.0mol , 1.25 eq)，緩慢升溫至62℃，在62℃下反應12 小時。將反應液倒入水(10.5 L)中，加入固體碳酸氫鈉調節pH至6-7。用乙酸乙酯（10.5 L)萃取，分液得有機相。有機相用飽和食鹽水(7.5 L)洗滌、無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮得到B-1-3。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.54 (s, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.22 (s, 3H)。

步驟3：化合物B-1的合成。

向反應瓶中加入B-1-3 (100 g, 572.57 mmol, 1 eq)、水(24.76 g, 1.37 mol, 24.76 mL, 2.4 eq)和乙腈(1000 mL)，抽換氮氣後依次加入碘化鈉(571.59 g, 3.81 mol, 6.66 eq)、三甲基氯矽烷(186.61 g, 1.72 mol, 218.00 mL, 3 eq)，20℃下混合液反應 14小時。反應完畢後，反應液中依次加入二氯甲烷(800 mL)和用水(12000 mL)。然後加碳酸氫鈉固體調pH至6-7，分液，水相用二氯甲烷(500 mL)萃取一次，合併有機相，有機相依次用飽和亞硫酸鈉水溶液(500 mL)和飽和食鹽水(500 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮得粗品。粗品中加入正庚烷(0.5 L)，攪拌1小時，過濾，收集濾餅得到B-1。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.34 (s, 1H), 2.48 (s, 3H), 2.21 (s, 3H)。

參考例3

步驟1：化合物D-1-2的合成。

向乾燥的反應瓶中加入乙酸鈉(4.54 g, 55.39 mmol, 5 eq)、單過硫酸氫鉀(13.62 g, 22.16 mmol, 2 eq)和水(46 mL) 。降溫到0℃，加入D-1-1 (4.6 g, 11.08 mmol, 1 eq) 、甲醇 (46 mL)和四氫呋喃 (46 mL) 的溶液，25℃下反應12小時。反應完畢後，反應液用飽和亞硫酸鈉水溶液（50mL)淬滅，用二氯甲烷（50 mLx3）萃取，合併有機相，有機相用飽和食鹽水（50 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液用水泵減壓濃縮得D-1-2。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ (ppm) = 8.66-8.67 (d, J=4.60 Hz, 1 H), 7.64-7.65 (d, J=4.82 Hz, 1 H), 3.37 (s, 3 H), 1.36-1.57 (m, 6 H), 1.33-1.35 (m, 6 H), 1.21-1.23 (m, 6 H), 0.88-0.95 (m, 9 H)。

步驟2：化合物D-1的合成。

向乾燥的反應瓶中加入D-1-2 (4.68 g, 10.46 mmol, 1 eq)、D-1-3 (1.22 g, 12.56 mmol, 1.2 eq) 和四氫呋喃 (70 mL)。抽換氮氣，-30℃滴加六甲基二矽基胺基鋰(1 M, 21.98 mL, 2.1 eq) ，-30℃反應2小時。反應完畢後，將反應液倒入飽和氯化銨水溶液(100 mL)中，用乙酸乙酯(100 mL x 3)萃取，合併有機相。有機相用飽和食鹽水(100mL)洗滌、無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗品。粗品通過柱層析純化得到D-1。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ (ppm) = 8.17 (d, J=4.65 Hz, 1 H), 7.45 (d, J=1.96 Hz, 1 H), 6.91 (d, J=4.65 Hz, 1 H), 6.79 (br s, 1 H), 6.31 (d, J=1.96 Hz, 1 H), 3.78 (s, 3 H), 1.43-1.64 (m, 6 H), 1.24-1.38 (m, 6 H), 1.07-1.14 (m, 6 H), 0.89 (t, J=7.34 Hz, 9 H)。

參考例4

步驟1：化合物E-1-3的合成。

向反應瓶中加入三級丁醇鉀(4.83 g, 43.04 mmol, 2.5 eq)和四氫呋喃(16 mL)。抽換氮氣後緩慢滴入E-1-1 (2 g, 17.22 mmol, 2.30 mL, 1 eq)、E-1-1 (2.55 g, 34.44 mmol, 2.77 mL, 2 eq)的四氫呋喃(16 mL)溶液，25 ℃下混合液反應3 小時。反應完畢後，濃縮得到E-1-3。

步驟2：化合物E-1-5的合成。

向反應瓶中加入E-1-3 (2.24 g, 17.21 mmol, 1 eq)和異丙醇(140 mL)，抽換氮氣後加入E-1-4 (2.62 g, 34.42 mmol, 2 eq)，90 ℃下混合液反應 12小時。反應完畢後，反應液減壓濃縮得到粗品。向粗品中加入20 mL水，用醋酸調節pH至4，過濾，收集濾餅。濾餅通過柱層析純化得到E-1-5。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 12.25 (br s, 2H), 7.22 (s, 1H), 2.21 (q, J=7.5 Hz, 2H), 1.01 (t, J=7.5 Hz, 3H)。

步驟3：化合物E-1-6的合成。

向反應瓶中加入氫氧化鈉(1.34 g, 33.61 mmol, 1.05 eq)和水(50 mL)，隨後加入化合物E-1-5 (5 g, 32.01 mmol, 1 eq)。抽換氮氣後，降溫至10℃，緩慢加入碘甲烷(5.68 g, 40.01 mmol, 2.49 mL, 1.25 eq)，10 ℃下混合液反應 0.5小時，緩慢升溫至25 ℃繼續反應2.5小時。反應完畢後，將反應液降溫至0~5℃，然後用6N的鹽酸調節pH至7~8，過濾，收集濾餅，濾餅乾燥得到E-1-6。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 12.64 (br s, 1H), 7.70 (br s, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.29 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 1.06 (t, J= 7.4 Hz, 3H)。

步驟4：化合物E-1-7的合成。

向反應瓶中加入E-1-6 (7.4 g, 43.47 mmol, 1 eq)和乙腈(75 mL)，抽換氮氣後緩慢滴入三氯氧磷(8.33 g, 54.34 mmol, 5.05 mL, 1.25 eq)，62℃下混合液反應 2.5小時。反應完畢後，將反應液倒入水(100 mL )中，然後用固體碳酸鈉調節pH至6~7。水相用乙酸乙酯(50 mL x 2)萃取，合併有機相，有機相用飽和食鹽水(50 mL)洗滌、無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮得到E-1-7。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.58 (s, 1H), 2.63 (q, J= 7.5 Hz, 2H), 2.51 (s, 3H), 1.17 (t, J= 7.5 Hz, 3H)。

步驟5：化合物E-1的合成。

向反應瓶中加入E-1-7 (3.5 g, 18.55 mmol, 1 eq)和乙腈(40 mL)，抽換氮氣後依次加入碘化鈉(18.52 g, 123.54 mmol, 6.66 eq)、三甲基氯矽烷(6.71 g, 61.77 mmol, 7.84 mL, 3.33 eq)和水(802.26 mg, 44.52 mmol, 802.26 μL, 2.4 eq)，25℃下混合液反應12小時。反應完畢後，反應液中依次加入二氯甲烷(50 mL)和水(50 mL)，再加碳酸氫鈉固體調pH至6-7。分液後，水相用二氯甲烷(50 mL)萃取，合併有機相。有機相用分別用飽和亞硫酸鈉水溶液(50 mL)和飽和食鹽水(50 mL)洗滌、無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮得粗品。粗品用柱層析純化得到E-1。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.32 (s, 1H), 2.58 - 2.52 (m, 2H), 2.48 (s, 3H), 1.13 (t, J= 7.5 Hz, 3H)。

實施例1

合成路線：

步驟1：WX001-1的合成

向乾燥的反應瓶中加入A-1 (70 g, 283.27 mmol, 1 eq)、二氯甲烷(1400 mL) 、4-二甲氨基吡啶(38.07 g, 311.60 mmol, 1.1 eq)和二碳酸二三級丁酯(123.65 g, 566.54 mmol, 130.15 mL, 2 eq)。抽換氮氣，20℃下反應12小時。反應完畢後，向反應液加入水(300mL)，分離有機相和水相。水相用二氯甲烷(400mL)萃取3次。合併有機相，用飽和食鹽水(300mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗品。粗品用正己烷(140 mL)打漿，過濾，收集濾餅乾燥得WX001-1。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 1.75 (s, 6 H)，1.52 (s, 9 H)。

步驟2：WX001-2的合成

向乾燥的反應瓶中加入WX001-1 (10 g, 28.80 mmol, 1 eq)、四氫呋喃(133 mL)、氯化鋅溶液(0.7 M, 41.14 mL, 1 eq) 和四甲基乙二胺(3.35 g, 28.80 mmol, 4.35 mL, 1 eq)。降溫至-78℃加入正丁基鋰(2.5 M, 17.28 mL, 1.5 eq)，攪拌10分鐘。補加正丁基鋰(2.5 M, 5.76 mL, 0.5 eq)，繼續攪拌10分鐘。補加正丁基鋰(2.5 M, 3.46 mL, 0.3 eq)，繼續在20℃反應1小時，得到反應液1。

將B-1 (7.66 g, 28.80 mmol, 1 eq)、四三苯基膦鈀(998.39 mg, 863.99 μmol, 0.03 eq)和 N’N-二甲基甲醯胺 (67 mL)的混合液升溫至50℃，得到反應液2。將反應液1滴加到反應液2中，50 ℃反應40分鐘。反應完畢後，向反應液中加入0.1M的乙二胺四乙酸二鈉水溶液(450 mL)，攪拌30 分鐘，過濾，收集濾餅得到粗品。粗品通過柱層析分離純化得到WX001-2。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.72 (s, 1H), 2.59 (s, 3H), 2.58 (s, 3H), 1.82 (s, 6H), 1.54 (s, 9H)。

步驟3：WX001-3的合成

在乾燥的反應瓶中加入WX001-2 (10 g, 24.60 mmol, 1 eq)、DCM (100 mL) 和三氟乙酸(36.49 g, 320.03 mmol, 23.69 mL, 13.01 eq)，20 ℃反應1小時。反應完畢後，將反應液先濃縮，然後用氯仿(30 mL x 3)置換除去殘餘三氟乙酸，得到WX001-3。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.89 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 2.61 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.57 (s, 6H)。

步驟4：WX001-5的合成

向乾燥的反應瓶中加入WX001-3 (150 mg, 489.55μmol, 1 eq)、 N’N-二甲基甲醯胺(1.5 mL)、碳酸銫(239.26 mg, 734.32 μmol, 1.5 eq)和WX001-4 (109.30 mg, 587.46 μmol, 1.2 eq)。抽換氮氣，25℃下反應16小時。反應完畢後，向反應液中加入水(10 mL），過濾得到濾餅。濾餅溶於二氯甲烷(10 mL)中，並用飽和食鹽水(15 mL)洗滌，分液得有機相。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮幹得WX001-5。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.74 (s, 1H), 7.62 (t, J= 7.8 Hz, 1H), 7.18 - 7.06 (m, 2H), 4.72 (s, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 2.45 (s, 3H), 1.54 (s, 6H)。

步驟5：WX001-6的合成

向乾燥的反應瓶中加入WX001-5 (130 mg, 315.88 μmol, 1 eq)、乙腈(3 mL)、水(1.5 mL)和單過硫酸氫鉀 (388.39 mg, 631.77 μmol, 2 eq)。抽換氮氣，20℃下反應16小時。反應完畢後，向反應液中加入飽和硫代硫酸鈉溶液(10 mL)，隨後用二氯甲烷（10 mL x 3）萃取。合併有機相，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(20mL x 2)和飽和食鹽水(20 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到WX001-6。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ = 9.18 (s, 1H), 7.62 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.13 (d, J= 7.7 Hz, 2H), 4.73 (s, 2H), 3.48 (s, 3H), 2.82 (s, 3H), 2.45 (s, 3H), 1.57 (s, 6H)。

步驟6：WX001的合成

向乾燥的反應瓶中加入WX001-6 (140 mg, 315.64 μmol, 1 eq)、D-1-3 (61.31 mg, 631.28 μmol, 2 eq)、二氯甲烷(1 mL)和四氫呋喃(1 mL)。抽換氮氣，將反應液降溫至0℃下，滴加六甲基二矽基胺基鋰(1 M, 599.72 μL, 1.9 eq)。滴加完畢後0℃繼續反應2小時。反應完畢後，向反應液中加水(10 mL)淬滅反應，隨後用二氯甲烷(10 mL x 3)萃取。合併有機相，用飽和食鹽水(15 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾。濾液減壓濃縮得粗品。粗品通過高效液相色譜(色譜柱：Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10μm；流動相：[水(10mM 碳酸氫銨)-乙腈]；B(乙腈)%：25%-55%，8分鐘)純化得到WX001。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 9.61 (s, 1 H), 8.60 (s, 1 H), 7.61 (t, J=7.69 Hz, 1 H), 7.39 (d, J=1.88 Hz, 1 H), 7.12 (dd, J=7.57, 3.56 Hz, 2 H), 6.34 (d, J=1.88 Hz, 1 H), 4.71 (s, 2 H), 3.72 (s, 3 H), 2.58 (s, 3 H), 2.45 (s, 3 H), 1.53 (s, 6 H)；LCMS m/z: 461[M+H] ⁺。

實施例2

合成路線：

步驟1：WX002的合成

向乾燥的反應瓶中加入WX001-6 (180 mg, 405.82 μmol, 1 eq)、WX002-1 (246.29 mg, 2.43 mmol, 6 eq)和DMSO (1 mL)。在100 ℃下反應12小時。反應完畢後，反應液直接通過高效液相色譜(色譜柱：Phenomenex C18 80*40mm*3μm；流動相：[水(碳酸氫銨)-乙腈]；B(乙腈)%：25%-55%，8分鐘)純化得到WX002。 ¹H NMR (DMSO- d ₆, 400 MHz) δ = 8.40 (s, 1H), 7.61 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.2-7.4 (m, 1H), 7.12 (dd, J=4.8, 7.7 Hz, 2H), 4.6-4.8 (m, 2H), 3.8-4.0 (m, 3H), 3.4-3.5 (m, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.45 (s, 3H), 1.89 (dd, J=1.5, 12.0 Hz, 2H), 1.5-1.6 (m, 2H), 1.52 (s, 6H)；LCMS m/z: 465[M+H] ⁺。

實施例3

合成路線

步驟1：WX003-1的合成

向乾燥的反應瓶中加入A-1 (500 mg, 2.02 mmol, 1 eq)、 N’N-二甲基甲醯胺(5 mL)、碳酸銫(988.88 mg, 3.04 mmol, 1.5 eq)和WX001-4 (451.74 mg, 2.43 mmol, 1.2 eq)。抽換氮氣，在25℃下反應16小時。反應完畢後，向反應液加入水(20 mL），過濾得到濾餅。濾餅溶解於二氯甲烷(10 mL)中，並用飽和食鹽水(15 mL x 3)洗滌，分液得有機相。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮幹得WX003-1。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 7.60 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.09 (dd, J= 7.7, 13.8 Hz, 2H), 4.66 (s, 2H), 2.44 (s, 3H), 1.48 (s, 6H)。

步驟2：WX003的合成

向乾燥的反應瓶中加入WX003-1 (150 mg, 425.84 μmol, 1 eq)、D-1 (217.46 mg, 468.42 μmol, 1.1 eq) 和甲苯(3 mL)。抽換氮氣，然後加入四三苯基膦鈀(98.42 mg, 85.17 μmol, 0.2 eq)，加熱到110℃反應12小時。反應完畢後，反應液直接減壓濃縮得粗品。粗品先通過薄層層析矽膠板純化，再經高效液相色譜(色譜柱：Waters Xbridge BEH C18 100*25mm*5μm;流動相: [水(碳酸氫銨)-乙腈]；B(乙腈)%：20%-50%，10分鐘)分離純化得到WX003。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ = 9.79 (s, 1H), 8.69 (d, J= 5.0 Hz, 1H), 7.61 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.54 (d, J= 5.0 Hz, 1H), 7.40 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 7.11 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 6.33 (d, J= 1.6 Hz, 1H), 4.71 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.45 (s, 3H), 1.53 (s, 6H)；LCMS m/z: 447[M+H] ⁺。

實施例4

合成路線

步驟1：WX004-2的合成

向乾燥的反應瓶中加入WX001-1 (500.00 mg, 1.44 mmol, 1 eq)、四氫呋喃 (6.5 mL)、氯化鋅溶液(0.7 M, 2.06 mL, 1 eq)和四甲基乙二胺(167.33 mg, 1.44 mmol, 217.32 μL, 1 eq) 。置換氮氣，降溫至-78℃，滴加正丁基鋰(2.5 M, 863.99 μL, 1.5 eq)。攪拌10分鐘，補加正丁基鋰(2.5 M, 288.00 μL, 0.5 eq) 。攪拌10分鐘，補加正丁基鋰(2.5 M, 172.80 μL, 0.3 eq)。滴加完畢後於20℃下反應1小時，得到反應液1。

氮氣保護下，將E-1 (403.38 mg, 1.44 mmol, 1 eq)、四三苯基膦鈀(49.92 mg, 43.20 μmol, 0.03 eq) 和 N’N-二甲基甲醯胺(3.5 mL) 的混合液升溫至50℃，隨後加入上述反應液1，在50℃下繼續反應40分鐘。反應完畢後，反應液用飽和氯化銨水溶液(20mL)淬滅，乙酸乙酯(20 mL x3)萃取。合併有機相，用飽和食鹽水(20 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮幹得粗品。粗品通過柱層析分離純化得到WX004-2。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.79 (s, 1 H), 3.14 (d, J=7.34 Hz, 2 H), 2.60 (s, 3 H), 1.82 (s, 6 H) ,1.54 (s, 9 H), 1.22 (t, J=7.40 Hz, 3 H)。

步驟2：WX004-3的合成

向反應瓶中加入WX004-2 (200 mg, 475.57 μmol, 1 eq)和二氯甲烷(5 mL)。降溫至0℃後，將三氟乙酸 (108.45 mg, 951.14 μmol, 70.42 μL, 2 eq)加到反應瓶中，在25℃攪拌1小時。反應完畢後，將反應液緩慢倒入飽和碳酸氫鈉水溶液(20 mL)中，調節pH至7~8。用二氯甲烷(10 mL x 2)萃取，合併有機相。有機相用飽和食鹽水(20 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮幹得WX004-3。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.90 (s, 1 H), 8.75 (s, 1 H), 3.15 (q, J=7.40 Hz, 2 H), 2.59 (s, 3 H), 1.58 (s, 6 H), 1.22 (t, J=7.40 Hz, 3 H)。

步驟3：WX004-4的合成

向反應瓶中加入WX004-3 (225 mg, 702.18 μmol, 1 eq)、碳酸銫(343.17 mg, 1.05 mmol, 1.5 eq)和 N’N-二甲基甲醯胺(5 mL)。抽換氮氣後加入WX001-4 (156.77 mg, 842.61 μmol, 1.13 mL, 1.2 eq)，25 ℃ 下混合液反應2小時。反應完畢後，將反應液倒入冰水混合物(200 mL)中，攪拌0.5小時，過濾得到濾餅。濾餅用甲苯(5mL x 3)共沸濃縮得到WX004-4。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.77 (s, 1 H), 7.60-7.64 (t, J=7.67 Hz, 1 H), 7.11-7.13 (d, J=7.67 Hz, 2 H), 4.72 (s, 2 H), 3.18 (q, J=7.38 Hz, 2 H), 2.60 (s, 3 H), 2.45 (s, 3 H), 1.54 (s, 6 H), 1.24 (t, J=7.45 Hz, 3 H)。

步驟4：WX004-5的合成

向乾燥的反應瓶中加入WX004-4 (100 mg, 234.98 μmol, 1 eq)、水(1.5 mL)和乙腈(3 mL)。抽換氮氣後降溫至0℃，分批加入單過硫酸氫鉀(288.92 mg, 469.96 μmol, 2 eq) ，然後25℃下反應12小時。反應完畢後，反應液中加入飽和亞硫酸鈉水溶液(10 mL)攪拌0.5小時，然後加入乙酸乙酯(10 mL x 2)萃取。合併有機相，用飽和食鹽水(20 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得WX004-5。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ (ppm) = 8.77 (s, 1H), 7.62 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.12 (d, J= 7.7 Hz, 2H), 4.72 (s, 2H), 3.18 (q, J= 7.4 Hz, 2H), 2.60 (s, 3H), 2.45 (s, 3H), 1.54 (s, 6H), 1.24 (t, J= 7.5 Hz, 3H)。

步驟5：WX004的合成

將WX004-5 (55 mg, 120.20 μmol, 1 eq) 、D-1-3 (23.35 mg, 240.40 μmol, 2 eq) 、二氯甲烷 (1 mL) 和四氫呋喃 (1 mL) 加到反應瓶中。置換氮氣，降溫至0℃ 。將六甲基二矽基胺基鋰(1 M, 228.38 μL, 1.9 eq) 滴加到反應瓶中，在0℃ 下攪拌1小時。反應完畢後，反應液中加入水(10 mL)淬滅反應，然後用乙酸乙酯(10 mL x 2)萃取。合併有機相，用飽和食鹽水(10 mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗品。粗品先通過薄層層析矽膠板純化，再通過高效液相色譜(色譜柱：Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10μm；流動相：[水(碳酸氫銨)-乙腈]；B(乙腈)%：25%-55%，8分鐘)分離純化得到WX004。 ¹H NMR (DMSO- d ₆, 400 MHz) δ (ppm) = 9.64 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 7.61 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.39 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.12 (d, J=7.8 Hz, 2H), 6.34 (d, J=1.8 Hz, 1H), 4.71 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.12 (q, J=7.3 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H), 1.53 (s, 6H), 1.22 (t, J=7.4 Hz, 3H)；LCMS m/z: 475[M+H] ⁺。

實驗例一、體外酶活性測試

1.實驗目的：測量化合物抑制ERK1和ERK2激酶活性的能力。

2.實驗緩衝液： 20 mM Hepes (pH 7.5)，10 mM MgCl ₂，1 mM乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.02% Brij35，0.02 mg /mL牛血清白蛋白(BSA)，0.1 mM Na ₃VO ₄，2 mM二硫蘇糖醇(DTT)，1% DMSO。

3.化合物處理：將測試化合物溶於100% DMSO中，配製成特定濃度的母液。利用Integra Viaflo Assist智能移液器將化合物連續稀釋在DMSO溶液中。

4.實驗方法：在新製備的反應緩衝液中配置底物MBP；將ERK1（或ERK2）激酶加入到上述MBP溶液中並輕輕混合；運用超聲技術（Echo550；納升範圍）將溶於100% DMSO中的化合物加入到激酶反應體系中，在室溫下孵育20分鐘；將 ³³P-ATP（特定濃度10 μCi/μL）加入到反應體系中，此時開始發生反應；在室溫下孵育2小時；通過過濾--結合方法檢測放射性的量； ERK1（或ERK2）激酶活性計算方式為測試樣品中剩餘激酶活性占對照組（二甲基亞碸處理）激酶活性的比值。使用Prism（GraphPad軟件）進行曲線擬合併計算IC ₅₀值。

5.實驗結果見表1和表2：表1 ERK1酶活性測試結果

化合物	ERK1
IC ₅₀(nM)
WX001	1.2

結論：本發明化合物表現出較優的對ERK1酶抑制活性。表2 ERK2酶活性測試結果

化合物	ERK2
IC ₅₀(nM)
WX001	0.49
WX002	0.47
WX003	0.93
WX004	0.34

結論：本發明化合物表現出較優的對ERK2酶抑制活性。

實驗例二、體外細胞增殖抑制實驗

1.實驗目的：測量化合物抑制HT29腫瘤細胞增值的能力。

2.化合物處理：將測試化合物溶於100% DMSO中，配製成10mM的母液。

3.實驗步驟與方法：開啟生物安全櫃紫外燈，倒計時30分鐘； 37℃水浴鍋中，預熱RPMI1640培養基和胰酶；紫外照射完畢，開啟生物安全櫃，將預熱培養基，胰酶，磷酸緩衝鹽溶液(PBS)等用酒精擦拭並放入生物安全櫃中；將HT29細胞從培養箱中取出，在生物安全櫃中去除舊培養基，加入10毫升PBS，輕輕搖晃，並去除PBS；加入預熱0.25%胰酶1.5毫升，水平晃動培養瓶，使其均勻覆蓋到底部的細胞，置培養箱中2分鐘；用完全培養基終止細胞消化，並吹打至均勻的細胞懸液計數；根據細胞計數結果，調整細胞懸液密度為1500細胞每孔，50微升每孔進行種板；將化合物母液連續稀釋在DMSO溶液中，並使用Tecan將化合物加入細胞板中；將加過化合物的細胞板和CellTiterGlo放到室溫平衡，後加CellTiterGlo 25微升至每孔，震盪1-2 分鐘，靜置10分鐘後檢測信號值，並用XL-Fit分析數據，計算各化合物的IC ₅₀。

4.實驗結果見表3：表3 體外細胞活性測試結果

化合物	HT29
IC ₅₀(nM)
WX001	21
WX002	46

結論：本發明化合物表現出較優的對HT29細胞增殖抑制活性。

實驗例三、小鼠體內PK研究

1.實驗目的：以雌性BALB/c小鼠為受試動物，單次給藥後測定化合物血藥濃度並評估藥代動力學行為。

2.實驗操作：選擇健康成年雌性BALB/c小鼠4只，2只為靜注組，2只為口服組。靜注組溶媒為5%DMSO+95%(20% HP-β-CD），待測化合物與適量靜注溶媒混合，渦旋並超聲，製備得到0.5 mg/mL澄清溶液，微孔濾膜過濾後備用；口服組溶媒為5%DMSO+95%(20% HP-β-CD），待測化合物與溶媒混合後，渦旋並超聲，製備得到0.3 mg/mL溶液。小鼠1 mg/kg靜脈給藥或3 mg/kg口服給藥後，收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS 方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin 軟件(美國Pharsight公司)計算藥代參數。注 DMSO：二甲基亞碸；HP-β-CD：羥丙基-β-環糊精。

3.實驗結果見表4：表4 化合物PK測試結果

化合物	C _max(nM)	F%	口服DNAUC (nM.h/mpk)	Vd _ss(L/kg)	Cl (mL/min/kg)	T _1/2(h)
WX001	2115	62%	787.18	1.6	27.5	1.29

注：C _max為最大濃度； F%為口服生物利用度；DNAUC = AUC _PO/Dose，AUC _PO為口服暴露量，Dose為藥物劑量；Vd _ss為分佈容積；Cl為清除率；T _1/2為半衰期。

結論：本發明化合物展現了優良的口服暴露量和生物利用度。

實驗例四、溶解度研究

1.實驗目的：測定化合物的溶解度，評估化合物的溶解性。

2.測試溶液：緩衝液A（pH 2.0）：50 mM磷酸鹽緩衝液，pH 2.0；緩衝液B（pH 6.5）：50 mM磷酸鹽緩衝液， pH 6.5；緩衝液C液（pH 7.4）：50 mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.4；標準溶液的製備：將50%的乙腈溶液和50%的緩衝溶液混合，得到稀釋液； 10 mM（10 μL /化合物）化合物儲備液加入稀釋液（490 μL /化合物）混合為200 µM的檢測標準溶液；以10倍和200倍量的稀釋液稀釋200 μM的紫外檢測標準液，得到20 μM，1 μM的紫外標準溶液； 1 μM、20 μM、200 μM的紫外標準溶液作為溶解性實驗的標準溶液。

3.實驗方法： DMSO溶解化合物配製成10 mM的儲配液。鹽酸胺碘酮，卡馬西平，氯黴素作為溶解度實驗的對照；被測試化合物和對照的儲備液（各10 μL）放入96孔板中，分別加入三種不同的溶解介質（緩衝液A，B，C）490 μL，對應溶解度溶液的pH分別為2.0，6.5和7.4 。實驗化合物的理論最大濃度為200 μM，含DMSO 2%；在室溫（25±2℃）下以每分鐘600轉的轉速，在搖床中振盪24小時；吸取200 μL的溶液於96孔板真空抽濾裝置中抽濾後取至新96孔板中作為測試樣品；用HPLC-UV測試化合物濃度，HPLC條件如表5：表5 HPLC條件

試驗方法	HPLC-UV檢測
儀器	Agilent 1200
流動相	A: 水+0.37%三氟乙酸 B: 乙腈+0.19%三氟乙酸
色譜柱	Waters Xbridge RP-C18 (2.1×50 mm, 5 µm)
比例	時間(min) 0.00 2.00 2.50 3.01 4.00	B% 5 90 90 5 5	流速(mL/min) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

從低濃度到高濃度（1 µM, 20 µM, 200 µM）注入3個紫外標準液至HPLC中，然後注入待測化合物的測試樣品；對紫外色譜峰進行積分，計算樣品的溶解度。

4.實驗結果見表6：表6 化合物溶解度測試結果

化合物	不同pH的溶解度
pH=2.0	pH=6.5	pH=7.4
WX001	＞200.00 μM	6.2 μM	7.08 μM

結論：本發明化合物在不同pH條件下具有較好的溶解度。

實驗例五、人黑色素瘤A375小鼠模型體內藥效研究

1.實驗目的：使用人黑色素瘤A375細胞皮下異種移植腫瘤裸小鼠模型，評價WX001的抗腫瘤作用。

2.實驗動物：種屬：小鼠品系：BALB/c裸小鼠周齡：6-8周齡性別：雌性體重：18-22克供應商：維通利華實驗動物技術有限公司

3.飼養環境：動物在SPF級動物房以IVC（獨立送風系統，恒溫恒濕）籠具飼養（每籠3只），溫度：20-26℃，濕度：40-70 %；籠具：以聚碳酸酯製成，體積375 mm x 215 mm x 180mm，墊料為玉米芯，每週更換一次；食物：實驗動物在整個實驗階段中可自由進食（照射滅菌，幹顆粒狀食物）；飲水：實驗動物可自由飲用滅菌水；籠具標識：每籠動物信息卡應注明籠內動物數目，性別，品系，接收日期，給藥方案實驗編號，組別以及實驗開始日期；動物標識：實驗動物以耳標進行標識。

4.實驗內容：實驗細胞及培養：人黑色素瘤A375細胞體外單層培養，培養條件為DMEM培養基中加10%胎牛血清，37℃ 5%CO ₂孵箱培養。一周兩次用胰酶-EDTA進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量到達要求時，收取細胞，計數，接種；腫瘤組織接種及分組：0.1 mL（5×10 ⁵個）A375細胞皮下接種於每只小鼠的右側腋下，腫瘤平均體積達到170 mm ³時，將動物隨機分為4組，開始給藥。實驗分組和給藥方案見表7；表7 實驗動物分組及給藥方案

組別	動物數量	藥物	劑量 (mg/kg)	給藥週期	給藥途徑和頻次
1	6	溶劑對照(Vehicle)	--	21天	口服給藥(PO)，每天兩次(BID)
2	6	WX001	5	21天	口服給藥(PO)，每天兩次(BID)
3	6	WX001	10	21天	口服給藥(PO)，每天兩次(BID)
4	6	WX001	20	21天	口服給藥(PO)，每天兩次(BID)

實驗動物日常觀察：本實驗方案的擬定及任何修改均通過了實驗動物管理與使用委員會（IACUC）的評估核准。實驗動物的使用及福利遵照國際實驗動物評估和認可委員會（AAALAC）的規定執行。每天監測動物的健康狀況及死亡情況，例行檢查包括觀察腫瘤生長和藥物治療對動物日常行為表現的影響如行為活動，攝食攝水量（僅目測），體重變化（每週測量兩次體重），外觀體征或其它不正常情況。基於各組動物數量記錄了組內動物死亡數和副作用。受試物的配製溶媒組：5%DMSO+95%(20%HP-β-CD)。待測化合物組：稱量定量的受試化合物於配藥瓶內，加入相應體積的DMSO後渦旋，得到澄清溶液，在加入相應體積的20%HP-β-CD後渦旋，得到均一混懸液。腫瘤測量和實驗指標：每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：TV=1/2×a×b ²，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑；化合物的抑瘤療效用TGI (%)評價。TGI(%)，反映腫瘤生長抑制率。TGI(%)的計算：TGI (%)={[1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積－該處理組開始給藥時平均瘤體積)]/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積－溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)}×100%。

5.實驗結果：如表8和圖1所示，在人黑色素瘤A375細胞皮下異種移植腫瘤裸小鼠模型上，口服給藥至第21天，WX001能夠劑量依賴性地抑制腫瘤生長，在5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg三個劑量下，TGI分別為36%、81%和104%。實驗動物的體重作為間接測定藥物毒性的參考指標。如圖2所示，給藥至第21天時，溶劑對照組和WX001組所有動物的體重均未有明顯下降，無發病或死亡現象。表8 小鼠A375模型體內藥效實驗結果

藥物	TGI
WX001 (5 mg/kg, PO, BID)	36%
WX001 (10 mg/kg, PO, BID)	81%
WX001 (20 mg/kg, PO, BID)	104%

實驗結論：WX001在5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg三個給藥劑量下，能夠劑量依賴性地抑制腫瘤生長；給藥過程中動物的體重未見明顯下降，耐受性好。

實驗例六、SD大鼠體內PK研究

1.實驗目的：以雄性SD大鼠為受試動物，單次給藥後測定化合物血藥濃度並評估藥代動力學行為。

2.實驗操作：選擇健康成年雄性SD大鼠6只，3只為靜注組，3只為口服組。靜注組溶媒為5%DMSO+95%(20% HP-β-CD），待測化合物與適量靜注溶媒混合，渦旋並超聲，製備得到0.2 mg/mL澄清溶液，微孔濾膜過濾後備用；口服組溶媒為5%DMSO+95%(20% HP-β-CD），待測化合物與溶媒混合後，渦旋並超聲，製備得到1 mg/mL溶液。SD大鼠1 mg/kg靜脈給藥或10 mg/kg口服給藥後，收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS 方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin 軟件(美國Pharsight公司)計算藥代參數。注 DMSO：二甲基亞碸；HP-β-CD：羥丙基-β-環糊精。

3.實驗結果見表9：表9 化合物PK測試結果

化合物	C _max(nM)	F%	口服DNAUC (nM.h/mpk)	Vd _ss(L/kg)	Cl (mL/min/kg)	T _1/2(h)
WX001	1011	21%	302.12	1.06	24.8	2.60

實驗例七、食蟹猴體內PK研究

1.實驗目的：以雄性食蟹猴為受試動物，單次給藥後測定化合物血藥濃度並評估藥代動力學行為。

2.實驗操作：選擇健康成年雄性食蟹猴5只，2只為靜注組，3只為口服組。靜注組溶媒為5%DMSO+95% (20% HP-β-CD），待測化合物與適量靜注溶媒混合，攪拌溶解，製備得到0.4 mg/mL澄清溶液，微孔濾膜過濾後備用；口服組溶媒為5%DMSO+95%(20% HP-β-CD），待測化合物與溶媒混合後，攪拌溶解，製備得到0.3 mg/mL溶液。食蟹猴1 mg/kg靜脈給藥或3 mg/kg口服給藥後，收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS 方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin 軟件(美國Pharsight公司)計算藥代參數。注 DMSO：二甲基亞碸；HP-β-CD：羥丙基-β-環糊精。

3.實驗結果見表10：表10 化合物PK測試結果

化合物	C _max(nM)	F%	口服DNAUC (nM.h/mpk)	Vd _ss(L/kg)	Cl (mL/min/kg)	T _1/2(h)
WX001	1248	41%	1995.93	1.19	7.90	2.0

實驗例八、比格犬體內PK研究

1.實驗目的：以雄性比格犬為受試動物，單次給藥後測定化合物血藥濃度並評估藥代動力學行為。

2.實驗操作：選擇健康成年雄性比格犬5只，2只為靜注組，3只為口服組。靜注組溶媒為5%DMSO+95% (20% HP-β-CD），待測化合物與適量靜注溶媒混合，攪拌溶解，製備得到0.4 mg/mL澄清溶液，微孔濾膜過濾後備用；口服組溶媒為5%DMSO+95%(20% HP-β-CD），待測化合物與溶媒混合後，攪拌溶解，製備得到0.3 mg/mL溶液。食蟹猴1 mg/kg靜脈給藥或3 mg/kg口服給藥後，收集一定時間的全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS 方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin 軟件(美國Pharsight公司)計算藥代參數。注 DMSO：二甲基亞碸；HP-β-CD：羥丙基-β-環糊精。

3.實驗結果見表11：表11 化合物PK測試結果

化合物	C _max(nM)	F%	口服DNAUC (nM.h/mpk)	Vd _ss(L/kg)	Cl (mL/min/kg)	T _1/2(h)
WX001	1229	52%	1099.27	1.94	19.0	1.09

實驗例九、hERG測試

1.實驗目的：使用全自動膜片鉗方法測試化合物對hERG鉀通道(human Ether-a-go-go Related Gene potassium channel) 電流的影響。

2.實驗方法：

2.1 細胞準備 CHO-hERG細胞培養於175 cm ²培養瓶中，待細胞密度生長到60~80%，移走培養液，用7 mL PBS（Phosphate Buffered Saline磷酸鹽緩衝液）洗一遍，然後加入3 mL Detachin消化。待消化完全後加入7 mL培養液中和，然後離心，吸走上清液，再加入5 mL培養液重懸，以確保細胞密度為2~5×10 ⁶/mL。

2.2 溶液配製細胞外液配方 (mM)：140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl ₂, 1.25 MgCl ₂, 10 HEPES and 10 Glucose，用NaOH調節pH至7.4。細胞內液配方 (mM)：140 KCl, 1 MgCl ₂, 1 CaCl ₂, 10 EGTA and 10 HEPES，用KOH調節pH至7.2。

2.3 電生理記錄過程單細胞高阻抗封接和全細胞模式形成過程全部由Qpatch儀器自動完成，在獲得全細胞記錄模式後，細胞鉗制在-80毫伏，在給予一個5秒的+40毫伏去極化刺激前，先給予一個50毫秒的-50毫伏前置電壓，然後複極化到-50毫伏維持5秒，再回到-80毫伏。每15秒施加此電壓刺激，記錄2分鐘後給予細胞外液記錄5分鐘，然後開始給藥過程，化合物濃度從最低測試濃度開始，每個測試濃度給予2.5分鐘，連續給完所有濃度後，給予陽性對照化合物3µM Cisapride。每個濃度至少測試3個細胞 (n ≥ 3)。

2.4 化合物準備將化合物20.00 mM母液用DMSO進行稀釋，取10µL化合物母液加入至20µL DMSO溶液中，3倍連續稀釋至6個DMSO濃度。分別取4µL 6個DMSO濃度的化合物，加入至396µL的細胞外液中，100倍稀釋至 6個中間濃度，再分別取80µL的6個中間濃度化合物，加入至32　µɅ的細胞外液中，　倍稀釋至需要測試的最終濃度。最高測試濃度為　　µ　，依次分別為　　，　　　　，　　　，　　　　，　　　　　，　　　　　　　共　個濃度。最終測試濃度中的DMSO含量不超過0.2%，此濃度的DMSO對hERG鉀通道沒有影響。化合物準備由Bravo儀器完成整個稀釋過程。

2.5 數據分析實驗數據由GraphPad Prism 5.0軟件進行分析。

2.6 質量控制環境：濕度20~50%，溫度22~25℃ 試劑：所用實驗試劑購買於Sigma公司，純度＞98% 報告中的實驗數據必須滿足以下標準：全細胞封接阻抗＞ 100 MΩ 尾電流幅度＞ 300 pA 藥理學參數：多濃度Cisapride對hERG通道的抑制效應設為陽性對照。

3.實驗結果見表12：表12 化合物hERG測試結果

化合物	IC50 (μM)
WX001	＞ 40

結論：本發明化合物對hERG鉀通道電流抑制作用弱，心臟毒性風險更低，安全性更高。

實驗例十、血漿蛋白結合度測試（PPB）

1.實驗目的：研究受試化合物與人/小鼠/大鼠/犬/猴血漿白蛋白的結合度。

2.實驗操作：基質準備：實驗當天，將血漿在冷水中解凍，並以3220 rpm的速度離心5 min，以去除所有血塊。測量得到的血漿的pH值，並根據需要使用1%的磷酸或1N的氫氧化鈉將其pH調整到7.4±0.1。測試化合物的稀釋步驟：測試化合物溶解在二甲基亞碸（DMSO）中，以製備濃度分別為10 mM和2 mM的原液。用98 μL DMSO稀釋2 μL原液（2 mM），制得40 μM的工作溶液。用240 μL DMSO稀釋10 μL原液，製得400 μM對照化合物的工作溶液。將化合物的工作溶液（5 μL）與空白基質（995 μL）按1:200的比例混合均勻以製備負載基質。分析步驟：將等量的30 μL負載基質（n=2）轉移至樣品採集板，製備待測時間0 (T0)樣品用於殘留測定。樣品立即與相應的空白緩衝液進行匹配，最終體積為60 μL，每孔中血漿與緩衝液的體積比為1:1。然後，測試化合物的T0樣品分別加入60µL的4%H ₃PO ₄的H ₂O和480 µL含有內標物的終止液。然後將它們與其他樣品一起儲存在2-8℃下等待進一步處理。將剩餘的血漿樣品放在37±1℃的二氧化碳培養箱預培養30 min。準備無蛋白樣品（F樣品），負載基質的樣品（230μL）都被轉移到聚碳酸酯管（n = 2）中，並在37℃和155000×g (35000 rpm) 條件下超速離心4 h。為了製備T樣品（測試樣品），額外一份含基質樣品轉移到單獨的96孔板(樣品培育板)上，並在37℃下培育4 h。離心結束後，從上清液第二層（上層以下）取30 μL的無蛋白樣品和30 μL的T樣品轉移到新的樣品收集板中。每個樣品與相應的空白緩衝液或基質混合，最終體積為60 μL，基質:緩衝液體積比1:1。在所有樣品加入60µL 4%的H ₃PO ₄水溶液和480 µL的終止溶液（含內標）。混合物在轉速4000 rpm下離心20 min，取各樣品上清液100µL進行LC-MS/MS分析。

3.實驗結果見表13：表13 化合物血漿蛋白結合度測試結果

化合物	血漿蛋白結合率 (unbound%)
人	小鼠	大鼠	犬	猴
WX001	6.1%	7.2%	3.8%	4.1%	2.6%

結論：本發明化合物具有中等到高血漿蛋白結合度。

無

圖1：人黑色素瘤A375模型動物在分別給予溶劑和WX001後的腫瘤生長曲線；圖2：人黑色素瘤A375模型動物在給藥過程中的體重變化率。

Claims

一種式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，
其中，R₁和R₂分別獨立地選自H和C_1-3烷基，所述C_1-3烷基任選被1、2或3個R_a取代；各R₄獨立地選自H、F、Cl、Br、I和C_1-3烷基，所述C_1-3烷基任選被1、2或3個R_c取代；n選自1和2；環A選自吡唑基和四氫吡喃基，所述吡唑基和四氫吡喃基任選被1、2或3個R_d取代；R_a和R_c分別獨立地選自D、F、Cl、Br和I；R_d選自F、Cl、Br、I、C_1-3烷基和C_1-3烷氧基，所述C_1-3烷基和C_1-3烷氧基任選被1、2或3個R取代；R選自F、Cl、Br和I。
如請求項1所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₁和R₂分別獨立地選自H、CH₃和CH₂CH₃，所述CH₃和CH₂CH₃任選被1、2或3個R_a取代。
如請求項2所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₁和R₂分別獨立地選自H、CH₃、CHF₂、CD₃和CH₂CH₃。
如請求項1所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₄獨立地選自H、F、Cl、Br、I和CH₃，所述CH₃任選被1、2或3個R_c取代。
如請求項4所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R₄獨立地選自H、F、Cl、Br、I和CH₃。
如請求項1所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R_d選自F、Cl、Br、I、CH₃和OCH₃，所述CH₃和OCH₃任選被1、2或3個R取代。
如請求項6所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R_d選自CH₃和OCH₃。
如請求項1所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，環A 選自
、
和
，所述
、
和
任選被1、2或 3個R_d取代。
如請求項8所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，環A 選自
、
和
。
如請求項1所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，結構單元
選自
。
如請求項10所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，結構單元
選自
。
如請求項1~5任意一項所述化合物或其藥學上可接受的鹽，其選自
其中，R₂如請求項1~3任意一項所定義；R₄如請求項1、4或5任意一項所定義。
一種選自下式所示化合物或其藥學上可接受的鹽，
如請求項1~13任意一項所述化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療實體瘤的藥物中的應用。