TWI833395B - 發酵乳桿菌以及其或其代謝產物用於製備增肌減脂的組合物之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種發酵乳桿菌，其為發酵乳桿菌TCI757，且此發酵乳桿菌TCI757寄存於財團法人食品工業發展研究所（寄存編號為BCRC 911064）。本發明更提供一種發酵乳桿菌TCI757（ Lactobacillus FermentumTCI757）或其代謝產物用於製備增肌減脂的組合物之用途。

Description

發酵乳桿菌以及其或其代謝產物用於製備增肌減脂的組合物之用途
本發明關於一種發酵乳桿菌，特別是關於一種發酵乳桿菌TCI757（ Lactobacillus fermentum TCI757），以及其或其代謝產物用於製備增肌減脂的組合物之用途。
現在各類型的交通工具四通八達，生活形態又常處於缺乏運動、或飲食過度的狀況，常造成現代人有體重過重的困擾。
雖然重視運動的意識已逐漸升高，然而在忙碌工作之餘，運動時間有限之下，如何能提升肌肉量仍是許多人追求的目標。
有鑑於此，如何協助現代人更輕鬆的提升肌肉量，是發明人重要的目標。是以本發明提供一種發酵乳桿菌TCI757，以及其或其代謝產物用於製備增肌減脂的組合物之用途。
在一些實施例中，一種發酵乳桿菌及其或其代謝產物用於製備增肌減脂之組合物的用途，其中發酵乳桿菌為 Lactobacillus fermentumTCI757，寄存編號BCRC 911064。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以抑制肌肉生長抑制劑。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以促進骨骼肌細胞增生。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以促進鳶尾素分泌量提升。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以提升脂聯素分泌量。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以抑制脂肪堆積。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以減少體重。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以降低體脂肪重量。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以降低內臟脂肪面積。
在一些實施例中，發酵乳桿菌可以提升握力。
在一些實施例中，發酵乳桿菌的有效劑量係100 mg/天，其中發酵乳桿菌含量為10 9CFU/g。
在一些實施例中，一種可增肌減脂的食品，其中包含至少100 mg的發酵乳桿菌，發酵乳桿菌係為 Lactobacillus fermentumTCI757，寄存編號BCRC 911064。
綜上所述，任一實施例的發酵乳桿菌TCI757及其或其代謝產物可以抑制肌肉生長抑制劑、促進骨骼肌細胞增生、促進鳶尾素分泌量提升、提升脂聯素分泌量、抑制脂肪堆積、減少體重、降低體脂肪重量、降低內臟脂肪面積、提升握力，從而達到增肌減脂的用途。
發酵乳桿菌TCI757（ Lactobacillus fermentumTCI757），是分離自印尼天貝的菌株。發酵乳桿菌TCI757以寄存編號BCRC 911064寄存於財團法人食品工業發展研究所，以及以寄存編號DSM 33914寄存於德國微生物菌種保藏中心。
發酵乳桿菌TCI757為一種乳桿菌屬（Lactobacillus）的革蘭氏陽性桿菌，屬於兼性厭氧菌。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757或其代謝產物用於製備增肌減脂之組合物的用途，其中發酵乳桿菌TCI757是寄存於財團法人食品工業發展研究所其寄存編號為BCRC 911064的發酵乳桿菌，以及寄存在德國微生物菌種保藏中心其寄存編號為DSM 33914的發酵乳桿菌。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以抑制肌肉生長抑制劑。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以促進骨骼肌細胞增生。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以促進鳶尾素分泌量提升。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以提升脂聯素分泌量。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以抑制脂肪堆積。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以減少體重。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以降低體脂肪重量。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以降低內臟脂肪面積。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757可以提升握力。
在一些實施例中，發酵乳桿菌TCI757的有效劑量係100 mg/天，其中發酵乳桿菌含量為10 9CFU/g。
在一些實施例中，前述之組合物包含特定含量的發酵乳桿菌TCI757或其代謝產物。
在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效劑量的發酵乳桿菌TCI757或其代謝產物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、***錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之組合物可包括食品產品，該食品產品包含特定含量的發酵乳桿菌TCI757或其代謝產物。
在一些實施例中，食品產品可為一般食品、保健食品或膳食補充品。換言之，此一般食品、保健食品（health foods）或膳食補充品包含有效劑量的發酵乳桿菌TCI757或其代謝產物。
在一些實施例中，前述之食品產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，前述之一般食品可為食品產品本身或為另一食品產品的添加物（food additive）。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）或調味料。
例 1 ：菌種鑑定
首先，將分離自天貝的分離菌株進行菌種鑑定。透過聚合酶連鎖反應（PCR）得到此分離菌株的16S核醣體基因（16SrDNA）序列（即SEQID NO:1）。接著，將SEQID NO:1序列以美國國家生物技術資訊中心（NCBI）網站與其他發酵乳桿菌（如表一所示）之16S核醣體基因（16SrDNA）進行序列比對後可知，此分離菌株的16SrDNA序列與其他發酵乳桿菌（ Lactobacillus fermentum）的相似性為98.78%（如表一所示）。因此，將此分離菌株命名為發酵乳桿菌TCI757。
於此，上述天貝採購自印尼（Toko Indofamily Rui An公司，品名：KERIPIK TEMPE SAGU ORIGINAL），天貝（Tempeh）又稱丹貝，是一種印尼的傳統發酵食品，由黃豆製成。天貝是將生黃豆去皮、加熱煮熟後，發酵而成。
表一
發酵乳桿菌 相似度（Per. Ident）
Lactobacillus fermentum strain HT4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 98.78%
Lactobacillus fermentum strain 2951 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 98.78%
Lactobacillus fermentum strain 3715 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 98.78%
Lactobacillus fermentum strain 6879 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 98.78%
Lactobacillus fermentum strain 6336 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 98.78%
Lactobacillus fermentum strain 6020 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 98.78%
Lactobacillus fermentum strain 5561 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 98.78%
Lactobacillus fermentum strain HFB3 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 98.78%
例 2 ：發酵乳桿菌 TCI757 的保存及培育實驗
首先，使用液態培養基（MRS）培養分離所得的發酵乳桿菌TCI757以得到菌液，然後將菌液與甘油以4：1的比例混合。之後，將菌液與甘油的混合液置於-80℃下進行保存。
接下來，將發酵乳桿菌TCI757以1%的植菌量（約1x10 4CFU／mL）接種於MRS培養基（BD Difco™ Lactobacilli MRS Broth，1%（v/v））中，並於37℃且厭氧環境下培養18小時後形成TCI757菌液。
將發酵乳桿菌TCI757菌液以5000rpm轉速進行離心5分鐘取得上清液，將上清液以0.2μm的濾膜進行過濾，所得濾液即為TCI757樣品（即TCI757樣品含有發酵乳桿菌TCI757之代謝產物）。
例 3 ：促進鳶尾素分泌測試
鳶尾素（Irisin）是人體運動時肌肉分泌的一種運動激素，可使白色脂肪轉化為棕色脂肪細胞，並促進骨骼肌增生。鳶尾素來自於FNDC5基因，在骨骼肌運動的情況下會促使FNDC5基因轉譯FNDC5蛋白水解而產生鳶尾素。
3-1.測試材料及設備說明：
細胞株：小鼠骨骼肌肉細胞（mouse skeletal muscle cells, 以下稱C2C12細胞；購自ATCC®CRL-1772™）。
前處理培養基： 3.7克/升碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）、10體積% FBS（品牌：Gibco）及1體積%盤尼西林-鏈黴素的DMEM培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）。
處理培養基：1體積% FBS及1體積%馬血清（horse serum）的DMEM培養基。
纖連蛋白第三類含域蛋白5（FNDC5）之ELISA測試套組，ELISA Kit for Fibronectin Type III Domain Containing Protein 5 （FNDC5） （USCN；Cat. SEN576Mu）。
3-2.測試流程：
於此，以例2所培育的TCI757樣品作為測試樣品。檢測小鼠肌肉纖維細胞C2C12經過測試樣品處理後，能否提升細胞內鳶尾素（FNDC5/ Irisin）含量。於此。實驗進行三次重複。
首先，將小鼠骨骼肌肉細胞以每孔1×10 4個細胞的細胞數接種至每孔含有2毫升前處理培養基的24孔盤中，並於37°C下培養至細胞於每孔培養盤底部成均勻的單細胞層（即，細胞匯合率（confluence）達80%）。接著，更換培養基為處理培養基繼續培養C2C12細胞直到C2C12細胞分化融合為多核的肌小管（myotubes）。
接下來，將細胞分為空白組及實驗組，空白組未加入測試樣品，實驗組加入0.125%濃度的代測樣品，培養48小時得到各組培養液。
後續，各組取出300 μL/well的培養液，置於1.5 mL微量離心管。再以10,000g於4℃將微量離心管進行離心10分鐘，並收集上清液。
將上清液，使用ELISA測試套組檢測細胞中的FNDC5/ Irisin含量。
3-3.實驗結果：
所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖1所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
請參閱圖1。相較於空白組（即其相對鳶尾素含量視為100%），實驗組的相對鳶尾素含量為117%。換言之，實驗組的相對鳶尾素含量相對於空白組明顯上升17%。由此可知，發酵乳桿菌TCI757對於能有效促進肌肉細胞分泌鳶尾素。進而促進白色脂肪轉化為棕色脂肪，並且加速脂肪產熱代謝。
例 4 ：促進脂聯素分泌測試
脂聯素由脂肪細胞（adipocytes）所分泌一種功能性胜肽，其跟維持體內葡萄糖及脂質的代謝平衡有關，脂聯素提升可以降低脂肪堆積，促進肌肉細胞燃燒脂肪轉換成能量，更進一步也可預防冠狀動脈疾病。
4-1.測試材料及設備說明：
細胞株：採用小鼠骨髓基質細胞（後續簡稱OP9細胞），OP9細胞購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC®）之OP9細胞株（ATCC CRL-2749）。
培養基：以Alpha-MEM細胞培養液（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，美國，Cat. 12000-022）為基底、添加20%之胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國，Cat#10437-028），且加入0.1%之抗生素（Antibiotic-Antimycotic，購自Gibco，美國，Cat.15240-062）。
脂聯素檢測試劑套組（購自CUSABIO，型號CSB-E07272m）進行檢測。
4-2.測試流程：
於此，以例2所培育的TCI757樣品作為測試樣品。檢測分化後的脂肪細胞經過測試樣品處理後，能否提升細胞內脂聯素的含量。於此。實驗進行三次重複。
取24孔培養盤，將每孔接種8×10 4個OP9細胞及500μL上述培養基，置於二氧化碳培養箱內在37℃下培養7天。此7天的細胞培養期間每隔3天更換培養基。7天後，以顯微鏡（放大倍率400x）觀察細胞內油滴形成，藉以確認細胞已完全分化為脂肪細胞。
然後，將分化完成的脂肪細胞分為以下二組，係為空白組及實驗組，空白組未加入測試樣品，實驗組加入0.25%濃度的代測樣品，培養48小時得到各組培養液。
在37℃下培養24小時之後，將孔內培養液移至 1.5 mL微量離心管。於 2℃至8℃以 1000 xg 離心 15 分鐘，將離心後的上清液移至新的 1.5 ml 微量離心管，接著將上清液稀釋2000倍，接著以脂聯素檢測試劑套組進行檢測。
最終，以ELISA讀取儀（BioTek）讀取各組之OD548nm讀值（O.D.值越大，表示脂聯素的含量越高）。經過吸光值的比較換算並乘回稀釋倍數，在空白組的脂聯素含量為100%時，換算實驗組的脂聯素含量如圖2。
4-3.實驗結果：
所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖2所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
請參閱圖2。相較於空白組（即其相對脂聯素含量視為100%），實驗組的相對脂聯素含量為146.9%。換言之，實驗組的相對脂聯素含量相對於空白組明顯上升46.9%。由此可知，發酵乳桿菌TCI757對於能有效促進脂肪細胞分泌脂聯素。進而促進白色脂肪轉化為棕色脂肪，並且加速脂肪產熱代謝，本發明的發酵乳桿菌TCI757菌株具有效提升脂聯素含量，具有減脂的潛力。
例 5 ：脂質油滴堆積量測試
脂肪細胞內以油滴（Lipid droplet）的形式貯存脂肪。基此，本次試驗分析染色後的油滴，以觀察細胞內油滴的數量，藉以確認脂肪堆積的狀態。後續，再將染劑溶出並分析以作為量化的數值指標。
5-1.測試材料及設備說明：
細株胞：採用小鼠骨髓基質細胞（後續簡稱OP9細胞），OP9細胞購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC®）之OP9細胞株（ATCC CRL-2749）。
前脂肪細胞增殖培養基（pre-adipocyte expansion medium）：為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之最低必需培養基α（Minimum Essential Medium Alpha，MEMα，品牌：Gibco）。
所使用的分化培養基（differentiation medium）：為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之MEMα（品牌：Gibco）。
油-紅O染色試劑的儲備溶液：將油-紅O染色試劑（品牌：Sigma）徹底溶解於100%異丙醇（isopropanol，供應商：ECHO）以配製3mg/mL之油-紅O染色試劑的儲備溶液。為獲得可供使用的油-紅O工作溶液（oil-red O working solution），於使用前即時將油-紅O染色試劑的儲備溶液以二次水（ddH 2O）稀釋至濃度1.8mg/mL，即為60%油-紅O染色試劑的儲備溶液。
顯微鏡（品牌zeiss）、ELISA讀取儀（廠牌：BioTek）
5-2.測試流程：
首先，以每孔8×10 4個細胞的細胞數，將OP9細胞接種於含有500μL前脂肪細胞增殖培養基的24孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL分化培養基。於培養7天後，使用顯微鏡（廠牌：ZEISS）觀察各孔中的細胞內的油滴（lipid droplet）形成以確認細胞完全分化成脂肪細胞，供後續實驗使用。
實驗組：依照每孔500μL培養基含有62.5μL的以例2所培育的TCI757樣品作為測試樣品（即，濃度為0.125%），並將測試樣品添加至含分化後的培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
空白組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含分化後的脂肪細胞的分化培養基中，在37℃下培養7天。此7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
接著，依據下列步驟進行紅油O的染色。於7天細胞處理後，將培養基移除，以1mL之磷酸鹽緩衝溶液（Phosphate buffered saline, PBS）清洗脂肪細胞兩次，再加入1mL之10%甲醛並於室溫下反應30分鐘以固定脂肪細胞。接著移除甲醛後以1mL之PBS輕輕地清洗脂肪細胞兩次，接著於每孔細胞內加入1mL之60%異丙醇，反應1分鐘後，移除異丙醇並加入1mL之油紅O作用溶液與脂肪細胞反應，於室溫下反應1小時，接著移除與脂肪細胞作用的油紅O作用溶液並迅速地以1mL之60%異丙醇進將脂肪細胞行脫色5秒鐘，使用顯微鏡觀察並拍攝細胞（放大倍率400X），結果示於圖3。
後續，將染色後的各組再依下列步驟進行紅油O的定量。加入100%異丙醇至各孔中，並置於振盪器（shaker）上反應10分鐘以溶解油滴。然後，從各孔中取100μL前述之溶液至96孔培養盤並於510nm的波長下以ELISA讀取儀讀取各孔的吸光值（OD510nm）。
於量測後，藉由將所測得的吸光值代入下列公式I而計算出脂質油滴堆積量（%）。換言之，是將空白組的脂質油滴堆積量視為100%來計算各組別的脂質油滴堆積量（%），換算結果示於圖4。
脂質油滴堆積量（%）＝（OD 510sample/OD 510control）×100% （1） 公式I。
其中，OD 510sample代表欲換算之組別的吸光值，而OD 510control代表空白組的吸光值。
5-3.實驗結果：
參閱圖3。觀察空白組的細胞可見細胞內紅色（深色）的油滴數是明顯多於實驗組，細胞尺寸也更大。可知，發酵乳桿菌TCI757能有效地抑制脂肪細胞大小，進而達成減肥之功能。
參閱圖4。以空白組的脂質油滴堆積量為100%的情況下，而實驗組的脂質油滴堆積量只有74.8%。由此可知，發酵乳桿菌TCI757能有效地抑制脂肪累積，具有減少受體的脂肪形成的功能，進而達成減肥之功能。
例 6 ：肌肉生長抑制素基因表現測試
肌肉生長抑制素（Myostatin, MSTN）抑制MSTN可活化衛星細胞而增加肌肉再生。
6-1.測試材料及設備說明：
細胞株：小鼠骨骼肌肉細胞（mouse skeletal muscle cells, 以下稱C2C12細胞；購自ATCC®CRL-1772™）。
培養基：以DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，購自Gibco，產品編號12800017），添加10% FBS（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）以及1%抗生素（購自Gibco，產品編號15240-062）。
10X DPBS 杜氏磷酸鹽緩衝液（購自Gibco；Cat.14200-075）。
RIPA 裂解與提取緩衝液（Thermo，產品編號#89900）。
6-2.測試流程：
首先，取6孔培養盤將每孔接種1×10 6個C2C12細胞及2mL的培養基並培養隔夜。將培養完成的C2C12細胞分為二組：空白組、對照組與實驗組。
空白組：僅添加培養基，然後在37℃下培養24小時。
對照組：添加0.25%的MRSD，所述MRSD是指養菌時的空培液。
實驗組：添加0.25%的依例2所製得的TCI757樣品，然後在37℃下培養24小時。
將培養後的各組細胞以400xg進行5分鐘離心後去除上清液之後，剩下的細胞以1X DPBS緩衝液清洗後再次以400xg進行5分鐘離心，再去除上清液後，加入500μL的RIPA 裂解與提取緩衝液以裂解細胞膜而分別形成細胞溶液。
接著，使用RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G）分別收集二組細胞溶液內之RNA。接著，每組取1000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript ®III反轉錄酶 （購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）以引子黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system （Thermo Fisher Scientific公司，美國），以及KAPA SYBR FAST （購自Sigma公司，美國，編號38220000000）將二組反轉錄後產物分別以下列引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應 （quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction） 以觀察實驗組和控制組的PBMC細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應1 秒，60°C反應20秒，總共40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量各基因的mRNA表現量，進而推斷各基因編碼的蛋白質的表現量，如圖5所示。
目標基因MSTN，所使用引子包括：引子名稱MSTN-F，序列編號SEQID NO:2，序列：TTCCGGTTCCTTTTCCCTT，長度577bp。引子名稱MSTN-R，序列編號SEQID NO:3，序列：TCTGCAGCTTGTGTTGCTCT，長度577bp。
參考圖5。將空白組的MSTN基因的表現量視為1時，對照組的MSTN基因的表現量為0.68，而實驗組相對於空白組的MSTN基因的表現量為0.19，也就是說，相較於空白組，實驗組的MSTN基因的表現量顯著地的減少達81%。即便是和一般常用的抑制劑MRSD相比，也具有更佳的效果。
需要特別說明的是，圖5中顯示的係以相對倍率呈現，即將空白組的定量結果視為1來將實驗組的定量結果換算成相對於空白組的表現量。其中，使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中，「*」代表相對於空白組p值小於0.05，「**」代表相對於空白組p值小於0.01，以及「***」代表相對於空白組p值小於0.001。
由此可知，當肌肉細胞存在有發酵乳桿菌TCI757的情況下，可以明顯抑制肌肉生長抑制素相關基因的表現量。也就是說，發酵乳桿菌TCI757可以有效抑制肌肉生長抑制素，從而達到增生肌肉量，而預防肌少症。
例 7 ：骨骼肌細胞增生測試
7-1.測試材料及設備說明：
細胞株：小鼠骨骼肌肉細胞（mouse skeletal muscle cells, 以下稱C2C12細胞；購自ATCC®CRL-1772™）。
培養基：以MEMAM細胞培養液（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，美國）為基底、添加20%之胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國，Cat#10437-028），且加入0.1%之青黴素/鏈黴素（Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國）。
細胞增生ELISA測試劑套組（購自Roche羅氏，型號11647229001），套組中包括細胞固定溶液（FixDenat）、抗BrdU-POD工作溶液（溴化去氧尿苷 BrdU，又稱抗體偶聯物 antibody conjugate）。
7-2.測試流程：
於此，以例2所培育的TCI757樣品作為測試樣品。檢測分化後的骨骼肌細胞經過測試樣品處理後，能否提升細胞數量。於此。實驗進行三次重複。
取24孔培養盤，將每孔接種5000個C2C12細胞於96孔盤上，置於二氧化碳培養箱內在37℃下培養2小時。
然後，將C2C12細胞分為以下二組，係為空白組及實驗組，實驗組加入每孔100µL的代測樣品及10µL的BrdU，而空白組僅加入10µL的BrdU而未加入測試樣品，在培養24小時得到各組培養液。
各組培養液去除上清液後，加入200µL的細胞固定溶液，室溫下處理30分鐘。
去除細胞固定溶液後，使用1Xpbs洗滌一次。接著加入每孔的抗BrdU-POD工作溶液，室溫下處理90分鐘。
之後，去除抗BrdU-POD工作溶液後，使用200到300µL的洗滌液充份沖洗三次後，去除洗滌液再加入100µL的底物溶液（substrate solution），室溫下處理15分鐘。
接者，每孔加入25µL的1M的H 2SO 4並處理10分鐘，後在300rpm的振動器上振動1分鐘。
最終，於顯微鏡下拍攝照片，如圖6所示，並於450nm的波長下以ELISA讀取儀讀取各孔的吸光值（OD450nm）。經過吸光值的比較換算並乘回稀釋倍數，在空白組的細胞數量為100%時，換算實驗組的細胞數量量如圖7。
7-3.實驗結果：
所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖7所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
請參閱圖6。圖中藍色光點為細胞核，綠色光點為新增生的細胞核。相較於空白組，實驗組中不論藍色或綠色光點都明顯較多，尤其是綠色光點增加數量更為顯著。
請參閱圖7。相較於空白組（即其相對細胞數量視為100%），實驗組的相對骨骼肌數量為124.6%。換言之，實驗組的相對骨骼肌數量相對於空白組明顯上升接近25%。由此可知，發酵乳桿菌TCI757對於能有效促進骨骼肌細胞增生，具有增肌的潛力。
例 8 ：人體測試
8-1.樣品：採用例2所製備的發酵乳桿菌TCI757所製得的膠囊，內含100mg的菌粉。於此，菌粉係將例2所製備的發酵乳桿菌TCI757菌液加入2.2% (w/w)海藻糖、4.6%(w/w)乳糖及10%(w/w)脫脂奶粉，混合均匀，冷凍乾燥後磨粉製成。
8-2.受試者：10位受試者。各受試者為20歲以上，欲減少體脂肪、提升肌肉量者，其中，10位受試的平均體重為70.88公斤，平均體脂為28.35%。
8-3.測試項目：體重變化、體脂肪重量、體脂率、內臟脂肪面積及手掌握力。
8-4.測試方式：
令10位受試者每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757所製得的膠囊，並每天持續攝入八周。於開始攝入前（即第0周，又稱對照組）及飲用八周後（即第8周，又稱為實驗組）分別進行量測。
其中，以身體組成分析儀（型號：InBody 770）量測受試者的體重（kg）、體脂肪重量（kg）、體脂率（%）、內臟脂肪面積（cm 2）。
其中，利用握力器（型號CAMRY EH101 electronic hand dynamometer）量測受試者的握力（kg）。
8-5.測試結果：
請參閱圖8。經過八周的每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757後，10位受試者的平均體重從70.88kg（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至69.91kg（第8周）。使用本發明之發酵乳桿菌TCI757僅8周，其前後的平均體重差異達0.97kg。意即，每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757可以有效降低體重。
請參閱圖9。經過八周的每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757後，10位受試者的平均體脂肪重量從20.07kg（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至19.37kg（第8周）。使用本發明之發酵乳桿菌TCI757僅8周，其前後的平均體脂肪重量差異達0.7kg。意即，每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757可以有效降低體脂肪重量。
由上述二項數據可知，受試者的平均體重減少0.97kg，而平均體脂肪重量減少0.7kg，可見所減少的體重中，有72%以上是脂肪重量，而非肌肉重量，明顯達成增肌減脂的效能。
請參閱圖10。經過八周的每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757後，10位受試者的平均體脂率從28.35%（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至27.74%（第8周）。使用本發明之發酵乳桿菌TCI757僅8周，其前後的平均體脂率減少0.61%。意即，每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757可以有效降低體脂率。
請參閱圖11。經過八周的每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757後，10位受試者的平均內臟脂肪面積從83.13cm 2（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至80.52cm 2（第8周）。使用本發明之發酵乳桿菌TCI757僅8周，其前後的平均內臟脂肪面積減少2.61 cm 2。意即，每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757可以有效降低內臟脂肪面積。
參考圖12。經過八周的每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757後，10位受試者的平均手掌握力從37.8 kg（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況上升至38.8 kg（第8周）。使用本發明之發酵乳桿菌TCI757僅8周，其前後的平均手掌握力增加1 kg。意即，每日攝取100mg的發酵乳桿菌TCI757可以有效提升握力，達到改善肌肉力量。
由此可知，使用發酵乳桿菌TCI757及其或其代謝產物可以抑制肌肉生長抑制劑、促進骨骼肌細胞增生、促進鳶尾素分泌量提升、提升脂聯素分泌量、抑制脂肪堆積、減少體重、降低體脂肪重量、降低內臟脂肪面積、提升握力，從而達到增肌減脂的功效。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是發酵乳桿菌TCI757於促進鳶尾素分泌量測試的結果圖。 圖2是發酵乳桿菌TCI757於提升脂聯素分泌量測試的結果圖。 圖3是發酵乳桿菌TCI757的抑制脂肪堆積測試的細胞狀態圖。 圖4是發酵乳桿菌TCI757於抑制脂肪堆積測試的結果圖。 圖5是發酵乳桿菌TCI757的抑制肌肉生長抑制劑測試結果圖。 圖6是發酵乳桿菌TCI757的促進骨骼肌細胞增生測試的細胞狀態圖。 圖7是發酵乳桿菌TCI757於促進骨骼肌細胞增生測試的結果圖。 圖8是發酵乳桿菌TCI757的人體實驗體重變化結果圖。 圖9是發酵乳桿菌TCI757的人體實驗體脂肪重量變化結果圖。 圖10是發酵乳桿菌TCI757的人體實驗體脂率變化結果圖。 圖11是發酵乳桿菌TCI757的人體實驗內臟脂肪面積重量變化結果圖。 圖12是發酵乳桿菌TCI757的人體實驗體握力變化結果圖。
財團法人食品工業發展研究所（台灣）；民國110年6月11日；寄存編號：BCRC 911064。 德國微生物菌種保藏中心（德國）；西元2021年6月24日；寄存編號為DSM 33914。
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Claims (12)

  1. 一種發酵乳桿菌以及其或其代謝產物用於製備增肌減脂之組合物的用途，其中該發酵乳桿菌為 Lactobacillus fermentumTCI757，寄存編號BCRC 911064。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以抑制肌肉生長抑制劑。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以促進骨骼肌細胞增生。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以促進鳶尾素分泌量提升。
  5. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以提升脂聯素分泌量。
  6. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以抑制脂肪堆積。
  7. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以減少體重。
  8. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以降低體脂肪重量。
  9. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以降低內臟脂肪面積。
  10. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌可以提升握力。
  11. 如請求項1所述之用途，其中該發酵乳桿菌的有效劑量係100 mg/天，其中該發酵乳桿菌含量為10 9CFU/g。
  12. 一種可增肌減脂的食品，其中包含至少100 mg的發酵乳桿菌，該發酵乳桿菌係為 Lactobacillus fermentumTCI757，寄存編號BCRC 911064。
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