TWI754351B - 瓜拿納發酵液的製備方法及瓜拿納發酵液的用途 - Google Patents
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Abstract
一種瓜拿納發酵液的製備方法，包括提供培養液、將培養液及複數菌種進行發酵7日以得到發酵原液，以及調整發酵原液以形成瓜拿納發酵液。上述培養液包括以1重量份的瓜拿納（Paullinia cupana
）及10重量份的水所形成的一瓜拿納萃取液及瓜拿納萃取液總重10%的葡萄糖。上述複數菌種包括相對於培養液為0.1%的酵母菌、相對於培養液為0.05%的乳酸菌及相對於培養液為5%的醋酸菌。
Description
本發明關於一種發酵液，特別是關於一種瓜拿納發酵液的製備方法及其用途。
自有機及天然的飲食概念興起後，生技公司及食品業者積極投入關於天然植物的相關產品之研發。為使植物相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎，植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。而原產於巴西亞馬遜盆地地區的瓜拿納（Guarana，學名為Paullinia cupana）亦成為研究開發的對象之一。
瓜拿納（Guarana，學名為Paullinia cupana），又名巴西香可可，是無患子科泡林藤屬（又稱保力藤屬）的爬藤植物。瓜拿納分布在巴西、祕魯、哥倫比亞、委內瑞拉等亞馬遜盆地區域。目前主要種植於巴西亞馬遜州及巴西巴伊亞州。
瓜拿納為三葉、其花小而白，且其果實具有紅色的外殼，當果實成熟時會露出白色的果肉和種子。瓜拿納的果實含有大量的咖啡因，常被用來製作糖漿、食品，並再加工成飲料。
自15世紀起，瓜拿納便作為亞馬遜人所使用的傳統藥材，其主要作為體能增強劑使用。在葡萄牙，自1990年代末期起，瓜拿納被用來製作為飲料。
在一些實施例中，一種瓜拿納發酵液的製備方法，包括提供培養液、將培養液及複數菌種進行發酵7日以得到發酵原液，以及調整發酵原液以形成瓜拿納發酵液。上述培養液包括以1重量份的瓜拿納（Paullinia cupana
）及10重量份的水所形成的一瓜拿納萃取液及瓜拿納萃取液總重10%的葡萄糖。上述複數菌種包括相對於培養液為0.1%的酵母菌、相對於培養液為0.05%的乳酸菌及相對於培養液為5%的醋酸菌。
在一些實施例中，一種瓜拿納發酵液的製備方法所製得瓜拿納發酵液用於製備減少受體的脂肪形成的組合物之用途，其中瓜拿納發酵液用以提升脂肪分解酶（ATGL）表現量以減少脂肪形成。
在一些實施例中，一種瓜拿納發酵液的製備方法所製得瓜拿納發酵液用於製備減少受體的脂肪形成的組合物之用途，其中瓜拿納發酵液用以減少脂質油滴的生成以減少脂肪形成。
在一些實施例中，一種以上述的瓜拿納發酵液的製備方法所製得瓜拿納發酵液用於製備減少受體的脂肪形成的組合物之用途，其中瓜拿納發酵液用以降低澱粉分解酶及α-葡萄糖苷酶的活性以及減少澱粉分解成醣類後的熱量吸收以減少脂肪形成。
綜上所述，根據任一實施例的瓜拿納發酵液的製備方法，其能製備一瓜拿納發酵液。在一些實施例中，瓜拿納發酵液可用於製備減少脂肪形成的組合物。在一些實施例中，瓜拿納發酵液的製備方法能提高所製得的瓜拿納發酵液的總多酚含量。在一些實施例中，瓜拿納發酵液用以提升脂肪分解酶的表現量，進而減少受體的脂肪形成。在一些實施例中，瓜拿納發酵液用以減少脂質油滴的生成，進而減少脂肪形成。在一些實施例中，瓜拿納發酵液用以降低澱粉分解酶的活性以及減少澱粉分解成醣類後的熱量吸收，進而減少脂肪形成。
關於本文中所使用之符號「%」通常是指重量百分濃度，而符號「vol%」通常是指體積百分濃度。關於本文中所使用之「瓜拿納」通常是指瓜拿納（Paullinia cupana
）的果實（包含種子），其果實大小為1至1.5公分，且其為完熟果實。
請參閱圖1。在一些實施例中，瓜拿納萃取液的製備方法下列步驟：提供培養液（步驟S100）、將培養液及複數菌種進行發酵7日以得到發酵原液（步驟S300），以及調整發酵原液以形成瓜拿納發酵液（步驟S500）。其中，培養液包括以1重量份的瓜拿納（Paullinia cupana
）及10重量份的水所形成的瓜拿納萃取液及瓜拿納萃取液總重10%的葡萄糖。複數菌種包括相對於培養液為0.1%的酵母菌、相對於培養液為0.05%的乳酸菌及相對於培養液為5%的醋酸菌。
在一些實施例中，酵母菌可以是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae
）。在一些實施例中，乳酸菌可以是胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum
）或植物乳桿菌。在一些實施例中，醋酸菌可以是乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti
）。
請參閱圖2。在一些實施例中，步驟S100包括下列步驟：混合瓜拿納及水以形成瓜拿納基液（步驟S110）、將瓜拿納基液於95℃下萃取1小時以得到瓜拿納萃取液（步驟S120），以及將瓜拿納萃取液與葡萄糖混合以得到培養液（步驟S130）。於此，瓜拿納基液中，瓜拿納與水的比例為1：10。
在步驟S110的一些實施例中，與水混和的瓜拿納為顆粒狀。換言之，在混和瓜拿納及水之前，瓜拿納需先打碎以形成瓜拿納顆粒，以便於與水充分混合。
在一些實施例中，於此所選用的瓜拿納可為包含紅色外殼、白色果肉及種子的全果，全果果實大小為1至1.5公分，且為完熟果實。換言之，瓜拿納全果連果殼及種子一起打碎成瓜拿納顆粒。
在步驟S120的一些實施例中，瓜拿納萃取液的萃取方式是透過將瓜拿納浸泡在恆溫為95℃的水中靜置1小時。在步驟S120的另一些實施例中，瓜拿納萃取液的萃取方式是透過將瓜拿納浸泡在水中後將瓜拿納與水置於95℃的環境下靜置1小時。
在一些實施例，瓜拿納萃取液以其總重10%的葡萄糖調整其糖度為10°Bx至10.4°Bx以形成培養液。於此，糖度為10°Bx至10.4°Bx的培養液可以確保後續發酵的順利進行，並確保菌種有足夠的養份消耗。
在一些實施例中，所獲得的培養液可採取自然降溫的方式冷卻至室溫，以利於後續將培養液與多種菌種進行發酵。
在一些實施例中，培養液的pH值為6.3±2。
請參閱圖3。在一些實施例中，步驟S300包括下列步驟：首先，將酵母菌於培養液內發酵1日後形成第一初發酵液（步驟S310）。換言之，0.1%的酵母菌與培養液混合成的第一混合液進行發酵1日後形成第一初發酵液。其中，酵母菌的添加量是相對於培養液總重的1%。在一些實施例中，第一混合液是在28℃至37℃下進行發酵。並且，在步驟S310的一實施態樣中，酵母菌為啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae
）。
於第一初發酵液形成後，再添加乳酸菌於第一初發酵液內發酵1日後形成第二初發酵液（步驟S330）。換言之，0.05%的乳酸菌與第一初發酵液混合成的第二混合液進行發酵1日後形成第二初發酵液。其中，乳酸菌的添加量是相對於培養液總重的0.05%。在一些實施例中，第二混合液是在28℃至37℃下進行發酵。並且，在步驟S330的一實施態樣中，乳酸菌為胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum
）。
於第二初發酵液形成後，再添加醋酸菌於第二初發酵液內發酵5日後形成第三初發酵液（步驟S350）。換言之，5%的醋酸菌與第二初發酵液混合成的第三混合液進行發酵5日以形成第三初發酵液。其中，醋酸菌的添加量是相對於培養液總重的5%。在一些實施例中，第三混合液是在28℃至37℃下進行發酵。並且，在步驟S350的一實施態樣中，醋酸菌為乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti
）。並且，第三初發酵液的pH值為3至4。在一些實施例中，第三初發酵液的pH值為3.4。
於第三初發酵液形成後，過濾第三初發酵液以得到發酵原液（步驟S370）。在步驟S370的一實施態樣中，第三初發酵液的過濾步驟包括在60℃下減壓濃縮，及以200目數（mesh）的網孔的濾網過濾第三初發酵液以得到發酵原液。於此，發酵原液的pH值為3至4。在一些實施例中，發酵原液的pH值為3.4。
再請參閱圖1。再得到發酵原液後，調整發酵原液以形成瓜拿納發酵液（步驟S500）。舉例來說，透過調整發酵原液的糖度或/及濃度可形成瓜拿納發酵液。在步驟S500的一實施態樣中，調整發酵原液的糖度以形成瓜拿納發酵液。在一些實施例中，透過添加相對於發酵原液總重60%的寡糖至發酵原液以形成瓜拿納發酵液。於此，瓜拿納發酵液的糖度為40°Bx。
在一些實施例中，瓜拿納發酵液的總多酚（total polyphenol）含量為1600微克/毫升（µg/ml）以上。換言之，每1毫升的瓜拿納發酵液中含有1600微克以上的總多酚含量。
在一些實施例中，瓜拿納發酵液具有提升脂肪分解酶基因的表現量之作用。其中，脂肪分解酶可以為脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase, ATGL）。在一些實施例中，瓜拿納發酵液具有減少脂質油滴的生成之作用。在一些實施例中，瓜拿納發酵液具有降低澱粉分解酶（Amylase）的活性之作用。在一些實施例中，瓜拿納發酵液具有降低α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）的活性之作用。在一些實施例中，瓜拿納發酵液具有減少受體體內的澱粉分解成醣類後的熱量吸收之作用。在一些實施例中，瓜拿納發酵液能透過下列一種或多種細胞層面的作用來達成減脂及/或減少熱量吸收之作用：提升脂肪分解酶（ATGL）基因的表現量、減少脂質油滴生成、降低澱粉分解酶的活性以及降低α-葡萄糖苷酶的活性。
在一些實施例中，瓜拿納發酵液能用於製備提升脂肪分解酶（ATGL）基因的表現量之組合物。
在一些實施例中，瓜拿納發酵液能用於製備減少脂質油滴生成的組合物。
在一些實施例中，瓜拿納發酵液能用於製備降低澱粉分解酶（Amylase）及/或α-葡萄糖苷酶的活性之組合物。
在一些實施例中，瓜拿納發酵液能用於製備減少一受體體內的澱粉分解成醣類後的熱量吸收之組合物。
在一些實施例中，瓜拿納發酵液能用於製備減少受體的脂肪形成之組合物。
在一些實施例中，前述之任一 組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的瓜拿納發酵液。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、***錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation） 或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用組合物。換言之，食用組合物包含特定含量的瓜拿納發酵液。在一些實施例中，前述之食用組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為化妝品或保養品。換言之，化妝品或保養品包含特定含量的瓜拿納發酵液。
在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中，外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。
範例一：瓜拿納發酵液的製備
將瓜拿納全果（包含果殼、果肉及果核）敲碎成瓜拿納顆粒後，取1重量份的瓜拿納顆粒及10重量份的水混合成瓜拿納基液。接著，將瓜拿納基液於95℃下萃取1小時以得到瓜拿納萃取液。將瓜拿納萃取液與其總重10%的葡萄糖混合以形成作為發酵用的培養液。並且，培養液的糖度為10.4°Bx且pH值為6.3。
將培養液冷卻至室溫（25℃）並將冷卻後的培養液置於發酵桶中，接著添加相對於培養液總重為0.1%的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae
，購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（BCRC）且寄存編號BCRC20271）至發酵桶內的培養液中以形成第一混合液。將第一混合液於30℃進行發酵1日以形成第一初發酵液。
於發酵桶內的第一初發酵液中添加相對於培養液總重為0.05%的胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum
TCI378，購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（BCRC）且寄存編號BCRC910760）以形成第二混合液。將第二混合液於30℃進行發酵1日以形成第二初發酵液。
於發酵桶內的第二初發酵液中添加相對於培養液總重為5%的乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti
，購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（BCRC）且寄存編號11688）以形成第三混合液。將第三混合液於30℃進行發酵5日以形成第三初發酵液。接著，確認第三初發酵液的酸鹼值是否為pH3.4以確認發酵結束時間點。
將發酵結束的第三初發酵液於60℃下進行以減壓濃縮機進行減壓濃縮，並200目數（mesh）的網孔的濾網過濾第三初發酵液以得到發酵原液。並且，添加相對於發酵原液總重60%的異麥芽寡糖至發酵原液中，以調整發酵原液的糖度至40°Bx以形成瓜拿納發酵液。
範例二：瓜拿納水萃液的製備
將瓜拿納全果（包含果殼、果肉及果核）敲碎成瓜拿納顆粒後，取1重量份的瓜拿納顆粒及10重量份的水混合成瓜拿納基液。接著，將瓜拿納基液於95℃下萃取1小時以得到瓜拿納水萃原液。將瓜拿納水萃原液與其總重10%的葡萄糖混合以形成瓜拿納水萃液。並且，瓜拿納水萃液的糖度為10.4°Bx且pH值為6.3。
實驗一：總多酚含量測試
1-1. 標準曲線
秤取10.0毫克（mg）的沒食子酸（Gallic acid）置於10mL容量瓶中，然後以水（H2O）定量至10mL，以得到沒食子酸的儲備溶液（stock solution）。將沒食子酸的儲備溶液稀釋10倍，即100μL沒食子酸的儲備溶液加900μL的水，以得到100μg/mL沒食子酸的初始溶液（即含1000ppm的沒食子酸）。然後，依據下表1配置0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、及100μg/mL之沒食子酸的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至玻璃試管中。加入500μL之福林酚試劑（Folin-Ciocalteu's phenol reagent，購自Merck）至各玻璃試管內與標準溶液混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉（sodium carbonate）混合均勻後反應30分鐘以得到標準反應溶液。取200μL之標準反應溶液至96孔盤中，並測量其在750nm下之吸光值，以獲得標準曲線。
表1
| 標準溶液（μg/mL） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 初始溶液（μL） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 水（μL） | 100 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
1-2. 實驗結果
將實驗組的測試樣品（即範例一的瓜拿納發酵液）及對照組的測試樣品（即範例二的瓜拿納水萃液）分別以水稀釋10倍，並取100微升（μL）至離心管中。在含有稀釋10倍的測試樣品的離心管中加入500μL之福林酚試劑並與測試樣品混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到待測反應溶液。將裝有待測反應溶液的離心管進行震盪以確保無氣泡後，取200μL之待測反應溶液至96孔盤中，並測量待測反應溶液於750nm下之吸光值。
接著，利用標準曲線與內插法將待測反應溶液的吸光值換算成總多酚含量。於此，可得到實驗組（即瓜拿納發酵液）的總多酚含量為1617.45μg/mL，且對照組（即瓜拿納水萃液）的總多酚含量為728.09μg/mL，如圖4所示。
由此可知，瓜拿納透過微生物發酵後，可增加總多酚含量2.2倍。即，相對於瓜拿納水萃液，瓜拿納發酵液能提升抗氧化活性。
實驗二：澱粉分解酶的酵素活性測試
2-1. 溶劑配置
含有6mM氯化鈉的0.02莫爾濃度（M）磷酸鈉緩衝溶液（Sodium phosphate buffer）（以下簡稱NaCl-Pi緩衝溶液）：將0.7356克的磷酸一氫鈉（購自J.T.Baker，編號3828-01）、0.5492克的磷酸二氫鈉（購自Sigma，編號04270）及1.7532克的氯化鈉（購自第一化工，編號C4B07）混合並溶於500毫升的水（H2
O）中，以配置含有6mM氯化鈉且酸鹼值（pH）為6.3的NaCl-Pi緩衝溶液。
2當量濃度（N）氫氧化鈉（NaOH）溶液：以8克氫氧化鈉（購自Macron，編號7708-10）溶於100毫升水中，以配置2N的氫氧化鈉溶液。
二硝基水楊酸顏色試劑（Dinitrosalicylic acid color reagent，以下稱終止劑）：將1克3,5-二硝基水楊酸（購自Sigma，編號D0550）溶入50毫升去離子水中，再緩慢加入30克酒石酸鉀鈉（sodium potassium tartrate tetrahydrate，購自Sigma，編號32312）及緩慢加入20毫升2N氫氧化鈉溶液，並以去離子水定量至100毫升。於此，可得到終止劑。其中，終止劑的保存期限為兩周之內。
1%澱粉溶液：秤取1克澱粉至100毫升NaCl-Pi緩衝溶液並緩慢加熱使澱粉完全溶解於NaCl-Pi緩衝溶液中，待加熱後的含有澱粉的NaCl-Pi緩衝溶液降至室溫後，以水定量至100毫升。於此，可得到1%澱粉溶液，並儲存於4°C環境。此外，進行酵素活性測試前至少要將1%澱粉溶液置於室溫下4至5分鐘。
α-澱粉分解酶（α-amylase）溶液（5單位/毫升）：將0.0096克α-澱粉分解酶溶解於25毫升NaCl-Pi緩衝溶液。於此，可得到每毫升5單位的α-澱粉分解酶溶液。一般而言，α-澱粉分解酶溶液儲存於4℃環境，並可存放2至3天。
2-2.測試流程
依據下表2進行各測試組別的澱粉分解酶的酵素活性測試。其中，測試組別中實驗組（0分鐘）、對照組（0分鐘）及控制組（0分鐘）代表α-澱粉分解酶並無與澱粉反應的測試組別（以下稱反應起始點（0分鐘）），而實驗組（10分鐘）、對照組（10分鐘）及控制組（10分鐘）代表α-澱粉分解酶與澱粉進行10分鐘反應的測試組別（以下稱反應終止點（10分鐘））。
表2
| 測試組別 | 測試樣品 | 反應酵素 | 反應基質 |
| 實驗組（0分鐘） | 5倍稀釋 瓜拿納發酵液 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
| 實驗組（10分鐘） | 5倍稀釋 瓜拿納發酵液 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
| 對照組（0分鐘） | 5倍稀釋 瓜拿納水萃液 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
| 對照組（10分鐘） | 5倍稀釋 瓜拿納水萃液 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
| 控制組（0分鐘） | NaCl-Pi緩衝溶液 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
| 控制組（10分鐘） | NaCl-Pi緩衝溶液 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
於表2中，瓜拿納發酵液及瓜拿納水萃液均是以水進行稀釋，且各測試組別皆進行三重覆實驗。反應酵素為5單位/毫升的α-澱粉分解酶溶液。反應酵素作用的反應基質為1%澱粉溶液。換言之，酵素（即，α-澱粉分解酶）作用的基質為澱粉。
依照表2，首先，分別取200μL的測試樣品（即，5倍稀釋的瓜拿納發酵液、5倍稀釋的瓜拿納水萃液及NaCl-Pi緩衝溶液）至離心管中，接著分別於各離心管中加入200μL的α-澱粉分解酶溶液（5單位/毫升），並將裝有測試樣品及α-澱粉分解酶溶液的離心管進行震盪使測試樣品及α-澱粉分解酶溶液混合均勻以形成待反應溶液，並將裝有待反應溶液的離心管置於25℃環境下反應10分鐘。
接著，將反應起始點（0分鐘）的三組測試組別分別加入400μL的終止劑至離心管中與待反應溶液混合均勻，再分別加入200μL的1%澱粉溶液並於25℃下靜置10分鐘以形成未反應溶液。換言之，在反應起始點（0分鐘）的測試組別中，α-澱粉分解酶不會與澱粉產生反應。
而反應終止點（10分鐘）的三組測試組別則分別加入200μL的1%澱粉溶液至離心管中，使1%澱粉溶液與待反應溶液混合均勻以形成混合溶液。裝有混合溶液的離心管置於25℃下反應10分鐘以形成反應溶液，然後再加入400μL的終止劑與反應溶液混合均勻，以停止澱粉與α-澱粉分解酶反應。
然後，將反應起始點（0分鐘）的三組測試組別（即裝有未反應溶液的離心管）及反應終止點（10分鐘）的三組測試組別（即裝有反應溶液的離心管）置於沸水（100℃）中反應5分鐘，並將6組測試組別的離心管冷卻至室溫（25℃），以形成6組測試組別的待測溶液。
從離心管中分別取出150μL待測溶液與850μL水混合以稀釋待測溶液。接著取200μL稀釋後的待測溶液至96孔盤中，並測量其在540nm下之吸光值。
2-3. 實驗結果
根據下列公式（1）計算各測試組別相對於控制組的澱粉分解酶的酵素活性百分比（%），如圖5所示。換言之，是將控制組的澱粉分解酶的酵素活性百分比視為100%，來計算實驗組與對照組的澱粉分解酶的酵素活性百分比（%）。
公式（1）
% α-Amylase 活性 =
×100% （1）
其中，% α-Amylase活性代表澱粉分解酶酵素活性百分比（%）；A540nm
(Sample10min
-Sample0min
)代表反應終止點（10分鐘）的測試組別在540nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的測試組別在540nm下之吸光值之間的差值，且此測試組別為實驗組或對照組。A540nm
(Control10min
-Control0min
)代表反應終止點（10分鐘）的控制組在540nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的控制組在540nm下之吸光值之間的差值。
請參考圖5。相較於控制組（酵素活性視為100%），實驗組的澱粉分解酶酵素活性百分比為20.9%。換言之，實驗組的澱粉分解酶的酵素活性百分比相對於控制組明顯下降79.1%（約80%）。並且，相較於控制組，對照組的澱粉分解酶的酵素活性百分比為77.7%。換言之，對照組的澱粉分解酶的酵素活性百分比相對於控制組下降22.3%。由此可知，瓜拿納發酵液對於澱粉分解酶的酵素活性的抑制能力明顯高於瓜拿納水萃液對於澱粉分解酶酵素活性的抑制能力。
實驗三：α-葡萄糖苷酶的酵素活性抑制測試
3-1.溶劑配置
0.1莫爾濃度（M）磷酸鈉緩衝溶液（Sodium phosphate buffer，以下簡稱Pi緩衝溶液）：將4.7283克的磷酸一氫鈉（購自J.T.Baker，編號3828-01）及2.0028克的磷酸二氫鈉（購自Sigma，編號04270）混合並溶於400毫升的逆滲透水（RO水）中，並以定量瓶定量至500毫升，以得到酸鹼值（pH）為7.0的Pi緩衝溶液。
2.5mM對硝基苯酚-β-D葡萄糖苷（p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside, PNPG）：秤取0.0377克 PNPG以逆滲透水（RO水）定量至100毫升。
0.2M碳酸鈉（Na2
CO3
）：秤取2.1198克碳酸鈉以RO水定量至100 毫升，作為α-葡萄糖苷酶的終止劑。
0.2單位/毫升（units/ml）α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，購自 sigma Chemical Co.（St. Louis, MO, G5003-100UN））溶液：取3.85毫克的固態α-葡萄糖苷酶以2.0毫升的0.1M Pi緩衝溶液溶解，以得到50 U/毫升之α-葡萄糖苷酶原液。接著，取0.1毫升 50 U/毫升之α-葡萄糖苷酶原液並以RO水定量至25毫升，即可得到0.2 U/毫升α-葡萄糖苷酶溶液。其中每毫克固態的α-葡萄糖苷酶的活性為26單位（units）。
3-2.測試流程
依據下表3進行各測試組別的澱粉分解酶的酵素活性測試。其中，測試組別中實驗組（0分鐘）、對照組（0分鐘）及控制組（0分鐘）代表α-葡萄糖苷酶並無與PNPG反應的測試組別（以下稱反應起始點（0分鐘）），而實驗組（5分鐘）、對照組（5分鐘）及控制組（5分鐘）代表α-葡萄糖苷酶與PNPG進行5分鐘反應的測試組別（以下稱反應終止點（5分鐘））。
表3
| 測試組別 | 測試樣品 | 緩衝液 | 反應酵素 | 反應基質 | 終止劑 |
| 實驗 （0分鐘） | 5倍稀釋 瓜拿納發酵液 | Pi緩衝溶液 | Pi緩衝溶液 | PNPG | 0.2M碳酸鈉 |
| 實驗組 （5分鐘） | 5倍稀釋 瓜拿納發酵液 | Pi緩衝溶液 | α-葡萄糖苷酶 | PNPG | 0.2M碳酸鈉 |
| 對照組 （0分鐘） | 5倍稀釋 瓜拿納水萃液 | Pi緩衝溶液 | Pi緩衝溶液 | PNPG | 0.2M碳酸鈉 |
| 對照組 （5分鐘） | 5倍稀釋 瓜拿納水萃液 | Pi緩衝溶液 | α-葡萄糖苷酶 | PNPG | 0.2M碳酸鈉 |
| 控制組 （0分鐘） | Pi緩衝溶液 | Pi緩衝溶液 | Pi緩衝溶液 | PNPG | 0.2M碳酸鈉 |
| 控制組 （5分鐘） | Pi緩衝溶液 | Pi緩衝溶液 | α-葡萄糖苷酶 | PNPG | 0.2M碳酸鈉 |
於表3中，範例一的瓜拿納發酵液及範例二的瓜拿納水萃液均是以水進行稀釋，且各測試組別皆進行三重覆實驗。反應酵素為0.2單位/毫升α-葡萄糖苷酶溶液。反應酵素作用的反應基質為2.5mM PNPG。
依照表3，首先，分別取160μL的測試樣品（即，5倍稀釋的瓜拿納發酵液、5倍稀釋的瓜拿納水萃液及Pi緩衝溶液）至96孔盤中，接著分別於各孔中加入20μL Pi緩衝溶液以形成待反應溶液。
接著，將反應起始點（0分鐘）的三組測試組別分別加入20μL的Pi緩衝溶液至對應的孔中與待反應溶液混合均勻並於25℃下反應10分鐘。於反應10分鐘後，於每孔中加入20μL的2.5mM PNPG，並將待反應溶液、Pi緩衝溶液及PNPG混合均勻後置於37℃下反應5分鐘以形成0分鐘組反應溶液。於0分鐘組反應溶液中加入80μL終止劑，以中止α-葡萄糖苷酶的活性。接著，於0分鐘組反應溶液與終止劑混合均勻後，測量其在405nm下之吸光值。
而反應終止點（5分鐘）的三組測試組別則分別加入20μL的0.2單位/毫升α-葡萄糖苷酶溶液至對應的孔中與待反應溶液混合均勻，接著，將反應終止點（5分鐘）的三組測試組別置於25℃下反應10分鐘，以活化α-葡萄糖苷酶。於反應10分鐘後，再於每孔中加入20μL的2.5mM PNPG，使活化的α-葡萄糖苷酶與PNPG作用。將待反應溶液、α-葡萄糖苷酶溶液及PNPG混合均勻後置於37℃下反應5分鐘以形成5分鐘組反應溶液。於5分鐘組反應溶液中加入80μL終止劑，以中止α-葡萄糖苷酶的活性。接著，5分鐘組反應溶液與終止劑混合均勻後，測量其在405nm下之吸光值。
3-3. 實驗結果
根據下列公式（2）計算實驗組及對照組的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比（%），如圖6所示。換言之，是將控制組的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比視為100%，來計算實驗組與對照組的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比（%）。
公式（2）
% α-Glucosidase活性=
×100% （2）
其中，% α-Glucosidase活性代表α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比（%）；A405nm
(Sample5min
-Sample0min
)代表反應終止點（5分鐘）的測試組別在405nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的測試組別在405nm下之吸光值之間的差值，且此測試組別為實驗組或對照組。A405nm
(Sample5min
-Sample0min
)代表反應終止點（5分鐘）的控制組在405nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的控制組在405nm下之吸光值之間的差值。
請參考圖6。相較於控制組（酵素活性視為100%），實驗組的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比為0%。換言之，實驗組的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比相對於控制組明顯下降100%，代表瓜拿納發酵液完全抑制α-葡萄糖苷酶的酵素活性。並且，相較於控制組，對照組的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比為10.2%。換言之，對照組相對於控制組的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比下降89.8%。由此可知，瓜拿納發酵液對於α-葡萄糖苷酶的酵素活性的抑制能力明顯高於瓜拿納水萃液對於對於α-葡萄糖苷酶的酵素活性的抑制能力。於此，瓜拿納發酵液具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性之能力。
實驗四：脂肪分解酶基因表現檢測
4-1. 檢測標的及溶液配置
以脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase, ATGL）基因作為脂肪分解酶基因檢測的標的。
於此，所使用的條件培養基（Condition Medium）為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之最低必需培養基α（Minimum Essential Medium Alpha，MEMα，品牌：Gibco)。
4-2. 檢測流程
首先，以每孔1×105
個細胞的細胞數，將小鼠骨髓基質細胞株OP9（購自ATCC®
，編號CRL-2749™
）接種於含有2mL條件培養基的6孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養48小時。接著，於培養48小時候，再將含有OP9細胞的6孔培養盤置於37°C下接續培養7天。並於7-10天的培養期間，每2天更換一次新鮮的2mL條件培養基。並於培養7-10天後，使用顯微鏡（廠牌：ZEISS）觀察各孔中的細胞內的油滴（lipid droplet）形成以確認OP9細胞完全分化成脂肪細胞。
將脂肪細胞分成3個組別：實驗組、對照組以及控制組。移除各組別的條件培養基，並更換成每孔2mL實驗培養基，然後置於37°C下分別接續培養48小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.031vol%範例一中所得到的瓜拿納發酵液的條件培養基。對照組的實驗培養基為含有0.031vol%範例二中所得到的瓜拿納水萃液的條件培養基。控制組的實驗培養基為單純的條件培養基（即不含瓜拿納發酵液或瓜拿納水萃液）。
於培養48小時後，移除各孔中的實驗培養基並以PBS清洗一次。去除PBS，接著以RNA純化套組（RNA purification kit，品牌：GeneMark）從各組別的脂肪細胞萃取出RNA。接著，透過反轉錄酶套組（SuperScript™ Reverse Transcriptase kit ，品牌：Invitrogen）將各組別萃取出的RNA反轉錄為cDNA，並透過ABI系統（ABI StepOne Plus™ System，品牌：Applied Biosystems）配合二引子（Primer）（如表4所示，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2）量化脂肪細胞內ATGL基因的表現量，並以2- ΔΔCt
方法進行基因定量，如圖7所示。需要特別說明的是，圖7中的基因表現是以相對表現倍率數呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖7中，「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05。
表4
| 引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
| ATGL-F | SEQ ID NO:1 | GGATGGCGGCATTTCAGACA |
| ATGL-R | SEQ ID NO:2 | CAAAGGGTTGGGTTGGTTCAG |
4-3. 實驗結果
請參閱圖7。控制組的ATGL基因的表現量視為1.00（即控制組的ATGL基因的表現量為100%）。相較於控制組，實驗組的ATGL基因的表現量為3.30，而對照組的ATGL基因的表現量為1.57。於此，實驗組的ATGL基因的表現量相較於控制組有顯著地提高，且實驗組的ATGL基因的表現量相較於對照組亦有明顯提高。由此可知，瓜拿納發酵液能有效地提高脂肪分解酶基因的表現，進而提高脂肪分解酶。換言之，瓜拿納發酵液具有分解脂肪的功能，進而避免脂肪累積，達成減少受體的脂肪形成及減脂的功效。並且，瓜拿納透過微生物發酵後可能產出較瓜拿納水萃液多的分解脂肪的活性成分。
實驗五：脂肪堆積檢測
5-1. 溶劑配置
於此，所使用的前脂肪細胞增殖培養基（pre-adipocyte expansion medium）為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之最低必需培養基α（Minimum Essential Medium Alpha，MEMα，品牌：Gibco)。所使用的分化培養基（differentiation medium）為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之MEMα（品牌：Gibco)。並且，將油-紅O染色試劑（品牌：Sigma）徹底溶解於100%異丙醇（isopropanol，供應商：ECHO）以配製3mg/mL之油-紅O染色試劑的儲備溶液。為獲得可供使用的油-紅O工作溶液（oil-red O working solution），於使用前即時將油-紅O染色試劑的儲備溶液以二次水（ddH2
O）稀釋至濃度1.8mg/mL，即為60%油-紅O染色試劑的儲備溶液。
5-2. 檢測流程
首先，以每孔8×104
個細胞的細胞數，將小鼠骨髓基質細胞株OP9（購自ATCC®
，編號CRL-2749™
）接種於含有500μL前脂肪細胞增殖培養基的24孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL分化培養基。於培養7天後，使用顯微鏡（廠牌：ZEISS）觀察各孔中的細胞內的油滴（lipid droplet）形成以確認細胞完全分化成脂肪細胞，供後續實驗使用。
在培養24小時後，將脂肪細胞分成3個組別：實驗組、對照組以及控制組。移除各組別的分化培養基，並更換成每孔500μL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL實驗培養基。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.062vol%範例一中所得到的瓜拿納發酵液的分化培養基。對照組的實驗培養基為含有0.062vol%範例二中所得到的瓜拿納水萃液的分化培養基。控制組的實驗培養基為單純的分化培養基（即不含瓜拿納發酵液或瓜拿納水萃液）。
接著，移除各孔中的實驗培養基並以1xPBS潤洗二次。繼而，於各孔內添加1mL的10%甲醛（formaldehyde，供應商：ECHO）並於室溫下培養30分鐘，藉以固定細胞。之後，移除各孔內的甲醛並以1mL PBS對各孔潤洗二次。於再次潤洗後，添加1mL的60%異丙醇至每孔中並作用1分鐘。接著，移除異丙醇，再添加1mL油-紅O工作溶液並於室溫下作用1小時。
於作用1小時候，移除油-紅O工作溶液並以1mL的60%異丙醇快速退染5秒。於退染後，染色後的細胞以顯微鏡拍照以取得染色後的細胞的顯微照片，如圖8所示。
接著，加入100%異丙醇至各孔中，並置於振盪器（shaker）上反應10分鐘以溶解染劑。然後，從各孔中取100μL前述之染劑-異丙醇溶液至96孔培養盤並於510nm的波長下以ELISA讀取儀（廠牌：BioTek）讀取各孔的吸光值（OD510
）。
於量測後，藉由將所測得的吸光值代入下列公式（3）而計算出脂質油滴相對含量（%）。換言之，於此，是將控制組的脂質油滴含量視為1（即控制組的相對脂質油脂含量為100%）來計算各組別的脂質油滴相對含量（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖9所示。在圖9中，「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05。
公式（3）
脂質油滴相對含量（%）＝(OD510
sample/OD510
control)×100% （3）
其中，OD510
sample代表欲換算之組別的吸光值，而OD510
control代表控制組的吸光值。
5-3. 實驗結果
請參閱圖8，相較於控制組及對照組，實驗組的脂肪細胞的油滴明顯減少。請參閱圖9，相較於控制組，實驗組的脂質油滴相對含量為77.96%，且其可減少22.04%的油滴量。於此，實驗組的脂質油滴相對含量相較於控制組有顯著地降低。相較於控制組，對照組的脂質油滴相對含量為95.05%，且其可減少4.95%的油滴量。於此，實驗組的脂質油滴相對含量相較於對照組的脂質油滴相對含量亦有明顯下降。由此可知，瓜拿納發酵液能有效地抑制脂肪累積，具有減少受體的脂肪形成的功能，進而達成減脂之功效。並且，瓜拿納透過微生物發酵後可能產出較瓜拿納水萃液多的減脂活性成分。
實驗六：人體檢測
6-1. 檢測流程
令8位受試者每日飲用5mL瓜拿納發酵飲品（其含有12 vol%範例一的瓜拿納發酵液與88vol%水），連續飲用4週。並且，於飲用前（即第0週）及飲用4週後（即第4週），以體重計（廠牌： TANITA BC545N 十合一體組成計）測量此些受試者體重以及以布尺測量此些受試者的腰圍。並且，8位受試者（年齡介於20-55歲）的BMI大於或等於24並小於27，且受試者男性的體脂率大於25%、受試者女性的體脂率大於30%。
需要特別說明的是，第0週的量測結果與第4週的量測結果之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖10及圖11所示。在圖10及圖11中，「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05，且「**」代表在與第0週比較下其p值小於0.01。
6-2. 檢測結果
請參閱圖10及圖11。8位受試者的平均體重從68公斤下降至67.3公斤（如圖10所示），且此些受試者的平均腰圍從85.8公分減少至82.9公分（如圖11所示）。換言之，相比飲用前（第0週），持續4週飲用含有瓜拿納發酵液的瓜拿納發酵飲品後可使此些受試者的平均體重顯著地下降0.7公斤，以及使此些受試者的平均腰圍顯著地減少2.9公分。由此可知，長期使用瓜拿納發酵液可改善受體的體重及腰圍，即瓜拿納發酵液具瘦身減脂之功效。
綜上所述，根據本發明任一實施例的瓜拿納發酵液的製備方法可製備一瓜拿納發酵液。在一些實施例中，，所製備的瓜拿納發酵液可用於製備減少受體的脂肪形成的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：提升抗氧化活性、抑制澱粉分解酶活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性、提高脂肪分解酶基因的表現亮、抑制脂肪累積、減少受體的脂肪形成以及減脂瘦身。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
S100~S500:步驟
圖1是瓜拿納發酵液的製備流程圖；
圖2是圖1步驟S100的細部的流程圖；
圖3是圖1步驟S300的細部的流程圖；
圖4是瓜拿納發酵液的多酚含量測量結果圖；
圖5是澱粉分解酶的酵素活性相對測量結果圖；
圖6是α-葡萄糖苷酶的酵素活性相對測量結果圖；
圖7是ATGL基因的表現倍率結果圖；
圖8是油紅O染色照片；
圖9是脂質油脂含量的相對測量結果圖；
圖10是第0週及第4週的體重數據結果圖；以及
圖11是第0週及第4週的腰圍數據結果圖。
S100~S500:步驟
Claims (8)
- 一種瓜拿納發酵液的製備方法，包括：提供一培養液，該培養液包括以1重量份的瓜拿納(Paullinia cupana)及10重量份的水所形成的一瓜拿納萃取液及該瓜拿納萃取液總重的10%的葡萄糖；將0.1%的酵母菌添加至該培養液內發酵1日後形成一第一初發酵液，其中該酵母菌為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；添加0.05%的乳酸菌至該第一初發酵液內發酵1日後形成一第二初發酵液，其中該乳酸菌為胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)；添加5%的醋酸菌至該第二初發酵液內發酵5日後形成一第三初發酵液，其中該醋酸菌為乙酸醋酸菌(Acetobacter aceti)；過濾該第三初發酵液以得到一發酵原液；以及調整該發酵原液以形成該瓜拿納發酵液。
- 如請求項1所述的瓜拿納發酵液的製備方法，其中過濾該第三初發酵液的步驟包括：在60℃下減壓濃縮及以200mesh過濾該第三初發酵液。
- 如請求項1所述的瓜拿納發酵液的製備方法，其中該提供該培養液的步驟包括：混合該瓜拿納及該水以形成一瓜拿納基液；將該瓜拿納基液於95℃下萃取1小時以得到該瓜拿納萃取液；以及將該瓜拿納萃取液與該葡萄糖混合以得到該培養液。
- 如請求項1所述的瓜拿納發酵液的製備方法，其中調整該發酵原液以形成該瓜拿納發酵液的步驟為調整該發酵原液的糖度以形成該瓜拿納發酵液。
- 如請求項1所述的瓜拿納發酵液的製備方法，其中該瓜拿納發酵液的總多酚含量為1600μg/ml以上。
- 一種瓜拿納發酵液用於製備一減少一受體的脂肪形成之組合物之用途，其中該瓜拿納發酵液是以如請求項1之製備方法所製備而成，該瓜拿納發酵液用以提升一脂肪分解酶(ATGL)基因的表現量以減少脂肪形成。
- 一種瓜拿納發酵液用於製備一減少一受體的脂肪形成之組合物之用途，其中該瓜拿納發酵液是以如請求項1之製備方法所製備而成，該瓜拿納發酵液用以減少脂質油滴的生成以減少脂肪形成。
- 一種瓜拿納發酵液用於製備一減少一受體的脂肪形成之組合物之用途，其中該瓜拿納發酵液是以如請求項1之製備方法所製備而成，該瓜拿納發酵液用以降低澱粉分解酶及α-葡萄糖苷酶的活性以及減少澱粉分解成醣類後的熱量吸收以減少脂肪形成。
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