TWI830151B - 抗GPRC5DxBCMAxCD3三特異性抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明關於三特異性抗原結合蛋白，更具體地，關於包含特異性結合GPRC5D和BCMA兩種腫瘤抗原和T細胞表面抗原CD3的三特異性抗體，以及包含其的醫藥組成物、製備方法和用途。
Description
本發明關於三特異性抗原結合蛋白，更具體地，關於包含特異性結合GPRC5D和BCMA兩種腫瘤抗原和T細胞表面抗原CD3的三特異性抗體，以及包含其的醫藥組成物、製備方法和用途。
T細胞雙特異性抗體(BsAb)已經被用於腫瘤治療。此類抗體可以在細胞毒性T淋巴細胞與腫瘤細胞之間形成突觸，誘導腫瘤細胞破壞。BsAb通常關於針對腫瘤相關抗原(TAA)和T細胞表面抗原(也稱作T細胞銜接抗原，TEA)的雙重靶向。然而，基於BsAb的治療策略典型地依賴於腫瘤相關抗原在待治療的腫瘤細胞上的分佈。這就導致治療對於患者群體的選擇性和治療的局限性。此外，研究也顯示，靶向單個TAA位點的治療形式可能會因腫瘤的逃逸機制而引起疾病的復發，從而限制治療的有效性。
已經提出了開發三特異性和/或四特異性抗體來有效募集免疫細胞到腫瘤部位和改善治療的功效。為此，近年來，多種多價、多特異性抗體形式(format)被描述。然而，不同治療產品在治療功能性和治療行為上的要求具有多樣性，決定了並不存在可以適用於大多數不同期望分子組合的“最佳形式”。因此，
在實現多特異性時，需要考慮多種因素，包括，例如不同靶抗原的空間分佈或大小，以及腫瘤細胞表面的腫瘤相關抗原表達密度。在許多情況下，對於特定靶抗原組合有效的抗體形式，必須藉由產生和比較不同的抗體形式的功能性來鑑定。
由於GPRC5D和BCMA在腫瘤中的表達呈非相關性，本發明人提出，組合靶向GPRC5D和BCMA的多特異性抗體將既可以覆蓋GPRC5D陽性腫瘤患者，也可以覆蓋BCMA陽性腫瘤患者，同時可以避免由於單一抗原丟失帶來的復發，從而達到提高患者覆蓋率和改善治療功效的目的。
為了實現這一目的，本發明人提出了靶向GPRC5D/BCMA/CD3的三特異性抗體，並對多種GPRC5DxBCMAxCD3 format進行了深入研究。藉由調節兩種TAA抗原(GPRC5D及BCMA)和T細胞表面抗原(CD3)之間的組合方式和距離，調控T細胞銜接器(T cell engager)抗體在介導T細胞激活和殺傷效能中的作用，本發明人成功實現了多靶點組合，減少了多藥聯用的需求。在此基礎，進一步地藉由Fc段採用Knob-in-Hole(結入扣)技術，減少重鏈錯配；並藉由胞外氧化還原的手段，解決輕鏈錯配的問題，本發明的抗體也具有良好的可製備性和良好的可成藥性。
因此，在一方面，本發明提供了具有上述優勢的三特異性Y型抗體分子，其包含特異性結合GPRC5D、BCMA和CD3的抗原結合位點，且包含：兩個抗體臂、位於抗體臂C端的莖，以及綴合部件，其中該綴合部件綴合在抗體臂和/或莖C端。
再一方面，本發明提供特異性結合GPRC5D的抗體分子，其包含
選自如下的CDR序列組合：按照HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的順序，SEQ ID NO：1-6；7-12；13-18或19-24。本發明的抗體分子以高親和力結合GPRC5D，並阻斷細胞中由GPRC5D介導的信號傳導。
再一方面，本發明也提供本發明抗體分子的編碼核酸、載體和宿主細胞；以及本發明抗體分子的用途，尤其是治療GPRC5D陽性和/或BCMA陽性腫瘤，例如多發性骨髓瘤的方法和用途。
結合以下附圖一起閱讀時，將更好地理解以下詳細描述的本發明的較佳實施方案。出於說明本發明的目的，圖中顯示了目前較佳的實施方案。然而，應當理解本發明不限於圖中所示實施方案的精確安排和手段。
圖1示意性顯示：設計的Format_1、2、6和7的三特異性抗體分子的結構。
圖2示意性顯示，實施例中使用的對照雙特異性抗體分子的結構。
圖3顯示，Jurkat-NFAT-Luc報告系統檢測示例抗體Ts-F2-1和-2介導的T細胞激活。
圖4顯示，Jurkat-NFAT-Luc報告系統檢測示例抗體Ts-F2-3以及Ts-F6介導的T細胞激活。
圖5顯示，Jurkat-NFAT-Luc報告系統檢測示例抗體Ts-F2-4和5介導的T細胞激活(A-D)；和Jurkat-NFAT-Luc報告系統檢測示例抗體Ts-F2-4、5和6介導的T細胞激活(E-F)。
圖6顯示，Jurkat-NFAT-Luc報告系統檢測示例抗體Ts-F7-1和7-2介
導的T細胞激活。
圖7顯示，Jurkat-NFAT-Luc報告系統檢測示例抗體Ts-F7-3和7-4介導的T細胞激活。
圖8顯示，示例抗體介導的PBMC中CD4+T細胞的激活。
圖9顯示，示例抗體介導的PBMC中CD8+T細胞的激活(B)。
圖10顯示，示例抗體介導的PBMC對H929細胞的殺傷作用。
圖11顯示，示例抗體誘導的PBMC對NCl-H929細胞的殺傷過程伴隨的細胞因子釋放量。
圖12顯示，示例抗體在H929荷瘤人源化小鼠模型中的抑瘤作用。
圖13顯示，不同多發性骨髓瘤細胞表面的GPRC5D和BCMA表達水平。
除非另外限定，否則本文中所用的全部技術與科學術語具有如本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的相同含義。本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻藉由引用的方式完整地併入。此外，本文中該材料、方法和例子僅是說明性的並且不意在是限制性的。本發明的其他特徵、目的和優點將從本說明書及圖式並且從後附的申請專利範圍中顯而易見。
I.定義
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步
驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。
術語“抗體”在本文中以最廣意義使用，指包含抗原結合位點的蛋白質，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、單鏈抗體、完整抗體和抗體片段。
術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指天然存在的包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。
術語“抗原結合片段”是比完整或完全抗體的胺基酸殘基數要少的完整或完全抗體的一部分或一段，其能結合抗原或與完整抗體(即與抗原結合片段所來源的完整抗體)競爭結合抗原。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、單鏈Fv、雙體抗體(diabody)、單結構域抗體(sdAb)。該Fab片段是一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，例如，藉由木瓜蛋白酶消化完全抗體能夠獲得Fab片段。此外，藉由胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下面消化完全抗體產生F(ab')2，其為Fab’的二聚體，是二價的抗體片段。F(ab')2可以在中性條件下藉由破壞鉸鏈區中的二硫鍵而被還原，由此將F(ab')2二聚體轉化為Fab'單
體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區的Fab片段(其它抗體片段的更詳細的描述請參見：基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993))。該Fv片段由抗體單臂的VL和VH結構域組成。另外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但是使用重組方法，可以將它們藉由能夠使這兩個結構域作為單條蛋白鏈產生的合成性連接肽連接，在該單條蛋白鏈中VL區和VH區配對以形成單鏈Fv。可以藉由化學方法、重組DNA方法或蛋白酶消化法獲得該抗體片段。
如本文所用的術語“抗原結合位點”與“抗原結合結構域”可以互換使用，表示抗體分子中與抗原實際結合的區域。較佳地，用於本發明抗體分子的抗原結合位點包括由抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體重鏈可變結構域(VH)組成的VH/VL對，該VH/VL對可以包含單一多肽鏈中或包含在分離的兩條多肽鏈中。在較佳的實施方案中，本發明的抗體分子包含至少一個特異結合GPRC5D的抗原結合位點、至少一個特異結合BCMA的抗原結合位點，以及至少一個特異結合CD3的抗原結合位點。在一個實施方案中，本發明抗體為三價三特異性抗體，或4價三特異性抗體，或6價三特異性抗體。
如本文所用，術語“單特異性”抗體指具有一個或多個結合位點的抗體，該位點中的每一個位點與相同抗原的相同表位結合。如本文所用，術語“多特異性”抗體指具有至少兩個抗原結合位點的抗體，該至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。本文提供的抗體為針對GPRC5D、BCMA和CD3的三特異性抗體。
術語“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗體的結構的蛋白質。例如，IgG類免疫球蛋白是由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成的約150,000道
爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條免疫球蛋白重鏈具有一個重鏈可變區(VH)，也稱作重鏈可變結構域，隨後是三個重鏈恆定結構域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條免疫球蛋白輕鏈具有一個輕鏈可變區(VL)，也稱作輕鏈可變結構域，隨後是一個輕鏈恆定結構域(CL)。免疫球蛋白的重鏈可以歸屬5個類別之一，稱作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些類別可以進一步劃分成亞類，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列而劃分成兩種類型之一，稱作κ和λ。IgG免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子和兩個二聚化的Fc區組成。
術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗體與抗原結合的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區。在一些情況下，單個VH或VL結構域可以足以給予抗原結合特異性。
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”或“高變區”，是抗體可變結構域中在序列上高度可變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR從N-端開始順序編號，通常稱作CDR1、CDR2和CDR3。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR也稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR則稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，可以採用本領域公知的多種方案確定其CDR序列，例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia，基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.
Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(國際免疫遺傳學信息系統，萬維網imgt.cines.fr/)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義(North等，“A New Clustering of Antibody CDR Loop Con格式ions”，Journal of Molecular Biology，406，228-256(2011))。
例如，使用Kabat和Chothia編號的CDR區域的不同定義範圍。
除非另有說明，否則在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。
CDR也可以基於與參考CDR序列具有相同的Kabat編號位置而確定。除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。
術語“Fc結構域”或“Fc區”在本文中用來定義免疫球蛋白重鏈的含有至少一部分恆定區的C端區域。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然的免疫球蛋白“Fc結構域”包含兩個或三個恆定結構域，即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。例如，在天然抗體中，免疫球蛋白Fc結構域包含源自IgG、IgA和IgD類抗體的兩條重鏈的第二和第三恆定結構域(CH2結構域和CH3結構域)；或者包含源自IgM和IgE類抗體的兩條重鏈的第二、第三和第四恆定結構域(CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域)。除非本文中另外說明，否則Fc區或重鏈恆定區中的胺基酸殘基編號根據如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中該EU編號體系(也稱作EU索引)進行編號。
術語“效應子功能”指隨免疫球蛋白同種型變動的歸因於免疫球蛋白Fc區的那些生物學活性。免疫球蛋白效應子功能的例子包括：C1q結合和補體依賴的細胞毒性(CDC)、Fc受體結合作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞攝取抗原、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)和B細胞活化。
術語“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)將恆定區或其部分改變、替換或交換，從而抗原結合位點與不同的或改變的類別、效應子功能和/或物種的恆定區或賦予嵌合抗體新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物)等連接；或(b)將可變區或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區改變、替換或交換。例如，小鼠抗體可以藉由將其恆定區更換為來自人免疫球蛋白的恆定區進行修飾。由於更換為人類恆定區，該嵌合抗體可以保留其在識別抗原方面的特異性，同時如與原始小鼠抗體相比，具有在人類中降低的抗原性。
“人源化抗體”是一種保留非人類抗體(例如小鼠單株抗體)的抗原特異性反應性，同時作為治療藥對人施用時免疫原性較低的抗體。這可以例如藉由保留非人類抗原結合位點並且抗體的剩餘部分替換成它們的人類相應部分(即，恆定區以及可變區中不參與結合的部分為人類抗體的相應部分)來實現。參見，例如Padlan,Anatomy of the antibody molecule，Mol.Immun.,1994，31：169-217。人類抗體工程化技術的其他例子包括但不限於US 5,766,886中公開的Xoma技術。
如本文所用，術語“結合”或“特異性結合”意指結合作用對抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。抗原結合位點與特定抗原結合的能力可以藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域已知的常規結合測定法測定。
“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(KD)代表，解離常數是解離速率常數和締合速率常數(分別是kdis和kon)的比例。親和力可以
由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。
胺基酸序列的“同一性百分數(%)”是指將候選序列與本說明書中所示的具體胺基酸序列進行比對並且如有必要的話為達到最大序列同一性百分數而引入空位後，並且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分時，候選序列中與本說明書中所示的具體胺基酸序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基百分數。在一些實施方案中，本發明考慮本發明抗體分子的變體，該變體相對於在本文中具體公開的抗體分子及其序列而言具有相當程度的同一性，例如同一性為至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%或更高。該變體可以包含保守性修飾。
對於多肽序列，“保守性修飾”包括對多肽序列的置換、缺失或添加，它們導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。這類保守性修飾的變體相對於本發明的多態性變體、物種間同源物和等位基因而言是附加的並且不排斥它們。以下8組含有互為保守替換的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、穀胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)***酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參閱例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些實施方案中，術語“保守序列修飾”用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。
術語“宿主細胞”指已經向其中引入外源多核苷酸的細胞，包括這類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，這包括原代轉化的細胞
和從其衍生的子代。宿主細胞是可以用來產生本發明抗體分子的任何類型的細胞系統，包括真核細胞，例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞；和原核細胞，例如，大腸桿菌細胞。宿主細胞包括培養的細胞，也包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物組織或動物組織內部的細胞。
術語“表達載體”是指包含重組多核苷酸的載體，其包含有效連接要表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包含足夠的用於表達的順式作用元件；用於表達的其它元件可以由宿主細胞提供或在體外表達系統中。表達載體包括本領域已知的所有那些，包括被摻入重組多核苷酸的黏粒、質粒(例如，裸的或包含在脂質體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，個體是人。
術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。在一些實施方案中，本發明的抗體分子用來延緩疾病發展或用來減慢疾病的進展。
術語“抗腫瘤作用”或抑瘤作用指可以藉由多種手段展示的生物學效果，包括但不限於例如，腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活減少。術語“腫瘤”和“癌症”在本文中互換地使用，涵蓋實體瘤和液體腫瘤。
術語“GPRC5D”指腫瘤相關抗原G蛋白偶聯受體家族C組5成員D(例如，登錄號UniProt Q9NZD1下的人GPRC5D蛋白)。在本文中，“針對GPRC5D的抗原結合特異性”是指特異性結合GPRC5D的抗體或抗體片段，例如scFv或Fab。在一個實施方案中，藉由流式細胞術檢測，本發明抗體分子中結合GPRC5D的抗原結合位點可以對表達GPRC5D的細胞具有高親和力結合活性，例如，1-100nM，如20-60nM的EC50值。在一個實施方案中，該抗原結合特異性對人和猴GPRC5D具有交叉反應性。
術語“BCMA”指腫瘤相關抗原B細胞成熟抗原，也稱為BCMA，TR17_人，TNFRSF17(例如，登錄號UniProt Q02223下的人BCMA蛋白)。在本文中，“針對BCMA的抗原結合特異性”是指特異性結合BCMA的抗體或抗體片段，例如scFv或Fab。在一個實施方案中，藉由生物膜層光學干涉技術檢測，本發明抗體分子中結合BCMA的抗原結合位點可以對BCMA具有高親和力結合活性，例如，0.1-10nM，如0.1-5nM的KD值。在一個實施方案中，該抗原結合特異性對人和猴BCMA具有交叉反應性。
術語“CD3”指T細胞銜接抗原T細胞表面糖蛋白CD3(例如，登錄號UniProt P07766下的人CD3蛋白)。在本文中，“針對CD3的抗原結合特異性”是指特異性結合CD3的抗體或抗體片段，例如scFv或Fab。在一個實施方案中，藉由生物膜層光學干涉技術檢測，本發明抗體分子中結合CD3的抗原結合位點可以對CD3 epsilon鏈具有高親和力結合活性，例如，1-50nM，如0.1-5nM的KD值。較佳地，在本發明三特異性抗體分子中，使用高親和力CD3抗原結合位點，例如具有小於50nM的KD值。在一個實施方案中，該抗原結合特異性對人和猴CD3具有交叉反應性。
在描述本發明抗體結構時，術語“N端”指N端的最末胺基酸，術語“C端”指C端的最末胺基酸。
“knob-in-hole”突變或“結入扣”突變在本文中用於指，利用“結入扣”技術，在第一Fc多肽和第二Fc多肽中分別引入突變，以在第一Fc多肽的界面上與在第二Fc多肽的界面上形成凸起(“結(knob)”)和互補的空穴(“扣(hole)”)。本領域已知，“結入扣”技術可在抗體分子的不同鏈之間改造界面，以促進抗體分子的各鏈正確締合。通常，該技術涉及在一條鏈的界面引入“凸起”，在欲與之配對的另一條鏈的界面引入相應的“空穴”，使得凸起可置於空穴中。一個較佳的界面包含一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域和欲與之配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域。可藉由將來自一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面的小胺基酸側鏈替換為較大的側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)來構建凸起。藉由將大胺基酸側鏈替換為較小的側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)，在欲配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面構建與凸起相同或相似大小的補償性空穴。另一可選的界面是上文所述Fab片段的包含輕鏈的CL結構域和重鏈的CH1結構域，藉由構建凸起-空穴相互作用促進Fab片段的兩條鏈之間發生正確的異二聚化。
“單鏈可變片段”或“scFv”在本文中用於指，包含由接頭連接的重鏈可變結構域VH和輕鏈可變結構域VL的單鏈抗體片段，其中VH和VL配對形成抗原結合位點。“二硫鍵穩定的單鏈可變片段”或“dsscFv”在本文中用於指，經二硫鍵穩定化的單鏈可變片段，其中，藉由人為地將半胱胺酸突變引入VH結構域和VL結構域中，該scFv片段在VH和VL結構域之間形成二硫鍵連接。
“Fv片段”在本文中用於指，包含重鏈可變結構域VH和輕鏈可變結
構域VL的抗體片段。“二硫鍵穩定的可變片段”或“dsFv”在本文中用於指，藉由在VH和VL結構域之間人為引入的二硫鍵來穩定的Fv片段。
“單域抗體”或“sdAb”在本文中用於指，由單個可變抗體結構域，例如由VH或VL組成的抗體片段，例如衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、衍生自魚類IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR)。單域抗體的單個可變結構域不需要與另一可變結構域相互作用以識別靶抗原。單結構域抗體的實例包括源自駱駝科(美洲駝和駱駝)和軟骨魚(例如護士鯊)的單結構域抗體。
“Fab片段”或“Fab”在本文中用於指，由兩條多肽鏈組成的、包含免疫球蛋白重鏈可變結構域VH、重鏈恆定結構域CH1、輕鏈可變結構域VL和輕鏈恆定結構域CL的免疫球蛋白片段，其中，一條多肽鏈從N端到C端包含VH和選自CH1和CL的一個恆定區，另一條多肽鏈從N端到C端包含VL和選自CL和CH1的另一恆定區，其中該VH結構域和VL結構域配對形成抗原結合位點。在本文中，當Fab的一條多肽鏈包含與CL連接的VH且另一多肽鏈包含與CH1連接的VL時，該Fab也稱作crossFab。
在本文中，“單鏈Fab”或“scFab”用於指，將Fab片段的兩條鏈藉由接頭連接而形成的單鏈多肽。
在本發明的一些實施方案中，本發明抗體可以包含選自以下的Fab片段：(i)由包含VH-CH1的一條鏈與包含VL-CL的一條鏈組成的Fab；和(ii)由包含VH-CL的一條鏈和包含VL-CH1的一條鏈組成的crossFab。在本發明的另一些實施方案中，本發明抗體可以包含選自以下的單鏈Fab片段：(i)包含VH-CH1-接頭-VL-CL的單鏈Fab；和(ii)包含VH-CL-接頭-VL-CH1的單鏈Fab。
在本文中，免疫球蛋白恆定結構域可以根據抗體分子的預期功能
進行選擇。例如，恆定結構域可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結構域，尤其是人IgG的免疫球蛋白恆定結構域，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定結構域，較佳人IgG1的恆定結構域。作為一個例子，抗體的Fab片段可以包含來自IgG1的CH和CL恆定結構域。作為再一例子，抗體的Fc區可以包含來自IgG1的CH2和CH3結構域。
在本文中，術語“柔性連接肽”或“連接肽”或“接頭”是指由胺基酸組成的短胺基酸序列，例如單獨或組合使用的甘胺酸(G)和/或絲胺酸(S)和/或蘇胺酸殘基(T)，或來自免疫球蛋白的鉸鏈區。在一個實施方案中，連接肽具有5-50個胺基酸長度，例如，10、15、20、25、30個胺基酸長度。在一個實施方案中，連接肽包含胺基酸序列(G4S)n，其中n是等於或大於1的整數，例如，n是2、3、4、5、6或7的整數。在一個實施方案中，連接肽包含胺基酸序列TS(G4S)n、其中n是等於或大於1的整數，例如，n是2、3、4、5、6或7的整數。在再一實施方案中，連接肽為來自免疫球蛋白的鉸鏈區，例如包含“CPPC”的鉸鏈區胺基酸序列，例如，胺基酸序列“EPKSCDKTHTCPPCP”(SEQ ID NO：114)或“EPKSSDKTHTCPPCP”(SEQ ID NO：115)。可以用於本發明抗體分子連接各結構域的連接肽還可以是，例如但不限於，如下胺基酸序列：GGG(SEQ ID NO：116)、DGGGS(SEQ ID NO：117)、TGEKP(SEQ ID NO：118)、GGRR(SEQ ID NO：119)、EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO：120)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：121)、GGRRGGGS(SEQ ID NO：122)、LRQRDGERP(SEQ ID NO：123)、LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO：124)和GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：125)。或者，可以使用計算機程序模擬蛋白和肽的三維結構，或藉由噬菌體展示方法，來合理地設計合適的柔性連接肽。
Ⅱ.本發明的三特異性抗體分子
本發明的三特異性抗體分子為Y型抗體分子。在本文中，術語“Y型抗體分子”是指包含兩條抗體臂與一個莖部的Y型結構抗體分子，其中兩個抗體臂形成Y型結構的兩個分支，並各自連接在由兩個抗體Fc結構域配對形成的Y型結構的莖部上。一種典型的Y型抗體分子是免疫球蛋白IgG分子。免疫球蛋白IgG分子的Y型結構由三個區域組成：兩個抗體臂(Fab)和一個莖部(Fc)，其中，富有彈性的鉸鏈區(Hinge)將抗體的莖部(Fc)與抗體臂(Fab)相連。在IgG分子中，兩條臂可用於抗原的特異性結合，而莖部決定了抗體的型別和功能特性。在本文中，Y型抗體分子也涵蓋與IgG分子具有相同或類似的Y型結構的分子，例如在抗體的抗體臂和/或莖上帶有綴合部件的Y型分子。較佳地，本發明的抗體分子是帶有綴合部件的三特異性抗體分子。
在本發明的Y型抗體分子中，抗體臂可以由Fab、scFv、sdAB等抗原結合結構域構成，且構成兩個抗體臂的抗原結合結構域可以靶向相同或不同的抗原和/或表位，具有相同或不同的結合特異性。在本發明的Y型抗體分子中，抗體分子的莖可以由配對的兩個免疫球蛋白Fc結構域組成，其中該Fc結構域可以各自獨立地含有或不含有突變。當抗體分子為非對稱IgG樣分子時，較佳地，莖部的兩個Fc結構域包含利於其配對和二聚化的突變，例如，互補的“結入扣”突變。此外，莖部的Fc結構域也可以包含其它突變，例如半胱胺酸突變(以利於在第一Fc和第二Fc間形成二硫鍵連接)，電荷配對突變；和/或降低或消除效應子功能的突變(例如，降低或消除ADCC活性的突變，例如L234A/L235A突變組合)。本發明的Y型抗體分子的兩個抗體臂可以直接或藉由連接肽分別共價連接在莖的各一個Fc結構域上，較佳地，臂藉由免疫球蛋白的鉸鏈區連接在莖Fc結構域
上。
除了臂和莖外，本發明的Y型抗體分子還較佳地包含綴合在臂和/或莖上的綴合部件，該綴合部件包含額外的抗原結合結構域，例如Fab、scFv、sdAB，較佳scFv。綴合部件中的抗原結合結構域可以賦予不同於抗體臂的抗原結合特異性。例如，Y型分子的兩個抗體臂可以包含分別提供第一和第二抗原結合特異性的抗原結合結構域，而Y型分子的綴合部件包含提供第三抗原結合特異性的抗原結合結構域，且第一、第二和第三抗原結合特異性各不相同。或者，Y型分子的兩個抗體臂可以包含提供第一抗原結合特異性的抗原結合結構域，而Y型分子的綴合部件包含提供第二和第三抗原結合特異性的抗原結合結構域，且第一、第二和第三抗原結合特異性各不相同。
在本發明的Y型抗體分子中，第一、第二和第三抗原結合特異性為分別針對選自CD3、BCMA和GPRC5D的不同抗原結合特異性。例如，第一和第二抗原結合特異性可以分別針對選自GPRC5D和BCMA的不同腫瘤相關抗原(TAA)；第三抗原結合特異性可以針對T細胞表面抗原(TEA)CD3。或者，第一(或第二)和第三抗原結合特異性可以分別針對選自GPRC5D和BCMA的不同腫瘤相關抗原(TAA)，而第二(或第一)抗原結合特異性可以針對T細胞表面抗原(TEA)。
根據臂、莖和綴合部件的結構，本發明的Y型抗體分子可以包含至少2條多肽鏈，例如2條或4條多肽鏈。在本文中，包含莖Fc結構域的多肽鏈稱作重鏈，對應地不包含Fc結構域的多肽鏈稱作輕鏈。因此，在一些實施方案中，本發明的Y型分子是包含第一重鏈多肽鏈與第二重鏈多肽鏈的二鏈分子，在另一些實施方案中，本發明的Y型分子是包含兩條重鏈多肽鏈和兩條輕鏈多肽鏈的四鏈分子。在包含綴合部件的本發明Y型分子中，綴合部件可以綴合在抗體分子的
重鏈多肽鏈上(例如莖部Fc結構域的C末端)，或可以綴合在抗體分子的輕鏈多肽鏈上(例如，包含Fab抗原結合位點的抗體臂的Fab輕鏈的C末端)。因此，例如，本發明抗體可以包含兩條重鏈多肽鏈和兩條輕鏈多肽鏈，其中第一重鏈和第一輕鏈配對形成抗體的一個抗體臂，第二重鏈和第二輕鏈配對形成抗體的另一抗體臂，且第一重鏈的Fc結構域和第二重鏈的Fc結構域配對形成抗體的莖，其中第一重鏈或第二重鏈在C端還包含形成抗體綴合部件的單鏈抗體片段(如scFv)，或第一輕鏈和第二輕鏈在C端還包含形成抗體綴合部件的單鏈抗體片段(如scFv)。
在一個方面，因此，本發明提供三特異性Y型抗體分子。本發明的Y型抗體分子具有下式的結構：
(M1：M2-(X1)p)-Fc：：Fc-(X2)q， (式I)
其中，
M1和M2分別表示包含抗原結合位點的Y型抗體分子的第一抗體臂和第二抗體臂，其中第一抗體臂與第二抗體臂的抗原結合位點可以相同或不同；
Fc：：Fc表示位於第一和第二抗體臂C端的Y型抗體分子的莖，由配對並二聚化的第一Fc結構域和第二Fc結構域組成；
X1表示綴合在抗體臂C端上的綴合部件，X2表示綴合在莖C端上的綴合部件，其中該綴合部件包含抗原結合位點，其中綴合部件直接或藉由連接肽綴合在抗體分子上；且
其中p和q分別表示0、1或2的整數，且p和q不同時為0，
其中，該抗體藉由抗體臂和綴合部件特異性結合GPRC5D、BCMA
和CD3，
較佳地，當第一抗體臂和第二抗體臂結合不同抗原時，p和q之一為0，其中抗體臂M1和M2提供第一和第二抗原結合特異性，綴合部件提供第三抗原結合特異性；或者
較佳地，當第一抗體臂和第二抗體臂結合相同抗原時，p和q均不為0，其中抗體臂M1和M2提供第一抗原結合特異性，綴合部件X1和X2分別提供第二和第三抗原結合特異性。
在一些實施方案中，抗體分子的抗體臂(M1和M2)包含選自Fab或scFab(較佳Fab)的抗原結合位點，且p和q之一為0，其中抗體臂M1和M2分別結合第一和第二抗原，綴合部件(X1或X2)結合第三抗原，其中第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3，
較佳地，當p=0時，q=1，綴合部件X2綴合在抗體分子莖的兩個Fc結構域之一上；或
較佳地，當q=0時，p=2，綴合部件X1綴合在抗體分子抗體臂M1和M2兩者的Fab輕鏈上。
在一些實施方案中，抗體分子的抗體臂(M1和M2)包含選自Fab或scFab(較佳Fab)的抗原結合位點，且p和q均不為0；其中抗體臂M1和M2結合相同的第一抗原，綴合部件X1和X2分別結合第二抗原和第三抗原，其中第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3，
較佳地，p=2且q=2，其中綴合部件X1綴合在抗體分子抗體臂M1和M2兩者的Fab輕鏈上；且綴合部件X2綴合在抗體分子莖的兩個Fc結構域上。
在再一些實施方案中，抗體分子的抗體臂(M1和M2)包含選自scFv
(較佳dsscFv)的抗原結合位點，且p=0，q=1或2，其中抗體臂M1和M2分別結合第一和第二抗原，綴合部件X2結合第三抗原，其中第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3，
較佳地，當p=0時，q=1，綴合部件X2綴合在抗體分子莖的兩個Fc結構域之一的C末端。
在上述任一實施方案中，較佳地，綴合部件包含選自scFv、dsFv和dsAb的抗原結合位點，較佳地scFv，更佳dsscFv。
在上述任一實施方案中，較佳地，第一Fc結構域和第二Fc結構域包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，由此，本發明抗體分子在第一和第二Fc結構域之間形成鏈間二硫鍵，以促成本發明的抗體分子的多肽鏈的正確配對。較佳地，在本發明的抗體分子中，抗體臂藉由Fc區的鉸鏈區融合在Fc區的N端。
在上述任一實施方案中，較佳地，綴合部件藉由柔性連接肽綴合在抗體分子的莖和/或臂上。較佳地，該連接肽長5-15個胺基酸長度，例如10、12、15個胺基酸長度。較佳地，該鏈接肽包含胺基酸序列TS(G4S)n或(G4S)n，其中n=1、2或3，較佳地n=2。
因此，在一些較佳實施方案中，當式I的p和q之一為0時，本發明提供具有下式結構的IgG樣抗體分子：
(M1：M2-(X1)p)-Fc：：Fc-(X2)q， (式I)
其中，
M1和M2分別包含結合第一和第二抗原的Fab或scFab，較佳Fab，
其中，當p=0時，X2包含結合第三抗原的scFv，或者
當q=0時，X1包含結合第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在再一些較佳實施方案中，當式I的p=0時，本發明提供具有下式結構的IgG樣抗體分子：
(M1：M2)-Fc：：Fc-(X2)q， (Format_2)
其中，
q=1，
M1和M2分別包含結合第一和第二抗原的Fab或scFab，較佳Fab，且
X2包含結合第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在再一些較佳實施方案中，當式I的q=0時，本發明提供具有下式結構的IgG樣抗體分子：
(M1：M2-(X1)p)-Fc：：Fc， (Format_7)
其中，
p=2，
M1和M2分別包含結合第一和第二抗原的Fab，且
X2包含結合第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在再一些實施方案中，當式I的p=2且q=2時，本發明提供具有下式
結構的IgG樣抗體分子：
(M1：M2-(X1)p)-Fc：：Fc-(X2)q， (Format_6)
其中，
M1和M2包含結合相同的第一抗原的Fab或scFab，較佳Fab，且
X1和X2分別包含結合第二抗原和第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在再一些實施方案中，當式I的p=0且q=1時，本發明提供具有下式結構的IgG樣抗體分子：
(M1：M2)-Fc：：Fc-X2， (Format_1)
其中，
M1和M2和X2分別包含結合第一、第二、和第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
以下分別對構成本發明三特異性抗體分子的抗體臂、綴合部件和莖作出進一步詳細描述。所屬技術領域具有通常知識者明瞭，這些描述將適用於上述的本發明任何三特異性抗體分子，例如式I的分子、以及具有Format_1、2、6和7的結構的分子。
本發明抗體分子的抗體臂和綴合部件
本發明的抗體分子藉由抗體臂和綴合部件的抗原結合位點，提供
特異性地與第一、第二和第三抗原結合的抗原結合位點，其中第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：腫瘤相關抗原GRPC5D和腫瘤相關抗原BCMA以及T細胞銜接抗原CD3。
在一個實施方案中，本發明提供式I的抗體分子，其中，當p=0或q=0時，抗體的第一抗體臂和第二抗體臂分別提供第一和第二抗原結合位點，綴合部件提供第三抗原結合位點。
在另一實施方案中，本發明提供式I的抗體分子，其中，當p和q均不為0時，抗體的第一抗體臂和第二抗體臂提供第一抗原結合位點，且綴合在抗體臂C端上的綴合部件提供第二抗原結合位點、綴合在抗體莖上的綴合部件提供第三抗原結合位點。
可以用於本發明三特異性抗體分子的抗原結合位點(包括特異地結合GPRC5D、BCMA和CD3的抗原結合位點)可以是包含能夠結合目的抗原的任何抗體或抗體片段。例如，在本發明的式I抗體分子中，抗體臂和綴合部件中的抗原結合位點可以獨立地是scFv、dsFv、Fab、scFab、或sdAb。較佳地，在一些實施方案中，抗體臂的抗原結合位點選自：Fab和scFab，較佳Fab。較佳地，在另一些實施方案中，綴合部件的抗原結合位點選自：scFv、dsFv和dsAb，較佳scFv，更佳二硫鍵穩定的scFv(即，dsscFv)。在更佳的一些實施方案中，抗體臂的抗原結構位點為Fab，且綴合部件的抗原結構位點為scFv，尤其是dsscFv。
在本文中，Fab_GPRC5D、Fab_BCMA和Fab_CD3分別用於表示結合GPRC5D、BCMA和CD3的Fab形式的抗原結合位點。在本文中，ScFv_GPRC5D、ScFv_BCMA和ScFv_CD3分別用於表示結合GPRC5D、BCMA和CD3的scFv形式的抗原結合位點。
在一些實施方案中，包含在本發明抗體分子中的Fab抗原結合位點由包含免疫球蛋白VH、CH1、VL和CL結構域的兩條多肽鏈組成，其中該VH和VL配對且該CH1和CL配對以形成抗原結合位點。在一些實施方案中，在Fab中，一條鏈從N端到C端包含VH和CH1(即，VH-CH1)，另一條鏈從N端到C端包含VL和CL(即，VL-CL)。在另一些實施方案中，在Fab中，一條鏈從N端到C端包含VH和CL(即，VH-CL)，另一條鏈從N端到C端包含VL和CH1(即，VL-CH1)。在一些實施方案中，Fab構成本發明抗體分子的抗體臂的抗原結合位點。在該實施方案中，該Fab可以藉由包含VH的鏈C端融合在抗體莖的Fc結構域的N端；或其中該Fab藉由包含VL的鏈的C端融合在抗體莖的Fc結構域的N端。較佳地，該Fab包含VH-CH1鏈和VL-CL鏈，並藉由VH-CH1鏈的C末端與抗體莖Fc區結合。較佳地，當本發明抗體分子包含綴合在抗體臂上的綴合部件時，該綴合部件綴合在未與抗體莖連接的Fab鏈的C末端。在本文中，未與抗體莖連接的Fab鏈也稱作Fab的輕鏈。因此，在一些實施方案中，本發明抗體分子具有綴合在抗體臂的Fab輕鏈的綴合部件。
在另一些實施方案中，包含在本發明抗體分子中的scFab抗原結合位點由包含免疫球蛋白VH、CH1、VL和CL結構域的一條多肽鏈組成，其中該VH和VL配對且該CH1和CL配對以形成抗原結合位點。在一些實施方案中，該scFab從N端到C端包含：VH-CH1、接頭、和VL-CL。在另一些實施方案中，該scFab從N端到C端包含：VL-CL、接頭、和VH-CH1。在再一些實施方案中，該scFab從N端到C端包含：VH-CL、接頭、和VL-CH1。在另一些實施方案中，該scFab從N端到C端包含：VL-CH1、接頭、和VH-CL。在一些實施方案中，scFab構成本發明抗體分子的抗體臂的抗原結合位點。在一些實施方案中，該scFab藉由其
多肽鏈的C端融合在抗體莖的Fc結構域的N端。較佳地，該scFab從N端到C端包含：VL-CL、接頭、和VH-CH1，並藉由CH1結構域的C末端與抗體莖Fc區結合。較佳地，當本發明抗體分子包含scFab抗體臂時，抗體分子的綴合部件僅綴合在抗體莖Fc結構域的C末端上。
在一些實施方案中，包含在本發明抗體分子中的Fab或scFab包含來自IgG免疫球蛋白的CH1結構域，例如，IgG1的CH1結構域，較佳人IgG1的CH1結構域。在一些較佳實施方案中，該CH1結構域包含SEQ ID NO：104的胺基酸序列、或與其具有至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，包含在本發明抗體分子中的Fab或scFab包含來自IgG免疫球蛋白的kappa輕鏈恆定結構域，例如IgG1的CLκ結構域，較佳人IgG1的CLκ結構域。例如，該Fab或scFab包含具有SEQ ID NO：105的胺基酸序列，或與其至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的kappa輕鏈恆定結構域。在另一些實施方案中，包含在本發明抗體分子中的Fab或scFab包含來自IgG免疫球蛋白的lamda輕鏈恆定區，例如IgG1的CLλ結構域，較佳人IgG1的CLλ結構域。例如，該Fab包含具有SEQ ID NO：106的胺基酸序列，或與其至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的lamda輕鏈恆定結構域。在一些實施方案中，當本發明的抗體分子的抗體臂M1和M2包含結合不同抗原的Fab或scFab(較佳地Fab)時，抗體臂M1和抗體臂M2的Fab或scFab的輕鏈恆定結構域互不相同。例如，在一些實施方案中，抗體臂M1的Fab包含kappa輕鏈恆定結構域，抗體臂M2的Fab包含lamda輕鏈可變結構域；或抗體臂M1的Fab包含lamda輕鏈恆定結構域，抗體臂M2的Fab包含kappa輕鏈可變結構域。
在一些實施方案中，包含在本發明抗體分子中的scFv抗原結合位
點由包含免疫球蛋白VH和VL結構域的一條多肽鏈組成，其中該VH和VL藉由接頭連接以配對形成抗原結合位點。在一些實施方案中，該scFv為反式構型，從N端到C端包含：VH、接頭、和VL(VH-接頭-VL)。在另一些實施方案中，該scFv為順式構型，從N端到C端包含：VL、接頭、和VH(VH-接頭-VL)。在一些實施方案中，接頭為由胺基酸殘基組成的肽接頭。適宜的肽接頭是所屬技術領域具有通常知識者已知的。在一個實施方案中，接頭為10-50個胺基酸長度，例如5-30個胺基酸長，例如15個胺基酸或20個胺基酸長度。在一個實施方案中，接頭包含胺基酸序列(G4S)n，其中n=1、2、3、4或5，較佳地，n=3或4，更佳地，n=4。
在一些實施方案中，scFv構成本發明抗體分子的抗體臂的抗原結合位點，並藉由其多肽鏈的C端融合在抗體莖的Fc結構域的N端。
在另一些實施方案中，scFv構成本發明抗體分子的綴合部件的抗原結合位點。在一些實施方案中，該scFv藉由其多肽鏈的N端融合在抗體莖的C端和/或抗體臂的C端。較佳地，本發明抗體分子中，抗體臂包含Fab，綴合部件包含scFv，其中，該scFv藉由其多肽鏈的N端融合在抗體莖Fc的C端和/或抗體臂Fab輕鏈的C端。
在一些較佳的實施方案中，包含在本發明抗體分子中的scFv抗原結合位點為二硫鍵穩定的scFv，即，dsscFv。當抗原結合位點為dsscFv時，藉由突變在scFv的VH和VL可變結構域之間引入的二硫鍵可以位於下列殘基對之間(以下位置根據Kabat編號確定)：
VH的37位殘基+VL的95位殘基；VH的44位殘基+VL的100位殘基；VH的44位殘基+VL的105位殘基；VH的45位殘基+VL的87位殘基；VH的55位殘基+VL的101位殘基；VH的100位殘基+VL的50位殘基；VH的100b位殘基
+VL的49位殘基；VH的98位殘基+VL的46位殘基；VH的105位殘基+VL的43位殘基；以及VH的106位殘基+VL的57位殘基。較佳地，為形成dsscFv，半胱胺酸取代可以被引入VH的44位和VL的100位殘基，從而在該VH和VL配對時在兩殘基之間形成二硫鍵連接。
結合GPRC5D的抗原結合位點
可以用於本發明抗體分子的GPRC5D抗原結合位點可以是能夠結合GPRC5D的任何抗體或抗體片段。例如，在本發明的抗體分子中，包含在抗體臂或綴合部件中的GPRC5D抗原結合位點可以獨立地是scFv、dsFv、Fab、scFab、或sdAb，且較佳是具有上面描述的scFv或Fab結構的抗原結合位點。較佳地，抗體臂的GPRC5D抗原結合位點選自：Fab和scFab，較佳Fab。較佳地，綴合部件的GPRC5D抗原結合位點選自：scFv、dsFv和dsAb，較佳scFv，更佳二硫鍵穩定的scFv(即，dsscFv)。在一個更佳的實施方案中，抗體包含結合GPRC5D的抗體臂，且抗體臂的GPRC5D抗原結構位點為Fab；在另一更佳的實施方案中，抗體包含結合GPRC5D的綴合部件，且綴合部件的GPRC5D抗原結構位點為scFv，尤其是dsscFv。
在一些較佳的實施方案中，結合GPRC5D的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的GPRC5D抗原結合位點，包含：
(i)如SEQ ID NO：25所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(ii)如SEQ ID NO：27所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(iii)如SEQ ID NO：29所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序
列，以及如SEQ ID NO：30所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(iv)如SEQ ID NO：31所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：32所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(v)如SEQ ID NO：98所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：99所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(vi)如SEQ ID NO：100所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：101所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列。
在較佳的一些實施方案中，結合GPRC5D的抗原結合位點，例如，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的GPRC5D抗原結合位點，包含選自如下的CDR序列組合：
(i)分別如SEQ ID NO：1-6所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者
(ii)分別如SEQ ID NO：7-12所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者
(iii)分別如SEQ ID NO：13-18所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者
(iv)分別如SEQ ID NO：19-24所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者
(v)分別如SEQ ID NO：13，110和15-18所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列。
或者，結合GPRC5D的該抗原結合位點，例如，scFv或Fab，包含該CDR序列組合之一的變體，其中該變體在1、2、3、4、5或較佳地6個CDR區上
共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)，較佳地重鏈CDR3保持不變。
在較佳的一些實施方案中，結合GPRC5D的抗原結合位點，例如，具有上面描述的scFv或Fab結構的GPRC5D抗原結合位點，包含選自如下的重鏈可變結構域VH：
(a)包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；
(b)包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；
(c)包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；
(d)包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；
(e)包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；
(f)包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域。
在較佳的一些實施方案中，結合GPRC5D的抗原結合位點，例如，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的GPRC5D抗原結合位點，包含選自如下的輕鏈可變結構域VL：
(a)包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(b)包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(c)包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(d)包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(e)包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(f)包含SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在較佳的一些實施方案中，結合GPRC5D的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的GPRC5D抗原結合位點，包含選自如下的VH和VL胺基酸序列組合：
(a)包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；或
(b)包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；或
(c)包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、
85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；或
(d)包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(e)包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(f)包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在較佳的一些實施方案中，結合GPRC5D的抗原結合位點，例如，具有上面描述的scFv或Fab結構的GPRC5D抗原結合位點，包含選自如下的VH和VL序列組合：
(i)包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域，或者
(ii)包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域，或者
(iii)包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域，或者
(iv)包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(v)包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(vi)包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在一些較佳的實施方案中，當結合GPRC5D的抗原結合位點是二硫鍵穩定的scFv時，該scFv還在VH結構域的44位包含半胱胺酸取代並在VL結構域的100位包含半胱胺酸取代。
結合BCMA的抗原結合位點
可以用於本發明抗體分子的BCMA抗原結合位點可以是能夠結合BCMA的任何抗體或抗體片段。例如，在本發明的抗體分子中，包含在抗體臂或綴合部件中的BCMA抗原結合位點可以獨立地是scFv、dsFv、Fab、scFab、或sdAb，且較佳是具有上面描述的scFv或Fab結構的抗原結構位點。較佳地，抗體臂的BCMA抗原結合位點選自：Fab和scFab，較佳Fab。較佳地，綴合部件的BCMA抗原結合位點選自：scFv、dsFv和dsAb，較佳scFv，更佳二硫鍵穩定的scFv(即，dsscFv)。在一個更佳的實施方案中，抗體包含結合BCMA的抗體臂，且抗體臂的BCMA抗原結構位點為Fab；在另一更佳的實施方案中，抗體包含結合BCMA的綴合部件，且綴合部件的BCMA抗原結構位點為scFv，尤其是dsscFv。
在一些較佳的實施方案中，結合BCMA的抗原結合位點，例如具
有上面描述的scFv或Fab結構的BCMA抗原結合位點，包含：如SEQ ID NO：39所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：40所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列。
在較佳的一些實施方案中，結合BCMA的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的BCMA抗原結合位點，包含如下CDR序列組合：
-包含或由SEQ ID NO：33所示胺基酸序列組成的HCDR1；
-包含或由SEQ ID NO：34所示胺基酸序列組成的HCDR2；
-包含或由SEQ ID NO：35所示胺基酸序列組成的HCDR3；
-包含或由SEQ ID NO：36所示胺基酸序列組成的LCDR1；
-包含或由SEQ ID NO：37所示胺基酸序列組成的LCDR2；
-包含或由SEQ ID NO：38所示胺基酸序列組成的LCDR3，
或者，結合BCMA的該抗原結合位點包含該CDR序列組合之一的變體，其中該變體在1、2、3、4、5或較佳地6個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)，較佳地重鏈CDR3保持不變。
在較佳的一些實施方案中，結合BCMA的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的BCMA抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域VH。
在較佳的一些實施方案中，結合BCMA的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的BCMA抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列
同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域VL。
在較佳的一些實施方案中，結合BCMA的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的BCMA抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域VH；且包含具有SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域VL。
較佳地，結合BCMA的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的BCMA抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列的VH結構域和具有SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列的VL結構域。在一些較佳的實施方案中，當結合BCMA的抗原結合位點是二硫鍵穩定的scFv時，該scFv還在VH結構域的44位包含半胱胺酸取代並在VL結構域的100位包含半胱胺酸取代。
結合CD3的抗原結合位點
可以用於本發明抗體分子的CD3抗原結合位點可以是能夠結合CD3的任何抗體或抗體片段。例如，在本發明的抗體分子中，包含在抗體臂或綴合部件中的CD3抗原結合位點可以獨立地是scFv、dsFv、Fab、scFab、或sdAb，且較佳是具有上面描述的scFv或Fab結構的抗原結構位點。較佳地，抗體臂的CD3抗原結合位點選自：Fab和scFab，較佳Fab。較佳地，綴合部件的CD3抗原結合位點選自：scFv、dsFv和dsAb，較佳scFv，更佳二硫鍵穩定的scFv(即，dsscFv)。在一個更佳的實施方案中，抗體包含結合GPRC5D的抗體臂，且抗體臂的CD3抗原結構位點為Fab；在另一更佳的實施方案中，抗體包含結合GPRC5D的綴合部件，且綴合部件的CD3抗原結構位點為scFv，尤其是dsscFv。
在一些較佳的實施方案中，結合CD3的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的CD3抗原結合位點，包含：如SEQ ID NO：48所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：49所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列。
在另一些較佳的實施方案中，結合CD3的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的CD3抗原結合位點，包含：如SEQ ID NO：50所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：49所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列。
在較佳的一些實施方案中，結合CD3的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的CD3抗原結合位點，包含如下CDR序列組合：
-包含或由SEQ ID NO：41所示胺基酸序列組成的HCDR1；
-包含或由SEQ ID NO：42或47所示胺基酸序列組成的HCDR2；
-包含或由SEQ ID NO：43所示胺基酸序列組成的HCDR3；
-包含或由SEQ ID NO：44所示胺基酸序列組成的LCDR1；
-包含或由SEQ ID NO：45所示胺基酸序列組成的LCDR2；
-包含或由SEQ ID NO：46所示胺基酸序列組成的LCDR3，
或者，結合CD3的該抗原結合位點包含該CDR序列組合之一的變體，其中該變體在1、2、3、4、5或較佳地6個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)，較佳地重鏈CDR3保持不變。
在較佳的一些實施方案中，結合CD3的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的CD3抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：48或50所
示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域VH。
在較佳的一些實施方案中，結合CD3的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的CD3抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域VL。
在較佳的一些實施方案中，結合CD3的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的CD3抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：48或50所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域VH；且包含具有SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域VL。
較佳地，結合CD3的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的CD3抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：48或50所示的胺基酸序列的VH結構域和具有SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列的VL結構域。更佳地，結合CD3的抗原結合位點，例如具有上面描述的scFv或Fab結構的CD3抗原結合位點，包含具有SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列的VH結構域和具有SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列的VL結構域。在一些較佳的實施方案中，當結合CD3的抗原結合位點是二硫鍵穩定的scFv時，該scFv還在VH結構域的44位包含半胱胺酸取代並在VL結構域的100位包含半胱胺酸取代。
本發明抗體分子的莖
本發明抗體分子包含位於抗體臂的C端、由第一Fc結構域和第二
Fc結構域形成的莖。在一些實施方案中，第一和第二Fc結構域相同。在另一些實施方案中，第一Fc結構域和第二Fc結構域不同，兩者配對並異二聚化。
適用於本發明抗體分子的Fc結構域片段可以是任何抗體Fc結構域。例如，本發明抗體的Fc結構域可以包含兩個或三個恆定結構域，即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。較佳地，本發明抗體的Fc結構域從N端到C端包含：CH2-CH3，更佳地從N端到C端包含：鉸鏈區-CH2-CH3。
在本發明的抗體分子中，Fc結構域可以包含源自IgG、IgA和IgD類抗體的第二和第三恆定結構域(CH2結構域和CH3結構域)；或者包含源自IgM和IgE類抗體的第二、第三和第四恆定結構域(CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域)。在一些實施方案中，抗體分子的Fc結構域為來自IgG的Fc結構域，例如，IgG1、IgG2或IgG4的Fc結構域，較佳地來自人IgG1的Fc結構域。
如所屬技術領域具有通常知識者理解的，根據本發明抗體分子的預期用途，本發明抗體分子可以在Fc結構域中包含改變效應子功能的修飾。在一個實施方案中，本發明Fc結構域的一種或多種效應子功能相對於相同同種型的野生型Fc結構域已經被降低或消除。可以藉由選自以下的任何方法來降低或消除Fc結構域的效應子功能：改變Fc結構域的糖基化、使用天然具有降低或消除的效應子功能的Fc同種型、和修飾Fc結構域的胺基酸序列。
在一個實施方案中，藉由降低Fc結構域的糖基化來降低或消除效應子功能。本領域已知多種可以用於降低Fc結構域的糖基化的方法，包括但不限於：在不允許野生型糖基化的環境中生產本發明的抗體分子；除去Fc結構域上已經存在的碳水化合物基團；和修飾Fc結構域使得不發生野生型糖基化。在一個實施方案中，藉由修飾Fc結構域來降低Fc結構域的糖基化，如在Fc結構域的位置
297引入突變，使得該位置的野生型天冬醯胺殘基被另一個干擾該位置糖基化的胺基酸替代，例如N297A突變。
在另一個實施方案中，藉由修飾至少一個Fc結構域的胺基酸序列，來降低或消除效應子功能。該Fc結構域修飾可以選自：在以下位置之一或多個上，引入損害Fc結構域與一種或多種Fc受體結合的點突變：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438和439；或者在選自以下位置引入損害C1q結合的點突變：270、322、329和321。
如所屬技術領域具有通常知識者理解的，根據本發明抗體分子的預期用途，本發明抗體分子也可以在Fc結構域中包含改變對一種或多種Fc受體的結合親和力的修飾。在一個實施方案中，該Fc受體是Fcγ受體，特別地是人Fcγ受體。在一個實施方案中，該修飾減少本發明抗體分子的效應子功能。在一個具體實施方案中，該效應子功能是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，本發明抗體分子的Fc結構域在第234和235位置(EU編號)包含胺基酸置換。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是L234A和L235A(LALA突變)。在另一個實施方案中，本發明抗體分子的Fc結構域在第329位置(EU編號)包含胺基酸置換。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是P329G。
如所屬技術領域具有通常知識者理解的，當本發明抗體分子為非對稱抗體分子時(例如Format_2和Format_7的抗體分子)，為了促進正確的非對稱抗體分子形成，本發明抗體分子可以在第一和第二Fc結構域中包含利於第一Fc結構域與第二Fc結構域異二聚化的突變。例如，可以基於Knob-in-Hole技術，在
第一Fc結構域和第二Fc結構域中引入互補的Knob突變和Hole突變。
因此，在一些實施方案中，本發明提供三特異性抗體分子，該抗體分子在第一Fc結構域和第二Fc結構域中分別包含促進第一和第二Fc結構域配對並異二聚化的第一和第二異二聚化突變。在一些較佳實施方案中，第一Fc結構域上的第一異二聚化突變包含Knob突變，第二Fc結構域的第二異二聚化突變包含與該knob突變互補的Hole突變；或者，第一Fc結構域上的第一異二聚化突變包含Hole突變，第二Fc結構域的第二異二聚化突變包含與該hole突變互補的Knob突變。在一些較佳實施方案中，該Knob突變為T366W，且該互補的hole突變是T366S/L368A/Y407V。
在一個實施方案中，本發明提供三特異性抗體分子，其包含：
i)視需要具有突變L234A和L235A的、人IgG1亞類的同二聚Fc-區，或
ii)視需要具有突變P329G、S228P和L235E的、人IgG4亞類的同二聚Fc-區，或
iii)異二聚Fc-區，其中
a)一個Fc-區多肽包含突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A和Y407V，或
b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或
iv)人IgG1亞類的異二聚Fc-區，其中兩個Fc-區多肽都包含突變L234A和L235A，且
a)一個Fc-區多肽包含突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A和Y407V，或
b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或
v)人IgG4亞類的異二聚Fc-區，其中兩個Fc-區多肽都包含突變P329G、S228P和L235E，且
a)一個Fc-區多肽包含突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A和Y407V，或
b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一些實施方案中，本發明抗體分子的Fc結構域還可以包含其他利於異源多聚化抗體純化的突變。例如，可以將H435R突變引入第一和第二Fc結構域之一中(例如，帶Hole突變的Fc結構域)，以利於使用蛋白A純化目的異源多聚體抗體。
在本發明抗體分子中，抗體莖在Fc結構域的N端與抗體臂連接。
如所屬技術領域具有通常知識者明瞭的，適用於本發明抗體分子中連接抗體臂和莖部Fc結構域片段的連接肽可以是本領域已知的任何柔性連接肽。在一些實施方案中，連接肽可以包含來自IgG1的鉸鏈區胺基酸序列，或可以包含選自以下的胺基酸序列：(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、和(GGGS)n，其中n是至少1的整數。較佳地，抗體莖藉由來自IgG的鉸鏈區(尤其是來自人IgG1的鉸鏈區)與抗體臂連接。在一些實施方案中，對於包含鉸鏈區的本發明異源多聚體抗體，可以在鉸鏈區中引入突變，例如C220S，以利於目的異源多聚體抗體的形成。
示例性三特異性抗體分子
Format_2
在一些實施方案中，當p=0且q=1時，本發明抗體分子具有結構：(M1：M2)-Fc：：Fc-(X2)q。由此，在該抗體分子上，僅具有綴合在莖上的綴合部件X2。在該抗體分子中，較佳地，抗體臂M1和M2包含分別結合第一抗原和第二抗原的Fab抗原結合位點，且綴合部件X2包含結合第三抗原的scFv抗原結合位點，其中第一、第二、第三抗原各不相同，且彼此獨立地選自：GPRC5D、BCMA和CD3。
因此，在一些較佳實施方案中，本發明提供了三特異性Y型抗體分子，該抗體分子具有結構：
(M1：M2)-Fc：：Fc-(X2)q， (Format_2)
其中，q=1，
M1和M2分別表示抗體分子的第一抗體臂和第二抗體臂，且M1和M2分別包含結合第一和第二抗原的Fab或scFab，較佳Fab，
Fc：：Fc表示抗體分子的莖，由配對並二聚化的第一Fc結構域和第
二Fc結構域組成，其中第一和第二抗體臂分別直接或藉由連接肽(較佳地鉸鏈區)連接在第一Fc結構域和第二Fc結構域的N端；
X2表示綴合在莖C端上的綴合部件，其中該綴合部件包含結合第三抗原的scFv，其中X2直接或藉由連接肽綴合在第一Fc結構域的C端，或者綴合在第二Fc結構域的C端，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在一些實施方案中，本發明提供Format_2結構的三特異性抗體分子，其中，
(a)：該分子的抗體臂M1和抗體臂M2分別包含結合GPRC5D的Fab和結合CD3的Fab且綴合部件X2包含結合BCMA的scFv，該分子具有結構：(Fab_GPRC5D：Fab_CD3)-Fc：：Fc-(scFv_BCMA)；(例如實施例的Ts-F2-1、3-6分子)或者
(b)：該分子的抗體臂M1和抗體臂M2分別包含結合BCMA的Fab和結合CD3的Fab且綴合部件X2包含結合GPRC5D的scFv，該分子具有結構(Fab_BCMA：Fab_CD3)-Fc：：Fc-(scFv_GPRC5D)；(例如實施例Ts-F2-2的分子)或者
(c)：該分子的抗體臂M1和抗體臂M2分別包含結合GPRC5D的Fab和結合BCMA的Fab且綴合部件X2包含結合CD3的scFv，該分子具有結構：(Fab_GPRC5D：Fab_BCMA)-Fc：：Fc-(scFv_CD3)。
在上述本發明Format_2抗體分子的任何實施方案中，結合GPRC5D的Fab或scFv可以是特異結合GPRC5D的任何適宜Fab或scFv，例如上文描述的scFv或Fab結構的本發明GPRC5D抗原結合位點，尤其是具有上文該VH和
VL胺基酸序列的scFv或Fab。
在上述本發明Format_2抗體分子的任何實施方案中，結合BCMA的Fab或scFv可以是特異結合BCMA的任何適宜Fab或scFv，例如上文描述的scFv或Fab結構的本發明BCMA抗原結合位點，尤其是具有上文該VH和VL胺基酸序列的scFv或Fab。
在上述本發明Format_2抗體分子的任何實施方案中，結合CD3的抗原結合位點可以是特異性結合CD3的任何適宜scFv或Fab，例如上文描述的scFv或Fab結構的本發明CD3抗原結合位點，尤其是具有上文該VH和VL胺基酸序列的scFv或Fab。
在上述本發明Format_2抗體分子的任何實施方案中，抗體分子可以包含上文描述的適用於Format_2的任何本發明抗體莖結構。例如，在本發明的Format_2非對稱三特異性抗體分子中，較佳地，為了促進抗體分子多肽鏈的正確配對，可以在莖的第一Fc結構域和第二Fc結構域中引入利於第一和第二Fc結構域異二聚化的突變，尤其是互補“結入扣”突變，例如第一Fc結構域引入knob突變且第二Fc結構域引入互補的hole突變；或反之亦然，由此該抗體分子的兩個Fc結構域可以配對形成“結入扣”的穩定締合。根據預期的用途，本發明的Format_2抗體分子的第一和/或第二Fc結構域較佳地還可以包含影響抗體效應子功能的突變，例如，降低ADCC活性的突變，如LALA突變。
在一些實施方案中，本發明的Format_2三特異性抗體分子包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球
蛋白CH1結構域、Fc結構域；
第一輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域；
第二重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域；
第二輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域；
且其中第一重鏈多肽鏈或第二重鏈多肽鏈還包含直接或較佳地藉由連接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)綴合在其Fc結構域C端的scFv結構域；
其中，
第一重鏈多肽鏈的VH-CH1與第一輕鏈多肽鏈的VL-CL配對形成結合第一抗原的第一抗體臂(M1)；
第二重鏈多肽鏈的VH-CH1與第二輕鏈多肽鏈的VL-CL配對形成結合第二抗原的第二抗體臂(M1)；
第一重鏈多肽鏈的Fc結構域與第二重鏈多肽鏈的Fc結構域配對並二聚化形成抗體莖(Fc：：Fc)；且
綴合在第一重鏈多肽鏈或第二重鏈多肽鏈C末端的scFv結構域形成結合第三抗原的綴合部件(X2)，
其中第一、第二和第三抗原各不相同，並彼此獨立地選自：GPRC5D，BCMA，和CD3。
在一個的實施方案中，抗體臂M1結合GPCR5D，第二抗體臂M2結合CD3，綴合部件X2結合BCMA，由此，
-第一重鏈多肽鏈和第一輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合GPRCR5D的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
-第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合CD3的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
其中，當綴合部件X2綴合在第一重鏈多肽鏈上時，第一重鏈多肽鏈在C端還包含特異結合BCMA的scFv的胺基酸序列，或者較佳地，當綴合部件X2綴合在第二重鏈多肽鏈上時，第二重鏈多肽鏈在C端還包含特異結合BCMA的scFv的胺基酸序列。
在另一實施方案中，抗體臂M1結合BCMA，第二抗體臂M2結合CD3，綴合部件X2結合GPCR5D，由此，
-第一重鏈多肽鏈和第一輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合BCMA的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
-第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合CD3的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
其中，當綴合部件X2綴合在第一重鏈多肽鏈上時，第一重鏈多肽鏈在C端還包含特異結合GPRCR5D的scFv胺基酸序列，或者較佳地，當綴合部件X2綴合在第二重鏈多肽鏈上時，第二重鏈多肽鏈在C端還包含特異結合GPRCR5D的scFv的胺基酸序列。
在再一實施方案中，抗體臂M1結合GPCR5D，第二抗體臂M2結合BCMA，綴合部件X2結合CD3，由此，
-第一重鏈多肽鏈和第一輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合GPRCR5D的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
-第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合BCMA的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
其中，當綴合部件X2綴合在第一重鏈多肽鏈上時，第一重鏈多肽鏈在C端還包含特異結合CD3的scFv胺基酸序列，或者當綴合部件X2綴合在第二重鏈多肽鏈上時，第二重鏈多肽鏈在C端還包含特異結合CD3的scFv的胺基酸序列。
在一個較佳的實施方案中，特異結合GPRC5D的Fab或scFv包含選自下組的VH和VL：
(a)包含SEQ ID NOs：1-3的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：4-6的LCDR1-3序列的VL；
(b)包含SEQ ID NOs：7-8的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：10-12的LCDR1-3序列的VL；
(c)包含SEQ ID NOs：13-15的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：16-18的LCDR1-3序列的VL；或
(d)包含SEQ ID NOs：19-21的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：22-24的LCDR1-3序列的VL；
較佳地，該Fab和該scFv包含選自下組的VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：25/26、SEQ ID NOs：27/28、SEQ ID NOs：29/30、和SEQ ID NOs：31/32，
且較佳地，當scFv為dsscFv時，還包含引入該VH和VL序列中的半胱胺酸置換，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換。
在一個較佳的實施方案中，該特異結合CD3的Fab或scFv包含選自下組的VH和VL：
(a)包含SEQ ID NOs：41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：44-46的LCDR1-3序列的VL；或
(b)包含SEQ ID NOs：41、47、43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：44-46的LCDR1-3序列的VL；
較佳地，該Fab和scFv包含選自下組的VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：48/49、SEQ ID NOs：50/49，且更佳地SEQ ID NOs：48/49，
且較佳地，當scFv為dsscFv時，還包含引入該VH和VL序列中的半胱胺酸置換，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換。
在一個較佳的實施方案中，該特異結合BCMA的Fab或scFv包含如下VH和VL：
包含SEQ ID NOs：33-35的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs36-38的LCDR1-3序列的VL；
較佳地，該Fab和scFv包含VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：39/40，
且較佳地，當scFv為dsscFv時，還包含引入該VH和VL序列中的半胱胺酸置換，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換。
在一些較佳實施方案中，第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈分別包含kappa輕鏈恆定結構域CLκ和lamda輕鏈恆定結構域CLλ。在一個具體的實施方案中，輕鏈恆定結構域CLκ包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；輕鏈恆定結構域CLλ包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些較佳實施方案中，第一重鏈多肽鏈和第二重鏈多肽鏈包含來自人IgG1的重鏈恆定區CH1，較佳地，包含SEQ ID NO：104的胺基酸序列或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些較佳實施方案中，第一重鏈多肽鏈和第二重鏈多肽鏈分別包含含有knob或互補hole突變的Fc結構域。在一個具體實施方案中，含有knob突變的Fc結構域包含T366W；含有互補hole突變的Fc結構域包含T366S、L368A、Y407V突變。在一個具體實施方案中，含有hole突變的Fc結構域包含選自SEQ ID NO：102和107的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；含有互補knob突變的Fc結構域包含SEQ ID NO：103的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_2結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：65的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_2結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：69的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_2結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：72的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_2結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：75的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：76的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：77或78的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_2結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：79的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：77的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
Format_7
在一些實施方案中，當q=0且p=2時，本發明抗體分子具有結構：(M1：M2-(X1)p)-Fc：：Fc。由此，在該抗體分子上，僅具有綴合在抗體臂上的綴合部件X1。在該抗體分子中，抗體臂M1和M2包含分別結合第一抗原和第二抗原的Fab抗原結合位點，且綴合部件X1包含結合第三抗原的scFv抗原結合位點，其中第一、第二、第三抗原各不相同，且彼此獨立地選自：GPRC5D、BCMA和CD3。
因此，在一些較佳實施方案中，本發明提供了三特異性Y型抗體分子，該抗體分子具有結構：
(M1：M2-(X1)p)-Fc：：Fc， (Format_7)
其中，p=2，
M1和M2分別表示抗體分子的第一抗體臂和第二抗體臂，且M1和M2分別包含結合第一和第二抗原的Fab，
Fc：：Fc表示抗體分子的莖，由配對並二聚化的第一Fc結構域和第二Fc結構域組成，其中第一和第二抗體臂分別直接或藉由連接肽(較佳地鉸鏈區)連接在第一Fc結構域和第二Fc結構域的N端；
X1表示綴合在抗體臂C端上的綴合部件，其中該綴合部件包含結合第三抗原的scFv，其中X1直接或藉由連接肽綴合在第一和第二抗體臂的Fab輕鏈C端，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在一些實施方案中，本發明提供Format_7結構的三特異性抗體分子，其中，
(a)：該分子的抗體臂M1和抗體臂M2分別包含結合GPRC5D的Fab和結合CD3的Fab且綴合部件X1包含結合BCMA的scFv，該分子具有結構：(Fab_GPRC5D：Fab_CD3-(scFv_BCMA)2)-Fc：：Fc；(例如，實施例Ts-F7-1、2、5的分子)或者
(b)：該分子的抗體臂M1和抗體臂M2分別包含結合GPRC5D的Fab和結合BCMA的Fab且綴合部件X1包含結合CD3的scFv，該分子具有結構：(Fab_GPRC5D：Fab_BCMA-(scFv_CD3)2)-Fc：：Fc；(例如，實施例Ts-F7-3、4的分子)或者
(c)該分子的抗體臂M1和抗體臂M2分別包含結合BCMA的Fab和結合CD3的Fab且綴合部件X1包含結合GPRC5D的scFv，該分子具有結構(Fab_BCMA：Fab_CD3-(scFv_GPRC5D)2)-Fc：：Fc。
在上述本發明Format_7抗體分子的任何實施方案中，結合GPRC5D的Fab或scFv可以是特異結合GPRC5D的任何適宜Fab或scFv，例如上文描述的scFv或Fab結構的本發明GPRC5D抗原結合位點，尤其是具有上文所述VH和VL胺基酸序列的scFv或Fab。
在上述本發明Format_7抗體分子的任何實施方案中，結合BCMA的Fab或scFv可以是特異結合BCMA的任何適宜Fab或scFv，例如上文描述的scFv或Fab結構的本發明BCMA抗原結合位點，尤其是具有上文所述VH和VL胺基酸序列的scFv或Fab。
在上述本發明Format_7抗體分子的任何實施方案中，結合CD3的抗原結合位點可以是特異性結合CD3的任何適宜scFv或Fab，例如上文描述的scFv或Fab結構的本發明CD3抗原結合位點，尤其是具有上文所述VH和VL胺基
酸序列的scFv或Fab。
在上述本發明Format_7抗體分子的任何實施方案中，抗體分子可以包含上文描述的適用於Format_7的任何本發明抗體莖結構。例如，在本發明的Format_7非對稱三特異性抗體分子中，較佳地，為了促進抗體分子多肽鏈的正確配對，可以在莖的第一Fc結構域和第二Fc結構域中引入利於第一和第二Fc結構域異二聚化的突變，尤其是互補“結入扣”突變，例如第一Fc結構域引入knob突變且第二Fc結構域引入互補的hole突變；或反之亦然，由此該抗體分子的兩個Fc結構域可以配對形成“結入扣”的穩定締合。根據預期的用途，本發明的Format_7抗體分子的第一和/或第二Fc結構域較佳地還可以包含影響抗體效應子功能的突變，例如，降低ADCC活性的突變，如LALA突變。
在一些實施方案中，本發明的Format_7三特異性抗體分子包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域；
第一輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域；
第二重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域；
第二輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域；
且其中第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈還包含直接或較佳地
藉由連接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)綴合在其CL結構域C端的scFv結構域；
其中，
第一重鏈多肽鏈的VH-CH1與第一輕鏈多肽鏈的VL-CL配對形成結合第一抗原的第一抗體臂(M1)；
第二重鏈多肽鏈的VH-CH1與第二輕鏈多肽鏈的VL-CL配對形成結合第二抗原的第二抗體臂(M1)；
第一重鏈多肽鏈的Fc結構域與第二重鏈多肽鏈的Fc結構域配對並二聚化形成抗體莖(Fc：：Fc)；且
綴合在第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈C末端的scFv結構域形成結合第三抗原的綴合部件(X1)，
其中第一、第二和第三抗原各不相同，並彼此獨立地選自：GPRC5D，BCMA，和CD3。
在一個的實施方案中，抗體臂M1結合GPCR5D，第二抗體臂M2結合CD3，綴合部件X1結合BCMA，由此，
-第一重鏈多肽鏈和第一輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合GPRCR5D的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
-第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合CD3的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
且，第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈在C端還包含特異結合BCMA的scFv的胺基酸序列。
在一個的實施方案中，抗體臂M1結合BCMA，第二抗體臂M2結合CD3，綴合部件X1結合GPCR5D，由此，
-第一重鏈多肽鏈和第一輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合BCMA的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
-第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合CD3的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
且，第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈在C端還包含特異結合GPRCR5D的scFv的胺基酸序列。
在一個的實施方案中，抗體臂M1結合GPCR5D，第二抗體臂M2結合BCMA，綴合部件X1結合CD3，由此，
-第一重鏈多肽鏈和第一輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合GPRCR5D的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
-第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈分別在N端包含特異性結合BCMA的Fab抗原結合位點的VH和VL胺基酸序列，
且，第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈在C端還包含特異結合CD3的scFv的胺基酸序列。
在一個較佳的實施方案中，特異結合GPRC5D的Fab或scFv包含選自下組的VH和VL：
(a)包含SEQ ID NOs：1-3的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：4-6的LCDR1-3序列的VL；
(b)包含SEQ ID NOs：7-8的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：10-12的LCDR1-3序列的VL；
(c)包含SEQ ID NOs：13-15的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：16-18的LCDR1-3序列的VL；或
(d)包含SEQ ID NOs：19-21的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：22-24的LCDR1-3序列的VL；
較佳地，該Fab和該scFv包含選自下組的VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：25/26、SEQ ID NOs：27/28、SEQ ID NOs：29/30、和SEQ ID NOs：31/32，
且較佳地，當scFv為dsscFv時，還包含引入該VH和VL序列中的半胱胺酸置換，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換。
在一個較佳的實施方案中，該特異結合CD3的Fab或scFv包含選自下組的VH和VL：
(a)包含SEQ ID NOs：41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：44-46的LCDR1-3序列的VL；或
(b)包含SEQ ID NOs：41、47、43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：44-46的LCDR1-3序列的VL；
較佳地，該Fab和scFv包含選自下組的VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：48/49，SEQ ID NOs：50/49，且更佳地SEQ ID NOs：48/49，
且較佳地，當scFv為dsscFv時，還包含引入該VH和VL序列中的半胱胺酸置換，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換。
在一個較佳的實施方案中，該特異結合BCMA的Fab或scFv包含如下VH和VL：
包含SEQ ID NOs：33-35的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs36-38的LCDR1-3序列的VL；
較佳地，該Fab和scFv包含VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：39/40，
且較佳地，當scFv為dsscFv時，還包含引入該VH和VL序列中的半胱胺酸置換，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換。
在一些實施方案中，第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈包含kappa輕鏈恆定結構域CLκ。在一些實施方案中，第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈包含lamda輕鏈恆定結構域CLλ。在一個具體的實施方案中，輕鏈恆定結構域CLκ包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。在一個具體的實施方案中，輕鏈恆定結構域CLλ包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些較佳實施方案中，第一重鏈多肽鏈和第二重鏈多肽鏈包含來自人IgG1的重鏈恆定區CH1，較佳地，包含SEQ ID NO：104的胺基酸序列或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些較佳實施方案中，第一重鏈多肽鏈和第二重鏈多肽鏈分別包含含有knob或互補hole突變的Fc結構域。在一個具體實施方案中，含有knob突變的Fc結構域包含T366W；含有互補hole突變的Fc結構域包含T366S、L368A、Y407V突變。在一個具體實施方案中，含有knob突變的Fc結構域包含選自SEQ ID NO：102和107的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；含有互補hole突變的Fc結構域包含SEQ ID NO：103的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_7結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈
多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：87的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：88的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：77或78的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：89的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_7結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：90的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：91的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：77的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：89的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_7結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈
多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：92的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：93或96的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：95或97的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
Format_1
在一些實施方案中，當p=0且q=1時，本發明抗體分子具有結構：(M1：M2)-Fc：：Fc-(X2)q，其中抗體臂M1和M2和綴合部件X2分別包含結合第一抗原、第二抗原和第三抗原的scFv抗原結合位點，其中第一、第二、第三抗原各不相同，且彼此獨立地選自：GPRC5D、BCMA和CD3。
因此，在一些較佳實施方案中，本發明提供了三特異性Y型抗體分子，該抗體分子具有結構：
(M1：M2)-Fc：：Fc-(X2)q， (Format_1)
其中，q=1，
M1和M2分別表示抗體分子的第一抗體臂和第二抗體臂，且M1和M2分別包含結合第一和第二抗原的scFv，
Fc：：Fc表示抗體分子的莖，由配對並二聚化的第一Fc結構域和第二Fc結構域組成，其中第一和第二抗體臂分別直接或藉由連接肽(較佳地鉸鏈
區)連接在第一Fc結構域和第二Fc結構域的N端；
X2表示綴合在莖C端上的綴合部件，其中該綴合部件包含結合第三抗原的scFv，其中X2直接或藉由連接肽綴合在第一Fc結構域的C端，或者綴合在第二Fc結構域的C端，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在一些實施方案中，本發明提供Format_1結構的三特異性抗體分子，其中，
(a)：該分子的抗體臂M1和抗體臂M2分別包含結合GPRC5D的scFv和結合CD3的scFv且綴合部件X2包含結合BCMA的scFv，該分子具有結構：(scFv_GPRC5D：scFv_CD3)-Fc：：Fc-(scFv_BCMA)；(例如，實施例Ts-F1-1的分子)或者
(b)：該分子的抗體臂M1和抗體臂M2分別包含結合BCMA的scFv和結合CD3的scFv且綴合部件X2包含結合GPRC5D的scFv，該分子具有結構(scFv_BCMA：scFv_CD3)-Fc：：Fc-(scFv_GPRC5D)；(例如，實施例Ts-F1-2的分子)。
在一些實施方案中，本發明的Format_1三特異性抗體分子包含或由第一重鏈多肽鏈和第二重鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈從N端到C端包含：第一scFv和Fc結構域；
第二重鏈多肽鏈從N端到C端包含：第二scFv和Fc結構域；
且其中第一重鏈多肽鏈或第二重鏈多肽鏈還包含直接或較佳地藉由連接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)綴合在其Fc結構域C端的第三scFv結構域；
其中，
第一重鏈多肽鏈的第一scFv形成結合第一抗原的第一抗體臂(M1)；
第二重鏈多肽鏈的第二scFv形成結合第二抗原的第二抗體臂(M1)；
第一重鏈多肽鏈的Fc結構域與第二重鏈多肽鏈的Fc結構域配對並二聚化形成抗體莖(Fc：：Fc)；且
綴合在第一重鏈多肽鏈或第二重鏈多肽鏈C末端的第三scFv結構域形成結合第三抗原的綴合部件(X2)，
其中第一、第二和第三抗原各不相同，並彼此獨立地選自：GPRC5D、BCMA和CD3。
在一些實施方案中，本發明提供Format_1結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈和第二重鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：61的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_1結構的三特異性抗體分子，其包含或由第一重鏈多肽鏈和第二重鏈多肽鏈組成，其中，
第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：63的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
Format_6
在一些實施方案中，當p=2且q=2時，本發明抗體分子具有結構：(M1：M2-(X2)p)-Fc：：Fc-(X2)q，其中抗體臂M1和M2包含結合第一抗原的Fab抗原結合位點、且綴合部件X1和X2分別包含結合第二抗原和第三抗原的scFv抗原結合位點，其中第一、第二、第三抗原各不相同，且彼此獨立地選自：GPRC5D、BCMA和CD3。
因此，在一些較佳實施方案中，本發明提供了三特異性對稱Y型抗體分子，該抗體分子具有結構：
(M1：M2-(X2)p)-Fc：：Fc-(X2)q， (Format_6)
其中，p=2且q=2，
M1和M2分別表示抗體分子的第一抗體臂和第二抗體臂，且M1和M2均包含結合第一抗原的Fab，
Fc：：Fc表示抗體分子的莖，由配對並二聚化的第一Fc結構域和第二Fc結構域組成，其中第一和第二抗體臂分別直接或藉由連接肽(較佳地鉸鏈區)連接在第一Fc結構域和第二Fc結構域的N端；
X1和X2分別表示綴合在抗體臂Fab輕鏈C端或莖Fc結構域C端上的綴合部件，其中該綴合部件X1包含結合第二抗原的scFv，該綴合部件X2包含結合第三抗原的scFv，其中X1和X2直接或藉由連接肽綴合在臂或莖上，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此獨立地選自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在一些實施方案中，本發明提供Format_6結構的三特異性抗體分子，其中，
(a)該分子的抗體臂M1和抗體臂M2包含結合GPRC5D的Fab，綴合部件X1包含CD3的scFv且綴合部件X2包含結合BCMA的scFv，該分子具有結構：(Fab_GPRC5D：Fab_GPRC5D-(scFv_CD3)2)-Fc：：Fc-(scFv_BCMA)2；(例如，實施例Ts-F6-1,2的分子)或者
(b)：該分子的抗體臂M1和抗體臂M2包含結合BCMA的Fab，綴合部件X1包含CD3的scFv且綴合部件X2包含結合GPRC5D的scFv，該分子具有結構：(Fab_BCMA：Fab_BCMA-(scFv_CD3)2)-Fc：：Fc-(scFv_GPRC5D)2；(例如，實施例Ts-F6-3,4的分子)。
在一些實施方案中，本發明的Format_6三特異性抗體分子包含或由兩條相同的重鏈多肽鏈和兩條相同的輕鏈多肽鏈組成，其中，
該重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域、和第一scFv結構域；
該輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域和第二scFv結構域；
其中該重鏈多肽鏈和輕鏈多肽鏈的第一和第二scFv結構域直接或較佳地藉由連接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)分別綴合在其C端；
其中，
一條重鏈多肽鏈N端的VH-CH1結構域與一條輕鏈多肽鏈N端的VL-CH1結構域配對形成結合第一抗原的第一抗體臂(M1)；
另一條重鏈多肽鏈N端的VH-CH1結構域與一條輕鏈多肽鏈N端的VL-CH1結構域配對形成結合第一抗原的第二抗體臂(M2)；
兩條重鏈多肽鏈的Fc結構域配對形成並二聚化形成抗體莖
(Fc：：Fc)；且
綴合在兩條輕鏈多肽鏈C末端的scFv結構域形成結合第二抗原的綴合部件(X1)，
綴合在兩條重鏈多肽鏈C末端的scFv結構域形成結合第三抗原的綴合部件(X2)；
其中第一、第二和第三抗原各不相同，並彼此獨立地選自：GPRC5D、BCMA和CD3。
在一些實施方案中，本發明提供Format_6結構的三特異性抗體分子，其包含或由兩條相同的重鏈多肽鏈和兩條相同的輕鏈多肽鏈組成，其中，
該重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：81的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
該輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：82或83的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供Format_6結構的三特異性抗體分子，其包含或由兩條相同的重鏈多肽鏈和兩條相同的輕鏈多肽鏈組成，其中，
該重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：84的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；
該輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：85或86的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
III.本發明的GPRC5D抗體分子
在一方面，本發明提供特異性結合GPRCR5D的抗體或其抗原結合片段。在一些較佳的實施方案中，本發明GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含：
(i)如SEQ ID NO：25所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(ii)如SEQ ID NO：27所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(iii)如SEQ ID NO：29所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：30所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(iv)如SEQ ID NO：31所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：32所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(v)如SEQ ID NO：98所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：99所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列，或者
(vi)如SEQ ID NO：100所示的重鏈可變結構域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：101所示的輕鏈可變結構域的LCDR1、2和3序列。
在另一些實施方案中，本發明的GPRC5D抗體或其抗原結合片段包含選自如下的CDR序列組合：
(i)分別如SEQ ID NO：1-6所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者
(ii)分別如SEQ ID NO：7-12所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者
(iii)分別如SEQ ID NO：13-18所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者
(iv)分別如SEQ ID NO：19-24所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者
(v)分別如SEQ ID NO：13、110和18所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列。
在再一些實施方案中，本發明的GPRC5D抗體分子或其抗原結合片段包含選自如下的VH和VL胺基酸序列組合：
(a)包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；或
(b)包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；或
(c)包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；或
(d)包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(e)包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；
和包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(f)包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
較佳地，本發明的GPRC5D抗體分子或其抗原結合片段包含選自如下的VH和VL胺基酸序列組合：
(i)包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域，或者
(ii)包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域，或者
(iii)包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域，或者
(iv)包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(v)包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；
(vi)包含SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列的重鏈可變結構域，和包含SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在一些實施方案中，本發明GPRC5D抗體為單特異性抗體、雙特異性抗體或三特異性抗體。在一些較佳的實施方案中，本發明GPRC5D抗體為雙
特異性抗體，還包含結合CD3的抗原結合位點，例如上文描述的本發明CD3抗原結合位點。在另一些較佳實施方案中，本發明GPRC5D抗體為三特異性抗體，還包含結合BCMA的抗原結合位點(例如上文描述的本發明BCMA抗原結合位點)和結合CD3的抗原結合位點(例如，上文描述的本發明CD3抗原結合位點)。
在一些實施方案中，本發明GPRC5D抗體是結合GPRC5D和CD3的雙特異性抗體，
較佳地，其中，該抗體包含結合CD3的選自下組的VH和VL胺基酸序列對：
(a)包含SEQ ID NOs：41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：44-46的LCDR1-3序列的VL；或
(b)包含SEQ ID NOs：47、42、43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：44-46的LCDR1-3序列的VL；
較佳地，包含選自下組的VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：48/49，和SEQ ID NOs：50/49，
視需要地，該VH和VL序列中包含引入的半胱胺酸置換，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換，由此在該VH和VL之間形成二硫鍵。
因此，在一個較佳實施方案中，本發明提供結合GPRC5D和CD3的雙特異性抗體，其中，該抗體包含選自下組的結合GPRC5D的VH和VL胺基酸序列對和結合CD3的VH和VL胺基酸序列對的組合，
本發明也提供上述雙特異性抗體的變體，其中該變體在該結合GPRC5D的VH和VL胺基酸序列對，和/或在該結合CD3的VH和VL胺基酸序列對中包含胺基酸改變，例如胺基酸置換、缺失和/或***，其中該胺基酸改變不影響雙特異性抗體對GPRC5D和CD3的結合。在一些實施方案中，該變體包含選自如下的胺基酸序列組合，
在一個較佳的實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含在該結合GPRC5D的VH和VL胺基酸序列對，和/或在該結合CD3的VH和VL胺基酸序列對中引入了半胱胺酸置換，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換，由此在該VH和VL之間形成二硫鍵。
本發明也提供包含本發明GPRC5D抗體的融合蛋白和免疫綴合物(例如與毒素或化學小分子綴合)、以及醫藥組成物和藥物聯合。在醫藥組成物或藥物聯合中，本發明的抗體可以包含另一治療劑，例如，可以用於本發明抗體的預期用途的另一治療劑，例如化療劑、放療劑、抑瘤分子。
IV．本發明的抗體分子的生產和純化
再一方面，本發明提供用於生產本發明抗體分子的方法，該方法包括：在適於表達該抗體的多肽鏈的條件下培養包含編碼該多肽鏈的宿主細胞；和在適於該多肽鏈裝配為該抗體分子的條件下使多肽鏈裝配產生該抗體。
當本發明抗體分子為非對稱抗體分子時，例如包含第一重鏈多肽鏈和第一輕鏈多肽鏈以及第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈的三特異性抗體分子，例如Format_2和Format_7的抗體分子，較佳地，本發明的抗體分子生產方法包括步驟：(i)在適於表達該抗體分子的第一重鏈多肽鏈和第一輕鏈多肽鏈的條件下，培養包含編碼該第一重鏈和第二輕鏈的宿主細胞，產生第一親本蛋白，(ii)在適於表達該抗體分子的第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈的條件下，培養包含編碼該第二重鏈和第二輕鏈的宿主細胞，產生第二親本蛋白，(iii)將第一親本
蛋白和第二親本蛋白等莫耳比例混合，並置於體外適宜的氧化還原條件下，使其裝配形成該抗體。在一個具體實施方案中，步驟(iii)包括：向純化的第一和第二親和蛋白的混合溶液中加入谷胱甘肽(GSH)，其中，較佳地，GHS/蛋白莫耳比例控制在500-700倍。在一個具體的實施方案中，步驟(iii)還包括：在去除GSH後，進行一段時間(例如2-3小時)的自然氧化。
本發明的抗體分子的多肽鏈可以例如藉由固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組生產獲得。為了重組生產，將編碼該抗體分子的任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈的多核苷酸分離並***一個或多個載體中以便進一步在宿主細胞中選殖和/或表達。使用常規方法，可以輕易地分離該多核苷酸並將其測序。在一個實施方案中，提供了包含本發明的一種或多種多核苷酸的載體，較佳地表達載體。
可以使用所屬技術領域具有通常知識者熟知的方法來構建表達載體。表達載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。
一旦已經製備了用於表達的包含本發明的一種或多種多核苷酸的表達載體，則可以將表達載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的，例如，原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質體的轉染或其他常規技術。
在一個實施方案中，提供了包含一種或多種本發明多核苷酸的宿主細胞。在一些實施方案中，提供了包含本發明表達載體的宿主細胞。如本文所用，術語“宿主細胞”指可以工程化以產生本發明的抗體分子的任何種類的細胞系統。適於複製和支持本發明的抗體分子表達的宿主細胞是本領域熟知的。根據需
要，這類細胞可以用特定表達載體轉染或轉導，並且可以培育大量含有載體的細胞用於接種大規模發酵器以獲得足夠量的本發明抗體分子用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物，如大腸桿菌，真核微生物如絲狀真菌或酵母，或各種真核細胞，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞等。可以使用適於懸浮培養的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(HEK 293或293F細胞)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、布法羅大鼠肝臟細胞(BRL3A)、人肺細胞(W138)、人肝臟細胞(Hep G2)、CHO細胞、NSO細胞、骨髓瘤細胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。適於產生蛋白質的哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268頁(2003)。在一個較佳的實施方案中，該宿主細胞是CHO、HEK293或NSO細胞。
如本文所述製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於如淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對所屬技術領域具有通常知識者是顯而易見的。
可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，該熟知分析方法包括大小排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。可以藉由本領域已知的多種測定法，鑑定、篩選或表徵本文提供的抗體分子的物理/化學特性和/或生物學活性。
V.醫藥組成物、藥物聯合和試劑盒
在一個方面，本發明提供了組成物，例如，醫藥組成物，該組成
物包含與可藥用載體配製在一起的本文所述的抗體分子。如本文所用，“可藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。本發明的醫藥組成物適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮施用(例如，藉由注射或輸注)。在一些實施方案中，本發明抗體分子是醫藥組成物中的唯一活性成分。在另一些實施方案中，醫藥組成物可以包含本文所述的抗體分子與一種以上治療劑。
在另一方面，本發明也提供包含本文所述的抗體分子與一種以上治療劑的藥物聯合。
適用於本發明的醫藥組成物和藥物聯合中的治療劑可以為選自以下類別(i)-(iii)任一類別的治療劑：(i)增強抗原呈遞(例如，腫瘤抗原呈遞)的藥物；(ii)增強效應細胞反應(例如，B細胞和/或T細胞活化和/或動員)的藥物；(iii)減少免疫抑制的藥物；(iv)具有抑制腫瘤作用的藥物。
本發明的組成物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、分散體劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。常見的較佳組成物處於可注射用溶液劑或可輸注溶液劑形式。較佳的施用模式是腸胃外(例如，靜脈內、皮下、腹腔(i.p.)、肌內)注射。在一個較佳實施方案中，藉由靜脈內輸注或注射施用抗體分子。在另一個較佳實施方案中，藉由肌內、腹腔或皮下注射施用抗體分子。
如本文所用的短語“腸胃外施用“和“腸胃外方式施用”意指除了腸施用和局部施用之外的施用模式，通常藉由注射施用，並且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、皮內、腹腔、經氣管、皮下注射和輸注。
治療性組成物一般應當是無菌的並且在製造和儲存條件下穩定。可以將組成物配製為溶液、微乳液、分散體、脂質體或凍乾形式。可以藉由將活性化合物(即抗體分子)以要求的量加入適宜的溶劑中，隨後過濾消毒，製備無菌可注射溶液劑。通常，藉由將該活性化合物併入無菌溶媒中來製備分散體，該無菌溶媒含有基礎分散介質和其他成分。可以使用包衣劑如卵磷脂等。在分散體的情況下，可以藉由使用表面活性劑來維持溶液劑的適宜流動性。可以藉由在組成物中包含延遲吸收的物質例如單硬脂酸鹽和明膠而引起可注射組成物的延長吸收。
在某些實施方案中，可以口服施用本發明的抗體分子，例如隨惰性稀釋劑或可食用載體一起經口施用。本發明的抗體分子也可以封閉在硬殼或軟殼明膠膠囊中、壓縮成片劑或直接摻入受試者的膳食中。對於口服治療施用，該化合物可以隨賦形劑一起摻入並且以可攝取的片劑、頰用片劑、錠劑(troche)、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑(wafer)等形式使用。為了藉由非腸胃外施用方法施用本發明的抗體分子，可能需要將該抗體分子與防止其失活的材料包衣或隨這種材料共施用。還可以用本領域已知的醫療裝置施用治療組成物。
本發明的醫藥組成物可以包含“治療有效量”或“預防有效量”的本發明所述抗體分子。“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量等變動治療有效量。治療有效量是任何有毒或有害作用不及治療有益作用的量。相對於未治療的受試者，“治療有效量”較佳地抑制可度量參數(例如腫瘤生長率)至少約20%、更佳地至少約40%、甚至更佳地至少約60%和仍更佳地至少約80%。
可以在預示人腫瘤中的功效的動物模型系統中評價本發明的抗體分子抑制可度量參數(例如，腫瘤體積)的能力。
“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在受試者中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量小於治療有效量。
包含本文所述抗體分子的試劑盒也處於本發明的範圍內。試劑盒可以包含一個或多個其他要素，例如包括：使用說明書；其他試劑，例如標記物或用於偶聯的試劑；可藥用載體；和用於施用至受試者的裝置或其他材料。
V.本發明分子的用途和方法
在一個方面，本發明提供了本發明抗體分子的體內、體外用途和應用方法。
在一些實施方案中，本發明的用途和方法關於將本發明抗體分子在體內和/或體外應用於：
-以高親和力，例如KD小於10nM，結合GPRC5D抗原，包括細胞表面表達GPRC5D抗原；
-使T細胞(例如CD4+和/或CD8+ T細胞)靶向表面表達GPRC5D的細胞，尤其是GPRC5D陽性腫瘤細胞；
-使T細胞(例如CD4+和/或CD8+ T細胞)靶向表面表達BCMA的細胞，尤其是BCMA陽性腫瘤細胞；
-激活T細胞的CD3下游信號通路；
-介導T細胞對GPRC5D陽性腫瘤細胞和/或BCMA陽性腫瘤細胞的殺傷作用；
-誘導T細胞釋放細胞因子，例如TNF-α、IFN-γ和IL-2；
-抑制或殺傷GPRC5D陽性和/或BCMA陽性腫瘤細胞，或
-治療GPRC5D陽性和/或BCMA陽性多發性骨髓瘤，例如治療BCMA陽性患者群、GPRC5D陽性患者群，在抗BCMA分子結合後BCMA丟失的GPRC5D陽性患者群；
-用於避免由BCMA逃逸介導的腫瘤復發，例如多發性骨髓瘤復發。
在一些實施方案中，本發明抗體分子或包含本發明抗體分子的醫藥組成物用作在個體中治療和/或預防疾病的藥物或用作疾病的診斷工具，較佳地，該個體是哺乳動物，更佳地是人。
在一些實施方案中，本發明提供應用本發明的抗體分子尤其是三特異性抗體分子治療癌症的方法和用途，其中該癌症可以例如選自多發性骨髓瘤、黑素瘤、B細胞淋巴瘤。較佳地，該癌症是多發性骨髓瘤。由於具有針對BCMA和GRPC5D的抗原結合特異性，本發明的三特異性抗體分子可以比靶向BCMA和CD3雙特異性抗體和靶向GPRC5D和CD3的雙特異性抗體具有更寬的治療癌症患者群體。在一些實施方案中，本發明提供應用本發明的三特異性抗體分子治療BCMA陰性癌症或BCMA低表達癌症的方法。在再一些實施方案中，本發明提供應用本發明的三特異性抗體分子治療GPRC5D和CD3雙陽性癌症。
在一個方面，本發明提供了體外或體內檢測生物樣品，例如血清、***或尿或組織活檢樣品(例如，來自過度增生性或癌性病灶)中存在相關抗原的診斷方法。該診斷方法包括：(i)在允許相互作用發生的條件下使樣品(和視需要地，對照樣品)與如本文所述的抗體分子接觸或向受試者施用該抗體分子和(ii)檢
測該抗體分子和樣品(和視需要地，對照樣品)之間複合物的形成。複合物的形成表示存在相關抗原，並且可以顯示本文所述治療和/或預防的適用性或需求。
在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測相關抗原。可以使用的檢測方法包括免疫組織化學、免疫細胞化學、FACS、ELISA測定、PCR技術(例如，RT-PCR)或體內成像技術。一般地，體內和體外檢測方法中所用的抗體分子直接或間接地用可檢測物質標記以促進檢測結合的或未結合的結合物。合適的可檢測物質包括多種生物學活性酶、輔基、螢光物質、發光物質、順磁(例如，核磁共振活性)物質和放射性物質。
在一些實施方案中，體內確定相關抗原的水平和/或分佈，例如，以非侵入方式確定(例如，藉由使用合適的成像技術(例如，正電子發射斷層攝影術(PET)掃描)檢測可檢測物標記的本發明抗體分子。在一個實施方案中，例如，藉由檢測用PET試劑(例如，18F-氟脫氧葡萄糖(FDG))以可檢測方式標記的本發明抗體分子，體內測定相關抗原的水平和/或分佈。
在一個實施方案中，本發明提供了包含本文所述抗體分子和使用說明書的診斷試劑盒。
描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。
實施例
實施例1、融合瘤細胞的製備
過表達細胞系的構建
將人、猴和鼠的GPRC5D全長序列分別***到PEE17.4質粒
(Lonza,GS Xceed Expression System)中，藉由電轉化的方法將質粒轉入宿主細胞GS-CHO中，藉由加壓篩選，構建過表達GPRC5D蛋白的穩定細胞系。同時將人的GPRC5D全長序列***到pCHO1.0載體中，將其轉入宿主細胞293F中，構建成過表達細胞株293F-huGPRC5D。
免疫
將人GPRC5D的全長序列構建到pcDNA3.1載體中，用該質粒免疫Balb\c和Harbour小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，每兩週肌肉注射一次(每隻小鼠50ug質粒)，共免疫3次。接著，再用過表達人GPRC5D的GS-CHO細胞株進行加強免疫，每兩週腹腔注射一次(每隻小鼠1×107)，共免疫2次。
細胞融合
當血清效價滿足要求後，摘取小鼠的脾製備B淋巴細胞懸液，與SP2/0骨髓瘤細胞(ATCC)以1：2~1：1的比例混合後進行電融合。將融合後的細胞從電極皿中轉移入50ml離心管中，用HAT培養基稀釋細胞至1~2×104個細胞/ml，96孔板中每孔加入100μl細胞懸液。融合後第7天更換篩選培養基，培養第10天(或更久，根據細胞生長狀態)後進行流式細胞儀(FACS)檢測，篩選陽性純株。
融合瘤細胞高通量篩選
藉由流式細胞儀(FACS)篩選出特異性表達抗GPRC5D抗體的融合瘤細胞。將待檢測細胞(293F-huGPRC5D/GS-CHO-huGPRC5D)計數，並稀釋至1×106個細胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g離心5min，去除細胞培養基。將融合瘤96孔板培養上清和陽性對照抗體加入U型板並重新懸浮細
胞，每孔加100μl，冰上靜置30min。500g離心5min去除上清，PBS洗細胞1遍。500g 5min去除PBS。向加入過融合瘤上清的孔中每孔加入100μl goat anti-mouse IgG的FITC標記的二抗(Jackson Immunoresear,Cat#115-545-006，1：500稀釋於PBS中)；向包括陽性對照抗體(Roche-5E11)孔加入100μl抗人Fc的PE標記的二抗(BioLegend,Cat#409304)。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗細胞1遍。用50μl 1×PBS重新懸浮細胞，FACS上機檢測。
將篩選出的陽性純株，再用上述同樣方法進行GS-cynoGPRC5D/GS-huGPRC5A細胞的複篩，共獲得82株與人GPRC5D和猴GPRC5D都結合，且與人GPRC5A不結合的融合瘤細胞。
陽性融合瘤細胞亞選殖
根據細胞結合實驗的結果，採用常規方式將候選純株進行亞選殖。之後，用上述高通量的篩選方法檢測，挑出目標陽性孔，進行細胞凍存。
實施例2、嵌合抗體的製備
對實施例1中獲得的融合瘤候選純株進行抗體輕重鏈基因序列的調取，並將其構建成人鼠嵌合抗體。
取新鮮培養的每株細胞約5×106個，抽提RNA(Macherey-Nagel，Cat#740984.250)。利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉錄獲得cDNA。以位於5’端FR1區的鹼基序列設計上游引子，以位於抗體恆定區或FR4區的鹼基設計下游引子，擴增出抗體輕鏈和重鏈可變區基因片段。將其連接到T載體中(Mighty TA-cloning Kit試劑盒，Takara)，挑取單純株進行測序，將測序結果利用MEGA7軟體進行分析比對。
經比對，選擇抗體輕重鏈可變區序列正確且配對的純株，分別將
其輕重鏈可變區基因片段藉由南京諾維贊公司的同源重組酶(Exnase®II，目錄號：C112-01)連接到pcDNA3.1載體中，其中恆定區選擇IgG1亞型，獲得輕鏈和重鏈抗體的表達質粒。
然後將同一抗體的輕鏈質粒與重鏈質粒按1：1的莫耳比混合，經聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences，Cat#23966)轉染293F細胞，培養5-7天後，細胞活力低於60%時，收集細胞培養上清並用Protein A親和柱純化出單株抗體。
實施例3、嵌合抗體的體外篩選
抗GPRC5D抗體的親和力藉由流式細胞術檢測。不同濃度的抗體與表達人GPRC5D的細胞共同孵育30分鐘，包括過表達人GPRC5D的GS-CHO細胞(huGPRC5D GS-CHO)，多發性骨髓瘤細胞MM1.R、H929和AMO-1。然後加入螢光標記的二抗(APC-小鼠抗人IgG Fc抗體，Biolegend，貨號：409306)，並使用Live/Dead yellow死細胞染色劑(Thermo Fisher，貨號：L34967)，藉由流式細胞術檢測細胞螢光強度，利用GraphPad Prism 8.0擬合曲線並計算EC50值，以示抗體與人GPRC5D結合的親和力。
檢測的抗體中，HB15H1G1(重鏈可變區SEQ ID NO：25，輕鏈可變區SEQ ID NO：26)為全人源抗體，ch5E12C4(重鏈可變區SEQ ID 98，輕鏈可變區SEQ ID 99)，ch11B7(重鏈可變區SEQ ID 100，輕鏈可變區SEQ ID 101)和ch7F5D4抗體(重鏈可變區SEQ ID NO：27，輕鏈可變區SEQ ID NO：28)為嵌合抗體。結果顯示在下表1中。
表1.示例抗體與人GPRC5D的親和力檢測
對篩選的ch5E12C4和嵌合ch11B7抗體進行人源化，形成抗體hz5E12.1.P1和hz11B7.5。
實施例4、三特異性抗體(Ts)的分子結構設計和構建
同時靶向GPRC5D，BCMA和CD3的T細胞銜接器(T-cell engager)類多特異性抗體，可同時結合多發性骨髓瘤細胞(Multiple Myeloma,MM)表面的兩類腫瘤相關抗原GPRC5D和BCMA以及T細胞表面的CD3受體。以4個抗GPRC5D抗體(HB15H1B1、ch7F5D4、hz5E12.1.P1、hz11B7.5)、1個抗BCMA抗體(ADI-38456)和兩個不同親和力的抗CD3抗體(較低親和力CD3抗體hzsp34.87和較高親和力CD3抗體hzsp34.24)為基礎，設計同時靶向GPRC5D、BCMA和CD3的多特異性抗體。
如圖1所示，設計了四種不同format的多特異性抗體分子：包括
1+1+1 format 1(TS-F1)的2個示例抗體，1+1+1 format 2(TS-F2)的6個示例抗體，2+2+2 format 6(TS-F6)的4個示例抗體和1+1+2 format 7(TS-F7)的5個示例抗體(見下表4)。示例抗體設計利用Fc“結入扣”(knob-in-hole)技術解決非對稱IgG樣雙特異性抗體的重鏈錯配，其中Fc為IgG1的重鏈恆定區；同時引入減弱效應子功能(effector function)的L234A，L235A(根據Kabat的“EU”編號)胺基酸突變。
TS-F2和TS-F7由4條多肽鏈組成左右非對稱的IgG樣四聚體，TS-F6由2條多肽鏈組成左右對稱的IgG樣四聚體。
TS-F2由一條包含重鏈可變結構域、免疫球蛋白CH1結構域和Fc結構域的肽鏈1#，一條包含輕鏈可變結構域、免疫球蛋白CL結構域的肽鏈2#，一條包含重鏈可變結構域、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域、和一段藉由人工合成的連接肽連接而成的單鏈抗體scFv的肽鏈3#，以及一條包含輕鏈可變結構域、免疫球蛋白CL結構域的肽鏈4#組成。肽鏈#1的重鏈可變結構域和肽鏈2#的輕鏈可變結構域配對形成第一抗原識別位點，肽鏈#3的重鏈可變結構域和肽鏈4#的輕鏈可變結構域配對形成第二抗原識別位點，scFv形成第三抗原識別位點。
TS-F7由一條包含重鏈可變結構域、免疫球蛋白CH1結構域和Fc結構域的肽鏈1#，一條包含輕鏈可變結構域、免疫球蛋白CL結構域、和一段藉由人工合成的連接肽連接而成的單鏈抗體scFv的肽鏈2#，一條包含重鏈可變結構域、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域的肽鏈3#，和一條包含輕鏈可變結構域、免疫球蛋白CL結構域，一段藉由人工合成的連接肽連接而成的單鏈抗體scFv的肽鏈4#組成。肽鏈#1的重鏈可變結構域和肽鏈2#的輕鏈可變結構域配對形成第一抗原識別位點，肽鏈#3的重鏈可變結構域和肽鏈4#的輕鏈可變結構域配對形成第二抗原識別位點，肽鏈2#和肽鏈4#中的兩個scFv為兩個相同的第三抗原識別
位點。
在TS-F2和TS-F7中，肽鏈#1和肽鏈#3各自的Fc結構域分別含有“結入扣”的對應穩定締合突變。
TS-F6由兩條相同的肽鏈1和兩條相同的肽鏈2組成，其中肽鏈1#包含重鏈可變結構域、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域、和一段藉由人工合成的連接肽連接而成的單鏈抗體scFv；肽鏈2#包含輕鏈可變結構域、免疫球蛋白CL結構域、和一段藉由人工合成的連接肽連接而成的單鏈抗體scFv。肽鏈#1的重鏈可變結構域和肽鏈2#的輕鏈可變結構域配對形成第一抗原識別位點，肽鏈#1中的scFv為第二抗原識別位點，肽鏈2#中的scFv為第三抗原識別位點。
TS-F1由肽鏈1和肽鏈2組成，其中肽鏈1#包含第一單鏈抗體scFv和Fc結構域；肽鏈2#包含第二單鏈抗體scFv和Fc結構域。肽鏈#1中的第一scFv形成第一抗原識別位點，肽鏈2#中的scFv形成第二抗原識別位點。
實施例5. TS抗體的表達及純化
四個抗GPRC5D抗體(HB15H1B1、ch7F5D4、hz5E12.1.P1、hz11B7.5)，其中HB15H1B1為全人源抗體，ch7F5D4為嵌合抗體，hz5E12.1.P1和hz11B7.5為人源化的抗體，1個抗BCMA抗體(ADI-38456)和兩個不同親和力的抗CD3抗體(hzsp34.87和hzsp34.24)的CDR區、輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列在本申請的“序列表”部分列出，上述抗體的CDR區、輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列的序列編號見表2。
表2. 抗GPRC5D抗體、抗BCMA抗體和抗CD3抗體的CDR區，輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列編號。
表3A. 示例抗體中接頭的胺基酸序列編號和序列描述
表3B. 示例抗體中單鏈抗體片段的胺基酸序列編號和序列描述
表4. 示例TS抗體的胺基酸序列編號
同時設計了GPRC5DxCD3和BCMAxCD3雙特異性抗體。如圖2A所示，作為合理設計，雙特異性抗體兩端均為Fab形式，形成1+1format的非對稱Ig樣結構。利用Fc“結入扣”(knob-in-hole)技術解決該非對稱IgG-樣雙特異性抗體的重鏈錯配，其中Fc為IgG1的重鏈恆定區；同時引入減弱效應子功能(effector
function)的L234A，L235A(根據Kabat的“EU”編號)胺基酸突變。
同時，還表達BCMAxCD3雙特異性抗體46758。如圖2B所示，該雙特異性抗體的一個抗體臂為結合BCMA的Fab，另一抗體臂為結合CD3的scFv，其中該Fab來自抗BCMA親本抗體38456，該scFv來自不同之前的抗CD3親本抗體。組成該雙特異性抗體的三條多肽鏈如SEQ ID NO：111-113所示。
同時，還表達純化了Roche-5E11雙特異性抗體(GPRC5DxCD3,2：1 format，來源於專利WO 2019/154890 A1)。如圖2C所示。雙特異性抗體Roche_5E11由WO 2019/154890 A1的序列SEQ ID NO：17、18、19和20組成，包含兩個GPRC5D結合位點和一個CD3結合位點。
為了重組生產，委託蘇州金唯智生物科技有限公合成了編碼重鏈和輕鏈的核苷酸序列並分別***載體pcDNA3.1中以便進一步在宿主細胞中選殖和/或表達。
在HEK293細胞中的表達和純化：
將Expi293F細胞(購自Thermo Fisher scientific公司)傳代培養於Expi293F細胞培養基(購自Thermo Fisher scientific公司)中。轉染前一天檢測細胞密度，用新鮮的Expi293細胞培養基調整到2×106個細胞/ml繼續培養，轉染當天將細胞密度調整為3×106個細胞/ml。
取轉染Expi293F細胞終體積1/10的Opti-MEM培養基(購自Gibco公司)作為轉染緩衝液，每mL轉染緩衝液中加入10μg的1：1莫耳比率的上述製備的分別包含配對的重鏈和輕鏈的核苷酸序列的重組質粒，混勻，每mL轉染緩衝液中再加入30ug聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)(Polysciences)，混勻，室溫溫育20分鐘，然後將PEI/DNA混合物輕柔倒入Expi293F細胞懸浮液中混勻，
置於搖床培養，培養條件為8% CO2、36.5℃、120rpm。
培養16~18小時後，向培養瓶中補加轉染後培養物體積1/50的濃度為200g/L的FEED(100g/L Phytone Peptone+100g/L Difco Select Phytone)、終濃度為4g/L的葡萄糖溶液和終濃度為2mM/L的VPA(Gibco)，輕輕混勻，置於8% CO2、36.5℃、120rpm搖床繼續培養。連續培養6天，收集培養物，以4000轉/分鐘離心30分鐘，取細胞上清用0.45μM濾膜過濾，藉由親和層析和離子交換層析進行親本蛋白純化。對於對稱結構的IgG樣抗體，純化出來最終分子。
下面顯示了，針對上述不同Format的TS抗體和雙特異性抗體，藉由重組產生的親本蛋白：
對於非對稱IgG樣抗體，純化出來的兩個親本蛋白無需換液，蛋白濃度分別>1mg/ml，按照莫耳比1：1混合，混合液中蛋白濃度1~10mg/ml。然後加入適量的GSH：GSH/蛋白莫耳比控制在500-700倍，GSH終濃度>5mM。最後用1M Arg pH 10.0調節上述混合液的pH至8.0-8.5。Arg終濃度>=50mM。上述反應液於室溫過夜，不超過24h。第二天將過夜反應的反應液換液去掉GSH，換液buffer可以是上述不含GSH的重組反應0.2M PB溶液(Ph6.0)。自然氧化2-3h後，藉由
monoS(GE Cat.17516801)純化即可。
Roche-5E11雙特異性抗體按照WO 2019/154890 A1中公開的方法製備。
收穫根據上述方法製備的對稱性抗體和非對稱抗體，利用親和層析和離子交換層析，進行純化。
利用大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測層析收集的各級分管中樣品的純度。根據SEC結果將純度大於95%的級分管中的樣品合併。
將純化後的雙特異性抗體溶液使用15ml超濾離心管，4500轉/分鐘離心30分鐘，使用PBS將蛋白稀釋後繼續離心，4500轉/分鐘離心30分鐘，重複該操作幾次，以更換緩衝液。將更換緩衝液後的抗體合併，測抗體濃度。進一步利用毛細管電泳(CE-SDS)和液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)相結合對多特異性抗體的成分和含量進行定性和定量。
實施例6. 三特異性抗體親和力測定
在示例的三特異性抗體中，檢查來自人源化抗體hz5E12.1.P1和hz11B7.5的抗原結合位點與GPRC5D的結合親和力。按照與實施例3相同的方式，將不同濃度的三特異性抗體與huGPRC5D GS-CHO細胞共同孵育30分鐘，然後加入螢光標記的二抗，藉由流式細胞儀(BD)檢測細胞螢光強度，利用GraphPad Prism 8.0擬合曲線並計算EC50值，以示抗體與人GPRC5D結合的親和力。結果顯示在下表5中。
表5. 示例抗體與人GPRC5D的親和力
在示例三特異性抗體中，抗BCMA端和抗CD3端的親和力藉由生物膜層光學干涉技術(BLI)檢測。測定了示例抗體與人BCMA、猴BCMA，人CD3E和猴CD3E的結合動力學。
將偶聯鏈黴親和素蛋白(streptavidin protein，SA)或抗human-Fc(AHC)的探針sensors(Fortebio，貨號18-5019)浸泡於200ul SD buffer(1x PBS,0.1% BSA,0.05% tween-20)中預濕。示例抗體和生物素標記的或帶Fc-tag的BCMA和CD3D&E異源二聚體抗原分別用SD buffer稀釋。取200μl的SD buffer、各稀釋樣品(100nM)分別加入到96孔黑板(Greiner，貨號655209)中。將探針和樣品置於Octet中(Fortebio，Red96e)。打開DataAcquisition 10.0，選擇“New Kinetic Experiment”，根據樣品位置布板，選擇sensors位置，設置運行步驟及時間：Baseline 60s、Loading 250s、Baseline 100s、Association 600s和Dissociation 600s。實驗轉速為1000rpm，溫度為30℃。
在“Data Analysis 10.0”軟體中對結果分析，扣除buffer參比通道，選擇1：1 binding對數據進行擬合，計算出示例抗體的kon、koff、KD值。
在如以上測定法所述進行的實驗中，使用人BCMA抗原(ACRO Biosystems)和猴BCMA抗原(ACRO Biosystems)檢測示例抗體。與人BCMA的
親和力檢測結果如表6所示；與猴BCMA的親和力檢測結果如表7所示。
表6. 示例抗體與人BCMA的親和力檢測
由以上表結果可見，本發明上述3個示例抗體均顯示與BCMA極高的親和力。
表7. 示例抗體與猴BCMA的親和力檢測
在如以上測定法該進行的實驗中，使用人CD3D&E異源二聚體抗原(ACRO Biosystems)和猴CD3D&E異源二聚體抗原(ACRO Biosystems)檢測示例抗體的親和力，結果如表8、表9所示。同時也檢查了GPRC5DXCD3雙特異性抗體，hz5E12.1-P1/SP34.24和hz5E12.1-P1/SP34.87，與人/猴CD3D&E的結合親和力。
表8 示例抗體與人CD3D&E的親和力檢測
表9 示例抗體與猴CD3D&E的親和力檢測
實施例7、抗GPRC5DxBCMAxCD3抗體介導的Jurkat細胞激活實驗
藉由Jurkat-NFAT-Luc報告系統檢測抗GPRC5DxBCMAxCD3抗體對CD3E下游信號通路的激活活性。當抗GPRC5DxBCMAxCD3多抗與多發性骨髓瘤(MM)細胞株表面的GPRC5D和/或BCMA結合，同時與Jurkat-NFAT-Luc細胞(Jurkat)表面的CD3E結合時，可以藉由腫瘤相關抗原(GPRC5D和/或BCMA)依賴性的CD3交聯，刺激Jurkat-NFAT-Luc細胞中CD3E下游信號。因此，藉由Luciferase報告系統評估示例抗體介導的T細胞激活水平。
在Jurkat NFAT luciferase細胞與MM腫瘤細胞中，加入不同濃度的示例抗體，觀察Jurkat細胞螢光素酶的表達。
試劑與材料
簡言之，首先稀釋樣品：將抗體用RPMI medium 1640(5%FBS)稀釋到100nM濃度，然後5倍梯度稀釋。然後準備細胞：Jurkat細胞和腫瘤細胞在300g離心5min，倒掉上清，重新懸浮於RPMI medium 1640(5%FBS)，計數(Countstar)後調整細胞密度至：Jurkat NFAT 2x106cell/ml，腫瘤細胞根據效應細胞與靶細胞比例調整。在96孔白色細胞培養板中每孔加入45μl的腫瘤細胞，加入30μl梯度稀釋的樣品，加入45μl Jurkat NFAT細胞。然後將96孔板放入37攝氏度5%CO2培養箱繼續培養。培養一段時間後，取出培養板細胞培養板，室溫放置5min，每孔加入80ul Bio-Glo(Promega，G7940)，避光孵育10min，在SpectraMax i3(MOLECULAR DEVICES)讀取螢光值。利用GraphPad Prism 8.0擬合曲線並計算EC50值，以比較示例抗體對T細胞的激活活性。結果顯示為實驗組讀值與對照hIgG1組讀值的倍數比值。
結果：
TsF2-1和Ts-F2-2
在H929細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養16小時條件下，以及在L363細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為
5：1)共同培養16小時條件下，TS-F2-1和TS-F2-2均可以隨著抗體濃度增加，顯著提高Jurkat細胞螢光素酶的表達(圖3A和3B)；且其激動活性高於Ts-F1與對照組GPRC5DxCD3雙抗和BCMAxCD3雙抗。所檢測抗體的具體EC50見表10。其中示例抗體TS-F2-1和TS-F2-2均由來自HB15H1G1(GPRC5D抗體)、hzsp34.24(CD3抗體)和38456(BCMA抗體)的三個結合特異性組成，但HB15H1G1和38456結合特異性的位置不同。
表10 示例抗體介導的T細胞激活
TsF2-3
在H929細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同
培養16小時條件下，在L363細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養16小時條件下，以及在U266細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養16小時條件下，TS-F2-3均可以隨著抗體濃度增加，顯著提高Jurkat細胞螢光素酶的表達(圖4A、4B和4C)；且其激動活性顯著高於TS-F6抗體，並高於對照組GPRC5DxCD3雙抗(ch7F5D4/hzsp34.24)和BCMAxCD3(46758)雙抗。所檢測抗體的具體EC50見表11。示例抗體TS-F2-3和TS-F6(TS-F6-1至-4)由來自ch7F5D4(GPRC5D抗體)、hzsp34.24(CD3抗體)和38456(BCMA抗體)的三個結合特異性組成。
將構建的過表達huGPRC5D的GS-CHO(huGPRC5D-GS-CHO)細胞和Jurkat細胞共同培養16小時，加入示例抗體以模擬僅表達GPRC5D的多發性骨髓瘤細胞介導的T細胞激活。其中效應細胞(Jurkat細胞)與靶細胞(huGPRC5D-GS-CHO細胞)比例為50：1。實驗結果表明，TS-F2-3可以隨著抗體濃度增加，顯著提高Jurkat細胞螢光素酶的表達(圖4D)；且其激動活性高於Ts-F6抗體和對照組GPRC5DxCD3雙抗和BCMAxCD3雙抗(46758)。具體EC50見表11。
表11 示例抗體介導的T細胞激活
TsF2-4和Ts-F2-5
在H929細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養5個小時條件下，
在L363細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養5個小時條件下，
在8226細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養5個小時條件下，以及
在U266細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養5個小時條件下，
TS-F2-4和TS-F2-5均可以隨著抗體濃度增加，顯著提高Jurkat細胞
螢光素酶的表達(圖5A、5B、5C)；且其激動活性高於對照組GPRC5DxCD3、BCMAxCD3雙抗(38456/hzsp34.24)和46758雙抗。具體EC50見表12。其中示例抗體TS-F2-4由hz5E12.1.P1(GPRC5D抗體)、hzsp34.24(高親和力CD3抗體)和38456(BCMA抗體)組成，示例抗體TS-F2-5由hz5E12.1.P1(GPRC5D抗體)、hzsp34.87(低親和力CD3抗體)和38456(BCMA抗體)組成。
表12 示例抗體介導的T細胞激活
在MM1.S細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為10：1)共同培養5個小時條件下，以及在ARD細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為10：1)共同培養5個小時條件下，TS-F2-4和TS-F2-5可以隨著抗體濃度增加，顯著提高Jurkat細胞螢光素酶的表達(圖5E)；且其激動活性高於對照組GPRC5DxCD3雙抗和BCMAxCD3雙抗46758。具體EC50見表13。
表13 示例抗體介導的T細胞激活
Ts-F7-1和TS-F7-2
在H929細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養5個小時條件下，
在L363細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養5個小時條件下，
在8226細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養5個小時條件下，以及
在U266細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養5個小時條件下，
TS-F7-1和TS-F7-2可以隨著抗體濃度增加，顯著提高Jurkat細胞螢光素酶的表達(圖6A、圖6B、圖6C、圖6D)；且其激動活性高於對照組GPRC5DxCD3雙抗和BCMAxCD3雙抗46758。具體EC50見表14。其中示例抗體TS-F7-1由hz5E12.1.P1(GPRC5D抗體)、hzsp34.24(CD3抗體)和38456(BCMA抗體)組成，示例抗體TS-F7-2由hz11B7.5(GPRC5D抗體)、hzsp34.87(CD3抗體)和38456(BCMA抗體)組成。
表14 示例抗體介導的T細胞激活
Ts-F7-3和TS-F7-4
在L363細胞和Jurkat細胞(效應細胞與腫瘤細胞比例為5：1)共同培養16個小時條件下，TS-F7-3和TS-F7-4可以隨著抗體濃度增加，顯著提高Jurkat細胞螢光素酶的表達(圖7)；但其激動活性低於Ts-F2-3。其中示例抗體TS-F7-3和TS-F7-4由ch7F5D4(GPRC5D抗體)、hzsp34.24(CD3抗體)和38456(BCMA抗體)組成，hzsp34.24抗體形成單鏈抗體時TS-F7-3為VL在前、VH在後，TS-F7-4為
VH在前、VL在後。
實施例8、抗GPRC5DxBCMAxCD3抗體對人多發性骨髓瘤細胞的殺傷實驗
藉由乳酸脫氫酶(LDH)法檢測PBMC與GPRC5D和/或BCMA陽性的MM細胞共培養條件下示例抗體介導的T細胞對人多發性骨髓瘤細胞的殺傷能力。當抗GPRC5DxBCMAxCD3多抗與MM細胞表面的GPRC5D和/或BCMA結合，同時與primary T細胞表面的CD3E結合時，可以藉由腫瘤相關抗原(GPRC5D和/或BCMA)依賴性的與T細胞交聯，刺激T細胞激活，介導腫瘤細胞的殺傷。利用多因子檢測試劑盒(Human Th1/Th2/Th17,BD)同時檢測多種細胞因子的水平；同時藉由流式細胞儀(BD)檢測T細胞中CD69陽性細胞的百分比。
使用如下試劑和材料。
實驗步驟：
將PBMC細胞從液氮中取出，於37度水浴鍋迅速化開，加入9ml無血清培養基中，300g離心4min，棄上清，重新懸浮於10%FBS無酚紅1640培養基，調整細胞密度為4×106cell/ml。收集一定量對數期H929細胞，離心，用10%FBS無酚紅1640培養基調整腫瘤細胞密度至2×105cells/ml。將抗體按上表用10%FBS無酚紅1640培養基稀釋到100nM，從5nM 5倍梯度稀釋。在96孔細胞培養板(U
型)中加入100μL的腫瘤細胞、50μL梯度稀釋的樣品和50μL PBMC細胞。同時，設置對照孔，用培養基補齊至200μL/孔。放入37度CO2培養箱培養16h。培養16h後，取出細胞培養板，室溫放置5min，TM孔每孔加入10% Lysis Solution，避光裂解15min。400g，5min離心細胞培養板，取50μl上清轉移至新的平底96孔板中。加入LDH顯色試劑50μl，室溫避光顯色30min，加入終止液50μl。酶標儀讀取吸光值，藉由吸光值計算殺傷。再取90μL上清至新的96孔板(V型)中，用於後續細胞因子檢測。將細胞培養板中每孔加200μL FACS buffer洗一遍，離心後傾去液體，每孔加入45μL染液(用FACS buffer配製)，4度避光孵育20min，用200μL FACS buffer洗1遍，用150μL FACS buffer重新懸浮後上機檢測。
CBA檢測細胞因子：
用2ml assay diluent溶解標準品，成為standard 0(std 0)，然後2倍梯度稀釋8個孔std1-8，std 9為assay diluent空白對照。將每種beads渦旋5-10s，各吸出322ul，然後加入2254ul assay diluent，渦旋混勻，準備一塊96孔V型板，每孔加入50ul混合均勻的beads，每孔加入30ul assay diluent，然後每孔加入30ul樣品，即將所有樣品稀釋2倍。PE detection reagent：用assay diluent 1：1稀釋後使用。在孔中加入50ul std或sample以及PE detection reagent，用封口膜封板，並用鋁箔覆蓋。在平板振盪器上以1100rpm的轉速室溫震盪5min。然後室溫孵育3h。孵育結束後，每孔加入120ul wash buffer，300g離心5min，吸棄上清。加120μL Wash Buffer重新懸浮，用流式細胞儀檢測。
實驗結果：
藉由流式細胞術檢測，發現示例抗體可以劑量依賴性的激活primary T細胞(圖8A和圖8B)，並且T細胞的激活程度與CD3的親和力存在一定
的相關性：抗CD3親和力越高則對T細胞激活能力越強，從而介導PBMC對H929細胞的殺傷作用(圖9)，殺傷過程中伴隨的多種細胞因子釋放水平見圖11A-D。
實施例9、示例抗體在H929荷瘤人源化小鼠模型體內的抗腫瘤藥效
雌性NOG小鼠(35-41天)購自北京維通達實驗動物技術有限公司。等級為SPF級。小鼠在到達後馴化檢疫7天，隨後開始研究。
將H929細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗，離心收集細胞，以PBS分散H929細胞。將NOG小鼠右側背腹部剃毛接種H929細胞，5x106個/隻，接種體積200ul/隻。H929細胞接種後第五天進行小鼠靜脈注射PBMC細胞，5x106個/隻，接種體積200ul/至。
給藥：PBMC細胞接種後第3天，根據小鼠瘤體積進行分組(每組7至)給藥。每7天給藥一次，總共給藥3次。每週2次監測小鼠瘤體積與體重。腫瘤體積測定：採用游標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W2/2。採用電子天平測定體重。在整個研究期間，當腫瘤達到端點時或當小鼠具有>20%體重減輕時，使小鼠安樂死。統計腫瘤大小。
實驗結果
腫瘤生長曲線見圖12，示例抗體可以顯著抑制H929細胞的生長。同時在給藥的小鼠組中，均沒有發現體重減輕的現象。
實施例10、不同多發性骨髓瘤表面GPRC5D和BCMA的表達水平
藉由qifikit試劑盒，利用飽和濃度的BCMA抗體和GPRC5D抗體與MM細胞染色，藉由流式定量不同多發性骨髓瘤細胞株表面BCMA和GPRC5D分子。
實驗試劑
加入1x105個不同的MM細胞於96-well板，GS-CHO-huGPRC5D和GS-CHO-huBCMA細胞作為陽性對照，並且互為陰性對照。400g離心5min，去上清。加入10μL鼠來源一抗(BCMA和Mgprc5d-17G1B8)在4℃條件下孵育1h。陰性對照IgG1。QIFIKIT/Beads準備：分別加入100μL混合均勻的beads(Vial 1和Vial 2)。加入200uL FACS buffer，洗3遍後去除上清，加入100uL二抗(FITC Conjugate,Vial 3(共200uL),1：50稀釋在0.01mol/L PBS中)混勻，在4℃避光條件下孵育45分鐘。加入200uL FACS緩衝液，洗3遍後，加入100uL PBS，混勻，藉由流式細胞術檢測。
實驗結果：在測試的不同MM細胞上具有不同的表面GPRC5D和BCMA表達水平，如圖13所示。如圖5A-F和圖6A-D和圖7所示，與對照GPRC5D/CD3二抗和BCMA/CD3二抗相比，所評價的Format 2和Format 7三特異性抗體在具有不同GPRC5D和BCMA表達水平的多種MM細胞(H929，L363,8226，U266，MM1.S和ARD)上都誘導了有利的生物活性。這說明，藉由組合靶向GPRC5D和BCMA，本發明的三特異性抗體將既可以覆蓋GPRC5D陽性腫瘤患者，也可以覆蓋BCMA陽性腫瘤患者，提高對多發性腫瘤患者的覆蓋率；同時也可以避免由於單一抗原如BCMA的丟失帶來的腫瘤復發，改善治療功效。
Claims (23)
- 一種特異性結合GPRC5D的抗體分子或其抗原結合片段，其包含選自如下的CDR序列組合：(i)分別如SEQ ID NO：13-18所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列，或者(ii)分別如SEQ ID NO：13，110和15-18所示的重鏈可變結構域HCDR1、2和3序列和輕鏈可變結構域LCDR1、2和3序列。
- 如請求項1所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中該抗體分子或其抗原結合片段包含選自如下的VH和VL胺基酸序列組合：(a)包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域；或(b)包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域；和包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
- 如請求項2所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，該VH和VL序列中包含引入VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換，由此在該VH和VL之間形成二硫鍵。
- 如請求項1所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，該抗原結合片段為Fab、scFv或dsscFv。
- 如請求項1所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，該抗體分子為單特異性、雙特異性或三特異性抗體。
- 如請求項5所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，該抗體分子還包含結合CD3的抗原結合位點，或還包含結合BCMA的抗原結合位點和結合CD3的抗原結合位點。
- 如請求項6所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，結合CD3的抗原結合位點包含選自下組的VH和VL：(a)包含SEQ ID NOs：41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：44-46的LCDR1-3序列的VL；或(b)包含SEQ ID NOs：47、42、43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：44-46的LCDR1-3序列的VL。
- 如請求項6所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，結合CD3的抗原結合位點包含選自下組的VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：48/49或SEQ ID NOs：50/49。
- 如請求項6所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，結合CD3的抗原結合位點為dsscFv，且包含引入VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換。
- 如請求項6所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，結合BCMA的抗原結合位點包含如下VH和VL：包含SEQ ID NOs：33-35的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：36-38的LCDR1-3序列的VL。
- 如請求項6所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，結合BCMA的抗原結合位點包含VH和VL胺基酸序列對：SEQ ID NOs：39/40。
- 如請求項6所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，結合BCMA的抗原結合位點為dsscFv，且包含引入VH序列中44位和VL序列中100位的半胱胺酸置換。
- 如請求項7至9中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，該抗體分子為結合GPRC5D和CD3的雙特異性抗體。
- 如請求項6至12中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，該抗體分子包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，該第一重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域；該第一輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域；該第二重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域；該第二輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域；且其中，該第一重鏈多肽鏈或第二重鏈多肽鏈還包含直接或藉由連接肽綴合在其Fc結構域C端的scFv結構域；其中， 該第一重鏈多肽鏈的VH-CH1與第一輕鏈多肽鏈的VL-CL配對形成結合第一抗原的第一抗體臂(M1)；該第二重鏈多肽鏈的VH-CH1與第二輕鏈多肽鏈的VL-CL配對形成結合第二抗原的第二抗體臂(M2)；該第一重鏈多肽鏈的Fc結構域與第二重鏈多肽鏈的Fc結構域配對並二聚化形成抗體莖(Fc：：Fc)；且綴合在該第一重鏈多肽鏈或第二重鏈多肽鏈C末端的scFv結構域形成結合第三抗原的綴合部件(X2)，其中，該第一抗原、第二抗原和第三抗原各不相同，並彼此獨立地選自：GPRC5D、BCMA和CD3。
- 如請求項14所述的抗體分子或其抗原結合片段，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，該第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：75的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；該第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：76的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；該第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：77或78的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；該第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
- 如請求項6至12中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中，該抗體分子包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，該第一重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域；該第一輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域；該第二重鏈多肽鏈從N端到C端包含：重鏈可變結構域VH、免疫球蛋白CH1結構域、Fc結構域；該第二輕鏈多肽鏈從N端到C端包含：輕鏈可變結構域VL、免疫球蛋白CL結構域；且其中，該第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈還包含直接或藉由連接肽綴合在其CL結構域C端的scFv結構域；其中，該第一重鏈多肽鏈的VH-CH1與第一輕鏈多肽鏈的VL-CL配對形成結合第一抗原的第一抗體臂(M1)；該第二重鏈多肽鏈的VH-CH1與第二輕鏈多肽鏈的VL-CL配對形成結合第二抗原的第二抗體臂(M2)；該第一重鏈多肽鏈的Fc結構域與第二重鏈多肽鏈的Fc結構域配對並二聚化形成抗體莖(Fc：：Fc)；且綴合在該第一輕鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈C末端的scFv結構域形成結合第三抗原的綴合部件(X1)， 其中，該第一抗原、第二抗原和第三抗原各不相同，並彼此獨立地選自：GPRC5D、BCMA和CD3。
- 如請求項16所述的抗體分子或其抗原結合片段，其包含或由第一重鏈多肽鏈、第一輕鏈多肽鏈、第二重鏈多肽鏈和第二輕鏈多肽鏈組成，其中，該第一重鏈多肽鏈包含：SEQ ID NO：87的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；該第一輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：88的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；該第二重鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：77或78的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列；該第二輕鏈多肽鏈包含SEQ ID NO：89的胺基酸序列，或與之具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
- 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至17中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段。
- 一種載體，其包含如請求項18所述的多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項18所述的多核苷酸或如請求項19所述的載體。
- 一種用於生產如請求項1至17中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段的方法，該方法包括：在適於表達該抗體的多肽鏈的條件下培養包含編碼該多肽鏈的宿主細胞；和在適於該多肽鏈裝配為該抗體分子的條件下使多肽鏈裝配產生該抗體。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至17中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段和可藥用載體。
- 一種如請求項1至17中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段、如請求項22所述的醫藥組成物的用途，其係用於製備在個體中治療和/或預防癌症的藥物或用作癌症的診斷工具。
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