TW202405015A

TW202405015A - 特異性結合ｐｓｍａ和ｃｄ２８的抗原結合分子及其醫藥用途

Info

Publication number: TW202405015A
Application number: TW112113500A
Authority: TW
Inventors: 石金平; 楊昊; 黎婷婷; 應華; 陶維康
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2022-04-11
Filing date: 2023-04-11
Publication date: 2024-02-01
Also published as: WO2023198015A1

Abstract

本揭露關於特異性結合PSMA和CD28的抗原結合分子及其醫藥用途。該抗原結合分子可用於治療腫瘤。

Description

特異性結合PSMA和CD28的抗原結合分子及其醫藥用途

本揭露要求2022年04月11日提交的中國專利申請202210371696.3的優先權。

本揭露屬於生物技術領域，更具體地，本揭露關於PSMA/CD28抗原結合分子及其應用。

這裡的陳述僅提供與本揭露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

PSMA屬於谷胺酸羧肽酶II(Glutamate carboxypeptidase II，GCPII)，由750個胺基酸組成。PSMA的胞外部分由3個結構域組成：蛋白酶樣結構域(protease-like domain)、頂極結構域(apical domain)和C-末端。三個結構域都參與受質的結合，其中，蛋白酶樣結構域和頂極結構域直接與受質結合，C-末端使PSMA形成二聚體發揮作用。在***癌患者中，PSMA在腫瘤組織上的表達水平相較於正常***提高了100-1000倍，特別是在低分化的、轉移的和激素難以治療的癌中，PSMA的表達明顯增加。在一些惡性腫瘤的腫瘤外周和腫瘤內區域中的毛細血管的內皮細胞中也表達PSMA，但在正常組織的血管中不表達。另外，PSMA與腫瘤血管生成相關(Silver D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：81-85)。最近，已經證明PSMA在結腸癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腎癌和黑色素瘤中的腫瘤相關新血管系統的內皮細胞中表達(Chang，S.S.(2004)Curr Opin Investig Drugs 5：611-5)。因此，PSMA不僅能作為針對***癌的藥物，也可能適用於其他類型的腫瘤。

一般情況下，T細胞的激活依賴於被APC細胞或其他細胞表面MHC-肽複合物激活的TCR提供的第一信號，同時需要共刺激因子提供第二信號才可徹底激活T細胞。CD28作為T細胞表面主要共刺激之一，為免疫球蛋白超家族成員之一。在人類中，CD28主要表達於T細胞表面，也少量表達於骨髓基質細胞、漿細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等其他細胞中。CD28分子可藉由結合表達於激活APC細胞表面的CD80/CD86分子進一步激活下游NFAT、NF-κB和AP-1信號通路，促進T細胞的激活和增殖。

因此，提供靶向PSMA/CD28的雙特異性抗體是治療腫瘤等疾病的一個有效手段。

本揭露提供了一種特異性結合CD28和PSMA抗原結合分子和特異性結合CD28的抗體。

在一個方面，本揭露提供了一種抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合CD28的抗原結合模塊和至少一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊，該特異性結合CD28的抗原結合模塊包含重鏈可變區CD28-VH和輕鏈可變區CD28-VL，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊包含重鏈可變區PSMA-VH和輕鏈可變區PSMA-VL。

在一些實施方式中，如前所述的抗原結合分子，其中，

(i)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：35中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：36、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

(ii)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：33中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：34、72、73、74、75、76、77、78、79或80中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

(iii)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：37、129或132中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：38、138、139、141、142或143中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

(iv)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：31、46、47、48或49中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和 CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：32或52中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前所述的抗原結合分子，其中，

(i)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：35中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：36中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

(ii)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：33中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：80中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：33中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：34中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

(iii)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：37中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和 CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：38中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

(iv)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：31中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：32中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列；或

該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：31中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：52中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該CD28-HCDR1、CD28-HCDR2、CD28-HCDR3、CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號規則定義。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，

(i)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：23、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

(ii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：17、54、55、56、57、58、59、60、61或62的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

(iii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25或117的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：26或116的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

(iv)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：9、39、40、41或42的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：11或43的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的CD28-LCDR3。

該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29、118、119、120、121 或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：116的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：117的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：117的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：116的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3。

該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：9、39、40、41或42的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：9、39、40、41或42的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的CD28-LCDR3。

(i)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

(ii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

(iii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

(iv)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的CD28-LCDR3。

(i)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：19所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：20所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：21所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：22所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：23、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：24所示的CD28-LCDR3；或

(ii)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：13所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：14所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：15所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：16所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：17、54、55、56、57、58、59、60、61或62所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：18所示的CD28-LCDR3；或

(iii)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：25或117所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：26或116所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：27所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：28所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：30所示的CD28-LCDR3；或

(iv)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：7所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：8所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：9、39、40、41或42所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：10所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：11或43所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：12所示的CD28-LCDR3。

該CD28-VH包含如SEQ ID NO：25所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：26所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：27所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：28所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：30所示的CD28-LCDR3；或

該CD28-VH包含如SEQ ID NO：25所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：116所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：27所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：28所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：30所示的CD28-LCDR3；或

該CD28-VH包含如SEQ ID NO：117所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：26所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：27所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：28所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：30所示的CD28-LCDR3；或

該CD28-VH包含如SEQ ID NO：117所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：116所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：27所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：28所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：30所示的CD28-LCDR3。

該CD28-VH包含如SEQ ID NO：7所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：8所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：9、39、40、41或42所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：10所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：11所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：12所示的CD28-LCDR3；或

該CD28-VH包含如SEQ ID NO：7所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：8所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：9、39、40、41或42所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：10所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：43所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：12所示的CD28-LCDR3。

(i)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：19所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：20所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：21所示的CD28-HCDR3，和該 CD28-VL包含如SEQ ID NO：22所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：23所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：24所示的CD28-LCDR3；或

(ii)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：13所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：14所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：15所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL如SEQ ID NO：16所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：62所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：18所示的CD28-LCDR3；或

(iii)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：25所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：26所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：27所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：28所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：29所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：30所示的CD28-LCDR3；或

(iv)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：7所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：8所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：9所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：10所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：43所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：12所示的CD28-LCDR3。

該CD28-VH包含如SEQ ID NO：19所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：20所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：21所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：22所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：23所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：24所示的CD28-LCDR3。

該CD28-VH包含如SEQ ID NO：13所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：14所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：15所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL如SEQ ID NO：16所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：62所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：18所示的CD28-LCDR3。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，該CD28-HCDR1、CD28-HCDR2、CD28-HCDR3、CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3是根據Kabat編號規則定義的。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該CD28-VH和CD28-VL是人源化的，均包含人抗體的FR區。

(i)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的CD28-HCDR3，且該CD28-VH的FR區包含選自1E、26A、29L、69L、71V、78A和93S組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：23、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的CD28-LCDR3，且該CD28-VL的FR區包含選自41D、42G、43T、44I和71Y組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(ii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的CD28-HCDR3，且該CD28-VH的FR區包含選自1E、28S、69L、71V、73K和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：17、54、 55、56、57、58、59、60、61或62的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的CD28-LCDR3，且該CD28-VL的FR區包含選自43S和70K組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(iii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25或117的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：26或116的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，且該CD28-VH的FR區包含選自1E、25P、71V和78A組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3，且該CD28-VL的FR區包含選自41D、42G、43T、44V和73L組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(iv)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：9、39、40、41或42的胺基酸序列的CD28-HCDR3，且該CD28-VH的FR區包含選自1E、69L、71V、73K、78A和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：11或43的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的CD28-LCDR3；且該CD28-VL的FR區包含選自43S和73F組成的組中的一個或多個胺基酸取代。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其在25℃條件下以小於2×10^-8M、8×10^-9M或5×10^-9M的KD結合人CD28，該KD是藉由表面電漿共振法測量的。

(i)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的CD28-HCDR3，且該CD28-VH的FR區包含選自1E、26A、29L、69L、71V、78A和93S組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的CD28-LCDR3，且該CD28-VL的FR區包含選自41D、42G、43T、44I和71Y組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(ii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的CD28-HCDR3，且該CD28-VH的FR區包含選自1E、28S、69L、71V、73K和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的CD28-LCDR3，且該CD28-VL的FR區包含選自43S和70K組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(iii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，且該CD28-VH的FR區包含選自1E、25P、71V和78A組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3，且該CD28-VL的FR區包含選自41D、42G、43T、44V和73L組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(iv)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的CD28-HCDR3，且該CD28-VH的FR區包含選自1E、69L、71V、73K、78A和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的CD28-LCDR3；且該CD28-VL的FR區包含選自43S和73F組成的組中的一個或多個胺基酸取代。

i)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：166的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：167的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：168的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

ii)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：170的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：171的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：172的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：173的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：174的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：175的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

iii)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：158的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：159的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：160的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：161的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：162的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：163的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

iv)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：176的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：177的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：180的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：181的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

v)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：213的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：214的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：215的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：216的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：218的胺基酸序列的PSMA-LCDR3。

該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：170的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：171的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：172的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：173的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：174的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：175的胺基酸序列的PSMA-LCDR3。

該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：166的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：167的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：168的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列的PSMA-LCDR3。

i)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：164所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：165所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：166所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：167所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：168所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：169所示的PSMA-LCDR3；或

ii)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：170所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：171所示PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：172所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：173所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：174所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：175所示的PSMA-LCDR3；或

iii)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：158所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：159所示PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：160所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：161所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：162所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：163所示的PSMA-LCDR3；或

iv)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：176所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：177所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：178所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：179所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：180所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：181所示的PSMA-LCDR3；或

v)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：213所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：214所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：215所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：216所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：217所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：218所示的PSMA-LCDR3。

該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：170所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：171所示PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：172所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：173所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：174所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：175所示的PSMA-LCDR3。

該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：164所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：165所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：166所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：167所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：168所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：169所示的PSMA-LCDR3。

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：98的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：98的FR區包含選自26A、29L、69L、71V、78A和93S組成的組中的一個或多個胺基酸取代，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：102的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：102的FR區包含選自41D、42G、43T、44I和71Y組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：69的FR區包含選自28S、69L、71V、73K和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：70的FR區包含選自43S和70K組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：133的FR區包含選自25P、71V和78A組成的組中的一個或多個胺基酸取代，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：137的FR區包含選自41D、42G、43T、44V和73L組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：53的FR區包含選自1E、69L、71V、73K、78A和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：52的FR區包含選自43S和73F組成的組中的一個或多個胺基酸取代。

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95、35、94、96、97或98的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101、36、99、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列；或

(ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68、33、63、64、65、66、67或69的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80、34、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79的胺基酸序列；或

(iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：126、37、123、124、125、127、128、129、130、131、132或133的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、38、135、136、137、138、139、140、141、142或143的胺基酸序列；或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44、31、45、46、47、48、49或53的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52、32、50或51的胺基酸序列。

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95、94、96、97或98的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101、99、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列；或

(ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68、63、64、65、66、67或69的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79的胺基酸序列；或

(iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：126、123、124、125、127、128、129、130、131、132或133的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135、136、137、138、139、140、141、142或143的胺基酸序列；或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49或53的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52、50或51的胺基酸序列。

i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95、94、96、97或98的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101、99、100或102的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101、99、100、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：96的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99或100的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：97的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99、100或101的胺基酸序列，或

ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80、72、73、74、75、76、77、78或79的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70或71的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70、71或72的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70、71或72的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70、71、72、74、75、76或79胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：72、74、75、76或79的胺基酸序列，或

iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135、136、137、138或139的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135或136的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：124的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：125的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134或135的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：127的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：137、138或139的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：128的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、137、138、139或142的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、138、139、140、141、142或143的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138、140、141、142或143的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138、140、141、142或143的胺基酸序列，或

iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52、50或51的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或51的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或52的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或51的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或51的胺基酸序列。

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列；或

(ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列；或

(iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列；或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列。

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；或

(ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：78的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；或

(iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：125的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：128的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：142的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138的胺基酸序列。

(i)該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：44所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：50所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：44所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：52所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：46所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：52所示；或

(ii)該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示；或

(iii)該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：106所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：94所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示；或

(iv)該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：126所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：134所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：125所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：135所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：128所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：142所示；或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：129所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：138所示。

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50、51或52的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或51的胺基酸序列，或

(ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：63、64、65或66的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：63、64、65或66的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：64或65的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：72的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：71、72、74、75、76或79的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：72、74、75、76或79的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：72、73、74、75、76、78、79或80的胺基酸序列；或

(iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：96的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99或100的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：97的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99、100或101的胺基酸序列；或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135或136的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135、136、137、138或139的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、138、139、140、141、142或143的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138、140、141、142或143的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138、140、141、142或143的胺基酸序列。

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；或

(ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；或

(iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列。

(i)該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示；或

(ii)該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示；或

(iii)該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：126所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：134所示；或

(iv)該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：44所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：52所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示。

i)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197、199、332、194、195、196或198的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201、202、333或200的胺基酸序列；或

ii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204、184或203的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206、185或205的胺基酸序列；或

iii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188、182、189或190的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191、183、192或193的胺基酸序列；或

iv)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207或186的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208、187、209或210的胺基酸序列；或

v)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；

i)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

ii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：199的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列；或

iii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

iv)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列。

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列。

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列。

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：199的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列。

i)該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：204所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：206所示；或

ii)該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：197所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：201所示；或

該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：199所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：202所示；或

iii)該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：188所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：191所示；或

iv)該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：207所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：208所示。

該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：204所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：206所示。

該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：197所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：201所示。

該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：199所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：202所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該特異性結合CD28的抗原結合模塊或該特異性結合PSMA的抗原結合模塊包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該特異性結合CD28的抗原結合模塊包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該特異性結合PSMA的抗原結合模塊包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Titin鏈包含選自由SEQ ID NO：334至SEQ ID NO：352組成的組的胺基酸序列，該Obscurin鏈包含選自由SEQ ID NO：353至SEQ ID NO：393組成的組的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Titin鏈包含SEQ ID NO：350的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：388的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Titin鏈包含SEQ ID NO：350的胺基酸序列，和該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：388的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含IgG Fc區。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含IgG1 Fc區。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區包含一個或多個能夠減少Fc區與Fcγ受體結合的胺基酸取代。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區是人IgG1 Fc區，並且在234和235位置的胺基酸為A，編號依據為EU索引。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1和Fc2各自獨立地具有一個或多個減少Fc區同源二聚化的胺基酸取代。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構，該Fc1在366位置的胺基酸為W；並且該Fc2在366位置的胺基酸為S、在368位置的胺基酸為A、和在407位置的胺基酸為V，編號依據為EU索引。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構，其中，該Fc1在354位置的胺基酸為C和在366位置的胺基酸為W；並且該Fc2在349位置的胺基酸為C、在366位置的胺基酸為S、在368位置的胺基酸為A、和在407位置的胺基酸為V，編號依據為EU索引。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，其中，該Fc1包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列；和該Fc2包含SEQ ID NO：221或222的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基 Fc2，其中，該Fc1包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列；和該Fc2包含SEQ ID NO：221的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含一個特異性結合CD28的抗原結合模塊和一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含一個特異性結合CD28的抗原結合模塊和一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊，其中，

該特異性結合CD28的抗原結合模塊是Fab，和該特異性結合PSMA的抗原結合模塊是經替換的Fab，其包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，該抗原結合分子包含一條具有式(a)所示結構的第一鏈、一條具有式(b)所示結構的第二鏈、一條具有式(c)所示結構的第三鏈和一條具有式(d)所示結構的第四鏈，

(a)[CD28-VH]-[CH1]-[Fc1]，

(b)[CD28-VL]-[CL]，

(c)[PSMA-VH]-[連接子1]-[Titin鏈]-[Fc2]，

(d)[PSMA-VL]-[連接子2]-[Obscurin鏈]，

其中，該連接子1和該連接子2是相同或不同的肽連接子；式(a)、(b)、(c)和(d)所示的結構是從N端至C端排列的。

(a)[CD28-VH]-[CH1]-[Fc1]，

(b)[CD28-VL]-[CL]，

(c)[PSMA-VH]-[連接子1]-[Titin鏈]-[Fc2]，

(d)[PSMA-VL]-[連接子2]-[Obscurin鏈]，

其中，該連接子1和該連接子2不存在，即該連接子1和該連接子2均是鍵；式(a)、(b)、(c)和(d)所示的結構是從N端至C端排列的。

i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：78的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；或

ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；或

iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；或

iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列。

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列。

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示；並且該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：204所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：206所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Titin鏈和Obscurin鏈可選自本揭露中表3-1和表3-2中任意可以形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Titin鏈包含如SEQ ID NO：350的胺基酸序列。在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Obscurin鏈包含如SEQ ID NO：388的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該連接子1和連接子2均為本領域已知的肽連接子，只要抗原結合分子能夠展現出期望的抗原結合活性。例如，肽連接子可以是具有1-50或3-20個胺基酸殘基的柔性肽。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，該肽連接子各自獨立地具有(GGGGS)n的結構，其中n是1、2或3。在一些實施方案中，該連接子1和連接子2的序列為GGGGS(SEQ ID NO：223)。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該CH1為IgG的CH1序列。在一些實施方案中，該CH1為IgG1的CH1。在一些實施方案中，該CH1包含SEQ ID NO：219的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該CL為抗體的輕鏈恆定區。在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該CL為kappa或lamada的輕鏈恆定區。在一些實施方式中，其中該CL包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子具有：

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：250的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：226的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：227的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：230的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：231的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：230的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：233的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：234的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：235的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：236的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：238的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：241的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：244的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：245的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：246的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：230的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：248的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：230的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：250的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：251的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：248的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：251的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：250的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：251的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：252的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：253的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：251的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：254的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：255的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：248的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：252的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：253的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：254的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：255的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：248的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：250的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：252的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：253的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：254的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：255的胺基酸序列的第四鏈。

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：250的胺基酸序列的第四鏈。

一條如SEQ ID NO：237所示的第一鏈、一條如SEQ ID NO：239所示的第二鏈、一條如SEQ ID NO：249所示的第三鏈和一條如SEQ ID NO：250所示的第四鏈。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含一個特異性結合CD28的抗原結合模塊和一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊是Fab；該特異性結合CD28的抗原結合模塊是經替換的Fab，其包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含一條具有式(e)所示結構的第一鏈、一條具有式(f)所示結構的第二鏈、一條具有式(g)所示結構的第三鏈和一條具有式(h)所示結構的第四鏈，

(e)[CD28-VH]-[連接子3]-[Titin鏈]-[Fc1]，

(f)[CD28-VL]-[連接子4]-[Obscurin鏈]，

(g)[PSMA-VH]-[CH1]-[Fc2]，

(h)[PSMA-VL]-[CL]，

其中，該連接子3和連接子4是相同或不同的肽連接子；式(e)、(f)、(g)和(h)所示的結構是從N端至C端排列的。

(e)[CD28-VH]-[連接子3]-[Titin鏈]-[Fc1]，

(f)[CD28-VL]-[連接子4]-[Obscurin鏈]，

(g)[PSMA-VH]-[CH1]-[Fc2]，

(h)[PSMA-VL]-[CL]，

其中，該連接子3和連接子4不存在，即該連接子3和連接子4均為鍵；式(e)、(f)、(g)和(h)所示的結構是從N端至C端排列的。

i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；或

ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列。

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列。

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列。

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示；並且該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：197所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：201所示。

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示；並且該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：204所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：206所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該連接子3和連接子4均為本領域已知的肽連接子，只要抗原結合分子能夠展現出期望的抗原結合活性。例如，肽連接子可以是包含1-50或3-20個胺基酸殘基的柔性肽。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，該肽連接子各自獨立地具有(GGGGS)n的結構，其中n是1、2或3。在一些實施方案中，該連接子3和連接子4的序列為GGGGS(SEQ ID NO：223)。

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：274的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：275的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：272的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：273的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：257的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：258的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：263的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：264的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：265的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：266的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：267的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：270的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：271的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：276的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：277的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：278的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：279的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：272的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：273的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：274的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：275的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：276的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：277的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：278的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：279的胺基酸序列的第四鏈。

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：272的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：273的胺基酸序列的第四鏈。

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：274的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：275的胺基酸序列的第四鏈。

一條如SEQ ID NO：261所示的第一鏈、一條如SEQ ID NO：262所示的第二鏈、一條如SEQ ID NO：272所示的第三鏈和一條如SEQ ID NO：273所示的第四鏈。

一條如SEQ ID NO：261所示的第一鏈、一條如SEQ ID NO：262所示的第二鏈、一條如SEQ ID NO：274所示的第三鏈和一條如SEQ ID NO：275所示的第四鏈。

在另一方面，本揭露還提供一種抗CD28抗體，其能夠特異性結合CD28，該抗CD28抗體包含重鏈可變區CD28-VH和輕鏈可變區CD28-VL，其中，

(ii)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：33中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：34、73、74、75、76、77、78、79或80中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

(iii)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：37、129或132中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和 CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：38、139、141、142或143中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

(iv)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：31中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：32、46、47、48或49中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前所述的抗CD28抗體，其中，

(iii)該CD28-VH中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3分別包含SEQ ID NO：37中的CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3的胺基酸序列，和該CD28-VL中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3分別包含SEQ ID NO：38中的CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3的胺基酸序列，或

在一些實施方式中，如前所述的抗CD28抗體，其中，

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29、118、119、120、121或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：117的胺基酸序列的CD28-HCDR1、包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3，和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1、包含SEQ ID NO：29、118、119、120、121 或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，該CD28-HCDR1、CD28-HCDR2、CD28-HCDR3、CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3是根據Kabat編號規則定義的。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該CD28-VH和CD28-VL是人源化的，均包含人抗體的FR區。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其在25℃條件下以小於2×10^-8M、8×10^-9M或5×10^-9M的KD結合人CD28，該KD是藉由表面電漿共振法測量的。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：98的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：98的FR區包含且該CD28-VH的FR區包含選自26A、29L、69L、71V、78A和93S組成的組中的一個或多個胺基酸取代，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：102的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：102的FR區包含選自41D、42G、43T、44I和71Y組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：53的FR區包含選自1E、69L、71V、73K、78A和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：50的FR區包含選自43S和73F組成的組中的一個或多個胺基酸取代；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：53的FR區包含選自1E、69L、71V、73K、78A和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列或其變體，該變體為在SEQ ID NO：52的FR區包含選自43S和73F組成的組中的一個或多個胺基酸取代。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44、45、46、47、48或49的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52、50、51或53的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

(i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95、94、96、97或98的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101、99、100或102的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列，或

(ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70或71的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：72、73、74、75、76、77、78、79或80的胺基酸序列，或

(iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135或136的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135、136、137、138或139的胺基酸序列，或

(iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50、51或52的胺基酸序列，或

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中，

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：126所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：134所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：44所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：52所示。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該抗CD28抗體包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該重鏈恆定區為人IgG1恆定區。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：144的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO：145的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該抗CD28抗體包含重鏈和輕鏈，其中，

該重鏈包含與SEQ ID NO：146具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：147具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的胺基酸序列；或

該重鏈包含與SEQ ID NO：148具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：149具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的胺基酸序列；或

該重鏈包含與SEQ ID NO：150具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：151具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的胺基酸序列；或

該重鏈包含與SEQ ID NO：152具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：153具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的胺基酸序列。

該重鏈包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列；

該重鏈包含SEQ ID NO：148的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：149的胺基酸序列；或

該重鏈包含SEQ ID NO：150的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：151的胺基酸序列；或

該重鏈包含SEQ ID NO：152的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：153的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該抗CD28抗體包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：150的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：151的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該抗CD28抗體包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：148的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：149的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該抗CD28抗體是抗體片段。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該抗CD28抗體是抗體片段，其中該抗體片段為Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv、dsFv或dAb。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該抗CD28抗體是雙特異性抗體。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗CD28抗體，其中該抗CD28抗體是雙特異性抗體，該雙特異性抗體特異性結合CD28和PSMA。

在另一個方面，本揭露提供了一種醫藥組成物，其含有：(例如治療有效量的)前述任一項所述的抗原結合分子或前述任一項所述的抗CD28抗體，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。在一些實施方案中，該醫藥組成物中還包含至少一種(例如一種)第二治療劑。在一個實施例中，該第二治療劑是有利地與PSMA/CD28雙特異性抗原結合分子組合的任何藥劑(包括抗腫瘤藥劑、放射療法、抗體藥物綴合物、雙特異性抗體、與抗腫瘤藥劑綴合的雙特異性抗體、免疫檢查點抑制劑或其組合)。在一些實施方案中，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3的抗體；較佳地，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3的雙特異性抗體；更佳地，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3和腫瘤細胞表面抗原(TAA)的雙特異性抗體；最佳地，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3和PSMA的雙特異性的抗體。在一些實施方案中，該第二治療劑是免疫檢查點抑制劑，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1或CTLA4；較佳地，其中該免疫檢查點抑制劑是抗PD-1抗體。

在另一個方面，本揭露還提供分離的核酸，其編碼前述任一項所述的抗原結合分子或前述任一項所述的抗CD28抗體。

在另一個方面，本揭露還提供載體，其包含前述的分離的核酸。

在另一個方面，本揭露還提供一種宿主細胞，其包含前述的載體。

在另一個方面，本揭露還提供一種治療疾病的方法，該方法包括向受試者施用(例如治療有效量的)前述任一項所述的抗原結合分子或前述任一項所述的抗CD28抗體或如前任一項所述的組成物。

在另一個方面，本揭露還提供前述任一項所述的抗原結合分子或前述任一項所述的抗體或其組成物在製備治療疾病的藥物中的用途。

在另一個方面，本揭露還提供用作藥物的前述任一項所述的抗原結合分子或前述任一項所述的抗CD28抗體或如前任一項所述的組成物。在一些實施方式中，該藥物用於治療疾病。

在一些實施方式中，如前任一項所述的疾病是腫瘤。在一些實施方式中，如前任一項所述的腫瘤為***癌、腎癌、尿路上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、原發性肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、膠質母細胞瘤(例如多形性膠質母細胞瘤)、骨肉瘤、卵巢癌、食管癌、宮頸鱗狀細胞癌、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌)、結直腸癌(包括結腸癌和直腸癌)、子宮內膜癌、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腦癌、胃食管癌(胃食管腺癌)、肝臟轉移性癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓樣白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)或B細胞淋巴瘤。

在一些實施方式中，如前所述的腫瘤的細胞或靠近該腫瘤的血管內皮細胞表達PSMA。

在一些實施方式中，如前所述的腫瘤是實體瘤。

在一些實施方式中，如前所述的腫瘤是實體瘤，該實體瘤為***癌、腎癌、尿路上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、原發性肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、膠質母細胞瘤(例如多形性膠質母細胞瘤)、骨肉瘤、卵巢癌、食管癌、宮頸鱗狀細胞癌、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌)、結直腸癌(包括結腸癌和直腸癌)、子宮內膜癌、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腦癌、胃食管癌(胃食管腺癌)、肝臟轉移性癌。

在一些實施方式中，如前所述的腫瘤是***癌。

在一些實施方式中，如前所述的腫瘤是非實體瘤。

在一些實施方式中，如前所述的腫瘤是非實體瘤，該非實體瘤為多發性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓樣白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)或B細胞淋巴瘤。

在一些實施方式中，如前所述的***癌是難治性***癌、***上皮內瘤、雄激素非依賴性***癌、惡性***癌、復發性***癌或去勢抵抗性***癌。

在一些實施方案中，該疾病為與PSMA相關的疾病；在一些實施方案中，該疾病為表達PSMA的疾病。

在一些實施方案中，如前所述治療疾病的方法，其進一步包括使用第二治療劑。在一些實施方案中，該第二治療劑包括抗腫瘤藥劑、放射療法、抗體藥物綴合物、雙特異性抗體、與抗腫瘤藥劑綴合的雙特異性抗體、免疫檢查點抑制劑或其組合。在一些實施方案中，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3的抗體；較佳地，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3的雙特異性抗體；更佳地，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3和腫瘤細胞表面抗原(TAA)的雙特異性抗體；最佳地，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3和PSMA的雙特異性的抗體。在一些實施方案中，該第二治療劑是免疫檢查點抑制劑，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1或CTLA4；較佳地，其中該免疫檢查點抑制劑是抗PD-1抗體。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑與本揭露任一項所述的抗原結合分子同時施用、序貫施用或分開施用。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含至少一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和至少一個特異性結合CD3的抗原結合模塊。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含至少一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和至少一個特異性結合CD3的抗原結合模塊，其中該特異性結合PSMA的抗原結合模塊與特異性結合CD28和PSMA的抗原結合分子中結合PSMA的抗原結合模塊結合的表位不同。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含至少一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和至少一個特異性結合CD3的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊包含重鏈可變區PSMA-VH和輕鏈可變區PSMA-VL，該特異性結合CD3的抗原結合模塊包含重鏈可變區CD3-VH和輕鏈可變區CD3-VL。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中，

v)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：301的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：302的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：303 的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：304的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：305的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：306的胺基酸序列的PSMA-LCDR3。

該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：166的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：167的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：168的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列的PSMA-LCDR3

ii)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：170所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：171所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：172所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：173所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：174所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：175所示的PSMA-LCDR3；或

iii)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：158所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：159所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：160所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：161所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：162所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：163所示的PSMA-LCDR3；或

v)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：301所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：302所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：303所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：304所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：305所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：306所示的PSMA-LCDR3。

該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：170所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：171所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：172所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：173所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：174所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：175所示的PSMA-LCDR3。

v)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：313的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：314的胺基酸序列。

i)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

ii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

iv)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：199的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列；或

v)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該PSMA-VH包含SEQ ID NO：199的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該特異性結合CD3的抗原結合模塊包含重鏈可變區CD3-VH和輕鏈可變區CD3-VL，其中，

i)該CD3-VH具有：包含SEQ ID NO：283的胺基酸序列的CD3-HCDR1，包含SEQ ID NO：284的胺基酸序列的CD3-HCDR2，和包含SEQ ID NO：285的胺基酸序列的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL具有：包含SEQ ID NO：286的胺基酸序列的CD3-LCDR1，包含SEQ ID NO：287的胺基酸序列的CD3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：288的胺基酸序列的CD3-LCDR3；或

ii)該CD3-VH具有：包含SEQ ID NO：307的胺基酸序列的CD3-HCDR1，包含SEQ ID NO：308的胺基酸序列的CD3-HCDR2，和包含SEQ ID NO：309的胺基酸序列的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL具有：包含SEQ ID NO：310的胺基酸序列的CD3-LCDR1，包含SEQ ID NO：311的胺基酸序列的CD3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：312的胺基酸序列的CD3-LCDR3。

該CD3-VH具有：包含SEQ ID NO：283的胺基酸序列的CD3-HCDR1，包含SEQ ID NO：284的胺基酸序列的CD3-HCDR2，和包含SEQ ID NO：285的胺基酸序列的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL具有：包含SEQ ID NO：286的胺基酸序列的CD3-LCDR1，包含SEQ ID NO：287的胺基酸序列的CD3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：288的胺基酸序列的CD3-LCDR3。

i)該CD3-VH包含如SEQ ID NO：283所示的CD3-HCDR1，如SEQ ID NO：284所示的CD3-HCDR2，和如SEQ ID NO：285所示的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL包含如SEQ ID NO：286所示的CD3-LCDR1，如SEQ ID NO：287所示的CD3-LCDR2，和如SEQ ID NO：288所示的CD3-LCDR3；或

ii)該CD3-VH包含如SEQ ID NO：307所示的CD3-HCDR1，如SEQ ID NO：308所示的CD3-HCDR2，和如SEQ ID NO：309所示的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL包含如SEQ ID NO：310所示的CD3-LCDR1，如SEQ ID NO：311所示的CD3-LCDR2，和如SEQ ID NO：312所示的CD3-LCDR3。

該CD3-VH包含如SEQ ID NO：283所示的CD3-HCDR1，如SEQ ID NO：284所示的CD3-HCDR2，和如SEQ ID NO：285所示的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL包含如SEQ ID NO：286所示的CD3-LCDR1，如SEQ ID NO：287所示的CD3-LCDR2，和如SEQ ID NO：288所示的CD3-LCDR3。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，該CD3-VH包含SEQ ID NO：289的胺基酸序列，和該CD3-VL包含SEQ ID NO：290的胺基酸序列；或

該CD3-VH包含SEQ ID NO：315的胺基酸序列，和該CD3-VL包含SEQ ID NO：316的胺基酸序列。

該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：170所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：171所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：172所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：173所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：174所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：175所示的PSMA-LCDR3；且

該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：164所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：165所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：166所示的PSMA- HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：167所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：168所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：169所示的PSMA-LCDR3；且

該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：301所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：302所示的PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：303所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：304所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：305所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：306所示的PSMA-LCDR3；且

該CD3-VH具有：包含SEQ ID NO：307的胺基酸序列的CD3-HCDR1，包含SEQ ID NO：308的胺基酸序列的CD3-HCDR2，和包含SEQ ID NO：309的胺基酸序列的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL具有：包含SEQ ID NO：310的胺基酸序列的CD3-LCDR1，包含SEQ ID NO：311的胺基酸序列的CD3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：312的胺基酸序列的CD3-LCDR3。

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；且

該CD3-VH包含SEQ ID NO：289的胺基酸序列，和該CD3-VL包含SEQ ID NO：290的胺基酸序列。

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；且

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：199的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列；且

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：313的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：314的胺基酸序列；且

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含Fc區。在一些實施方案中，該Fc區為IgG Fc區。在一些實施方案中，該Fc區為IgG1 Fc區。在一些實施方案中，該Fc區該Fc區包含一個或多個能夠減少Fc區與Fcγ受體結合的胺基酸取代。在一些實施方案中，該Fc區是人IgG1 Fc區，並且在234和235位置的胺基酸為A，編號依據為EU索引。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1和Fc2各自獨立地具有一個或多個減少Fc區同源二聚化的胺基酸取代。在一些實施方案中，該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構。在一些實施方案中，該Fc1在366位置的胺基酸為W；並且該Fc2在366位置的胺基酸為S、在368位置的胺基酸為A、和在407位置的胺基酸為V，編號依據為EU索引。在一些實施方案中，該Fc1在354位置的胺基酸為C和在366位置的胺基酸為W；並且該Fc2在349位置的胺基酸為C、在366位置的胺基酸為S、在368位置的胺基酸為A、和在407位置的胺基酸為V，編號依據為EU索引。在一些實施方案中，該Fc1包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列；該Fc2包含SEQ ID NO：221的胺基酸序列。在一些實施方案中，該Fc1包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列；該Fc2包含SEQ ID NO：222的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和一個特異性結合CD3的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊和特異性結合CD3的抗原結合模塊均是scFv。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含一條具有式(a)所示結構的第一鏈和一條具有式(b)所示結構的第二鏈，

(a)[PSMA-VH]-[連接子6]-[PSMA-VL]-[連接子7]-[CD3-VH]-[連接子8]-[CD3-VL]-[連接子9]-[Fc2]，

(b)[Fc1]，

式(a)和(b)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子6、連接子7、連接子8和/或連接子9是相同或不同的肽連接子。

(b)[Fc1]，

式(a)和(b)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子6、連接子7、連接子8和/或連接子9是相同或不同的肽連接子；其中，

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列；和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；且該CD3-VH包含SEQ ID NO：289的胺基酸序列；和該CD3-VL包含SEQ ID NO：290的胺基酸序列。

(b)[Fc1]，

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：199的胺基酸序列；和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；且該CD3-VH包含SEQ ID NO：289的胺基酸序列；和該CD3-VL包含SEQ ID NO：290的胺基酸序列。

(b)[Fc1]，

式(a)和(b)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子6和連接子8是序列相同的肽連接子；連接子7和連接子9是序列不同的肽連接子。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，該連接子6、連接子7、連接子8和連接子9可以是任意適宜的肽連接子，只要抗原結合分子能夠展現出期望的抗原結合活性。例如，肽連接子可以是包含1-50或3-20個胺基酸殘基的柔性肽。在一些實施方式中，該肽連接子各自獨立地具有L₁-(GGGGS)n-L₂的結構，其中，L₁是鍵、S、GS、GGS(SEQ ID NO：399)或GGGS(SEQ ID NO：400)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是鍵、G、GG、GGG(SEQ ID NO：295)或GGGG(SEQ ID NO：256)，並且該肽連接子不是鍵。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該連接子6和連接子8包含SEQ ID NO：293的胺基酸序列(GGGGSGGGGSGGGGS)。在一些實施方案中，其中該連接子7包含SEQ ID NO：294的胺基酸序列(SGGGGS)。在一些實施方案中，其中該連接子9包含SEQ ID NO：295的胺基酸序列(GGG)。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該Fc1包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該Fc2包含SEQ ID NO：221的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體具有：一條包含SEQ ID NO：296的胺基酸序列的第一鏈和一條包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列的第二鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體具有：

一條包含SEQ ID NO：297的胺基酸序列的第一鏈和一條包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列的第二鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和一個特異性結合CD3的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊或特異性結合CD3的抗原結合模塊包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和一個特異性結合CD3的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊是Fab；該特異性結合CD3的抗原結合模塊是經替換的Fab，其包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該特異性結合CD3的抗原結合模塊是Fab；該特異性結合PSMA的抗原結合模塊是經替換的Fab，其包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含一條具有式(c)所示結構的第一鏈、一條具有式(d)所示結構的第二鏈、一條具有式(e)所示結構的第三鏈和一條具有式(f)所示結構的第四鏈，

(c)[PSMA-VH]-[CH1]-[Fc1]，

(d)[PSMA-VL]-[CL]，

(e)[CD3-VH]-[連接子10]-[Obscurin鏈]-[Fc2]，

(f)[CD3-VL]-[連接子11]-[Titin鏈]，

式(c)、(d)、(e)和(f)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子10和連接子11是相同或不同的肽連接子。

(c)[PSMA-VH]-[CH1]-[Fc1]，

(d)[PSMA-VL]-[CL]，

(e)[CD3-VH]-[連接子10]-[Obscurin鏈]-[Fc2]，

(f)[CD3-VL]-[連接子11]-[Titin鏈]，

式(c)、(d)、(e)和(f)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子10和連接子11是相同或不同的肽連接子；其中，

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列；和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；且該CD3-VH包含SEQ ID NO：289的胺基酸序列；和該CD3-VL包含SEQ ID NO：290的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該Titin鏈和Obscurin鏈為本揭露中表3-1和表3-2中任意可以形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈。在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Titin鏈包含如SEQ ID NO：350的胺基酸序列。在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Obscurin鏈包含如SEQ ID NO：388的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該連接子10和連接子11可以是任意適宜的肽連接子，只要抗原結合分子能夠展現出期望的抗原結合活性。例如，肽連接子可以是包含1-50或3-20個胺基酸殘基的柔性肽。在一些實施方式中，該肽連接子各自獨立地具有L₁-(GGGGS)n-L₂的結構，其中，L₁是鍵、S、GS、GGS(SEQ ID NO：399)或GGGS(SEQ ID NO：400)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是鍵、G、GG、GGG(SEQ ID NO：295)或GGGG(SEQ ID NO：256)，並且該肽連接子不是鍵。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，該連接子10和該連接子11包含如SEQ ID NO：223所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該CH1為IgG的CH1序列。在一些實施方案中，該CH1為IgG1的CH1。在一些實施方案中，該CH1包含SEQ ID NO：219的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其中該CL為kappa或lamada的輕鏈恆定區。在一些實施方式中，其中該CL包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其具有：一條包含SEQ ID NO：298的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：275的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：291的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：292的胺基酸序列的第四鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其具有IgG-scFv結構。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含兩條式(a)所示結構的第一鏈和兩條式(b)所示結構的第二鏈：

(a)[PSMA-VH]-[IgG恆定區]-[連接子12]-[CD3-VL]-[連接子13]-[CD3-VH]；

(b)[PSMA-VL]-CL；

式(a)和(b)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子12和連接子13是相同或不同的肽連接子。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其具有IgG-scFv結構，其包含兩條式(a)所示結構的第一鏈和兩條式(b)所示結構的第二鏈：

(a)[PSMA-VH]-[IgG恆定區]-[連接子12]-[CD3-VL]-[連接子13]-[CD3-VH]；

(b)[PSMA-VL]-CL；

式(a)和(b)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子12和連接子13是相同或不同的肽連接子；其中，

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：313的胺基酸序列；和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：314的胺基酸序列；且該CD3-VH包含SEQ ID NO：315的胺基酸序列；和該CD3-VL包含SEQ ID NO：316的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體包含兩條SEQ ID NO：299的胺基酸序列和兩條SEQ ID NO：300的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是免疫檢查點抑制劑，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1或CTLA4。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是免疫檢查點抑制劑，其中該免疫檢查點抑制劑是抗PD-1抗體。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是抗PD-1抗體，其包括任何已知的具有治療活性的抗PD-1抗體，包括但不限於卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)、派姆單抗(Keytruda)、納武單抗(Opdivo)和西米普利單抗(cemiplimab)。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是抗PD-1抗體，其包含重鏈可變區PD-1-VH和輕鏈可變區PD-1-VL，其中，

該PD-1-VH具有：包含SEQ ID NO：319的胺基酸序列的PD-1-HCDR1、包含SEQ ID NO：320的胺基酸序列的PD-1-HCDR2和包含SEQ ID NO：321的胺基酸序列的PD-1-HCDR3，和該PD-1-VL具有：包含SEQ ID NO： 322的胺基酸序列的PD-1-LCDR1、包含SEQ ID NO：323的胺基酸序列的PD-1-LCDR2和包含SEQ ID NO：324的胺基酸序列的PD-1-LCDR3。

在一些實施方案中，如任一項所述的第二治療劑是抗PD-1抗體，其包含重鏈可變區PD-1-VH和輕鏈可變區PD-1-VL，其中，

該PD-1-VH包含SEQ ID NO：325的胺基酸序列，和該PD-1-VL包含SEQ ID NO：326的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的第二治療劑是抗PD-1抗體，其包含SEQ ID NO：328的胺基酸序列的重鏈，和SEQ ID NO：329的胺基酸序列的輕鏈。

本揭露提供的抗原結合分子，具有治療活性、安全性、藥物代謝動力學特性和成藥性(如穩定性)好的特點。

圖1A為PSMA/CD28雙特異性抗體的式1的結構示意圖；

圖1B為PSMA/CD28雙特異性抗體的式2的結構示意圖；

圖1C為PSMA/CD3雙特異性抗體的式1的結構示意圖；

圖1D為PSMA/CD3雙特異性抗體的式5的結構示意圖；其中Ob代表Obscurin。

圖2顯示固定PSMA/CD3雙特異性抗體CC-1的濃度，不同濃度的PSMA/CD28雙特異性抗體對CHO-huPSMA細胞的殺傷結果。

圖3顯示在PSMA/CD3雙抗、PSMA/CD28雙抗和CHO-huPSMA細胞的共同作用下，PBMC中細胞因子IFN-γ分泌的變化。

圖4顯示在PSMA/CD3雙抗、PSMA/CD28雙抗和CHO-huPSMA細胞的共同作用下，PBMC中細胞因子IL-6分泌的變化。

術語

本文所用的術語只是為了描述實施方案的目的，並非旨在進行限制。除非另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常所理解的相同意義。

除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。除非另有說明，“包含”包括了“由......組成”。例如，對於包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，其明確的涵蓋胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示的PSMA-HCDR1。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

術語“和/或”，例如“X和/或Y”應當理解為意指“X和Y”或“X或Y”並且應當被用來提供對兩種含義或任一含義的明確支持。

術語“CD28”(分化簇28，Tp44)是指來自任何脊椎動物來源的任何CD28蛋白，該脊椎動物來源包括哺乳動物諸如靈長類動物(例如，人)、非人靈長類動物(例如，食蟹獼猴)和齧齒動物(例如，小鼠和大鼠)。CD28在T細胞上表達，並提供T細胞活化和存活所需的共刺激信號。除T細胞受體(TCR)外，藉由CD28刺激T細胞也可以為產生各種白介素提供有效的信號。CD28是CD80(B7.1) 蛋白和CD86(B7.2)蛋白的受體，並且是在幼稚T細胞上組成性表達的唯一B7受體。人CD28的胺基酸序列顯示在UniProt(www.uniprot.org)登錄號P10747中。

術語“胺基酸”是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫、羧基、胺基和R基團結合的α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有修飾的R基團(例如，正亮胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化學化合物。

術語“胺基酸突變”包括胺基酸取代，缺失，***和修飾。可以進行取代、缺失、***和修飾的任意組合來實現最終構建體，只要最終構建體擁有期望的特性，例如降低或對Fc受體的結合。胺基酸序列缺失和***包括在多肽鏈的胺基端和/或羧基端的缺失和***。具體的胺基酸突變可以是胺基酸取代。在一個實施方式中，胺基酸突變是非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種天然胺基酸的衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變。遺傳方法可以包括定點誘變、PCR，基因合成等。預計基因工程以外的改變胺基酸側鏈基團的方法，如化學修飾也是可用的。本文中可使用各種名稱來指示同一胺基酸突變。本文中，可採用位置+胺基酸殘基的方式表示特定位點的胺基酸殘基，例如366W，則表示在366位點上的胺基酸殘基為W。T366W則表示第366位點上的胺基酸殘基由原來的T突變為了W。

術語“抗原結合分子”以最廣義使用，涵蓋各種特異性結合抗原的分子，包括但不限於抗體、其他具有抗原結合活性的多肽以及兩者融合而成的抗體融合蛋白，只要它們展現出期望的抗原結合活性。本文的抗原結合分子包含可變區(VH)和可變區(VL)，其共同構成抗原結合域。示例性的，本文中的抗原結合分子是雙特異性抗原結合分子(例如：雙特異性抗體)。

術語“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫鍵結合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH)，又稱作可變重域、重鏈可變區，接著是三個恆定域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域，或輕鏈可變域，接著是一個恆定輕域(輕鏈恆定區、CL)。

術語“雙特異性抗體”指能夠對兩個不同抗原或同一抗原的至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。現有技術已揭露了各種結構的雙特異性抗體，根據IgG分子的完整性可分為IgG樣雙特異性抗體和抗體片段型雙特異性抗體，根據抗原結合區域的數量可分為二價、三價、四價或更多價的雙特異性抗體，根據結構是否對稱可分為對稱結構雙特異性抗體和不對稱結構雙特異性抗體。其中，基於抗體片段的雙特異性抗體，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其藉由將2個或多個Fab片段結合在一個分子中形成雙特異性抗體，其具有較低的免疫原性，且分子量小，具有較高的腫瘤組織滲透性，該類型的典型的抗體結構如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab；IgG樣雙特異性抗體(例如具有Fc片段)，這類抗體相對分子量較大，Fc片段有助於抗體的純化，並提高其溶解性、穩定性，Fc部分還可能會與受體FcRn結合，增加抗體血清半衰期，典型的雙特異性抗體結構模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、FcΔAdp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgGTDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等(參見Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019：4516041)。

術語“可變區”或“可變域”指抗原結合分子中結合抗原的域。本文中，特異性結合PSMA的抗原結合模塊中的重鏈可變區標示為PSMA-VH，輕鏈可變區標示為PSMA-VL；特異性結合CD28的抗原結合模塊中的重鏈可變區標示為CD28-VH，輕鏈可變區標示為CD28-VL。VH和VL各包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區(CDR)。其中，術語“互補決定區”或“CDR”指可變結構域內主要促成與抗原結合的區域；“框架”或“FR”是指除CDR殘基之外的可變結構域殘基。VH包含3個CDR區：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3個CDR區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。本文中，PSMA-VH中的3個CDR區分別標示為PSMA-HCDR1、PSMA-HCDR2和PSMA-HCDR3；PSMA-VL中的3個CDR區分別標示為PSMA-LCDR1、PSMA-LCDR2和PSMA-LCDR3；CD28-VH中的3個CDR區分別標示為CD28-HCDR1、CD28-HCDR2和CD28-HCDR3； CD28-VL中的3個CDR區分別標示為CD28-LCDR1、CD28-LCDR2和CD28-LCDR3。每個VH和VL從N端到C端依次為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。單個VH或VL可能足以賦予抗原結合特異性。

可以藉由各種公知方案來確定CDR的胺基酸序列邊界，例如：“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則、“ABM”編號規則、“contact”編號規則(參見Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9：2278)等；各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。本揭露的編號規則如下表1中所示。

表1.CDR編號系統之間的關係

除非另有說明，本揭露實施例中的可變區和CDR序列均適用“Kabat”編號規則。儘管在具體的實施方案中，採用了一種編號系統(如Kabat)來限定胺基酸殘基，但是其他編號系統所的對應技術方案將視為等同技術方案。

術語“抗體片段”指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，該部分保留了完整抗體的抗原結合能力。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab')₂、單域抗體、單鏈Fab(scFab)、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

術語“Fc區”或“片段可結晶區”用於定義抗體重鏈的C末端區域，包括天然Fc區和改造的Fc區。在一些實施方式中，Fc區包含了相同或不同的兩個亞基。在一些實施方式中，人IgG重鏈的Fc區定義為從Cys226位置處的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。用於本文所述抗體的合適天然序列Fc區包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。除非另有說明，Fc區的編號規則為EU索引。

術語“Titin鏈”是指Titin蛋白中一段長度為78-118個胺基酸的包含Titin Ig-樣152結構域的肽段或其功能變體，該Titin鏈能夠與Obscurin鏈結合形成二聚化複合物。術語“Obscurin鏈”是指Obscurin蛋白上一段長度為87-117個胺基酸的包含Obscurin Ig-樣1結構域的肽段或其功能變體，或Obscurin-樣1蛋白上一段長度為78-118個胺基酸的包含Obscurin-樣Ig-樣1結構域的肽段或其功能變體，該Obscurin鏈能夠與Titin鏈結合形成二聚化複合物。本揭露的Titin鏈與Obscurin鏈可用於替換Fab中的CH1和CL，形成經替換的Fab(Fab-S)，該替換不影響抗原結合分子與抗原的結合。

術語“嵌合”抗體指這樣的一種抗體，其中重和/或輕鏈的一部分源自特定的來源或物種，而重和/或輕鏈的剩餘部分源自不同來源或物種。

術語“人源化”抗體是保留非人抗體的反應性同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，可以藉由保留非人CDR區並用其人對應物(即，恆定區以及可變區的框架區部分)替換抗體的其餘部分來實現。

術語“親和力”是指分子(例如，抗體)的單個結合部位與其結合配體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總體的強度。除非另外指明，如本文所用，“結合親和力”是指內部結合親和力，其反映出結合對(例如，抗體與抗原)的成員之間1：1相互作用。分子X對其配體Y的親和力通常可以由平衡解離常數(KD)表示。親和力可以藉由本領域已知的常規方法(包括本文所述的那些)測量。術語“kassoc”或“ka”指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而如本文所使用的術語“kdis”或“kd”意在是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所使用的，術語“KD”指平衡解離常數，其獲得自kd與ka的比率(即kd/ka)並且表示為莫耳濃度(M)。可以使用本領域已知的方法測定抗體的KD值，例如表面電漿共振法、ELISA或溶液平衡滴定法(SET)。

術語“單株抗體”指基本上均質的抗體的群或其成員，即在該群中包含的抗體分子的胺基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突變以外。相比之下，多株抗體製劑通常包含在其可變結構域具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，其通常特異性針對不同表位。“單株”表示從基本上均質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不應解釋為要求藉由任何特定方法來生產抗體。在一些實施方式中，本揭露提供的抗體是單株抗體。

術語“抗原”是指能夠由抗原結合分子(例如抗體)選擇性識別或結合的分子或分子部分。抗原可具有一個或多個能夠與不同的抗原結合分子(例如抗體)相互作用的表位。

術語“表位”指能夠與抗體或其抗原結合片段特異性結合的抗原上的區域(area或region)。表位可以由連續胺基酸(線性表位)形成或包含非連續胺基酸(構象表位)，例如因抗原的折疊(即藉由蛋白質性質的抗原的三級折疊)而使得非連續的胺基酸在空間上得以接近。構象表位和線性表位的差別在於：在變性溶劑的存在下，抗體對構象表位的結合喪失。表位包含處於獨特空間構象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10個胺基酸。篩選結合特定表位的抗體(即那些結合相同表位的)可以使用本領域例行方法來進行，例如但不限於丙胺酸掃描、肽印跡(見Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)、肽切割分析、表位切除、表位提取、抗原的化學修飾(見Prot.Sci.9(2000)487-496)和交叉阻斷(見“Antibodies”，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY))。

術語“能夠特異性結合”、“特異性結合”或“結合”是指相比其他抗原或表位，抗體能夠以更高的親和力結合至某個抗原或表位。通常，抗體以約1×10^-7M或更小(例如約1×10^-8M或更小)的平衡解離常數(KD)結合抗原或表位。在一些實施方式中，抗體與抗原結合的KD為該抗體結合至非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10%或更低(例如1%)。可使用已知的方法來測量KD，例如藉由FACS或表面電漿共振測定法所測量的。然而，特異性結合至抗原或其表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種(同源)(諸如人或猴，例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩 (Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相應抗原具有交叉反應性。

術語“不結合”是指抗體不能夠以上述特異性結合的方式結合至某個抗原或其表位。例如，當抗體以約1×10^-6M或更大的平衡解離常數(KD)結合抗原或其表位。

術語“抗原結合模塊”指特異性結合目標抗原或其表位的多肽分子。具體的抗原結合模塊包括抗體的抗原結合域，例如包含重鏈可變區和輕鏈可變區。術語“特異性結合CD28的抗原結合模塊”是指能夠以足夠的親和力結合CD28或其表位的模塊，使得含有該模塊的分子可用作靶向CD28的診斷劑和/或治療劑。例如，特異性結合CD28的抗原結合模塊具有以下的平衡解離常數(KD)：<約2×10^-8M，其是藉由表面電漿共振測定法測量的。抗原結合模塊包括如本文定義的抗體片段，例如Fab，經替換的Fab或scFv。

術語“連接子”指連接兩個多肽片段的連接單元。在本文中，同一結構式中出現的連接子可以是相同或不同的。連接子可以是肽連接子，其包含一個或多個胺基酸，典型的約1-30個、2-24個或3-15個胺基酸。應用於本文的連接子可以是相同或不同的。當“-”出現在結構式中，其表示兩側的單元直接藉由共價鍵連接。

“Tm”是溶解變性溫度(內源螢光)。當蛋白質變性(加熱或變性劑作用)時，三級結構打開，芳香族胺基酸微環境發生變化，導致發射螢光光譜改變。本揭露中，Tm1是指螢光變化到最大值的一半時的溫度。

“Tonset”是變性起始溫度。意指蛋白質開始變性時的溫度，即螢光值開始變化時的溫度。

“Tagg”是聚集起始溫度。藉由靜態光散射，在266nm和473nm兩個波長下檢測聚集體，監測到樣品開始聚集時的溫度。Tagg 266指的是266nm下監測到聚集起始溫度。

術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，該核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。“分離的”核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。編碼該抗原結合分子的分離的核酸指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一個或更多個核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的一個或更多個核酸分子，和存在於宿主細胞中一個或更多個位置的這樣的一個或更多個核酸分子。除非另有說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡並密碼子取代)和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下詳述，簡並密碼子取代可以藉由產生如下序列而獲得，在這些序列中，一個或多個所選的(或全部)密碼子的第三位被簡並鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代。

術語“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸相應的人工化學模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體。

術語序列“同一性”指，當對兩條序列進行最佳比對時，兩條序列的胺基酸/核酸在等價位置相同的程度(百分比)。在比對過程中，必要時可允許引入間隙以獲取最大序列同一性百分比，但任何保守性取代不視為構成序列同一性的一部分。為測定序列同一性百分比，比對可以藉由本領域技術已知的技術來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。

術語“融合”或“連接”是指部件(例如抗原結合模塊和Fc結構域)直接地或經由連接子共價連接。

術語“載體”意指能夠轉運與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接附加的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，例如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。術語“表達載體”或“表達構建體”是指適用於對宿主細胞進行轉化且含有指導和/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接的一個或多個異源編碼區的表達的核酸序列的載體。表達構建體可以包括但不限於影響或控制轉錄、轉譯且在存在內含子時影響與其可操作地連接的編碼區的RNA剪接的序列。

術語“宿主細胞”，“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用，並且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的後代，而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中，該術語包括突變體後代，其與在原代轉化細胞中篩選或選擇的細胞具有相同的功能或生物學活性。宿主細胞包括原核和真核宿主細胞，其中真核宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞、昆蟲細胞系植物細胞和真菌細胞。哺乳動物宿主細胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬和倉鼠細胞，包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞、3T3細胞和HEK-293細胞。真菌細胞包括酵母和絲狀真菌細胞，包括例如巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、海藻畢赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉馬畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜狀畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小畢赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌畢赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳畢赤酵母(Pichia salictaria)、格爾庫姆畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮傑普畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、構巢麯黴(Aspergillus nidulans)、黑麯黴(Aspergillus niger)、米麯黴(Aspergillus oryzae)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮刀菌(Fusarium gramineum)、菜鐮刀菌(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。畢赤酵母屬、任何釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌(Candida albicans)、任何麯黴屬、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勒克黴菌(Chrysosporium lucknowense)、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。本專利的宿主細胞不包括在專利法中不授權的客體。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。

術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述的抗原結合分子或抗體與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。

術語“藥學上可接受的載體”指藥物製劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。藥學上可接受載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

術語“受試者”或“個體”包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非明確指出，否則該術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所使用的，術語“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。

“施用”或“給予”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。

術語“樣本”是指從受試者分離的類似流體、細胞、或組織的採集物，以及存在於受試者體內的流體、細胞或組織。示例性樣本為生物流體，諸如血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、***物、痰、分泌組織和器官的黏膜分泌物、***分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體、由支氣管灌洗液收集的流體、滑液、與受試者或生物來源接觸的液體溶液，例如細胞和器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液等，組織活檢樣本、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物或細胞培養物。

“治療(treatment或treat)”和“處理”(及其語法變型)指試圖施加至所治療個體的臨床干預，並且可以為了預防目的、或者在臨床病理學的過程期間進行實施。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或復發、減輕症狀、減輕/減少疾病的任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態、和消退或改善的預後。在一些實施方案中，使用本揭露的分子來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。

術語“復發(recurrence)”、“復發(relapse)”“復發(relapsed)”是指癌症或疾病在疾病消失的臨床評估之後的恢復。遠處癌轉移或局部復發的診斷可視為復發。

術語“難治性”或“抵抗性”是指對治療無反應的癌症或疾病。

“有效量”一般是足以降低症狀的嚴重程度和/或頻率、消除這些症狀及/或潛在病因、預防症狀和/或其潛在病因出現和/或改良或改善由疾病狀態引起或與其相關的損傷的量。在一些實施例中，有效量是治療有效量或預防有效量。“治療有效量”是足以治療疾病狀態或症狀、尤其與該疾病狀態相關的狀態或症狀，或者以其他方式預防、阻礙、延遲或逆轉該疾病狀態或以任何方式與該疾病相關的任何其他不理想症狀的進展的量。“預防有效量”是當給予受試者時將具有預定預防效應，例如預防或延遲該疾病狀態的發作(或復發)，或者降低該疾病狀態或相關症狀的發作(或復發)可能性的量。完全治療或預防效未必在給予一個劑量之後便發生，可能在給予一系列劑量之後發生。因而，治療或預防有效量可以一次或多次給予的方式給予。“治療有效量”和“預防有效量”可取決於多種因素變化：諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及治療劑或治療劑組合在個體中引發期望的應答的能力。有效治療劑或治療劑組合的示例性指標包括例如患者改善的健康狀況。

術語“免疫檢查點”意指在CD4 T細胞和CD8 T細胞的細胞表面上的一組分子。這些分子可以有效地充當下調或抑制抗腫瘤免疫應答的“刹車”。免疫檢查點分子包括但不限於程序性死亡1(PD-1)、細胞毒T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)、B7H1、B7H4、OX-40、CD137、CD40和LAG-3，它們直接抑制免疫細胞。

用於本揭露的免疫檢查點抑制劑為抑制免疫檢查點分子的功能的物質。對免疫檢查點抑制劑沒有特別限制，只要抑制劑為可抑制免疫檢查點分子的功能(信號)的物質即可。可以作為可用於本揭露方法中的免疫檢查點抑制劑包括但不限於PD-1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)和/或TGFRβ的抑制劑。對抑制性分子的抑制可以藉由在DNA、RNA或蛋白

質水平抑制而實施。在實施方案中，抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA或shRNA)可以用來抑制抑制性分子的表達。在其他實施方案中，抑制性信號的抑制劑是與抑制性分子結合的多肽，例如，可溶性配體或抗體。本揭露中使用的免疫檢查點抑制劑的實例可以包括但不特別限於抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體和抗CTLA-4抗體，並且可以較佳為抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體。

本揭露的抗原結合分子

本揭露提供了抗原結合分子，其具有諸多有利的特性，例如良好的體外殺傷活性、治療活性、安全性、藥物代謝動力學特性和成藥性(如產率、純度和穩定性等)。

示例性的抗原結合分子

本揭露的抗原結合分子，包括特異性結合CD28和PSMA的雙特異性抗原結合分子(例如雙特異性抗體)和抗CD28抗體。特別的，本揭露的抗原結合分子具有如下任一的性質：

a.對CD28的高親和力。在一些實施方式中，該抗CD28抗體以小於1nM的EC50結合人CD28，該EC₅₀是藉由ELISA測量的。

b.對細胞表面的CD28和PSMA的高親和力。

c.對T細胞的體外激活活性。在一些實施方案中，該抗原結合分子在第一激活信號存在時，以小於0.1μg/mL的EC50激活表達IL-2的Jurkat細胞。

d.與PSMA/CD3雙特異性抗體聯用，誘導低水平的細胞因子(IL6和IFNγ)釋放。

e.更強的體內治療活性。在一些實施方案中，與PSMA/CD3雙特異性抗體或抗PD-1抗體聯用，具有更好的體內治療活性。

f.與PSMA/CD3雙特異性抗體聯用，可顯著增加PSMA/CD3雙特異性抗體對腫瘤細胞的殺傷作用。

本揭露提供了一種抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合CD28的抗原結合模塊和至少一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊，該特異性結合CD28的抗原結合模塊包含CD28-VH和CD28-VL，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊包含PSMA-VH和PSMA-VL。本揭露還提供了一種抗CD28抗體，其能夠特異性結合CD28，該抗體包含CD28-VH和CD28-VL。具體地，本文的實施例揭露了抗體系列81、94、97和129。以下以抗體97和94為例描述本文的抗體。

特異性結合CD28和PSMA的抗原結合分子或抗CD28抗體，其中，

(ii)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：13所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：14所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：15所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：16所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：17、54、55、56、57、58、59、60、61或62所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：18所示的CD28-LCDR3。

特異性結合CD28和PSMA的抗原結合分子或抗CD28抗體，其中，

(i)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：19所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：20所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：21所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL包含如SEQ ID NO：22所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：23所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：24所示的CD28-LCDR3；或

(ii)該CD28-VH包含如SEQ ID NO：13所示的CD28-HCDR1、如SEQ ID NO：14所示的CD28-HCDR2和如SEQ ID NO：15所示的CD28-HCDR3，和該CD28-VL如SEQ ID NO：16所示的CD28-LCDR1、如SEQ ID NO：62所示的CD28-LCDR2和如SEQ ID NO：18所示的CD28-LCDR3。

在一些實施方案中，如前所述的抗原結合分子或抗CD28抗體，該CD28-VH和/或該CD28-VL是鼠源的或人源化的。在一些實施方案中，該CD28-VH和/或該CD28-VL是人源化的。

在一些實施方案中，該人源化的CD28-VH的FR1、FR2、FR3和FR4與SEQ ID NO：98的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少60%、70%、80%或90%的序列同一性；該人源化的CD28-VL的FR1、FR2、FR3和FR4與SEQ ID NO：102的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少60%、70%、80%或90%的序列同一性。

在一些實施方案中，該人源化的CD28-VH具有來源於IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3和來源於IGHJ6*01的FR4，並且其是未被取代的或具有選自1E、26A、29L、69L、71V、78A和93S組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和/或該人源化的CD28-VL具有來源於IGKV1-33*01的FR1、FR2、FR3 和來源於IGKJ4*01的FR4，並且其是未被取代的或具有選自41D、42G、43T、44I和71Y組成的組中的一個或多個胺基酸取代。在一些實施方案中，上述可變區中的胺基酸位置是根據Kabat編號規則定義的。

在一些實施方案中，該人源化的CD28-VH包含SEQ ID NO：98的胺基酸序列或其變體。在一些實施方案中，該變體為在SEQ ID NO：98的FR區包含選自26A、29L、69L、71V、78A和93S組成的組中的一個或多個胺基酸取代。在一些實施方案中，該人源化的CD28-VL包含SEQ ID NO：102的胺基酸序列，或其變體。在一些實施方案中，該變體為在SEQ ID NO：102的FR區包含選自41D、42G、43T、44I和71Y組成的組中的一個或多個胺基酸取代。

在一些實施方案中，該人源化的CD28-VH的FR1、FR2、FR3和FR4與SEQ ID NO：69的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少60%、70%、80%或90%的序列同一性；該人源化的CD28-VL的FR1、FR2、FR3和FR4與SEQ ID NO：80的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少60%、70%、80%或90%的序列同一性。

在一些實施方案中，該人源化的CD28-VH具有來源於IGHV1-3*01的FR1、FR2、FR3和來源於IGHJ1*01的FR4，並且其是未被取代的或具有選自1E、28S、69L、71V、73K和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代；和/或該人源化的CD28-VL具有來源於IGKV1-12*01的FR1、FR2、FR3和來源於IGKJ4*01的FR4，並且其是未被取代的或具有選自43S和70K組成的組中的一個或多個胺基酸取代。在一些實施方案中，上述可變區中的胺基酸位置是根據Kabat編號規則定義的。

在一些實施方案中，該人源化的CD28-VH包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列或其變體。在一些實施方案中，該變體為在SEQ ID NO：69的FR區包含選自28S、69L、71V、73K和94S組成的組中的一個或多個胺基酸取代。在一些實施方案中，該人源化的CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列，或其變體。在一些實施方案中，該變體為在SEQ ID NO：80的FR區包含一個或多個胺基酸取代。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子或抗CD28抗體，其中該CD28-VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：95、35、94、96、97或98具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和該CD28-VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：101、36、99、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施方案中，該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95、35、94、96、97或98所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101、36、99、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115所示。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子或抗CD28抗體，該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：94所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115所示，或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115所示，或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：96所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：99或100所示，或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：97所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：99、100或101所示。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子或抗CD28抗體，該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：95所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子或抗CD28抗體，其中該CD28-VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：68、33、63、64、65、66、67或69具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和該CD28-VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：80、34、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施方案中，該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68、33、63、64、65、66、67或69所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：80、34、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79所示。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子或抗CD28抗體，該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：70或71所示，或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：64所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：70、71或72所示，或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：70、71或72所示，或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：70、71、72、74、75、76或79所示，或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：72、74、75、76或79所示，或

該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：72、73、74、75、76、77、78、79或80所示。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子或抗CD28抗體，該CD28-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和該CD28-VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示。

在一些實施方案中，如前所述的抗原結合分子，其中，

ii)該PSMA-VH包含如SEQ ID NO：170所示的PSMA-HCDR1，如SEQ ID NO：171所示PSMA-HCDR2，和如SEQ ID NO：172所示的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL包含如SEQ ID NO：173所示的PSMA-LCDR1，如SEQ ID NO：174所示的PSMA-LCDR2，和如SEQ ID NO：175所示的PSMA-LCDR3。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，該PSMA-VH和/或該PSMA-VL是鼠源的或人源化的。在一些實施方案中，該PSMA-VH 和/或該PSMA-VL是人源化的。在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，

i)該PSMA-VH的胺基酸序列SEQ ID NO：197、199、332、194、195、196或198所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列SEQ ID NO：201、202、333或200所示；或

ii)該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：204、184或203所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列SEQ ID NO：206、185或205所示。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，

i)該PSMA-VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：204所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列SEQ ID NO：206所示；或

ii)該PSMA-VH的胺基酸序列SEQ ID NO：197所示，和該PSMA-VL的胺基酸序列SEQ ID NO：201所示；或

在一些實施方案中，上述可變區和CDR是根據Kabat編號規則定義的。

根據本文實施例所揭露的抗體系列81和129與以上所描述的抗體系列97和94具有類似的技術方案範圍。

抗原結合分子的結構

本揭露的雙特異性抗原結合分子並不受限於特定的分子結構，只要其具有所期望的抗原結合功能。例如，本文的雙特異性抗原結合分子可以是雙價(1+1)的、三價(2+1)的或4價(2+2)的。抗原結合分子中的抗原結合模塊可以是任意的具有抗原結合活性的抗體片段，其藉由肽連接子融合。本揭露的肽連接子(例如連接子1至11)可以是任意適宜的肽鏈，只要抗原結合分子能夠展現出期望的抗原結合活性。例如，肽連接子可以是包含1-50或3-20個胺基酸殘基的柔性肽。在一些實施方式中，該肽連接子各自獨立地具有L₁-(GGGGS)n-L₂的結構，其中，L₁是鍵、A、GS、GGS(SEQ ID NO：399)、GGGS(SEQ ID NO：400)、SGGGGS(SEQ ID NO：294)、GGGTKLTVLGGG(SEQ ID NO：401)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是鍵、G、GG、GGG(SEQ ID NO：295)或GGGG(SEQ ID NO：256)，並且該肽連接子不是鍵。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，該肽連接子各自獨立地具有(GGGGS)n的結構，其中n是1、2或3。在一些實施方案中，該連接子1、連接子2、連接子3和連接子4的胺基酸序列如SEQ ID NO：223所示。

示例性的，本揭露的該抗原結合分子具有式(a)所示結構的第一鏈、一條具有式(b)所示結構的第二鏈、一條具有式(c-1)所示結構的第三鏈和一條具有式(d-1)所示結構的第四鏈，

(a)[CD28-VH]-[CH1]-[Fc1]，

(b)[CD28-VL]-[CL]，

(c-1)[PSMA-VH]-[GGGGS]-[Titin鏈]-[Fc2]，

(d-1)[PSMA-VL]-[GGGGS]-[Obscurin鏈]，

式(a)、(b)、(c-1)和(d-1)所示的結構是從N端至C端排列的。

示例性的抗原結合分子具有：

示例性的，該抗原結合分子包含一條具有式(e-1)所示結構的第一鏈、一條具有式(f-1)所示結構的第二鏈、一條具有式(g)所示結構的第三鏈和一條具有式(h)所示結構的第四鏈，

(e-1)[CD28-VH]-[GGGGS]-[Titin鏈]-[Fc1]，

(f-1)[CD28-VL]-[GGGGS]-[Obscurin鏈]，

(g)[PSMA-VH]-[CH1]-[Fc2]，

(h)[PSMA-VL]-[CL]，

式(e-1)、(f-1)、(g)和(h)所示的結構是從N端至C端排列的。

示例性的抗原結合分子具有：

抗原結合分子的變體

在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗原結合分子的胺基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以藉由將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者藉由肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗原結合分子的胺基酸序列內的殘基的刪除、和/或***、和/或取代。可以進行刪除、***、和取代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特徵，例如抗原結合特性。

取代、***、和刪除變體

在某些實施方案中，提供了具有一處或多處胺基酸取代的抗原結合分子變體。可以在CDR和FR進行取代。保守取代在表2中在“較佳的取代”的標題下顯示。更實質的變化在表2中在“示例性取代”的標題下提供，並且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步描述的。可以將胺基酸取代引入感興趣的抗體中，並且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

依照常見的側鏈特性，胺基酸可以如下分組：

(1)疏水性的：正亮胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性，親水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)鹼性的：His，Lys，Arg；

(5)影響鏈取向的殘基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守取代會是指用一個類別的成員替換另一個類別的成員。

一類取代變體涉及取代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個CDR殘基。一般地，經選擇用於進一步研究的所得變體相對於親本抗體會具有某些生物學特性(例如升高的親和力，降低的免疫原性)的改變(例如改善)，和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一種例示性的取代變體是親和力成熟的抗體，可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術(如本文所述的那些技術)，便利地產生該抗體。簡言之，將一個或多個CDR殘基突變，並將變體抗體在噬菌體上展示，並對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。可以對CDR做出改變(例如取代)，例如以改善抗體親和力。可以對CDR“熱點”，即在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基，和/或接觸抗原的殘基做出此類改變，同時對所得的變體VH或VL測試結合親和力。在親和力成熟的一些實施方案中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸指導的誘變)的任一種，將多樣性引入所選擇用於成熟的可變基因中。然後，創建次級文庫。然後，篩選文庫以鑑定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法涉及CDR定向的方法，其中將幾個CDR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可以例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性鑑定涉及抗原結合的CDR殘基。

在某些實施方案中，取代、***或缺失可以在一個或多個CDR內發生，只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如，可以對CDR做出保守變化(例如保守取代，如本文中提供的)，其不實質性降低結合親和力。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方案中，每個CDR是未改變的，或者含有不超過1、2或3處胺基酸取代。

一種可用於鑑定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作“丙胺酸掃描誘變”。在這種方法中，鑑定一個殘基或殘基組(例如帶電荷的殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，並且替換為中性或帶負電荷的胺基酸(例如，Ala或聚丙胺酸)，以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響。可以在對初始取代顯示功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的取代。此外，可藉由研究抗原 -抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體與抗原間的接觸點。這些接觸殘基及鄰近殘基可以作為取代候選物被打靶或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。

胺基酸序列***包括：在胺基和/或羧基端融合1個殘基或長度為100或更多個殘基的多肽；和單個或多個胺基酸殘基的序列內***。在末端***的例子包括具有N端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它***變體包括，在抗體的N或C端融合有酶(或延長抗體的血清半衰期的多肽)的融合物。

Fab的改造

在一個方面，本揭露的抗原結合分子中，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊和該特異性結合CD28的抗原結合模塊兩者之一是經替換的Fab，該經替換的Fab包含重鏈可變區、輕鏈可變區、Titin鏈和Obscurin鏈。在經替換的Fab中，Fab原有的CH1和CL被Titin鏈和Obscurin鏈所替換。示例性的，Titin鏈和Obscurin鏈的序列如表3-1和表3-2所示。

Fc區的改造

在一個方面，本揭露的抗原結合分子的Fc區包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代減少其與Fc受體的結合，例如其與Fcγ受體的結合，並且降低或消除效應子功能。天然IgG Fc區，具體地是IgG₁ Fc區或IgG₄ Fc區，可能導致本揭露的抗原結合分子靶向表達Fc受體的細胞，而不是表達抗原的細胞。本揭露改造的Fc區表現出降低的對Fc受體的結合親和力和/或降低的效應子功能。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對Fc受體的結合親和力下降50%、80%、90%或95%以上。在一些實施方案中，該Fc受體是Fcγ受體。在一些實施方案中，該Fc受體是人Fcγ受體，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIB、FcγRIIIa。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對補體，如C1q的結合親和力也降低。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力不降低。在一些實施例中，改造的Fc區具有降低的效應子功能，該降低的效應子功能可以包括但不限於以下中的一個或多個：降低的補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、降低的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、減少的細胞因子分泌、減少的免疫複合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、減少的與NK細胞的結合、減少的與巨噬細胞的結合、減少的與單核細胞的結合、減少的與多形核細胞的結合、減少的直接信號傳導誘導性細胞凋亡、降低的樹突細胞成熟或減少的T細胞引發。對於IgG₁ Fc區，在238、265、269、270、297、327和329等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。在一些實施方案中，該Fc區是人IgG₁ Fc區，並且在234和235位置的胺基酸殘基為A，編號依據為EU索引。對於IgG₄ Fc區，在228等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。

抗原結合分子還可包含二硫鍵改造，例如第一亞基的354C和第二亞基的349C。為增加抗原結合分子的血清半衰期，可以引入252Y、254T和256E的突變。

當抗原結合分子包含與Fc區的兩個亞基融合的不同結合模塊，可能導致不期望的同源二聚化。為了提高產率和純度，因此在本揭露的抗原結合分子的Fc區中引入促進異源二聚化的修飾將是有利的。在一些實施方式中，本揭露的Fc區包含根據杵臼(knob-into-hole，KIH)技術的改造，該方法涉及在第一亞基的界面處引入凸起結構(knob)以及在第二亞基的界面處引入孔結構(hole)。使得該凸起結構可以定位在孔結構中，促進異源二聚體的形成並抑制同源二聚體的產生。凸起結構是藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)取代來自第一亞基的界面的小胺基酸側鏈而構建的。而孔結構是藉由用較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈而在第二亞基的界面中創建的。凸起結構和孔結構藉由改變編碼多肽的核酸來製備，可選的胺基酸取代如下表所示：

除了杵臼技術外，用於修飾重鏈的CH3結構域以實現異源二聚化的其他技術也是本領域中已知的，例如WO1996027011A1、WO1998050431、EP1870459、WO2007110205、WO2009089004、WO2010129304、WO201190754、WO2011143545、WO2012058768、WO2013157954和WO2013096291。

Fc區的C末端可以是以胺基酸殘基PGK結束的完整C末端；也可以是截短的C末端，例如在該截短的C末端中去除了一個或兩個C末端胺基酸殘基。在一個較佳的方面中，重鏈的C末端是以PG結束的縮短的C末端。因此，在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括去除了所有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括沒有去除K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物具有帶有和不帶有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體混合物的抗體群體。

重組方法

抗原結合分子可以使用重組方法來產生。對於這些方法，提供編碼抗原結合分子的一個或更多個分離的核酸。

在天然抗體、天然抗體片段或具有同源二聚體重鏈的雙特異性抗體的情況下，需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段，一個用於重鏈或其片段。此類核酸編碼包含抗體VL的胺基酸序列和/或包含抗體VH的胺基酸序列(例如抗體的輕鏈和/或重鏈)。這些核酸可以在相同的表達載體上或在不同的表達載體上。

在具有異二聚體重鏈的雙特異性抗體的情況下，需要例如四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於包含第一異源單體Fc區多肽的第一重鏈，一個用於第二輕鏈，並且一個用於包含第二異源單體Fc區多肽的第二重鏈。這四個核酸可包含在一個或更多個核酸分子或表達載體中，通常這些核酸位於兩個或三個表達載體上，即一個載體可包含這些核酸中的多於一個。

在一個實施方案中，本揭露提供了編碼如前所述的抗體的分離的核酸。此類核酸可以獨立地編碼前述的任一多肽鏈。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的一種或多種載體(例如表達載體)。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，提供製備抗原結合分子的方法，其中該方法包括，在適合抗體表達的條件下，培養包含編碼該抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

為了重組產生抗原結合分子，將編碼蛋白的核酸分離並***一個或更多個載體中，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸可以使用常規程序容易地分離和測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)，或者藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。

用於選殖或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別是當抗體不需要糖基化和Fc效應子功能時。在表達後，抗體可以在可溶級分中從細菌細胞糊狀物分離，並且可進一步純化。

除了原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是用於編碼抗體的載體的合適的選殖或表達宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途徑已經“人源化”，導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。適於表達(糖基化)抗體的合適的宿主細胞也可源自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)；無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑑定了許多杆狀病毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，特別是用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染；還可利用植物細胞培養物作為宿主，例如US5959177、US 6040498、US6420548、US 7125978和US6417429；也可將脊椎動物細胞用作宿主，例如適應於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。適宜的哺乳動物宿主細胞系的其它例子是經SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293或293T細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞；MRC 5細胞；和FS4細胞。其它適宜的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞；以及骨髓瘤細胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(編)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268頁。

診斷與治療組成物

在某些實施方案中，本揭露提供的抗原結合分子可用於檢測生物學樣品中PSMA和/或CD3的存在。在用於本文時，術語“檢測”涵蓋定量或定性檢測。在某些實施方案中，生物學樣品包含細胞或組織，諸如腫瘤組織。

在一個實施方案中，提供了在診斷或檢測方法中使用的抗原結合分子。在又一方面，提供了檢測生物學樣品中PSMA和/或CD3的存在的方法。在某些實施方案中，該方法包括在適宜條件下使生物學樣品與抗原結合分子接觸，並檢測是否在檢測試劑與抗原之間形成複合物。此類方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，使用抗原結合分子來選擇適合治療的受試者，例如PSMA和/或CD3是用於選擇患者的生物標誌物。

可使用本揭露的抗原結合分子來診斷的例示性病症，例如腫瘤或癌症。

在某些實施方案中，提供了經標記的抗原結合分子。標記物包括但不限於直接檢測的標記物或模塊(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光、和放射性標記物)，和間接檢測的模塊(例如，經由酶反應或分子相互作用間接檢測的模塊，諸如酶或配體)。

在另外的方面，提供包含該抗原結合分子的醫藥組成物，例如，用於以下任何治療方法。在一個方面，醫藥組成物包含本文提供的任何抗原結合分子和藥學上可接受的載體。在另一個方面，醫藥組成物包含本文提供的任何抗原結合分子和至少一種另外的治療劑。

本揭露該抗原結合分子的醫藥組成物藉由以下製備：將具有所需純度的此類抗原結合分子與一種或更多種視需要的藥學上可接受的載體混合，該醫藥組成物為凍乾組成物或水溶液的形式。用於體內施用的製劑一般是無菌的。無菌性可容易地實現，例如藉由穿過無菌濾膜過濾。

治療方法與施用途徑

本文提供的任何抗原結合分子可用於治療方法。

在又一個方面，本揭露提供抗原結合分子在藥物的製造或製備中的用途。在一個實施方案中，該藥物用於治療增殖性疾病或腫瘤。並且該藥物是以對上述疾病的有效量的形式存在的。在一些實施方式中，該有效量是單位日劑量或單位週劑量。在一個此類實施方案中，該用途進一步包括向受試者施用有效量的至少一種另外的治療劑(例如一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。根據任意以上實施方案的“受試者”可以是人。

在又一個的方面，提供包含該抗原結合分子的醫藥組成物，例如，其用於以上任何製藥用途或治療方法。在另一個實施方案中，醫藥組成物還包含至少一種另外的治療劑。

本揭露的抗原結合分子可單獨使用或與其他試劑聯合用於治療。例如，本揭露的抗原結合分子可與至少一種另外的治療劑共同施用。在一些實施方案中，該另外的治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體或抗PD-1抗體。

本揭露的抗原結合分子(和任何另外的治療劑)可藉由任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果需要局部治療，則病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。給藥可以藉由任何適當的途徑，例如，藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，這部分取決於施用是短期的還是長期的。本文考慮多種給藥時間方案，包括但不限於，單次或在多個時間點多次施用，推注施用和脈衝輸注。

本揭露的抗原結合分子將以符合良好醫療實踐(GOOD MEDICAL PRACTICE)的方式配製、給藥和施用。在此背景下考慮的因素包括所治療的具體病症、所治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、病症的起因、試劑的遞送部位、施用方法、施用時間安排以及醫學從業者已知的其他因素。抗原結合分子無需但視需要地與目前用於預防或治療該病症的一種或更多種試劑一起配製。此類其它試劑的有效量取決於醫藥組成物中存在的抗原結合分子的量、病症或治療的類型以及上文討論的其它因素。這些通常以與本文所述相同的劑量和施用路徑使用，或以本文所述劑量的約1至99%使用，或以任何劑量使用，並藉由經驗/臨床確定為合適的任何途徑使用。

為了預防或治療疾病，本揭露的抗原結合分子(當單獨使用或與一種或更多種其他另外的治療劑組合使用時)的適當的劑量將取決於待治療的疾病的類型，治療分子的類型，疾病的嚴重性和病程，是為預防還是治療目的施用，之前的治療，患者的臨床病史和對治療分子的響應，和主治醫師的判斷。治療分子恰當地以一次或經過一系列治療施用於患者。取決於疾病的類型和嚴重性，約 1μg/kg至15mg/kg的抗原結合分子可以是用於施用至患者的初始候選劑量，不管例如是藉由一次或更多次分開的施用還是藉由連續輸注。一種典型的每日劑量可能在約1μg/kg至100mg/kg或更多的範圍內，這取決於上文提及的因素。相應的，以50kg體重為例，示例性的單位日劑量為50μg-5g。

製品

在本揭露的另一方面中，提供一種製品，該製品包含可用於治療、預防和/或診斷上述病症的材料。該製品包含容器和在容器上或與容器聯合的標簽或包裝插頁(package insert)。合適的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以自各種材料諸如玻璃或塑料形成。容器裝有單獨或與另一種組成物組合有效治療，預防和/或診斷疾患的組成物，並且可具有無菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或管形瓶)。組成物中的至少一種活性試劑是本揭露的抗原結合分子。標簽或包裝插頁指示使用該組成物是來治療選擇的病況。此外，製品可以包含：(a)其中裝有組成物的第一容器，其中該組成物包含本揭露的抗原結合分子；和(b)其中裝有組成物的第二容器，其中該組成物包含另外的細胞毒性劑或其他方面的治療劑。本揭露的該實施方案中的製品可進一步包含包裝插頁，該包裝插頁指示該組成物可以用於治療特定病況。備選地，或另外地，製品可進一步包含第二(或第三)容器，該第二(或第三)容器包含藥學上可接受的緩衝液。從商業和用戶立場，它可進一步包括所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。作為一個示例，製品製備成藥盒(kit)的形式。

實施例與測試例

以下結合實施例和測試例進一步描述本揭露，但這些實施例和測試例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例和測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1.含有Titin鏈/Obscurin鏈的抗原結合分子

本揭露的Titin鏈/Obscurin鏈可以來源於任意適宜的多肽，包括來源於WO2021139758(藉由援引完整收入本文)和CN202110527339.7及將其作為優先權文件的專利(藉由援引完整收入本文)中的多肽。構建雙特異性抗體，其中CL為WO2021139758中的kappa輕鏈恆定區(序列參見說明書第[0377]段)，Titin鏈和Obscurin鏈的胺基酸序列見表3-1和表3-2，連接子序列包括GGGGS(SEQ ID NO：223)、ASTKG(SEQ ID NO：397)或RTVAS(SEQ ID NO：398)，本實施例中的Fc1、Fc2、CH1的胺基酸序列如下所示。

>實施例1-Fc1(knob，SEQ ID NO：394)

>實施例1-Fc2(hole，SEQ ID NO：222)

>實施例1-CH1(SEQ ID NO：219)

1.1 DI雙特異性抗體

參照WO2021139758的實施例5，構建抗hNGF和hRANKL的DI雙特異性抗體：DI-2至DI-20，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：

第一重鏈：從N端到C端依次為：[VH1-I]-[連接子1]-[Obscurin鏈]-[Fc2]，

第一輕鏈：從N端到C端依次為：[VL1-I]-[連接子2]-[Titin鏈]，

第二重鏈：從N端到C端依次為：[VH2-D]-[CH1]-[Fc1]，和

第二輕鏈：從N端到C端依次為：[VL2-D]-[CL]；

其中，VH1-I和VL1-I分別為WO2021139758中I0的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH2-D和VL2-D分別為WO2021139758中D0的重鏈可變區和輕鏈可變區。本實施例中DI雙特異性抗體中Obscurin鏈、Titin鏈、連接子1、連接子2結構見下表。

採用WO2021139758的測試例4中的方法檢測DI-2至DI-20雙特異性抗體與其抗原的結合活性。對抗體進行熱穩定性研究。研究方法：用PBS將抗體的濃度稀釋至5mg/mL，採用高通量微分掃描螢光儀(UNCHAINED，規格型號：Unit)測定其熱穩定性。實驗結果表明，改造後的雙特異性抗體對抗原的結合活性沒有顯著變化；並且，與DI-2相比，DI-4至DI-8、DI-10至DI-16、DI-20的Tm1(℃)、Tnset(℃)有明顯的提升，雙特異性抗體的熱穩定性更優。

採用10mM乙酸，pH5.5，9%蔗糖的緩衝液配製含DI雙特異性抗體的溶液，將溶液置於40℃恆溫箱中孵育四週，結束後將抗體濃度濃縮至孵育開始時濃度，觀察溶液沉澱情況。實驗結果表明，DI-2雙特異性抗體組溶液出現沉澱，DI-3至DI-7相比DI-2具有更好的穩定性。

1.2 PL雙特異性抗體

構建抗hPDL1和hCTLA4的PL雙特異性抗體：PL-1至PL-19，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：

第一重鏈：從N端到C端依次為：[VH1-P]-[連接子1]-[Obscurin鏈]-[Fc1]，

第一輕鏈：從N端到C端依次為：[VL1-P]-[連接子2]-[Titin鏈]，

第二重鏈：從N端到C端依次為：[VH2-L]-[CH1]-[Fc2]，和

第二輕鏈：從N端到C端依次為：[VL2-L]-[CL]；

其中，VH1-P和VL1-P分別為WO2020177733A1中h1831K抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH2-L和VL2-L的胺基酸序列如下所示。

>VH2-L(SEQ ID NO：395)

>VL2-L(SEQ ID NO：396)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK

本實施例中PL雙特異性抗體中Obscurin鏈、Titin鏈、連接子1、連接子2結構見下表。

參照WO2021139758中測試例4中的ELISA方法檢測PL雙特異性抗體的結合活性，其中hPDL1、hCTLA4抗原購自：Sino biology。對抗體進行熱穩定性研究。方法：用PBS將抗體的濃度稀釋至1.4-3mg/mL，採用高通量微分掃描螢光儀(UNCHAINED，規格型號：Unit)測定其熱穩定性。實驗結果表明，PL雙特異性抗體對抗原仍具有良好的結合活性；並且，與PL-1相比，PL-2至PL-19的Tm1(℃)、Tagg 266(℃)、Tonset(℃)有明顯的提升，雙特異性抗體的熱穩定性更優。

1.3 HJ雙特異性抗體

構建抗hIL5和hTSLP的HJ雙特異性抗體：HJ-3至HJ11，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：

第一重鏈：從N端到C端依次為：[VH1-H]-[連接子1]-[Titin鏈]-[Fc1]，

第一輕鏈：從N端到C端依次為：[VL1-H]-[連接子2]-[Obscurin鏈]，

第二重鏈：從N端到C端依次為：[VH2-J]-[CH1]-[Fc2]，和

第二輕鏈：從N端到C端依次為：[VL2-J]-[CL]；

其中，VH1-H和VL1-H分別為WO2021139758中H0的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH2-J和VL2-J分別為WO2021139758中J1的重鏈可變區和輕鏈可變區。本實施例中HJ雙特異性抗體中Obscurin鏈、Titin鏈、連接子1、連接子2結構見下表。

參照WO2021139758中測試例4中的方法檢測HJ雙特異性抗體的抗原結合活性。對抗體的熱穩定性進行研究，方法：用10mM乙酸pH5.5、9%蔗糖的緩衝液配製HJ雙特異性抗體稀釋溶液，然後藉由超濾濃縮的方法將雙特異性抗體濃縮，獲得不同濃度的HJ雙特異性抗體溶液(HJ雙特異性抗體的濃度見表13-2)，然後將濃縮溶液置於40℃恆溫箱中孵育，第0天(也即40℃孵育開始前，D0)，第7天(40℃孵育第7天，D7)，第14天(40℃孵育第14天，D14)，第21天(40℃孵育第21天，D21)和第28天(40℃孵育第28天，D28)檢測樣品的SEC純度，40℃孵育28天後，馬上取樣檢測樣品CE-SDS純度。實驗結果表明，本揭露構建的HJ雙特異性抗體對抗原的結合活性沒有顯著變化；並且，與HJ-3相比，HJ-5至HJ-11雙特異性抗體的熱穩定性更優。

實施例2.抗人CD28融合瘤抗體的篩選和鑑定

2.1 細胞株構建

構建CHO-hPSMA、CHO-APC-hPSMA、CHO-hCD28、HEK293-hCD28、CHO-APC-hPSMA-PDL1和Jurkat-PD1細胞株，相關蛋白序列如下：

人PSMA蛋白(UniProtKBQ04609)：

SEQ ID NO：1

人CD28蛋白(UniProt P10747)：

SEQ ID NO：2

人PD1蛋白(UniProt Q15116)：

SEQ ID NO：3

人PDL1蛋白(UniProt Q9NZQ7)：

SEQ ID NO：4

將編碼人PSMA或人CD28全長基因選殖到哺乳動物細胞表達載體pCDH上，用pVSV-G、pCMV-dR8.91和pCDH-hPSMA三種質粒共同轉染HEK293T細胞(ATCC,CRL-11268)包裝病毒。轉染48小時後，收集病毒感染HEK293(ATCC,CRL-1573)，CHO-K1(ATCC,CCL-61)或CHO-APC細胞(Promega,JA9441)，藉由加壓篩選兩週後，進行細胞亞選殖，經過FACS檢測獲得高表達PSMA或CD28的CHO-hPSMA、CHO-APC-hPSMA、CHO-hCD28和HEK293-hCD28細胞株。

將編碼人PDL1或人PD1全長基因選殖到哺乳動物細胞表達載體pCDH上，用pVSV-G、pCMV-dR8.91和pCDH-hPSMA三種質粒共同轉染HEK293T細胞(ATCC® CRL-11268)包裝病毒，轉染48小時後，收集病毒感染前文所述CHO-APC-hPSMA或Jurkat(ATCC,TIB-152)細胞，藉由加壓篩選，進行細胞分選獲得高表達PDL1或PD1的CHO-APC-hPSMA-PDL1和Jurkat-PD1的細胞株。

2.2 抗CD28融合瘤抗體的篩選和鑑定

本揭露藉由融合瘤技術製備了針對人CD28的單株抗體，所得抗體以較高的親和力與人CD28特異性結合，並且可以與食蟹猴CD28有交叉結合，與細胞表面的人CD28和食蟹猴CD28均有較好的結合活性。

以人CD28-his、人CD28-Fc、CHO-hCD28細胞或HEK293-hCD28細胞為免疫原。蛋白初次免疫50μg，加強免疫每次25μg，以TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)為佐劑交叉免疫。細胞免疫按照每次5E6進行免疫。經過初次免疫和7次加強免疫後選擇血清中抗體滴度高小鼠進行脾細胞融合。免疫原序列如下：

人CD28-his：

SEQ ID NO：5

人CD28-Fc：

SEQ ID NO：6

融合後根據融合瘤細胞生長密度，對融合瘤培養上清進行檢測。篩選出和細胞表面的人CD28有較好的結合活性，且具有良好激活功能的融合瘤。收集單株融合瘤細胞，用NucleoZol(MN)提取RNA(按照試劑盒說明書步驟)，並進行反轉錄(PrimeScript^TM Reverse Transcriptase，Takara,cat # 2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用小鼠Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序，獲得融合瘤細胞株中抗體的CDR和可變區的胺基酸序列。

>m81VH：

SEQ ID NO：31

>m81VL：

DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLVWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSSPLTFGGGTKLEIK SEQ ID NO：32

>m94VH：

SEQ ID NO：33

>m94VL：

DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO：34

>m97VH：

SEQ ID NO：35

>m97VL：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK SEQ ID NO：36

>m129VH：

SEQ ID NO：37

>m129VL：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEHGDIATYFCQQGYTLPRTFGGGTKLEIK SEQ ID NO：38

註：下劃線部分為根據Kabat編號規則獲得的CDR區。

鼠源抗CD28抗體的可變區序列分別與SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：145所示的重鏈和輕鏈恆定區組合獲得嵌合抗體。示例性的，Chi81表示包含m81鼠源重鏈可變區、輕鏈可變區和該SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：145所示的重鏈和輕鏈恆定區的嵌合抗體。Chi94、Chi97和Chi129依此類推。

實施例3.抗CD28單株抗體的人源化

鼠源抗體的人源化根據本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，從人源種系數據庫中搜索輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)的同源序列，按FR的同源性由高到低排序，選取FR同源性最高的種系作為模板，將鼠源抗體的CDR區移植到人源模板上，對可變區的某些胺基酸突變，並將鼠源抗體的恆定區替換為人恆定區，得到最終的人源化抗體。

3-1. m81抗體的人源化

m81抗體的人源化抗體選擇IGKV1-12*01的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板；選擇IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3和IGHJ1*01的FR4作為重鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的輕鏈可變區上第43、54和/或73位的胺基酸殘基進行取代；和/或對人源化抗體的重鏈可變區上第1、69、71、73、78、94、100a、100b和/或100c位的胺基酸殘基進行取代。

m81的人源化抗體的CDR如下：

人源化抗體h81可變區序列如下：

>h81VH1：

SEQ ID NO：44

>h81VH2：

SEQ ID NO：45

>h81VH3：

SEQ ID NO：46

>h81VH4：

SEQ ID NO：47

>h81VH5：

SEQ ID NO：48

>h81VH6：

SEQ ID NO：49

>h81VL1：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLVWYQQKPGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSSPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：50

>h81VL2：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLVWYQQKPGK

PKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFT

TISSLQPEDFATYYCQQLYSSPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：51

>h81VL3：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLVWYQQKPGKAPKLLIYAATS

ADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSSPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：52

>h81VH7：

SEQ ID NO：53

註：單下劃線部分為CDR，雙下劃線處為胺基酸取代位點，其餘部分為FR。

3-2. m94抗體的人源化

m94的人源化抗體選擇IGKV1-12*01的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板；選擇IGHV1-3*01的FR1、FR2、FR3和IGHJ1*01的FR4作為重鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的輕鏈可變區上第43、50、51、53、54、55和/或70位的胺基酸殘基進行取代；和/或對人源化抗體的重鏈可變區上第1、28、66、69、71、73和/或94位的胺基酸殘基進行取代。

m94的人源化抗體的CDR區序列如下：

人源化抗體h94可變區序列如下：

>h94VH1：

SEQ ID NO：63

>h94VH2：

SEQ ID NO：64

>h94VH3：

SEQ ID NO：65

>h94VH4：

SEQ ID NO：66

>h94VH5：

SEQ ID NO：67

>h94VH6：

SEQ ID NO：68

>h94VH7：

SEQ ID NO：69

>h94VL1：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：70

>h94VL2：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：71

>h94VL3：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIYAAT

LADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：72

>h94VL4：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIYAAT

LADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：73

>h94VL5：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIY

ATSLADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：74

>h94VL6：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIY

ATSLADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：75

>h94VL7：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIYA

TSLADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：76

>h94VL8：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIYA

TSLADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：77

>h94VL9：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIYAAT

LADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：78

>h94VL10：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIYAATSL

DGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：79

>h94VL12：

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGK

PKLLIYAAT

ADGVPSRFSGSGSGT

FTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSTPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：80

3-3. m97的人源化

鼠源抗體97的人源化抗體選擇IGKV1-33*01的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板；選擇IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3和IGHJ6*01的FR4作為重鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的輕鏈可變區上第41、42、43、44、50、51、52、53、54、55、56和/或71位的胺基酸殘基進行取代；和/或對人源化抗體的重鏈可變區上第1、26、29、69、71、78和/或93位的胺基酸殘基進行取代。

m97人源化抗體的CDR區如下：

人源化抗體h97可變區序列如下：

>h97VH1：

SEQ ID NO：94

>h97VH2：

SEQ ID NO：95

>h97VH3：

SEQ ID NO：96

>h97VH4：

SEQ ID NO：97

>h97VH5：

SEQ ID NO：98

>h97VL1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：99

>h97VL2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：100

>h97VL3：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKP

KLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：101

>h97VL4：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：102

>h97VL1-1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTS

L

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：103

>h97VL1-2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYT

RL

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：104

>h97VL1-3：

SEQ ID NO：105

>h97VL1-4：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYY

SRL

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：106

>h97VL1-5：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSRL

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：107

>h97VL1-6：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIY

TSRL

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：108

>h97VL2-1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYYTSR

HSGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：109

>h97VL2-2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIY

TSRL

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：110

>h97VL2-3：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYY

SRL

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：111

>h97VL2-4：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYY

SRL

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：112

>h97VL2-5：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYYT

RL

SGVPSRFSGSGSGTD

TFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：113

>h97VL2-6：

SEQ ID NO：114

>h97VL2-7：

SEQ ID NO：115

3-4. m129的人源化

鼠源抗體m129的人源化抗體選擇IGKV1-33*01的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板；選擇IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3和IGHJ6*01的FR4作為重鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的輕鏈可變區上第41、42、43、44、50、53、54、55和/或73位的胺基酸殘基進行取代；和/或對人源化抗體的重鏈可變區上第1、25、30、34、52、71和/或78位的胺基酸殘基進行取代。

m129的人源化抗體的CDR如下：

人源化抗體129的可變區序列如下：

>h129VH1：

SEQ ID NO：123

>h129VH2：

SEQ ID NO：124

>h129VH3：

SEQ ID NO：125

>h129VH4：

SEQ ID NO：126

>h129VH5：

SEQ ID NO：127

>h129VH6：

SEQ ID NO：128

>h129VH7：

SEQ ID NO：129

>h129VH8：

SEQ ID NO：130

>h129VH9：

SEQ ID NO：131

>h129VH10：

SEQ ID NO：132

>h129VH11：

SEQ ID NO：133

>h129VL1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：134

>h129VL2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPG

A

KLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFT

TISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：135

>h129VL3：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKP

KLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFT

TISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：136

>h129VL4：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：137

>h129VL5：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYYTSR

HSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：138

>h129VL6：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYYTSRL

SGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：139

>h129VL7：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSR

HSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：140

>h129VL8：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYYTS

HSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：141

>h129VL9：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIYYTSR

SGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：142

>h129VL10：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKA

KLLIY

TSR

HSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYTLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：143

將抗CD28人源化抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區分別與重鏈恆定區hIgG1：CH1-Fc和輕鏈恆定區CL重組，獲得全長的人源化抗體。

>hIgG1：CH1-Fc：

SEQ ID NO：144

>CL：

SEQ ID NO：145

本揭露抗CD28的人源化抗體如下：

示例性的，抗CD28人源化抗體的全長序列如下：

81H1L3重鏈：

SEQ ID NO：146

81H1L3輕鏈：

SEQ ID NO：147

94H6L12重鏈：

SEQ ID NO：148

94H6L12輕鏈：

SEQ ID NO：149

97H2L3重鏈：

SEQ ID NO：150

97H2L3輕鏈：

SEQ ID NO：151

129H4L1重鏈：

SEQ ID NO：152

129H4L1輕鏈：

SEQ ID NO：153

本揭露使用的抗CD28抗體的對照抗體如下：

REGN-hIgG1參考專利US20190389951A1構建，其序列如下：

>REGN-hIgG1重鏈：

SEQ ID NO：154

>REGN-hIgG1輕鏈：

SEQ ID NO：155

CD28超級激動劑TGN1412參考專利US07585960B2製備，具體序列如下：

>TGN1412輕鏈：

SEQ ID NO：156

>TGN1412重鏈：

SEQ ID NO：157

實施例4.抗人PSMA融合瘤抗體的篩選和鑑定

本揭露藉由融合瘤技術製備了針對人PSMA的單株抗體。所得抗體與人PSMA以較高的親和力特異性結合，並且可以與食蟹猴PSMA發生交叉反應；所得抗體與細胞表面的人PSMA和食蟹猴PSMA有較好的結合活性。

將人PSMA-ECD-his、LnCap細胞(ATCC)或CHOK1-hPSMA細胞作為免疫試劑，或者將人PSMA-ECD-his和LnCap細胞作為交叉免疫試劑， TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)作為佐劑交叉免疫小鼠。經過初次免疫和7次加強免疫後選擇血清中抗體滴度高的小鼠(滴度>307.2K)進行脾細胞融合。融合後根據融合瘤細胞生長密度，對融合瘤培養上清進行檢測。篩選得到活性好的單株融合瘤細胞株。分別收集對數生長期融合瘤細胞，用NucleoZol(MN)提取RNA(按照試劑盒說明書步驟)，並進行反轉錄(PrimeScript^TM Reverse Transcriptase，Takara,cat# 2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序。篩選的單株融合瘤細胞株的CDR和可變區的胺基酸序列如下：

>13鼠源重鏈可變區：

SEQ ID NO：182

>13鼠源輕鏈可變區：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLSISNLEQEDIATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLEI SEQ ID NO：183

>15鼠源重鏈可變區：

SEQ ID NO：332

>15鼠源輕鏈可變區：

SEQ ID NO：333

>19鼠源重鏈可變區：

SEQ ID NO：184

>19鼠源輕鏈可變區：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNRLPRTFGGGTKLEIK SEQ ID NO：185

>31鼠源重鏈可變區：

SEQ ID NO：186

>31鼠源輕鏈可變區：

SEQ ID NO：187

註：下劃線標記區為根據Kabat編號規則獲得的CDR區。

鼠源抗PSMA抗體的可變區序列與SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：145所示的重鏈和輕鏈恆定區組合獲得嵌合抗體。示例性的，Chi13表示包含13鼠源重鏈可變區、輕鏈可變區和該SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：145所示的重鏈和輕鏈恆定區的嵌合抗體。Chi15、Chi19和Chi31以此類推。

>hIgG1：CH1-Fc

SEQ ID NO：144

>CL

SEQ ID NO：145

實施例5：抗人PSMA單株抗體的人源化設計

鼠源單株抗體人源化根據本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，從人源種系數據庫中搜索輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)的同源序列，將鼠源抗體的CDR區移植到人源模板上，並對VL和VH的部分殘基進行突變，將鼠源抗體的恆定區替換為人恆定區，得到最終的人源化分子。

5-1.抗體13的人源化

鼠源抗體13的人源化抗體選擇IGHV2-26*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ6*01的FR4作為重鏈框架區模板；選擇IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的重鏈可變區上第1、30、44、49、73和/或89位的胺基酸進行取代；和/或對人源化抗體的輕鏈可變區上第41、42、43、44和/或71位的胺基酸進行取代。

抗體可變區的序列如下：

>hu13VH1：

SEQ ID NO：188

>hu13VH2：

SEQ ID NO：189

>hu13VH3：

SEQ ID NO：190

>hu13VL1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDTLPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：191

>hu13VL2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPDGAPKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGDTLPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：192

>hu13VL3：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGDTLPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：193

註：下劃線部分為CDR，其餘部分為FR。

5-2.抗體15的人源化

鼠源抗體15的人源化抗體選擇IGHV1-3*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ1*01的FR4作為重鏈框架區模板；選擇IGKV1-27*01的FR1、FR2、FR3和IGKJ2*01的FR4作為輕鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的重鏈可變區上第1、2、28、44、48、67、69、71、73和/或76位的胺基酸進行取代；和/或對人源化抗體的輕鏈可變區上第43、60和/或100位的胺基酸進行取代。

表25-2.人源化抗體15的胺基酸取代

抗體可變區的序列如下：

>hu15VH1：

SEQ ID NO：194

>hu15VH2：

SEQ ID NO：195

>hu15VH3：

SEQ ID NO：196

>hu15VH4：

SEQ ID NO：197

>hu15VH5：

SEQ ID NO：198

>hu15VH6：

SEQ ID NO：199

>hu15VL1：

SEQ ID NO：200

>hu15VL2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVDTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSRYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO：201

>hu15VL3：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVDTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSRYPLTFGCGTKLEIK SEQ ID NO：202

註：下劃線部分為CDR，其餘部分為FR。

5-3.抗體19的人源化

鼠源抗體19的人源化抗體選擇IGHV3-7*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ6*01的FR4作為重鏈框架區模板；選擇IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的重鏈可變區上第3位的胺基酸進行取代；和/或對人源化抗體的輕鏈可變區上第71位的胺基酸進行取代。

抗體可變區的序列如下：

>hu19VH1：

SEQ ID NO：203

>hu19VH2：

SEQ ID NO：204

>hu19VL1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNRLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：205

>hu19VL2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNRLPRTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：206

註：下劃線部分為CDR，其餘部分為FR。

5-4.抗體31的人源化

鼠源抗體31的人源化抗體選擇IGHV3-7*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ1*01的FR4作為重鏈框架區模板：選擇IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的重鏈可變區上第94位的胺基酸進行取代；和/或對人源化抗體的輕鏈可變區上第43、45、48和/或70位的胺基酸進行取代。

抗體可變區的序列如下：

>hu31VH1：

SEQ ID NO：207

>hu31VL1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAETLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPPTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：208

>hu31VL2：

SEQ ID NO：209

>hu31VL3：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKSPQLLVYNAETLADGVPSRFSGSGSGTQFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPPTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：210

註：下劃線部分為CDR，其餘部分為FR。

實施例6.抗PSMA/CD28雙特異性抗體的製備

本揭露PSMA/CD28雙特異性抗體的PSMA臂可以來源於任意適宜的抗PSMA抗體。示例性的，本揭露中的雙特異性抗體中的抗PSMA臂可以為實施例4中的任意抗PSMA抗體的可變區，或者US20190389951A1專利中揭露的PSMA臂的可變區，其中本揭露使用的US20190389951A1中的PSMA臂的可變區及CDR序列如下：

bs16429D的PSMA重鏈可變區(也稱h20VH)：

SEQ ID NO：211

bs16429D的PSMA輕鏈可變區(也稱h20VL)：

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO：212

本揭露的PSMA-CD28雙特異性抗體分子的結構如下：

式1為非對稱結構分子，包含完整分子共四條鏈，四條鏈均不相同，具體如下：

鏈1：[CD28-VH]-[IgG1(CH1)]-[IgG1Fc(Knob)]；

鏈2：[CD28-VL]-[CL]；

鏈3：[PSMA-VH]-[連接子1a]-[Titin]-[IgG1Fc(Hole)]；和

鏈4：[PSMA-VL]-[連接子1a]-[Obscurin]；

其示意圖如圖1A所示(其中，Ob代表Obscurin)。

式2為非對稱結構分子，包含完整分子共四條鏈，四條鏈均不相同，具體如下：

鏈1：[CD28-VH]-[連接子1a]-[Titin]-[IgG1Fc(Knob)]；

鏈2：[CD28-VL]-[連接子1a]-[Obscurin]；

鏈3：[PSMA-VH]-[IgG1(CH1)]-[IgG1Fc(Hole)]；

鏈4：[PSMA-VL]-[CL]；

其示意圖如圖1B所示(Ob代表Obscurin)。

相關序列如下：

>IgG1(CH1)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC SEQ ID NO：219

>IgG₁Fc(Knob,L234A/L235A/S354C/T366W)：

SEQ ID NO：220

>IgG₁Fc(Hole,L234A/L235A/Y349C/T366S/L368A/Y407V)

SEQ ID NO：221

>CL：

SEQ ID NO：145

>IgG₁Fc(EM，Hole,L234A/L235A/Y349C/T366S/L368A/Y407V)：

SEQ ID NO：222

>連接子1a：

GGGGS SEQ ID NO：223

>Titin(T.16)：

GIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDD S TTL T IKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI SEQ ID NO：224

>Obscurin(O.28)

SGAPRFLTRPKA S VVSVGKDATLSCQIVGNPFPQVSWEKDKQPVTAGVRFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVCRARNA H GEAFACLGLQVDAEA SEQ ID NO：225

本揭露示例性使用式1構建的雙特異性抗體的序列如下：

1. Chi81-F1

>Chi81-F1鏈1：

SEQ ID NO：226

>Chi81-F1鏈2：

SEQ ID NO：227

>Chi81-F1鏈3；

SEQ ID NO：228

>Chi81-F1鏈4：

SEQ ID NO：229

2. 81H1L1-F1

>81H1L1-F1鏈1：

SEQ ID NO：230

>81H1L1-F1鏈2：

SEQ ID NO：231

>81H1L1-F1鏈3(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>81H1L1-F1鏈4(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

3. 81H1L3-F1

>81H1L3-F1鏈1(同81H1L1-F1鏈1，SEQ ID NO：230)

>81H1L3-F1鏈2：

SEQ ID NO：232

>81H1L3-F1鏈3(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>81H1L3-F1鏈4(同Chi81-E1鏈4，SEQ ID NO：229)

4. Chi94-F1

>Chi94-F1鏈1：

SEQ ID NO：233

>Chi94-F1鏈2：

SEQ ID NO：234

>Chi94-F1鏈3：(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>Chi94-F1鏈4：(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

5. 94H3L2-F1

>94H3L2-F1鏈1：

SEQ ID NO：235

>94H3L2-F1鏈2：

SEQ ID NO：236

>94H3L2-F1鏈3：(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>94H3L2-F1鏈4：(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

6. 94H6L9-F1

>94H6L9-F1鏈1：

SEQ ID NO：237

>94H6L9-F1鏈2：

SEQ ID NO：238

>94H6L9-F1鏈3：(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>94H6L9-F1鏈4：(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

7. 94H6L12-F1

>94H6L12-F1鏈1(同94H6L9-F1鏈1，SEQ ID NO：237)

>94H6L12-F1鏈2：

SEQ ID NO：239

>94H6L12-F1鏈3：(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>94H6L12-F1鏈4：(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

8. 97H2L3-F1

>97H2L3-F1鏈1：

SEQ ID NO：240

>97H2L3-F1鏈2：

SEQ ID NO：241

>97H2L3-F1鏈3：(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>97H2L3-F1鏈4：(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

9. 97H2L1-4-F1

>97H2L1-4-F1鏈1：(同97H2L3-F1鏈1，SEQ ID NO：240)

>97H2L1-4-F1鏈2：

SEQ ID NO：242

>97H2L1-4-F1鏈3：(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>97H2L1-4-F1鏈4：(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

10. Chi129-F1

>Chi129-F1鏈1：

SEQ ID NO：243

>Chi129-F1鏈2：

SEQ ID NO：244

>Chi129-F1鏈3：(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>Chi129-F1鏈4：(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

11. 129H4L1-F1

>129H4L1-F1鏈1：

SEQ ID NO：245

>129H4L1-F1鏈2：

SEQ ID NO：246

>129H4L1-F1鏈3：(同Chi81-F1鏈3，SEQ ID NO：228)

>129H4L1-F1鏈4：(同Chi81-F1鏈4，SEQ ID NO：229)

12. 81H1L3-15-F1

>81H1L3-15-F1鏈1(同81H1L1-F1鏈1，SEQ ID NO：230)

>81H1L3-15-F1鏈2(同81H1L3-F1鏈2，SEQ ID NO：232)

>81H1L3-15-F1鏈3：

SEQ ID NO：247

>S1H1L3-15-F1鏈4：

SEQ ID NO：248

13. 81H1L3-19-F1

>81H1L3-19-F1鏈1：(同81H1L1-F1鏈1，SEQ ID NO：230)

>81H1L3-19-F1鏈2：(同81H1L3-F1鏈2，SEQ ID NO：232)

>81H1L3-19-F1鏈3：

SEQ ID NO：249

>81H1L3-19-F1鏈4：

SEQ ID NO：250

14. 81H3L3-15-F1

>81H3L3-15-F1鏈1：

SEQ ID NO：251

>81H3L3-15-F1鏈2(同81H1L3-F1鏈2，SEQ ID NO：232)

>81H3L3-15-F1鏈3(同81H1L3-15-F1鏈3，SEQ ID NO：247)

>81H3L3-15-F1鏈4(81H1L3-15-F1鏈4，SEQ ID NO：248)

15. 81H3L3-19-F1

>81H3L3-19-F1鏈1：(同81H3L3-15-F1鏈1，SEQ ID NO：251)

>81H3L3-19-F1鏈2：(同81H1L3-F1鏈2，SEQ ID NO：232)

>81H3L3-19-F1鏈3：(同81H1L3-19-F1鏈3，SEQ ID NO：249)

>81H3L3-19-F1鏈4：(同81H1L3-19-F1鏈4，SEQ ID NO：250)

16. 81H3L3-13-F1

>81H3L3-13-F1鏈1：(同81H3L3-15-F1鏈1，SEQ ID NO：251)

>81H3L3-13-F1鏈2：(同81H1L3-F1鏈2，SEQ ID NO：232)

>81H3L3-13-F1鏈3：

SEQ ID NO：252

>81H3L3-13-F1鏈4：

SEQ ID NO：253

17. 81H3L3-31-F1

>81H3L3-31-F1鏈1：((同81H3L3-15-F1鏈1，SEQ ID NO：251)

>81H3L3-31-F1鏈2：(同81H1L3-F1鏈2，SEQ ID NO：232)

>81H3L3-31-F1鏈3：

SEQ ID NO：254

>81H3L3-31-F1鏈4：

SEQ ID NO：255

18. 94H6L12-15-F1

>94H6L12-15-F1鏈1：(同94H6L9-F1鏈1，SEQ ID NO：237)

>94H6L12-15-F1鏈2：(同94H6L12-F1鏈2，SEQ ID NO：239)

>94H6L12-15-F1鏈3：(同81H1L3-15-F1鏈3，SEQ ID NO：247)

>94H6L12-15-F1鏈4：(81H1L3-15-F1鏈4，SEQ ID NO：248)

19. 94H6L12-19-F1

>94H6L12-19-F1鏈1：(同94H6L9-F1鏈1，SEQ ID NO：237)

>94H6L12-19-F1鏈2：(同94H6L12-F1鏈2，SEQ ID NO：239)

>94H6L12-19-F1鏈3：(同81H1L3-19-F1鏈3，SEQ ID NO：249)

>94H6L12-19-F1鏈4：(同81H1L3-19-F1鏈4，SEQ ID NO：250)

20. 94H6L12-13-F1

>94H6L12-13-F1鏈1：(同94H6L9-F1鏈1，SEQ ID NO：237)

>94H6L12-13-F1鏈2：(同94H6L12-F1鏈2，SEQ ID NO：239)

>94H6L12-13-F1鏈3：(同81H3L3-13-F1鏈3，SEQ ID NO：252)

>94H6L12-13-F1鏈4：(同81H3L3-13-F1鏈4，SEQ ID NO：253)

21. 94H6L12-31-F1

>94H6L12-31-F1鏈1：(同94H6L9-F1鏈1，SEQ ID NO：237)

>94H6L12-31-F1鏈2：(同94H6L12-F1鏈2，SEQ ID NO：239)

>94H6L12-31-F1鏈3：(同81H3L3-31-F1鏈3，SEQ ID NO：254)

>94H6L12-31-F1鏈4：(同81H3L3-31-F1鏈4，SEQ ID NO：255)

22. 97H2L1-4-15-F1

>97H2L1-4-15-F1鏈1：(同97H2L3-F1鏈1，SEQ ID NO：240)

>97H2L1-4-15-F1鏈2：(同97H2L1-4-F1鏈2，SEQ ID NO：242)

>97H2L1-4-15-F1鏈3：(同81H1L3-15-F1鏈3，SEQ ID NO：247)

>97H2L1-4-15-F1鏈4(81H1L3-15-F1鏈4，SEQ ID NO：248)

23. 97H2L1-4-19-F1

>97H2L1-4-19-F1鏈1：(同97H2L1-4-15-F1鏈1，SEQ ID NO：240)

>97H2L1-4-19-F1鏈2：(同97H2L1-4-15-F1鏈2，SEQ ID NO：242)

>97H2L1-4-19-F1鏈3：(同81H1L3-19-F1鏈3，SEQ ID NO：249)

>97H2L1-4-19-F1鏈4：(同81H1L3-19-F1鏈4，SEQ ID NO：250)

24. 97H2L1-4-13-F1

>97H2L1-4-13-F1鏈1：(同97H2L1-4-15-F1鏈1，SEQ ID NO：240)

>97H2L1-4-13-F1鏈2：(同97H2L1-4-15-F1鏈2，SEQ ID NO：242)

>97H2L1-4-13-F1鏈3：(同81H3L3-13-F1鏈3，SEQ ID NO：252)

>97H2L1-4-13-F1鏈4：(同81H3L3-13-F1鏈4，SEQ ID NO：253)

25. 97H2L1-4-31-F1

>97H2L1-4-31-F1鏈1：(同97H2L1-4-15-F1鏈1，SEQ ID NO：240)

>97H2L1-4-31-F1鏈2：(同97H2L1-4-15-F1鏈2，SEQ ID NO：242)

>97H2L1-4-31-F1鏈3：(同81H3L3-31-F1鏈3，SEQ ID NO：254)

>97H2L1-4-31-F1鏈4：(同81H3L3-31-F1鏈4，SEQ ID NO：255)

示例性的，使用式2構建的PSMA/CD28雙特異性抗體的序列如下：

26. 81H1L3-F2

>81H1L3-F2鏈1：

SEQ ID NO：257

>81H1L3-F2鏈2：

SEQ ID NO：258

>81H1L3-F2鏈3：

SEQ ID NO：259

>81H1L3-F2鏈4：

SEQ ID NO：260

27. 97H2L3-F2

>97H2L3-F2鏈1：

SEQ ID NO：261

>97H2L3-F2鏈2：

SEQ ID NO：262

>97H2L3-F2鏈3：(同81H1L3-F2鏈3，SEQ ID NO：259)

>97H2L3-F2鏈4：(同81H1L3-F2鏈4，SEQ ID NO：260)

28. 97H2L1-4-F2

>97H2L1-4-F2鏈1：(同97H2L3-F2鏈1，SEQ ID NO：261)

>97H2L1-4-F2鏈2：

SEQ ID NO：263

>97H2L1-4-F2鏈3：(同81H1L3-F2鏈3，SEQ ID NO：259)

>97H2L1-4-F2鏈4：(同81H1L3-F2鏈4，SEQ ID NO：260)

29. 97H1L3-F2

>97H1L3-F2鏈1：

SEQ ID NO：264

>97H1L3-F2鏈2：

SEQ ID NO：265

>97H1L3-F2鏈3：(同81H1L3-F2鏈3，SEQ ID NO：259)

>97H1L3-F2鏈4：(同81H1L3-F2鏈4，SEQ ID NO：260)

30. Chi129-F2

>Chi129-F2鏈1：

SEQ ID NO：266

>Chi129-F2鏈2：

SEQ ID NO：267

>Chi129-F2鏈3：(同81H1L3-F2鏈3，SEQ ID NO：259)

>Chi129-F2鏈4：(同81H1L3-F2鏈4，SEQ ID NO：260)

31. 129H4L1-F2

>129H4L1-F2鏈1：

SEQ ID NO：268

>129H4L1-F2鏈2：

SEQ ID NO：269

>129H4L1-F2鏈3：(同81H1L3-F2鏈3，SEQ ID NO：259)

>129H4L1-F2鏈4：(同81H1L3-F2鏈4，SEQ ID NO：260)

32. 129H7L5-F2

>129H7L5-F2鏈1：

SEQ ID NO：270

>129H7L5-F2鏈2：

SEQ ID NO：271

>129H7L5-F2鏈3：(同81H1L3-F2鏈3，SEQ ID NO：259)

>129H7L5-F2鏈4：(同81H1L3-F2鏈4，SEQ ID NO：260)

33. 97H2L3-15-F2

>97H2L3-15-F2鏈1：(同97H2L3-F2鏈1，SEQ ID NO：261)

>97H2L3-15-F2鏈2：(同97H2L3-F2鏈2，SEQ ID NO：262)

>97H2L3-15-F2鏈3：

SEQ ID NO：272

>97H2L3-15-F2鏈4：

SEQ ID NO：273

34. 97H2L3-19-F2

>97H2L3-19-F2鏈1：(同97H2L3-F2鏈1，SEQ ID NO：261)

>97H2L3-19-F2鏈2：(同97H2L3-F2鏈2，SEQ ID NO：262)

>97H2L3-19-F2鏈3：

SEQ ID NO：274

>97H2L3-19-F2鏈4：

SEQ ID NO：275

35. 97H2L3-13-F2

>97H2L3-13-F2鏈1(同97H2L3-F2鏈1，SEQ ID NO：261)

>97H2L3-13-F2鏈2：(同97H2L3-F2鏈2，SEQ ID NO：262)

>97H2L3-13-F2鏈3：

SEQ ID NO：276

>97H2L3-13-F2鏈4：

SEQ ID NO：277

36. 97H2L3-31-F2

>97H2L3-31-F2鏈1：(同97H2L3-F2鏈1，SEQ ID NO：261)

>97H2L3-31-F2鏈2：(同97H2L3-F2鏈2，SEQ ID NO：262)

>97H2L3-31-F2鏈3：

SEQ ID NO：278

>97H2L3-31-F2鏈4：

SEQ ID NO：279

37. 129H4L1-15-F2

>129H4L1-15-F2鏈1：(同129H4L1-F2鏈1，SEQ ID NO：268)

>129H4L1-15-F2鏈2：(同129H4L1-F2鏈2，SEQ ID NO：269)

>129H4L1-15-F2鏈3：(同97H2L3-15-F2鏈3，SEQ ID NO：272)

>129H4L1-15-F2鏈4：(同97H2L3-15-F2鏈4，SEQ ID NO：273)

38. 129H4L1-19-F2

>129H4L1-19-F2鏈1：(同129H4L1-F2鏈1，SEQ ID NO：268)

>129H4L1-19-F2鏈2：(同129H4L1-F2鏈2，SEQ ID NO：269)

>129H4L1-19-F2鏈3：(同97H2L3-19-F2鏈3，SEQ ID NO：274)

>129H4L1-19-F2鏈4：(同97H2L3-19-F2鏈4，SEQ ID NO：275)

39. 129H4L1-13-F2

>129H4L1-13-F2鏈1：(同129H4L1-F2鏈1，SEQ ID NO：268)

>129H4L1-13-F2鏈2：(同129H4L1-F2鏈2，SEQ ID NO：269)

>129H4L1-13-F2鏈3：(同97H2L3-13-F2鏈3，SEQ ID NO：276)

>129H4L1-13-F2鏈4：(同97H2L3-13-F2鏈4，SEQ ID NO：277)

40. 129H4L1-31-F2

>129H4L1-31-F2鏈1：(同129H4L1-F2鏈1，SEQ ID NO：268)

>129H4L1-31-F2鏈2：(同129H4L1-F2鏈2，SEQ ID NO：269)

>129H4L1-31-F2鏈3：(同97H2L3-31-F2鏈3，SEQ ID NO：278)

>129H4L1-31-F2鏈4：(同97H2L3-31-F2鏈4，SEQ ID NO：279)

註：雙下劃線標記區為Titin或Obscurin序列，斜體為恆定區。

本揭露的PSMA/CD28雙特異性抗體的對照分子為REGN5678V，參考US20190389951A1中bs16429D(又稱REGN-5678)構建，將其Fc換成本揭露IgG1Fc(Knob)和IgG₁Fc(Hole)，得到REGN5678V，其具有共同輕鏈的結構。具體序列如下：

>REGN5678V第一鏈：

SEQ ID NO：280

>REGN5678V第二鏈：

SEQ ID NO：281

>REGN5678V第三鏈：

SEQ ID NO：282

實施例7：抗PSMA/CD3雙特異性抗體的製備

本揭露的CD3結合分子可以來源於任意適宜的抗體。具體的，本揭露的實施例採用的是S107E。

S107E可變區序列如下：

>S107E-VH：

SEQ ID NO：289

>S107E-VL：

SEQ ID NO：290

本揭露中的PSMA/CD3雙特異性抗體具有以下式1和式5的分子結構：

式1為非對稱結構分子，包含：

鏈1：VH(anti-PSMA)-IgG₁(CH1)-IgG₁Fc(Knob,L234A/L235A/S354C/T366W)；

鏈2：VL(anti-PSMA)-CL；

鏈3(Ob-hole)：VH(S107E)-連接子1a-Obscurin-IgG₁Fc(Hole,L234A/L235A/Y349C/T366S/L368A/Y407V)；和

鏈4(VL-Titin)：VL(S107E)-連接子1a-Titin。

其示意圖如圖1C所示。

>IgG₁(CH1)(SEQ ID NO：219)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

>CL(SEQ ID NO：145)

>IgG₁Fc(Knob,L234A/L235A/S354C/T366W)(SEQ ID NO：220)

>IgG₁Fc(Hole,L234A/L235A/Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO：221)

>Ob-hole(SEQ ID NO：291)

>VL-Titin：VL(S107E)-連接子1a-Titin(SEQ ID NO：292)

>連接子1a(SEQ ID NO：223)

GGGGS

註：單下劃線標記區為根據Kabat編號規則獲得的CD3結合結構域的CDR區，雙下劃線標記區為Titin或Obscurin序列，斜體為恆定區。下同。

式5為非對稱結構分子，包含

鏈1：VH(anti-PSMA)-連接子2a-VL(anti-PSMA)-連接子3a-VH(S107E)-連接子2a-VL(S107E)-連接子4a-IgG₁Fc(Hole,L234A/L235A/Y349C/T366S/L368A/Y407V)；和

鏈3(Fc(Knob))：IgG₁Fc(Knob,L234A/L235A/S354C/T366W)，其示意圖如圖1D所示。

>IgG₁Fc(Knob,L234A/L235A/S354C/T366W)(SEQ ID NO：220)

>IgG₁Fc(Hole,Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO：221)

>連接子2a：(SEQ ID NO：293)

GGGGSGGGGSGGGGS

>連接子3a：(SEQ ID NO：294)

SGGGGS

>連接子4a：(SEQ ID NO：295)

GGG

基於15和19的人源化抗體的胺基酸序列，分別構建了如下所示的雙特異性抗體。

其中，15-F5-1表示該分子採用抗體15及其人源化抗體的可變區作為PSMA結合域，採用式5作為分子結構。hu15H4L2-F5-1表示該鏈採用hu15H4作為重鏈可變區，hu15L2作為輕鏈可變區，以此類推。具體胺基酸序列如下：

>hu15H4L2-F5-1(SEQ ID NO：296)

>IgG₁Fc(Knob,L234A/L235A/S354C/T366W)(SEQ ID NO：220)

>hu15H6L3-F5-1(SEQ ID NO：297)

>IgG₁Fc(Knob,L234A/L235A/S354C/T366W)(SEQ ID NO：220)

>hu19H2-F1-1(SEQ ID NO：298)

>hu19L2-CL(SEQ ID NO：275)

>Ob-hole(SEQ ID NO：291)

>VL-Titin：VL(S107E)-連接子1a-Titin(SEQ ID NO：292)

此外，本揭露也使用了PSMA-CD3雙特異性抗體CC-1，參考專利WO2017121905A1雙抗製備，其具有IgG-scFv結構，完整分子包含兩條第一鏈和兩條第二鏈，具體如下：

鏈1：[PSMA-VH]-[IgG恆定區]-[連接子1b]-[CD3-VL]-[連接子2a]-[CD3-VH]；鏈2：[PSMA-VL]-CL；

具體序列如下：

>CC-1第一鏈：

SEQ ID NO：299

>CC-1第二鏈：

SEQ ID NO：300

>PSMA VH：

SEQ ID NO：313

>PSMA VL：

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSISSNYLHWYQQKPGQAPRLLIYRTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQGSYIPFTFGQGTKLEIK SEQ ID NO：314

>CD3 VH：

SEQ ID NO：315

>CD3 VL：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO：316

>CD3 scFv：

SEQ ID NO：317

IgG恆定區：

SEQ ID NO：318

CL：SEQ ID NO：145

連接子1b：SG連接子2a：GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO：293

本揭露所用的PSMA/CD3雙特異性抗體的對照分子為Aca-Mab，其胺基酸序列如WO2017134158A1中的SEQ ID NO：382所示。

本揭露還涉及PSMA/CD28雙特異性抗體與抗PD-1抗體的聯用，使用的抗PD-1抗體參考專利WO2020156509A1製備，具體序列如下：

>PD-1 VH

SEQ ID NO：325

>PD-1 VL：

SEQ ID NO：326

>PD-1重鏈恆定區：

SEQ ID NO：327

>PD-1輕鏈恆定區：

SEQ ID NO：145

>PD-1重鏈：

SEQ ID NO：328

>PD-1輕鏈：

SEQ ID NO：329

此外，本揭露的測試例中還使用了抗CD3抗體TNB383B-H，參考WO2018052503A1製備，具體序列如下：

>TNB383B-H重鏈：

SEQ ID NO：330

>TNB383B-H輕鏈：

SEQ ID NO：331

測試例

測試例1.CD28單抗對T細胞的激活作用

為測試本揭露CD28抗體的共刺激作用，本測試例用Jurkat-NFAT lum(Promega,J133A)細胞檢測CD28單抗在溶液中對Jurkat細胞的激活。方法如下：

Jurkat-NFAT lum細胞在完全培養基中傳代培養，將抗體用1640+10%FBS的培養基梯度稀釋，50μL每孔加入96孔酶標板中。離心收集Jurkat-NFAT lum細胞集，使用1640+10%FBS的培養基重新懸浮計數，調整細胞數為1E6細胞/mL，向加有抗體的96孔酶標板中每孔加入50μL(5E4/孔)細胞；37℃放置6小時後，每孔加入50μL firefly-glo螢光素酶報告基因檢測試劑(美侖生物Cat.#MA0519-2)，室溫放置8分鐘後，將液體轉入白板中，用多功能酶標儀(BMG Cat.# PHERAstar)讀板。結果見下表32-1至表32-4。

表32-1.人源化抗體81的T細胞激活作用(生物發光值)

結果顯示，81，94，97和129的所有人源化抗體對T細胞NFAT信號通路的激活程度都遠小於超級激動劑TGN1412。

測試例2.CD28單抗聯合CD3單抗對T細胞的激活作用

為測試本揭露CD28抗體的共刺激作用，本測試例用Jurkat-IL2 lum細胞(Promega，J129A)檢測CD28和CD3單抗(TNB383B-H)在溶液中對Jurkat-IL2 lum細胞的激活。方法如下：

Jurkat-IL2 lum細胞用1640完全培養基培養，每2天傳代一次。實驗時，將細胞吹打均勻，離心，去除上清，用PBS重新懸浮細胞，離心。再次用1640完全培養基重新懸浮細胞，並計數，將細胞密度調整為3E4細胞/50μL/孔。用2μg/mL Anti-hu(H+L)包被到高吸附細胞培養板上，細胞培養箱包被2小時；棄上清，加入30ng/mL TNB383B-H，細胞培養箱包被0.5~1小時；棄上清，加入稀釋好的CD28人源化抗體(從3μg/mL開始，3倍稀釋成8個濃度)，細胞培養箱包被1小時；棄上清，加入Jurkat-IL2-lum細胞，密度調整為3E4細胞/50μL/孔，培養過夜讀板：加入50μL/孔firefly-glo螢光素酶報告基因檢測試劑(美侖生物Cat.#MA0519-2)，室溫避光孵育10分鐘後PheraStar進行lumin的信號讀取。

結果顯示，TNB383B-H單用時IL2激活信號較弱，與CD28單抗聯用可以增強IL2激活信號，81、94、97、129的所有抗體均能激活T細胞的IL2信號通路。

測試例3.抗CD28人源化單抗與CD28抗原的結合活性

為測試本揭露CD28靶向性人源化抗體結合CD28抗原的能力，本測試例用ELISA法檢測CD28人源化抗體與人CD28抗原(購自SinoBiological，11524-HCCH)或猴CD28抗原(購自SinoBiological，90182-C08H)的結合活性。具體如下：

將CD28抗原按照0.5μg/孔包被於96孔板，放置於4℃過夜。棄去上清後用5%脫脂牛奶封閉2小時。用1%BSA配置不同濃度的各人源化抗體，起始濃度為200nM，5倍稀釋8個濃度。將封閉後的96孔板洗兩次後加入各人源化抗體，4℃孵育1小時，洗四次後用抗人IgG Fc-HRP二抗(1：10000)在4℃孵育1小時，TMB顯色後用0.1M硫酸終止反應。ELISA結果如下表34和35所示。

表34.CD28人源化單抗與人CD28抗原的結合作用

結果顯示，本揭露CD28抗體與人和猴CD28均可特異性結合。

測試例4.抗PSMA抗體對PSMA的結合活性

為測試本揭露PSMA靶向性人源化抗體結合PSMA抗原的能力，本測試例用ELISA法檢測PSMA人源化抗體與人PSMA抗原(購自R&D SYSTEM，4234-ZN-010)的結合。具體如下：

將PSMA抗原並按照1μg/孔包被於96孔板，放置於4℃過夜。棄去上清後用5%脫脂牛奶封閉2小時。用1%BSA配置不同濃度的各人源化抗體，起始濃度為10μg/mL，4倍稀釋12個濃度。將封閉後的96孔板洗兩次後加入配置的PSMA抗原，4℃孵育1h，洗四次後用抗人IgG Fc-HRP二抗(1：10000)在4℃孵育1h，用TMB顯色後用0.1M硫酸終止反應。ELISA結果如下表36所示。

表36.CD28抗體與人PSMA抗原的ELISA結合作用

結果顯示，本揭露所篩選的PSMA人源化抗體及嵌合抗體與人PSMA抗原具有良好結合作用。

測試例5.抗體對表達PSMA的細胞的結合活性

本測試例用流式細胞術方法檢測了抗體與過表達人PSMA的穩轉細胞株CHO-hPSMA的結合活性。

實驗一：採用10% FBS的F12培養基培養CHO-hPSMA。接種了細胞的培養基放置於37℃，5% CO₂培養箱中培養2天，按每孔細胞數1×10⁵個將細胞加至細胞板中，離心洗滌。梯度稀釋抗體，將抗體溶液按100μL/孔加入細胞板中，4℃孵育1小時後洗滌。向細胞板中加入100μL/孔的AF488-Goat Anti-human IgG Fc螢光二抗稀釋液(1：400)，4℃孵育1個小時後洗滌。向細胞板中加入100μL/孔的PBS後讀板。抗體的細胞結合活性如下表37-1所示。

實驗二：採用與實驗一相同的方法培養細胞並將其接種至細胞板中。然後梯度稀釋抗體，將抗體溶液按100μL/孔加入細胞板中，4℃孵育1小時後洗滌。向細胞板中加入100μL/孔的HRP-Goat Anti-human IgG(H+L)二抗稀釋液(1：8000)，4℃孵育1個小時後離心洗滌。用TMB顯色後用0.1M硫酸終止反應，並檢測OD450值。抗體的細胞結合活性如下表37-2所示。

實驗三：採用實驗一的方法檢測雙特異性抗體的結合活性。抗體在各濃度條件下與細胞的結合活性如下表37-3所示。

實驗五：用Protein A生物傳感芯片親和捕獲抗體，然後於芯片表面流經人PSMA，用Biacore T200儀器在25℃條件下實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用Glycine 1.5將生物傳感芯片洗淨再生。數據擬合模型採用1：1 Model。其中人PSMA抗原購於Acro(貨號為PSA-H52H3)；hCD3D&CD3E複合物抗原購於Sino Biological(貨號為CT038-H2508H)。各抗體結合及解離情況如下表37-4。

結果顯示，本揭露的抗PSMA抗體和雙特異性抗體與人PSMA和表達PSMA的細胞均具有良好結合作用，強於Aca-mab。

測試例6.本揭露的PSMA/CD28雙特異性抗體與CD28抗原的結合

為測試本揭露PSMA/CD28雙特異性抗體結合CD28抗原的能力，本測試例用ELISA法檢測PSMA/CD28雙特異性抗體與人或猴CD28抗原(購自SinoBiological，11524-HCCH；90182-C08H)的結合。具體如下：

將CD28抗原並按照5μg/孔包被於96孔板，放置於4℃過夜。棄去上清後用5%脫脂牛奶封閉2小時。用1%BSA配置不同濃度的各抗體，起始濃度為200nM，5倍稀釋8個濃度。將封閉後的96孔板洗兩次後加入配置各抗體，4℃孵育1小時，洗四次後用anti human IgG Fc-HRP二抗二抗(1：10000)在4℃孵育1小時，用TMB顯色後用0.1M硫酸終止反應。ELISA結果如下表38-1和38-2所示。

結果顯示，本揭露PSMA/CD28抗體與人或猴CD28抗原均有較好結合作用。

測試例7.本揭露的雙特異性抗體的細胞結合活性

為測試本揭露PSMA-CD28雙特異性抗體與PSMA及CD28的結合能力，本測試例用流式細胞術方法檢測了雙特異性抗體與過表達人PSMA的穩轉細胞株CHO-hPSMA和過表達人CD28的穩轉細胞株CHO-hCD28細胞的結合能力。具體如下：

上述細胞培養於10% FBS的F12培養基中，放置於37℃，5% CO₂培養箱中，培養2天，按每孔細胞數1×10⁵個將細胞加至細胞板中，300g離心5分鐘，1% BSA洗一次。抗體梯度稀釋8個濃度，按每孔100μL加入細胞板中，4℃孵育1小時，1% BSA洗一次，每孔加入100μL AF488-Goat Anti-human IgG Fc螢光二抗(Invitrogen,A-11013)稀釋液(1：400)，4℃孵育1個小時。1% BSA洗板三次，每孔加入100μL PBS讀板。各抗體與CHO-hCD28細胞結合結果如下表39-1至表39-4所示。

結果顯示，本揭露PSMA-CD28雙特異性抗體與表達PSMA和CD28的細胞均有較好結合作用。

測試例8. PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙特異性抗體與PSMA共結合

為測試本揭露PSMA-CD28雙特異性抗體與PSMA-CD3雙特異性抗體共同結合PSMA抗原的結合能力，本測試例用流式細胞術方法檢測了雙特異性抗體與過表達人PSMA的穩轉細胞株CHO-hPSMA結合能力。具體如下：

CHO-hPSMA細胞培養於10% FBS的F12培養基中，放置於37℃，5% CO₂培養箱中，培養2天，按每孔細胞數1×10⁵個將細胞加至細胞板中，300g離心5分鐘，1% BSA洗一次。PSMA/CD28雙特異性抗體稀釋到40μg/mL，按每孔100μL加入細胞板中，4℃孵育1小時，1% BSA洗三次。預先用生物素標記(DO JINDO，LK03)PSMA-CD3雙特異性抗體15-F5-1和19-F1，並梯度稀釋8 個濃度，按每孔100μL加入細胞板中以重新懸浮細胞，4℃孵育1小時，1% BSA洗一次，每孔加入100μL SA-PE螢光二抗(Biolegend，740452)稀釋液，4℃孵育1個小時。1% BSA洗板三次，每孔加入100μL PBS讀板。PSMA/CD28雙特異性抗體預先與細胞結合後，PSMA/CD3雙特異性抗體在各濃度條件下與CHO-hPSMA細胞結合情況與如下表40所示。

表40. PSMA-CD3雙抗與CHO-hPSMA細胞的結合

結果表明，對於PSMA/CD3雙特異性抗體15-F5-1，其PSMA靶向區域為人源化抗體15可變區，因此對於採用相同表位的15作為PSMA/CD28雙特異性抗體PSMA靶向區域時，預先孵育飽和劑量PSMA/CD28雙特異性抗體會影響後續PSMA/CD3雙特異性抗體與PSMA的結合；但對於採用不同表位的19或31作為PSMA/CD28雙特異性抗體PSMA靶向區域時，PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙特異性抗體可共同結合到CHO-hPSMA細胞上。

對於PSMA/CD3雙特異性抗19-F1，其PSMA靶向區域為人源化抗體19，對於採用相同或相似表位的19或31作為PSMA/CD28雙特異性抗體 PSMA靶向區域時，預先孵育飽和劑量PSMA/CD28雙特異性抗體會影響後續PSMA/CD3雙特異性抗體與PSMA的結合；但對於採用不同表位的15作為PSMA/CD28雙特異性抗體PSMA靶向區域時，PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙特異性抗體可共同結合到CHO-hPSMA細胞上。

測試例9.本揭露的雙特異性抗體的Biacore結合作用

為測試本揭露PSMA/CD28雙特異性抗體與CD28的結合能力，用Protein A生物傳感芯片親和捕獲抗體，然後於芯片表面流經hCD28-his抗原，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用Glycine 1.5將生物傳感芯片洗淨再生。數據擬合模型採用1：1 Model。各抗體結合及解離情況如下表41-1和41-2所示。

結果顯示，本揭露雙特異性抗體與CD28抗原均具有良好結合作用。

測試例10.雙特異性抗體的激活作用

為測試本揭露PSMA/CD28雙特異性抗體對T細胞的激活作用，本測試例檢測了雙特異性抗體在T細胞存在第一激活信號的情況下對Jurkat-IL2 lum細胞的激活作用。用沒有抗性的培養基稀釋CHO-APC-hPSMA細胞到2E5/mL，加入到細胞培養板中，100μL/孔。37℃ CO₂培養箱中過夜。用補充了10%FBS的培養基稀釋抗體到起始濃度5μg/mL，4倍稀釋，棄掉細胞板中的培養基，然後加入50μL/孔稀釋好的抗體，37℃ CO₂培養箱孵育1小時。用無抗生素的1640培養基(Hyclone,SH30027.01)稀釋Jurkat-IL2 lum細胞到5E5/mL；用排槍吸掉細胞板中的抗體，加入100μL/孔稀釋好的Jurkat-IL2 Lum細胞。37℃,CO₂培養箱孵育5小時。加入50μL/孔螢光素酶受質(美天侖，MA0519-2)，室溫孵育10分鐘，然後轉移100μL的反應液到白色不透明底板中，上機讀數。各雙抗對Jurkat-IL2 lum激活作用見下表42。

結果顯示，本揭露雙特異性抗體在第一信號存在情況下能有效刺激T細胞IL-2信號通路。

測試例11.雙特異性抗體的體外細胞毒性

本測試例研究了本揭露的雙特異性抗體在T細胞第一刺激信號存在情況下的殺傷作用。用表達PSMA的細胞系CHO-APC-hPSMA細胞的作為靶細胞來檢測本揭露的雙特異性抗體的靶點特異性細胞毒活性。

CHO-APC-hPSMA細胞培養在補充了10% FBS(ThermoFisher Scientific，10099-141)的DMEM/F12(美侖生物，PWL005)完全培養基中。凍存PBMC(妙順生物)復蘇後用補充了10% FBS的1640(Gibco，11875119)完全培養基重新懸浮，置於T75培養瓶培養4小時(密度為2E6 cells/mL)。PBMC收集離心後用補充了4% FBS無酚紅1640(Gibco，11835-030)重新懸浮，再次離心後重新懸浮、計數，調整細胞數為7.5E5細胞/mL，每孔加入50μL。CHO-APC-hPSMA細胞消化，1000rpm離心3分鐘，重新懸浮，計數，調整細胞數為1.5E5細胞/mL，每孔加入50μL，確保E：T比值為5：1。抗體用無酚紅1640+4% FBS培養基稀釋至起始濃度50nM，5倍稀釋，每孔加入50μL。處理好的細胞放在37℃，5% CO₂的培養箱培養72小時。檢測前，在只有靶細胞的其中兩個孔中吸出15μL培養基，然後加入15μL裂解液(10X)，裂解45分鐘。45分鐘後取出培養板，1000rpm離心3分鐘，吸取50μL上清於新的96孔板中，並加入50μL CytoTox 96® Reagent(Promega，G1780)，室溫孵育0.5小時後加入50μL終止液，用FlexStation 3檢測吸收光(490nm)。

靶細胞完全裂解的值減去靶細胞的背景值作為100%裂解值，即最大LDH釋放，在計算之前所有組別減去僅PBMC組的背景值，同濃度下的殺傷百分比為：

裂解率%=100×檢測孔OD490/LDH最大釋放量孔OD490

雙特異性抗體的殺傷作用如下表43。

結果顯示，在TCR第一激活信號存在時，本揭露雙特異性抗體對表達PSMA的細胞表現出較強腫瘤殺傷作用。

測試例12. PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙特異性抗體的聯合激活作用

為測試本揭露PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙抗聯用對T細胞的激活作用，本測試例檢測了PSMA/CD28與PSMA/CD3雙抗聯用對Jurkat-IL2 lum細胞的激活作用。

計數儀計數CHO-hPSMA細胞，用沒有抗性的培養基稀釋到2E5/mL，加入到細胞培養板中，100μL/孔。37℃ CO₂培養箱中過夜。用補充了10%FBS的培養基稀釋PSMA/CD28抗體到4X起始濃度20μg/mL，4倍稀釋。同時用補充了10%FBS的培養基稀釋PSMA/CD3雙特異性抗體15-F5-1和15-F5-2到80ng/mL，19-F1稀釋到1250ng/mL。棄掉細胞板中的培養基，然後各加入50μL/孔稀釋好的PSMA/CD28雙抗和PSMA/CD3雙抗，37℃ CO₂培養箱孵育1小時。用無抗生素的1640培養基(Hyclone,SH30027.01)稀釋Jurkat-IL2 lum細胞到5E5/mL；吸掉細胞板中的抗體，加入100μL/孔稀釋好的Jurkat-IL2 Lum細胞。37℃，CO₂培養箱孵育5小時。加入50μL/孔螢光素酶受質(美天侖，MA0519- 2)，室溫孵育10分鐘，然後轉移100μL的反應液到白色不透明底板中，上機讀數。各雙抗聯用對Jurkat-IL2 lum激活作用見下表44。

結果顯示，本揭露PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙特異性抗體聯用可顯著增強對T細胞的激活作用。

測試例13.雙特異性抗體聯用的體外細胞毒性(固定PSMA/CD3雙特異性抗體的劑量)

本測試例檢測了PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙特異性抗體聯用介導的殺傷作用。

CHO-huPSMA細胞培養在補充了10% FBS(ThermoFisher Scientific，10099-141)的DMEM/F12(美侖生物，PWL005)完全培養基中。凍存PBMC(妙順生物)復蘇後用補充了10% FBS的1640(Gibco，11875119)完全培養基重新懸浮，置於T75培養瓶培養4小時(密度為2E6細胞/mL)。PBMC收集離心後用補充了4% FBS無酚紅1640培養基(Gibco，11835-030)重新懸浮，再次離心後重新懸浮、計數，調整細胞數為1.5E6細胞/mL，每孔加入50μL。CHO-huPSMA細胞消化，1000rpm離心3分鐘，重新懸浮，計數，調整細胞數為1.5E5細胞/mL，每孔加入50μL，確保E：T比值為10：1。抗體用無酚紅1640+4% FBS培養基稀釋，其中PSMA-CD3雙抗CC-1配置成16pM，同時配置PSMA/CD28雙特異性抗體，起始濃度為100nM，5倍稀釋，9個劑量點。每孔加入PSMA/CD3雙抗及PSMA-CD28各25μL，處理好的細胞放在37℃，5% CO₂的培養箱培養72小時。檢測前，在只有靶細胞的其中兩個孔中吸出15μL培養基，然後加入試劑盒提供的15μL裂解液(10X)，裂解45分鐘。45分鐘後取出培養板，1000rpm離心3分鐘，吸取50μL上清於新的96孔板(#3590)中，並加入50μL CytoTox 96® Reagent(Promega，G1780)，室溫孵育0.5小時後加入50μL終止液，用FlexStation 3檢測吸收光(490nm)。

靶細胞完全裂解的值減去靶細胞的背景值作為100%裂解值，即LDH最大釋放，在計算之前所有組別減去PBMC only組的背景值，同濃度下的殺傷百分比為：

裂解率%=100×檢測孔OD490/LDH最大釋放量孔OD490。

各抗體聯用的殺傷作用見圖2。

結果顯示，本揭露雙特異性PSMA/CD28雙特異性抗體單獨無法誘導明顯殺傷作用，這與該試驗體系不存在第一信號相關。在PSMA/CD28雙特異性抗體低劑量條件下，PSMA/CD3雙特異性抗體由於劑量較低而無明顯殺傷作用，但增強PSMA/CD28雙特異性抗體的劑量能在低劑量PSMA-CD3雙特異性抗體存在時發揮對PSMA表達細胞的腫瘤殺傷作用。

測試例14.雙特異性抗體聯用的體外細胞毒性(固定PSMA/CD28雙特異性抗體劑量)

本測試例檢測了PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙特異性抗體聯用介導的殺傷作用。按照測試例13所述方法培養細胞。凍存PBMC(妙順生物)復蘇後用補充了10% FBS的1640(Gibco，11875119)完全培養基重新懸浮，置於T75培養瓶培養4小時(密度為2E6細胞/mL)。PBMC收集離心後用補充了4% FBS無酚紅1640(Gibco，11835-030)重新懸浮，再次離心後重新懸浮、計數，調整細胞數為1.5E6細胞/mL，每孔加入50μL。CHO-huPSMA細胞消化，1000rpm離心3分鐘，重新懸浮，計數，調整細胞數為1.5E5細胞/mL，每孔加入50μL，確保E：T比值為10：1。抗體用無酚紅1640+4% FBS培養基稀釋，其中PSMA/CD28抗體稀釋至4nM，同時將PSMA-CD3雙抗配置至起始濃度4nM，5倍稀釋，9個劑量點；每孔加入PSMA/CD3及PSMA/CD28各25μL，處理好的細胞放在37℃，5% CO₂的培養箱培養72小時。檢測前，在只有靶細胞的其中兩個孔中吸出15μL培養基，然後加入試劑盒提供的15μL裂解液(10X)，裂解45分鐘。45分鐘後取出培養板，1000rpm離心3分鐘，吸取50μL上清於新的96孔板中，並加入50μL CytoTox 96® Reagent(Promega，G1780)，室溫孵育0.5小時後加入50μL終止液，用FlexStation 3檢測吸收光(490nm)。

靶細胞完全裂解的值減去靶細胞的背景值作為100%裂解值，即LDH最大釋放，在計算之前所有組別減去僅PBMC組的背景值，同濃度下的殺傷百分比為：

裂解率%=100×檢測孔OD490/LDH最大釋放量孔OD490。

各抗體聯用的殺傷作用見下表45-1至表45-4。

結果顯示，本揭露PSMA/CD28雙特異性抗體能協同低劑量PSMA/CD3雙特異性抗體發揮對表達PSMA細胞更強的殺傷作用。

測試例15.雙特異性抗體的細胞因子釋放水平

本測試例檢測了在PSMA/CD3雙抗、PSMA/CD28雙抗和CHO-huPSMA細胞的共同作用下，PBMC中細胞因子IL-6及IFN-γ分泌的變化。

將測試例13中收集的抗體及細胞混合培養上清凍存於-20℃冰箱的上清，常溫解凍，震盪混勻，樣品使用1640+4%FBS培養基稀釋20倍備用。使用無菌水溶解IL-6及IFN-γ標準品粉末，使用1640+4% FBS培養基稀釋標準品至需要的濃度。取出要檢測的細胞因子的試劑盒，包括人IL6試劑盒(CISBIO，62HIL06PEG)和人IFN-γ試劑盒(CISBIO，62HIFNGPEG)，平衡試劑盒至常溫，使用檢測緩衝液稀釋試劑盒中的兩個檢測抗體。取16μL細胞上清(原液用於IL-6檢測，20倍稀釋用於IFNγ檢測)及IL-6或IFNγ標準品於96孔板中，加入4μL稀釋好的對應的檢測抗體；震盪混勻，1000rpm離心1分鐘，常溫孵育過夜。取出孵育過夜的樣品，1000rpm離心1分鐘，使用PHERAstar多功能酶標儀讀取665nm和620nm的吸收值。結果見圖3和圖4。

結果顯示，本揭露的PSMA/CD28雙特異性抗體與PSMA/CD3雙特異性抗體聯用後誘導的PBMC的細胞因子IL6和IFNγ的釋放水平相對較低。

測試例16.雙特異性抗體與PD-1單抗聯用的激活作用

由於PD1/PDL1信號通路會阻斷CD28的共刺激信號，為測試本揭露PSMA/CD28雙特異性抗體與PD1/PDL1聯用在T細胞存在第一信號條件下的激活作用，本測試例檢測了雙特異性抗體與PD1單抗聯用對Jurkat-PD1細胞的激活作用。

CHO-APC-hPSMA-PDL1用無抗性1640培養基稀釋到4E5/mL，25μL每孔鋪入96孔板；Jurkat-PD1用無抗性1640培養基稀釋到4E6/mL，25μL每孔鋪入96孔板。PD1單抗HRP01511用無抗性1640培養基稀釋到20μLg/mL，每孔加入25μl(終濃度為5μg/mL)；PSMA/CD28雙抗用無抗性1640培養基稀釋到40μg/mL，每孔25μL(終濃度為10μg/mL)，1：10梯度稀釋。在細胞懸液中加入稀釋的抗體。終體積100μL，37℃，5% CO₂，繼續培養72小時。取出細胞培養板離心(300×g，10分鐘)；取出16μL上清轉移至96孔檢測板；按照IL2檢測說明書(Cisbio,62HIL02PEG)稀釋檢測抗體，每孔加入4μL，總體積20μL，貼緊封板膜防止液體揮發。室溫放置3小時後上機檢測。各PSMA/CD28雙抗單用或聯用PD1單抗對Jurkat-PD1細胞IL2刺激情況如下表46。

結果顯示，PD1/PDL1信號通路的存在會抑制本揭露雙特異性抗體對T細胞激活作用，而本揭露雙特異性抗體與PD1抗體聯用能有效刺激T細胞。

體內活性生物學評價

測試例17.本揭露的雙特異性抗體在22RV1皮下移植瘤模型中的藥效

本揭露使用人***癌22RV1細胞人PBMC NOG小鼠異種移植瘤模型，對PSMA-CD3聯用PSMA/CD28雙抗在抗腫瘤活性方面進行評價。

NOG小鼠，雄性，4-5週齡，購自北京維通利華上海分公司。

人***癌22RV1細胞，購於ATCC。

將22RV1細胞1×10⁶細胞/隻/200μL(含50% matrigel)接種於NOG小鼠右肋部皮下，次日將復蘇後狀態良好的人PBMC以5×10⁶細胞/100μL注射到NOG小鼠腹腔，當荷瘤小鼠腫瘤體積達到130mm³左右時，去除體積過大過小、體重過小的進行分組給藥。將分組當天定義為該實驗Day0(第零天)，Day0開始腹腔注射各抗體，每週2次，共給藥5次。每週2次監測腫瘤體積、動物重量並記錄數據。當實驗動物腫瘤體積超過2000mm³或多數腫瘤出現破潰或體重下降20%時，將荷瘤動物進行安樂死作為實驗終點。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b²其中a、b分別表示長、寬。

相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100%，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。

抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。

表47. PSMA/CD28與PSMA/CD3雙特異性抗體15-F5-1聯用的抗腫瘤活性

結果顯示，本揭露PSMA/CD28雙抗能有效提高PSMA/CD3雙抗的藥效。實驗期間未觀測到藥物相關動物死亡及其他明顯藥物相關毒副反應。

測試例18.本揭露的雙特異性抗體在22RV1皮下移植瘤模型中的藥效

本揭露使用人***癌22RV1細胞人PBMC NCG小鼠異種移植瘤模型，對PSMA-CD3聯用PSMA/CD28雙抗在抗腫瘤活性方面進行評價。

NOG小鼠，雄性，4-5週齡，購自北京維通利華上海分公司。

人***癌22RV1細胞，購於ATCC。

將22RV1細胞1×10⁶細胞/隻/200μL(含50% matrigel)接種於NOG小鼠右肋部皮下，次日將復蘇後狀態良好的人PBMC以4.5×10⁶細胞/100μL注射到NOG小鼠腹腔，當荷瘤小鼠腫瘤體積達到110mm³左右時，去除體積過大過小、體重過小的進行分組給藥。將分組當天定義為該實驗Day0(第零天)，Day0開始腹腔注射各抗體，每週2次，共給藥4次。每週2次監測腫瘤體積、動物重量並記錄數據。當實驗動物腫瘤體積超過2000mm³或多數腫瘤出現破潰或體重下降20%時，將荷瘤動物進行安樂死作為實驗終點。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b²，其中a、b分別表示長、寬。

抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。

表48.PSMA/CD28與PSMA/CD3雙特異性抗體15-F5-2聯用的抗腫瘤活性

結果顯示，本揭露PSMA/CD28雙抗能有效提高低劑量PSMA/CD3雙抗的藥效。PSMA/CD28雙抗本身對該模型無明顯腫瘤抑制作用。實驗期間未觀測到藥物相關動物死亡及其他明顯藥物相關毒副反應。

雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本揭露的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的揭露內容藉由引用完整地清楚結合。

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Claims

一種抗原結合分子，其特異性結合CD28和PSMA，該抗原結合分子包含至少一個特異性結合CD28的抗原結合模塊和至少一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊，該特異性結合CD28的抗原結合模塊包含重鏈可變區CD28-VH和輕鏈可變區CD28-VL，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊包含重鏈可變區PSMA-VH和輕鏈可變區PSMA-VL；其中，

i)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的CD28-HCDR1，包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的CD28-HCDR2和包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的CD28-HCDR3；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的CD28-LCDR1，包含SEQ ID NO：23、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93的胺基酸序列的CD28-LCDR2，和包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

ii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的CD28-HCDR1，包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的CD28-HCDR2，和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的CD28-HCDR3；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的CD28-LCDR1，包含SEQ ID NO：62、17、54、55、56、57、58、59、60或61的胺基酸序列的CD28-LCDR2，和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

iii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25或117的胺基酸序列的CD28-HCDR1，包含SEQ ID NO：26或116的胺基酸序列的CD28-HCDR2，和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1，包含SEQ ID NO：29、118、119、 120、121或122的胺基酸序列的CD28-LCDR2，和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

iv)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的CD28-HCDR1，包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的CD28-HCDR2，和包含SEQ ID NO：9、39、40、41或42的胺基酸序列的CD28-HCDR3；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的CD28-LCDR1，包含SEQ ID NO：43或11的胺基酸序列的CD28-LCDR2，和包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的CD28-LCDR3；

較佳地，

i)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的CD28-HCDR1，包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的CD28-HCDR2，和包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的CD28-HCDR3；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的CD28-LCDR1，包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列的CD28-LCDR2，和包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

ii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的CD28-HCDR1，包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的CD28-HCDR2，和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的CD28-HCDR3；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的CD28-LCDR1，包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列的CD28-LCDR2，和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

iii)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的CD28-HCDR1，包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CD28-HCDR2，和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CD28-HCDR3；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CD28-LCDR1，包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的CD28-LCDR2，和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CD28-LCDR3；或

iv)該CD28-VH具有：包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的CD28-HCDR1，包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的CD28-HCDR2，和包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的CD28-HCDR3；和該CD28-VL具有：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的CD28-LCDR1，包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列的CD28-LCDR2，和包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的CD28-LCDR3；

更佳地，

該抗原結合分子在25℃條件下以小於2×10^-8M的KD結合人CD28，該KD是藉由表面電漿共振法測量的。
如請求項1所述的抗原結合分子，其中，

i)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：170的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：171的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：172的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；和該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：173的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：174的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：175的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

ii)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：166的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；和該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：167的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：168的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

iii)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：158的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：159的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：160的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；和該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：161的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：162的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：163的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

iv)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：176的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：177的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；和該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：180的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：181的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

v)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：213的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：214的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：215的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；和該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：216的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：218的胺基酸序列的PSMA-LCDR3。
如請求項1或2所述的抗原結合分子，其中，

i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95、35、94、96、97或98的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101、36、99、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列；或

ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68、33、63、64、65、66、67或69的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80、34、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79的胺基酸序列；或

iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：126、37、123、124、125、127、128、129、130、131、132或133的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、38、135、136、137、138、139、140、141、142或143的胺基酸序列；或

iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44、31、45、46、47、48、49或53的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52、32、50或51的胺基酸序列；

較佳地，

i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95、94、96、97或98的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101、99、100或102的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101、99、100、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99、100、101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：96的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99或100的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：97的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：99、100或101的胺基酸序列，或

ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80、72、73、74、75、76、77、78或79的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70或71的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70、71或72的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70、71或72的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：70、71、72、74、75、76或79胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：72、74、75、76或79的胺基酸序列，或

iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135、136、137、138或139的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、135或136的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：124的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：125的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134或135的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：127的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：137、138或139的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：128的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、137、138、139或142的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134、138、139、140、141、142或143的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138、140、141、142或143的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138、140、141、142或143的胺基酸序列，或

iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52、50或51的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或51的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或52的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或51的胺基酸序列，或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50或51的胺基酸序列；

更佳地：

i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；或

ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；或

iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；或

iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項所述的抗原結合分子，其中，

i)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204、184或203的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206、185或205的胺基酸序列；或

ii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197、332、194、195、196、198或199的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201、333、200或202的胺基酸序列；或

iii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188、182、189或190的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191、183、192或193的胺基酸序列；或

iv)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207或186的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208、187、209或210的胺基酸序列；或

v)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；

較佳地，

i)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

ii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

iii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

iv)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項所述的抗原結合分子，其中該特異性結合CD28的抗原結合模塊或該特異性結合PSMA的抗原結合模塊包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈；

較佳地，

該Titin鏈包含選自由SEQ ID NO：334至SEQ ID NO：352組成的組的胺基酸序列，該Obscurin鏈包含選自由SEQ ID NO：353至SEQ ID NO：393組成的組的胺基酸序列；

更佳地，

該Titin鏈包含SEQ ID NO：350的胺基酸序列，該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：388的胺基酸序列。
如請求項1至5中任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子進一步包含Fc區，該Fc區較佳為IgG Fc區，進一步佳為IgG1 Fc區；

更佳地，該Fc區包含一個或多個能夠減少Fc區與Fcγ受體結合的胺基酸取代；

最佳地，該Fc區是人IgG1 Fc區，並且在234和235位置的胺基酸為A，編號依據為EU索引。
如請求項6所述的抗原結合分子，其中該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1和Fc2各自獨立地具有一個或多個減少Fc區同源二聚化的胺基酸取代；

較佳地，該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構；

更佳地，該Fc1在366位置的胺基酸為W；並且該Fc2在366位置的胺基酸為S，在368位置的胺基酸為A，和在407位置的胺基酸為V，編號依據為EU索引；

最佳地，該Fc1包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列；該Fc2包含SEQ ID NO：221或222的胺基酸序列。
如請求項7所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含一個特異性結合CD28的抗原結合模塊和一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊，該特異性結合CD28的抗原結合模塊是Fab；該特異性結合PSMA的抗原結合模塊是經替換的Fab，其包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈；

較佳地，

該抗原結合分子包含一條具有式(a)所示結構的第一鏈、一條具有式(b)所示結構的第二鏈、一條具有式(c)所示結構的第三鏈和一條具有式(d)所示結構的第四鏈，

(a)[CD28-VH]-[CH1]-[Fc1]，

(b)[CD28-VL]-[CL]，

(c)[PSMA-VH]-[連接子1]-[Titin鏈]-[Fc2]，

(d)[PSMA-VL]-[連接子2]-[Obscurin鏈]，

其中，該連接子1和該連接子2是相同或不同的肽連接子；或連接子1和/或連接子2不存在；

式(a)、(b)、(c)和(d)所示的結構是從N端至C端排列的；

更佳地，其中，

i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：78的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；或

ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；或

iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；或

iv)該CD28-VH包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；

最佳地，該抗原結合分子具有：

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：250的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：226的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：227的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：230的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：231的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：230的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：233的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：234的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：235的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：236的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：238的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：241的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：244的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：245的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：246的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：229的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：230的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：248的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：230的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO；250的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：251的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：248的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：251的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：250的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：251的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：252的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：253的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：251的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：254的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：255的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：248的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：252的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：253的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：237的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：239的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：254的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：255的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：247的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：248的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：249的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：250的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：252的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：253的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：254的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：255的胺基酸序列的第四鏈。
如請求項7所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含一個特異性結合CD28的抗原結合模塊和一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊是Fab；該特異性結合CD28的抗原結合模塊是經替換的Fab，其包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈；

較佳地，

該抗原結合分子包含一條具有式(e)所示結構的第一鏈、一條具有式(f)所示結構的第二鏈、一條具有式(g)所示結構的第三鏈和一條具有式(h)所示結構的第四鏈，

(e)[CD28-VH]-[連接子3]-[Titin鏈]-[Fc1]，

(f)[CD28-VL]-[連接子4]-[Obscurin鏈]，

(g)[PSMA-VH]-[CH1]-[Fc2]，

(h)[PSMA-VL]-[CL]，

其中，該連接子3和連接子4是相同或不同的肽連接子；或連接子3和/或連接子4不存在；

式(e)、(f)、(g)和(h)所示的結構是從N端至C端排列的；

更佳地，其中，

i)該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：95的胺基酸序列，和該CID28-VL包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；或

ii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

iii)該CD28-VH包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：138的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

該CD28-VH包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列，和該CD28-VL包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列；並且該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列；

最佳地，該抗原結合分子具有：

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：274的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：275的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：272的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：273的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：257的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：258的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：263的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：264的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：265的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：266的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：267的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：270的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：271的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：259的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：260的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：276的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：277的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：261的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：262的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：278的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：279的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：272的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：273的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：274的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：275的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：276的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：277的胺基酸序列的第四鏈；或

一條包含SEQ ID NO：268的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：269的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：278的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：279的胺基酸序列的第四鏈。
一種醫藥組成物，其含有：

如請求項1至9中任一項所述的抗原結合分子，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑；

較佳地，該醫藥組成物中還包含第二治療劑；

更佳地，該第二治療劑是能夠特異性結合CD3的抗體。
一種分離的核酸，其編碼如請求項1至9中任一項所述的抗原結合分子。
一種宿主細胞，其包含如請求項11所述的分離的核酸。
一種治療疾病的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至9中任一項所述的抗原結合分子，或如請求項10所述的醫藥組成物；

較佳地，該疾病是腫瘤；更佳地，該腫瘤為***癌、腎癌、尿路上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、原發性肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、膠質母細胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、食管癌、宮頸鱗狀細胞癌、肺癌、結直腸癌、子宮內膜癌、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腦癌、胃食管癌、肝臟轉移性癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓樣白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)或B細胞淋巴瘤；最佳地，其中該腫瘤的細胞或靠近該腫瘤的血管內皮細胞表達PSMA。
如請求項13所述的方法，其中該方法進一步包括使用第二治療劑；較佳地，該第二治療劑包括抗腫瘤藥劑、放射療法、抗體藥物綴合物、雙特異性抗體、與抗腫瘤藥劑綴合的雙特異性抗體、免疫檢查點抑制劑或其組合。
如請求項14所述的方法，其中該第二治療劑是特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體，其包含至少一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和至少一個特異性結合CD3的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊包含重鏈可變區PSMA-VH和輕鏈可變區PSMA-VL，該特異性結合CD3的抗原結合模塊包含重鏈可變區CD3-VH和輕鏈可變區CD3-VL；

較佳地，

i)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：166的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：167的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：168的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

ii)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：170的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：171的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：172的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：173的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：174的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：175的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

iii)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：158的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：159的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：160的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：161的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：162的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：163的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

iv)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：176的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：177的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：180的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：181的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；或

v)該PSMA-VH具有：包含SEQ ID NO：301的胺基酸序列的PSMA-HCDR1，包含SEQ ID NO：302的胺基酸序列的PSMA-HCDR2，和包含SEQ ID NO：303的胺基酸序列的PSMA-HCDR3；並且該PSMA-VL具有：包含SEQ ID NO：304的胺基酸序列的PSMA-LCDR1，包含SEQ ID NO：305的胺基酸序列的PSMA-LCDR2，和包含SEQ ID NO：306的胺基酸序列的PSMA-LCDR3；

更佳地，

i)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197、199、332、194、195、196或198的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201、202、333或200的胺基酸序列；或

ii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204、184或203的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206、185或205的胺基酸序列；或

iii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188、182、189或190的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191、183、192或193的胺基酸序列；或

iv)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207或186的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208、187、209或210的胺基酸序列；或

v)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：313的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：314的胺基酸序列；

最佳地，

i)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：197的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列；或

該PSMA-VH包含SEQ ID NO：199的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列；或

ii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：206的胺基酸序列；或

iii)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：191的胺基酸序列；或

iv)該PSMA-VH包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列，和該PSMA-VL包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列。
如請求項15所述的方法，其中該特異性結合CD3的抗原結合模塊包含重鏈可變區CD3-VH和輕鏈可變區CD3-VL，其中，

i)該CD3-VH具有：包含SEQ ID NO：283的胺基酸序列的CD3-HCDR1，包含SEQ ID NO：284的胺基酸序列的CD3-HCDR2，和包含SEQ ID NO：285的胺基酸序列的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL具有：包含SEQ ID NO：286的胺基酸序列的CD3-LCDR1，包含SEQ ID NO：287的胺基酸序列的CD3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：288的胺基酸序列的CD3-LCDR3；或

ii)該CD3-VH具有：包含SEQ ID NO：307的胺基酸序列的CD3-HCDR1，包含SEQ ID NO：308的胺基酸序列的CD3-HCDR2，和包含SEQ ID NO：309 的胺基酸序列的CD3-HCDR3；並且該CD3-VL具有：包含SEQ ID NO：310的胺基酸序列的CD3-LCDR1，包含SEQ ID NO：311的胺基酸序列的CD3-LCDR2，和包含SEQ ID NO：312的胺基酸序列的CD3-LCDR3；

更佳地，

該CD3-VH包含SEQ ID NO：289的胺基酸序列，和該CD3-VL包含SEQ ID NO：290的胺基酸序列；或

該CD3-VH包含SEQ ID NO：315的胺基酸序列，和該CD3-VL包含SEQ ID NO：316的胺基酸序列。
如請求項15或16所述的方法，其中該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體包含Fc區；

較佳地，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構；

更佳地，該Fc1在366位置的胺基酸為W；並且該Fc2在366位置的胺基酸為S，在368位置的胺基酸為A，和在407位置的胺基酸為V，編號依據為EU索引；

最佳地，該Fc1包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列；該Fc2包含SEQ ID NO：221或222的胺基酸序列。
如請求項15至17中任一項所述的方法，其中該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體包含一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和一個特異性結合CD3的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊和特異性結合CD3的抗原結合模塊均是scFv；

較佳地，

該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體包含一條具有式(a)所示結構的第一鏈和一條具有式(b)所示結構的第二鏈，

(a)[PSMA-VH]-[連接子6]-[PSMA-VL]-[連接子7]-[CD3-VH]-[連接子8]-[CD3-VL]-[連接子9]-[Fc2]，

(b)[Fc1]，

其中，式(a)和(b)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子6、連接子7、連接子8和連接子9是相同或不同的肽連接子；

最佳地，

該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體具有：一條包含SEQ ID NO：296的胺基酸序列的第一鏈和一條包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列的第二鏈；或

該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體具有：一條包含SEQ ID NO：297的胺基酸序列的第一鏈和一條包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列的第二鏈。
如請求項15至17中任一項所述的方法，其中該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體包含一個特異性結合PSMA的抗原結合模塊和一個特異性結合CD3的抗原結合模塊，該特異性結合PSMA的抗原結合模塊是Fab；該特異性結合CD3的抗原結合模塊是經替換的Fab，其包含能夠形成二聚體的Titin鏈和Obscurin鏈；

較佳地，

該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體包含一條具有式(c)所示結構的第一鏈、一條具有式(d)所示結構的第二鏈、一條具有式(e)所示結構的第三鏈和一條具有式(f)所示結構的第四鏈，

(c)[PSMA-VH]-[CH1]-[Fc1]，

(d)[PSMA-VL]-[CL]，

(e)[CD3-VH]-[連接子10]-[Obscurin鏈]-[Fc2]，

(f)[CD3-VL]-[連接子11]-[Titin鏈]，

其中，式(c)、(d)、(e)和(f)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子10和連接子11是相同或不同的肽連接子；

更佳地，

該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體具有：一條包含SEQ ID NO：298的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：275的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：291的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：292的胺基酸序列的第四鏈。
如請求項15至17中任一項所述的方法，其中該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體包含兩條式(a)所示結構的第一鏈和兩條式(b)所示結構的第二鏈：

(a)[PSMA-VH]-[IgG恆定區]-[連接子12]-[CD3-VL]-[連接子13]-[CD3-VH]；

(b)[PSMA-VL]-CL；

式(a)和(b)所示的結構是從N端至C端排列的，該連接子12和連接子13是相同或不同的肽連接子；較佳地，

其中該特異性結合PSMA和CD3的雙特異性抗體具有兩條包含SEQ ID NO：299的胺基酸序列的第一鏈和兩條包含SEQ ID NO：300的胺基酸序列的第二鏈。
如請求項14所述的方法，其中該第二治療劑是免疫檢查點抑制劑，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1或CTLA4；較佳地，其中該免疫檢查點抑制劑是抗PD-1抗體。
如請求項21所述的方法，其中該抗PD-1抗體包含重鏈可變區PD-1-VH和輕鏈可變區PD-1-VL，其中，

該PD-1-VH具有：包含SEQ ID NO：319的胺基酸序列的PD-1-HCDR1，包含SEQ ID NO：320的胺基酸序列的PD-1-HCDR2，和包含SEQ ID NO：321的胺基酸序列的PD-1-HCDR3；和該PD-1-VL具有：包含SEQ ID NO：322的胺基酸序列的PD-1-LCDR1，包含SEQ ID NO：323的胺基酸序列的PD-1-LCDR2，和包含SEQ ID NO：324的胺基酸序列的PD-1-LCDR3；

較佳地，

該PD-1-VH包含SEQ ID NO：325的胺基酸序列，和該PD-1-VL包含SEQ ID NO：326的胺基酸序列；

更佳地，

該抗PD-1抗體包含SEQ ID NO：328的胺基酸序列的重鏈，和SEQ ID NO：329的胺基酸序列的輕鏈。