TWI754260B - 魚針草內酯抗新型冠狀病毒之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關係於魚針草內酯(Ovatodiolide)安全有效使用於抑制新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染的藥學組成物之用途。前述之藥學組成物，包括安全有效量之魚針草內酯或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體(carrier)。前述含安全有效量之魚針草內酯之藥學組成物，其頗具潛力應用於預防或治療新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引發的嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)。

Description

魚針草內酯抗新型冠狀病毒之用途

本發明的重點是魚針草內酯(Ovatodiolide；Ova)抗新型冠狀病毒之用途；惟在研究開發過程中，將天然物魚針草內酯之製備鑑定分析、基本毒理試驗、魚針草內酯抗新型冠狀病毒作用機制之分子對接模擬、魚針草內酯抗新型冠狀病毒生化實驗證實等，依序進行探討並確認魚針草內酯可適量生產，安全無虞，具備抗新型冠狀病毒的作用機制與實際功效；魚針草內酯確是具有潛力的抑制新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染的天然物，可用以開發為防治嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)的藥物。

目前，因為全世界尚未針對新型冠狀病毒開發出有效預防疫苗或有效治療藥物；新型冠狀病毒已散佈各大洲，導致嚴重特殊傳染性肺炎正全球大流行，許多國家與各跨國藥企都在積極進行研究開發可有效防治之疫苗或藥物。

魚針草(Anisomeles indica O.Kuntze)，為台灣民間常用之草藥，又名客人抹草(廣東蕉嶺、梅縣)、金劍草、本藿香等。臺灣衛福部已將魚針草列入可供食品使用原料彙整一覽表，全株可食。魚針草為唇形科(Labiatae)之一年或越年生草本植物。魚針草主要分佈於中國西南部、印度、菲律賓、印尼爪哇及蘇門答臘，台灣全境平野至低海拔山區均可發現， 台灣花蓮玉里亦有零星藥用栽培。一般民間藥用為採集於夏、秋間，拔起全草或割取地上部位，洗淨，鮮用或曬乾用。全草有解熱、袪風、除濕、健胃、解毒、止痛、抗菌之功效。民間常用於治療感冒發熱、腹痛嘔吐、傷食霍亂、胃痛、胃腸炎、神經性皮炎、風濕骨痛、筋骨疼痛、濕疹、腫毒、瘡瘍、便毒、毒蛇咬傷。

本研發團隊長期進行魚針草育種(GenBank：GU726292)，並持續進行農場種植之魚針草全草萃取物的系列研究，尤其聚焦在魚針草內酯結晶純物質的製備(圖2)，具體執行了萃取分離純化、分析鑑定，以及抗發炎、抗病毒、抗幽門螺旋桿菌、抗癌、抗癌幹細胞等藥理作用等等研究。本團隊近年完成魚針草內酯對照治療A型與B型流行性感冒藥物「克流感」(羅氏藥廠：Tamiflu)的測試實驗，發現魚針草萃取物與魚針草內酯抑制流感病毒的良好效果。近期於2019年底獲悉，治療愛滋病藥物對治療新型冠狀病毒感染病人有呈現正面反應；按，依據文獻報導魚針草內酯可抑制HIV愛滋病毒( Fitoterapia,2000,71(5)：574-576.)。此外，既有研究亦發現魚針草內酯能抑制胃壁中幽門螺旋桿菌引起的胃炎，亦能抑制NF-B與STAT3介導的炎症反應，因此魚針草內酯亦可能緩解新型冠狀病毒引起的肺炎症狀。

本發明是基於發現魚針草內酯或其醫藥上可接受鹽，其可用於抑制新型冠狀病毒感染，甚至治療或預防嚴重特殊傳染性肺炎。特定言之，本發明係提供一種用於抑制新型冠狀病毒感染，甚至治療或預防肺炎之藥學組成物，包括安全有效量之魚針草內酯或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體。

本發明之魚針草內酯具有一化學結構式I，該化學結構式I如圖1所示。

本發明係提供一種以魚針草內酯為有效成分用於抑制新型冠狀病毒感染之藥學組成物為主。經模擬魚針草內酯對新型冠狀病毒表面刺突糖蛋白受體結合區(receptor-binding domain,RBD)分子對接結果顯示：魚針草內酯(Ova)結合到RBD幾個疏水氨基酸(L455,F456,Y489,F490)構成的疏水口袋，並與Y489和Q493形成氫鍵作用(圖3)。該結合位點處於新冠病毒刺突糖蛋白RBD與人體細胞膜受體血管收縮素轉換酶-2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)結合的介面上，預測魚針草內酯(Ova)可阻斷或干擾病毒刺突糖蛋白受體結合區(RBD)與受體(ACE2)的直接結合。新型冠狀病毒表面刺突糖蛋白與人體細胞膜受體血管收縮素轉換酶-2(ACE2)結合是介導病毒入侵宿主的關鍵步驟，阻斷或干擾病毒與受體的結合是潛在的預防及治療策略。

同時，瞭解到宿主內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin L對新型冠狀病毒的融合過程有關鍵的作用。經模擬分子對接結果還顯示魚針草內酯(Ova)亦可能結合至內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin L的催化口袋。魚針草內酯(Ova)以疏水脂環結合Cathepsin B由Y75,P76,A173,A200，以及E245構成的疏水S2位點，並通過環外烯烴與催化半胱氨酸C29形成共價複合物從而抑制Cathepsin B的活性(圖4A)。另一方面，魚針草內酯(Ova)以疏水脂環結合Cathepsin L由L69,M70,Y72,A135,以及M161構成的疏水S2位點，並通過環外烯烴與催化半胱氨酸C25形成共價複合物從而抑制Cathepsin L的活性(圖4B)。由於內體半胱氨酸蛋白水解酶 Cathepsin B和Cathepsin L對新型冠狀病毒的融合過程有關鍵的作用，魚針草內酯(Ova)潛在地阻斷新型冠狀病毒的侵入融合過程。

本研究特別落實經由北京清華大學愛滋病綜合研究中心主任張林琦教授實驗室開發之新型冠狀病毒假病毒抑制活性檢測體系，具體評估魚針草內酯是否阻斷新型冠狀病毒感染宿主細胞過程。實驗結果顯示魚針草內酯以具體有別於氯喹(chloroquine)或瑞德西偉(Remdesivir)抑制新型冠狀病毒的分子作用機制，魚針草內酯在微摩爾級別顯著展現對新型冠狀病毒感染的抑制效果(圖5)。

魚針草內酯可擁有一或多個對掌中心，因此具有各種立體異構物形式。本發明中提及之魚針草內酯包括所有此等異構物；此外，亦包括含魚針草內酯主結構之衍生化合物，且該等衍生化合物對於抑制新型冠狀病毒的分子作用機制與本發明揭示之結合新型冠狀病毒表面刺突糖蛋白受體結合區分子對接機制，或結合宿主內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin L分子對接機制，具類同效果者。魚針草內酯具有選擇性抑制新型冠狀病毒感染的功效；由於其分子量極小，因此，可使用較低劑量的魚針草內酯或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體，即可得到渴望的治療效果。本發明為一抑制新型冠狀病毒感染，甚至治療或預防嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)的藥學組成物，係將一安全有效量之魚針草內酯或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體，用於抑制新型冠狀病毒，或投予具有嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)症狀的患者，以治癒、恢復、減輕、緩和、改變、治療、改善、改進或影響疾病、疾病的症狀或傾向於疾病的體質為目的。此處使用的“有效量(an effective amount)”指有效量之魚針草內酯或其醫藥上 可接受鹽，具有抑制或治療功效的量。有效量的改變是根據給藥的途徑、輔藥使用(excipient usage)以及與其他共同使用(co-usage)的活性藥劑。

此處之“嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)”意指新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)侵入人體引起的致命肺炎。新型冠狀病毒利用冠狀病毒表面的刺突醣蛋白(Spike glycoprotein)識別細胞表面的血管收縮素轉換酶-2(ACE2)，進而侵染人體的正常細胞。一種可能的機制是當病毒侵入體內後，體內的免疫細胞激烈作用，引發體內免疫風暴，釋放大量自由基(如過氧化自由)而讓蛋白質變性，DNA損傷，細胞激素過度產生，導致大量細胞的壞死，在肺部就形成了嚴重的致命肺炎。魚針草內酯可有效抑制新型冠狀病毒感染，進而預防或治療嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)。

魚針草內酯是以有機溶劑萃取魚針草全草、地上部分枝葉、或葉子，並經矽膠管柱分離純化製備而得；或另以化學合成方法製備而得。例如：由“魚針草萃取”指自較適成長程度之魚針草所萃取出的魚針草萃取物。為取得該魚針草萃取物，可使用本技術領域中眾所周知的萃取技術。例如可將經乾燥與研磨之該魚針草懸浮在一溶劑或者兩種或多種溶劑之混合液於一足夠長的時間。適合的溶劑的例子包括，但不限定為：水、甲醇、乙醇、丙酮(acetone)、醚類(ether)(例如***(diethyl ether))與乙酸乙酯酯類(ethyl acetate)與己烷(hexane)。之後移除固體殘餘物(例如藉由過濾)得到該魚針草萃取物溶液，其可經氧化鋁、氧化矽、矽膠管柱純化製備得魚針草內酯。

在本發明之治療方法中，魚針草內酯或其醫藥上可接受鹽類可同時給藥或分開給藥，以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或 藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。此處所使用之“非口服”指皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intraleaional)與頭顱內(intracranial)注射以及灌注技術。本發明所使用魚針草內酯及/或其醫藥上可接受鹽類可與至少一種固體、液體或半液體狀之賦形劑或輔助劑一同形成適當的藥劑形式。其形式包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。藥錠一般所使用的載體(carrier)包括乳糖與玉米澱粉。一般也將潤滑劑(lubricating agent)，例如硬脂酸鎂(magnesium stearate)加至藥錠中。用於膠囊形式的稀釋劑(diluents)包括乳糖與經乾燥的玉米澱粉。當口服給藥為水性懸浮液或乳劑時，可懸浮或溶解有效成分(active ingredient)於與乳化或懸浮劑結合的油相(oily phase)。如果需要，可加入特定甜味、調味與著色劑。本發明所使用魚針草內酯或其醫藥上可接受鹽類亦可配製成無菌注射成分(例如，水或油的懸浮液)，例如利用本技術領域中已知的技術使用適合的分散或增溼劑(例如Tween 80)與懸浮劑。無菌注射調劑也可以將無菌注射溶液或懸浮液加入無毒性非口服之稀釋劑或溶劑，例如1,3丁二醇(1,3-Butanediol)中。可使用的載具(vehicles)與溶劑包括甘露醣醇(mannitol)、水、林格氏液(Ringer’s solution)與等滲透壓氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油常作為溶劑或懸浮媒介(例如合成的單-或雙-甘油酯(glycerides))。脂肪酸，例如油酸(oleic acid)與其甘油酯衍生物亦可用在注射劑的調製，其為天然藥學上可接受的油，例如橄欄油、蓖麻油(castor oil)，特別是於其聚氧乙基化 的(polyoxyethylated)變化形式。這些油溶液或懸浮液也可包含一長鏈醇類稀釋劑或分散劑，或者羧基甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)或類似的分散劑。本發明所使用魚針草內酯或其醫藥上可接受鹽類亦可根據此技術領域中所熟知的技術來配製成吸入成分。例如可製成鹽類溶液，利用苯甲醇(benzyl alcohol)或其他適合的防腐劑、增強生物可利用性(bioavailability)的吸附促進劑、碳氟化合物(fluorocarbon)或其他本技術領域中熟知的助溶或分散劑來配製。用於藥學組成物的載體必須是“可接受的”，其與配方的有效成分相容(以及較佳為具有穩定有效成分之能力)以及不對病患有害。例如，助溶劑(例如環狀糊精(cyclodextrins))(其與一個或多個萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的複合物)，為了有效成分的傳送而作為藥理學上的輔藥。其他載體的例子包括膠狀二氧化矽(colloidal silicon dioxide)、硬脂酸鎂、纖維素與烷基硫酸鹽(sodium lauryl sulfate)。

另外，由於抗病毒劑如以高劑量投予病患易產生副作用。是以依據本發明揭示之魚針草內酯系列毒理實驗結果，含對大鼠之單一劑量口服急毒性試驗、對大鼠28天餵食毒性試驗、對沙門氏菌回復突變之Ames試驗、對體外哺乳類細胞株染色體異常分析試驗、對小鼠週邊血液微核試驗等，均顯示魚針草內酯不具有基因毒性，並提供了安全口服劑量範圍。本發明醫藥組合物為含有安全有效量之魚針草內酯，用於抑制新型冠狀病毒感染，其中該安全有效量為一般成人(60公斤體重)：每日口服480毫克以內，並以持續服用28天以內為限。較佳為一般成人(60公斤體重)：每日口服20毫克至40毫克，並以持續服用7天至14天為適當。施予個別病人的特定劑量是依所有可能存在因素而定，例如：所使用之特定化合物的活性、年齡、體重、 一般健康狀況、性別、進食狀況、施用時間與路徑、***率、醫藥物質之組合、以及所欲治療之疾病的嚴重程度等。

本發明還提供一種組合物用於製備抑制冠狀病毒的藥物之用途，其中該組合物包括一魚針草內酯(Ovatodiolide)、或一魚針草內酯之結構異構物。

圖1.魚針草內酯(Ovatodiolide)結構式。

圖2.魚針草內酯結晶X-ray ORTEP diagram。

圖3.新型冠狀病毒突刺糖蛋白受體結合區RBD與人體細胞膜受體ACE2複合物結構，及魚針草內酯(Ova)與RBD的對接結構，魚針草內酯(Ova)結合在RBD上，干擾其與ACE2的結合。圖中標記：ACE2：血管收縮素轉換酶2；nCov S-RBD：新型冠狀病毒突刺糖蛋白受體結合區；Ovatodiolide(Ova)：魚針草內酯。

圖4.魚針草內酯(Ova)與半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B(A)和Cathepsin L(B)的對接結構，其中魚針草內酯(Ova)以環外烯烴分別與Cathepsin B的催化半胱氨酸C29，以及Cathepsin L的催化半胱氨酸C25形成共價鍵。圖中標記：Ovatodiolide(Ova)：魚針草內酯；Cathepsin B：半胱氨酸蛋白水解酶B；Cathepsin L：半胱氨酸蛋白水解酶L。

圖5.魚針草內酯抑制新型冠狀病毒感染的活性曲線，IC₅₀=3.73μM。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較 佳實施例，做詳細說明如下：

實施例1.魚針草內酯的製備與分析：取魚針草(一年生、臺灣花蓮玉里秋季採收)大致陰乾葉子部分(800g)，放入烘箱(40℃)進行乾燥(24小時)，可得乾燥魚針草葉子(500g)。將乾燥之魚針草葉子(500g)裝入20公升桶子(PE材質)，並加入10公升95%酒精確保所有葉子均浸泡於溶劑中，之後將桶子密封保存於陰涼處7天。7天之後，將95%酒精層與葉子經由過濾分開並透過迴轉式蒸發濃縮機進行濃縮，獲得黃綠色萃取物(10g)。以氧化鋁管柱層析法進行純化(中性氧化鋁：300g)。用10mL丙酮將黃綠色萃取物(10g)溶解並加到充填好的氧化鋁管柱。溶劑沖提比例Hexane：Ethyl acetate/100%：0%，逐漸增加極性到Hexane：Ethyl acetate/70%：30%。經由薄層色層分析試紙檢測(TLC)的篩選比對，魚針草內酯可於第三個區段流出管柱。利用迴轉式蒸發濃縮機將可揮發物質抽乾後，加入15mL的丙酮回溶，利用溶劑擴散長晶方式，經過七天可得透明魚針草內酯晶體1.56g，產率約0.3%。經由X-ray,NMR,IR,Mass,HPLC等儀器鑑定。純化所得晶體確定為魚針草內酯。透過乾燥、萃取、純化和鑑定，我們成功地從魚針草中單離出魚針草內酯(ovatodiolide)，其對葉子的產率約為3000ppm，惟葉子只占魚針草全株的7%以下，且收集不易。魚針草內酯分析鑑定：X-ray Crystals of ovatodiolide are Orthorhombic,space group P2₁2₁2₁,with a=10.7714(3),b=12.8674(3),c=13.0829(3),V=1813.29(8)ų,D(calculated)=1.203Mg/m³,Z=4,Formula weight=328.39,Goodness-of-fit on F²=1.056,R indices(all data)：R1=0.0347,wR2=0.0942。ORTEP diagram is depicted as Figure 2(圖2).¹HNMR(400MHz,CDCl₃)：1.59(s,3H),1.62(m,1H),1.64(m,1H),1.72(s,3H),2.04(m,1H), 2.12(m,1H),2.19(m,1H),2.26(dd,1H),2.39(m,1H),2.45(m,1H),2.52(m,1H),2.80(m,1H),2.86(dd,1H),4.81(m,1H),4.85(bd,1H),5.08(m,1H),5.12(bd,1H),5.57(bs,1H),6.12(bs,1H),6.98(bs,1H)。¹³CNMR(125MHz,CDCl₃)：15.1,19.3,23.7,24.9,33.3,36.3,40.3,42.7,77.9,78.8,122.9,125.0,129.1,131.2,134.3,134.5,139.6,147.4,170.4,173.0。FTIR(KBr pellet)：3100,2900,1740,1650,1430,1395,1320,1200,1110,1045,1080,980,960,930,910,880,860,820,750,625cm ¹ and HRMS(ESI)m/z calcd.for C₂₀H₂₄O₄(M+)328.1675,found 328.1672。

實施例2.魚針草內酯對大鼠之單一劑量口服急毒性試驗：本實施例為測試魚針草內酯對大鼠之單一劑量口服急毒性安全性試驗，提供食用安全評估之參考。試驗依據臺灣衛福部健康食品安全性評估-單一劑量口服急毒性試驗、美國環保署(USEPA)(Health Effects Test Guidelines,OPPTS 870.1100,Acute oral toxicity,US EPA 712-C-98-190.In：OPPTS Harmonized Test Guidelines,Series 870.3050,EPA712-C-00-366)及經濟合作暨開發組織(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals.Section 4：Health Effects.No.420：Acute Oral Toxicity-Fixed Dose Procedure,No.423：Acute Oral Toxicity-Acute Toxic Class Method,No.425：Acute Oral Toxicity-Up and Down Method)等試驗規範進行單一劑量口服急毒性試驗。本實驗進行魚針草內酯對大鼠(Sprague-Dawley,SD品系)之單一劑量口服急毒性試驗。魚針草內酯為微黃結晶狀，試驗純度為99.95%，試驗時以10%DMSO配製成溶液濃度0.1g/mL，每隻大鼠餵食體積量為10mL/kg body weight，當日依體重經口餵食大鼠，最終投予劑量總計為1g/kg-body weight，投予後連續觀察14天。結果顯示，以魚針草內酯口服投予大鼠後，全部鼠隻皆無中毒症狀或死亡。每週體重變化 (g)方面，處理組雄鼠及雌鼠之每週體重及增重與對照組相比均無明顯差異。試驗結束後，處理組雄鼠及雌鼠之血液值變化，包括：白血球總數(WBC count)、紅血球總數(RBC count)、血球容積比(Hct)、平均紅血球體積(MCV)、平均血紅素(MCH)、平均血紅素濃度(MCHC)、血小板(platelet)總數及白血球分類等均無明顯異常。處理組雄鼠及雌鼠之血清肝腎酵素值，包括：天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)、丙胺酸胺基轉移酶(ALT)、尿素氮(BUN)及肌酐酸(creatinine)等項目均無影響。體內臟器絕對重量(g)及臟器重量百分比方面，於腎上腺、腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、胸腺、睪丸或卵巢等臟器，處理組與對照組比較並無顯著差異。經檢查體內臟器，處理組之腎上腺、腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、胸腺、睪丸或卵巢等重要臟器均無肉眼病變。經組織病理檢查結果顯示，魚針草內酯處理組之重要臟器亦均無與試驗物質相關之組織病理變化。綜合試驗結果顯示，魚針草內酯1g/kg-body weight(換算人類適用劑量約為50mg/kg-body weight)之單一劑量口服急毒性試驗對大鼠並未造成急性中毒或死亡，且對體內重要臟器均未造成組織器官與毒性反應有關之病理變化。

實施例3.魚針草內酯對大鼠28天餵食毒性試驗：本實施例為測試魚針草內酯對大鼠之重複劑量口服毒性安全性試驗，藉以建立物質安全資料表(material safety data sheet)，提供人體重複服用臨床安全性評估之參考。試驗乃依據臺灣衛福部健康食品安全性評估28天餵食毒性試驗(1999)及藥品非臨床試驗安全規範(2014)，並符合美國環保署(USEPA)(Health Effects Test Guidelines,OPPTS 870.1100,Repeated Dose 28-Day Oral Toxicity Study in Rodents.In：OPPTS Harmonized Test Guidelines,Series 870.3050,EPA712-C- 00-366)及經濟合作暨開發組織(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals.Section 4：Health Effects.No.407：Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in Rodents)等試驗規範。本實驗探討魚針草內酯對人體是否可能造成潛在副作用毒性，以供臨床安全評估，進行魚針草內酯對大鼠28天重複劑量口服毒性之臨床副作用觀察試驗。魚針草內酯為微黃色結晶狀，試驗純度視為99.95%，試驗時將樣品以5% DMSO配製。大鼠(Sprague-Dawley,SD品系)分為對照組(5% DMSO)、低劑量組(10mg/kg-body weight)、中劑量組(25mg/kg body weight)及高劑量組(50mg/kg-body weight)等4組，每組20隻大鼠，雌雄鼠各半，每隻大鼠餵食體積量為10mL/kg-body weight，當日依體重經口餵食大鼠連續28天。試驗結果顯示，以魚針草內酯口服連續投予大鼠28天後，全部鼠隻皆無因試驗物質造成中毒症狀或死亡。試驗結束後，魚針草內酯各處理組雄鼠及雌鼠之體重變化、飼料消耗量、尿液、血液值、血清酵素值及臟器重量與對照組比較等數值，雖因個體差異略有上升或下降現象，但仍在正常值範圍內，或組間並不具劑量與反應相關性，並不具臨床病理意義，與試驗物質無關。檢查各組大鼠全身臟器均無明顯肉眼病理變化，經組織病理檢查結果顯示，高劑量組對體內各臟器並未造成器官毒性反應相關之病理變化。綜合以上檢查結果顯示，魚針草內酯分別以低劑量組(10mg/kg-body weight)、中劑量組(25mg/kg-body weight)及高劑量組(50mg/kg-body weight)經口連續餵食大鼠28天後，並不造成雌雄大鼠各臟器毒性反應，對大鼠28天餵食毒性試驗之「無不良影響劑量值」(No observed adverse effect level,NOAEL)為50mg/kg-body weight，換算人類適用劑量約為8mg/kg-body weight。

實施例4.魚針草內酯對沙門氏菌回復突變之Ames試驗：本實施例為測試魚針草內酯對沙門氏菌(Salmonella typhimurium)TA98、TA100、TA102、TA1535及TA1537菌株回復突變之Ames試驗，藉以建立產品安全資料(Material Safety Data Sheet)，提供使用安全評估之參考。試驗依據臺灣衛福部「健康食品安全性評估方法」之基因毒性試驗(genotoxicity study)(1999)、美國環保署(USEPA)(Health Effects Test Guidelines,Bacterial Reverse Mutation Test,US EPA 712-C-98-247.In：OPPTS Harmonized Test Guidelines,Series 870.5100,1998)及經濟合作暨開發組織(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals.Section 4：Health Effects.No.471：Bacterial Reverse Mutation Test,2002)等試驗規範進行致變異性試驗。本實驗進行魚針草內酯對沙門氏菌(Salmonella typhimurium)TA98、TA100、TA102、TA1535及TA1537菌株回復突變之Ames試驗。試驗先以魚針草內酯之1.25、2.5及5mg/plate等濃度與菌株共同作用18-20小時，進行細菌毒性試驗。結果顯示，魚針草內酯在5mg/plate以下對TA102菌株無顯著毒性，但對TA98、TA100、TA1535及TA1537菌株具有毒性；於是再以魚針草內酯之0.63、1.25及2.5mg/plate等濃度與TA98、TA100、TA1535及TA1537菌株共同作用18小時，進行細菌毒性試驗。結果顯示，魚針草內酯在2.5mg/plate以下對TA98、TA100、TA1535及TA1537菌株皆無顯著毒性。以魚針草內酯對TA102菌株無顯著毒性之最高濃度向下連續2倍稀釋，選取0.31、0.63、1.25、2.5及5mg/plate等5個濃度作為Ames正式試驗；而TA98、TA100、TA1535及TA1537菌株無顯著毒性之最高濃度向下連續2倍稀釋，選取0.16、0.31、0.63、1.25及2.5mg/plate等5個濃度作為Ames正式試驗，分別進行魚針草內酯直接以及經大鼠肝臟活 化酵素抽出液(S9)混合後作用於沙門氏突變菌株，藉以模擬魚針草內酯經動物體內肝臟酵素(S9)代謝後之代謝產物對各菌株之基因致變異性，經共同培養48小時後計數其菌量。結果顯示，不論魚針草內酯直接或經S9作用後，對細菌回復突變菌數均未大於陰性對照組回復突變菌數2倍以上。綜合以上結果，魚針草內酯對沙門氏菌回復突變之Ames試驗並不具有致變異性，對細菌基因突變測試結果為陰性反應(non genetic mutation in Ames test)。

實施例5.魚針草內酯對體外哺乳類細胞株染色體異常分析：本實施例為測試魚針草內酯對體外哺乳類細胞株染色體異常分析，藉以建立產品安全資料(Material Safety Data Sheet)，提供使用安全評估之參考。試驗依據臺灣衛福部健康食品之體外哺乳類細胞株染色體異常分析試驗，並符合美國環保署(USEPA)(Health Effects Test Guidelines,OPPTS 870.1100,In vitro mammalian chromosome aberration test,US EPA 712-C-98-190.In：OPPTS Harmonized Test Guidelines,Series 870.3050,EPA712-C-00-366,1998)及經濟合作暨開發組織(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals.Section 4：Health Effects.No.473：In vitro mammalian chromosome aberration test 1997)等試驗規範進行基因毒性試驗。本實驗進行魚針草內酯之細胞染色體變異試驗(Chromosomal aberration test with mammalian cell in culture)。魚針草內酯為微黃色結晶狀，試驗時以Dimethyl sulfoxide(DMSO)配製。細胞毒性試驗分為兩部分，一部分以CHO-K1細胞直接與魚針草內酯作用，另一部分以大鼠肝臟活化酵素抽出液(S9)模擬人體代謝，CHO-K1細胞與大鼠肝臟活化酵素抽出液(S9)及魚針草內酯混合後作用。於不含大鼠肝臟活化酵素抽出液(-S9)試驗先以5種測試劑量12.5、15、17.5、20及25μM進行24小時細胞毒性 試驗，結果顯示，17.5μM之魚針草內酯對CHO-K1細胞存活率約65.6%。另於含大鼠肝臟活化酵素抽出液(+S9)試驗先以5種測試劑量60、70、75、80及90μM進行24小時細胞毒性試驗，結果顯示，75μM之魚針草內酯對CHO-K1細胞存活率約60.3%，顯示魚針草內酯對CHO-K1細胞具有細胞毒性，選此濃度作為正式試驗最高劑量。細胞染色體變異試驗取樣品魚針草內酯以12.5、15與17.5μM(-S9)，配製樣品溶液於每個細胞培養皿中，共同培養24小時；另於55、65與75μM與S9共同培養3小時後，經24小時觀察細胞染色體數量及結構是否正常。結果顯示，魚針草內酯經或未經S9混合液代謝活化系統之測試條件下，在12.5、15與17.5μM(-S9)及55、65與75μM(+S9)，等3個劑量組所造成之CHO-K1細胞染色體異常頻率，與陰性對照組並無明顯增加，且對細胞染色體變異位置亦無明顯變化。綜合以上結果顯示，無論是否含有S9混合物之魚針草內酯對體外哺乳類細胞株CHO-K1之染色體均不具致變異作用。

實施例6.魚針草內酯對小鼠週邊血液微核試驗：本實施例為測試魚針草內酯之基因毒性試驗，藉以建立產品安全資料(Material Safety Data Sheet)，提供使用安全評估之參考。試驗依據臺灣衛福部健康食品安全性評估-基因毒性試驗之小鼠週邊血液微核試驗，並符合美國環保署(USEPA)(Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test,In：OPPTS Harmonized Test Guidelines,Series 870.5395,EPA 712-C-98-226)及經濟合作暨開發組織(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals.Section 4：Health Effects.No.474：Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test,1997)等試驗規範進行基因毒性試驗。本實驗進行魚針草內酯對小鼠(ICR品系)週邊血液微核試驗。 本試驗主要測試魚針草內酯對嚙齒類動物體內(in vivo)週邊血液微核發生之比例，藉以評估直接或間接引發紅血球染色體或有絲***之基因變異造成傷害程度。試驗以ICR小鼠為試驗對象，試驗分為陰性對照組、陽性對照組(Cyclophosphamide,60mg/kg bw ip)、魚針草內酯低劑量(0.25g/kg bw)、中劑量(0.5g/kg bw)及高劑量(1g/kg bw)等5組，每組5隻小鼠(雄)，並以胃管單次餵食魚針草內酯，在投予試驗物質48小時及72小時後，評估對小鼠週邊血液之網狀紅血球及網狀紅血球中微核發生率(‰)。結果顯示，投予魚針草內酯48小時及72小時後，各處理組並無毒性症狀及體重差異。小鼠週邊血液之網狀紅血球以0.1% Acridine orange stain染色於螢光顯微鏡下呈橘紅色，網狀紅血球內可見約1/20-1/5紅血球大小黃綠色螢光之微核。比較魚針草內酯各處理組之48小時及72小時網狀紅血球數目及網狀紅血球中含微核數目均與陰性對照組間無明顯差異。陽性對照組小鼠之網狀紅血球數目與陰性對照組比較則有顯著性下降(p<0.05)，網狀紅血球中微核數目亦有顯著性增加(p<0.05)。綜合以上結果，魚針草內酯各劑量組對小鼠週邊血液之網狀紅血球和網狀紅血球中微核數目均與陰性對照組無顯著性差異，試驗結果為陰性。因此，魚針草內酯對小鼠週邊紅血球不具染色體基因變異之毒性作用。

實施例7.魚針草內酯結合新型冠狀病毒表面刺突糖蛋白受體結合區分子對接模擬研究：新型冠狀病毒表面刺突糖蛋白與人體細胞膜受體血管收縮素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)結合是介導病毒入侵宿主的關鍵步驟，阻斷或干擾病毒與受體的結合是潛在的預防及治療策略。本實施例為基於分子對接評估魚針草內酯(Ova)是否結合新型冠狀病毒表面刺突糖蛋白以及阻斷或干擾其與受體分子血管收縮素轉換酶 2(ACE2)的結合，以闡明魚針草內酯抗病毒的機制。具體實施方法如下：取新冠病毒表面刺突糖蛋白受體結合區(receptor-binding domain,RBD)的晶體結構(PDB code：6M0J)作為分子對接受體，利用MOE軟體給RBD結構添加氫原子並進行能量優化。配體魚針草內酯(Ova)的結構亦由MOE軟體構建，採用標準MMFF94分子力場以及0.0001kcal/mol的能量梯度為收斂標準進行能量優化。基於MOE的分子對接模組進行分子對接，能量最優的對接結構進一步進行能量優化以及對接模式分析。分子對接結果顯示魚針草內酯(Ova)結合到RBD幾個疏水氨基酸(L455,F456,Y489,F490)構成的疏水口袋，並與Y489和Q493形成氫鍵作用(圖3)。該結合位點處於新冠病毒刺突糖蛋白RBD與受體ACE2結合的介面上，預測魚針草內酯(Ova)可阻斷或干擾病毒刺突糖蛋白RBD與受體ACE2的直接結合。

實施例8.魚針草內酯結合宿主內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin L分子對接模擬研究：宿主內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin L對冠狀病毒的融合過程有關鍵的作用。本實施例為基於分子對接評估魚針草內酯是否結合並抑制Cathepsin B和Cathepsin L，以闡明魚針草內酯抗病毒的作用機制。具體實施方法如下：取人內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和cathepsin L的晶體結構(PDB code：3AI8 & 2XU1)分別作為分子對接受體，利用MOE軟體給RBD結構添加氫原子並進行能量優化。配體魚針草內酯(Ova)的結構亦由MOE軟體構建，採用標準MMFF94分子力場以及0.0001kcal/mol的能量梯度為收斂標準進行能量優化。基於MOE的分子對接模組進行分子對接，能量最優的對接結構進一步進行能量優化以及對接模式分析。分子對接結果還顯示魚針草內酯(Ova)亦可能結合 至內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin L的催化口袋。魚針草內酯(Ova)以疏水脂環結合Cathepsin B由Y75,P76,A173,A200，以及E245構成的疏水S2位點，並通過環外烯烴與催化半胱氨酸C29形成共價複合物從而抑制Cathepsin B的活性(圖4A)。另一方面，魚針草內酯(Ova)以疏水脂環結合Cathepsin L由L69,M70,Y72,A135，以及M161構成的疏水S2位點，並通過環外烯烴與催化半胱氨酸C25形成共價複合物從而抑制Cathepsin L的活性(圖4B)。由於內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin L對冠狀病毒的融合過程有關鍵的作用，魚針草內酯(Ova)潛在地阻斷新冠病毒的侵入融合過程。

實施例9.魚針草內酯抑制新型冠狀病毒感染的活性研究：實施例7所述魚針草內酯與新型冠狀病毒表面刺突糖蛋白受體結合區(receptor-binding domain,RBD)的分子對接模擬研究結果，以及實施例8所述魚針草內酯與內體半胱氨酸蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin L等的分子對接模擬研究結果，預測魚針草內酯可抑制新型冠狀病毒的感染過程。本實施例為基於北京清華大學愛滋病綜合研究中心主任張林琦教授實驗室開發之新型冠狀病毒假病毒抑制活性檢測體系，評估魚針草內酯是否阻斷新型冠狀病毒感染宿主細胞過程。具體實施方法按新型冠狀病毒假病毒構建和新型冠狀病毒感染抑制檢測兩步驟進行：步驟1.利用膜糖蛋白缺失(Env-defective)與表達螢光素蛋白的HIV-1病毒基因組質粒pNL4-3R-E-luciferase，以及表達新型冠狀病毒全長表面刺突糖蛋白質粒pcDNA3.1/SARS-CoV-2共轉染293T細胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養基培養60小時。取培養上清液，獲得新型冠狀病毒假病毒的病毒液(簡稱SARS-CoV-2病毒液)。步驟2.取 96孔細胞培養板，每孔加入100微升魚針草內酯稀釋液和50微升SARS-CoV-2病毒液(50微升SARS-CoV-2病毒液中的病毒濃度為1×10⁴TCID50/mL)，使得混合體系中的魚針草內酯溶液濃度為相應的稀釋濃度，37℃靜置孵育1小時。用等體積10%胎牛血清的DMEM培養基代替魚針草內酯溶液稀釋液，作為病毒對照。用等體積含10%胎牛血清的DMEM培養基代替SARS-CoV-2病毒液，作為細胞對照。取所述細胞培養板，每孔接種100微升Huh7細胞懸液(用於製備細胞懸液的溶劑為含10%胎牛血清的DMEM培養基，細胞懸液中的Huh7細胞濃度為2×10⁵個細胞/mL)，37℃靜置孵育64小時。吸棄上清液，每孔加入150微升裂解液(微格拉斯生物技術，貨號T003，按說明書操作)，37℃靜置孵育5分鐘。取所述細胞培養板，檢測螢光素酶活性。每個處理設置多個複孔。抑制活性(%)=[1-(試驗組的螢光強度-細胞對照的螢光強度)/(病毒對照的螢光強度-細胞對照的螢光強度)]×100%。利用Prism 5軟體計算抑制活性為50%時的魚針草內酯濃度，即魚針草內酯的IC₅₀值(圖5)。研究結果顯示魚針草內酯以具體有別於氯喹(chloroquine)或瑞德西偉(Remdesivir)抑制新型冠狀病毒之分子作用機制，在微摩爾級別顯著展現對新型冠狀病毒感染的抑制效果。

Claims (8)

1. 一種組合物用於製備抑制新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的藥物之用途，其中該組合物包括一安全有效量之魚針草內酯(Ovatodiolide)、或一安全有效量之魚針草內酯之結構異構物，其中該魚針草內酯具有一化學結構式I：

   
2. 如請求項1所述之用途，其中該組合物進一步包括該魚針草內酯或該魚針草內酯之結構異構物於醫藥上可接受之鹽或載體(carrier)。
3. 如請求項1所述之用途，其中該組合物可用於預防或治療新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的疾病。
4. 如請求項1所述之用途，其中該組合物可用於預防或治療嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)。
5. 如請求項1所述之用途，其中該魚針草內酯係以有機溶劑萃取魚針草，並經層析管柱分離純化製備而得之天然化合物，或係以化學合成方式製備同魚針草內酯天然物構形之人工合成化合物。
6. 如請求項1所述之用途，其中該安全有效量為60公斤體重之 一般成人每日口服480毫克以內，並以持續服用28天以內為限。
7. 如請求項1所述之用途，其中該安全有效量為60公斤體重之一般成人每日口服20毫克至40毫克，並持續服用7天至14天。
8. 一種組合物用於製備抑制冠狀病毒的藥物之用途，其中該組合物包括一魚針草內酯(Ovatodiolide)、或一魚針草內酯之結構異構物，其中該魚針草內酯具有一化學結構式I：

   

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