TW201313243A - 魚針草內酯或魚針草萃取物用於製造抑制細菌引起之發炎反應之醫藥組成物的用途 - Google Patents

Abstract

一種魚針草內酯或魚針草萃取物用於製造抑制細菌引起之發炎反應之醫藥組成物的用途，其中抑制細菌引起之發炎反應包括抑制幽門螺旋桿菌所引起之發炎反應及抑制巨噬細胞所引起之發炎反應。本發明可應用於有效的治療胃發炎反應的各種治療中，而具有低副作用及高安全性。

Description

魚針草內酯或魚針草萃取物用於製造抑制細菌引起之發炎反應之醫藥組成物的用途

本發明係一種魚針草內酯或魚針草萃取物用於製造抑制細菌引起之發炎反應之醫藥組成物的用途，尤其係一種魚針草內酯或魚針草萃取物用於製造抑制幽門螺旋桿菌引起之發炎反應之醫藥組成物的用途。

胃發炎是現今常見的疾病之一，致病原因包括長期壓力過大引起自律神經亢進，導致胃酸增加，或是進食時間不正常等而形成慢性胃炎，或是攝取刺激性食物傷害胃部黏膜、細菌或病毒入侵胃部而造成急性發炎等，這些原因都會造成胃黏膜發炎，同時伴隨腹痛、噁心、嘔吐及腹瀉等症狀，若不及時醫治或胃部反覆發炎可能導致胃潰瘍，嚴重甚至導致出血而危及生命。

目前最常見引起胃發炎的細菌，即是幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)，幽門螺旋桿菌是一種微需氧之革蘭氏陰性菌，喜好聚集於胃部及十二指腸的黏膜層部分。該幽門螺旋桿菌會利用尿素酶(urease)產生鹼性的氨(NH₄ ⁺)以中和胃酸使細菌本身更能存活於胃部酸性環境中，並藉由觸化酶(catalase)及超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)保護細菌本身不受宿主細胞之吞噬及胞內毒殺作用；並藉由分泌液泡性毒素(vacuolation cytotoxin)以破壞黏膜組織，進而引起發炎反應而造成胃黏膜受損，反覆發炎則會引發胃潰瘍甚至導致胃癌。

目前治療感染幽門螺旋桿菌的方式，通常需合併下列藥物同時進行投藥：(1)抗生素類，例如：胺羥芐青黴素(amoxicillin)、克拉黴素(clarithromycin)、四環黴素(tetracycline)或甲硝唑(metronidazole)等；以及(2)鉍鹽(bismuth)、制酸劑或質子幫浦抑制劑(proton pump inhibitor)等。但幽門螺旋桿菌容易對抗生素產生抗藥性，故目前是以兩種抗生素加上鉍鹽或質子幫浦抑制劑等三合一或四合一療法合併投藥，但除菌率仍只有84%，且病患常伴有嘔心、腹瀉、脹氣、暈眩等明顯的副作用，因此病患常自行停用服藥，而導致難以根除。基於上述可見，現有技術的胃發炎的治療方法仍待改善。

有鑑於現有技術的前述缺失，本發明之目的在於提供一種魚針草內酯或魚針草萃取物用於製造抑制細菌引發之發炎反應之醫藥組成物的用途，且相較於現有技術的抗生素，本發明之魚針草萃取物以較低的濃度即可作為治療因細菌所引起之發炎反應之用途，且魚針草萃取物係來自天然植物，而不會有抗生素以及鉍鹽等之副作用，而具有較高的安全性。

為達到上述之目的，本發明提供一種魚針草內酯或魚針草萃取物用於製造抑制細菌引起之發炎反應之醫藥組成物的用途，其中抑制細菌所引起之發炎反應包括抑制細菌所引起之發炎反應及抑制巨噬細胞所引起之發炎反應。

所述之該魚針草萃取物係包括以不同濃度之乙醇水溶液(ethanol aqueous solution)萃取所得的魚針草萃取物，其係含有魚針草內酯(ovatodiolide)。

依據本發明，用語「不同濃度之乙醇水溶液」如此處所使用的係指以10、20、50及95%濃度之乙醇水溶液。

較佳的，所述之魚針草萃取物係以濃度介於50至95%的乙醇水溶液萃取而得的產物。

較佳的，所述之用途中細菌係幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)。更佳的，所述的幽門螺旋桿菌係寄存於食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，且其寄存編號為BCRC 17219(ATCC 700392)。較佳的，所述之用於製造抑制幽門螺旋桿菌所引起之發炎反應之魚針草萃取物係以50%乙醇水溶液萃取，並註記為『魚針草50%乙醇萃取物』，該魚針草50%乙醇萃取物可抑制幽門螺旋桿菌所引起之胃上皮細胞分泌之介白質-8(Interleukin-8,IL-8)及轉錄因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB)，且該魚針草50%乙醇萃取物之濃度為每毫升100至400微克(μg/ml)。

較佳的，所述之用於製造抑制幽門螺旋桿菌所引起之發炎反應之魚針草萃取物係以95%乙醇水溶液萃取，並註記為『魚針草95%乙醇萃取物』，該魚針草95%乙醇萃取物可抑制幽門螺旋桿菌引起胃上皮細胞分泌介白質-8(Interleukin-8,IL-8)及轉錄因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB)，且該魚針草95%乙醇萃取物之濃度為100至400 μg/ml。

較佳的，所述之用於製造抑制巨噬細胞所引起之發炎反應之魚針草50%乙醇萃取物，可抑制細菌所引起之巨噬細胞分泌之腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及釋放一氧化碳(NO)，該濃度係為50至200 μg/ml。

較佳的，所述之用於製造抑制巨噬細胞所引起之發炎反應之魚針草95%乙醇萃取物，可抑制細菌所引起之巨噬細胞分泌之腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及釋放一氧化碳(NO)，該濃度係為50至200 μg/ml。

本發明將由下列的實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明之技藝者，可以做些許之改良與修飾，但不脫離本發明知範疇。

實施例

材料及方法

1.化學藥品與試劑

布魯氏桿菌血液培養基(Brucella blood agar plates)購自美國BD公司(Becton Dickinson Co. U.S.A)；二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國默克公司(Merck Co. U.S.A)；克拉黴素(clarithromycin,CLA)、甲硝唑(metronidazole,MTZ)、胺羥芐青黴素(amoxicillin,AMX)及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽{3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT}購自美國Sigma-Aldrich公司；脂質體轉染試劑(Lipofectamine 2000)、RPMI-1640培養液及F12培養液(cell culture media)購自美國Invitrogen公司；冷光酵素基質(luciferase substrate)購自美國Promega公司；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；NF-κB-Luc冷光報導基因(NF-κB-Luc promoter construct)來自Chih-Hsin Tang(湯智昕)博士提供。

2.植物材料

魚針草[Anisomeles indica(L.) Kuntze]全株於2005年九月採自台灣東部花蓮縣玉里鎮，與一植物學鑑定證據標本(voucher specimen)YMT-05-03寄存於台灣朝陽科技大學生物科技系的植物標本室。

3.從植物中萃取、分離與純化魚針草內酯(ovatodiolide)

取魚針草之風乾葉子(3公斤)使用回流系統以去離子水(兩次80公升，每次兩小時)萃取，經過充分的萃取過程，經減壓後收集到的萃取物會濃縮形成深棕色糖漿狀，大約為119公克，前述粗萃液接著被懸浮於去離子水中且以已烷成功地分離，經濃縮的己烷層(870毫克)利用矽膠管柱(silica gel column)進行色層分析濃縮的己烷層(870毫克)，以呈線性比例增加的極性的己烷/乙酸乙酯梯度溶液(gradient)洗提管柱，而得到5個分份[分份1至分份5(Fr1-Fr5)]分別依序為153、78.7、113、291.3及130毫克重，第四個分份4(Fr4)更進一步以半製備的反相高效能液相層析法(semi-preparative RP-HPLC)(以0.1%乙腈、三氟乙酸與水比例63:37洗提，UV光波長265 nm下偵測)分離，經鍵定確認獲得純魚針草內酯(16毫克)(Shahidul Alam et al.,2000,Fitoterapia,71: 574-576)。

4.以乙醇水溶液萃取魚針草

本發明之係以不同濃度的乙醇水溶液萃取魚針草，其中10%及20%乙醇水溶液萃取之魚針草萃取物係以熱迴流方式，以100℃連續萃取2小時，分別註記為『魚針草10%乙醇萃取物』及『魚針草20%乙醇萃取物』；其中以50%乙醇水溶液及95%乙醇水溶液萃取所得之魚針草萃取物係以溫浸方式，以50℃連續萃取2小時，分別註記為『魚針草50%乙醇萃取物』及『魚針草95%乙醇萃取物』。

5.幽門螺旋桿菌之品種與成長條件

H. pylori BCRC 17219(ATCC 700392)取自台灣新竹生物資源保存及研究中心，該幽門螺旋桿菌培養在含有10%綿羊血清之布魯氏桿菌血液培養基，並將前述培養基培養於微嗜氧系統(microaerophilic system)，內部填充氣體成分為5%氧氣，10%二氧化碳與85%氮氣(BD GasPak^TM Ez氣體生產系統)於37℃下培養48至72小時。

6.抗幽門螺旋桿菌活性

(1)抑制作用區測量(inhibitory-zone measurement)

利用紙錠瓊脂擴散法(disk agar diffusion)來量測含有魚針草內酯之萃取物之抗幽門螺旋桿菌活性。紙錠瓊脂擴散法之步驟係將每一個待測試的細菌懸浮液體積為100微升(μl)(濃度為3×10⁸菌落形成單位/毫升)均勻塗抹於胰蛋白腖大豆洋菜瓊脂培養皿上，其含有10%綿羊血清，於培養皿上製作複數個紙錠直徑為6毫米(mm)，並於其中分別注入以不同濃度之乙醇水溶液萃取魚針草所得的含有魚針草內酯之魚針草(乙醇)萃取物或魚針草內酯於井內並混合；以DMSO為負對照組，另以0.8微克/毫升(mg/ml)之MTZ、0.05 mg/ml之CLR及0.05 mg/ml之AMX為正對照組，於微嗜氧系統，內部填充氣體成分為5%氧氣，10%二氧化碳與85%氮氣，37℃下培養72小時後進行抑制作用區的直徑測量。

(2)50%抑制濃度(inhibitory concentration at 50%,IC₅₀)之測定

於測試樣本(抗菌試劑)於該培養基中可抑制50%菌落生長之濃度，被定義為『50%抑制濃度』。本實施例以不同濃度乙醇水溶液萃取魚針草所得的含有魚針草內酯之魚針草(乙醇)萃取物，對於幽門螺旋桿菌之50%抑制濃度(IC₅₀)是利用微量稀釋分析法(micro-dilution analysis)測定。將體積為40微升的幽門螺旋桿菌懸浮液(最初細菌總數為3×10⁸菌落形成單位/毫升(cfu/ml)均勻塗抹於布魯氏血液培養基上，並分別將以不同濃度之含有魚針草內酯之魚針草乙醇萃取物、作為負對照組之DMSO及作為正對照組之8.0至128.0 mg/ml的MTZ與0.008至0.128 mg/ml的CLR併入分析(co-assayed)，並培育於內部填充氣體成分為5%氧氣，10%二氧化碳與85%氮氣，37℃下培養72小時的微嗜氧系統，內部填充氣體成分為5%氧氣，10%二氧化碳與85%氮氣，37℃下培養72小時，將複數個菌落在培養皿上所形成的菌落予以計數出，並且計算出50%抑制濃度。

7.細胞培養

AGS細胞(人類胃腺癌上皮細胞，ATCC CRL 1739)係購自美國菌種中心(American Type Culture Collection,ATCC,Rockville,MD)，細胞培養於F12培養液中，並於37℃含有5%二氧化碳之培養箱培養。RAW 264.7細胞(小鼠巨噬細胞株)係購自ATCC(TIB-71)，細胞培養於含有10%胎牛血清(De-complement fetal bovine serum)之RPMI-1640培養液中(購自美國Invitrogen公司)，並於37℃含有5%二氧化碳之培養箱培養。於細菌感染實驗中，細胞培養液不添加任何抗生素。

8.細胞存活率試驗

將每孔1x10⁶之細胞培養於96孔培養盤中，分別將以不同比例之乙醇萃取之濃度為100至400 μg/ml之魚針草內酯之萃取物加入於96孔盤中，經由24及48小時培養後，將10 μl之濃度為5 mg/ml之MTT溶液加入孔盤中，並將96孔盤培養於37℃培養4小後，加入含有100 μl及0.1當量(N)鹽酸(HCl)之異丙醇(isopropanol)，再以波長570 nm測量吸光值，其吸光值與活細胞數目成正比，而推算細胞之存活率。

9.數據統計

數據係由三次不同實驗每次以三重複進行所得的平均值，以平均值±標準偏差表示。並以(*p<0.05)表示具有顯著差異。

實施例1：抑制作用區測量(inhibitory-zone measurement)

本實施例是利用如「材料及方法」中所述的紙錠瓊脂擴散法(disk agar diffusion)來評估魚針草內酯或魚針草萃取物抑制幽門螺旋桿菌生長之能力。

表1利用紙錠瓊脂擴散法評估魚針草內酯或魚針草萃取物抑制幽門螺旋桿菌生長之影響

結果顯示，有效之抑制作用區之範圍係9至23 mm，且以魚針草95%乙醇萃取物之抑制效果較其他濃度之乙醇萃取物來的優異，且比MTZ抑制效果更好。

接下來，並以AGS細胞進行MTT試驗。結果顯示，魚針草萃取物儘管加入最大濃度400 μg/ml並不影響AGS細胞生長，故選擇以魚針草50%、95%乙醇萃取物作為抑制幽門螺旋桿菌之試劑。

實施例2：魚針草萃取物之50%抑制濃度(inhibitory concentration at 50%,IC ₅₀ )的測定

本實施例是利用如「材料及方法」中「50%抑制濃度」所述的方法來評估魚針草萃取物抑制幽門螺旋桿菌生長之能力。

表2.　魚針草萃取物抑制之50%抑制濃度

如表2所示，魚針草50%乙醇萃取物，50%抑制濃度係為820 μg/ml；魚針草95%乙醇萃取物，50%抑制濃度係為390 μg/ml，由此顯示，魚針草50%及95%之乙醇萃取物皆具有抑制幽門螺旋桿菌生長之能力。

實施例3：抑制受幽門螺旋桿菌感染之AGS細胞

本實施例，如前述「材料及方法」所述，是以暫時轉染法(transiently transfection)將NF-κB-Luc冷光報導基因轉染至AGS細胞，感染幽門螺旋桿菌後，以魚針草不同濃度之乙醇萃取物及魚針草內酯處理後，藉由測量冷光酵素(Luciferase)以測量NF-κB之活性。

結果如圖1所示，以DMSO處理做為控制組，以濃度為100 μg/m及400 μg/ml之魚針草95%乙醇萃取物處理AGS細胞，並將NF-κB之活性與控制組相比，活性分別下降10%及下降48%；而濃度400 μg/ml之魚針草50%乙醇萃取物處理後，NF-κB之活性僅下降15%；若以濃度為0.005及0.02 μg/ml魚針草內酯之處理，NF-κB之活性分別下降21%及下降64%。

本實施例進一步更如前述「材料及方法」所述，藉由測量IL-8得之魚針草內酯或魚針草萃取物抑制由幽門螺旋桿菌所引起之發炎反應之能力。

結果如圖2所示，對於AGS細胞以濃度400 μg/ml之魚針草50%及95%乙醇萃取物進行前處理，其等抑制IL-8分泌之趨勢與抑制NF-κB之活性相似，0.005 μg/ml之魚針草內酯則具有超過60%的對於IL-8分泌之抑制活性。由此實施例說明，魚針草萃取物與魚針草內酯皆可抑制幽門螺旋桿菌所引起之胃上皮細胞分泌之NF-κB，進而抑制IL-8之活性。

實施例4：抑制受脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)處理後，巨噬細胞所引起之發炎反應

本實施例，如前述「材料及方法」所述，是使用魚針草萃取物及魚針草內酯對於RAW 264.7細胞(小鼠巨噬細胞)進行前處理後，加入100 ng/ml脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)處理18小時，藉以活化巨噬細胞，並藉由測量一氧化碳(NO)之生成量以評估魚針草內酯或魚針草萃取物抑制發炎反應之效果。

結果如圖3所示，濃度為5 μg/ml之魚針草內酯可抑制82% NO生成；而濃度200 μg/ml之50%及95%魚針草萃取物，可分別抑制39%及84% NO生成。

另外，本實施例以如前述「材料及方法」所述之方法，測量腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，所述的腫瘤壞死因子-α係與NO相關之發炎反應之細胞激素。本實施例主要使用魚針草萃取物及魚針草內酯對於RAW 264.7細胞進行前處理後，再加入100 ng/ml之LPS處理24小時，藉以活化巨噬細胞。

結果如圖4所示，魚針草50%及95%之乙醇萃取物，抑制TNF-α之趨勢與抑制NO相似。

圖1係魚針草以不同濃度(100、200及400 μg/ml)之乙醇萃取物及不同濃度(0.005、0.01及0.02 μg/ml)魚針草內酯抑制受幽門螺旋桿菌感染之AGS細胞，所測得NF-κB相對於控制組(DMSO)所測得之NF-κB活性之柱狀圖。

圖2係魚針草以不同濃度(100、200及400 μg/ml)之乙醇萃取物及不同濃度(0.005、0.01及0.02 μg/ml)魚針草內酯抑制受幽門螺旋桿菌感染之AGS細胞所測得IL-8相對於控制組(DMSO)所測得之IL-8活性之柱狀圖。

圖3係以不同濃度(50、100及200 μg/ml)之魚針草萃取物及不同濃度(1.25、2.5、5 μg/ml)魚針草內酯處理巨噬細胞後，再由脂多醣(LPS)感染之巨噬細胞引起之發炎反應，其相對於未以魚針草萃取物處理者所測得之NO活性之柱狀圖。

圖4係以不同濃度(50、100及200 μg/ml)之魚針草萃取物及不同濃度(1.25、2.5、5 μg/ml)魚針草內酯處理巨噬細胞後，再由脂多醣(LPS)感染之巨噬細胞引起之發炎反應，其相對於未以魚針草萃取物處理者所測得之TNF-α活性之柱狀圖。

Claims (8)

1. 一種魚針草內酯或魚針草萃取物用於製造抑制細菌引起之發炎反應之醫藥組成物的用途，其中抑制細菌引起之發炎反應包括抑制細菌所引起之發炎反應及抑制巨噬細胞(macrophage)所引起之發炎反應。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該魚針草萃取物係以濃度介於50至95%的乙醇水溶液萃取。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中細菌係幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，所述的幽門螺旋桿菌係寄存於食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，且其寄存編號為BCRC 17027(ATCC 700392)。
5. 如申請專利範圍第1至第4項任一項所述之用途，其中該魚針草萃取物係以濃度50%的乙醇水溶液萃取魚針草，取得魚針草50%萃取物，其可抑制幽門螺旋桿菌所引起之胃上皮細胞分泌之介白質-8(Interleukin-8,IL-8)及轉錄因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB)，且該魚針草50%萃取物濃度係為100至400 μg/ml。
6. 如申請專利範圍第1至第4項任一項所述之用途，其中該魚針草萃取物係以濃度95%的乙醇水溶液萃取魚針草，取得魚針草95%萃取物，其可抑制幽門螺旋桿菌所引起之胃上皮細胞分泌之介白質-8(Interleukin-8,IL-8)及轉錄因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB)，且該魚針草95%萃取物濃度係為100至400 μg/ml。
7. 如申請專利範圍第1至第4項任一項所述之用途，其中該魚針草萃取物係以濃度50%的乙醇水溶液萃取，取得魚針草50%萃取物，其可抑制細菌所引起之巨噬細胞分泌之腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及釋放一氧化碳(NO)，且該魚針草50%萃取物濃度係為50至200 μg/ml。
8. 如申請專利範圍第1至第4項任一項所述之用途，其中該魚針草萃取物係以濃度95%的乙醇水溶液萃取，取得魚針草95%萃取物，其可抑制細菌所引起之巨噬細胞分泌之腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及釋放一氧化碳(NO)，且該魚針草95%萃取物濃度係為50至200 μg/ml。