TWI749712B - 乳酸片球菌tci188及其用於口腔保健的用途 - Google Patents
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Abstract
一種乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)TCI188菌株,其寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910883)。基於此,乳酸片球菌TCI188及/或其代謝物具有抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)生長、與轉糖鏈球菌共聚合(co-aggregation)、降低轉糖鏈球菌附著於牙齒以及減少色素附著的作用。
Description
本發明有關一種乳酸片球菌,特別是關於一種乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)TCI188及其用於製備牙齒保健功能的組合物、抗汙組合物的用途。
蛀牙是琺瑯質向象牙質漸次進行的現象,牙齒表面形成小洞時,食物便會嵌入其中,成為微生物繁殖的最佳場所,造成口臭、牙菌斑孳生、牙齦發炎等口腔疾病。
造成蛀牙的原因,是食物殘渣留於口中,細菌以食物殘渣作為營養的來源,不斷繁殖增長,同時製造出一種酸性物質,酸性物質侵害牙齒表層的組織,導致礦物質流失。於現代的飲食中,甜點、飲料受大眾的歡迎,當口腔持續浸在高糖分的環境中,細菌更容易分解食物中的糖分作為營養的來源。
目前用於治療或預防蛀牙的方式例如:施予避免細菌附著至牙齒抗附著劑、使用抗菌劑或是氟化物。然而前述方式效果有限或有副作用,因此開發出以天然方法改善口腔健康,更有益於全民健康福祉。
在一些實施例中,一種乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)TCI188菌株,其寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910883)。
在一些實施例中,乳酸片球菌TCI188用於製備具牙齒保健功能的組合物的用途,其中乳酸片球菌TCI188寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910883)。
在一些實施例中,乳酸片球菌TCI188用於製備抗汙組合物的用途,其中乳酸片球菌TCI188寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910883)。
綜上所述,在一些實施例的乳酸片球菌TCI188用以抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)生長、與轉糖鏈球菌產生共聚合(co-aggregation)故能降低轉糖鏈球菌附著於牙齒,因此其用途可為用於製備具牙齒保健功能的組合物。在一些實施例的乳酸片球菌TCI188用以減少色素附著,因此其用途可為用於製備抗汙組合物。
A,B,C:試管
[圖1]顯示乳酸片球菌TCI188對轉糖鏈球菌的抑制效果。
[圖2]顯示乳酸片球菌TCI188能與轉糖鏈球菌產生共聚合。
[圖3A]為步驟C-4控制組的照片。
[圖3B]為牙齒色卡的色階7至色階11的牙齒顏色示意圖。
[圖3C]為步驟C-4實驗組的照片。
[圖3D]為牙齒色卡的色階4至色階8的牙齒顏色示意圖。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下,本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐,不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
關於本文中所使用之濃度符號「wt%」通常是指重量百分濃度,而濃度符號「vol%」通常是指體積百分濃度。
本文中所使用數值為近似值,所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內,最佳為在正負5%的範圍內。
乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)TCI188菌株是篩選自菜脯,即醃製過的蘿蔔乾,醃製的方式可以是但不限於以辣椒醬、豆瓣醬、麻油或是鹽巴等調味料的至少其中一種進行醃製。乳酸片球菌TCI188已寄存編號BCRC 910883寄存於財團法人食品工業發展研究所。
乳酸片球菌TCI188是革蘭氏陽性球菌,較佳的生長溫度為35℃至37℃。並且,可於酸鹼值(pH值)為2至7的環境下生存。因此,可生存於人體的消化道中,例如生存於口腔或是腸胃。
在一些實施例中,乳酸片球菌TCI188包含如SEQ ID NO:1所示之序列。
在一些實施例中,乳酸片球菌TCI188具有抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)生長的作用。
在一些實施例中,乳酸片球菌TCI188具有與轉糖鏈球菌共聚合(co-aggregation)的作用。
在一些實施例中,乳酸片球菌TCI188具有降低轉糖鏈球菌附著於牙齒的作用。
因此,在一些實施例中,乳酸片球菌TCI188的用途能用於製備具牙齒保健功能的組合物。
在一些實施例中,乳酸片球菌TCI188具有減少色素附著的作用。
因此,在一些實施例,乳酸片球菌TCI188的用途能用於製備抗汙組合物。
在一些實施例中,前述的組合物可為醫藥組合物、保養品組合物或食品組合物。
在一些實施例中,醫藥組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如,醫藥上可接受的載劑可包含下列一種或多種載劑:乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些載劑的選用與數量是熟習此項技術人員可視情況進行選擇的。
在一些實施例中,醫藥上可接受的載劑可進一步包含下列任一種溶劑:水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing
alcohol)以及其他任何合適的溶劑。
在一些實施例中,醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道地(enterally)、非經腸道地(parenterally)、口服地、或局部地(topically)投藥的劑型。醫藥組合物的劑型例如可為或局部地(topically)投藥的劑型。
在一些實施例中,經腸道或口服的投藥劑型可為,但不限於,錠劑(tablet)、片劑(troche)、***錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)或類似之物。
舉例來說,當組合物的劑型為膠囊狀時,組合物的劑量為5x107菌落形成單位/膠囊(CFU/cap)的該乳酸片球菌TCI188。
其中,前述的保養品組合物包含的乳酸片球菌TCI188。
在一些實施例中,保養品組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如,可接受的佐劑可包含下列一種或多種佐劑:溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。可根據實際需求對這些試劑的選用與數量進行合適的調整。保養品組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口腔使用的型態,例如漱口水、牙膏、噴霧或貼片等。
其中,前述的食品組合物包含乳酸片球菌TCI188。
在一些實施例中,食品組合物可以口服方式施予個體。其中,食品組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。個體可為人。
在一些實施例中,食品組合物可為食品產品或食品添加物(food additive)。在一些實施例中,食品產品可為但不限於:飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
例一:菌種篩選及鑑定
從醃製菜脯容器中取適量醃製液塗抹於培養基(BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth,DF0881-17-5)上塗盤並於28℃下培養至單一菌落形成。挑起多個單一菌落後,以16s核糖基因(16SrDNA)進行菌種鑑定,利用美國國家生物技術資訊中心(NCBI)網站進行菌種鑑定。根據物種鑑定結果,篩選出6種乳酸菌,菌種名稱與菌種鑑定結果顯示如下表一:
其中,將分離自菜脯且與其他乳酸片球菌亞種之16S核醣體基因(16SrDNA)或染色完整基因進行序列比對後可知此分離菌株的序列與其他乳酸片球菌亞種的相似性達97.92%的單一菌落,命名為乳酸片球菌TCI 188(後文以TCI 188表示)。並且,將乳酸片球菌TCI 188以寄
存編號BCRC 910883寄存於財團法人食品工業發展研究所。
其中,將分離自人體腸道且與其他乳酸乳球菌亞種之16S核醣體基因(16SrDNA)進行序列比對後可知此分離菌株的16SrDNA序列與其他乳酸乳球菌亞種的相似性達95.64%至96.28%的單一菌落,命名為乳酸乳球菌L414(後文以L414表示)。
其中,將分離自梨子且與其他嗜熱鏈球菌亞種之16S核醣體基因(16SrDNA)進行序列比對後可知此分離菌株的16SrDNA序列與其他嗜熱鏈球菌亞種的相似性達95.29%至96.28%的單一菌落,命名為嗜熱鏈球菌L537(後文以L537表示)。
其中,將分離自泡菜且與其他短乳酸菌亞種之16S核醣體基因(16SrDNA)進行序列比對後可知此分離菌株的16SrDNA序列與其他短乳酸菌亞種的相似性達97.62%至98.13%的單一菌落,命名為短乳酸菌L816(後文以L816表示)。
其中,將分離自書(紙張)且與其他凝結芽孢桿菌亞種之16S核醣體基因(16SrDNA)或染色完整基因進行序列比對後可知此分離菌株的16SrDNA序列與其他凝結芽孢桿菌亞種的相似性達97.46%至97.55%的單一菌落,命名為凝結芽孢桿菌L179(後文以L179表示)。
其中,將分離自薑黃且與其他乳酸乳球菌亞種之16S核醣體基因(16SrDNA)進行序列比對後可知此分離菌株的16SrDNA序列與其他乳酸乳球菌亞種的相似性達96.29%至96.43%的單一菌落,命名為乳酸乳球菌L820(後文以L820表示)。
例二:轉糖鏈球菌生長抑制
在此,測試表一的六種菌株抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)生長的效果。
實驗步驟:
步驟A-1:自前述表一的六種菌株(TCI 188、L414、L537、L816、L179以及L820)的凍管,以相對培養基濃度10vol%的植菌量接種於MRS培養基(購自BD Pharminge公司),並於37℃培養16小時。
步驟A-2:取轉糖鏈球菌凍管(購自食品工業研究所,寄存編號BCRC10793),以相對培養基濃度10vol%的植菌量接種於添加5vol%綿羊血(購自BD Pharminge公司)的BHI(brain heart infusion)培養基(購自BD Pharminge公司),並於37℃培養48小時。
步驟A-3:將經過步驟A-2得到的活化轉糖鏈球菌塗佈於包含5vol%綿羊血(購自BD Pharminge公司)的胰蛋白酶大豆瓊脂培養基(Trypticase Soy Agar II)(購自BD Pharminge公司)。接著,於胰蛋白酶大豆瓊脂培養基表面挖出數個孔洞。
步驟A-4:將經過步驟A-1得到的六種活化菌株(TCI 188、L414、L537、L816、L179以及L820),其10ml菌液(OD值為10)分別以5000rpm離心15分鐘。接著將六種菌株經離心的上清液50ul,分別填充於步驟A-3得胰蛋白酶大豆瓊脂培養基的孔洞中。意即,不同的孔洞填充不同菌株的上清液。
步驟A-5:接著,於37℃培養48小時。
步驟A-6:觀察步驟A-4各個孔洞周圍的抑菌圈並測量其直徑。
實驗結果:
請參照圖1所示,填充TCI188的孔洞周圍的抑菌圈直徑最大,顯示相較於其他五種菌株,乳酸片球菌TCI188抑制轉糖鏈球菌的效果最好。如此,乳酸片球菌具有較佳的抑制轉糖鏈球菌生長的功能,故其可用於製備具牙齒保健功能的組合物。
例三:與轉糖鏈球菌共聚合(co-aggregation)實驗
在此,測試乳酸片球菌TCI 188是否與轉糖鏈球菌產生共聚合現象。
實驗步驟:
步驟B-1:將經過以步驟A-1方式活化的乳酸片球菌TCI 188的菌液與經過以步驟A-2方式活化的轉糖鏈球菌的菌液各1ml,分別以5000rpm離心15分鐘,形成上清液及沉澱物,並去除上清液,得到乳酸片球菌TCI 188沉澱物及轉糖鏈球菌沉澱物。
步驟B-2:將步驟B-1得到的乳酸片球菌TCI 188沉澱物及轉糖鏈球菌沉澱物,各自沉澱物以5mL的磷酸鹽緩衝液(PBS)重新回溶,再以5000rpm離心15分鐘,並去除再次形成上清液,再次取得乳酸片球菌TCI 188沉澱物及轉糖鏈球菌沉澱物。將步驟B-2重複兩次(執行步驟B-2兩次)。其中磷酸鹽緩衝液是以2.59g/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)(購自Sigma-Aldrich公司,型號:60220-M)以及21.7g/L磷酸二氫納(NaHPO4)(購自Sigma-Aldrich,型號:S5136)配置而成。
步驟B-3:將執行兩次步驟B-2所得到的乳酸片球菌TCI 188沉澱物及轉糖鏈球菌沉澱物各自以磷酸鹽緩衝液(PBS)回溶至以分光光
度計(廠牌:Thermo Fisher)測量時OD600值為1,得到乳酸片球菌TCI 188樣品與轉糖鏈球菌樣品。
步驟B-4:將乳酸片球菌TCI 188樣品與轉糖鏈球菌樣品各取1ml經由漩渦(vortex)混合得到混合溶液,觀察是否有沉積物產生,並以儀器測量混合溶液的OD600吸光值。
實驗結果:
請參照圖2所示,在此,試管A為步驟B-3所得到的乳酸片球菌TCI 188樣品、試管B為步驟B-4得到的混合溶液、試管C為步驟B-3所得到的樣品。由圖2可見,試管B具有沉澱物,並且試管B的吸光值為OD600值為0.459,而試管A和試管C的OD600值為1,可知乳酸片球菌TCI 188與轉糖鏈球菌產生共聚合。共聚合效應使轉糖鏈球菌被乳酸片球菌TCI 188包覆,使得轉糖鏈球菌與牙齒表面或牙齦的接觸面積降低而不易附著或是定殖於牙齒表面或牙齦,故其用途可為用於製備具牙齒保健功能的組合物。
例四:色素附著實驗
在此,測試乳酸片球菌TCI 188是否可以降低色素附著於物體表面。
實驗步驟:
步驟C-1:分成實驗組與控制組。實驗組:先將蛋洗淨,接著塗抹500mg(濕重)以步驟B-1方式取得的乳酸片球菌TCI 188沉澱物於蛋殼表面。控制組:不做任何的動作。其中,蛋為重量約為60g的白殼蛋。
步驟C-2:將步驟C-1的實驗組與控制組於室溫(25℃)中靜置10分鐘。
步驟C-3:將步驟C-2的實驗組與控制組浸泡於咖啡中10分鐘。
步驟C-4:對實驗組與控制組拍照做紀錄。
實驗結果:
請參閱圖3A、3B、3C及3D所示,圖3A為步驟C-4控制組的照片,圖3B為牙齒色卡的色階7至色階11的牙齒顏色示意圖。圖3C為步驟C-4實驗組的照片,圖3D為牙齒色卡的色階4至色階8的牙齒顏色示意圖。由圖3A及3B可見,控制組蛋殼的顏色範圍介於牙齒色卡的色階7至色階11之間。由圖3C及3D可見,實驗組蛋殼的顏色範圍介於牙齒色卡的色階4至色階8之間,換言之實驗組蛋殼的顏色較控制組蛋殼的顏色淺。乳酸片球菌TCI 188產生的代謝物於齒面形成保護膜而隔絕與色素的接觸,也就是說,透過塗抹乳酸片球菌TCI 188的沉澱物於物體表面可以減少色素附著,因此其用途可為用於製備抗汙組合物。
綜上所述,在一些實施例的乳酸片球菌TCI188用以抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)生長、與轉糖鏈球菌產生共聚合(co-aggregation)故能降低轉糖鏈球菌附著於牙齒,因此乳酸片球菌TCI188用途可為用於製備具牙齒保健功能的組合物。在一些實施例的乳酸片球菌TCI188用以減少色素附著,因此其用途可為用於製備抗汙組合物。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所2019/04/15 BCRC 910883。
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<213> Lactococcus lactis
Claims (12)
- 一種乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)TCI188菌株,其寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910883)。
- 如請求項1所述的TCI188菌株,包含如SEQ ID NO:1所示之序列。
- 如請求項1所述的TCI188菌株,其具有抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)生長的作用。
- 如請求項1所述的TCI188菌株,其具有與轉糖鏈球菌共聚合(co-aggregation)的作用。
- 如請求項4所述的TCI188菌株,其具有降低轉糖鏈球菌附著於牙齒的作用。
- 如請求項1所述的TCI188菌株,其具有減少色素附著的作用。
- 一種乳酸片球菌TCI188用於製備具牙齒保健功能的組合物的用途,其中乳酸片球菌TCI188寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910883)。
- 如請求項7所述之用途,其中該乳酸片球菌TCI188用以抑制轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)生長。
- 如請求項7所述之用途,其中該乳酸片球菌TCI188用以與轉糖鏈球菌產生共聚合(co-aggregation)。
- 如請求項7所述之用途,其中該乳酸片球菌TCI188用以降低轉糖鏈球菌附著於牙齒。
- 一種乳酸片球菌TCI188用於製備抗汙組合物的用途,其中乳酸片球菌TCI188寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910883)。
- 如請求項11所述之用途,其中該乳酸片球菌TCI188用以減少色素附著。
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