KR20190122186A - 신규한 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주 및 이를 포함하는 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

신규한 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주 및 이를 포함하는 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR20190122186A
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lactobacillus plantarum
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KR1020190130165A
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백현동
이은정
손성호
이나경
임성일
이소영
김효진
김혜련
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건국대학교 산학협력단
한국식품연구원
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Abstract

본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 프로바이오틱스인 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주 및 이의 용도를 제공하는 것이며, 보다 상세하게는 상기 균주의 항비만 용도를 제공한다. 된장, 고추장 및 간장과 같은 전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주를 생균제로서 사용할 수 있으며, 지방세포에서 지방의 축적을 억제할 수 있고, 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델에 투여하였을 때 유의적인 체지방 감소 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 비만의 예방, 치료 및 개선을 위한 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주 및 이를 포함하는 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Novel Lactobacillus plantarum Ln4 strain and compositions for the prevention and treatment of obesity containing the same}
본 발명은 전통발효식품으로부터 분리된 프로바이오틱스인 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주 및 이의 용도를 제공하는 것이며, 보다 상세하게는 상기 균주의 항비만 용도를 제공한다.
비만은 주요 성인병들의 위험요소(risk factor)로서, 고혈압, 당뇨병, 동맥경화증, 뇌졸증, 심장마비 및 각종 종양 등과 같은 성인병의 발생에 관여하고(Wilson et al., 2005, Circulation 112: 3066-3072), 병의 진행을 촉진시키기도 하는데, 비만으로 인해 성인병에 걸릴 위험은 정상인보다 3∼6배 높다고 알려져 있다. 따라서, 비만은 단순히 외모상의 문제만이 아니라, 건강에 직결되는 중대한 문제가 아닐 수 없다. 이러한 비만의 예방은 현 상태의 식사량은 유지하면서 운동량을 늘리는 것이 중요하며, 비만이 되었을 경우에는 원인을 파악하고 거기에 맞는 적절한 식이요법을 통하여 적정 체중을 유지하면서, 신체가 정상적인 신진대사를 할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
한편, 김치, 된장, 청국장 등의 다양한 한국 전통발효식품들에는 프로바이오틱스로 가능성이 있는 유산균들이 많이 존재하고 있으며, 전통발효식품에서 분리한 유산균을 이용하는 연구도 많이 진행되고 있다. 또한 프로바이오틱스를 이용한 제품들이 다양하게 출시되고 있다. 프로바이오틱스(probiotics)란 살아있는 상태로 체내에 들어가서 면역 및 다양한 기능성을 주어 건강에 도움을 주는 유익한 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균들이지만 바실러스 속(Bacillus spp.) 또는 효모 등도 포함하고 있다. 프로바이오틱스 균주로서 인정을 받기 위해서는 위산 및 담즙산에서 생존하여 소장까지 도달하여야 한다. 또한 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 면역 및 다양한 기능성을 나타내야 하며 안전성이 입증되어야 한다.
현재까지 연구된 바에 따르면, 장류 또는 김치와 같은 발효식품으로부터 분리된 유산균을 프로바이오틱스로 사용할 수 있으며, 이들의 다양한 생리적 기능을 통해 약학적 치료 용도로서 적용할 수 있음이 공지된 바 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제 10-161653호에서는 가자미식혜로부터 분리된 신규한 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) KR-W.W-2 균주를 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 양식 어류의 병원균에 의해 생기는 질병의 치료에 사용할 수 있음을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 10-2015-0106093호에서는 장류로부터 분리된 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) C14 균주를 프로바이오틱스 제제로서 사용하여 항균용 조성물로서 사용할 수 있음을 개시하고 있다. 이 외에도 다양한 유산균을 유용 용도로서 사용하기 위한 연구가 계속되고 있다.
이에, 본 발명자들은 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 사용할 수 있는 유산균을 분리하고 이의 용도를 찾기 위해 노력한 결과, 된장, 고추장 및 간장과 같은 전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주를 생균제로서 사용할 수 있으며, 상기 균주는 지방세포에서 지방의 축적을 억제할 수 있고, 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델에 투여하였을 때 유의적인 체지방 감소 효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주를 생균제로서 사용할 수 있으며, 이를 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델에 투여하였을 때 유의적인 항비만 효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 신규한 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 균주를 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또다른 목적은 상기 균주의 약학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 균주는 내산성, 내담즙성, 장부착능 및 항생제 내성을 가지는 것을 특징한다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주는 지방축적 억제 및 체지방 감소 효과를 나타내는 것일 수 있다.
된장, 고추장 및 간장과 같은 전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주를 생균제로서 사용할 수 있으며, 이는 지방세포에서 지방의 축적을 억제할 수 있고, 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델에 투여하였을 때 유의적인 체지방 감소 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 비만의 예방, 치료 및 개선을 위한 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다.
도 1은 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주의 계통도이다.
도 2는 지방세포 내에서 락토바실러스 플란타룸 Ln4 처리에 따른 지방축적 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 고지방식이에 의한 비만 및 대사성질환 유도 동물 모델에서 락토바실러스 플란타룸 Ln4 투여에 따른 체중 조절 효과를 나타낸다.
도 4는 고지방식이에 의한 비만 및 대사성질환 유도 동물 모델에서 락토바실러스 플란타룸 Ln4 투여에 따른 체지방 감소 효능을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주”는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주”는 내산성, 내담즙성, 장부착능 및 항생제 내성을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 내산성은 pH 2 내지 3의 배지에서도 3 내지 5 시간 동안 99% 이상의 생존률을 나타낼 수 있음을 나타내며, 상기 내담즙성은 인간의 담즙과 유사한 환경에서 24 시간 동안 80% 이상의 생존률을 나타낼 수 있음이 바람직하다. 또한, 상기 장부착능을 대장 세포와 유의적인 수준으로 결합할 수 있는 능력을 나타낸다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 프로바이오틱스 제제로 사용하기 위해, 체내 경구투여시에도 균주의 생존능이 유지되는 것을 통해 효과가 저하 또는 증진될 수 있으므로, 소화기관에서의 환경에서 생존할 수 있도록 내산성, 내담즙성 및 장부착능을 가지는 것에서 유의적인 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 상기 항생제 내성은 제타마이신, 시프로플록사신, 가나마이신 및 스트렙토마이신에 대해서 내성을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로 사용할 수 있는 유산균을 분리하여, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성된 16S rRNA를 포함하는 신규 균주를 분리하였으며, 이의 상동성 분석을 통해 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 신규한 균주임을 확인하였고(도 1), 이를 2016년 09월 22일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하였다(기탁번호 KCCM 11897P).
또한, 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 특징을 확인한 결과, 락토바실러스 플란타룸 Ln4은 내산성, 내담즙성, 장 부착능 및 일부 항생제에 대한 내성을 나타내는 것을 확인하였고, 이에 비해 발암의 원인이 되는 효소를 생산하지 않고 정상 세포에 대하여 독성 역시 나타내지 않음을 확인하여(표 1 내지 표 5), 이러한 특징을 통해 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 생균체 또는 사멸체의 형태로 프로바이오틱스 제제에 사용할 수 있을 것으로 확인하였다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주는 신규한 균주로서 정상 세포에 대하여 안전하고 내산성, 내담즙성 및 장 부착능의 특징을 가지고 있으므로, 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 프로바이오틱스 제제의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주”는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주”는 내산성, 내담즙성, 장부착능 및 항생제 내성을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주”는 지방축적억제 및 체지방 감소 효과를 나타내는 것을 통해 비만에 대하여 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주의 항비만 효과를 확인하기 위해, 고지방식이를 통해 대사성증후군이 유발된 마우스 모델을 제작하였다. 상기 마우스 모델에 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 투여하였을 때 지방세포 내에서 지방의 축적이 억제되었으며, 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델에 투여하였을 때 유의적인 체지방 감소 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 2 내지 도 4).
따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 생균체로서 투여하였을 때 지방 세포에서 지방의 축적을 억제할 수 있고, 체지방 감소 효과를 나타내어 유의적인 항비만 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
본 발명의 미생물 제제는 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 트레할로스(Trehalose), 옥수수 전분(cornstarch), 콩기름(soybean oil), 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesiumstearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP: polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starchglycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone)중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulose sodium), 베타-싸이크로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methlparaben), 파라옥시안식향산프로필(propyl p-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.
아울러, 본 발명은 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주”는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주”는 내산성, 내담즙성, 장부착능 및 항생제 내성을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주”는 지방축적억제 및 체지방 감소 효과를 나타내는 것을 통해 비만에 대하여 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 생균체로서 투여하였을 때 지방세포에서 지방의 축적을 억제할 수 있고, 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델에 투여하였을 때 유의적인 체지방 감소 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 비만의 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주와 비만의 예방 및 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ～ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ～ 0.03 g 이다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주은 비만의 예방 및 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 비만의 예방 및 개선의 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주과 함께 비만의 예방 및 개선용 조성물에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
전통발효식품으로부터 유용 프로바이오틱스 균주의 분리 및 확보
<1-1> 전통발효식품 유래 미생물의 순수 분리
본 발명의 실시예를 수행하기 위해서, 전통발효식품으로부터 미생물을 순수 분리하였다.
구체적으로, 재래시장에서 구입한 된장, 간장 및 고추장의 장류를 구입하여, 이를 증류수에 10-1 내지 10-7의 비율로 단계 희석하여 발효식품 시료를 준비하였다. 그런 다음, 상기 발효식품 시료를 유산균 선택 배지인 락토바실러스 MRS 배지(lactobacilli MRS), 페닐에틸 알콜 배지(phenylethyl alcohol) 및 락토바실러스 선택 한천배지(lactobacillus selective agar)에 도말하였다. 도말한 배지는 37℃에서 정치 배양하여, 생성된 콜로니를 수득하고 형태를 관찰하여, 새로운 배지에 도말하고 미생물을 순수 분리하였다.
<1-2> 분리된 유산균의 동정
유산균 선택 배지를 통해서 순수 분리한 미생물이 어떠한 균주인지 확인하기 위해서, 분리한 미생물을 동정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 분리한 균주에서 유전체 DNA를 추출하고, 염기서열을 분석하여(Bionics 사, 한국에 의뢰) 16S rRNA의 유전자 염기서열을 확보하였다. 상기 16S rRNA의 염기서열은 BLAST 프로그램을 이용하여 데이터베이스에 등록된 다른 표준 균주와 상동성을 분석하고, 98% 이상의 상동성을 나타내는 균주로 동정하였다. 또한 클러스탈 X, 메가 7 프로그램(Clustal X, Mega 7 program)을 사용하여 상동성을 분석하고 계통도를 구축하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 전통발효식품으로부터 분리된 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 보고된 균주들과 상동성을 나타내는 것으로 락토바실러스 플란타룸 Ln4(Lactobacillus plantarum Ln4)로 명명하여, 2016년 09월 22일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하였다(기탁번호 KCCM 11897P).
락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주의 특징 확인
<2-1> 락토바실러스 플라타룸 Ln4의 내산성 및 내담즙성 확인
전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 특징을 확인하기 위하여, 내산성 및 내담즙성을 확인하였다.
구체적으로, 먼저 내산성을 확인하기 위해서 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 0.3% 펩신(pepsin) 수용액의 인공 위액 배지(pH 2.5)에 접종하여 3 시간 동안 정치배양하였다. 배양 후, 균을 수득하여 평판배지에 도말하고 37℃에서 48 시간동안 배양한 다음, 생성된 콜로니 수를 계수하여 생존 균수를 측정하여 용매 대조군의 생존 균수에 대한 상대적인 생존 균수를 확인하였다.
또한, 내담즙성을 확인하기 위해서 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 0.3% 옥스갈(oxgall)의 배지에 접종하여 24 시간 동안 정치배양하였다. 배양 후, 균을 수득하여 동일한 방법으로 상대적인 생존 균수를 확인하였다.
그 결과, 하기 [표 1]에서 나타난 바와 같이 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주는 인공 위액 배지에서도 3 시간 동안 99% 이상의 생존률을 유지하였기 때문에 우수한 내산성을 나타내는 것으로 확인하였다(표 1). 또한, 내담즙성에 대해서도 24 시간 동안 80% 이상의 균수를 유지하여, 우수한 내담즙성을 나타내는 것으로 확인하였다(표 1).
락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주의 내산성 및 내담즙성의 확인
균주명 내산성(%) 내담즙성(%)
락토바실러스 플란타룸 Ln4 균 99.25 84.20
<2-2> 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 효소 생산능 확인
전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 특징을 확인하기 위하여, 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주가 발암의 원인이 되는 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 등 다양한 효소를 생산할 수 있는지의 여부를 확인하였다.
구체적으로, 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 대수 증식기까지 배양한 다음, 10,000×g에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액의 배지를 제거하였다. 배지를 제거한 후 수득한 균주를 PBS 완충용액으로 세척(washig)한 후, API ZYM 키트의 기질을 세척한 균주와 혼합하여 4 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 키트의 용액 A 및 B를 각각 첨가하고 높은 광원에서 5 분간 반응시킨 후, 발색 정도에 따라 효소 생산 여부를 확인하였다.
그 결과, 하기 [표 2]에 나타난 바와 같이 락토바실러스 플란타룸 Ln4은 발암의 원인이 되는 β-글루쿠로니다제를 생산하지 않는 것을 확인하였다(표 2).
락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주의 효소 생산능 확인
Enzyme Enzyme activity (nmole)
Lactobacillus plantarum Ln4
Control 0
Alkaline phosphatase 0
Esterase 0
Esterase lipase 0
Lipase 0
Leucine arylamidase 2
Valine arylamidase 1
Cystine arylamidase 0
Trypsin 0
α-Chymotrypsin 0
Acid phosphatase 1
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase 1
α-Galactosidase 0
β-Galactosidase 4
β-Glucuronidase 0
α-Glucosidase 0
β-Glucosidase 3
N-Acetyl-β-glucosaminidase 0
α-Mannosidase 0
α-Fucosidase 0
(상기 표에서 0은 0 내지 5 nmol의 효소를 생산하는 것을 나타내고; 1은 5 내지 10 nmol의 효소를 생산하는 것을 나타내며; 2은 10 내지 20 nmol의 효소를 생산하는 것을 나타내고; 3은 20 내지 30 nmol의 효소를 생산하는 것을 나타내며; 4는 30 내지 40 nmol의 효소를 생산하는 것을 나타내고; 및 5는 40 nmol 이상의 효소를 생산하는 것을 나타낸다.)
<2-3> 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 세포 독성 확인
전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 특징을 확인하기 위하여, 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주의 세포 독성을 확인하였다.
구체적으로, 정상세포인 MRC-5 세포를 96웰 플레이트에 접종한 다음, 24 시간 동안 배양하여 MRC-5 세포를 2×105 세포/㎖ 농도로 준비하였다. 그리고 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 대수 증식기까지 배양한 다음, 10,000×g에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액의 배지를 제거하였다. 배지를 제거한 후 수득한 균주를 PBS 완충용액으로 세척한 후, 상기 준비한 MRC-5 배양 플레이트에 수득한 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 접종하여 44 시간 동안 배양하였다. 배양 후, PBS 완충용액으로 3 번 반복 세척한 다음, MTT 시약 50 ㎕를 처리하여 4 시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후에는 DMSO 50 ㎕를 처리하여 570 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 발색 정도에 따라 사멸한 MRC-5 세포 수준을 통해 세포 독성을 확인하였다.
그 결과 하기 [표 3]에서 나타난 바와 같이 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주는 정상 세포와 함께 배양한 후에도 MRC-5 세포의 사멸을 유도하지 않는 것을 확인하여, 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주가 정상 세포에 대하여 세포 독성을 가지지 않는 것을 확인하였다(표 3).
락토바실러스 플란타룸 Ln4의 세포 독성 확인
Microorganisms Cytotoxicity ( % )
Lactobacillus plantarum Ln4 3.91±1.10
<2-4> 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 장 부착능 확인
전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 특징을 확인하기 위하여, 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주의 장 부착능을 확인하였다.
구체적으로, 대장암 세포인 HT-29 세포를 96웰 플레이트에 접종한 다음, 24 시간 동안 배양하여 MRC-5 세포를 1×105 세포/㎖ 농도로 준비하였다. 그리고 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 대수 증식기까지 배양한 다음, 10,000×g에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액의 배지를 제거하였다. 배지를 제거한 후 수득한 균주를 PBS 완충용액으로 세척한 후, 상기 준비한 HT-29 배양 플레이트에 수득한 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 접종하여 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후, PBS 완충용액으로 3 번 반복 세척한 다음, 트리톤-X100 1 ㎖을 가하여 10 분 동안 처리하고 원심분리하고, 상등액을 수득하고 lactobacilli MRS 한천 배지에 도말하고 37℃에서 48 시간 동안 배양한 다음 생성된 콜로니 수를 확인하여, 대장암세포주에 부착한 균수와 배지에 남은 균수(생성된 콜로니 수)를 비교하여 장부착능을 확인하였다.
그 결과, 하기 [표 4]에서 나타난 바와 같이 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주가 대장암세포에 대하여 높은 장 부착능을 가지는 것을 확인하였다(표 4).
락토바실러스 플란타룸 Ln4의 장 부착능 확인
Microorganisms Adhesion ability( % )
Lactobacillus plantarum Ln4 7.64±3.25
<2-5> 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 항생제 내성 확인
전통발효식품으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 특징을 확인하기 위하여, 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주가 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012) 기준에 사용되는 항생제에 대하여 내성을 나타내는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주를 대수 증식기까지 배양한 다음, 10,000×g에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액의 배지를 제거하였다. 배지를 제거한 후 수득한 균주를 PBS 완충용액으로 세척한 후, 105 CFU/㎖ 농도로 희석하여 lactobacilli MRS 한천 배지에 도말하여 배지 표면을 락토바실러스 플란타룸 Ln4로 포화될 때까지 배양하였다. 그런 다음, 멸균한 종이 디스크(paper disc)를 50 ㎕ 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(Tetracycline), 제타마이신(Gentamycin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 가나마이신(Kanamycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 스트렙토마이신(Streptomycin) 또는 독소시클린(Doxycycline)에 각각 적시고, 이를 상기 배양한 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주 배지 표면에 올려놓았다. 그리고 37℃에서 24 시간 동안 배양하여 생성된 생육저지환(inhibition zone)의 크기에 따라 항생제 저항성 정도를 판별하였다.
그 결과, 하기 [표 5]에 나타난 바와 같이 락토바실러스 플란타룸 Ln4은 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜 및 독소시클린에 대하여 민감하고, 제타마이신, 시프로플록사신, 가나마이신 및 스트렙토마이신에 대하여 내성을 나타내는 것을 확인하였다(표 5).
락토바실러스 플란타룸 Ln4의 항생제 내성 확인
Antibiotics Lactobacillus plantarum Ln4 Antibiotics Lactobacillus plantarum Ln4
Ampicillin S Tetracycline S
Gentamycin R Ciprofloxacin R
Kanamycin R Chloramphenicol S
Streptomycin R Doxycycline S
(상기 표에서, R는 항생제 내성(resistant)를 나타내고, S는 항생제 민감성(sensitive)을 나타낸다.)
락토바실러스 플란타룸 Ln4의 생균체 및 사균체의 제조
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 약학적 효능을 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 확인하기 위해, 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 생균체와 사균체를 제조하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 분리 동정한 락토바실러스 플란타룸 Ln4을 lactobacilli MRS 액체 배지에 접종하고 37℃에서 18 시간 동안 배양한 다음, 5,000×g에서 10 분 동안 원심분리하여 균체의 침전물과 배양액의 상등액으로 분리하였다. 그런 다음, 분리한 침전물을 동결건조하여 이를 생균체로서 수득하였고, 생균체를 121℃에서 5 분 동안 열처리하여 사균체를 제조 및 수득하였다.
락토바실러스 플란타룸 Ln4의 항비만 효과 확인
<4-1> 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 지방축적 억제능 확인
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4가 시험관 내(In vitro) 수준에서 항비만 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하고자, 지방 세포에서의 지방 축적 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 지방 전구세포주인 3T3-L1 세포를 DMEM 배지에 접종한 후, 플레이트에서 포화도가 100%가 될 때까지 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 플레이트가 세포가 가득 차도록 자라면, 5 ㎍/㎖ 인슐린, 115 ㎍/㎖ IBMX 및 10μM 덱사메타손(dexamethasone)을 포함하는 10% FBS/DMEM 분화용 배지를 세포 배지로서 교환하고, 2 일 동안 추가 배양하였다. 이 때, 상기 분화용 배지에는 상기 <실시예 3>에서 제조한 락토바실러스 플란타룸 Ln4 사균체 100 ㎍/㎖를 추가하였다. 2 일 간의 배양이 끝나면, 락토바실러스 플란타룸 Ln4 사균체 100 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖ 인슐린을 포함하는 10% FBS/DMEM 배지로 교환하여 4 내지 6 일간 추가 배양하여, 지방전구세포로부터 분화된 지방세포를 수득하였다. 수득한 지방세포는 10% 포르말린 수용액을 가해 고정시키고, Oil Red O 용액을 처리하여 약 15 분 내지 2 시간 동안 반응하여 세포 내 축적된 지방을 염색하였다. 염색 완료 후, 현미경으로 관찰한 다음 이소프로필 알콜로 Oil Red O 용액을 다시 녹여 518 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는, 분화시키지 않은 미분화 세포 대조군(ND, non-differentiated) 및 사균체를 첨가하지 않은 배지에서 분화시킨 분화 세포 대조군(D, differentiated)을 사용하였으며, ND 대조군에 대비하여 D 대조군 및 실험군의 흡광도 수준의 증가 정도를 하기 [수학식 1]을 사용해 계산하였다.
[수학식 1]
Figure pat00001
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 분화 세포 대조군(D)와 비교하였을 때, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 Ln4 처리 실험군에서 지방 축적 수준이 감소된 것을 확인하였으며, 현미경 관찰을 통해서도 적색으로 염색된 지방구의 수 및 크기가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2).
<4-2> 고지방식이에 의한 당뇨 유도 동물 모델의 제조
락토바실러스 플란타룸 Ln4가 대사성질환이 유도된 동물모델에서 유의적인 항비만 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 대상 실험 동물인 당뇨 유도 마우스 모델을 제작하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 제조한 락토바실러스 플란타룸 Ln4 생균체를 증류수에 2.5×109 CFU/㎖ 농도로 현탁하여 균주 시료를 준비하였다. 그런 다음, 6 주령의 C57/BL6 마우스에 고지방 사료를 자유 급여하면서 상기 준비한 균주 시료를 매일 0.2 ㎖씩 경구투여하여 매일 5×108 CFU를 투여하였다. 상기 고지방 사료는 전체 사료의 열량(㎉)을 기준으로, 21.0% 단백질, 24.6% 탄수화물 및 54.4% 지방을 포함하는 펠렛 형태를 사용하였다. 총 5 주간 동일한 환경에서 균주 시료 투여 및 고지방 사료 급여한 후의 마우스를 락토바실러스 플란타룸 Ln4 투여 당뇨 유도 실험군(Ln4)로 사용하였다. Ln4 실험군의 결과를 비교하기 위해, 동일한 환경에서 사육하면서 생균체를 투여하면서 정상 사료를 자율급여한 군은 정상 대조군(Control)으로서 사용하였고, 동일한 환경에서 사육하면서 생균체를 투여하지 않고 고지방 사료를 자율급여한 군을 고지방식이 유도군(HFD)으로서 사용하였다. Ln4 실험군, 정상 대조군 및 HFD 유도군은 각각의 체중을 확인하여 고지방식이에 의해 당뇨 및 대사성질환이 유도되었는지 여부를 확인함과 동시에, 락토바실러스 플란타룸 Ln4에 의한 체중 감소 효과가 나타나는지를 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 정상 대조군에 비해 사육 1주일 후부터 HFD 유도군의 체중의 증가가 유의적으로 높은 수준임을 확인하였으며, 이러한 HFD 군의 체중 증가에 비해 Ln4 생균제 경구 투여군(Ln4)에서 체중 증가 수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 3).
<4-3> 락토바실러스 플란타룸 Ln4의 체지방 감소 효능 분석
락토바실러스 플란타룸 Ln4가 대사성질환이 유도된 동물모델에서 유의적인 항비만 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 대사성질환을 유도시킨 동물모델에서 체지방 감소 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-2>의 방법으로 5주 동안 대사성질환을 유도한 Ln4 생균제 투여군(Ln4) 및 대조군에서 체중 조절 효능을 분석한 후, 대표적인 내장 지방인 부고환 지방을 분리하여 무게를 측정하였다. 그런 다음, 고지방식이를 투여하기 전의 부고환 지방 무게와 비교하여 5주간의 고지방식이 유도에 따른 지방 무게의 증가 수준을 상대적으로 계산하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 정상 식이로 급여한 대조군과 비교하였을 때 고지방식이를 유도한 대조군(HFD)은 부고환지방의 무게가 약 2 배 수준으로 증가하였으나, 실험군(Ln4)에서는 HFD 군에 비해 부고환지방 무게의 증가 수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 4).
한국미생물보존센터(국외) KCCM11897P 20160922
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Novel Lactobacillus plantarum Ln4 strain and compositions for the prevention and treatment of obesity containing the same <130> 1066473 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 943 <212> RNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 1 tgctaataca tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca 60 tttgagtgag tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata 120 acacctggaa acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagcttgaa 180 agatggcttc ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta 240 acggctcacc atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac 300 tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa 360 agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt 420 taaagaagaa catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc 480 acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt 540 attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa 600 ccgaagaagt gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat 660 gtgtagcggt gaaatgcgta gtaatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg 720 tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta 780 gtccataccg taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag 840 ctaacgcatt aagcattccg cctgggggag tacggccgcc aggctgaaac tcaaaggaat 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtcggagc atgtggtttc att 943

Claims (6)

  1. 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 내산성, 내담즙성, 장부착능 및 항생제 내성을 가지는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주는 지방축적 억제 효과 및 체지방 감소 효능을 나타내는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 수탁번호 KCCM 11897P로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸 Ln4 균주는 지방축적 억제 효과 및 체지방 감소 효능을 특징으로 하는, 비만의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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