TWI740096B - 款冬花萃取物用於提升ｔｇｍ基因、ｋｒｔ基因、ａｑｐ基因、ｆｌｇ基因、ｇｂａ基因、及ｈａｓ基因表現量的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種款冬花萃取物用於提升TGM基因、KRT基因、AQP基因、FLG基因、GBA基因、及HAS基因表現量之用途，能使皮膚形成更多保濕因子，並維持角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能。其中該款冬花萃取物係款冬花以水、醇、或醇水混合物之溶劑所萃取而得。
Description
本發明係關於一款冬花萃取物之用途，尤其是一種款冬花萃取物用於提升TGM基因、KRT基因、AQP基因、FLG基因、GBA基因、及HAS基因表現量的用途。
表皮層為皮膚的最外層，由外往內依序為角質層、顆粒層、有棘層及基底層，表皮層主要由基底層中未分化之圓柱型角質細胞持續向上進行分化形成，此過程稱為角質化。角質細胞內含水量高，隨著細胞向上代謝分化，角質細胞形狀會逐漸變成扁平狀，且細胞核及胞器開始退化萎縮，並在角質層形成不具細胞核與胞器之死細胞。表皮層的主要功能為使皮膚保水，並形成皮膚屏障以抵禦各種外來傷害，其中表皮層最外層由一弱酸性的皮脂膜以及如磚牆結構的角質層所構成，此屏障能鎖住皮膚的水分和油脂、抵抗皮膚表面病菌入侵，及對抗外界異物及紫外光等傷害，對人體有非常重要的保護作用。
表皮層中的角質層，其角質細胞雖然為死細胞，但其主要成分為角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮膚保持濕潤，角質細胞也會分泌如玻尿酸等物質作為細胞間質，以維持表皮層皮膚屏障之結構完整，以防止皮膚水
分散失及形成完整防護。當皮膚接觸過冷或過熱之環境以及照射紫外光等刺激，會導致角質細胞無法維持正常的代謝循環，且皮膚保水能力也會下降，並導致皮膚表皮層屏障受損，讓皮膚變得粗糙、乾燥脫屑、脆弱易受刺激、敏感泛紅，因此角質層的健康與保水能力對於抵禦外來傷害著實非常重要。
綜合上面所述，為了改善因角質細胞受損及保水能力下降，導致皮膚變得脆弱、易敏的問題，開發一種能有效使角質細胞分泌更多保濕因子，並維持角質細胞排列、維持角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能之醫藥組成物，著實有其必要性。
緣此，本發明之一目的在提供一種款冬花萃取物用於製備提升轉谷氨醯胺酶(Transglutaminase,TGM)基因、角蛋白(Keratin,KRT)基因、聚角蛋白微絲(Filaggrin,FLG)基因、水通道蛋白(Aquaporin,AQP)基因、葡萄糖腦苷酯酶(Glucocerebrosidase,GBA)基因、及/或玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase,HAS)基因表現量之組合物的用途，其中該款冬花萃取物係以一溶劑萃取一款冬花所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物；該組合物可進一步包含一醫藥上可接受之載體。
在本發明之一實施例中，該溶劑與該款冬花之重量比為10-20：1-5；且該萃取之溫度係50-100℃。
在本發明之又一實施例中，該轉谷氨醯胺酶基因係轉谷氨酰胺酶1(Transglutaminase 1,TGM1)基因；該水通道蛋白係水通道蛋白3(Aquaporin 3,AQP 3)基因。
在本發明之又一實施例中，該角蛋白基因係角蛋白1(Keratin1,KRT1)基因、角蛋白14(Keratin14,KRT14)基因或其任意組合。
在本發明之又一實施例中，該HAS基因係玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2,HAS2)基因、玻尿酸合成酶3(Hyaluronan synthase 3,HAS3)基因或其組合。
在本發明之又一實施例中，該款冬花萃取物的濃度為至少0.25mg/mL。
在本發明之另一實施例中，該款冬花萃取物係維持皮膚角質層結構完整、及/或提升皮膚保濕能力。
本發明之款冬花萃取物能有效在6小時內即顯著地提升皮膚角質細胞中與保濕相關的TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因的表現量，能有效維持皮膚角質細胞排列，使皮膚角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能、以及防止皮膚水分散失；且亦能有效調節皮膚處於保水的狀態，並維持皮膚保水的恆定；其亦可使皮膚形成更多保濕因子，使皮膚保水能力上升、以及維持皮膚彈性。因此，本發明之款冬花萃取物可用於製備提升皮膚保濕能力之組合物的用途，其中該組合物該組合物是一醫藥品、一食品或一保養品，可藉由口服、皮膚塗抹等方式給予一個體。
圖1係為本發明之一實施例的款冬花萃取物作用6小時後提升TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。
圖2係為本發明之一實施例的款冬花萃取物作用24小時後提升TGM1基因、KRT1基因、AQP3基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、泡沫(foam)、以及懸浮液(suspension)等。
依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。
依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。
依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、及紫外線吸收劑
(ultraviolet absorbers)等。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)等。
本發明提供一種款冬花萃取物用於製備提升TGM基因、KRT基因、FLG基因、AQP基因、GBA基因、及HAS基因表現量之組合物的用途，本發明之款冬花萃取物係以一溶劑萃取一款冬花所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，其可用於維持皮膚角質層結構完整、及/或提升皮膚保濕。
同時，本發明用於製備提升TGM基因、KRT基因、FLG基因、AQP基因、GBA基因、及HAS基因表現量之組合物，亦可包含一有效量之款冬花萃取物及一醫藥上可接受之載體，該組合物係一醫藥品、一食品或一保養品。
以下將詳細說明本發明款冬花萃取物之詳細萃取方法，與該款冬花萃取物於調控皮膚角質細胞中TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因表現量之測試，以證實該款冬花萃取物能有效使皮膚角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能，並能有效維持皮膚保水的恆定與形成更多保濕因子，以使皮膚保水能力上升。
款冬(Tussilago farfara)係菊科(Asteraceae)款冬屬(Tussilago)多年生草本植物，又稱冬花、款花、看灯花、或艾冬花。莖呈葶狀，叢生且直立，彼此間不分枝，表面被有密褐色短柔毛及蛛絲狀綿毛；葉分為根生葉及莖生葉，
根生葉叢生狀，呈心形至腎形，葉緣具有細鋸齒狀，莖生葉則呈長橢圓狀披針形至卵狀長橢圓形。其花蕾又名款冬花，係常用中藥材的一種，可用於去咳止痰、治療氣喘或氣管炎。
在本發明之一實施例中，將款冬花的花蕾清洗，取洗淨後之款冬花花蕾與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑，萃取溶劑較佳為水，以1-5：10-20之重量比混合，均質後在溶劑中以50-100℃進行萃取0.5-3小時後，將粗萃取後冷卻至室溫，並將該粗萃取物以400mesh之濾網過濾以獲得濾液。最後，將該濾液於45-70℃進行減壓濃縮後，再經5μm孔徑之濾心進行過濾，得到之該濾液即為本發明之款冬花萃取物。
在本實施例中，較佳地，將洗淨後之款冬花花蕾與水以1：10之重量比混合，均質後在溶劑中以100℃進行萃取0.5小時後，將粗萃取後冷卻至室溫，並將該粗萃取物以400mesh之濾網過濾以獲得濾液。最後，將該濾液於70℃進行減壓濃縮後，再經5μm孔徑之濾心進行過濾，得到之該濾液即為本發明之款冬花萃取物。而後續實施例之實驗中所使用之「本發明之款冬花萃取物」，係以本段落所述之萃取條件製備而成。
本發明之一實施例以人類初代皮膚角質細胞HPEK-50(Human primary epidermal keratinocytes,HPEK)進行本發明之款冬花萃取物在短時間作用下調控TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP 3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表現量之功效的測試。該HPEK-50細胞係購自CELLnTEC公司(瑞士)，且培養於無血清之角質細胞培養液(keratinocyte-SFM)(Gibco公司，編號為#17005042，美國)，並於含有5% CO2之37℃細胞培養箱中進行培養。
首先，將1.5x105個HPEK-50細胞培養於每孔含有2mL上述培養液之6孔培養盤中，於37℃培養16-18小時，接著將細胞分成以下二組：(1)僅含有細胞培養液之控制組、(2)加入0.25mg/mL本發明之款冬花萃取物的實驗組，並分別作用6小時；其中該款冬花萃取物係以水為溶劑進行萃取。接著，將HPEK-50細胞以細胞裂解液(購自Geanaid公司，臺灣，編號RBD300)回收細胞後，使用RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，臺灣，編號RBD300)分別收集該二組細胞內之RNA，接著利用SuperScript® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)以2000ng之萃取RNA為模板並以引子產生mRNA反轉錄之相應cDNA產物，接著利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，以及KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)將該二組反轉錄後產物分別以表1之組合引子進行定量即時聚合酶連鎖反應(Quantitative real-time polymerase chain reaction)試驗，條件為95℃反應1秒，60℃反應20秒，總共40個迴圈。用以定量TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因之mRNA表現量，其中定量數值係取由閾值循環數(Ct)，而目標基因的mRNA相對量係推導自方程式2-△Ct，其中△Ct=Ct目標基因-CtTBP(TATA結合蛋白，TATA-binding protein)，再利用Excel軟體進行非成對單尾student t-test以決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
先前研究指出TGM會使角質化細胞之細胞膜與結構蛋白間形成強力鍵結，並能增加表皮層的強度與穩定性；KRT會形成角蛋微絲，而FLG會幫助角蛋白微絲組裝成堅固的網絡，為皮膚提供強度和彈性。因此，角質細胞的結構基因-TGM1基因、KRT1基因、及KRT14基因的表現量上升，能夠維持角質細胞排列，使皮膚角質組織的結構完整，並防止皮膚水分散失。而皮膚細胞的保濕纖維基因-FLG基因的表現量上升，能夠促進天然保濕因子(Natural Moisturizing Factor,NMF)的生成，並持續維持皮膚於保水狀態。
AQP會加角質細胞內水的通透性，以提高角質細胞的含水量；GBA則與維持角質結構完整有關。因此，皮膚細胞的水份調節基因-AQP3基因、及GBA基因的表現量上升，能夠穩定地調控皮膚的含水狀態，以維持皮膚水分的恆定。
HAS會促進角質細胞分泌玻尿酸的能力，能夠促進皮膚細胞之內生性玻尿酸生成，玻尿酸可吸附水份以提高皮膚的保水力，並能維持皮膚角質完整以提升皮膚屏障功能，且能支撐皮膚以維持皮膚彈性。因此，皮膚細胞的玻尿酸分泌基因-HAS2基因、及HAS3基因的表現量上升，能使皮膚保水力提升，並維持皮膚角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能。
本發明之款冬花萃取物作用6小時後提升角質細胞內TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表現量之結果如圖1所示。人類初代角質細胞經本發明之款冬花萃取物處理6小時後，TGM1基因表現量為控制組之1.8倍、KRT1基因為2.9倍、KRT14基因為1.3倍、FLG基因為1.3倍、GBA基因為1.2倍、HAS2基因為1.9倍、HAS3基因則為1.2倍，而AQP基因則與控制組差異不大(圖中未顯示)。此結果顯示本發明之款冬花萃取物能在短時間的作用下，有效提高TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因的表現量，能有效的維持皮膚角質細胞排列，使皮膚角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能、以及防止皮膚水分散失；且亦能有效調節皮膚處於保水的狀態，並維持皮膚保水的恆定；其亦可使皮膚形成更多保濕因子，使皮膚保水能力上升、以及維持皮膚彈性。
本發明之一實施例以人類初代皮膚角質細胞HPEK-50進行本發明之款冬花萃取物在較長時間內調控TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP 3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表現量之功效的測試。首先，將1.5x105個HPEK-50細胞培養於每孔含有2mL上述培養液之6孔培養盤中，於37℃培養16-18小時，接著將細胞分成以下三組：(1)僅含有細胞培養液之控制組、(2)加入0.25mg/mL本發明之款冬花萃取物的實驗組，並分別作用24小時；其中該款冬花萃取物係以水為溶劑進行萃取。接著，將HPEK-50細胞以
細胞裂解液回收細胞後，以實施例2中所述之步驟收集該三組細胞內之RNA，並進行反轉錄酶以產生mRNA反轉錄相應的cDNA產物，再進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應試驗，用以定量TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因之mRNA表現量，其中定量數值係取由閾值循環數(Ct)，而目標基因的mRNA相對量係推導自方程式2-△Ct，其中△Ct=Ct目標基因-Ct GAPDH ，再利用Excel軟體進行非成對單尾student t-test以決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
本發明之款冬花萃取物作用24小時後提升角質細胞內TGM1基因、KRT1基因、AQP 3基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表現量之結果如圖2所示。人類初代角質細胞經0.25mg/mL本發明之款冬花萃取物處理24小時後，TGM1基因表現量為控制組之1.3倍、KRT1基因為1.4倍、AQP 3基因為2.3倍、GBA基因為1.2倍、HAS2基因為2.4倍、HAS3基因則為2.7倍，而KRT14基因、及FLG基因則與控制組差異不大(圖中未顯示)。此些結果顯示本發明之款冬花萃取物能有效提高TGM1基因、KRT1基因、AQP 3基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因的表現量，能有效的維持皮膚角質細胞排列，使皮膚角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能、以及防止皮膚水分散失；且亦能有效調節皮膚處於保水的狀態，並維持皮膚保水的恆定；其亦可使皮膚形成更多保濕因子，使皮膚保水能力上升、以及維持皮膚彈性。
綜上所述，本發明之款冬花萃取物能有效在6-24小時內即顯著地提升皮膚角質細胞中與保濕相關的TGM1基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因、及/或HAS3基因的表現量，能有效維持皮膚角質細胞排列，使皮膚角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能、以及防止皮膚水分散失；且亦能有效調節皮膚處於保水的狀態，並維持皮膚保水的恆定；其亦可使皮膚形成更多保濕因子，使皮膚保水能力上升、以及維持皮膚彈
性。因此，本發明之款冬花萃取物可用於製備提升皮膚保濕能力之組合物的用途，其中該組合物該組合物是一醫藥品、一食品或一保養品，可藉由口服、皮膚塗抹等方式給予一個體。
<110> 大江生醫股份有限公司
<120> 款冬花萃取物用於提升TGM基因、KRT基因、AQP基因、FLG基因、GBA基因、及HAS基因表現量的用途
<130> 107B0528-I1
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (8)
- 一種款冬花萃取物用於製備一提升皮膚屏障功能組合物的用途，其中該組合物係透過維持角質細胞結構完整以達到該皮膚屏障功能，其中該款冬花萃取物係以一溶劑萃取一款冬花所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，且該款冬花萃取物的濃度為至少0.25mg/mL。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該溶劑與該款冬花之重量比為10-20：1-5。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該萃取之溫度係50-100℃。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物係透過提升轉谷氨醯胺酶(Transglutaminase,TGM)基因、角蛋白(Keratin,KRT)基因、及/或葡萄糖腦苷酯酶(Glucocerebrosidase,GBA)基因的表現量以達到該維持角質細胞結構完整之功能。
- 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該角蛋白基因係角蛋白1(Keratin1,KRT1)基因、角蛋白14(Keratin14,KRT14)基因或其任意組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該萃取之時間為0.5-3小時。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物進一步包含一醫藥上可接受之載體。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物是一醫藥品、一食品或一保養品。
Priority Applications (2)
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