TWI722003B - 包含免疫球蛋白Ｍ(ＩｇＭ)的組合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明的實施方案提供一種使用包含IgM的組合物治療或預防感染相關免疫狀況的方法。

Description

包含免疫球蛋白M(IgM)的組合物的用途
本發明關於一種經由施用包含IgM的組合物治療或預防免疫症狀或免疫狀況。
微生物物種可變得對被感染的患者極為有害，如果該個體不能清除感染的話。感染也可變成敗血性的，從被感染的器官擴散到血流中。對於患者，這些敗血性感染具有不良預後(poor outcome)。
充分表徵了，血漿來源的免疫球蛋白M(IgM)可結合內毒素並防止針對患者的內毒素介導的毒性。這歸因於IgM結合聚糖從而防止其效應的固有能力或偏好。通常，內毒素的這些毒性效應反應於由抗生素或患者的免疫系統引起的細菌死亡或溶菌。
另外，基於IgM與自身免疫性疾病或動脈粥樣硬化的特定標誌物(hallmarks)，例如，自身抗體的相互作用已提出使用IgM組合物或IgM富集的組合物用於治療所述疾病(Hurez,V.等“Pooled Normal Human Polyspecific IgM Contains Neutralizing Anti-Idioitypes to IgG Autoantibodies of Autoimmune Patients and Protects from Exaperimental Autoimmune Disease”,Blood,1997，第90 卷，第10期，4004-4013；以及Cesena,HY.“Immune-modulation by polyclonal IgM treatment reduces atherosclerosis in hypercholesterolemic apoE -/- mice”,Atherosclerosis,2012，第220卷，59-65)。
微生物感染的敗血性狀況及其他併發症通常與免疫系統的過度刺激相關，並且由於微生物的過度量級的且迅速的進化通常不可能被控制。因此，仍存在對減少、抑制或預防免疫系統的過度刺激的有效治療方案的需要。
本發明的實施方案提供一種組合物，該組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來源的IgM及任選地以藥物載體(carrier)形式的一種或複數種賦形劑。
在另外的實施方案中，本發明提供一種用於治療敗血症(sepsis)的包含IgM的組合物。
在另外的實施方案中，本發明提供一種用於治療由感染產生的免疫併發症的包含IgM的組合物。
在另外的實施方案中，本發明提供一種用於在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症的方法，該方法包括施用包含IgM的組合物。
在另外的實施方案中，本發明亦提供一種用於免疫調節需要其的患者中的感染的方法，該方法包括施用包含IgM的組合物。
為了更好的理解，以下參考通過舉例的方式呈現的圖 式並參考不是對本發明的限制的說明性實例更詳細地描述了本發明。
圖1示出了評價IgM對大腸桿菌(Escherichia coli)LPS-誘導的攜帶穩定NF-κ B報告物質粒的THP-1細胞中的NF-κ B活化的效應獲得的結果。在圖1A和圖1B兩者中，y軸示出了如通過NF-κ B SEAP報告物測量的NF-κ B活性的倍數增加，該增加與NF-κ B活性的誘導成正比。此外，在兩圖(圖1A和圖1B)中，多個處理組在x軸上示出。標準誤差在各個條上指示。
圖2示出了困難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)的類毒素A或類毒素B在攜帶穩定NF-κ B報告物質粒的THP-1細胞中誘導NF-κ B獲得的結果。如通過NF-κ B SEAP報告物測量的NF-κ B活性的倍數增加在y軸上指示，並且與NF-κ B活性的誘導成正比。以μg/mL計的類毒素A或類毒素B的濃度在x軸示出。
圖3示出了抑制困難梭狀芽孢桿菌的類毒素B誘導的攜帶穩定NF-κ B報告物質粒的THP-1細胞中的NF-κ B活化獲得的結果。如通過NF-κ B SEAP報告物測量的NF-κ B活性的倍數增加在y軸上指示，並且與NF-κ B活性的誘導成正比。多個處理組在x軸上示出。標準誤差在各個條上指示。
圖4示出了抑制肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)誘導的攜帶穩定NF-κ B報告物質粒的THP-1細胞中的 NF-κ B活化和IL-8分泌的結果。在圖4A中，y軸示出了如通過NF-κ B SEAP報告物測量的NF-κ B活性的倍數增加，該倍數增加與NF-κ B活性的誘導成正比；且x軸示出了多個處理組。在圖4B中，y軸示出了分泌到培養物上清液中的IL-8的濃度；且x軸示出了多個處理組。在圖4B中，“UD”指示在未處理的對照組中IL-8是檢測不到的。在兩圖中，標準誤差在各個條上指示。
圖5示出了對關於IgM介導的對佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate)(PMA)/離子黴素誘導的外周血單核細胞(PBMC)，特別是T細胞的細胞增殖的阻斷的實驗獲得的結果。如通過Cell Titer Glow測量的相對於對照組的相對增殖的倍數增加在y軸上指示，且與細胞增殖的誘導成正比。多個處理組在x軸上示出。標準差在各個條上指示。
在詳盡和大量的實驗和研究之後，本案發明人已發現，IgM組合物顯示出免疫調節活性(例如，通過減少NF-κ B活性誘導及/或降低外周血單核細胞的增殖)，這使得該組合物適合於治療與免疫系統的過度刺激相關的狀況，該免疫系統的過度刺激例如，與敗血性狀況相關的免疫系統的過度刺激。
本發明的實施方案提供一種組合物，該組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來源的IgM及任選地以藥物載體形式的一種或複數種賦形劑。根據特定 的實施方案，一種或複數種賦形劑及/或藥物載體是合成的，亦即，非天然存在的。
如本文使用的，術語“藥學上可接受的載體”指與本發明的血漿來源的IgM一起被施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類載體可以是無菌液體，諸如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等，聚乙二醇，甘油(glycerin)，丙二醇或其他合成的溶劑。鹽溶液和含水右旋糖和丙三醇(glycerol)溶液也可被用作液體載體，特別是用於可注射溶液的液體載體。根據特定的實施方案，藥學上可接受的載體是合成的(亦即，載體不是天然存在的)。
適合的賦形劑的非限制性實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、丙三醇、丙二醇、水、乙醇等。賦形劑亦可包括潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；抗細菌劑諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；以及用於調節張力(tonicity)的試劑諸如氯化鈉或右旋糖。根據特定的實施方案，一種或複數種賦形劑是合成的(亦即，賦形劑不是天然存在的)。
本發明的實施方案還關於一種用於獨立於內毒素介導的免疫反應而對針對微生物感染的反應進行免疫調節的方法。
因此，在第一實施方案中，本發明提供一種用於治療 敗血症的包含IgM的組合物。
在第二實施方案中，本發明提供一種用於治療由感染產生的免疫併發症的包含IgM的組合物。
在另外的實施方案中，本發明提供一種用於在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症的方法，該方法包括施用包含IgM的組合物。
此外，本發明亦提供一種用於免疫調節需要其的患者中的感染的方法，該方法包括施用包含IgM的組合物。
如本文使用的，“高細胞因子血症(hypercytokinemia)”及其複數意指這樣的免疫併發症，該免疫併發症特徵為，由於細胞因子和白細胞，包括T細胞和巨噬細胞之間的正反饋回路(positive feedback loop)而產生過量的促炎性細胞因子。
如本文使用的，“高凝血症(hypercoagulopathy)”及其複數意指由某些血細胞組分，如血小板及微生物的外來的和固有的途徑的血液凝固因子及其產物的過度活化導致的免疫併發症。
在一個實施方案中，本發明提供一種用於治療敗血症的包含IgM的組合物。根據特定的實施方案，該組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來源的IgM及任選地以藥物載體形式的一種或複數種賦形劑。
敗血症可由一種或複數種細菌(革蘭氏陽性或革蘭氏陰性)、一種或複數種真菌(例如，黃麴黴(Aspergillus flavus))、一種或複數種病毒或其組合產生。在較佳的實施 方案中，敗血症由一種或複數種細菌產生，更佳地敗血症由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、困難梭狀芽孢桿菌、肉毒梭孢桿菌(Clostridium botulinum)或其組合產生。
敗血症或敗血性狀況的治療通過治療免疫併發症，諸如促炎性反應或免疫系統的過度活化來進行，敗血症或敗血性狀況的治療繼而通過免疫調節來進行。該免疫調節較佳地獨立於內毒素介導的免疫反應，並且可通過多種方法來施加。在較佳的實施方案中，免疫調節通過抑制NF-κB誘導來進行。在另一個實施方案中，免疫調節通過抑制外周血單核細胞，較佳地T-細胞的增殖來進行。在最佳的實施方案中，免疫調節通過以上提及的兩種方法施加。
較佳地，組合物具有至少90%(w/v)的IgM純度，更佳地至少95%的IgM純度。在最佳的實施方案中，組合物具有95%(w/v)的IgM純度。
組合物的待施用的劑量較佳地為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者，更佳地從75mg IgM/kg患者至600mg IgM/kg患者，且最佳地，從75mg IgM/kg患者至300mg IgM/kg患者。另外，組合物較佳地被至少一週一次或每隔一天或者每週三次或每天提供或施用。
另外，該IgM可以是重組的、血漿來源的、細胞培養物來源的、轉基因的或化學合成的。
如果IgM是重組的，它可根據蛋白表達、生產和純化 領域中已知的任何技術來獲得。例如，IgM核酸序列可被***到適合於在被選擇的宿主細胞中表達的任何載體(vector)中，該被選擇的宿主細胞例如細菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)及葡萄球菌屬(Staphylococcus))、酵母(酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces))、昆蟲細胞(家蠶(Bombyx mori)、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)或黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))或哺乳動物細胞(HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS-1)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、人類腺病毒轉化的293細胞、小鼠L-929細胞、HaK倉鼠細胞系、來源於瑞士(Swiss)小鼠、Balb-c或NIH小鼠的鼠(murine)3T3細胞、CV-1細胞系、來源於原代組織或原代外植塊(explant)的體外培養物的細胞株)。
細胞培養物來源的IgM可通過本領域的現有技術中已知的任何方法或程式，例如，雜交瘤方法來產生。
轉基因和化學合成的IgM可通過本領域的現有技術中已知的任何方法或程式來產生。
在較佳的實施方案中，IgM是血漿來源的IgM，分離自合適的血漿級分例如，如美國發明專利第6,307,028號中描述的收集IgG之後的兩個ANX柱程式的洗滌物或者通過負選擇親和色譜(negative selection affinity chromatography)或尺寸排阻色譜(size exclusion chromatography)進一步純化該級分。
關於該血漿來源的IgM，任選地，它可被分離或純化以增加針對給定的外毒素、分泌型蛋白、微生物物種或其組合的特異性抗體的相對量。
根據特定的實施方案，設想了單獨地施用包含IgM的組合物。
在另一個實施方案中，包含IgM的組合物連同一種或複數種其他組合物或分子一起被施用。該其他組合物或分子較佳地選自抗炎分子、抗生素(例如，小分子抗生素、本質上是抗微生物劑的分子、天然或合成的肽抗微生物劑及/或具有抗微生物特性的蛋白)、其他免疫調節劑或其組合。在較佳的實施方案中，該其他組合物或分子是萬古黴素(vancomycin)、美洛培南(meropenem)、乳鐵蛋白或其組合。包含IgM的組合物連同如以上提及的一種或複數種其他組合物或分子一起的施用包括同時施用待提供的所有組合物或分子或者一種接著另一種地施用這些組合物或分子。
包含IgM的組合物可被用於治療敗血症(如以上提及的)以及用於預防該疾病兩者。
在另外的實施方案中，本發明揭露一種用於治療由感染產生的免疫併發症的包含IgM的組合物。
感染可由一種或複數種細菌(革蘭氏陽性或革蘭氏陰性)、一種或複數種真菌(例如，黃麴黴)、一種或複數種病毒或其組合產生。在較佳的實施方案中，感染由一種或複 數種細菌產生，更佳地，感染由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、困難梭狀芽孢桿菌、肉毒梭孢桿菌或其組合產生。
免疫併發症，諸如促炎性反應或免疫系統的過度活化的治療通過免疫調節來進行。該免疫調節較佳地獨立於內毒素介導的免疫反應，並且可通過多種方法來施加。在較佳的實施方案中，免疫調節通過抑制NF-κB誘導來進行。在另一個實施方案中，免疫調節通過抑制外周血單核細胞，較佳地T-細胞的增殖來進行。在最佳的實施方案中，免疫調節通過以上提及的兩種方法施加。
組合物較佳地具有至少90%(w/v)的IgM純度，更佳地至少95%(w/v)的IgM純度。在最佳的實施方案中，所用的組合物包括95%(w/v)的IgM純度。
組合物的待施用的劑量較佳地為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者，更佳地從75mg IgM/kg患者至600mg IgM/kg患者，且最佳地，從75mg IgM/kg患者至300mg IgM/kg患者。另外，組合物較佳地被至少一週一次或每隔一天或者每週三次或每天提供或施用。
另外，該IgM可以是重組的、血漿來源的、細胞培養物來源的、轉基因的或化學合成的。
如果IgM是重組的，它可根據蛋白表達、生產和純化領域中已知的任何技術來獲得。例如，IgM核酸序列可被***到適合於在被選擇的宿主細胞中表達的任何載體中，該被選擇的宿主細胞例如細菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、 鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈黴菌屬及葡萄球菌屬)、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬或克魯維酵母屬)、昆蟲細胞(家蠶、甘藍夜蛾、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅)或哺乳動物細胞(HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS-1)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、人類腺病毒轉化的293細胞、小鼠L-929細胞、HaK倉鼠細胞系、來源於瑞士小鼠、Balb-c或NIH小鼠的鼠3T3細胞、CV-1細胞系、來源於原代組織或原代外植塊的體外培養物的細胞株)。
細胞培養物來源的IgM可通過本領域的現有技術中已知的任何方法或程式，例如，雜交瘤方法來產生。
轉基因和化學合成的IgM可通過本領域的現有技術中已知的任何方法或程式來產生。
在較佳的實施方案中，IgM是血漿來源的IgM，分離自合適的血漿級分，例如，如在美國發明專利第6,307,028號中描述的收集IgG之後的兩個ANX柱程式的洗滌物，或者通過負選擇親和色譜或尺寸排阻色譜進一步純化該級分。
在另一個較佳的實施方案中，由感染產生的免疫併發症是高細胞因子血症、高凝血症或器官衰竭。
關於該血漿來源的IgM，任選地，它可被分離或純化以增加針對給定的外毒素、分泌型蛋白、微生物物種或其組合的特異性抗體的相對量。
根據特定的實施方案，設想了單獨地施用包含IgM的 組合物。
在另一個實施方案中，包含IgM的組合物連同一種或複數種其他組合物或分子一起被施用。該其他組合物或分子較佳地選自抗炎分子、抗生素(例如，小分子抗生素、本質上是抗微生物劑的分子、天然或合成的肽抗微生物劑及/或具有抗微生物特性的蛋白)、其他免疫調節劑或其組合。在較佳的實施方案中，該其他組合物或分子是萬古黴素、美洛培南、乳鐵蛋白或其組合。包含IgM的組合物連同如以上提及的一種或複數種其他組合物或分子一起的施用包括同時施用待提供的所有組合物或分子或者一種接著另一種地施用這些組合物或分子。
包含IgM的組合物可被用於治療由感染產生的免疫併發症(如以上提及的)以及用於預防該免疫併發症兩者。
在另外的實施方案中，本發明關於一種用於在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症的方法，該方法包括施用包含IgM的組合物。
感染可由一種或複數種細菌(革蘭氏陽性或革蘭氏陰性)、一種或複數種真菌(例如，黃麴黴)、一種或複數種病毒或其組合產生。在較佳的實施方案中，感染由一種或複數種細菌產生，更佳地感染由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、困難梭狀芽孢桿菌、肉毒梭孢桿菌或其組合產生。
免疫併發症，諸如促炎性反應或免疫系統的過度活化的治療通過免疫調節來進行。該免疫調節較佳地獨立於內 毒素介導的免疫反應，並且可通過多種方法來施加。在較佳的實施方案中，免疫調節通過抑制NF-κB誘導來進行。在另一個實施方案中，免疫調節通過抑制外周血單核細胞，較佳地T-細胞的增殖來進行。在最佳的實施方案中，免疫調節通過以上提及的兩種方法施加。
組合物較佳地具有至少90%(w/v)的IgM純度，更佳地至少95%(w/v)的IgM純度。在最佳的實施方案中，所用的組合物包括95%(w/v)的IgM純度。
組合物的待施用的劑量較佳地為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者，更較佳地從75mg IgM/kg患者至600mg IgM/kg患者，且最佳地，從75mg IgM/kg患者至300mg IgM/kg患者。另外，組合物較佳地被至少一週一次或每隔一天或者每週三次或每天提供或施用。
另外，該IgM可以是重組的、血漿來源的、細胞培養物來源的、轉基因的或化學合成的。
如果IgM是重組的，它可根據蛋白表達、生產和純化領域中已知的任何技術來獲得。例如，IgM核酸序列可被***到適合於在被選擇的宿主細胞中表達的任何載體中，該被選擇的宿主細胞例如細菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈黴菌屬及葡萄球菌屬)、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬或克魯維酵母屬)、昆蟲細胞(家蠶、甘藍夜蛾、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅)或哺乳動物細胞(HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS-1)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、人類腺病毒 轉化的293細胞、小鼠L-929細胞、HaK倉鼠細胞系、來源於瑞士小鼠、Balb-c或NIH小鼠的鼠3T3細胞、CV-1細胞系、來源於原代組織或原代外植塊的體外培養物的細胞株)。
細胞培養物來源的IgM可通過本領域的現有技術中已知的任何方法或程式，例如，雜交瘤方法來產生。
轉基因和化學合成的IgM可通過本領域的現有技術中已知的任何方法或程式來產生。
在較佳的實施方案中，IgM是血漿來源的IgM，分離自合適的血漿級分，例如，如在美國專利6,307,028中描述的收集IgG之後的兩個ANX柱程式的洗滌物或者通過負選擇親和色譜或尺寸排阻色譜進一步純化該級分。
關於該血漿來源的IgM，任選地，它可被分離或純化以增加針對給定的外毒素、分泌型蛋白、微生物物種或其組合的特異性抗體的相對量。
根據特定的實施方案，設想了單獨地施用包含IgM的組合物。
在另一個實施方案中，包含IgM的組合物連同一種或複數種其他組合物或分子一起被施用。該其他組合物或分子較佳地選自抗炎分子、抗生素(例如，小分子抗生素、本質上是抗微生物劑的分子、天然或合成的肽抗微生物劑及/或具有抗微生物特性的蛋白)、其他免疫調節劑或其組合。在較佳的實施方案中，該其他組合物或分子是萬古黴素、美洛培南、乳鐵蛋白或其組合。包含IgM的組合物連同如 以上提及的一種或複數種其他組合物或分子一起的施用包括同時施用待提供的所有組合物或分子或者一種接著另一種地施用這些組合物或分子。
本發明的方法可被用於治療由感染產生的免疫併發症(如以上提及的)以及用於預防該免疫併發症兩者。
最後，本發明亦揭露一種用於免疫調節需要其的患者中的感染的方法，該方法包括施用包含IgM的組合物。
該免疫調節可被用於治療或預防感染或感染相關的症狀或狀況。
感染可由一種或複數種細菌(革蘭氏陽性或革蘭氏陰性)、一種或複數種真菌(例如，黃麴黴)、一種或複數種病毒或其組合產生。在較佳的實施方案中，感染由一種或複數種細菌產生，更佳地感染由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、困難梭狀芽孢桿菌、肉毒梭孢桿菌或其組合產生。
該免疫調節允許治療免疫併發症，諸如促炎性反應或免疫系統的過度活化，並且較佳地獨立於內毒素介導的免疫反應，且可以通過多種方法來施加。在較佳的實施方案中，免疫調節通過抑制NF-κB誘導來進行。在另一個實施方案中，免疫調節通過抑制外周血單核細胞，較佳地T-細胞的增殖來進行。在最佳的實施方案中，免疫調節通過以上提及的兩種方法施加。
組合物較佳地具有至少90%(w/v)的IgM純度，更佳地至少95%(w/v)的IgM純度。在最佳的實施方案中，所用的 組合物包括95%(w/v)的IgM純度。
組合物的待施用的劑量較佳地為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者，更佳地從75mg IgM/kg患者至600mg IgM/kg患者，且最佳地，從75mg IgM/kg患者至300mg IgM/kg患者。另外，組合物較佳地被至少一週一次或每隔一天或者每週三次或每天提供或施用。
另外，該IgM可以是重組的、血漿來源的、細胞培養物來源的、轉基因的或化學合成的。
如果IgM是重組的，它可根據蛋白表達、生產和純化領域中已知的任何技術來獲得。例如，IgM核酸序列可被***到適合於在被選擇的宿主細胞中表達的任何載體中，該被選擇的宿主細胞例如細菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈黴菌屬及葡萄球菌屬)、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬或克魯維酵母屬)、昆蟲細胞(家蠶、甘藍夜蛾、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅)或哺乳動物細胞(HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS-1)、人類肝細胞癌細胞(例如，HepG2)、人類腺病毒轉化的293細胞、小鼠L-929細胞、HaK倉鼠細胞系、來源於瑞士小鼠、Balb-c或NIH小鼠的鼠3T3細胞、CV-1細胞系、來源於原代組織或原代外植塊的體外培養物的細胞株)。
細胞培養物來源的IgM可通過本領域的現有技術中已知的任何方法或程式，例如，雜交瘤方法來產生。
轉基因和化學合成的IgM可通過本領域的現有技術中 已知的任何方法或程式來產生。
在較佳的實施方案中，IgM是血漿來源的IgM，分離自合適的血漿級分，例如，如美國專利6,307,028中描述的收集IgG之後的兩個ANX柱程式的洗滌物，或者通過負選擇親和色譜或尺寸排阻色譜進一步純化該級分。
關於該血漿來源的IgM，任選地，它可被分離或純化以增加針對給定的外毒素、分泌型蛋白、微生物物種或其組合的特異性抗體的相對量。
根據特定的實施方案，設想了單獨地施用包含IgM的組合物。
在另一個實施方案中，包含IgM的組合物連同一種或複數種其他組合物或分子一起施用。該其他組合物或分子較佳地選自抗炎分子、抗生素(例如，小分子抗生素、本質上是抗微生物劑的分子、天然或合成的肽抗微生物劑及/或具有抗微生物特性的蛋白)、其他免疫調節劑或其組合。在較佳的實施方案中，該其他組合物或分子是萬古黴素、美洛培南、乳鐵蛋白或其組合。包含IgM的組合物連同如以上提及的一種或複數種其他組合物或分子一起的施用包括同時施用待提供的所有組合物或分子或者一種接著另一種地施用這些組合物或分子。
本文描述的實施方案意圖是對本發明示例性的，而不是對本發明的限制。本領域技術人員將理解可對本揭露內容的實施方案和實施例作出修改而不偏離本揭露內容的範圍。
以上使用術語“包括(comprising)”及其變型描述本發明的實施方案。然而，本案發明人的意圖是，在本文描述的任何實施方案中，術語“包括(comprising)”可被“由......組成(consisting of)”及“主要由......組成(consisting essentially of)”代替，而不偏離本發明的範圍。除非另外指明，否則本文提供的所有值包括多達給定的起點和終點並且包括給定的起點和終點。
以下實施例進一步闡明本發明的實施方案，並且應該被理解為是說明性的而不是對本發明的限制。
實施例
實施例1.分析IgM對由大腸桿菌的脂多糖(LPS)內毒素誘導的NF-κB活性的影響。
作為監測NF-κB訊號傳導途徑活化的方法，使用人類THP-1單核細胞細胞系進行該實驗，該人類THP-1單核細胞細胞系攜帶具有驅動分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)報告物的NF-κB依賴型啟動子的穩定質粒(Invivogen,San Diego,CA USA)。
根據製造商的推薦在增殖培養基中培養細胞。
該實驗用來源於大腸桿菌菌株O111：B4的LPS和來源於大腸桿菌菌株K12的LPS兩者來進行。以上提及的THP-1細胞用100ng/mL來源於菌株O111：B4的大腸桿菌LPS(參見圖1A)或1ng/mL來源於菌株K12的大腸桿菌LPS(參見圖1B)處理24小時。
當使用IgM時，LPS與純化的IgM(95%(w/v)或更高的 純度)一起預培養，然後處理細胞。
對於NF-κB活性測定，將1x105個細胞接種在96孔板的每個孔中。測定培養基與增殖培養基相同，例外是測定培養基包含減少的血清以減少胎牛血清(FBS)來源的蛋白的非特異性效應。如以上描述的，使用終濃度2.5mg/mL的IgM(至少95%(w/v)純的IgM)處理細胞。
NF-κB活性通過評價上清液中分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)的水平來確定，分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)的水平通過Quanti-Blue測定(Invivogen,San Diego,CA USA)測量並根據製造商的說明書進行。在NF-κB測定時的相對細胞數目通過Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來確定並且根據製造商的說明書進行。圖1中示出的相對NF-κB活性通過以下來計算：針對通過Cell Titer Glow測定確定的相對細胞數目將NF-κB測定值規範化，然後將實驗對照標準化為值1。
令人驚訝地，觀察到，在以上測試和提及的任何情況下，純化的IgM對LPS介導的NF-κB訊號傳導的活化不具有任何顯著效應(參見圖1A和圖IB)。
實施例2.分析IgM對由困難梭狀芽孢桿菌的類毒素B誘導的NF-κB活性的影響。
已知困難梭狀芽孢桿菌的毒素在單核細胞中誘導細胞因子分泌，包括IL-8和TNF-α(Linevsky,JK.，等，“IL-8 release and neutrophil activation by Clostridium difficile toxin-exposed human monocytes,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,1997,273,G1333-G1340；以及Sun,X.，等“Essential role of the glucosyltransferase activity in Clostridium difficile toxin-induced secretion of TNF-α by macrophages”,Microbial Pathogenesis,2009,16,298-305)。還已知這些細胞因子中的每個在NF-κB活化後被誘導。
因此，測試了困難梭狀芽孢桿菌的類毒素B是否能夠在如以上提及的攜帶穩定地整合的NF-κB報告物質粒(Invivogen,San Diego,CA USA)的人類THP-1細胞中誘導NF-κB訊號傳導。根據製造商的推薦在增殖培養基中培養細胞。
由於毒素本身是細胞毒性的，使用滅活的類毒素以避免複雜的結果解釋。對於NF-κB活性測定，在處理之前將2x105個細胞接種在96孔板的每個孔中24小時。然後，用幾種濃度的困難梭狀芽孢桿菌的類毒素A(List Biological Labs,Inc,Campbell,CA USA)或類毒素B(List Biological Labs,Inc,Campbell,CA USA)來處理細胞。NF-κB活性通過評價上清液中分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)的水平來確定，分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)的水平通過Quanti-Blue測定(Invivogen,San Diego,CA USA)測量並根據製造商的說明書來進行。在NF-κB測定時的相對細胞數目通過Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來確定並且根據製造商的說明書來進行。圖2中示出的相對NF-κB活性通過以下來計算：針對通過Cell Tirer Glow測定確定的 相對細胞數目將NF-κB測定值規範化，然後將實驗對照標準化為值1。
儘管類毒素A在這些細胞中不誘導NF-κB訊號傳導，但是類毒素B在這些細胞中顯示了NF-κB報告物的誘導(參見圖2)。
評價了相比於BSA(牛血清白蛋白)對照IgM(90%-95%純度的IgM)的溶液抑制NF-κB活性的能力。
細胞用9.25μg/mL的困難梭狀芽孢桿菌類毒素B處理24小時。在另外用BSA或IgM組合物處理的情況下，將類毒素B與該BSA或與IgM(90%-95%(w/v)純度的IgM)的溶液一起預培養，然後處理細胞。
測定培養基與增殖培養基相同，例外是測定培養基包含0.025μM維生素D3。對於NF-κB活性測定，在處理之前將2x105個細胞接種在96孔板的每個孔中24小時。然後，如以上描述的，使用終濃度3mg/mL IgM(90%-95%(w/v)純度的IgM)或BSA處理細胞。NF-κB活性通過評價上清液中分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)的水平來確定，鹼性磷酸酶(SEAP)的水平通過Quanti-Blue測定(Invivogen,San Diego,CA USA)測量並根據製造商的說明書來進行。在NF-κB測定時的相對細胞數目通過Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來確定並且根據製造商的說明書來進行。圖3中示出的相對NF-κB活性通過以下來計算：針對通過Cell Titer Glow測定確定的相對細胞數目將NF-κB測定值規範化，然後將實驗對照標準化為值1。
BSA對類毒素B的NF-κB活化沒有作用，而以上提及的IgM的溶液使類毒素B效應減弱(參見圖3)。
實施例3.分析IgM對肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌引起的NF-κB活性誘導和IL-8分泌的影響。
由於IgM不能使由大腸桿菌細胞壁內毒素LPS介導的NF-κB訊號傳導減弱(參見實施例1)，因此評價純化的IgM對未受損傷的完整細菌(具有細胞壁組分如LPS)的效應。
用活的微生物培養物的處理將摧毀(overtaken)並妨礙哺乳動物細胞培養測定系統的結果。因此，將完整細菌(肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌)進行甲醛固定以殺死該細菌，同時保持細胞完整。
將如以上提及的攜帶穩定NF-κB報告物質粒的THP-1細胞用甲醛殺死的肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌處理24小時。
當使用IgM時，在處理時，以上提及的微生物與純化的IgM共處理。
對於NF-κB活性測定，將1x105個細胞接種在96孔板的每個孔中。測定培養基與增殖培養基相同，例外是測定培養基包含減少的血清以減少FBS來源的蛋白的非特異性效應。如附圖說明中描述的，使用終濃度2.5mg/mL IgM(至少95%純的IgM)處理細胞。NF-κB活性通過評價上清液中分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)的水平來確定，分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)的水平通過Quanti-Blue測定(Invivogen,San Diego,CA USA)測量並根據製造商的說明書來進行。在 NF-κB測定時的相對細胞數目通過Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來確定並且根據製造商的說明書來進行。所示的相對NF-κB活性通過以下來計算：針對通過Cell Titer Glow測定確定的相對細胞數目將NF-κB測定值規範化，然後將實驗對照標準化為值1。
兩個種類的經甲醛處理的細菌能夠在實施例1和實施例2中使用的細胞系統或模型(即，攜帶穩定地整合的NF-κB報告物質粒的人類THP-1細胞)中有效地誘導NF-κB途徑(參見圖4A)。
令人驚訝地，用經甲醛處理的肺炎克雷伯桿菌或銅綠假單胞菌的任一種和純化的IgM的共處理顯示NF-κB訊號傳導的減少。
NF-κB訊號傳導的活化誘導促炎性細胞因子的分泌是現有技術中熟知的。IL-8是在人類中被充分表徵的NF-κB響應性促炎性細胞因子。因此，評價了以上提及的細胞培養物的培養物上清液中的IL-8分泌，以觀察該IL-8分泌是否也反應於細菌(肺炎克雷伯桿菌或銅綠假單胞菌)和IgM(參見圖4B)。分泌進上清液中的IL-8細胞因子使用AlphaLISA IL-8免疫測定試劑盒(Perkin-Elmer,Waltham,MA USA)根據製造商的操作方案通過AlphaLISA來測量。
類似於NF-κB活化，單獨的經甲醛固定的細菌誘導IL-8的分泌，而相對於僅單獨處理的培養物，用該細菌和IgM的共處理顯示減少的IL-8分泌(參見圖4B)。
實施例4.分析IgM對外周血單核細胞增殖的影響。
由於IgM顯示明顯的對於NF-κB促炎性途徑的效應，因此還評價了純化的IgM是否對免疫功能具有更普遍的效應。由抗原刺激的血液淋巴細胞，特別是T細胞的增殖是最基本的促炎性免疫反應中的一種。
使用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和離子黴素(一種非常常見的增殖刺激物)來誘導外周血單核細胞，更確切地講是血液T-淋巴細胞或T細胞的增殖。
在具有10%熱滅活的人類血清的RPMI中培養人類外周血單核細胞。對於增殖測定，使用培養基將3x105個細胞接種在96孔板的每個孔中。
T細胞用10ng/mL PMA和0.5μM離子黴素處理3天。在使用IgM的情況下，在處理時，視情況而定，用純化的IgM(以約5mg/mL的終濃度和至少95%的純度)處理或共處理細胞。
對於不同組的細胞滴度使用Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)測量(根據製造商的說明書進行)，並基於將對細胞增殖的誘導的測量值作為ATP含量的函數。
在PMA/離子黴素刺激3天後，在外周血單核細胞中觀察到增殖的顯著增加(參見圖5)。相對於對照未處理的細胞及相對於PMA/離子黴素處理，在存在或不存在PMA/離子黴素下，用IgM處理細胞降低了外周血單核細胞的增殖。由於PMA/離子黴素是極強的、極為非特異的促細胞***原，該觀察結果是高度令人驚訝的。這表明IgM本身 具有對免疫反應的調節作用。

Claims (14)

  1. 一種醫藥組合物用於製備在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症之藥物的用途，該醫藥組合物包括包含免疫球蛋白M(IgM)的組合物，其中該感染係由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、困難梭狀芽孢桿菌、或其組合產生，其中該免疫併發症的治療通過免疫調節來進行，且該免疫調節通過抑制NF-κB誘導、通過抑制外周血單核細胞的增殖或其組合來進行，且其中該組合物具有至少90%(w/v)的免疫球蛋白M(IgM)純度。
  2. 如請求項1所記載之醫藥組合物用於製備在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症之藥物的用途，其中該組合物具有95%(w/v)的免疫球蛋白M(IgM)純度。
  3. 如請求項1所記載之醫藥組合物用於製備在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症之藥物的用途，其中該組合物的待施用的劑量為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者。
  4. 如請求項3所記載之醫藥組合物用於製備在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症之藥物的用途，其中該組合物係至少一週一次施用。
  5. 如請求項1所記載之醫藥組合物用於製備在需要其的 患者中治療由感染產生的免疫併發症之藥物的用途，其中該免疫球蛋白M(IgM)是重組的、血漿來源的、細胞培養物來源的、轉基因的或化學合成的。
  6. 如請求項5所記載之醫藥組合物用於製備在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症之藥物的用途，其中該免疫球蛋白M(IgM)是從合適的血漿級分分離的血漿來源的免疫球蛋白M(IgM)。
  7. 如請求項1所記載之醫藥組合物用於製備在需要其的患者中治療由感染產生的免疫併發症之藥物的用途，其中該包含免疫球蛋白M(IgM)的組合物係單獨地施用。
  8. 一種醫藥組合物用於製備治療敗血症之藥物的用途，該醫藥組合物包括包含免疫球蛋白M(IgM)的組合物，其中該敗血症由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、困難梭狀芽孢桿菌、或其組合產生，其中該敗血症的治療通過免疫調節來進行，且該免疫調節通過抑制NF-κB誘導、通過抑制外周血單核細胞的增殖或其組合來進行，且其中該組合物具有至少90%(w/v)的免疫球蛋白M(IgM)純度。
  9. 如請求項8所記載之醫藥組合物用於製備治療敗血症之藥物的用途，其中該組合物具有95%(w/v)的免疫球蛋白M(IgM)純度。
  10. 如請求項8所記載之醫藥組合物用於製備治療敗血症 之藥物的用途，其中該組合物的待施用的劑量為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者。
  11. 如請求項10所記載之醫藥組合物用於製備治療敗血症之藥物的用途，其中該組合物係至少一週一次施用。
  12. 如請求項8所記載之醫藥組合物用於製備治療敗血症之藥物的用途，其中該免疫球蛋白M(IgM)是重組的、血漿來源的、細胞培養物來源的、轉基因的或化學合成的。
  13. 如請求項12所記載之醫藥組合物用於製備治療敗血症之藥物的用途，其中該免疫球蛋白M(IgM)是從合適的血漿級分分離的血漿來源的免疫球蛋白M(IgM)。
  14. 如請求項8所記載之醫藥組合物用於製備治療敗血症之藥物的用途，其中該包含免疫球蛋白M(IgM)的組合物係單獨地施用。
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