TWI713876B - 萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途。該萊菔子發酵物係藉由對一萊菔子水萃取物進行釀酒酵母、胚芽乳酸桿菌、及醋化醋酸桿菌之三階段發酵而製得，其能抑制巨噬細胞中的氧化型低密度脂蛋白之結合受器的基因表現及減少細胞內脂肪累積，因此抑制泡沫細胞形成，進而降低個體發生動脈粥狀硬化的風險及預防罹患心血管疾病。

Description

萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途
本發明係關於一種植物發酵物的保健用途，特別係關於一種萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途。
心臟及腦血管疾病是近年來國人的十大死因之二，其致病主因為動脈粥狀硬化(atherosclerosis)。簡言之，動脈粥狀硬化是因為動脈中膽固醇累積導致血管管壁增厚、失去彈性、及管徑變小，因此血流不順的狀況。先前研究顯示在動脈硬化發展過程中，血液中過量的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)攜帶膽固醇會積聚在動脈內壁並且氧化為具有細胞毒性的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)，因而引起血管的發炎反應，吸引單核球進入血管內皮及分化為巨噬細胞。其後，巨噬細胞會透過細胞表面的蛋白質受器(receptor)與氧化型低密度脂蛋白結合並將其吞噬，進而形成含有大量油滴的泡沫細胞(foam cell)。泡沫細胞之累積可能造成脂肪斑塊(fatty streak)形成，配合血管平滑肌細胞分泌的大量膠原纖維，最終可能形成動脈粥狀硬化斑塊，其會加劇發炎反應及增加血栓形成機率，甚至造成心絞痛、急性心肌梗塞、及中風。
避免動脈粥狀硬化的首要策略便是透過均衡飲食或運動等方式降低血中脂肪含量，特別是減少三酸甘油脂與低密度脂蛋白膽固醇。減少動脈粥狀硬化的危險因子，如高血壓、糖尿病、吸菸等，亦是預防動脈粥狀硬化的重要方法。其他策略包括減少血管發炎及抑制泡沫細胞形成。鑒於動脈粥狀硬化的成因複雜，為從各方面預防其發生及惡化，開發一種以抑制泡沫細胞形成為標的之新穎組合物，以提升動脈粥狀硬化之防治效果，實有其必要。
緣此，本發明之一目的在提供一種萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途，其中，該萊菔子發酵物係藉由以下步驟製得：(a)以水萃取一萊菔子(seeds of Raphanus raphanistrum subsp.sativus)而獲得一萊菔子萃取物，(b)添加一釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)至該萊菔子萃取物及進行發酵以獲得一第一中間發酵物，(c)添加一胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)至該第一中間發酵物及進行發酵以獲得一第二中間發酵物，以及(d)添加一醋化醋酸桿菌(Acetobacter aceti)至該第二中間發酵物及進行發酵以獲得該萊菔子發酵物。
在本發明之一實施例中，該釀酒酵母之發酵時間為1至2天，該胚芽乳酸桿菌之發酵時間為1至3天，及該醋化醋酸桿菌之發酵時間為14至21天。
在本發明之一實施例中，該釀酒酵母的添加量為該萊菔子萃取物重量的0.01%至0.5%，該胚芽乳酸桿菌的添加量為該萊菔子萃取物重量的0.01%至0.25%，及該醋化醋酸桿菌的添加量為該萊菔子萃取物重量的1%至20%。
在本發明之一實施例中，該萊菔子與水的重量比為1：5至1：10，且該萃取係在50℃至100℃進行。
在本發明之一實施例中，該萊菔子發酵物的濃度為至少2% w/v。
在本發明之一實施例中，該萊菔子發酵物減少一巨噬細胞之脂肪累積，因其抑制該巨噬細胞中的一氧化型低密度脂蛋白之結合受器的基因表現，故而減少該巨噬細胞對氧化型低密度脂蛋白之攝取。
在本發明之一實施例中，該氧化型低密度脂蛋白之結合受器為係為一白血球分化抗原36(cluster of differentiation 36，CD36)、一巨噬細胞清除受器(macrophage scavenger receptor，MSR)、或其組合。
本發明基於細胞實驗揭示經過特定發酵過程之萊菔子發酵物能抑制巨噬細胞中的氧化型低密度脂蛋白結合受器之基因表現，減少巨噬細胞內脂肪累積，最終抑制泡沫細胞形成。因此，本發明提供萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途，該組合物可具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型，且可製成食品、飲品、藥品、試劑或營養補充劑，藉由口服方式給予一個體。
鑒於先前研究顯示泡沫細胞形成是動脈粥狀硬化發展過程中的一致病因子，對一個體施予能抑制泡沫細胞形成的萊菔子發酵物可避免該個體血管內壁堆積泡沫細胞，進而降低發生動脈粥狀硬化的風險及預防罹患心血管疾病。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1顯示巨噬細胞經白藜蘆醇、萊菔子水萃取物、或萊菔子發酵物處理再與氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)及脂多醣(LPS)共培養後，其細胞內油紅O之相對含量。
圖2顯示巨噬細胞經萊菔子水萃取物或萊菔子發酵物處理再與氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)及脂多醣(LPS)共培養後，其血球分化抗原36(CD36)與巨噬細胞清除受器(MSR)基因之相對表現量。
本發明提供一種萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途。本發明之萊菔子發酵物係經水萃取及三階段發酵而製得，具體而言，該萊菔子發酵物之製備包含如下步驟：(a)以水萃取一萊菔子而獲得一萊菔子萃取物，(b)添加一釀酒酵母至該萊菔子萃取物及進行發酵以獲得一第一中間發酵物，(c)添加一胚芽乳酸桿菌至該第一中間發酵物及進行發酵以獲得一第二中間發酵物，以及(d)添加一醋化醋酸桿菌至該第二中間發酵物及進行發酵以獲得該萊菔子發酵物。該萊菔子發酵物經實驗證實能抑制巨噬細胞中的氧化型低密度脂蛋白結合受器的基因表現，如CD36及MSR之基因表現，並且減少巨噬細胞內的脂肪累積，故能抑制泡沫細胞的形成。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
材料與方法 微生物
自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)購買釀酒酵母(BCRC 20271)、胚芽乳酸桿菌(BCRC 910805)、及醋化醋酸桿菌(BCRC 11688)。
細胞培養
以下實施例使用購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之人類單核細胞株(human monocytic cell line)THP-1(ATCC TIB-202)。該THP-1細胞在37℃、5%二氧化碳的條件下培養於添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.05mM 2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、100單位/mL青黴素、及100μg/mL鏈黴素之RPMI 1640培養基(Gibco RPMI medium 1640；Thermo Fisher Scientific)，以下稱RPMI細胞培養基。
油紅O染液之製備
將染劑油紅O(Oil red O；購自Sigma)徹底溶解於100%異丙醇(isopropanol；購自Echo chemical)以配製30mg/mL之油紅O儲備溶液。為獲得可使用的油紅O染液，於使用前即時將該儲備溶液以二次水稀釋至濃度18mg/mL並以0.22m濾膜過濾。
油紅O染色
細胞中的脂肪含量係藉由油紅O染色測定。染色前，使用磷酸緩衝鹽溶液(簡稱PBS溶液；購自Thermo Fisher Scientific)清洗細胞，再以10%甲醛(formaldehyde；購自Echo chemical)固定細胞10分鐘。該固定的細胞經PBS溶液清洗1次後，以60%異丙醇潤洗15秒。其後，以油紅O染液對細胞染色1分鐘，再以60%異丙醇退染15秒。染色後細胞經PBS溶液清洗即以顯微鏡(ZEISS Axio Vert.A1)觀察，或以100%異丙醇溶解細胞內染劑以進行定量。定量結果以Excel軟體之學生t檢定進行統計分析。
基因表現量分析
基於定量聚合酶鏈鎖反應(quantitative polymerase chain reaction，簡稱qPCR)測定巨噬細胞中有關於攝入氧化型低密度脂蛋白的蛋白質受體的基因表現量，其步驟簡述如下。依據廠商使用說明，利用RNA萃取套組(RNA Extraction Kit；Geneaid)自細胞分離出核醣核酸(RNA)，於37℃下以反轉錄酶SuperScript® III Reverse Transcriptase(Invitrogen)將2000ng RNA反轉錄為cDNA。其後，利用qPCR套組(KAPA CYBR FAST qPCR Kit(2X)；KAPA Biosystems)以及CD36、MSR等目標基因與作為內部對照之β-肌動蛋白(β-actin)基因ACTB之引子對(表1)在PCR反應儀(Step One Plus Real-Time PCR system；Applied Biosystems)對前述cDNA進行qPCR，以取得解鏈曲線(melting curve)。
Figure 107128482-A0101-12-0005-2
最終，使用2-△△CT方法測定目標基因的相對表現量。該方法以GAPDH基因的循環閾值(CT)作為內部對照之參考基因的循環閾值，按照以下公式計算相對倍數變化：△CT=實驗組或控制組的目標基因的CT-內部對照的CT
△△CT=實驗組的△CT-控制組的△CT
倍數變化=2 -△△Ct 平均值
統計分析係使用Excel軟體中的STDEV函數計算各基因相對表現量的標準差，並以單尾學生t檢定(TTEST)計算統計上差異。
實施例1 萊菔子發酵物之製備
首先，洗淨蘿蔔的成熟乾燥種子(即萊菔子)，再將水與萊菔子混合以進行萃取及獲得一萊菔子萃取物。該萊菔子與水之重量比為1：5至1：10。 萃取溫度為介於50℃至100℃，較佳為80℃至95℃。本實施例中萃取時間為0.5至3小時。該萃取開始前添加5%至15%(w/v)之葡萄糖至萊菔子與水之混合物。
經上述步驟所得萊菔子萃取物冷卻至室溫後用於三階段發酵。各階段的較佳發酵條件如下：
階段一：添加釀酒酵母(BCRC 20271)至該萊菔子萃取物及於25℃至35℃進行發酵1至2天以獲得一第一發酵物。該釀酒酵母的添加量為該萊菔子萃取物重量的0.01%至0.5%。
階段二：添加胚芽乳酸桿菌(BCRC 910805)至該第一發酵物及於25℃至35℃進行發酵1至3天以獲得一第二發酵物。該胚芽乳酸桿菌的添加量為該萊菔子萃取物重量的0.01%至0.25%。
階段三：添加醋化醋酸桿菌(BCRC 11688)至該第二發酵物及於25℃至35℃進行發酵14至21天以獲得一萊菔子發酵物。該醋化醋酸桿菌的添加量為該萊菔子萃取物重量的1%至20%。
該萊菔子發酵物可透過200至400目(mesh)之濾網過濾以移除殘餘固體物。該過濾後的萊菔子發酵物可進一步在45℃至70℃進行減壓濃縮而獲得一濃縮產物。經過濃縮的萊菔子發酵物可選擇性地添加1-3%(w/w)檸檬酸及40-70%(w/w)異麥芽寡糖。最終，經加工處理的萊菔子發酵物於後續利用前於95℃至120℃滅菌70至90分鐘。
實施例2 萊菔子發酵物減少巨噬細胞之脂肪累積及泡沫細胞之形成
為探討本發明萊菔子發酵物對巨噬細胞形成泡沫細胞的影響，本實施例以油紅O染色分析由人類單核細胞株THP-1分化而得之巨噬細胞經萊菔子發酵物處理後，其脂肪含量的變化。首先，將THP-1細胞依2×105個細胞/孔接種於含有2mL RPMI細胞培養基的6孔盤的各孔，再以500nM佛波醇-12-肉蔻酯-13-乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；Sigma-Aldrich)處理該細胞48小時以誘導其分化為巨噬細胞。其後，更新細胞培養基並在37℃培養該巨噬細胞48小時，再以下列方式處理各孔細胞：(a)施以2mL RPMI培養基1小時(控制組)；(b)施以2mL RPMI培養基1小時，再施以50μg/mL人類氧化型低密度脂蛋白(購自Athens Research & Technology)及100ng/mL脂多醣(lipopolysaccharide，LPS； Sigma)(ox-LDL/LPS組)；(c)施以2mL含2.5μM白藜蘆醇之RPMI培養基1小時，再施以50μg/mL氧化型低密度脂蛋白及100ng/mL脂多醣(ox-LDL/LPS+白藜蘆醇組)；(d)施以2mL含2%(w/v)萊菔子水萃取物之RPMI細胞培養基1小時，再施以50μg/mL氧化型低密度脂蛋白及100ng/mL脂多醣(ox-LDL/LPS+萊菔子水萃取物組)；及(e)施以2mL含2%(w/v)萊菔子發酵物之RPMI細胞培養基1小時，再施以50μg/mL氧化型低密度脂蛋白及100ng/mL脂多醣(ox-LDL/LPS+萊菔子發酵物組)。前述各組細胞於37℃培養24小時後，移除培養基，以PBS溶液清洗細胞後進行油紅O染色及定量分析。
圖1顯示前述各組細胞內油紅O之相對含量，其係相對於控制組細胞之油紅O含量的百分比；##表示相比控制組為p<0.01，**及***分別表示相比ox-LDL組為p<0.01及p<0.001，▲▲表示相比ox-LDL+萊菔子水萃取物組為p<0.01。依據圖1，施予氧化型低密度脂蛋白以及刺激發炎反應之脂多醣會顯著增加巨噬細胞內的脂肪含量，但萊菔子發酵物之額外處理顯著抑制該脂肪含量增加，使細胞中的油紅O相對含量下降至約80%。此外，萊菔子水萃取物無法顯著減少ox-LDL/LPS刺激下增加的脂肪。此結果顯示本發明萊菔子發酵物能有效減少脂肪累積於巨噬細胞內，因此抑制泡沫細胞之形成。
實施例3 萊菔子發酵物抑制氧化型低密度脂蛋白結合受器之基因表現
為探討本發明萊菔子發酵物對巨噬細胞的脂肪攝取相關基因表現的影響，以qPCR測定THP-1細胞分化而得之巨噬細胞經萊菔子發酵物處理後，其氧化型低密度脂蛋白結合受器白之基因表現變化。首先，將THP-1細胞依2×105個細胞/孔接種於含有2mL RPMI細胞培養基的6孔盤的各孔，再以500nM PMA處理該細胞48小時以誘導其分化為巨噬細胞。其後，更新細胞培養基並在37℃培養該巨噬細胞48小時，再以下列方式處理各孔細胞：(a)施以2mL RPMI培養基1小時(控制組)；(b)施以2mL RPMI培養基1小時，再施以50μg/mL氧化型低密度脂蛋白及100ng/mL脂多醣(ox-LDL/LPS組)；(c)施以2mL含2%(w/v)萊菔子水萃取物之RPMI細胞培養基1小時，再施以50μg/mL氧化型低密度脂蛋白及100ng/mL脂多醣(ox-LDL/LPS+萊菔子水萃取物組)；及(d)施以2mL含2%(w/v)萊菔子發酵物之RPMI細胞培養基1小時，再施以50μg/mL氧化型低密度脂蛋白及 100ng/mL脂多醣(ox-LDL/LPS+萊菔子發酵物組)。前述各組細胞於37℃培養24小時後用於qPCR分析。
圖2顯示前述各組細胞之血球分化抗原36(CD36)與巨噬細胞清除受器(MSR)基因的相對表現量，其係相對於控制組細胞中相同基因之RNA含量的比值；*及**分別表示相比ox-LDL/LPS組為p<0.05及p<0.01。依據圖2，施予氧化型低密度脂蛋白以及刺激發炎反應之脂多醣會略為增加巨噬細胞內MSR的基因表現，但萊菔子發酵物之額外處理顯著抑制MSR的基因表現。此外，萊菔子發酵物會使ox-LDL/LPS刺激下減少的CD36基因表現有更明顯下降。相對地，相比ox-LDL/LPS組，萊菔子水萃取物之額外處理僅顯著減少MSR的基因表現，但未顯著影響CD36基因表現。此結果說明萊菔子發酵物能較全面地抑制巨噬細胞中的氧化型低密度脂蛋白結合受器之基因表現，因此有效減少巨噬細胞對氧化型低密度脂蛋白之攝取及細胞內脂肪累積。
綜上所述，上述實驗顯示經過特定發酵過程之萊菔子發酵物能抑制巨噬細胞中的氧化型低密度脂蛋白結合受器之基因表現，減少巨噬細胞內脂肪累積，最終抑制泡沫細胞形成。因此，本發明提供萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途，該組合物可具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型，且可製成食品、飲品、藥品、試劑或營養補充劑，藉由口服方式給予一個體。
<110> 大江生醫股份有限公司
<120> 萊菔子發酵物用於製備抑制泡沫細胞形成之組合物之用途
<130> 107B0208-I1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)

  1. 一種萊菔子發酵物用於製備直接抑制巨噬細胞攝取脂肪之組合物之用途，其中該萊菔子發酵物係藉由以下步驟製得：(a)以水萃取一萊菔子而獲得一萊菔子萃取物；(b)添加一釀酒酵母至該萊菔子萃取物及進行發酵以獲得一第一中間發酵物；(c)添加一胚芽乳酸桿菌至該第一中間發酵物及進行發酵以獲得一第二中間發酵物；以及(d)添加一醋化醋酸桿菌至該第二中間發酵物及進行發酵以獲得該萊菔子發酵物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該釀酒酵母之發酵時間為1至2天，該胚芽乳酸桿菌之發酵時間為1至3天，及該醋化醋酸桿菌之發酵時間為14至21天。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該釀酒酵母的添加量為該萊菔子萃取物重量的0.01至0.5%，該胚芽乳酸桿菌的添加量為該萊菔子萃取物重量的0.01至0.25%，及該醋化醋酸桿菌的添加量為該萊菔子萃取物重量的1至20%。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該萊菔子與水的重量比為1：5至1：10。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該萃取係在50℃至100℃進行。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該萊菔子發酵物的濃度為至少2% w/v。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該萊菔子發酵物減少該巨噬細胞對氧化型低密度脂蛋白之攝取。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該萊菔子發酵物抑制該巨噬細胞中的一氧化型低密度脂蛋白結合受器的基因表現。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該氧化型低密度脂蛋白結合受器係為一白血球分化抗原36(cluster of differentiation 36)、一巨噬細胞清除受器(macrophage scavenger receptor)、或其組合。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型。
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曹彥"萊菔子水溶性生物堿防治高血脂致動脈粥樣硬化作用及機制的實驗研究." 長春中醫藥大學，中醫內科學，碩士論文，2011年04期 *
曹彥"萊菔子水溶性生物堿防治高血脂致動脈粥樣硬化作用及機制的實驗研究." 長春中醫藥大學，中醫內科學，碩士論文，2011年04期。

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