TWI704155B - 雙特異性抗體之純化平台 - Google Patents

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班傑明 亞當斯
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Abstract

應用離液劑(chaotropic agent)和pH梯度或pH階層溶離緩衝劑之高解析A蛋白質層析，造成緊密相關的分子種類間之改善的波峰解析度。以高波峰解析將含有與A蛋白質-結合CH3區配對之A蛋白質-結合-燒蝕取代CH3區的雙特異性抗體和含有與A蛋白質-結合-燒蝕取代的CH3區配對之A蛋白質-結合-燒蝕取代的CH3區之單特異性抗體以及含有與A蛋白質-結合CH3區配對之A蛋白質-結合CH3區的單專一性抗體分離。有用的離液劑包括氯化鎂和氯化鈣。

Description

雙特異性抗體之純化平台
提供一種從蛋白質的複合混合物中經由親和性層析法純化特異性多聚體蛋白質之方法。特言之係提供一種用於從單體及同型二聚體之複合混合物中經由親和性層析(包括A蛋白質層析)使用離液劑分離異型二聚體(包括雙特異性抗體)之方法。
已提出有多種的雙特異性抗體模式且目前正在開發中。其中一種此模式係以具有改良的藥物動力學樣貌及最小的致免疫性之標準的全人類IgG抗體為基準(參見美國專利第8,586,713號，其係以全文引用的方式併入本文中)。一條單一共有的輕鏈和二條不同的重鏈組合，形成雙特異性。其中一條重鏈含有經取代的Fc序列(以下稱為「Fc*」)，其係減低或消除Fc*與A蛋白質結合。例如，一此Fc*序列係在CH3區含有H435R/Y436F(EU編碼系統；IMGT外顯子編碼系統為H95R/Y96F)取代。因二條重鏈和共有輕鏈之共表現結果，創造出三種產物：其中二種為重鏈之同型二聚體及其中一種為所欲的異型二聚體雙特異性產物。相較於高親和力FcFc重鏈同型二聚體或弱結合的Fc*Fc*同型二聚體，由於對A蛋白質之中級的結合親和力，Fc*序列讓FcFc*雙特異性產物之選擇性純化得以在市售的親和力管柱中進行。
為了達到商業等級的雙特異性異型二聚體之純化，需要FcFc同型二聚體、Fc*Fc異型二聚體及Fc*Fc*同型二聚體之間良好的解析度。本處，申請人描述了一種將這三種分子形式的解析度最適化之改良的分離方法。
在一或多方面及其實施例中，本發明係關於藉由應用親和力捕捉和溶離程序，從包括同型二聚體和異型二聚體之蛋白質的複合混合物中純化異型二聚體蛋白質，例如雙特異性抗體之方法。在一方面，本發明係關於藉由任一這些方法所製造的純化異型二聚體蛋白質。
在第一方面，本發明係關於製造蛋白質的方法，其包括將多聚體蛋白質之混合物載入親和性基質上，及然後溶離並於特定的pH範圍及在含有離液劑之緩衝液中從該基質收集異型二聚體之步驟。在一實施例中，此親和性基質最初為每公升的親和性基質載入5至50克蛋白質。在某些情況下，多聚體蛋白質之混合物係藉由多數個真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞於一細胞培養中所產生。
在一實施例中，多聚體蛋白質之混合物係含有(i)包括二個複製第一多肽之第一同型二聚體，(ii)包括第一多肽和第二多肽之異型二聚體，及視需要(iii)包括二個複製第二多肽之第二同型二聚體。本處，此第一和第二多肽對親和性基質具有不同的親和力，使得第一同型二聚體、異型二聚體和第二同型二聚體可在對親和性基質的差別性結合基礎上，將其分離。
對親和性基質的差別性結合可藉由改變其中包括通過親和性基質之溶液的pH及/或離子強度來操作。加入離液劑至溶液中增進了從親和性基質溶離各二聚體，藉此增加各個別二聚體種類的純度。在一實施例中，此異型二聚體係在具有第一pH範圍之緩衝液中從親和性基質溶離出，而第一同型二聚體係在具有第二pH範圍之緩衝液中從親和性基質溶離出。收集此異型二聚體。在一視需要的實施例中，其中此第二同型二聚體係包括在多聚體的混合物中，此第二同型二聚體係在無結合下流過管柱或係在具有第三pH範圍的沖洗緩衝液中從親和性基質溶離出。此第三pH範圍係包括一高於第一pH範圍的pH，其包括高於第二pH範圍之pH。
在一實施例中，親和性基質係包括附著於基材(substrate)之A蛋白質配體。在某些情況下，此基材為微珠或粒子，使得此親和性 基質為附著A蛋白質之多數個粒子。A蛋白質可為天然生成的或修飾的葡萄球菌A蛋白質，或其可為工程化的A蛋白質。工程化的A蛋白質可為例如Z-區四聚體、Y-區四聚體，或缺乏D和E區之工程化A蛋白質。這些工程化的A蛋白質範例不能與免疫球蛋白質的VH3區結合，但仍可與IgG1、IgG2和IgG4的CH3區結合。
在某些例子下，此親和性基質基材係含有或係由瓊脂、聚(苯乙烯二乙烯苯)、聚甲基丙烯酸酯、受控孔度玻璃、球形矽氧、纖維素及其類似物所製成。在其中此基材為微珠或粒子形狀之實施例中，粒子的平均直徑係從25μm至100μm。在某些實施例中，此等粒子具有35μm、45μm、60μm、75μm或85μm之平均直徑。在一特別的實施例中，此等粒子具有45μm之平均直徑及含有具有1100Å平均直徑的孔洞。
在某些實施例中，在起初將有蛋白質混合物載入親和性基質後，以具有大於pH 5之pH的緩衝液沖洗基質。在某些案例中，此緩衝液係包括pH 7.2之20mM磷酸鈉。當第二同型二聚體係包括在蛋白質混合物中時，係在此沖洗緩衝液中從親和性基質沖洗此第二同型二聚體。因此，本處此沖洗緩衝液為第三pH範圍。
在某些實施例中，將一緩衝的pH梯度施用於載入的親和性基質，或另一種選擇，將連續的溶離緩衝液，各自具有不同的pH施用於載入的親和性基質。在一實施例中，此pH梯度在pH 6至pH 3運作。第一pH範圍，在其內異型二聚體係從親和性基質溶離出，為約pH 5.5至約pH 3.6。在某些案例中，此溶離緩衝液及/或緩衝的pH梯度係含有適合的緩衝劑，例如檸檬酸鹽、乙酸鹽、4-嗎福啉乙磺酸鹽(MES)、檸檬酸鹽-磷酸鹽、琥珀酸鹽及其類似物，其在一實施例中為40mM乙酸鹽，以及離液劑。此離液劑可為具有選自鋰、鎂、鈣和胍鎓之陽離子，及選自氯、硝酸根、溴、氯酸根、碘、過氯酸根和硫氰酸根之陰離子的鹽。在一特別的實施例中，此離液劑為CaCl2，例如250-500mM CaCl2。在另外的特別實施例中，此離液劑為MgCl2，例如250-500mM MgCl2。
在一實施例中，此異型二聚體為一雙特異性抗體。本處，此第一多肽係包括一能與A蛋白質結合的CH3區(「Fc」)，而此第二多肽係包括一不能與A蛋白質結合的CH3區(「Fc*」)。在某些案例中，此第二多肽係在其CH3區包括一H435R/Y436F(以EU編號系統；以IMGT外顯子編號系統為H95R/Y96F)取代(亦稱為「Fc*」或「星號取代」)。因此，在某些實施例中，第一同型二聚體為一具有未經取代CH3區之單特異性抗體(亦即FcFc)；第二同型二聚體為一具有二個經H435R/Y436F取代的CH3區之單特異性抗體(亦即Fc*Fc*)；及異型二聚體為具有一未經取代CH3區和一經H435R/Y436F取代的CH3區之雙特異性抗體(亦即Fc*Fc)。
在一實施例中，係將從親和性基質收集的異型二聚體隨後載入更酸性pH之層析介質中，並從缺乏離液劑(或具有較低量或微量離液劑)之更鹼性的緩衝液中從此介質溶離出。在一案例中，此層析介質為一多模態層析樹脂。此異型二聚體可進一步純化。
在第二方面，係先藉由將混合物施用於第一親和性基質使得第一同型二聚體和異型二聚體與基質結合，同時讓第二同型二聚體通過並丟棄，將第二同型二聚體從蛋白質混合物中移除。隨後從第一親和性基質溶離第一同型二聚體和異型二聚體及然後隨後施用於第二親和性基質。在一實施例中，第一親和性基質最初係以每公升的親和性基質載入5至50克的蛋白質。多聚體蛋白質之混合物在某些案例中係藉由多數個真核細胞所產生，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞之細胞培養。
在一實施例中，施用於第一親和性基質之多聚體蛋白質的混合物係含有(i)包括二個複製第一多肽之第一同型二聚體，(ii)包括第一多肽和第二多肽之異型二聚體，及(iii)包括二個複製第二多肽之第二同型二聚體。本處，此第一和第二多肽對第一親和性基質以及對第二親和性基質具有不同的親和力，使得第一同型二聚體、異型二聚體和第二同型二聚體可在對第一及/或第二親和性基質的差別性結合基礎上，將其分離。
在一實施例中，第一親和性基質係包括附著於基材之缺乏與免疫球蛋VH3區結合能力的工程化A蛋白質配體。在某些案例中，此A蛋白質係缺乏D-區和E-區，例如包括Z-四聚體或Y-四聚體之工程化蛋白質。
第一同型二聚體和異型二聚體對第二親和性基質之差別性結合可藉由改變其中包括通過親和性基質之溶液的pH及/或離子強度來操作。加入離液劑至溶液中增進了以非重疊的分溶液從第二親和性基質溶離各二聚體種類，藉此增加各二聚體種類的純度。在一實施例中，此異型二聚體係在具有第一pH範圍之緩衝液中從第二親和性基質溶離出，而第一同型二聚體係在具有第二pH範圍之緩衝液中從第二親和性基質溶離出。收集異型二聚體。本處，第一pH範圍係包括高於第二pH範圍之pH。
在一實施例中，第二親和性基質係包括附著於一基材之A蛋白質配體。在某些案例中，此基材為微珠或粒子，使得第二親和性基質為一附著A蛋白質配體之多數個粒子。A蛋白質可為天然生成的或修飾的葡萄球菌A蛋白質，或其可為工程化的A蛋白質。工程化的A蛋白質可為例如Z-區四聚體、Y-區四聚體，或缺乏D和E區之另外的工程化A蛋白質。這些工程化的A蛋白質分子不能與免疫球蛋白質的VH3區結合(或就算有，係以非常低的親和力結合)，但仍能與IgG1、IgG2和IgG4的CH3區結合。
在某些案例中，此基材係含有或係由瓊脂、聚(苯乙烯二乙烯苯)、聚甲基丙烯酸酯、受控孔度玻璃、球形矽氧、纖維素(例如HYPERCEL)及其類似物所製成。在該等其中此基材為微珠或粒子形狀之實施例中，粒子的平均直徑係從30μm至90μm。在某些實施例中，此等粒子具有35μm、45μm、60μm、75μm或85μm之平均直徑。在一特別的實施例中，此等粒子具有45μm之平均直徑及包含具有1100Å平均直徑的孔洞。
在某些實施例中，在起初將第二親和性基質載入第一同型二聚體和異型二聚體混合物之後，以具有大於pH 5之pH的緩衝液沖洗基 質。在某些案例中，此緩衝液係包括pH 5-8.5，例如pH 7.2之20mM磷酸鈉。在某些實施例中，係將緩衝的pH梯度施用於載入的親和性基質，或另一種選擇，將各自具有不同pH的連續溶離緩衝液，施用於載入的第二親和性基質。在一實施例中，此pH梯度係在pH 6至pH 2.5下運作。第一pH範圍，在其內異型二聚體係從親和性基質溶離出，為約pH 5.5至約pH 3.6。在某些例子中，此溶離緩衝液及/或緩衝的pH梯度係含有乙酸鹽，其在一實施例中為40mM乙酸鹽，以及離液劑。此離液劑可為一具有選自鋰、鎂、鈣和胍鎓之陽離子，及一選自氯、硝酸根、溴、氯酸根、碘、過氯酸根和硫氰酸根之陰離子的鹽。在一特別的實施例中，此離液劑為CaCl2，例如500mM CaCl2。在另外的特別實施例中，此離液劑為MgCl2，例如500mM MgCl2。
在一實施例中，此異型二聚體為一雙特異性抗體。本處，此第一多肽係包括一能與A蛋白質結合的CH3區(「Fc」)，而此第二多肽係包括一不能與A蛋白質結合的CH3區(「Fc*」)。在某些例子中，第二多肽係在其CH3區包括H435R/Y436F(亦稱為「星號」)取代(「Fc*」)。因此，在某些實施例中，第一同型二聚體為具有未經取代CH3區(亦即FcFc)之單特異性抗體；第二同型二聚體為具有二個經H435R/Y436F取代的CH3區(亦即Fc*Fc*)之單特異性抗體；及異型二聚體為具有未經取代CH3區和經H435R/Y436F取代的CH3區(亦即Fc*Fc)之雙特異性抗體。
在一實施例中，係將從第二親和性基質收集的異型二聚體隨後載入更酸性pH之層析介質中，並從此介質以更鹼性的緩衝液及無離液劑(或降低量或微量的離液劑)下溶離出。在一例子中，此層析介質為一多模態層析樹脂。此異型二聚體可進一步純化。
在第三方面，本發明係關於根據上述方面之方法所製造的純化異型二聚體。在一實施例中，此異型二聚體為雙特異性抗體。
詳細說明
本發明不限於所述的特定方法和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將係由所附的申請專利範圍所定義。
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。雖然在施行或試驗本發明時可使用任何類似或相當該等與文中所述的方法和物質，但特定的方法和物質為目前所述。所提及的所有刊物特此係以全文引用的方式併入。
術語「抗體」，如文中所用，係包括藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈(二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈)所組成的免疫球蛋白質分子。各重鏈係包括一重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH)及一重鏈恆定區。重鏈恆定區係包括三個區CH1、CH2和CH3區。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL)及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區係包括一個CL區。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(FR)。各VH和VL係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重鏈CDR可縮寫為HCDR1、HCDR2和HCDR3；輕鏈CDR可縮寫為LCDR1、LCDR2和LCDR3)。術語「高親和力」抗體係指如表面電漿共振，例如BIACORETM或溶液-親和力ELISA所測，該等對其目標具有至少10-9M，至少10-1M；至少10-11M；或至少10-12M之結合親和力的抗體。
「雙特異性抗體」一詞係包括能選擇性結合二或多個表位之抗體。雙特異性抗體一般係包括二條不同的重鏈，其中各重鏈係特異性結合不同的表位-在二個不同的分子上(例如抗原)或在相同的分子上。若雙特異性抗體能選擇性結合二個不同的表位(第一表位和第二表位)，則第一重鏈對第一表位的親和力一般將至少低於第一重鏈對第二表位之親和力1至2，或3至4個數量級，且反之亦然。經雙特異性抗體所辨識的表位可在相同或不同的目標上(例如在相同或不同的蛋白質上)。雙特異性抗 體可例如藉由將辨識相同抗原上的不同表位之重鏈組合來製造。例如，辨識相同抗原的不同表位之編碼重鏈可變序列的核酸序列可與編碼不同重鏈恆定區之核酸序列融合，且此等序列可在表現一免疫球蛋白質輕鏈的細胞中表現。典型的雙特異性抗體具有二條各具有三個重鏈CDR之重鏈，接著(N-端或C-端)CH1區、絞鏈、CH2區及CH3區，而免疫球蛋白質輕鏈並未賦予抗原結合特異性但可與各重鏈相結合，或可與各重鏈結合及可結合一或多個與重鏈抗原結合區結合之表位，或可與各重鏈結合並使該一或二條重鏈與一或二個表位結合。
除非另有說明係包括一重鏈可變區，否則「重鏈」或「免疫球蛋白質重鏈」一詞係包括來自任何生物之免疫球蛋白質重鏈恆定區序列。除非另有說明，否則重鏈可變區係包括三個重鏈CDR和四個FR區。重鏈的片段包括CDR、CDR和FR，以及其組合。典型的重鏈，在可變區之後，係具有(從N-端至C-端)：CH1區、絞鏈、CH2區及CH3區。重鏈之功能性片段係包括能特異性辨識一抗原(例如，以微莫耳(micromolar)、奈莫耳(nanomolar)或皮莫耳(picomolar)範圍之KD辨識抗原)，其能從細胞表現及分泌，及其係包括至少一CDR之片段。
除非另有說明係包括人類κ和λ輕鏈，否則「輕鏈」一詞係包括來自任何生物之免疫球蛋白質輕鏈恆定區序列。除非另有說明，否則輕鏈可變(VL)區典型地係包括三個輕鏈CDR和四個框架(FR)區。一般而言，全長的輕鏈，從胺基端至羧基端，係包括一包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之VL區，及一輕鏈恆定區。可為本發明所用之輕鏈包括該等，例如不會選擇性結合與抗原結合蛋白質選擇性結合之第一或第二抗原。適合的輕鏈包括該等可藉由針對現存的抗體庫(濕式庫或於矽中)中最常用的輕鏈作篩選加以辨識者，其中輕鏈實質上不會干擾抗原結合蛋白質之抗原結合區的親和力及/或選擇性。適合的輕鏈包括該等可結合一或二個與抗原結合蛋白質之抗原結合區鍵結的表位者。
「可變區」一詞包括免疫球蛋白質輕鏈或重鏈之胺基酸序列(若需要經修飾)，其以從N-端至C-端的順序(除非另有指出)，包括下列胺基酸區：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。「可變區」係包括能摺疊成具有雙β平板結構之典範區(VH或VL)的胺基酸序列，其中該β平板係在第一β平板和第二β平板之殘基間以雙硫鍵相連接。
「互補決定區」或術語「CDR」一詞係包括由生物的免疫球蛋白質基因之核酸序列所編碼的胺基酸序列，其一般(亦即野生型動物)出現在免疫球蛋白質分子(例如抗體或T細胞受體)之輕鏈或重鏈可變區的二個框架區之間。CDR可由，例如，胚源序列或重排或未重排序列，及例如由未成熟或成熟的B細胞或T細胞所編碼。在某些情況下(例如就CDR3)，CDR可由二或多個序列(例如胚原序列)所編碼，其為非毗鄰的(例如未重排的核酸序列)但在B細胞核酸序列中為毗鄰的，例如因剪接或連接序列之結果(例如V-D-J重組而形成一重鏈CDR3)。
「含Fc蛋白質」一詞包括抗體、雙特異性抗體、免疫黏附素(immunoadhesin)及包括至少一免疫球蛋白質CH2和CH3區之功能部份的其他結合蛋白質。「功能部份」係指可結合一Fc受體(例如FcγR；或FcRn，亦即新生的Fc受體)，及/或可參與補體活化之CH2和CH3區。若CH2和CH3區含有刪除、取代及/或***或其他修飾，使其無法結合任何Fc受體且亦無法活化補體，則該CH2和CH3區並不具功能性。
含Fc-蛋白質可在免疫球蛋白質區包括修飾，其包括其中該等修飾係影響一或多個結合蛋白質之效應子功能(例如影響FcγR結合、FcRn結合及因而影響半衰期及/或CDC活性之修飾)。此等修飾包括(但不限於)下列修飾及其組合：就免疫球蛋白質恆定區之EU編號：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、 375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。
例如，但不限於，此結合蛋白質為一含Fc-蛋白質並具有增進的血清半衰期(相較於無所提的修飾之相同的含Fc-蛋白質)且在位置250(例如，E或Q)；250和428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)，254(例如，S或T)，及256(例如，S/R/Q/E/D或T)具有一修飾；或在428及/或433(例如，L/R/SI/P/Q或K)及/或434(例如，H/F或Y)5修飾；或250及/或4285之修飾；或在307或308(例如，308F、V308F)及434之修飾。在另外的實例中，此修飾可包括一428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修飾；一428L,259I(例如，V259I)及一308F(例如，V308F)修飾；一433K(例如，H433K)和一434(例如，434Y)修飾；一252,254及256(例如，252Y、254T和256E)修飾；一250Q和428L修飾(例如，T250Q和M428L)；一307及/或308修飾(例如，308F或308P)。
術語「星號取代」、「Fc*」及「HC*」係包括任何分子、免疫球蛋白質重鏈、Fc片段、含Fc-分子及其類似物，其在CH3區內含有一消除與A蛋白質結合之序列。如先前所述(Lindhofer,H.et al(1995)J.Immunol.155：219-225))，因為人類lgG3不會與A蛋白質結合，其潛在上可類似用於小鼠-大鼠雜交者，與任何其他三種人類IgG亞類共同用於純化策略。然而，雖然全部四種人類IgG亞類的序列為高度同源性，但IgGI、lgG2和lgG4之Fc部份是否容易與lgG3形成異型二聚體仍未知；即使僅優先形成同型二聚體，在特定的環境下(例如從四重雜交瘤中分離)對所欲的異型二聚體之總產率應有負面影響。已有報告提出(Jendeberg,L.et al.(1997)J.Immunological Meth.201：25-34))，lgG3無法結合A蛋白質係由一單一的胺基酸殘基Arg435(EU編號；IMGT為Arg95)所決定，其在其他IgG亞類中的對應位置係由組胺酸殘基所佔。因此可能，取代lgG3，係使用其中His435突變成Arg的IgG1序列。因此，IgG1中的單點突變應足以創造出經得起新的純化流程的不同結合親和力。此修飾將稱為IgGI △A，用以指出其無法結合A蛋白質(及，類似地，lgG2△A和lgG4△A一或更一般地，Fc△A)。
然而，定點突變係透過突變導入一新穎的胜肽序列，其可能為致免疫性的。點突變，理論上應承載至第II型MHC分子上及提呈給T細胞，且因此引起免疫反應。為了避免此項缺陷，可使用二肽突變H435R/Y436F(EU編號；IMGT為H95R/Y96F)。在改變處附近所產生的序列係與IgG3相同，且因此預期在免疫學上應為「察覺不出的」，因為應無非原生的短胜肽可供提呈給T細胞。已有報告提出，此雙突變仍不會結合A蛋白質(Jendeberg,L.et al.(1997)J.Immunological Meth.201：25-34)。最後，此胜肽突變並不包括任何形成Fc二聚體介面之殘基，所以其不可能干擾異型二聚體之形成。此二肽突變係稱為「星號取代」。
術語「細胞」包括任何適合用於表現一重組核酸序列之細胞。細胞包括該等原核細胞和真核細胞(單細胞或多細胞)、細菌細胞(例如，大腸桿菌(E.coli)、牙胞桿菌屬(Bacillus spp.)、鏈黴菌屬(Streptomyces spp.)菌株等)、分歧桿菌細胞(mycobacteria cell)、真菌細胞、酵母菌細胞(例如釀酒酵母菌(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、畢赤酵母(P.pastoris)、嗜甲醇畢赤酵母(P.methanolica)等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如SF-9、SF-21、棒狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物，例如雜交瘤或四重雜交瘤。在某些實施例中，此細胞為人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在某些實施例中，此細胞為真核細胞且係由下列細胞選出：CHO(例如，CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如，HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli細胞、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞之細胞株。在某些實施例中，此細胞係 包括一或多個病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞(例如，PER.C6TM細胞)。
「移動相修飾劑」一詞係包括降低效應或擾亂蛋白質間之非特異性(亦即非親和性)離子和其他非共價相互作用的基團。「移動相修飾劑」包括，例如鹽類、第I族和第II族金屬與乙酸鹽、碳酸氫鹽、鹵素(例如氯或氟)、硝酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽的離子組合。「移動相修飾劑」之非限定說明列表包括乙酸之鈹、鋰、鈉和鉀鹽；碳酸氫鈉和碳酸氫鉀；碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀及碳酸銫；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化銫及氯化鎂；氟化鈉和氟化鉀；硝酸鈉、硝酸鉀及硝酸鈣；磷酸鈉和磷酸鉀；及硫酸鈣和硫酸鎂。
「移動相修飾劑」亦包括離液劑，其係弱化或另外干擾非共價力及增加生物分子系統內的熵。離液劑之非限定實例包括丁醇、氯化鈣、乙醇、鹽酸胍、過氯酸鋰、乙酸鋰、氯化鎂、酚、丙醇、十二烷基硫酸鈉、硫脲及尿素。離液劑包括影響蛋白質溶解度之鹽類。較大離液性的陰離子包括，例如氯、硝酸根、溴、氯酸根、點、過氯酸根及硫氰酸根。較大離液性的陽離子包括，例如鋰、鎂、鈣及胍鎓。
「移動相修飾劑」包括該等影響離子或其他非共價相互作用之基團，其在加入pH梯度或階層後，或在A蛋白質載體中平衡及應用pH階層或梯度後，造成溶離同型二聚性IgG和異型二聚性IgG(例如野生型人類IgG和相同的IgG但帶有一或多個如文中所述之其CH3區的修飾)之間pH單位距離擴大。「移動相修飾劑」之適合的濃度可藉由使用相同管柱、pH階層或梯度之其濃度，隨著「移動相修飾劑」濃度增加，直到在一特定的pH階層或pH梯度時達到最大的pH距離，加以測定。「移動相修飾劑」亦可包括非極性修飾劑，其包括例如丙二醇、乙二醇等等。
如文中所用，「親和性層析」為一種利用生物分子間特異、可逆的相互作用，而非一般生物分子的性質例如等位點、疏水性或大小來進行色層分離之層析法。「A蛋白質親和性層析」或「A蛋白質層析」係指一利用A蛋白質之IgG結合區對免疫球蛋白質分子之Fc部份的親和力 之特異性親和性層析法。此Fc部份係包括人類或動物免疫球蛋白質恆定區CH2和CH3或實質上類似這些的免疫球蛋白質區。A蛋白質係涵蓋來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞壁之天然蛋白質、由重組或合成的方法所製造的A蛋白質及保留與Fc區結合能力的變體。在施行上，A蛋白質層析係涉及使用固定於一固體載體之A蛋白質。參見Gagnon,Protein A Affinity Chromotography,Purification Tools for Monoclonal Antibodies,pp.155-198,Validated Biosystems,1996。G蛋白質和L蛋白質亦可用於親和性層析。固體載體為一其上黏附A蛋白質之非水性基質。此等載體包括瓊脂、sepharose、玻璃、矽氧、聚苯乙烯、硝基纖維素、木炭、沙、纖維素及任何其他適合的物質。此等物質已為本項技術所熟知。任何適合的方法皆可用於將第二蛋白質固定至固體載體中。將蛋白質固定至適合的固體載體之方法已為本項技術所熟知。參見，例如Ostrove,in Guide to Protein Purification,Methods in Enzymology,182：357-371,1990。此等固體載體，有或無固定的A蛋白質，可容易地由許多市面來源取得，例如Vector Laboratory(Burlingame,Calif.)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,Calif.)、BioRad(Hercules,Calif.)、Amersham Biosciences(part of GE Healthcare,Uppsala,Sweden)、Pall(Port Washington,NY)及EMD-Millipore(Billerica,Mass.)。固定在多孔玻璃基質的A蛋白質可從市面上購得，如PROSEP®-A(Millipore)。此固相亦可為瓊脂為基底的基質。固定在瓊脂基質的A蛋白質可從市面上購得，如MABSELECTTM(Amersham Biosciences)。
親和性層析亦包括可用於選擇性結合且因此純化抗體、抗體片段或含有特定免疫球蛋白質區及/或序列之嵌合融合蛋白質的媒劑。抗體包括IgG、IgA、IgM、IgY、IgD和IgE型。抗體亦包括單鏈抗體例如駱駝科抗體、工程化駱駝科抗體、單鏈抗體、單區抗體、奈米抗體及其類似物。抗體片段包括VH、VL、CL、CH序列。抗體片段和含有抗體序列之融合蛋白質包括，例如F(ab’)3、F(ab’)2、Fab、Fc、Fv、dsFv、(scFv)2、scFv、scAb、微抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、Fc-融合蛋白質、trap分 子及其類似物(參見Ayyar et al.、Methods 56(2012)：116-129)。此等親和性層析媒劑可含有選擇性結合抗體、其片段和含有這些片段的融合蛋白質之配體。此等配體包括抗體結合蛋白質、細菌衍生的受體、抗原、凝集素(lectin)或針對目標分子之抗體。抗體需要純化。例如，抗任何一或多項IgG-CH1、IgG-Fc、IgG-CH3、IgG1、LC-κ、LC-λ、IgG3/4、IgA、IgM及其類似物之駱駝科衍生的親和配體可用作為親和配體(市面上可購得的為CAPTURESELECT層析樹脂，Life Technologies,Inc.,Carlsbad,Calif.)。
圖1係描繪說明以重組的A蛋白質樹脂(MabSelect XtraTM,A圖)，及缺乏VH結合之工程化A蛋白質-基底樹脂(MabSelect SuReTM,B圖)純化bsAb E之溶離步驟期間pH(虛線)和280nm之吸收度(實線)的層析圖。
圖2係描繪在40mM乙酸鹽、500mM氯化鈣中以MABSELECT SURETM(空心圓)或POROS MabCapture ATM(實心正方形)作為固定相，於30個管柱體積(“CV”)梯度溶離期間在雙特異性(Fc*Fc)及非-CH3-取代的同型二聚體(FcFc)波峰作為殘餘時間之函數間所得到的高峰解析度(Rs)。
圖3係描繪說明以添加檸檬酸鈉(A圖)、氯化鈉(B圖)、氯化鎂(C圖)或氯化鈣(D圖)作為溶離移動相之修飾劑，純化bsAb A之溶離步驟期間pH(虛線)和280nm之吸收度(實線)的層析圖。
圖4係描繪具有(A圖)和未具有(B圖)VH區SpA結合之含星號取代的(CH3-取代的，Fc*)雙特異性抗體(Fc*Fc)之純化程序的流程圖。
實例1：波峰解析程序
經由活A蛋白質層析利用如下之星號取代將雙特異性抗體從污染的同型二聚體分離出。因為Fc*Fc*同型二聚體具有的二個A蛋白質結合位置已從Fc區刪除，因此與此產物-有關的雜質預期會流經管柱並被移除，同時預期雙特異性和FcFc同型二聚體會留在管柱上。施予一連串的清洗以移除過程-相關的污染物，例如CHO DNA或宿主細胞蛋白質(HCP)。然後經由pH梯度或階層將雙特異性物選擇性溶離出，同時保留FcFc污染物，因為其相對於雙特異性物較強的結合。
當使用重組的葡萄球菌A蛋白質(SpA)層析樹脂進行最初的實驗時，觀察到雙特異性之間分離效能的廣泛變異。儘管，在某些案例中得到結合的FcFc同型二聚體和雙特異性產物間的基線解析，但雙特異性抗體之子群展現非常差的解析。就這些分子，當在經工程化而展現改善的鹼安定性之親和樹脂上進行分離時，可達到良好的解析。一此項之實例為bsAb E，就此係將收取的淨化細胞培養液裝載5g/L至SpA樹脂(MABSELECT XTRATM，圖1A)或工程化的A蛋白質-基底樹脂(MABSELECT SURETM，圖1B)上。一連串的(例如，pH 6-8)緩衝液沖洗步驟後，施予40個管柱體積(“CV”)梯度從pH 5至3之40mM乙酸鹽500mM NaCl，以溶離此結合的種類。在MABSELECT XTRATM上(圖1A)一介於25-35CV間的溶離波峰含有雙特異性和FcFc同型二聚體無解析。再者，儘管在Fc*Fc*污染物的Fc區中缺乏A蛋白質結合，一前導的淺溶離波峰(0-25CV)係由Fc*Fc*同型二聚體蛋白質所組成。然而，將相同的bsAb E承載施用於MABSELECT SURETM，產生二個分別含有雙特異性和FcFc同型二聚體的完全解析波峰(圖1B)，其中所有的Fc*Fc*同型二聚體在承載期間流過管柱。此項可能係由IgG和原生A蛋白質(“SpA”)及工程化SuRe配體間的不同相互作用所造成。
除了經典的結合位置，某些抗體已顯現在重鏈(“VH”)的可變區上含有一替代的SpA結合位置。特言之，某些含有來自人類VH3基因家族之重鏈的IgG已顯現具有此項行為，其中近乎一半的人類VH胚原基因係屬於VH3亞家族(參見Sasso et al.,Journal of Immunology 1989； 142：2778-83；Sasso et al.,Journal of Immunology 1991；147：1877-83；Schroeder et al.,International immunology 1990；2：41-50；及Walter,M.A.，及D.W.Cox,American Journal of Human Genetics 1988；42：446-51.)。因此似乎可能地，在SpA-基底樹脂上，雙特異性抗體例如bsAb E展現差的二種結合種類之解析，且由於VH結合而保留「未結合的」Fc*Fc*同型二聚體樹脂。因此VH結合被認為降低了雙特異性和FcFc同型二聚體及低親和力結合Fc*Fc*之間的親和力差異。
此假設藉由以MABSELECT SURETM所觀察到的改善純化而得到支持。SpA和抗體間的結合研究已顯示，當SpA的全部五個區(E、D、A、B和C)經由Fc-區與IgG結合時，僅D和E區展現顯著的Fab結合(參見，例如Starovasnik et al.,Protein Science 1999；8：1423-31)。工程化的MABSELECT SURETM親和配體為一Z-區的四聚體，一種原生、非-Fab及結合SpA B區之蛋白質-工程化版本。Z-區已知對抗體可變區具有微不足道的結合力(Starovasnik，上文)。因此，當使用帶有MABSELECT SURETM配體之樹脂時，雙特異性和FcFc同型二聚體間增加的親和力差異使得該等波峰之解析得以提高；且未保留Fc*Fc*同型二聚體。
篩選多種A蛋白質基底層析樹脂以便於鑑別供雙特異性臨床和商業製造之樹脂。選擇二種bsAbs進行評估，一種先前觀察係經由VH區與SpA結合(bsAb A)而一種係缺乏此項能力(bsAb B)。將承載物質先前進行標準的正性模式親和性層析以移除Fc*Fc*雜質。開始的雙特異性純度(Fc*Fc/[Fc*Fc+Fc*Fc*+FcFc])就bsAb A和bsAb B分別為84%及76%。所有的樹脂係承載至10g總蛋白質/每公升樹脂。一連串的清洗後，使用30CV梯度從pH 6至3以500mM NaCl或500mM CaCl2作為移動相修飾劑，將抗體溶離出。
所選的六種市售A蛋白質樹脂具有各種基底、微珠大小和配體類型。其中四種樹脂使用SpA，一種為Z-區的四聚體(MABSELECT SURETM)，及一種為非-Fab結合C區之鹼安定化版本，稱為Y-區(TOYOPEARL AF-rProtein A-650F)。在雙特異性產物和結合的FcFc同型 二聚體間所得到的這些數據及波峰解析(Rs=1.18([tR2-tR1]/[W½2+W½1]；其中R為波峰解析，W½一半高度時之波峰寬，及tR為滯留時間)係詳述於表1中。
Figure 104123813-A0202-12-0017-1
當使用NaCl作為溶離緩衝液中的修飾劑時，增加的解析度係與微珠大小成反比，其中就SpA樹脂平均粒徑大於45μm者無觀察到解析度。有趣地，就bsAb A，MABSELECT SURETM(Rs=0.92)顯現與TOYOPEARL AF-rProtein A-650F(Rs=0.87)相當的表現。此項並非預期的，由於(i)就TOYOPEARL AF-rProtein A-650F平均微珠尺寸較小(45對照85μm)及(ii)親和配體的相似性，其係以Y-區(衍生自C-區)為基礎且因此預期缺乏VH結合(Starovasnik，前文)。就bsAb B，POROS MABCAPTURE ATM展現較高的解析度，當相較於TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和ABSOLUTE HICAPTM時(2.50分別與2.37和2.41相比)時，儘管不具有較 小的粒徑。此項係假設由於此基底中灌流的元素，受到較大的通過孔洞幫助，及1100埃(Angstrom)的平均孔徑協助質量轉移。POROS MABCAPTURE ATM比起任何其他的SpA樹脂，亦展現較佳的bsAb A解析度，其中對TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和MABSELECT SURETM之非-VH結合樹脂具相當的解析度(0.70分別與0.87和0.92相比)。
當以CaCl2取代NaCl作為移動相修飾劑時，觀察到POROS MABCAPTURE ATM大大地改善解析力，大幅地超越MABSELECT SURETM(分別為1.83對1.08之Rs)。以此全部數據為基準，進一步評估POROS MABCAPTURE ATM和MABSELECT SURETM作為等位溶離(isocratic elution)之可能的解析層析樹脂。
因為樹脂比較係在400cm/h的相對快速線性速度下進行，因此MABSELECT SURE樹脂在相對於POROS MABCAPTURE A效力上可能下降，因為(i)微珠尺寸較大及(ii)缺乏灌流。因此在一生產相關範圍的駐留時間，比較此等樹脂。由於觀察到BsAb A經由其VH區與SpA結合(藉此給予非-VH結合MABSELECT SURE一較大的雙特異性和FcFc雜質間的非親和力差異)，因而選擇BsAb A作為模型分子。請注意，選擇VH結合抗體進行此項評估，MABSELECT SURE因為無此親和力利益，預期應較差，由於MABCAPTURE A的微珠尺寸較小。使用相同的親和力捕捉bsAb A承載物質進行樹脂評估研究，以10g總蛋白質/每公升樹脂施予量。以3分鐘的駐留時間進行所有的層析步驟，但溶離除外，其係在2-8分鐘間變化(600-150cm/h)。從FcFc同型二聚體波峰計算雙特異性波峰之解析度顯示，雖然樹脂的解析度隨駐留時間增加，但對MABSELECT SURE的效應比POROS MABCAPTURE A更明顯(分別為0.7和0.3的Rs增加，圖2)。此外，在所有試驗的條件下POROS MABCAPTURE A樹脂顯示優於MABSELECT SURE的解析度，儘管此樹脂在VH結合上的缺點，其確認了就有關二種結合類別之解析力上此樹脂的整體優勢。
溶離緩衝液中移動相修飾劑之結論改變及可能改善從FcFc同型二聚體解析雙特異性產物(參見表1)。因此，假設在霍夫梅斯特 序列(Hofmeister Series)上使用不同位置的鹽類，藉由緩和抗體類別和A蛋白質配體間的疏水性相互作用，改善樹脂的選擇性。將VH-結合的bsAb A以10g/L載入至MABCAPTURE A樹脂上。在一連串沖洗後，使用30CV梯度從pH 6至3以下列溶離移動相修飾劑溶離抗體：檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鎂及氯化鈣，排列順序係以霍夫梅斯特序列從穩液劑(kosmotroph)至離液劑(chaotroph)。使用500mM的鹽量，但檸檬酸鈉其中當濃度在300mM以上時，由於蛋白質沉澱在承載物質中，所以使用250mM。以較多的離液鹽類得到較佳的雙特異性產物和結合的FcFc同型二聚體間的解析度(圖3)。從第一升起的波峰中收集雙特異性波峰，波峰波谷的曲折變化詳如圖3。測量雙特異性之產率百分比、雙特異性之純度率百分比、波峰解析度(Rs)和可溶性聚集物之百分比(表2)。亦從層析圖中計算雙特異性pH頂峰時的pH。使用較多的離液鹽類(氯化鈣和氯化鎂)展現增加的產率及雙特異性純度。在較高pH時以氯化鎂和氯化鈣溶離蛋白質。所用的離液性最高和穩液性最高的鹽類在溶離雙特異性期間皆不會引發顯著的聚集作用。因此，使用離液鹽類例如氯化鈣作為離液緩衝液中的移動相修飾劑顯示增進波峰解析度及後續bsAb的純化。
Figure 104123813-A0202-12-0019-2
實例2：商業產程之開發
為了測定用於純化雙特異性抗體之星號取代基底平台的可行性，係開發一種供純化bsAb C之可擴展產程。當發現出現顯著的VH與SpA結合時，將此蛋白質選為最壞情況試驗。主要的開發目標為：(i)達到等位(階層)溶離以簡單化符合工廠及技術轉移，同時亦降低緩衝液消 耗和處理時間，(ii)以極少或無須承載調節，鑑定與親和解析步驟交接之整修步驟。
使用高通量篩選以96-孔盤模式(HTPD)，進行最初的因子篩選和設計空間評估。鑑別溶離pH、管柱承載(g/L總蛋白質)及移動相修飾劑濃度作為關鍵製程輸入(參見圖2)。亦考濾溶離駐留時間。本研究之承載物質先前已進行標準正性模式親和性層析，以移除Fc*Fc*雜質，產生64%雙特異性純度。進行二輪18-運轉中心-混成設計實驗研究(CCD DoE)，以便於以等位溶離模式評估MABSELECT SURE和POROS MABCAPTURE A二者。POROS MABCAPTURE A樹脂之研究因子為管柱承載(範圍10-25g總蛋白質/L)、溶離pH(4.5-5.5)及溶離緩衝液中氯化鈣的濃度(250-500mM)。駐留時間保持恆定為3min(400cm/h)。然後根據管柱承載(範圍10-25g總蛋白質n/L)、溶離pH(3.8-5.0)及溶離駐留時間(5-11min)評估MABSELECT SURE。溶離緩衝液中的氯化鈣濃度係保持恆定為500mM。
就MABCAPTURE A，使用標準的最小平方適配演算法得到雙特異性產率(R2=0.97)和雙特異性純度(R2=0.92)二者之良好模型。在所有的條件，觀察溶離緩衝液中從250-500mM之增加的氯化鈣量，在無降低雙特異性純度下增加了雙特異性產率10-20%(數據未顯示)。使用此模型，以500mM CaCl2進行一甜蜜區(sweet spot)分析。此分析係說明5.0-5.1的溶離pH應能達到>95%的純度目標及>80%的產率，以符合17-25g/L的樹脂挑戰。於至高2kL生產規使用類似的層析條件，且在進一步的最適化後，已得到超過99%之雙特異性純度。
評估MABSELECT SURE數據，得到雙特異性產率(R2=0.99)和雙特異性純度(R2=1.00)之良好的模型契合度。駐留時間並未顯現為任一反應之顯著因子。就MABCAPTURE A，在等高線圖強加一8分鐘駐留時間的限制，以排除其中得到雙特異性產率<80%及<95%之區域。所欲的操作窗(operating window)或甜蜜區比MABCAPTURE A所觀察到的小很多。因此使用MABSELECT SUR可能導致一在生產規模上牢固性 不足的產程，因為小量的pH或承載變化可能造成不可接受的雙特異性純度或產率。
實例3：後-親和性整修(post-affinity polishing)
在親和解析步驟後，可將雙特異性抗體進行整修步驟，希望以高度類似標準單株抗體的方式移除製程和產物相關的雜質。然而，在解析親和步驟的溶離緩衝液中使用高濃度的氯化鈣可能潛在上使下游單元操作複雜化。可使用超過濾/透析過濾(UF/DF)來降低集池的導電率以增進傳統的mAb整修步驟，例如陽離子交換或陰離子交換層析。然而，鑑別耐鹽性正性模式的層析步驟可能免於進行此項傳統的單元操作。多模式或混合模式層析係組合各種類型的相互作用，例如與單一樹脂之疏水性相互作用、氫鍵和離子性相互作用。經指出，此項可增進耐鹽性吸附。
考慮各種多模態樹脂(multimodal resin)作為整修步驟：(i)CAPTO ADHERE及(ii)CAPTO ADHERE IMPRES(此二者的N-苯甲基-甲基乙醇胺配體含有陰離子交換、疏水性和氫鍵相互作用基團)，(iii)陶瓷羥磷灰石及(iv)CAPTO MMC，一種帶有疏水性相互作用及氫鍵電位之多模態陽離子交換樹脂。最終，開發CAPTO MMC以同時移除製程-和產物-相關的雜質，同時降低製程液流的導電率。在產程開展後，在量產規模利用正性模式CAPTO MMC以bsAb C和bsAb D確認概念驗證(參見表3)。在二者情況，得到合理的(19-25g/L)動態結合能力，其中產率
Figure 104123813-A0202-12-0021-8
85%，可溶性聚集物高達3-倍的下降，及中度的(0.2-0.7對數移除)CHO宿主細胞蛋白質清除。
Figure 104123813-A0202-12-0021-3
實例4：純化策略
以上文所作及所述的發現為基礎，設想二種下游雙特異性處理平台(圖4)。若此雙特異性抗體係衍生自VH3基因片段且能經由VH區與SpA結合，則可利用另外的親和性層析單元操作，稱為親和捕捉層析(圖4A)。以收取移除細胞和碎片後，使用MABSELECT SURE樹脂進行親和捕捉層析，因為經由Z-區缺乏VH結合而確保移除Fc*Fc*親代抗體雜質。此步驟可使用A蛋白質結合來進行，沖洗和溶離條件標準化至市售單株抗體且亦作為增加蛋白質濃度並移除產程-和產物-相關的雜質。當蛋白質在低pH溶離時，方便的亦對產物集池就病毒失活進行一低pH鎖定。此項之後，以第二正性模式A蛋白質步驟稱為「親和解析層析」進行FcFc雜質之移除。在溶離緩衝液中使用結合離液修飾劑之POROS MABCAPTURE A樹脂可產生>95%雙特異性純度的集池。在親和解析層析之後，使用正性模式的耐鹽性多模態層析促進與親和解析步驟的直接連接，因此不需要介入UF/D操作，而將離液鹽從產程液流移除。結合另外的整修步驟，例如陰離子交換層析及病毒滯留性過濾，聚集物、HCP、DNA、病毒及其他雜質可移除達到可接受的程度。最後，將純化的產物藉由標準超過濾/透析過濾法濃縮到最終的調配緩衝液中。若此雙特異性分子不具有結合SpA的VH，藉由移除親和捕捉步驟，可簡化此純化列(圖4B)。在此情況下，可藉由親和解析層析進行FcFc和Fc*Fc*二種雜質之移除。
實例5：材料和方法
所有用於這些實例中的雙特異性抗體和細胞培養液係在CHO細胞中表現。層析樹脂係由其製造商所得來：MABSELECT SURE、MABSELECT XTRA、CAPTO MMC(GE Healthcare)，POROS MABCAPTURE A(Life Technologies)，TOYOPEARL AF-rProtein A-650F(TOSOH Biosciences)，ABSOLUTE HIGH CAP(Novasep Inc.)，PROSEP ULTRA PLUS(EMD Millipore)。所用的全部化學品係由J.T.Baker所供應。
實驗室規模的層析分離係使用來自GE Healthcare公司之AKTA AVANT層析系統及1.0cm內徑(I.D.)OMNIFIT BENCHMARK層 析管柱(Omnifit Ltd)來進行。領試規模(pilot scale)層析係應用來自GE Healthcare公司的AKTA PILOT層析系統及7.0cm I.D.INdEX層析管柱。量產規模層析係在AKTAPROCESS層析機組及40cm I.D.CHROMOFLOW管柱(GE Healthcare)上進行。UPLC分析係借自Waters公司之ACQUITY UPLC系統。細胞培養係使用一2L BIOSTAT B-DCU檯式生物反應器(Sartorius)，一50、250或2000L HYCLONE單次使用生物反應器(Thermo Scientific)，或一160L不鏽鋼生物反應器(ABEC Inc.)來進行。
當未使用淨化的細胞培養液時，用於親和解析開發之承載物質係藉由親和捕捉層析使用20±1cm床高MABSELECT SURE管柱所產生。以二個管柱(CV)的20mM磷酸鈉pH 7.2平衡後，以淨化的細胞培養液將管柱載入10-40g結合抗體/L。以雙特異性和FcFc效價總合來決定結合抗體濃度。清洗管柱及以專有的緩衝系統溶離蛋白質，之後2CV柱帶。收集整體溶離波峰並以2M Tris鹼中和至pH 7.5±0.5。
所有的解析層析係使用20±1cm床高管柱來進行。研究的A蛋白質管柱係以二個CV的20mM磷酸鈉pH 7.2平衡，之後加載。載入後，以專用的清洗緩衝系統清洗管柱並以指定的梯度或等位溶離進行溶離。就等位運作係使用4個CV溶離管柱，在開始溶離步驟後，從0.5-4CV收集圈集物。梯度和等位溶離緩衝液二者係含有40mM乙酸鹽作為緩衝物類。接著以2CV緩衝液脫除溶離管柱。除非另有說明，否則所有的步驟係在400cm/h之線性速度下進行。使用UNICORN 6.1軟體(GE Healthcare)進行層析分析，包括使用半高法時的寬度，計算假設高斯峰(Gaussian peak)之波峰解析度(Rs)。當進行自動分離時，波峰剝離係定義為在基線UV280中>50mAu增加。使用JMP 11.1.1(SAS Institute Inc.)進行實驗、分析及建模的統計設計。
使用25.1L管柱(20cm床高；40cm I.D.)及所有進行的步驟係在4min駐留時間(線性速度300cm/h)進行CAPTO MMC層析。以水將親和解析集池稀釋50%並調整至pH 5.0±0.1。以2CV的2M NaCl預 平衡管柱，之後以2CV的40mM乙酸鈉、250mM氯化鈣pH 5.0±0.1平衡。加載後，以3CV的40mM Tris、40mM乙酸鹽pH 5.0±0.1沖洗管柱，及然後以8CV的20mM Tris、60mM乙酸鹽pH 8.0±0.1(bsAb C)或20mM Tris、40mM乙酸鹽pH 8.0±0.1(bsAb D)溶離產物。從UV280nm剝離至溶離步驟結束收集圈集物。溶離後，以2CV的2M NaCl，接著2CV的1M NaOH清潔管柱。
使用市售的ELISA套組型號#F550(Cygnus Technologies)，進行宿主細胞蛋白質(“HCP”)定量。藉由二個ACQUITY UPLC PrST SEC管柱，200Å，1.7μm,4.6mm x 150mm型號#186005225，連續於10mM磷酸鈉、500mM氯化鈉pH 7.0移動相中定量可溶性聚集物。使用連續3個預裝填的POROS A 20μm管柱(2.1mm x 30mm,0.1mL)型號#2-1001-00及等位溶離緩衝系統測量雙特異性純度。使用POROS A 20μm管柱(2.1mm x 30mm,0.1mL)型號#2-1001-00測量雙特異性和FcFc效價，及藉由承載流經POROS G 20μm管柱(2.1mm x 30mm,0.1mL)上的液流測量Fc*Fc*效價。

Claims (18)

  1. 一種製造蛋白質之方法，其包括：(a)將一親和性基質承載一包含下列多聚體蛋白質之混合物：(i)包括二個複製第一多肽之第一同型二聚體，(ii)包括二個複製第二多肽之第二同型二聚體，及(iii)包括該第一多肽和該第二多肽之異型二聚體，其中在通過親和性基質之溶液其pH及/或離子強度為相同的情況下該第一多肽對該親和性基質具有比第二多肽更大之親和力；其中該親和性基質係包括附著於基材(substrate)之A蛋白質配體，該基材包含多重性(multiplicity)具有平均直徑為45微米(μm)且包含平均直徑為1100Å之孔洞的粒子；以及(b)從親和基質於包括CaCl2或MgCl2和具有從3.6至5.5的第一pH範圍之緩衝液中溶離及收集異型二聚體，其中該第一同型二聚體係在第二pH範圍之緩衝液中從親和性基質溶離，且該第二同型二聚體係在第三pH範圍之緩衝液中從親和性基質溶離，其中該第三pH範圍係包括高於第一pH範圍之pH，其包括高於第二pH範圍之pH。
  2. 根據請求項1之方法，係包括下列步驟：(c)將步驟(b)所收集的異型二聚體於具有酸性pH之緩衝液中施用於多模態層析樹脂；(d)從多模態層析樹脂於具有更鹼性pH之緩衝液中溶離異型二聚體；及(e)收集該異型二聚體。
  3. 根據請求項1之方法，其中該基材係包括任一或多種瓊脂、聚(苯乙烯二乙烯苯)、聚甲基丙烯酸酯、纖維素、受控孔度玻璃及球形矽氧。
  4. 根據請求項1之方法，其中每公升的親和性基質係載入5至50克的蛋白質。
  5. 根據請求項1之方法，其係包括將pH梯度施用於步驟(a)之載入的親和性基質。
  6. 根據請求項5之方法，其係包括在施用pH梯度前，以pH 6-8之溶液清洗步驟(a)之承載的親和性基質。
  7. 根據請求項5之方法，其中該pH梯度係在pH 6至pH 3間運作。
  8. 根據請求項1之方法，其中該緩衝液係包括乙酸鹽。
  9. 根據請求項8之方法，其中該緩衝液係包括40mM乙酸鹽。
  10. 根據請求項1至9中任一項之方法，其中該緩衝液係包括CaCl2。
  11. 根據請求項1至9中任一項之方法，其中該緩衝液係包括MgCl2。
  12. 根據請求項10之方法，其中該緩衝液係包括250-500mM CaCl2。
  13. 根據請求項11之方法，其中該緩衝液係包括250-500mM MgCl2。
  14. 根據請求項1之方法，其中該異型二聚體係為抗體，且該第一多肽係包括能與A蛋白質結合之CH3區及該第二多肽係包括不能與A蛋白質結合之CH3區。
  15. 根據請求項14之方法，其中該第二多肽係在其CH3區中包括H435R及Y436F取代(EU編號)。
  16. 根據請求項14或15之方法，其中該異型二聚體係為雙特異性抗體。
  17. 根據請求項1之方法，其中該多聚體蛋白質之混合物係由多個真核細胞於細胞培養中所製造。
  18. 根據請求項17之方法，其中該真核細胞係包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
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