KR102440737B1

KR102440737B1 - 이중특이적 항체에 대한 정제 플랫폼

Info

Publication number: KR102440737B1
Application number: KR1020177003803A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 투스티안; 크리스틴 에디콧; 벤자민 아담스; 존 마틸라; 한느 백
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2014-07-26
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2022-09-06
Also published as: MY187051A; TWI704155B; KR20170035941A; DK3912987T3; CN107074906A; DK3172221T3; BR112017001443A2; ES2942533T3; MX2017001217A; EP3912987B9; AR101262A1; TW201617359A; IL255198A0; PL3172221T3; FI3912987T3; JP2017524740A; ZA201700622B; AU2015298156B2; US10626142B2; EP3912987B1

Abstract

카오트로픽 작용제 및 pH 구배 또는 pH 단계 용리 버퍼를 이용하는 고 분해능 단백질 A 크로마토그래피는 밀접하게 관련된 분자 종 사이에서 개선된 피크 분해능을 발생시킨다. 단백질 A-결합 CH3 도메인과 쌍을 이루는 단백질 A-결합-제거 치환 CH3 도메인을 함유하는 이중특이적 항체는 높은 피크 분해능으로 단백질 A-결합-제거 치환된 CH3 도메인과 쌍을 이루는 단백질 A-결합-제거 치환된 CH3 도메인을 함유하는 단일특이적 항체 및 단백질 A-결합 CH3 도메인과 쌍을 이루는 단백질 A-결합 CH3 도메인을 함유하는 단일특이적 항체로부터 분리된다. 유용한 카오트로픽 작용제는 마그네슘 클로라이드 및 칼슘 클로라이드를 포함한다.

Description

이중특이적 항체에 대한 정제 플랫폼{PURIFICATION PLATFORM FOR BISPECIFIC ANTIBODIES}

친화도 크로마토그래피를 통해 단백질의 복합 혼합물로부터 특이적 멀티머 단백질을 정제하는 방법이 제공된다. 구체적으로는 카오트로픽(chaotropic) 작용제를 사용하여 친화도 크로마토그래피 (단백질 A 크로마토그래피 포함)를 통해 모노머 및 호모다이머의 복합 혼합물로부터 헤테로다이머 (이중특이적 항체 포함)를 단리시키는 방법이 제공된다.

다수의 이중특이적 항체 포맷이 제안되었고 현재 개발 중에 있다. 하나의 이러한 포맷은 개선된 약물동력학적 프로파일 및 최소한의 면역원성을 가진 표준 완전한 인간 IgG 항체를 기반으로 한다 (미국 특허 번호 8,586,713 참조, 이것은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 단일 공통 경쇄 및 두 개의 별개의 중쇄는 이중특이성을 형성하도록 결합한다. 중쇄 중 하나는 치환된 Fc 서열 (이하 "Fc*")을 함유하며 이것은 단백질 A로의 Fc*의 결합을 감소시키거나 제거한다. 예를 들어, 하나의 이러한 Fc* 서열은 CH3 도메인에서 H435R/Y436F (EU 넘버링(numbering) 시스템에 의해; IMGT 엑손 넘버링 시스템에 의해서는 H95R/Y96F) 치환을 함유한다. 두 개의 중쇄 및 공통 경쇄의 동시-발현의 결과로서, 세 개의 생성물이 생성된다: 이것들 중 둘은 중쇄에 대하여 호모다이머이고 이것들 중 하나는 원하는 헤테로다이머 이중특이적 생성물이다. Fc* 서열은 높은 결합력 FcFc 중쇄 호모다이머, 또는 약하게 결합하는 Fc*Fc* 호모다이머와 비교하여, 단백질 A에 대한 중간의 결합 친화도로 인해 상업적으로 이용 가능한 친화도 컬럼 상에서 FcFc* 이중특이적 생성물의 선택적 정제를 허용한다.

이중특이적 헤테로다이머의 상업적 규모 정제를 달성하기 위해서는, FcFc 호모다이머, Fc*Fc 헤테로다이머, 및 Fc*Fc* 호모다이머 사이의 우수한 분해능이 요구된다. 본원에서, 출원인은 이러한 세 가지 분자 형태의 분해능을 최적화하는 개선된 분리 공정을 기술한다.

하나 이상의 양태 및 이것들의 구체예에서, 본 발명은 친화도 캡쳐 및 용리 공정을 이용하여 호모다이머 및 헤테로다이머를 포함하는 단백질의 복합 혼합물로부터 헤테로다이머 단백질, 예를 들어, 이중특이적 항체를 정제하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 이 방법들 중 어느 하나에 의해 생산된 정제된 헤테로다이머 단백질에 관한 것이다.

제1 양태에서, 본 발명은 친화도 매트릭스 상으로 멀티머 단백질의 혼합물을 로딩하는 단계, 및 이어서 특정 pH 범위에서 및 카오트로픽 작용제를 함유하는 버퍼 내에서 상기 매트릭스로부터 헤테로다이머 단백질을 용리 및 수거하는 단계를 포함하는 단백질 제조 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 처음에는 친화도 매트릭스에 친화도 매트릭스의 리터 당 5 내지 50 그램의 단백질이 로딩된다. 일부 경우에서, 멀티머 단백질의 혼합물은 세포 배양물에서 복수의 진핵 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 생산된다.

한 구체예에서, 멀티머 단백질의 혼합물은 (i) 제1 폴리펩타이드의 두 개의 카피를 포함하는 제1 호모다이머, (ii) 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로다이머, 및 선택적으로 (iii) 제2 폴리펩타이드의 두 개의 카피를 포함하는 제2 호모다이머를 함유한다. 본원에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 제1 호모다이머, 헤테로다이머 및 제2 호모다이머가 친화도 매트릭스로의 차등적 결합에 근거하여 분리될 수 있도록 친화도 매트릭스에 대하여 상이한 친화도를 가진다.

친화도 매트릭스로의 차등적 결합은 그 중에서도 친화도 매트릭스를 통과하는 용액의 pH 및/또는 이온 강도를 변화시킴으로써 조작될 수 있다. 용액에 카오트로픽 작용제의 첨가는 친화도 매트릭스로부터 각각의 다이머 종의 용리를 향상시키고 이로 인해 복수의 개개의 다이머 종의 순도를 증가시킨다. 한 구체예에서, 헤테로다이머는 제1 pH 범위를 가지는 버퍼 내에서 친화도 매트릭스로부터 용리되고, 제1 호모다이머는 제2 pH 범위를 가지는 버퍼 내에서 친화도 매트릭스로부터 용리된다. 헤테로다이머가 수거된다. 제2 호모다이머가 멀티머의 혼합물에 포함되는 선택적 구체예에서, 제2 호모다이머는 결합되지 않고 컬럼을 통과해 흘러나가거나 제3 pH 범위를 가지는 세척 버퍼 내에서 친화도 매트릭스로부터 용리된다. 제3 pH 범위는 제2 pH 범위보다 더 높은 pH를 포함하는 제1 pH 범위보다 더 높은 pH를 포함한다.

한 구체예에서, 친화도 매트릭스는 기질에 부착된 단백질 A 리간드를 포함한다. 일부 경우에서, 기질은 비드 또는 입자이며, 이로써 친화도 매트릭스는 단백질 A에 부착된 복수의 입자이다. 단백질 A는 자연 발생 또는 변형된 포도상구균 단백질 A(Staphylococcal protein A)일 수도 있거나, 또는 조작된 단백질 A일 수도 있다. 조작된 단백질 A는, 예를 들어, Z-도메인 테트라머, Y-도메인 테트라머, 또는 D 및 E 도메인이 없는 조작된 단백질 A일 수도 있다. 이 조작된 단백질 A의 예들은 면역글로불린의 VH3 도메인에 결합할 수 없지만 (또는 결합하더라도 매우 낮은 친화도로 결합하지만), IgG1, IgG2 및 IgG4의 CH3 도메인에는 결합할 수 있다.

일부 경우에서, 친화도 매트릭스 기질은 아가로스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 제어된 포어 유리(controlled pore glass), 구형 실리카, 셀룰로스 등을 함유하거나 이것들로 제조된다. 기질이 비드 또는 입자와 같은 형태인 구체예에서, 입자의 평균 직경은 25 μm 내지 100 μm이다. 일부 구체예에서, 입자는 35 μm, 45 μm, 60 μm, 75 μm, 또는 85 μm의 평균 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 입자는 45 μm의 평균 직경을 가지고 1100 Å의 평균 직경을 가진 포어를 함유한다.

일부 구체예에서, 단백질의 혼합물로 친화도 매트릭스의 처음 로딩 후, 매트릭스는 pH 5보다 더 높은 pH를 가진 버퍼로 세척된다. 일부 경우에서, 버퍼는 pH 7.2에서 20 mM 나트륨 포스페이트를 포함한다. 제2 호모다이머가 단백질의 혼합물에 포함될 때, 제2 호모다이머는 세척 버퍼 내 친화도 매트릭스로부터 세척된다. 따라서, 본원에서 세척 버퍼는 제3 pH 범위에 있다.

일부 구체예에서, 완충된 pH 구배가 로딩된 친화도 매트릭스에 적용되거나, 또는 대안으로, 각각 다른 pH를 가지는 순차적 용리 버퍼가 로딩된 친화도 매트릭스에 적용된다. 한 구체예에서, pH 구배는 pH 6에서 pH 3으로 실행된다. 헤테로다이머가 친화도 매트릭스로부터 용리되는 제1 pH 범위는 약 pH 5.5 내지 약 pH 3.6이다. 일부 경우에서, 용리 버퍼 및/또는 완충된 pH 구배는 시트레이트, 아세테이트, 4-모르폴린에탄설포네이트 (MES), 시트레이트-포스페이트, 숙시네이트, 등과 같은 적합한 버퍼, 및 카오트로픽 작용제를 함유하며, 한 구체예에서는 40 mM 아세테이트이다. 카오트로픽 작용제는 리튬, 마그네슘, 칼슘, 및 구아니디늄으로부터 선택된 양이온, 및 클로라이드, 나이트레이트, 브로마이드, 클로레이트, 아이오다이드, 퍼클로레이트, 및 티오시아네이트로부터 선택된 음이온을 가진 염일 수도 있다. 한 특정 구체예에서, 카오트로픽 작용제는 CaCl₂, 예를 들어, 250 - 500 mM CaCl₂이다. 또 다른 특정 구체예에서, 카오트로픽 작용제는 MgCl₂, 예를 들어, 250 - 500 mM MgCl₂이다.

한 구체예에서, 헤테로다이머는 이중특이적 항체이다. 본원에서, 제1 폴리펩타이드는 단백질 A에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고 ("Fc") 제2 폴리펩타이드는 단백질 A에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함한다 ("Fc*"). 일부 경우에서, 제2 폴리펩타이드는 그것의 CH3 도메인에서 H435R/Y436F (EU 넘버링 시스템에 의해; IMGT 엑손 넘버링 시스템에 의해서는 H95R/Y96F) 치환 ("Fc*" 또는 "별표 치환"으로도 알려져 있음)을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 제1 호모다이머는 두 개의 치환되지 않은 CH3 도메인을 가지는 단일특이적 항체이고 (즉, FcFc); 제2 호모다이머는 두 개의 H435R/Y436F 치환된 CH3 도메인을 가지는 단일특이적 항체이며 (즉, Fc*Fc*); 헤테로다이머는 하나의 치환되지 않은 CH3 도메인 및 하나의 H435R/Y436F 치환된 CH3 도메인을 가지는 이중특이적 항체이다 (즉, Fc*Fc).

한 구체예에서, 친화도 매트릭스로부터 수거되는 헤테로다이머는 추후 더 산성인 pH에서 크로마토그래피 매질 상으로 로딩되고, 카오트로픽 작용제가 없는 (또는 더 적은 양 또는 미량의 카오트로프(chaotrope)를 가지는) 더 알칼리성 버퍼에서 상기 매질로부터 용리된다. 한 경우에서, 크로마토그래피 매질은 다중 모드 크로마토그래피 레진이다. 헤테로다이머는 추가로 정제될 수도 있다.

제2 양태에서, 제2 호모다이머는 제1 친화도 매트릭스에 혼합물을 적용함으로써 먼저 단백질의 혼합물로부터 제거되어 제1 호모다이머 및 헤테로다이머는 매트릭스에 결합된 채로 유지되는 한편 제2 호모다이머는 흘러나가서 폐기되도록 한다. 제1 호모다이머 및 헤테로다이머는 추후 제1 친화도 매트릭스로부터 용리된 다음 이어서 제2 친화도 매트릭스에 적용된다. 한 구체예에서, 제1 친화도 매트릭스에는 처음에 친화도 매트릭스 리터 당 단백질 5 내지 50 그램이 로딩된다. 멀티머 단백질의 혼합물은 일부 경우에는 세포 배양물에서, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 복수의 진핵 세포에 의해 생산된다.

한 구체예에서, 제1 친화도 매트릭스에 적용된 멀티머 단백질의 혼합물은 (i) 제1 폴리펩타이드의 두 개의 카피를 포함하는 제1 호모다이머, (ii) 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로다이머, 및 (iii) 제2 폴리펩타이드의 두 개의 카피를 포함하는 제2 호모다이머를 함유한다. 본원에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 제1 친화도 매트릭스, 뿐만 아니라 제2 친화도 매트릭스에 대하여 다른 친화도를 가지며, 이로써 제1 호모다이머, 헤테로다이머 및 제2 호모다이머는 제1 및/또는 제2 친화도 매트릭스로의 차등적 결합에 근거하여 분리될 수 있다.

한 구체예에서, 제1 친화도 매트릭스는 면역글로불린의 VH3 도메인에 결합하는 능력이 없는, 기질에 부착된 조작된 단백질 A 리간드를 포함한다. 일부 경우에서, 단백질 A, 예를 들어, Z-테트라머 또는 Y-테트라머를 포함하는 조작된 단백질 A는 D-도메인 및 E-도메인이 없다.

제2 친화도 매트릭스에 제1 호모다이머 및 헤테로다이머의 차등적 결합은 그 중에서도 친화도 매트릭스를 통과하는 용액의 pH 및/또는 이온 강도를 변화시킴으로써 조작될 수 있다. 용액에 카오트로픽 작용제의 첨가는 비-중첩 부분에서 제2 친화도 매트릭스로부터 각각의 다이머 종의 용리를 향상시키고, 이로 인해 각각의 다이머 종의 순도를 증가시킨다. 한 구체예에서, 헤테로다이머는 제1 pH 범위를 가지는 버퍼에서 제2 친화도 매트릭스로부터 용리되고, 제1 호모다이머는 제2 pH 범위를 가지는 버퍼에서 제2 친화도 매트릭스로부터 용리된다. 헤테로다이머가 수거된다. 본원에서, 제1 pH 범위는 제2 pH 범위보다 더 높은 pH를 포함한다.

한 구체예에서, 제2 친화도 매트릭스는 기질에 부착된 단백질 A 리간드를 포함한다. 일부 경우에서, 기질은 비드 또는 입자이며, 이로써 제2 친화도 매트릭스는 단백질 A 리간드와 부착된 복수의 입자이다. 단백질 A는 자연 발생 또는 변형된 포도상구균 단백질 A일 수도 있거나, 또는 조작된 단백질 A일 수도 있다. 조작된 단백질 A는, 예를 들어, Z-도메인 테트라머, Y-도메인 테트라머, 또는 D 및 E 도메인이 없는 또 다른 조작된 단백질 A일 수도 있다. 이 조작된 단백질 A 분자들은 면역글로불린의 VH3 도메인에 결합할 수 없지만 (또는 결합하더라도 매우 낮은 친화도로 결합하지만), IgG1, IgG2 및 IgG4의 CH3 도메인에 결합할 수 있음을 유지한다.

일부 경우에서, 기질은 아가로스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 제어된 포어 유리, 구형 실리카, 셀룰로스 (예를 들어, HYPERCEL) 등을 함유하거나 이것들로 제조된다. 기질이 비드 또는 입자와 같은 형태인 상기 구체예에서, 입자의 평균 직경은 30 μm 내지 90 μm이다. 일부 구체예에서, 입자는 35 μm, 45 μm, 60 μm, 75 μm, 또는 85 μm의 평균 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 입자는 45 μm의 평균 직경을 가지고 1100 Å의 평균 직경을 가진 포어를 함유한다.

일부 구체예에서, 제1 호모다이머 및 헤테로다이머를 함유하는 혼합물로 제2 친화도 매트릭스의 처음 로딩 후, 매트릭스는 pH 5보다 더 높은 pH를 가진 버퍼로 세척된다. 일부 경우에서 버퍼는 pH 5 - 8.5, 예를 들어, pH 7.2에서 20 mM 나트륨 포스페이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 완충된 pH 구배가 로딩된 친화도 매트릭스에 적용되거나, 또는 대안으로, 각각 다른 pH를 가진 순차적 용리 버퍼가 로딩된 제2 친화도 매트릭스에 적용된다. 한 구체예에서, pH 구배는 pH 6에서 pH 2.5로 실행된다. 헤테로다이머가 친화도 매트릭스로부터 용리되는 제1 pH 범위는 약 pH 5.5 내지 약 pH 3.6이다. 일부 경우에서, 용리 버퍼 및/또는 완충된 pH 구배는 아세테이트 (한 구체예에서는 40 mM 아세테이트이다), 및 카오트로픽 작용제를 함유한다. 카오트로픽 작용제는 리튬, 마그네슘, 칼슘, 및 구아니디늄으로부터 선택된 양이온, 및 클로라이드, 나이트레이트, 브로마이드, 클로레이트, 아이오다이드, 퍼클로레이트, 및 티오시아네이트로부터 선택된 음이온을 가진 염일 수 있다. 한 특정 구체예에서, 카오트로픽 작용제는 CaCl₂, 예를 들어, 500 mM CaCl₂이다. 또 다른 특정 구체예에서, 카오트로픽 작용제는 MgCl₂, 예를 들어, 500 mM MgCl₂이다.

한 구체예에서, 헤테로다이머는 이중특이적 항체이다. 본원에서, 제1 폴리펩타이드는 단백질 A에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고 ("Fc") 제2 폴리펩타이드는 단백질 A에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함한다 ("Fc*"). 일부 경우에서, 제2 폴리펩타이드는 그것의 CH3 도메인에서 H435R/Y436F ("별표"로도 알려져 있음) 치환을 포함한다 ("Fc*"). 따라서, 일부 구체예에서, 제1 호모다이머는 두 개의 치환되지 않은 CH3 도메인을 가지는 단일특이적 항체이고 (즉, FcFc); 제2 호모다이머는 두 개의 H435R/Y436F 치환된 CH3 도메인을 가지는 단일특이적 항체이며 (즉, Fc*Fc*); 헤테로다이머는 하나의 치환되지 않은 CH3 도메인 및 하나의 H435R/Y436F 치환된 CH3 도메인을 가지는 이중특이적 항체이다 (즉, Fc*Fc).

한 구체예에서, 제2 친화도 매트릭스로부터 수거된 헤테로다이머는 이어서 산성 pH에서 크로마토그래피 매질 상으로 로딩되고, 더 알칼리성 버퍼에서 및 카오트로픽 작용제 없이 (또는 감소된 수준 또는 미량의 카오트로프) 상기 매질로부터 용리된다. 한 경우에서, 크로마토그래피 매질은 다중 모드 크로마토그래피 레진이다. 헤테로다이머는 추가로 정제될 수 있다.

제3 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 양태의 방법에 따라 제조된 정제된 헤테로다이머에 관한 것이다. 한 구체예에서, 헤테로다이머는 이중특이적 항체이다.

도 1은 bsAb E의 정제를 위해 재조합 단백질 A 레진 (MABSELECT XTRA™, 패널 A), 및 VH 결합이 없는 조작된 단백질 A-기반 레진 (MABSELECT SURE™, 패널 B)을 이용한 용리 단계 중에 pH (점선) 및 280 nm에서의 흡광도 (실선)를 예시하는 크로마토그램을 도시한다.
도 2는 고정상으로서 MABSELECT SURE™ (열린 원), 또는 POROS MABCAPTURE A™ (닫힌 정사각형)으로 40 mM 아세테이트, 500 mM 칼슘 클로라이드 중 30 컬럼 부피 ("CV") 구배 용리 중 체류 시간의 함수로서 이중특이적 (Fc*Fc) 및 비-CH3-치환된 호모다이머 (FcFc) 피크 사이에서 얻어진 피크 분해능 (Rs)을 도시한다.
도 3은 개질제로서 용리 이동상에 첨가된 나트륨 시트레이트 (패널 A), 나트륨 클로라이드 (패널 B), 마그네슘 클로라이드 (패널 C), 또는 칼슘 클로라이드 (패널 D)로 bsAb A의 정제를 위한 용리 단계 중에 pH (점선) 및 280 nm에서의 흡광도 (실선)를 예시하는 크로마토그램을 도시한다. 이중특이적 피크 분별은 수직 점선으로 표시된다.
도 4는 VH 도메인 SpA 결합을 나타내는 것과 (패널 A) 이것을 나타내지 않는 (패널 B) 별표 치환-함유 (CH3-치환됨, Fc*) 이중특이적 항체 (Fc*Fc)에 대한 정제 공정의 흐름 계획을 도시한다.

본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 이와 같이 방법 및 조건이 달라질 수도 있다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술하기 위한 목적만을 위한 것이며, 본 발명의 범위가 청구범위에 의해 한정되기 때문에, 제한하려는 의도는 없는 것으로 이해해야 한다.

달리 한정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 업계의 당업자에 의해 흔히 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. 본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 이제 기술된다. 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 포함된다.

용어 "항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 네 개의 폴리펩타이드 사슬, 이황화 결합에 의해 서로 연결된 두 개의 중쇄 (H) 및 두 개의 경쇄 (L)로 구성된 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 축약됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불리는, 더 보존된 영역과 함께 산재하는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 불리는, 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 축약될 수도 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 축약될 수도 있다. 용어 "고친화도" 항체는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), 예를 들어, BIACORE™ 또는 용액-친화도 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 표적에 대하여 적어도 10^-9 M, 적어도 10^-1 M; 적어도 10^-11 M; 또는 적어도 10^-12 M의 결합 친화도를 가지는 상기 항체를 말한다.

구절 "이중특이적 항체"는 둘 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 두 개의 다른 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 두 개의 다른 분자 (예를 들어, 항원) 또는 같은 분자 (예를 들어, 같은 항원) 상에서 다른 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체가 두 개의 다른 에피토프 (제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 적어도 1 내지 2 또는 3 또는 4배 더 낮은 규모이고, 그 반대도 가능하다. 이중특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 같거나 다른 표적 상에 (예를 들어, 같거나 다른 단백질 상에) 있을 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어, 같은 항원의 다른 에피토프를 인식하는 중쇄를 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 같은 항원의 다른 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 다른 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이적 항체는 각각 세 개의 중쇄 CDR, 이어서 (N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지(hinge), CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 가지는 두 개의 중쇄, 및 항원-결합 특이성을 부여하는 것은 아니지만 각각의 중쇄와 회합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 회합할 수 있고 하나 또는 두 개의 에피토프에 중쇄 중 하나 또는 둘 다의 결합을 가능하게 하는 면역글로불린 경쇄를 가진다.

구절 "중쇄", 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않는 한, 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 달리 명시되지 않는 한, 세 개의 중쇄 CDR 및 네 개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 이것들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는, 가변 도메인 다음에 (N-말단에서 C-말단으로), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 가진다. 중쇄의 기능적 단편은 항원을 특이적으로 인식 (예를 들어, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 항원을 인식) 가능한 단편을 포함하는데, 이것은 세포로부터 발현되고 분비될 수 있으며, 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

구절 "경쇄"는 임의의 유기체의 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않는 한 인간 카파 및 람다 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 (VL) 도메인은 전형적으로, 달리 명시되지 않는 한, 세 개의 경쇄 CDR 및 네 개의 프레임워크 (FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는, 아미노 말단에서 카르복시 말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인, 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 경쇄는, 예를 들어, 항원-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 또는 제2 항원에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 적합한 경쇄는 기존의 항체 라이브러리 (습식 라이브러리 또는 인 실리코(in silico))에서 가장 흔하게 이용되는 경쇄에 대하여 스크리닝함으로써 확인될 수 있는 것들을 포함하는데, 경쇄는 항원-결합 단백질의 항원-결합 도메인의 친화도 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않는다. 적합한 경쇄는 항원-결합 단백질의 항원-결합 영역에 의해 결합된 하나 또는 두 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것들을 포함한다.

구절 "가변 도메인"은 N-말단에서 C-말단으로의 순서로 (달리 지시되지 않는 한) 다음 아미노산 영역을 포함하는 (원하는 대로 변형된) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. "가변 도메인"은 이중 베타 시트 구조를 가진 표준 도메인 (VH 또는 VL)으로 폴딩될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는데 베타 시트는 제1 베타 시트 및 제2 베타 시트의 잔기 사이에서 이황화 결합에 의해 연결된다.

구절 "상보성 결정 영역", 또는 용어 "CDR"은 보통은 (즉, 야생형 동물에서는) 면역글로불린 분자 (예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 두 개의 프레임워크 영역 사이에 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은, 예를 들어, 생식세포 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열에 의해, 및, 예를 들어, 나이브(naive) 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. 일부 상황에서는 (예를 들어, CDR3에 대하여), CDR은 인접하지 않지만 (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) B 세포 핵산 서열에서는, 예를 들어, 서열의 스플라이싱 또는 연결 (예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 결과로서 인접한 둘 이상의 서열 (예를 들어, 생식세포 서열)에 의해 암호화될 수 있다.

구절 "Fc-함유 단백질"은 항체, 이중특이적 항체, 면역접합체, 및 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역의 적어도 기능적 일부를 포함하는 다른 결합 단백질을 포함한다. "기능적 일부"는 Fc 수용체 (예를 들어, FcγR; 또는 FcRn, 즉, 신생 Fc 수용체)에 결합할 수 있고, 및/또는 보체의 활성화에 참여할 수 있는 CH2 및 CH3 영역을 말한다. CH2 및 CH3 영역이 결실, 치환, 및/또는 삽입 또는 CH2 및 CH3 영역을 임의의 Fc 수용체에 결합할 수 없게 만들고 또한 보체를 활성화시킬 수 없는 다른 변형을 함유하는 경우, CH2 및 CH3 영역은 기능적인 것이 아니다.

Fc-함유 단백질은 면역글로불린 도메인에서의 변형을 포함할 수 있으며, 변형은 결합 단백질의 하나 이상의 효과기 기능에 영향을 주는 경우 (예를 들어, FcγR 결합, FcRn 결합 및 따라서 반감기, 및/또는 CDC 활성에 영향을 주는 변형)을 포함한다. 이러한 변형은 면역글로불린 불변 영역의 EU 넘버링에 관하여 다음 변형 및 이것들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, 및 439.

제한되는 것은 아니고, 예를 들어, 결합 단백질은 Fc-함유 단백질이고 향상된 혈청 반감기를 나타내며 (전술된 변형(들)이 없는 같은 Fc-함유 단백질과 비교하여) 위치 250 (예를 들어, E 또는 Q)에서의 변형; 250 및 428 (예를 들어, L 또는 F)에서의 변형; 252 (예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들어, S 또는 T), 및 256 (예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 428 및/또는 433 (예를 들어, L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 307 또는 308 (예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 가진다. 또 다른 예에서, 변형은 428L (예를 들어, M428L) 및 434S (예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I (예를 들어, V259I), 및 308F (예를 들어, V308F) 변형; 433K (예를 들어, H433K) 및 434 (예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예를 들어, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형 (예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함할 수 있다.

용어 "별표 치환", "Fc*", 및 "HC*"는 CH3 도메인 내에서 단백질 A로의 결합을 폐지하는 서열을 함유하는 임의의 분자, 면역글로불린 중쇄, Fc 단편, Fc-함유 분자 등을 포함한다. 인간 IgG3는 단백질 A에 결합하지 않기 때문에, 그것이 마우스-래트 하이브리드(hybrid)에 사용된 것과 유사한 정제 전략으로 잠재적으로 다른 세 가지 인간 IgG 서브클래스 중 어느 것과도 함께 사용될 수 있다고 이전에 언급되었다 (Lindhofer, H. et ai (1995) J. Immunol. 155:219-225)). 하지만, 네 가지 인간 IgG 서브클래스 모두의 서열은 매우 상동성이지만, IgG1, IgG2, 및 IgG4의 Fc 부분이 IgG3과 얼마나 쉽게 헤테로다이머를 형성하는지는 알려져 있지 않으며; 심지어 단지 호모다이머의 우선적인 형성만이 특정 상황 (예를 들어, 콰드로마(quadroma)로부터의 단리)에서 원하는 헤테로다이머의 총 수확량에 대하여 부정적인 영향을 가질 것이다. IgG3가 단백질 A에 결합할 수 없음은 단일 아미노산 잔기, Arg435 (EU 넘버링; IMGT에 의해서는 Arg95)에 의해 결정되며, 다른 IgG 서브클래스에서 상응하는 위치는 히스티딘 잔기에 의해 점유되는 것으로 보고되었다 (Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34)). 그러므로 IgG3 대신에, His435가 Arg로 돌연변이되는 IgG1 서열을 사용하는 것이 가능하다. 따라서, IgG1에서 한점 돌연변이는 새로운 정제 계획에 따라 상이한 결합 친화도를 생성하기에 충분해야 한다. 이 변형은 단백질 A에 결합할 수 없음을 나타내기 위해 IgG1 ΔA (및, 유사하게는, IgG2ΔA 및 IgG4ΔA ― 또는 더 일반적으로, FcΔA)로 불릴 것이다.

하지만, 명시된 점 돌연변이는 돌연변이 전반에 걸쳐 잠재적으로 면역원성일 수 있는 새로운 펩타이드 서열을 도입한다. 점 돌연변이는 이론상 MHC 클래스 II 분자로 로딩되어 T 세포에 제공될 수 있으며, 그 결과 면역 반응을 유도한다. 이 곤란함을 방지하기 위해서, 디펩타이드 돌연변이, H435R/Y436F (EU 넘버링; IMGT에 의해서는 H95R/Y96F)가 사용될 수 있다. 변화의 부근에서 결과로 발생한 서열은 IgG3의 것과 동일하며, 그러므로 면역학적으로 "비가시적"일 것으로 예상되는데, T 세포로의 제공에 이용 가능한 비-고유 짧은 펩타이드가 없기 때문이다. 이러한 이중 돌연변이는 여전히 단백질 A에 결합하지 않는 것으로 보고되었다 (Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34). 마지막으로, 디펩타이드 돌연변이는 Fc 다이머 계면을 형성하는 잔기 중 어느 것도 포함하지 않으며, 그래서 헤테로다이머의 형성을 방해할 가능성이 낮다. 이러한 디펩타이드 돌연변이는 "별표 치환"으로 지칭한다.

용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하는데 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포 (단일 세포 또는 다중 세포), 박테리아 세포 (예를 들어, 대장균(E. coli), 바실루스 종(Bacillus spp .), 스트렙토미세스 종(Streptomyces spp.), 등의 균주), 미코박테리아 세포, 균류 세포, 효모 세포 (예를 들어, 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(S. pombe), 피치아 파스토리스(P. pastoris), 피치아 메타놀리카(P. m에탄올ica), 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스(baculovirus)-감염된 곤충 세포, 트리초플러시아 니(Trichoplusia ni), 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합체, 예를 들어, 하이브리도마(hybridoma) 또는 콰드로마를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 진핵세포이고 다음 세포들로부터 선택된다: CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종(myeloma) 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 구체예에서, 세포, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PER.C6™ 세포)는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함한다.

구절 "이동상 개질제"는 단백질 간의 비-특이적 (즉, 비-친화적) 이온성 및 다른 비-공유 상호작용의 효과를 감소시키거나, 또는 상기 상호작용을 방해하는 모이어티를 포함한다. "이동상 개질제"는, 예를 들어, 염, 아세테이트와 I족 및 II족 금속의 바이카보네이트, 카보네이트, 할로겐 (예를 들어, 클로라이드 또는 플루오라이드), 나이트레이트, 포스페이트, 또는 설페이트와의 이온성 조합을 포함한다. "이동상 개질제"의 비-제한적 예시의 목록은 아세테이트의 베릴륨, 리튬, 나트륨, 및 칼륨 염; 나트륨 및 칼륨 바이카보네이트; 리튬, 나트륨, 칼륨, 및 세슘 카보네이트; 리튬, 나트륨, 칼륨, 세슘, 및 마그네슘 클로라이드; 나트륨 및 칼륨 플루오라이드; 나트륨, 칼륨, 및 칼슘 나이트레이트; 나트륨 및 칼륨 포스페이트; 및 칼슘 및 마그네슘 설페이트를 포함한다.

"이동상 개질제"는 또한 카오트로픽 작용제를 포함하며, 이것은 비-공유 결합력을 약화시키거나 그렇지 않으면 방해하고 생체 분자 시스템 내 엔트로피를 증가시킨다. 카오트로픽 작용제의 비-제한적 예는 부탄올, 칼슘 클로라이드, 에탄올, 구아니디늄 클로라이드, 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 페놀, 프로판올, 나트륨 도데실 설페이트, 티오유레아, 및 유레아를 포함한다. 카오트로픽 작용제는 단백질의 가용성에 영향을 주는 염을 포함한다. 더 카오트로픽한 음이온은, 예를 들어, 클로라이드, 나이트레이트, 브로마이드, 클로레이트, 아이오다이드, 퍼클로레이트, 및 티오시아네이트를 포함한다. 더 카오트로픽한 양이온은, 예를 들어, 리튬, 마그네슘, 칼슘, 및 구아니디늄을 포함한다.

"이동상 개질제"는, pH 구배 또는 단계에 첨가시, 또는 "이동상 개질제"에서 단백질 A 지지물의 평형화 및 pH 단계 또는 구배의 적용시, 호모다이머 IgG 및 헤테로다이머 IgG (예를 들어, 야생형 인간 IgG 및 본원에서 기술된 바와 같이 CH3 도메인의 하나 이상의 변형을 함유하는 같은 IgG)의 용리 사이의 pH 단위 거리를 확장하는 결과를 초래하는 이온성 또는 다른 비-공유 상호작용에 영향을 주는 상기 모이어티를 포함한다. "이동상 개질제"의 적합한 농도는 같은 컬럼, pH 단계 또는 구배를 이용한 그것의 농도에 의해 결정될 수 있으며, 주어진 pH 단계 또는 pH 구배에서 최대 pH 거리에 도달할 때까지 "이동상 개질제"의 농도를 증가시킨다. "이동상 개질제"는 또한 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 등을 포함하는 비-극성 개질제를 포함할 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "친화도 크로마토그래피"는 크로마토그래피 분리를 수행하기 위해 등전점, 소수성, 또는 크기와 같은 생체 분자의 일반적인 성질보다는 생체 분자 간 특이적, 가역적 상호작용을 사용하는 크로마토그래피 방법이다. "단백질 A 친화도 크로마토그래피" 또는 "단백질 A 크로마토그래피"는 면역글로불린 분자의 Fc 부분에 대한 단백질 A의 IgG 결합 도메인의 친화도를 사용하는 특이적 친화도 크로마토그래피 방법을 말한다. 이 Fc 부분은 인간 또는 동물 면역글로불린 불변 도메인 CH2 및 CH3 또는 이것들과 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인을 포함한다. 단백질 A는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포벽의 고유한 단백질, 재조합 또는 합성 방법에 의해 생산된 단백질 A, Fc 영역에 결합하는 능력을 보유한 변종을 포함한다. 실제로는, 단백질 A 크로마토그래피는 고체 지지물에 고정된 단백질 A의 사용을 수반한다. Gagnon, Protein A Affinity Chromotography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, Validated Biosystems, 1996 참조. 단백질 G 및 단백질 L은 또한 친화도 크로마토그래피에 사용될 수도 있다. 고체 지지물은 단백질 A가 부착되는 비-수성 매트릭스이다. 이러한 지지물은 아가로스, 세파로스, 유리, 실리카, 폴리스티렌, 나이트로셀룰로스, 목탄, 모래, 셀룰로스 및 임의의 다른 적합한 재료를 포함한다. 이러한 재료들은 업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 적합한 방법이 제2 단백질을 고체 지지물에 부착시키는데 사용될 수 있다. 단백질을 적합한 고체 지지물에 부착시키는 방법은 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Ostrove, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182: 357-371, 1990 참조. 고정된 단백질 A가 있거나 없는 이러한 고체 지지물은, 예를 들어, Vector Laboratory (Burlingame, Calif.), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.), BioRad (Hercules, Calif.), Amersham Biosciences (part of GE Healthcare, Uppsala, Sweden), Pall (Port Washington, NY) 및 EMD-Millipore (Billerica, Mass.)를 포함하는 많은 상업적 공급처로부터 쉽게 이용 가능하다. 포어 유리 매트릭스에 고정된 단백질 A는 PROSEP®-A (Millipore)로서 상업적으로 이용 가능하다. 고체상은 또한 아가로스-기반 매트릭스일 수도 있다. 아가로스 매트릭스 상에 고정된 단백질 A는 MABSELECT™ (Amersham Biosciences)로서 상업적으로 이용 가능하다.

친화도 크로마토그래피는 또한 항체, 항체의 단편, 또는 면역글로불린 도메인 및/또는 서열을 함유하는 키메라 융합 단백질에 선택적으로 결합하고 따라서 이것들을 정제하는데 사용될 수 있는 매질을 포함한다. 항체는 IgG, IgA, IgM, IgY, IgD 및 IgE 유형을 포함한다. 항체는 또한 단일 사슬 항체, 예를 들어, 카멜리드(camelid) 항체, 조작된 카멜리드 항체, 단일 사슬 항체, 단일-도메인 항체, 나노바디, 등을 포함한다. 항체 단편은 VH, VL, CL, CH 서열을 포함한다. 항체 단편 및 항체 서열을 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어, F(ab')₃, F(ab')₂, Fab, Fc, Fv, dsFv, (scFv)₂, scFv, scAb, 미니바디, 디아바디, 트라이아바디, 테트라바디, Fc-융합 단백질, 트랩(trap) 분자, 등을 포함한다 (Ayyar et al., Methods 56 (2012): 116-129 참조). 이러한 친화도 크로마토그래피 매질은 항체, 그것들의 단편, 및 상기 단편을 함유하는 융합 단백질에 선택적으로 결합하는 리간드를 함유할 수도 있다. 이러한 리간드는 항체 결합 단백질, 박테리아 유래 수용체, 항원, 렉틴 또는 표적 분자로 향하는 항-항체를 포함한다. 항체는 정제를 필요로 한다. 예를 들어, IgG-CH1, IgG-Fc, IgG-CH3, IgG1, LC-카파, LC-람다, IgG3/4, IgA, IgM, 등 중 임의의 하나 이상으로 향하게 되는 카멜리드-유래 친화도 리간드가 친화도 리간드로서 사용될 수도 있다 (CAPTURESELECT 크로마토그래피 레진, Life Technologies, Inc., Carlsbad, Calif.로서 상업적으로 이용 가능함).

실시예 1: 피크 분해능 공정

이중특이적 항체를 다음과 같이 별표 치환을 이용하여 단백질 A 크로마토그래피를 통해 오염된 호모다이머로부터 분리하였다. Fc*Fc* 호모다이머가 Fc 영역으로부터 결실된 두 개의 단백질 A 결합 부위를 갖기 때문에, 이 생성물-관련 불순물은 컬럼을 통해 흘러나가서 제거될 것으로 예상하는 한편 이중특이적 및 FcFc 호모다이머는 컬럼 상에 남아있을 것으로 예상하였다. 일련의 세척을 적용하여 CHO DNA 또는 숙주 세포 단백질 (HCP)과 같은 공정-관련 오염물질을 제거하였다. 이어서 이중특이체는 pH 구배 또는 단계를 통해 선택적으로 용리되는 한편 FcFc 오염물질은 이중특이체에 비해 더 강력한 결합으로 인해 남아있었다.

재조합 포도상구균 단백질 A (SpA) 크로마토그래피 레진을 사용하여 초기 실험을 수행할 때 이중특이체로부터 이중특이체로의 분리 성능의 다양성을 관찰하였다. 결합 FcFc 호모다이머 및 이중특이적 생성물 사이의 베이스라인 분해능이 얻어지는 반면에, 일부 경우에서는, 이중특이적 항체 ("bsAb")의 부분군은 매우 불량한 분해능을 나타냈다. 이 분자들에 대하여, 개선된 염기 안정성을 나타내도록 조작된 친화도 레진 상에서 분리를 수행할 때 우수한 분해능을 얻을 수 있다. 이것의 한 예는 bsAb E이며, 이것에 대하여 수확된 정화된 세포 배양액을 SpA 레진 (MABSELECT XTRA™, 도 1A) 또는 조작된 단백질 A-기반 레진 (MABSELECT SURE™, 도 1B) 상에 5 g/L로 로딩하였다.

일련의 (예를 들어, pH 6 - 8) 버퍼 세척 단계 이후, 40mM 아세테이트 500mM NaCl 중에서 pH 5에서 3으로 40 컬럼 부피 ("CV") 구배를 결합된 종을 용리하는데 적용하였다. MABSELECT XTRA™ (도 1A) 상에서 25 - 35 CV 사이의 용리 피크는 분해능이 없는 이중특이적 및 FcFc 호모다이머 둘 다를 함유하였다. 게다가, Fc*Fc* 오염물질의 Fc 영역에서 단백질 A 결합이 없음에도 불구하고, 선도 얕은 용리 피크(leading shallow elution peak) (0 - 25 CV)는 Fc*Fc* 호모다이머 단백질로 이루어져 있다. 하지만, MABSELECT SURE™에 적용된 같은 bsAb E 로드는 각각 이중특이적 및 FcFc 호모다이머를 함유하는 두 개의 잘 분해된 피크를 수득하였으며 (도 1B), 모든 Fc*Fc* 호모다이머는 로드 중에 컬럼을 통해 흘러나간다. 이것은 IgG 및 고유한 단백질 A ("SpA")와 조작된 SuRe 리간드 간의 상이한 상호작용에 의해 유발될 수도 있다.

고전적인 결합 부위 이외에, 일부 항체는 중쇄 ("VH")의 가변 영역 상에서 대안의 SpA 결합 부위를 함유하는 것으로 나타났다. 특히, 인간 VH3 유전자 패밀리의 중쇄를 함유하는 일부 IgG가 이 행동을 나타내는 것으로 보여지며, 인간 VH 생식세포 유전자 중 거의 절반이 VH3 서브패밀리에 속한다. (Sasso et al., Journal of Immunology 1989; 142:2778-83; Sasso et al., Journal of Immunology 1991; 147:1877-83; Schroeder et al., International immunology 1990; 2:41-50; 및 Walter, M.A., and D.W. Cox, American Journal of Human Genetics 1988; 42:446-51 참조). 그러므로 SpA-기반 레진 상에서, bsAb E와 같은 이중특이적 항체는 VH 결합으로 인해 두 개의 결합하는 종의 불량한 분해능 및 "비-결합" Fc*Fc* 호모다이머 레진의 체류를 나타낼 가능성이 높은 것으로 보인다. 따라서 VH 결합은 이중특이적, 및 FcFc 호모다이머 간의 결합력 차이, 및 Fc*Fc*의 저친화도 결합을 감소시킬 것으로 생각된다.

이 가설은 MABSELECT SURE™으로 관찰된 개선된 정제에 의해 지지된다. SpA 및 항체 간의 결합 연구는 SpA의 다섯 개의 도메인 (E, D, A, B 및 C) 모두가 Fc-영역을 통해 IgG에 결합하는 한편, 단지 도메인 D 및 E만이 유의한 Fab 결합을 나타낸다는 것을 보여주었다. (예를 들어, Starovasnik et al., Protein Science 1999; 8:1423-31 참조). 조작된 MABSELECT SURE™ 친화도 리간드는 고유한, 비-Fab 결합 SpA B 도메인의 단백질-조작된 버전인 Z-도메인의 테트라머이다. Z-도메인은 항체 가변 영역으로 무시해도 될 정도의 결합을 갖는 것으로 알려져 있다 (Starovasnik, supra). 그러므로 MABSELECT SURE™ 리간드를 가지고 있는 이 레진이 사용될 때, 이중특이적 및 FcFc 호모다이머 간의 증가된 결합력의 차이는 상기 피크의 개선된 분해능을 허용하고; Fc*Fc* 호모다이머는 남아있지 않다.

이중특이적 임상적 및 상업적 생산을 위한 레진을 확인하기 위해 다수의 단백질 A-기반 크로마토그래피 레진을 스크리닝하였다. 두 개의 bsAb를 평가를 위해 선택하였는데, 하나는 VH 영역을 통해 SpA에 결합하는 것으로 앞서 관찰되었고 (bsAb A) 하나는 이 능력이 없다 (bsAb B). 로드 재료에 표준 양성 방식 친화도 크로마토그래피를 실시하여 불순물을 제거하였다. 시작 이중특이적 순도 (Fc*Fc/[Fc*Fc + Fc*Fc* + FcFc])는 bsAb A 및 bsAb B에 대하여 각각 84% 및 76%였다. 모든 레진을 10 g 총 단백질/L 레진으로 로딩하였다. 일련의 세척 이후 항체를 이동상 개질제로서 500 mM NaCl 또는 500 mM CaCl₂와 함께 pH 6에서 3으로의 30 CV 구배를 사용하여 용리하였다.

선택된 여섯 개의 상업적으로 이용 가능한 단백질 A 레진은 다양한 염기 매트릭스, 비드 크기 및 리간드 유형을 나타낸다. 레진 중 넷은 SpA를 사용하였는데, 하나는 Z-도메인의 테트라머 (MABSELECT SURE™)이고, 하나는 Y-도메인 (TOYOPEARL AF-rProtein A-650F)으로 불리는 비-Fab 결합 C 도메인의 염기 안정화된 버전의 멀티머이다. 이중특이적 생성물 및 결합 FcFc 호모다이머 사이에서 얻어진 이 데이터들 및 피크 분해능 (Rs = 1.18([t_R2 - t_R1]/[W½₂ + W½₁]; 여기에서 Rs는 피크 분해능이고, W½은 절반 높이에서 피크 너비이고, t_R 는 체류시간임)은 표 1에서 상세히 기술된다.

용리 버퍼 내에서 이동상 개질제로서 NaCl을 사용할 때, 증가된 분해능은 비드 크기에 반비례하는 것으로 나타났으며, 45 μm보다 더 큰 평균 입자를 가진 SpA 레진에 대해서는 분해능이 관찰되지 않았다. 흥미롭게도 MABSELECT SURE™ (Rs=0.92)은 bsAb A를 이용하여 TOYOPEARL AF-rProtein A-650F (Rs=0.87)와 비슷한 성능을 보였다. 이것을 (i) TOYOPEARL AF-rProtein A-650F에 대하여 더 작은 평균 비드 크기 (45 cf. 85 μm) 및 (ii) Y-도메인 (C 도메인으로부터 유래됨)을 기반으로 하는 친화도 리간드의 유사성으로 인해 예상하지 못했고 따라서 VH 결합이 없을 것으로 예상하였다 (Starovasnik, supra). bsAb B에 대하여, POROS MABCAPTURE A™는 더 작은 입자 크기를 갖지 않음에도 불구하고 TOYOPEARL AF-rProtein A-650F 및 AbSolute HiCap™과 비교하여 우수한 분해능을 나타냈다 (각각 2.37 및 2.41에 비교하여 2.50). 이것을 물질 전달을 돕는 큰 통과 포어, 및 1100 옹스트롬의 평균 포어 직경에 의해 촉진된 이 염기 매트릭스에서 관류성 흐름의 요소 때문인 것으로 가정하였다. POROS MABCAPTURE A™은 또한 어느 다른 SpA 레진보다도 bsAb A의 더 나은 분해능을 나타냈으며, TOYOPEARL AF-rProtein A-650F 및 MABSELECT SURE™의 비-VH 결합 레진과 비슷한 분해능을 가진다 (각각 0.87 및 0.92와 비교하여 0.70).

이동상 개질제로서 NaCl을 CaCl₂로 대체할 때, POROS MABCAPTURE A™은 분해 능력을 크게 개선하는 것으로 관찰되었으며, 큰 차이로 MABSELECT SURE™을 능가하였다 (각각 1.83 c.f. 1.08의 Rs). 이 데이터 전체에 기초하여, POROS MABCAPTURE A™ 및 MABSELECT SURE™을 등용매 용리에 대하여 가능한 분해 크로마토그래피 레진으로서 추가로 평가하였다.

400 cm/h의 비교적 빠른 선속도에서 레진 비교를 수행하였기 때문에, MABSELECT SURE 레진은 (i) 더 큰 비드 크기 및 (ii) 관류 흐름의 결여로 인해 POROS MABCAPTURE A에 비해 효능이 감소되었을 수도 있다. 그러므로 레진을 생산 관련 범위의 체류 시간에서 비교하였다. BsAb A를 VH 영역을 통해 SpA로의 관찰된 결합으로 인해 모델 분자로서 선택하였다 (이로 인해 이중특이적 및 FcFc 불순물 간의 더 큰 결합력 차이를 비-VH 결합 MABSELECT SURE에게 제공함). 이 결합력 이점 없이 MABSELECT SURE는 MABCAPTURE A의 더 작은 비드 크기로 인해 불량할 것으로 예상되기 때문에, 이 평가를 위해 VH 결합 항체를 선택하였다는 것을 알아야 한다. 레진 평가 연구에 사용된 바와 같이 친화도 캡쳐된 bsAb A 로드 재료를 10 g 총 단백질/L 레진 시도로 사용하였다. 모든 크로마토그래피 단계는 2-8 분까지 (600-150 cm/h) 다양한 용리를 제외하고 3분 체류 시간 내에 수행하였다. FcFc 호모다이머 피크로부터 이중특이적 피크의 분해능의 계산은 레진의 분해능이 체류 시간에 따라 증가하였지만, 효과는 POROS MABCAPTURE A보다 MABSELECT SURE에 대하여 더 확연하다는 것을 보여주었다 (각각 0.7 및 0.3의 Rs 증가, 도 2). 추가적으로, POROS MABCAPTURE A 레진은 이 레진에 대한 VH 결합의 단점에도 불구하고 테스트된 모든 조건에서 MABSELECT SURE에 대하여 우수한 분해능을 보여주었으며, 두 개의 결합 종의 분해 능력에 관하여 전체적인 우수성을 확인하였다.

용리 버퍼 내 이동상 개질제의 포함은 FcFc 호모다이머로부터 이중특이적 생성물의 분해능을 변형하였고 잠재적으로 개선하였다 (표 1 참조). 따라서, 호프마이스터 계열(Hofmeister series) 상에서 다양한 위치의 염의 사용이 항체 종 및 단백질 A 리간드 간의 소수성 상호작용의 조정에 의해 레진 선택성을 개선하는 것으로 가정하였다. VH-결합 bsAb A를 MABCAPTURE A 레진 상에서 10 g/L로 로딩하였다. 일련의 세척 후 항체를 용리 이동상 개질제, 나트륨 시트레이트, 나트륨 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 및 칼슘 클로라이드와 함께 pH 6에서 3으로의 30 CV 구배를 사용하여 용리하였으며, 호프마이스터 계열 내에서 코스모트로프(kosmotroph)에서 카오트로프로의 순서로 순위가 매겨진다. 500 mM의 염 수준을 나트륨 시트레이트를 제외한 모든 염에 사용하였으며, 300 mM 이상의 농도로 급등할 때 로드 재료 내 단백질 침전으로 인해 250 mM를 사용하였다. 더 많은 카오트로픽 염을 이용하여 이중특이적 생성물 및 결합 FcFc 호모다이머 간의 훌륭한 분해능을 얻었다 (도 3). 이중특이적 피크를 도 3에서 상세히 기술된 바와 같이 제1 피크 리프트오프(liftoff)에서 피크 변곡점까지 수거하였다. 퍼센트 이중특이적 수율, 퍼센트 이중특이적 순도, 피크 분해능 (Rs) 및 퍼센트 가용성 응집체를 측정하였다 (표 2). 이중특이적 pH 정점에서의 pH를 또한 크로마토그램으로부터 계산하였다. 더 많은 카오트로픽 염 (칼슘 클로라이드 및 마그네슘 클로라이드)의 사용은 증가된 수율 및 이중특이적 순도를 나타냈다. 단백질을 또한 마그네슘 클로라이드 및 칼슘 클로라이드를 이용하여 더 높은 pH에서 용리하였다. 사용된 가장 카오트로픽하고 가장 코스모트로픽한 염은 둘 다 이중특이체의 용리 중에 유의한 응집을 유도하지 않았다. 그러므로 용리 버퍼 내 이동상 개질제로서 칼슘 클로라이드와 같은 카오트로픽 염의 사용은 bsAb의 피크 분해능 및 추후 정제를 향상시키는 것으로 나타났다.

실시예 2: 상업적 공정의 개발

이중특이적 항체의 정제를 위한 별표 치환 기반 플랫폼의 실현 가능성을 결정하기 위해서, bsAb C의 정제를 위한 확장 가능한 공정을 개발하였다. 이 단백질이 SpA로의 유의한 VH 결합을 나타내는 것으로 발견되었기 때문에 플랫폼에 대한 최악의 경우 테스트로서 선택하였다. 주요 개발 목표는 다음과 같다: (i) 버퍼의 소모 및 처리 시간을 감소시키면서 설비 적합성 및 기술 이전을 단순화하기 위한 등용매 (단계) 용리의 달성, (ii) 적은 부하 조건 또는 무부하 조건으로 친화도 분해 단계와 직면하는 폴리싱 단계의 확인.

초기 인자 스크리닝 및 설계 공간 평가를 96-웰 플레이트 포맷 (HTPD)에서 고처리량 스크리닝을 사용하여 수행하였다. 용리 pH, 컬럼 로딩 (g/L 총 단백질) 및 이동상 개질제 농도를 주요 공정 입력값으로서 확인하였다 (도 2 참조). 용리 체류 시간을 또한 고려하였다. 이 연구를 위한 로드 재료에 앞서 표준 양성 방식 친화도 크로마토그래피를 실시하여 Fc*Fc* 불순물을 제거하였으며, 64% 이중특이적 순도를 발생시켰다. 두 개의 18-실행 중심-합성 실험 계획(central-composite design-of-experiment) 연구 (CCD DoE)를 등용매 용리 방식에서 MABSELECT SURE 및 POROS MABCAPTURE A 둘 다를 평가하기 위해 수행하였다. POROS MABCAPTURE A 레진에 대하여 연구된 인자들은 컬럼 로딩 (10-25 g 총 단백질/L의 범위), 용리 pH (4.5-5.5) 및 용리 버퍼 중 칼슘 클로라이드의 농도 (250-500 mM)이다. 체류 시간을 3 분 (400 cm/h)으로 일정하게 유지하였다. 이어서 MABSELECT SURE를 컬럼 로딩 (10-25 g 총 단백질/L의 범위), 용리 pH (3.8-5.0) 및 용리 체류 시간 (5-11 분)에 관하여 평가하였다. 용리 버퍼 중 칼슘 클로라이드 농도를 500 mM에서 일정하게 유지하였다.

MABCAPTURE A에 대하여, 표준 최소 제곱법 알고리즘을 사용하여 이중특이적 수율 (R² = 0.97) 및 이중특이적 순도 (R² = 0.92) 둘 다에 대하여 우수한 모델을 얻었다. 모든 조건에서, 용리 버퍼 중 250 - 500 mM의 칼슘 클로라이드 수준의 증가는 이중특이적 순도를 감소시키지 않으면서 이중특이적 수율을 10 - 20% 만큼 증가시키는 것으로 관찰되었다 (데이터 미도시). 상기 모델을 사용하여, 스위트 스팟(sweet spot) 분석을 500 mM CaCl₂에서 실행하였다. 분석은 5.0 - 5.1의 용리 pH가 > 95%의 순도 목표 및 > 80%의 수율을 허용하여 17-25 g/L의 레진 시도를 충족시킨다는 것을 설명하였다. 유사한 크로마토그래피 조건을 최대 2kL 생산 규모로 사용하였고, 추가의 최적화 후 99%를 초과하는 이중특이적 순도를 얻었다.

MABSELECT SURE 데이터를 평가하여, 이중특이적 수율 (R² = 0.99) 및 이중특이적 순도 (R² = 1.00)에 대한 우수한 모델 적합성을 획득하였다. 체류 시간은 어느 하나의 반응에 대하여 중요한 인자가 아닌 것으로 보여진다. MABCAPTURE A에 대하여, 8분 체류 시간에 제약 조건이 등고선 플롯(contour plot)에 부과되어 이중특이적 수율 < 80% 및 이중특이적 순도 < 95%가 얻어지는 영역을 제외하였다. 바람직한 작동 창 또는 스위트 스팟은 MABCAPTURE A를 이용하여 관찰된 것보다 훨씬 더 작다. 그러므로 MABSELECT SURE의 사용은 작은 pH 또는 로딩 변화가 허용 불가능한 이중특이적 순도 또는 수율을 초래할 수도 있기 때문에 생산 규모에서 불충분한 강건성을 나타내는 공정을 초래할 수도 있다.

실시예 3: 친화도 후 폴리싱 단계

친화도 분해 단계 이후, 이중특이적 항체에 표준 단클론성 항체와 매우 유사한 방식으로 공정 및 생성물 관련 불순물을 제거하기 위한 폴리싱 단계를 실시할 수도 있다. 하지만, 분해 친화도 단계의 용리 버퍼 중 고농도의 칼슘 클로라이드의 사용은 잠재적으로 다운스트림 유닛 작업을 복잡하게 만들 수도 있다. 한외여과/투석여과 (UF/DF)가 양이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피와 같이, 전통적인 mAb 폴리싱 단계를 용이하게 하기 위해서 풀(pool)의 전도도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 하지만, 내염성 양성 방식 크로마토그래피 단계의 확인은 이 추가적인 유닛 작업의 도입을 방지할 수 있다. 다중 모드 또는 혼합 모드 크로마토그래피는 단일 레진과의 소수성 상호작용, 수소 결합 및 이온성 상호작용과 같은 다양한 유형의 상호작용을 결합시킨다. 이것은 내염성 흡착을 용이하게 할 수 있다고 알려져 있다.

다양한 다중 모드 레진을 폴리싱 단계로 간주하였다: (i) CAPTO 부착 및 (ii) CAPTO 부착 IMPRES (이것들 둘 다의 N-벤질-메틸 에탄올 아민 리간드는 음이온 교환, 소수성 및 수소 결합 상호작용 기를 함유함), (iii) 세라믹 하이드록시아파타이트 및 (iv) CAPTO MMC, 소수성 상호작용 및 수소 결합 가능성을 가진 다중 모드 양이온 교환 레진. 궁극적으로, 공정 스트림(stream) 전도도를 낮추면서 공정- 및 생성물-관련 불순물을 동시에 제거하기 위해 CAPTO MMC를 개발하였다. 공정 개발 후, 개념 입증은 제조 규모에서 bsAb C 및 bsAb D를 이용한 양성 방식 CAPTO MMC 크로마토그래피를 이용하여 확인되었다 (표 3 참조). 두 가지 예에서 합리적인 (19-25 g/L) 동적 결합 능력을 수율 ≥ 85%, 가용성 응집체의 최대 3배 감소, 및 중간의 (0.2 - 0.7 log 제거) CHO 숙주 세포 단백질 클리어런스(clearance)로 얻었다.

실시예 4: 정제 전략

상기 제조 및 기술된 발견에 기초하여, 두 개의 다운스트림 이중특이적 공정 플랫폼을 구상된다 (도 4). 이중특이적 항체가 VH3 유전자 단편 패밀리로부터 유래되고 VH 영역을 통해 SpA에 결합할 수 있는 경우, 친화도 캡쳐 크로마토그래피라고 불리는 추가적인 친화도 크로마토그래피 유닛 작업을 이용할 수도 있다 (도 4A). 수확에 의해 세포 및 데브리(debris)의 제거 후, Z-도메인을 통한 VH 결합의 결여가 Fc*Fc* 모체 항체 불순물의 제거를 보장하기 때문에, 친화도 캡쳐 크로마토그래피를 MABSELECT SURE 레진을 사용하여 수행하였다. 이 단계는 상업적 단클론성 항체에 대하여 표준인 단백질 A 결합, 세척 및 용리 조건을 사용하여 수행될 수 있고 또한 단백질 농도를 증가시키고 공정- 및 생성물-관련 불순물을 제거하는 역할을 한다. 단백질이 낮은 pH에서 용리되기 때문에 생성물 풀을 이용하여 바이러스 비활성화를 위해 낮은 pH를 유지하는 것이 편리하다. 이에 따라, FcFc 불순물의 제거를 "친화도 분해 크로마토그래피"로 불리는 제2 양성 모드 단백질 A 단계에 의해 달성하였다. 용리 버퍼 내에서 카오트로픽 개질제와 결합된 POROS MABCAPTURE A 레진의 사용은 > 95% 이중특이적 순도의 풀을 발생시킬 수 있다. 친화도 분해 크로마토그래피 이후, 내염성 다중 모드 크로마토그래피의 사용은 친화도 분해 단계와 직접적으로 연결되고, 따라서 공정 경로로부터 카오트로픽 염을 제거하기 위한 개재 UF/DF 작업에 대한 필요성을 배제하는 것을 용이하게 한다. 음이온 교환 크로마토그래피 및 바이러스 체류형 여과와 같은 추가적인 폴리싱 단계와 결합하여, 응집체, HCP, DNA, 바이러스 및 다른 불순물은 허용 가능한 수준으로 제거될 수 있다. 마지막으로, 정제된 생성물을 표준 한외여과/투석여과 방법에 의해 최종 제형화 버퍼로 농축한다. 이중특이적 분자가 친화도 캡쳐 단계의 제거에 의해 SpA로의 VH 결합을 나타내지 않는 경우 이 정제 열(train)을 간소화할 수 있다 (도 4B). 이 경우에서, FcFc 및 Fc*Fc* 불순물 둘 다의 제거를 친화도 분해 크로마토그래피에 의해 수행할 수 있다.

실시예 5: 재료 및 방법

이 실시예들에서 사용된 모든 이중특이적 항체 및 세포 배양액을 CHO 세포에서 발현시켰다. 크로마토그래피 레진을 제조사로부터 획득하였다: MABSELECT SURE, MABSELECT XTRA, CAPTO MMC (GE Healthcare), POROS MABCAPTURE A (Life Technologies), TOYOPEARL AF-rProtein A-650F (TOSOH Biosciences), ABSOLUTE HIGH CAP (Novasep Inc.), PROSEP ULTRA PLUS (EMD Millipore). 사용된 모든 화학물질은 J.T. Baker에 의해 공급되었다.

실험실 규모 크로마토그래피 분리를 GE Healthcare의 AKTA AVANT 크로마토그래피 시스템 및 1.0 cm 내경 (I.D.) OMNIFIT BENCHMARK 크로마토그래피 컬럼 (Omnifit Ltd)을 사용하여 수행하였다. 중간 실험 규모 크로마토그래피를 GE Healthcare의 AKTA PILOT 크로마토그래피 시스템 및 7.0 cm I.D. INdEX 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 생산 규모 크로마토그래피를 AKTAPROCESS 크로마토그래피 스키드(skid) 및 40 cm I.D. CHROMOFLOW 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 실행하였다. UPLC 분석은 Waters Corporation의 ACQUITY UPLC 시스템을 활용하였다. 세포 배양을 2L BIOSTAT B-DCU 벤치 톱 바이오리액터 (Sartorius), 50, 250, 또는 2000L HYCLONE 1회용 바이오리액터 (Thermo Scientific), 또는 160L 스테인리스 강 바이오리액터 (ABEC Inc.)를 사용하여 수행하였다.

정화된 세포 배양액을 직접 사용하지 않았을 때, 친화도 분해 개발용 로드 재료를 20 ± 1 cm 층고 MABSELECT SURE 컬럼을 사용하여 친화도 캡쳐 크로마토그래피에 의해 생산하였다. 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.2의 2 컬럼 부피 (CV)로 평형화 이후, 컬럼에 10 - 40 g 결합 항체/L로 정화된 세포 배양액과 함께 로딩하였다. 결합 항체 농도는 이중특이적 및 FcFc 역가의 합계로 결정하였다. 컬럼을 세척하였고 2 CV 컬럼 스트립 전에 독점적 버퍼 시스템으로 용리하였다. 전체 용리 피크를 수거하여 2M Tris 염기를 이용하여 pH 7.5 ± 0.5로 중화시켰다.

모든 친화도 분해 크로마토그래피를 20 ± 1 cm 층고 컬럼을 사용하여 수행하였다. 연구된 단백질 A 컬럼을 로드 적용 전에 2 CV 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.2로 평형화하였다. 로딩 후, 컬럼을 독점적 세척 버퍼 시스템으로 세척하였고 명시된 바와 같이 구배 또는 등용매 용리로 용리하였다. 등용매 실행을 위해서, 4 CV 용리 부피를 사용하여, 용리 단계의 시작 이후 0.5 - 4 CV의 풀을 수거하였다. 구배 및 등용매 용리 버퍼 둘 다는 완충 종으로서 40 mM 아세테이트를 함유하였다. 용리 후 컬럼을 2 CV의 버퍼로 스트리핑하였다. 달리 진술되지 않으면 모든 단계를 400 cm/h의 선속도로 수행하였다. UNICORN 6.1 소프트웨어 (GE Healthcare)를, 절반 높이 방법에서의 너비를 사용하여 가우스 피크(Gaussian peak)를 추정하는 피크 분해능 (Rs)의 계산을 포함하는, 크로마토그래피 분석에 사용하였다. 자동화 분별을 수행할 때, 피크 리프트오프를 베이스라인 UV280에서 > 50 mAu 증가로 한정하였다. 실험, 분석 및 모델링의 통계적 설계를 JMP 11.1.1 (SAS Institute Inc.)을 사용하여 수행하였다.

CAPTO MMC 크로마토그래피를 25.1 L 컬럼 (20 cm 층고; 40 cm I.D.)을 사용하여 수행하였으며 모든 단계를 4 분 체류 시간 (선속도 300 cm/h)으로 수행하였다. 친화도 분해 풀을 물로 50% 희석하였고 pH 5.0 ± 0.1로 조정하였다. 컬럼을 40 mM 나트륨 아세테이트, 250 mM 칼슘 클로라이드, pH 5.0 ± 0.1 중 2 CV 평형화 전에 2 CV의 2 M NaCl로 사전 평형화하였다. 로드 적용 후 컬럼을 3 CV의 40 mM Tris, 40 mM 아세테이트, pH 5.0 ± 0.1로 세척한 다음 생성물을 8 CV의 20 mM Tris, 60 mM 아세테이트, pH 8.0 ± 0.1 (bsAb C) 또는 20 mM Tris, 40 mM 아세테이트, pH 8.0 ± 0.1 (bsAb D)로 용리하였다. 풀을 UV_280nm 리프트오프에서 용리 단계의 끝까지 수거하였다. 용리 후, 컬럼을 2 CV의 2 M NaCl에 이어서 2 CV의 1 M NaOH로 세척하였다.

숙주 세포 단백질 ("HCP") 정량화를 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트 Cat#F550 (Cygnus Technologies)를 사용하여 수행하였다. 10 mM 나트륨 포스페이트, 500 mM 나트륨 클로라이드, pH 7.0 이동상 중 연속적으로 두 개의 ACQUITY UPLC PrST SEC 컬럼, 200Å, 1.7 μm, 4.6 mm x 150 mm cat#186005225에 의한 가용성 응집체 정량화. 이중특이적 순도를 연속적으로 세 개의 사전 포장된 POROS A 20 μm 컬럼 (2.1 mm x 30 mm, 0.1mL) cat#2-1001-00 및 등용매 용리 버퍼 시스템을 사용하여 측정하였다. 이중특이적 및 FcFc 역가를 POROS A 20 μm 컬럼 (2.1 mm x 30 mm, 0.1mL) cat#2-1001-00을 사용하여 측정하였고, Fc*Fc* 역가를 POROS G 20 μm 컬럼 (2.1 mm x 30 mm, 0.1 mL) 위에 통과액을 로딩함으로써 측정하였다.

Claims

(a) 친화도 매트릭스에 (i) 제1 폴리펩타이드의 두 개의 카피를 포함하는 제1 호모다이머, (ii) 제2 폴리펩타이드의 두 개의 카피를 포함하는 제2 호모다이머, 및 (iii) 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로다이머를 포함하는 멀티머 단백질의 혼합물을 로딩하는 단계로서, 제1 폴리펩타이드는 단백질 A 리간드에 대한 친화도를 갖고, 친화도 매트릭스에 대해 제2 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도를 가지며, 친화도 매트릭스는 45 μm의 평균 직경을 가지는 다수의 입자를 포함하고 1100 Å의 평균 직경을 가진 포어를 포함하는 기질에 부착된 단백질 A 리간드를 포함하는는, 단계; 및
(b) CaCl₂ 또는 MgCl₂를 포함하고 제1 pH 범위를 가지는 버퍼 내에서 친화도 매트릭스로부터 헤테로다이머를 용리하고 수거하는 단계로서, 제1 호모다이머는 제2 pH 범위의 버퍼 내에서 친화도 매트릭스로부터 용리되고 제2 호모다이머는 제3 pH 범위의 버퍼 내에서 친화도 매트릭스로부터 용리되고, 제3 pH 범위는 제2 pH 범위보다 더 높은 pH를 포함하는 제1 pH 범위보다 더 높은 pH를 포함하는, 단백질 제조 방법.
제1 항에 있어서,
(c) 산성 pH를 가지는 버퍼 내에서 단계 (b)의 수거된 헤테로다이머를 다중 모드 크로마토그래피 레진에 적용하는 단계;
(d) 더 알칼리성인 pH를 가지는 버퍼 내에서 다중 모드 크로마토그래피 레진으로부터 헤테로다이머를 용리하는 단계; 및
(e) 헤테로다이머를 수거하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 기질은 아가로스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 셀룰로스, 제어된 포어 유리, 및 구형 실리카 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 친화도 매트릭스의 리터 당 5 내지 50 그램의 단백질이 로딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 단계 (a)의 로딩된 친화도 매트릭스에 pH 구배를 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5 항에 있어서, pH 구배를 적용하기 전 pH 6-8의 용액으로 단계 (a)의 로딩된 친화도 매트릭스를 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5 항에 있어서, pH 구배는 pH 6 내지 pH 3에서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5 항에 있어서, 제1 pH 범위는 pH 5.5 내지 pH 3.6의 범위로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8 항에 있어서, 버퍼는 아세테이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9 항에 있어서, 버퍼는 40 mM 아세테이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 버퍼는 CaCl₂를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 버퍼는 MgCl₂를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11 항에 있어서, 버퍼는 250-500 mM CaCl₂를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12 항에 있어서, 버퍼는 250-500 mM MgCl₂를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 헤테로다이머는 항체이고, 제1 폴리펩타이드는 단백질 A 리간드에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고 제2 폴리펩타이드는 단백질 A 리간드에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15 항에 있어서, 제2 폴리펩타이드는 그것의 CH3 도메인에서 H435R 및 Y436F 치환 (EU 넘버링)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15 항에 있어서, 헤테로다이머는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제16 항에 있어서, 헤테로다이머는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 멀티머 단백질의 혼합물은 세포 배양물에서 복수의 진핵 세포에 의해 생산되며, 선택적으로 진핵 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 이것의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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