TWI693899B

TWI693899B - 石榴發酵物及其用途

Info

Publication number: TWI693899B
Application number: TW107130400A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 莊偉秀
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-05-21
Also published as: CN110051572A; TW202002809A; CN110051572B

Abstract

本發明提供一種石榴發酵物及其用於調控MMP基因、TIMP基因、及COL4A4基因的表現量、促進膠原蛋白產生及抗老化的用途。

Description

石榴發酵物及其用途

本發明是有關於一種石榴(Punica granatum)發酵物及其用於調控MMP基因、TIMP基因、及COL4A4基因的表現量、促進膠原蛋白產生及抗老化的用途。

皮膚組織是由表皮、真皮及皮下組織所構成，其中真皮含有大量膠原蛋白及玻尿酸，而與皮膚之保水性及彈力息息相關。人類皮膚會隨著年紀、生理因素或環境因素，而有老化、膚質粗糙或產生皺紋等現象，如正常年輕人的皮膚都具一定的彈性和張力，當表情肌鬆弛後，皮膚會很快復原，使皺紋消失；但進入中年後，皮膚開始明顯老化，皮膚變薄、變硬、乾燥、張力降低；真皮膠原蛋白減少、彈力纖維變性、斷裂，使皮膚的張力和彈性降低，因此，當表情肌鬆弛後，皮膚不能很快復原，久之則使皺紋成形；且隨年齡的增大，皮膚和皮下組織更加鬆弛，加上面部支持組織的萎縮或缺失，以及肌肉的鬆軟，皮膚會在重力的作用下發生滑墜，形成更深的皺紋。而肌膚粗糙係由於乾燥、紫外線、清潔劑或化學物質等刺激性物質等外在重要因素，或激素平衡之紊亂等內在重要因素而產生之肌膚困擾，並伴隨角質層屏障功能之下降、角質層水分量之下降、表皮代謝回轉之亢進、鱗屑之產生而角質粗糙化等現象。因此皮膚上的細胞若失去彈性及保濕功能，會引起皮膚褶皺、乾燥及失去光澤等現象。

目前常見用來解決皮膚問題的方式大多為利用塗抹於皮膚表面的醫藥品、保養品，或口服具有抗老化效用的健康食品。然而，習知的醫藥品、保養品及健康食品大多由化學成分所製成，長期使用不但對人體健康有害無益，且這些產品往往價格昂貴，並非為一般使用者所能負擔。

為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出具有促進膠原蛋白產生及抗老化之功效的新穎醫藥品、保養品或食品產品以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明之目的為提供一種石榴發酵物，係藉由一包含下列步驟之方法而製得：(a)以水萃取一石榴而得到一石榴萃取物；以及(b)將石榴萃取物與啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)依序進行發酵而獲得一第一石榴發酵物；其中啤酒酵母菌的濃度介於0.01~0.5%，胚芽乳酸菌的濃度介於0.01~0.25%。

在本發明的一實施例中，釀酒酵母之發酵時間為1至2天，及胚芽乳酸桿菌之發酵時間為1至3天。

在本發明的一實施例中，在步驟(b)中，第一石榴發酵物進一步與醋酸菌(Acetobacter aceti)進行發酵，而獲得一第二石榴發酵物。

在本發明的一實施例中，醋酸菌的濃度介於1~20%。

在本發明的一實施例中，醋酸菌之發酵時間為14至21天。

在本發明的一實施例中，萃取的溫度介於50℃至100℃，及萃取的時間介於0.5至3小時。

本發明之另一目的為提供一種石榴發酵物用於製備一調控基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)基因、基質金屬蛋白酶的組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP)基因、及第IV型膠原蛋白α4鏈(collagen type IV alpha 4 chain,COL4A4)基因的表現量之組合物的用途。

在本發明的一實施例中，組合物是呈醫藥品、食品或保養品的形式。

在本發明的一實施例中，MMP基因是MMP2基因。

在本發明的一實施例中，TIMP基因是TIMP1基因。

本發明之另一目的為提供一種石榴發酵物用於製備一促進膠原蛋白產生及抗老化之組合物的用途，其中組合物是呈醫藥品、食品或保養品的形式。

在本發明的一實施例中，組合物是呈保養品的形式時，石榴發酵物是第一石榴發酵物。

在本發明的一實施例中，組合物是呈食品的形式時，石榴發酵物是第二石榴發酵物。

綜上所述，本發明石榴發酵物的功效在於：可調控MMP基因、TIMP基因及COL4A4基因的表現量，並藉由微生物發酵製程讓石榴總多酚釋出，增加抗氧化與美肌保養作用、促進膠原蛋白產生、降低色素生成與累積、提升肌膚緊緻，達到抗老化及撫平皺紋之功效。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1是本發明石榴發酵物的總多酚含量檢測之數據圖。

圖2是本發明石榴發酵物的抗糖化活性分析之數據圖。

圖3是本發明石榴發酵物在抵抗及防禦UVA能力上的功效之數據圖。

圖4是本發明石榴發酵物在抑制黑色素生成上的功效之數據圖。

圖5是本發明石榴發酵物在抗發炎上的功效之數據圖。

圖6是本發明石榴發酵物在提升皮膚緊緻程度上的功效之數據圖。

圖7是本發明石榴發酵物在調控MMP2基因表現上的功效之數據圖。

圖8是本發明石榴發酵物在調控TIMP1基因表現上的功效之數據圖。

圖9是本發明石榴發酵物在調控COL4A4基因表現上的功效之數據圖。

圖10是本發明石榴發酵物在抑制人體黑色素生成上的功效之數據圖，其中“*”表示與第0週比較，p<0.05。

圖11是本發明石榴發酵物在降低人體紅色素生成上的功效之數據圖。

圖12是本發明石榴發酵物在提升人體肌膚緊實度上的功效之數據圖。

圖13是本發明石榴發酵物在提升人體膠原蛋白密度上的功效之數據圖，其中“*”表示與第0週比較，p<0.05；及“***”表示與第0週比較，p<0.001。

圖14是本發明石榴發酵物在提升人體膠原蛋白密度上的功效之影像圖。

圖15是本發明石榴發酵物在提升人體肌膚緊實度上的功效之數據圖，其中“*”表示與第0週比較，p<0.05。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。

依據本發明，石榴(Punica granatum)，英文俗名為Pomegranate，漢語拼音為shi liu，中文別名為安石榴，是千屈菜科(Lythraceae)石榴屬(Punica)的落葉灌木；葉對生或近簇生，外觀呈矩圓形或倒卵形；花生於枝頂或腋生；漿果近球形，呈紅色，有肉質外皮。產區主要分佈於伊朗、印度北方的喜馬拉雅山脈、中國、美國以及地中海區域等。石榴的主要利用部位為葉、花、果皮以及根。在中國民俗醫學上，石榴的果皮被用於治療鼻衄、中耳炎、創傷出血、月經失調、紅崩白帶、牙痛、吐血、久瀉、久痢、便血、脫肛、滑精、崩漏、帶下、蟲積腹痛以及疥癬。另外，石榴具有抗病毒(antiviral)、抗細菌(antibacterial)、抗真菌(antifungal)以及抗癌(anticancer)等功效，並且可用於改善心血管健康(cardiovascular health)、預防糖尿病(diabetes)、緩解停經症狀(menopausal symptoms)、改善***失能(erectile dysfunction)、治療阿茲海默症(Alzheimer’s disease)以及類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)等。

如本文中所使用的，用語「石榴果汁(Punica granatum juice)」意指由包含石榴的果皮(peel)、果肉(pulp)(亦即可食用的部分)以及種籽(seed)之果實所產生的汁液。

如本文中所使用的，用語「石榴水萃取物」意為石榴果汁與水以1：5~10(w/w)比例經一特定時間與溫度萃取而得。

如本文中所使用的，用語「抗老化(anti-aging)」意指預防、減緩人類皮膚外觀之老化現象，例如：皺紋的產生及失去彈性等。評量實現此目的之程度將根據熟悉此項技術者已知之諸多因素來決定，諸如消費者的全身狀態、年齡、性別等。

如本文中所使用的，用語「培養(culturing)」以及「培育(cultivation)」可被交換使用。

依據本發明，有關發酵培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

如本文中所使用的，用語「啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)」、「胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)」以及「醋酸菌(Acetobacter aceti)」分別意欲涵蓋那些為熟習此項技術人士可易於獲得的啤酒酵母菌、胚芽乳酸菌以及醋酸菌(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的啤酒酵母菌、胚芽乳酸菌以及醋酸菌菌株。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。

依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液 (buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普^®974P(carbopol^®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

實施例1. 石榴發酵物的製備

1.1 作為食品產品之石榴發酵物的製備

首先，將石榴果汁與水以1：5~10(w/w)的比例混合，並在50℃~100℃下分別萃取0.5~3小時，得到石榴的萃取物。將石榴的萃取物冷卻至室溫供後續三段式發酵使用。三段式發酵係為把石榴的萃取物依序接種0.01~0.5%啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)BCRC 20271發酵1~2天；0.01~0.25%胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)TCI028(BCRC 910805)發酵1~3天；1~20%醋酸菌(Acetobacter aceti)BCRC 11688(以上菌株皆是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC))發酵14~21天。之後，於45℃~70℃下減壓濃縮，並以200~400網目(mesh)的網篩過濾。接著，添加0.5~1.5%檸檬酸及40~70%異麥芽寡糖調整規格後滅菌，得到作為食品產品之石榴發酵物(即第二石榴發酵物)。

1.2 作為保養品之石榴發酵物的製備

首先，將石榴果汁與水以1：5~10(w/w)的比例混合，並在50℃~100℃下分別萃取0.5~3小時，得到石榴的萃取物。將石榴的萃取物冷卻至室溫供後續發酵使用。三段式發酵係為把石榴的萃取物依序接種0.01~0.5%啤酒酵母菌並發酵1~2天；0.01~0.25%胚芽乳酸菌TCI028並發酵1~3天。之後，於45℃~70℃下減壓濃縮，並以0.5~20μm孔徑的濾袋進行過濾。接著，於90~120℃下滅菌30~120分鐘，接而添加0.5~1.5%苯氧乙醇(phenoxyethanol)(作為防腐劑)，得到作為保養品之石榴發酵物(即第一石榴發酵物)。

實施例2. 石榴發酵物的總多酚含量檢測

首先，製備標準溶液，將10g的沒食子酸(gallic acid)溶於水中並添加10mL的體積至量瓶中。接著，分別配製0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL及100μL/mL的標準溶液，接而取100μL的各個標準溶液至具有10mL體積的離心管。之後，添加500μL的佛蕭酚試劑(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)、混合並直立放置3分鐘，接而添加400μL的7.5%碳酸鈉(sodiμM carbonate)、混合並直立放置30分鐘。接著，將200μL的各個反應溶液轉移至96-孔盤中，於750nm下測量吸光值。

另外，將實施例1所得到的作為食品產品之石榴發酵物作為實驗組，將石榴的萃取物作為比較組。將實驗組及比較組分別以水予以稀釋並取100mL的體積至微量離心管中。之後，添加500μL的佛蕭酚試劑、混合並直立放置3分鐘，接而添加400μL的7.5%碳酸鈉、混合並直立放置30分鐘。接著，將200μL的各組反應溶液轉移至96-孔盤中，於750nm下測量吸光值。本實施例的結果顯示於圖1。

圖1是本發明石榴發酵物的總多酚含量檢測之數據圖。由圖1可見，與比較組相較之下，實驗組的總多酚含量有顯著的提升(提升2.6倍)。本實施例的結果顯示，本發明石榴發酵物會大量釋出總多酚。

實施例3. 石榴發酵物的抗糖化活性(antiglycative activity)分析

首先，將實施例1所得到的作為食品產品之石榴發酵物使用作為實驗組，將石榴的萃取物使用作為比較組。分別取0.25mL的經適當稀釋之實驗組及比較組的樣品，接而加入0.25mL的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)[以200mM磷酸鈉緩衝液(sodium phosphate buffer)(pH 7.4)配製含有0.06% NaN₃之60mg/mL BSA]溶液與果糖(fructose)溶液(以200mM磷酸鈉緩衝液配製 1.5M D-果糖)，均勻混合。之後，取0.1mL的體積於激發光360nm，放射光460nm下測定螢光值，此為反應前之零點。接著，取0.45mL的體積並於50℃下培養24小時，接而取0.1mL的體積測定螢光值，此為反應之終點。對照組以等量樣品回溶溶劑代替，以等量之3mM胺胍(aminoguanidine,AG)作為正對照組。抗糖化活性(%)是藉由下列公式(1)計算出：

本實施例的結果顯示於圖2。圖2是本發明石榴發酵物的抗糖化活性分析之數據圖。由圖2可見，與比較組相較之下，實驗組的抗糖化活性有顯著的提升(提升35%)。本實施例的結果顯示，本發明石榴發酵物具有優異的抗糖化活性。

實施例4. 石榴發酵物在抵抗及防禦UVA能力上的效用評估

首先，將人類皮膚纖維母細胞(human skin fibroblast)CCD-966Sk(對應於ATCC^® CRL-1881)培養於最低基本培養基(minimum essential medium)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1%青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)以及1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)](Gibco)中。於96孔培養盤的每孔中加入200μL的培養基，使每孔具有5 x 10³個人類皮膚纖維母細胞。在37℃下培養24小時後，移除培養基。

之後，將人類皮膚纖維母細胞分成4組，其中包括1個實驗組、1個比較組、1個UVA組及1個對照組。實驗組、比較組及UVA組的細胞是藉由使用紫外線輻射室於15J/cm²下對細胞照射UVA歷時1小時，此條件會造成50%致死劑量(lethal dose 50%,LD₅₀)，表示導致50%細胞死亡的輻射照射劑量。接著，將0.5%依據上面實施例1的作為食品產品之石榴發酵物添加至實驗組的細胞中，及將0.5%石榴萃取物添加至比較組的細胞中，而UVA組的細胞則不做任何處理。至於對照組的細胞則未照射UVA。

各組細胞培養物在37℃培養箱中進行培養24小時後，於每孔加入15μL的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化物 {3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide}(MTT，4mg/mL，配於PBS)(AMERSCO/0793-5G)並於37℃下予以培養4小時。之後，移除各孔中的培養基，繼而於每孔加入50μL的DMSO(ECHO/DA1101-000000-72EC)以分解甲臢結晶(formazan crystal)，接而將培養盤置於振盪器(shaker)上並培育10分鐘，然後於570nm的波長下以ELISA讀取儀(BioTek)來讀取各孔的吸光值(OD₅₇₀)。

細胞可活性(%)是藉由將所測得的吸光值(OD₅₇₀)代入下列公式(2)而計算出：細胞可活性(%)=(各組所測得的OD₅₇₀吸光值/對照組所測得的OD₅₇₀吸光值)×100% (2)

各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t檢驗(Student’s t-test)來決定。本實施例的結果顯示於圖3。

圖3是本發明石榴發酵物在抵抗及防禦UVA能力上的功效之數據圖。由圖3可見，與對照組相較之下，UVA組的細胞可活性(%)有降低的情形，這表示對人類皮膚纖維母細胞照射UVA會造成細胞死亡。而與UVA組及比較組相較之下，實驗組的細胞可活性(%)有顯著的提升(與UVA組比較，實驗組的細胞可活性提升12%)。本實施例的結果顯示，本發明石榴發酵物具有抵抗及防禦UVA損傷的能力。

實施例5. 石榴發酵物在抑制黑色素生成(inhibition of melanogenesis)上的效用評估

首先，將老鼠皮膚黑色素瘤細胞株B16F10(對應於ATCC CRL-6475)培養於杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)[添加有1%青黴素/鏈黴素(Gibco)及10% FBS(Gibco)]中。於6孔培養盤的每孔中加入3mL的培養基，使每孔具有1.5 x 10⁵個B16F10細胞。在37℃下培養24小時後，移除培養基。

之後，將B16F10細胞分成3組，其中包括1個實驗組、1個比較組以及1個對照組。將0.5%依據上面實施例1的作為食品產品之石榴發酵物(含有3mL的DMEM)添加至實驗組的細胞中，及將2%石榴的萃取物(含有3mL的DMEM)添加至比較組的細胞中，而對照組的細胞則被添加DMEM。

各組細胞培養物在37℃下培養48小時後，移除培養基並以1xPBS(Gibco)沖洗兩次。之後，加入胰蛋白酶(trypsin)來處理細胞3分鐘並將懸浮的細胞收集於15mL體積的離心管中，接而以400xg/5分鐘進行旋轉(spin)以沉澱細胞。在以1xPBS沖洗兩次之後，以200μL的1XPBS再懸浮細胞沉澱物(cell pellet)。接著，將細胞溶液於液態氮中放置10分鐘，接而於室溫下靜置30分鐘進行解凍。在解凍完全之後，以12,000xg進行旋轉30分鐘，接而移除上清液並添加120μL的1N NaOH(配於ddH₂O)。在混合均勻之後，於60℃乾浴槽中靜置1小時。之後，取100μL的體積至96孔培養盤中並於450nm的波長下以ELISA讀取儀來讀取各孔的吸光值(OD₄₅₀)。

黑色素含量(%)是藉由將所測得的吸光值(OD₄₅₀)代入下列公式(3)而計算出：黑色素含量(%)=(各組所測得的OD₄₅₀吸光值/對照組所測得的OD₄₅₀吸光值)×100% (3)

各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-試驗來決定。本實施例的結果顯示於圖4。

圖4是本發明石榴發酵物在抑制黑色素生成上的功效之數據圖。由圖4可見，與對照組及比較組相較之下，實驗組的黑色素含量有顯著的降低(與對照組比較，實驗組的黑色素含量降低20%)。本實施例的結果顯示，本發明石榴發酵物具有抑制黑色素生成的功效。

實施例6. 石榴發酵物在抗發炎(anti-inflammation)上的效用評估

首先，將小鼠巨噬細胞RAW 264.7(對應於ATCC TIB-71)培養於90% DMEM，添加有10% FBS(Gibco)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco)及4mM L-麩醯胺酸(L-glutamine)(Gibco)中。於96孔培養盤的每孔中加入200μL的培養基，使每孔具有2.5 x 10⁴個細胞。在37℃、5% CO₂的恆溫培養箱中培養24小時後，移除培養基。

之後，將RAW 264.7細胞分成4組，其中包括1個實驗組、1個比較組、1個LPS組以及1個對照組。將200ng/mL脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma；SI-L2880-25MG)添加至LPS組、比較組及實驗組的細胞中，俾以誘發發炎反應，並將1mg/mL依據上面實施例1的作為食品產品之石榴發酵物添加至實驗組的細胞中，及將1%石榴的萃取物添加至比較組的細胞中，而LPS組的細胞不做任何處理，至於對照組的細胞則未添加LPS且不做任何處理。同時，LPS組、實驗組及比較組是以不含FBS的培養基來配製，且一個樣品進行四重複)。

各組細胞培養物在作用24小時後，從每孔中取出150μL的培養液並置入新的96孔培養盤，接而加入130μL的二次水。之後，使用革利士試劑套組(Griess reagent kit)(Life technologies；1445263)來配製革利士試劑(試劑A及試劑B的比例為1：1)，取20μL的體積與96孔培養盤中的培養液進行避光反應30分鐘。接著，於548nm的波長下以微盤分析儀來讀取各孔的吸光值(OD₅₄₈)。特別地，讀取的吸光值越大，表示NO的濃度越高。各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-試驗來決定。本實施例的結果顯示於圖5。

圖5是本發明石榴發酵物在抗發炎上的功效之數據圖。由圖5可見，與對照組相較之下，LPS組的發炎程度有提升的情形，這表示LPS會誘發RAW 264.7細胞的發炎反應。而與LPS組及比較組相較之下，實驗組的發炎程度有顯著的降低(與LPS組比較，實驗組的發炎程度降低43%)。本實施例的結果顯示，本發明石榴發酵物具有抗發炎的功效。

實施例7. 石榴發酵物在提升皮膚緊緻程度上的效用評估

首先，將人類皮膚纖維母細胞CCD-966Sk(對應於BCRC編號60153)培養於依格最低基本培養基(Eagle minimum essential medium,EMEM)，配於厄爾平衡鹽溶液(Earle’s Balanced Salt Solution,Earle’s BSS)，添加有0.1mM非必需胺基酸、1.5g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、1mM丙酮酸鈉(90%)及10% FBS(Gibco)中。於24孔培養盤的每孔中加入培養基，使每孔每mL培養基具有2 x 10⁵個細胞。

之後，將人類皮膚纖維母細胞分成3組，其中包括1個實驗組、1個比較組及1個對照組。將0.5%依據上面實施例1的作為保養品之石榴發酵物添加至實驗組的細胞中，及將0.5%石榴的萃取物添加至比較組的細胞中，而對照組的細胞則不做任何處理。接著，添加0.66體積之充分混合的細胞懸浮液(±實驗變數)至無菌試管中，及添加0.33體積的3mg/mL膠原蛋白溶液至細胞懸浮液中。接著，快速添加適當體積的1M NaOH並將溶液上下混合3次，其中將酚紅基質指示劑(phenol red media indicator)轉為淺粉紅色之NaOH的最少量將可產生最堅硬的膠原蛋白凝膠，然後立即將500μL的混合物轉移至1.9cm²大小的孔中，以使凝膠於室溫下凝固及覆蓋20分鐘。

之後，添加500μL的培養基(±實驗變數)至每個孔中，接而將已成形的凝膠沿著膠體邊緣由模型分離，然後藉由將膠體邊緣往遠離模型方向拉來再懸浮凝膠，並確認凝膠已脫離培養盤。接著，將24孔培養盤重新置放於37℃、潮濕具有5% CO₂的培養箱中。

在預定時間點之時，將24孔培養盤由培養箱中取出用以進行影像獲取。接著，將24孔培養盤置於燈箱(light box)的頂部，然後利用數位相機在凝膠上方固定距離處在不同時間點拍照，接而將凝膠重新置於培養箱中。之後，以ImageJ軟體來分析影像，追蹤每個膠原蛋白凝膠的外觀並依據ImageJ軟體的操作指引計算出表面積，然後記錄每個時間點的表面積作為初始凝膠表面積的百分比。本實施例的結果顯示於圖6。

圖6是本發明石榴發酵物在提升皮膚緊緻程度上的功效之數據圖。由圖6可見，與對照組及比較組相較之下，實驗組的膠原蛋白密度(%)有顯著的提升(與對照組比較，實驗組的膠原蛋白密度提升25%)。本實施例的結果顯示，本發明石榴發酵物可藉由提升膠原蛋白密度達到提升皮膚緊緻程度的功效。

實施例8. 石榴發酵物在調控與皮膚彈性相關的基因表現上的效用評估

在本實施例中，探討石榴發酵物可否藉由調控與皮膚彈性相關的基因表現來達到提升皮膚彈性的功效。

首先，以添加有10% FBS、1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)及1%青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)的MEM培養基培養人類纖維母細胞CCD-966SK於培養盤，細胞濃度為2×10⁵細胞/孔，接而於37℃進行培養24小時，並移除培養基。

之後，將經培養的細胞分成3組，其中包括1個對照組、1個比較組及1個實驗組。將0.25%依據上面實施例1的作為保養品之石榴發酵物添加至實驗組的細胞中，及將0.25%石榴的萃取物添加至比較組的細胞中，而對照組的細胞則不做任何處理。接著，收取各組細胞培養物並拿來進行基因表現分析。

在本實施例中，用來分析與皮膚彈性相關的基因包括基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)基因、基質金屬蛋白酶的組織抑制因子1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1,TIMP1)基因、及第IV型膠原蛋白α4鏈(collagen type IV alpha 4 chain,COL4A4)基因。

以RNA萃取套組(Geneaid)對上面所得到的各組細胞培養物進行RNA的萃取。對由此所得到的各組RNA取2,000ng並以SuperScript^® III反轉錄酶(Invitrogen)將萃取出的RNA反轉錄為cDNA。接著，以cDNA作為模版，並且使用用來擴增標的基因的引子對，包括MMP2、TIMP1、COL4A4及GAPDH(作為內部對照組)，它們的核苷酸序列顯示於下表1，在StepOne Plus即時PCR系統(ABI)中利用KAPA CYBR FAST qPCR套組(2x)(KAPA Biosystems)來進行定量即時PCR，俾以對標的基因進行擴增及定量。PCR產物的熔化曲線是在定量即時PCR反應期間進行確認。

標的基因的相對表現量是推導自方程式2^-△△Ct，並利用GAPDH基因(作為內部對照組)及基準基因的循環閾值及藉由標準差來計算相對倍數變化，其中△Ct=Ct_{目標基因/基準基因}-Ct_GAPDH，△△Ct=△Ct_目標基因-△Ct_基準基因，倍數變化=2^-△△Ct _平均值。以對照組的標的基因表現量作為1的比較基準。各組之間的統計學顯著差異是藉由單尾史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖7至圖9。

圖7至圖9是本發明石榴發酵物在調控與皮膚彈性相關的基因(包括MMP2基因、TIMP1基因及COL4A4基因)表現上的功效之數據圖，其中圖7是本發明石榴發酵物在調控MMP2基因表現上的功效之數據圖，圖8是本發明石榴發酵物在調控TIMP1基因表現上的功效之數據圖，及圖9是本發明石榴發酵物在調控COL4A4基因表現上的功效之數據圖。由圖7可見，就MMP2基因而言，與對照組及比較組相較之下，實驗組的基因相對表現量有顯著的降低(與對照組比較，實驗組的基因相對表現量降低42%)，這表示本發明石榴發酵物可藉由抑制MMP2基因的表現量而避免膠原蛋白被分解。由圖8可見，就TIMP1基因而言，與對照組及比較組相較之下，實驗組的基因相對表現量有顯著的提升(與對照組比較，實驗組的基因相對表現量提升39%)，這表示本發明石榴發酵物可藉由提升TIMP1基因的表現量而抑制膠原蛋白分解基因活性。由圖9可見，就COL4A4基因而言，與對照組及比較組相較之下，實驗組的基因相對表現量有顯著的提升(與對照組比較，實驗組的基因相對表現量提升17倍)，這表示本發明石榴發酵物可藉由提升COL4A4基因的表現量來促進膠原蛋白合成量。本實施例的結果顯示，本發明石榴發酵物可藉由調控與皮膚彈性相關的基因表現來達到提升皮膚彈性的功效。

實施例9. 作為食品產品之石榴發酵物的人體功效測試

在本實施例中，藉由使用依據實施例1之作為食品產品之石榴發酵物來檢測其是否具有改善人體肌膚的功效。

首先，募集8位25~45歲上班族作為受試者，接而請每位受試者每天口服飲用10mL的15~30%作為食品產品之石榴發酵物，測試時間為8週。測試項目包括受試者飲用前後的黑色素含量、紅色素含量及肌膚緊實度改善百分比，使用VISIA Complexion分析系統(VISIA Complexion Analysis System)(Canfield scientific,USA)進行檢測。本實施例的結果顯示於圖10至圖12。

圖10是本發明石榴發酵物在抑制人體黑色素生成上的功效之數據圖。圖11是本發明石榴發酵物在降低人體紅色素生成上的功效之數據圖。圖12是本發明石榴發酵物在提升人體肌膚緊實度上的功效之數據圖。由圖10可見，與飲用前(第0週)相較之下，受試者在飲用後第8週所測得的黑色素含量有顯著的降低(與第0週比較，受試者在飲用後第8週所測得的黑色素含量降低4.1%)。由圖11可見，與飲用前(第0週)相較之下，受試者在飲用後第8週所測得的紅色素含量有降低的情形(與第0週比較，受試者在飲用後第8週所測得的紅色素含量降低10.3%)。由圖12可見，與飲用前(第0週)相較之下，受試者在飲用後第8週所測得的肌膚緊實度改善百分比有提升的情形(與第0週比較，受試者在飲用後第8週所測得的肌膚緊實度改善百分比提升22.2%)。本實施例的結果顯示，本發明作為食品產品之石榴發酵物具有改善人體肌膚的功效。

實施例10. 作為保養品之石榴發酵物的人體功效測試

在本實施例中，申請人藉由使用依據實施例1之作為保養品之石榴發酵物來檢測其是否具有改善人體肌膚的功效。

首先，募集8位受試者，並將每位受試者的左臉使用作為對照組，及將右臉使用作為實驗組，其中每日早晚清潔臉部後，將安慰劑塗抹於對照組肌膚，及將5~15%作為保養品之石榴發酵物塗抹於實驗組肌膚，以指腹稍加按摩促進吸收，並於使用前(第0週)、使用後第2週與第4週進行檢測。檢測項目包括膠原蛋白密度、肌膚鬆弛度及肌膚皺紋，使用VISIA Complexion分析系統(VISIA Complexion Analysis System)(Canfield scientific,USA)進行檢測。本實施例的結果顯示於圖13至圖15。

圖13是本發明石榴發酵物在提升人體膠原蛋白密度上的功效之數據圖。圖14是本發明石榴發酵物在提升人體膠原蛋白密度上的功效之影像圖。圖15是本發明石榴發酵物在提升人體肌膚緊實度上的功效之數據圖。由圖13可見，與第0週相較之下，實驗組的肌膚膠原蛋白密度會隨著時間增加而有顯著的提升，對照組則無；與第0週比較，實驗組在使用後第2週的肌膚膠原蛋白密度提升11.6%，在使用後第4週的肌膚膠原蛋白密度提升19.6%。由圖14可見，與第0週相較之下，實驗組的肌膚膠原蛋白密度會隨著時間增加而有提升的情形，圖14中黑色部分越少表示膠原蛋白密度越高。由圖15可見，與第0週相較之下，實驗組的肌膚緊實度會隨著時間增加而有顯著的提升，對照組則無；與第0週比較，實驗組在使用後第2週的肌膚緊實度提升11.6%，在使用後第4週的肌膚膠緊實度提升15%。本實施例的結果顯示，本發明作為保養品之石榴發酵物具有改善人體肌膚的功效。

綜上所述，本發明石榴發酵物可調控MMP基因、TIMP基因及COL4A4基因的表現量，並藉由微生物發酵製程讓石榴總多酚釋出，增加抗氧化與美肌保養作用、促進膠原蛋白產生、降低色素生成與累積、提升肌膚緊緻、改善肌膚暗沉，達到抗老化及撫平皺紋之功效。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

<110> 大江生醫股份有限公司

<120> 石榴發酵物及其用途

<130> 107B0338-I1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成引子

<400> 3

<210> 4

<211> 21

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<220>

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<210> 5

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<400> 5

<210> 6

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<212> DNA

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<400> 6

<210> 7

<211> 21

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<223> 合成引子

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 8

Claims

一種石榴發酵物，係藉由一包含下列步驟之方法而製得：(a)以水萃取一石榴而得到一石榴萃取物；以及(b)將該石榴萃取物與啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)依序進行發酵而獲得一第一石榴發酵物，其中該第一石榴發酵物進一步與醋酸菌(Acetobacter aceti)進行發酵，而獲得一第二石榴發酵物；其中該第一石榴發酵物或該第二石榴發酵物提升第IV型膠原蛋白α4鏈(collagen type IV alpha 4 chain,COL4A4)基因的表現量。
如申請專利範圍第1項所述的石榴發酵物，其中該釀酒酵母之發酵時間為1至2天，該胚芽乳酸桿菌之發酵時間為1至3天，該啤酒酵母菌的濃度介於0.01~0.5%，該胚芽乳酸菌的濃度介於0.01~0.25%。
如申請專利範圍第1項所述的石榴發酵物，其中該醋酸菌的濃度介於1~20%。
如申請專利範圍第3項所述的石榴發酵物，其中該醋酸菌之發酵時間為14至21天。
如申請專利範圍第1項所述的石榴發酵物，其中該萃取的溫度介於50℃至100℃，及該萃取的時間介於0.5至3小時。
一種如申請專利範圍第1項所述之石榴發酵物用於製備一調控基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)基因及基質金屬蛋白酶的組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP)基因的表現量之組合物的用途。
如申請專利範圍第6項所述的用途，其中該組合物是呈醫藥品的形式。
如申請專利範圍第6項所述的用途，其中該MMP基因是MMP2基因。
如申請專利範圍第6項所述的用途，其中該TIMP基因是TIMP1基因。
一種如申請專利範圍第1項所述之石榴發酵物用於製備一促進膠原蛋白產生及抗老化之組合物的用途，其中該組合物是呈醫藥品的形式。
如申請專利範圍第10項所述的用途，其中當該組合物是呈保養品的形式時，該石榴發酵物是第一石榴發酵物。
如申請專利範圍第10項所述的用途，其中當該組合物是呈食品的形式時，該石榴發酵物是第二石榴發酵物。