TWI676679B - 核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法 - Google Patents

核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI676679B
TWI676679B TW105116589A TW105116589A TWI676679B TW I676679 B TWI676679 B TW I676679B TW 105116589 A TW105116589 A TW 105116589A TW 105116589 A TW105116589 A TW 105116589A TW I676679 B TWI676679 B TW I676679B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
primer
forward primer
design method
reverse
dimer
Prior art date
Application number
TW105116589A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201643248A (zh
Inventor
陳偉銘
Wei-Ming Chen
康詩婷
Shih-Ting Kang
Original Assignee
奎克生技光電股份有限公司
Quark Biosciences Taiwan, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 奎克生技光電股份有限公司, Quark Biosciences Taiwan, Inc. filed Critical 奎克生技光電股份有限公司
Publication of TW201643248A publication Critical patent/TW201643248A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI676679B publication Critical patent/TWI676679B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

本發明提供一種具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列、具有SEQ ID NO:2的通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法以及miRNA檢測方法。於miRNA檢測方法中，使用所述通用反轉錄引子對miRNA樣品進行cDNA合成，而所述通用反向引子用於在qPCR定量檢測時進行所述cDNA分子擴增。所述引子設計方法使用所述通用反向引子序列、所述核苷酸序列及設計規則，以設計qPCR定量檢測所用的引子。

Description

核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法
本發明是有關於一種核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法，且特別是有關於一種應用於miRNA檢測、定量和表達譜分析的核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法。
miRNA為高度保守的非編碼RNA，長度約為18-25個核苷酸，其能夠調控生物體的基因表現。近年來，研究結果顯示miRNA與許多疾病相關，特別是癌症，miRNA具有致癌基因或抑癌基因的作用，在人類癌症的病理生理學中扮演重要角色。更詳細而言，miRNA在癌症病例中的表現情形，可作為癌症診斷和預後判斷的工具，甚至能夠進一步預測病患的存活率，已成為新一代的癌症生物標記(Biomarker)。此外，也基於健康個體與癌症病患之間的miRNA表現差異，發展出各種癌症診斷工具。因此，用 於miRNA檢測、定量和表達譜分析(expression profiling)的材料和方法是重要且關鍵的。
在習知技術中，檢測與定量miRNA的方法包括北方墨點雜交法(Northern blot hybridization)、轉殖技術(cloning)、微陣列基因晶片分析及次世代定序技術。相較於習知技術，即時定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應(qRT-PCR，quantitative real-time reverse transcription PCR)方法具有較高的敏感度及特異性。
目前已發展出各種不同的qRT-PCR方法，這些方法主要可分成以下兩種。第一種方法是使用莖環反轉錄引子(stem-loop RT primer)進行cDNA合成，並使用miRNA特異性探針(miRNA specific probe)或通用探針(universal probe)對miRNA進行定量。第二種方法則是使用線性的通用反轉錄引子(universal RT primer)進行cDNA合成，並使用miRNA特異性正向引子(miRNA specific forward primer)、反轉錄引子特異性反向引子(RT-primer specific reverse primer)以及雙股DNA結合染料(double-stranded DNA intercalating dye)進行miRNA的定量。
針對上述qRT-PCR方法，第一種方法的反轉錄引子因含有一個莖環結構，具有較佳的特異性，但所使用之miRNA特異性探針或通用探針的成本較高。第二種方法不需使用探針，因此，可進一步降低成本。然而，第二種方法所使用之線性通用反轉錄引子的特異性較第一類的莖環反轉錄引子差，且目前市售的通用反轉錄引子可能需要進一步修飾。
基於上述，如何提升線性通用反轉錄引子及反向引子的特異性及敏感度，同時兼具降低成本及方便使用的特性，以檢測、定量和分析miRNA的表現量，為目前所需改良的重要課題。
本發明提供一種核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子及引子設計方法，適用於miRNA檢測、定量和表達譜分析的qRT-PCR方法，其中通用反向引子、通用反轉錄引子以及由引子設計方法所設計出的引子具有較佳的特異性及敏感度，同時兼具降低成本及方便使用的特性，且不需對引子進行額外的核酸修飾(oligonucleotide modification)。
本發明提供一種具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，用於設計miRNA qPCR檢測所用的正向引子，與反向引子搭配以進行cDNA分子擴增。
本發明提供一種具有SEQ ID NO：2的通用反向引子，用於miRNA qPCR檢測中與正向引子搭配進行cDNA分子擴增。
在本發明的一實施例中，通用反向引子的Tm值為59.1℃。
本發明提供一種通用反轉錄引子，用於對待測miRNA樣品進行cDNA合成，通用反轉錄引子為以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN
其中R為5’端的核苷酸序列且為SEQ ID NO：2，(dT)n為中間部分n個連續的胸腺嘧啶殘基(thymine residue)，n為19，VN為3’端由核苷酸殘基組成的序列，V為腺嘌呤殘基(adenine residue)、鳥糞嘌呤殘基(guanine residue)或胞嘧啶殘基(cytosine residue)，N為腺嘌呤殘基、鳥糞嘌呤殘基、胞嘧啶殘基或胸腺嘧啶殘基。
本發明提供一種引子設計方法，所述引子用於miRNA qPCR檢測，包括以下步驟。確認待測miRNA與同物種中的其他miRNA之間的序列相似度。當待測miRNA與同物種中的其他miRNA之間的序列相似度低於90%時，以第一設計方法設計正向引子，第一設計方法包括第一調整步驟以及第一確認步驟。在第一調整步驟中，使正向引子與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子之間的Tm值差異不超過2度，當正向引子的Tm值低於57℃時，在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列，以使正向引子的Tm值達到57℃至61℃。在第一確認步驟中，確認正向引子之二聚體(dimer)的△G大於-7.5千卡/莫耳。當二聚體的△G小於-7.5千卡/莫耳時，刪減二聚體區域之正向引子序列，以避開形成二聚體的區域，並重新進行第一調整步驟及第一確認步驟。當待測miRNA與同物種中的其他miRNA之間的序列相似度高於90%時，以第二設計方法設計正向引子及反向引子，第二設計方法包括重疊設計步驟、第二調整步驟以及第二確認步驟。在重疊設計步驟中，比對待測miRNA與同物種中的其他miRNA之間的核苷酸差異位置，並使正向引子及反向引子的3’端的最後一個核苷 酸殘基設計至所述核苷酸相異位置上，若仍無法區分待測miRNA與同物種中的其他miRNA，將正向引子或反向引子再往前增加一個重疊的鹼基，或將正向引子和反向引子同時再增加一個重疊鹼基。在第二調整步驟中，使正向引子與反向引子之間的Tm值差異不超過2度，且當正向引子的Tm值低於55℃時，在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列，當反向引子的Tm值低於55℃時，在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：2自3’端開始的序列，以使正向引子與反向引子的Tm值達到55℃至61℃。在第二確認步驟中，確認正向引子及反向引子之二聚體的△G大於-7.5千卡/莫耳。當二聚體的△G小於-7.5千卡/莫耳時，更換增加於正向引子5’端的具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，其中具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有不同的核苷酸殘基組合，以避開形成二聚體的區域，並重新進行第二調整步驟及第二確認步驟。當第二設計方法無法避開形成二聚體的區域時，若二聚體問題是由反向引子造成，進行第三設計方法，若二聚體問題是由正向引子造成，進行第四設計方法。第三設計方法包括延長正向引子的3’端長度並縮短反向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中核苷酸差異位置設計在正向引子或反向引子的3’端的最後四個核苷酸內，且在縮短反向引子的3’端長度後若Tm值不足，則在反向引子的5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：2自3’端開始的序列。第四設計方法包括延長反向引子的3’端長度並縮短正向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區 域，其中核苷酸差異位置設計在正向引子或反向引子的3’端的最後四個核苷酸內，在縮短正向引子的3’端長度後若Tm值不足，則在正向引子的5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列。
在本發明的一實施例中，以第一設計方法設計出的正向引子與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子在qPCR檢測中進行cDNA分子擴增。
在本發明的一實施例中，在第一設計方法中，正向引子的二聚體包括正向引子的自身二聚體(self-dimer)或正向引子與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子之間形成的異二聚體(hetero-dimer)。
在本發明的一實施例中，在第二設計方法中，正向引子及反向引子的二聚體包括正向引子及反向引子各自的自身二聚體或正向引子與反向引子之間形成的異二聚體。
在本發明的一實施例中，在第一設計方法中，無法避開形成二聚體的區域時，以下述方式設計正向引子及反向引子，以避開形成二聚體的區域，其中反向引子不為具有SEQ ID NO：2的通用反向引子。延伸正向引子方式，延長正向引子的3’端長度並縮短反向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中正向引子的長度為12-18鹼基，或延伸反向引子方式，延長反向引子的3’端長度並縮短正向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中反向引子的長度為12-18鹼基。
本發明提供一種miRNA檢測方法，包括以下步驟。首先，對樣品中的待測miRNA添加poly-A尾。之後，利用通用反轉錄引子對待測miRNA進行cDNA合成。接著，利用本發明引子設計方法設計的正向引子及反向引子進行cDNA分子擴增。其中，通用反轉錄引子為以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN，其中R為5’端的核苷酸序列且為SEQ ID NO：2，(dT)n為中間部分n個連續的胸腺嘧啶殘基，n為19，VN為3’端由核苷酸殘基組成的序列，V為腺嘌呤殘基、鳥糞嘌呤殘基或胞嘧啶殘基，N為腺嘌呤殘基、鳥糞嘌呤殘基、胞嘧啶殘基或胸腺嘧啶殘基。
在本發明的一實施例中，反向引子為具有SEQ ID NO：2的通用反向引子。
基於上述，本發明提供一種核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法，於miRNA檢測方法中，通用反轉錄引子用於對miRNA樣品進行cDNA合成，通用反向引子用於qPCR定量檢測時擴增所述cDNA分子，而引子設計方法則是使用通用反向引子序列、核苷酸序列及設計規則，以設計qPCR定量檢測所用的引子。本發明的通用反轉錄引子、通用反向引子以及由引子設計方法所設計出的引子具有較佳的特異性及敏感度，同時兼具降低成本及方便使用的特性，且不需對引子進行額外修飾。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，作詳細說明如下。
圖1為本發明之miRNA檢測方法的流程示意圖。
本發明提供一種核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子及引子設計方法，適用於miRNA檢測、定量和表達譜分析的qRT-PCR方法。下文中，先針對說明書內文所使用的名詞加以定義說明。
「△G」為吉布斯自由能(Gibbs Free Energy)，其為一種描述化學反應的熱力學函數。二聚體結構的穩定性可由△G表示，其意義為用來打斷二聚體所需的能量。較大的△G負值(本發明定為△G<-7.5千卡/莫耳)代表出現穩定、非所需的二聚體結構，對PCR反應造成不良影響。
「qPCR」或「real-time quantitative PCR」(即時定量聚合酶鏈鎖反應)是指使用PCR以擴增並同時定量目標DNA的實驗方法。利用多種測定化學物質來進行定量(包括諸如SYBR ® green的螢光染料或Taqman探針的螢光報告寡核苷酸探針等)，隨著每次擴增循環之後反應中積累的擴增DNA來對其進行即時定量。
「qRT-PCR」(即時定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應)是指以待測樣品逆轉錄反應中所產生的cDNA，作為PCR擴增過程的起始 DNA模板的定量逆轉錄聚合酶鏈式反應，隨後進行qPCR對待測miRNA進行定量。
「Tm」(解鏈溫度)，通常將Tm定義為核苷酸和互補核苷酸鏈之間形成的雙股螺旋有50%解離為單鏈時的溫度。核苷酸的長度和核苷酸組成，例如核苷酸序列中G和C核苷酸的含量是影響Tm的重要因素。由於Tm的測量方法為本發明所述技術領域的習知技術，故在此不予贅述。
「cDNA」(complementary DNA，互補DNA)是指利用逆轉錄酶對RNA模板進行逆轉錄所產生的互補DNA。
「核苷酸」包括腺嘌呤(A)、鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)。
「micro RNA」為miRNA的同義簡寫。
「Ct值」為qPCR操作流程中，開始顯著地增加螢光強度時的擴增循環數目。
本發明提供一種引子設計方法，所設計出的引子可適用於檢測miRNA的qPCR方法。在本發明的引子設計方法中，先確認待測miRNA與同物種中的其他miRNA之間的序列相似度，將待測miRNA與同物種中的其他miRNA的序列進行比較，評估差異的核苷酸序列鹼基數所佔的比例，再依據序列相似度判斷進行第一設計方法或第二設計方法。更詳細而言，同物種中的其他miRNA之相關資訊可從本領域相關科技文獻或諸如miRBase資料庫(http：//microRNA.sanger.ac.uk/)的公開資料庫取得。當序列相似 度低於90%時，以第一設計方法設計正向引子；當序列相似度高於90%時，以第二設計方法設計正向引子及反向引子。
正向引子的序列設計通常包含與待測miRNA序列5’端相同的12至18個核苷酸殘基。反向引子的序列設計通常包含與待測miRNA序列3’端互補的2至8個核苷酸殘基，接著包含19個胸腺嘧啶殘基以及長度不一的尾端(SEQ ID NO：2序列)，其中19個胸腺嘧啶殘基及尾端與通用反轉錄引子的一部分相同。之後，再依據本發明所提出的引子設計方法，依其設計規則由第一設計方法至第四設計方法中選擇其中一種方法對引子進行設計。
<第一設計方法>
第一設計方法包括第一調整步驟以及第一確認步驟。
首先，進行第一調整步驟，使正向引子與具有序列5’-CAACTCAGGTCGTAGGCAATTCGT-3’(SEQ ID NO：2)的通用反向引子之間的Tm值差異不超過2度，其中通用反向引子的Tm值為59.1℃。更詳細而言，當正向引子的Tm值低於57℃時，在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入序列CGWTSSRCRC(SEQ ID NO：1)自3’端開始的序列，以使正向引子的Tm值達到57℃至61℃。當正向引子本身序列的Tm值即為57℃至61℃時，則不需在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入所述核苷酸序列自3’端開始的序列。
必須說明的是，在具有序列CGWTSSRCRC(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列中，W為腺嘌呤殘基或胸腺嘧啶殘基(A或T)，S為鳥糞嘌呤殘基或胞嘧啶殘基(G或C)，R為腺嘌呤殘基或鳥糞嘌呤殘基(A或G)。於正向引子5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列能夠較容易地使正向引子的Tm值達到所需的範圍，且具有高度特異性，更能夠進一步防止自身二聚體(self-dimer)及異二聚體(hetero-dimer)形成。
接著，進行第一確認步驟，確認正向引子是否形成自身二聚體或正向引子與通用反向引子之間是否形成異二聚體。
若自身二聚體與異二聚體的△G大於-7.5千卡/莫耳，則完成正向引子的設計。當自身二聚體與異二聚體中至少一者的△G小於-7.5千卡/莫耳時，刪減二聚體區域之正向引子序列，以避開形成二聚體的區域，並重新進行第一調整步驟及第一確認步驟。
若使用第一設計方法無法避開形成二聚體的區域，則可以以下述方式設計正向引子及反向引子，以避開形成二聚體的區域，其中反向引子不為具有SEQ ID NO：2的通用反向引子。延伸正向引子方式，延長正向引子的3’端長度並縮短反向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中正向引子的序列長度約為12至18鹼基。或者，延伸反向引子方式，延長反向引子的3’端長度並縮短正向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中反向引子的長度約為12至18鹼基。
使用第一設計方法設計出正向引子後，在miRNA檢測方法中，使用通用反轉錄引子對待測miRNA進行cDNA合成，再以 第一設計方法設計出的正向引子與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子在qPCR定量檢測中進行cDNA分子擴增。
更詳細而言，通用反轉錄引子為以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN
其中R為5’端的核苷酸序列且為SEQ ID NO：2，(dT)n為中間部分n個連續的胸腺嘧啶殘基，n為19，VN為3’端由核苷酸殘基組成的序列，V為腺嘌呤殘基、鳥糞嘌呤殘基或胞嘧啶殘基，N為腺嘌呤殘基、鳥糞嘌呤殘基、胞嘧啶殘基或胸腺嘧啶殘基。
<第二設計方法>
第二設計方法包括重疊設計步驟、第二調整步驟以及第二確認步驟。
首先，進行重疊設計步驟，比對出待測miRNA與同物種中的其他miRNA之間的核苷酸差異位置，並使正向引子及反向引子的3’端的最後一個核苷酸殘基設計至所述核苷酸相異位置上的核苷酸殘基。更詳細而言，若重疊一個核苷酸殘基仍無法區分待測miRNA與同物種中的其他miRNA，則可將正向引子或反向引子再向前增加一個重疊的鹼基，或將正向引子與反向引子同時再增加一個重疊的鹼基。
接著，進行第二調整步驟，使正向引子與反向引子之間的Tm值差異不超過2度。更詳細而言，當正向引子的Tm值低於55℃時，在正向引子5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列，當反向引子的Tm值低於55℃時，在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：2自3’端開始的序列，以使正向引子與反向引子的Tm值達到55℃至61℃。當正向引子與反向引子本身序列的Tm值即為55℃至61℃時，則不需在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入核苷酸序列。
之後，進行第二確認步驟，確認正向引子及反向引子是否形成自身二聚體或正向引子與反向引子之間是否形成異二聚體。
若自身二聚體與異二聚體的△G大於-7.5千卡/莫耳，則完成正向引子與反向引子的設計。若自身二聚體與異二聚體中至少一者的△G小於-7.5千卡/莫耳時，更換增加於正向引子的5’端的具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列(其中具有不同的核苷酸殘基組合)，並重新進行第二調整步驟及第二確認步驟。
使用第二設計方法設計出正向引子與反向引子後，在miRNA檢測方法中，使用通用反轉錄引子對待測miRNA進行cDNA合成，再以第二設計方法設計出的正向引子與反向引子在qPCR定量檢測中進行cDNA分子擴增。所使用的通用反轉錄引子與上文中所述的通用反轉錄引子相同，故在此不予贅述。
當第二設計方法無法避開形成二聚體的區域，進行第三設計方法或第四設計方法。若二聚體問題是由反向引子造成，進行第三設計方法，若二聚體問題是由正向引子造成，進行第四設計方法。
<第三設計方法>
第三設計方法包括延長正向引子的3’端長度並縮短反向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中待測miRNA與同物種中的其他miRNA之核苷酸差異位置需設計在正向引子或反向引子的3’端的最後四個核苷酸內。當縮短反向引子的3’端長度後，若Tm值不足，則在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：2自3’端開始的序列。如此一來，能夠增加成功區分高度相似miRNA序列的機率。此外，在第三設計方法中，若無法避免二聚體問題時，亦可使用具有SEQ ID NO：2的通用反向引子取代反向引子。
<第四設計方法>
第四設計方法包括延長反向引子的3’端長度並縮短正向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中待測miRNA與同物種中的其他miRNA之核苷酸差異位置需設計在正向引子或反向引子的3’端的最後四個核苷酸內。當縮短正向引子的3’端長度後，若Tm值不足，則在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列。如此一來，能夠增加成功區分高度相似miRNA序列的機率。
本發明亦提出一種miRNA檢測方法，圖1為本發明之miRNA檢測方法的流程示意圖，將參照圖1詳細說明如下。
請參照圖1，在本發明的miRNA檢測方法中，先利用poly(A)聚合酶對樣品中的待測miRNA添加poly-A尾，其中poly(A) 聚合酶將腺嘌呤殘基添加到待測miRNA的3’端。之後，通過與通用反轉錄引子的雜交，使通用反轉錄引子與帶poly-A尾的待測miRNA黏合。所使用的通用反轉錄引子與上文中所述的通用反轉錄引子相同，故在此不予贅述。接著，利用通用反轉錄引子對待測miRNA進行cDNA合成。最後，進行qPCR反應，利用本發明引子設計方法設計的正向引子及反向引子進行cDNA分子擴增，進行miRNA及時定量檢測。
更詳細而言，若使用上文所述的第一設計方法設計引子，則用來進行cDNA分子擴增的正向引子及反向引子分別為由第一設計方法設計出的正向引子與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子。若使用上文所述的第二設計方法設計引子，則用來進行cDNA分子擴增的正向引子及反向引子分別為以第二設計方法設計出的正向引子與反向引子。
以下，藉由實驗例來詳細說明上述各設計方法。然而，下述實驗例並非用以限制本發明。
實驗例
為了證明本發明所提出的引子設計方法能夠改善引子的專一性及特異性，以下特別作此實驗例。
第一設計方法
以合成寡核苷酸hsa-miR-589-5p作為模板，並以第一設 計方法所設計出的正向引子hsa-miR-589-5p-F與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子作為專一性引子對，進行miRNA檢測方法。
cDNA合成的實驗步驟如下。首先，混合x μl(2ng)miRNA、0.5μl 200μM通用反轉錄引子、1μl 1mM ATP(New England Biolads Inc.，新英倫生物技術股份有限公司)、1μl 10mM dNTP(New England Biolads Inc.)、2μl 10x M-MuLV反轉錄酶反應緩衝液、1μl(200U/μl)M-MuLV反轉錄酶(New England Biolads Inc.)及1μl(5U/μl)E.coli Poly(A)聚合酶(New England Biolads Inc.)，再加水至20μl以形成cDNA混合液。接著，將cDNA混合液於37℃下孵育1小時，再將M-MuLV反轉錄酶於80℃去活性5分鐘。所獲得的cDNA產物在使用前可先儲存於-20℃。
利用PanelStation(由奎克生技光電股份有限公司所製造)進行qPCR，其中反應條件如下。混合2μl的RT反應物及30μl 2x GoTaq® qPCR Master Mix(Promega)，再加水至60μl以形成混合液。將混合液於95℃反應3分鐘，隨後以95℃下36秒及60℃下72秒進行39個循環。
由實驗結果可得知，正向引子hsa-miR-589-5p-F與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子可成功擴增出專一性產物，Ct值為26.5。
hsa-miR-589-5p：5’-TGAGAACCACGTCTGCTCTGAG-3’(SEQ ID NO：3)
hsa-miR-589-5p-F：GCTGAGAACCACGTCTGCTC(SEQ ID NO：4)
其中正向引子hsa-miR-589-5p-F底線標示處為在第一調整步驟中所依序增加之具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，正向引子的性質測定數據：Tm=58.2℃；自身二聚體的△G=-6.3千卡/莫耳；異二聚體的△G=-6.73千卡/莫耳。
第二設計方法
以序列相似度極高的合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p及hsa-miR-18b-5p作為模板，並以第二設計方法所設計出的正向引子hsa-miR-18a-5p-F與反向引子hsa-miR-18a-5p-R作為專一性引子對，進行miRNA檢測方法，其中cDNA合成與qPCR的實驗方法如上文第一設計方法的實驗例中所述，故在此不予贅述。
hsa-miR-18a-5p：5’-TAAGGTGCATCTAGTGCAGATAG-3’(SEQ ID NO：5)
hsa-miR-18b-5p：5’-TAAGGTGCATCTAGTGCAGTTAG-3’(SEQ ID NO：6)
其中合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p及hsa-miR-18b-5p底線標示處為核苷酸差異位置。
hsa-miR-18a-5p-F：5’-GCTAAGGTGCATCTAGTGCAGA-3’(SEQ ID NO：7)
hsa-miR-18a-5p-R：5’-TCGTAGGCAATTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAT-3’(SEQ ID NO：8)
其中正向引子hsa-miR-18a-5p-F底線標示處為在第二調整步驟中所依序增加之具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，反向引子hsa-miR-18a-5p-R底線標示處為在第二調整步驟中所依序增加之具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列， 正向引子與反向引子的性質測定數據：正向引子Tm=56.7℃；反向引子Tm=55.9℃；正向引子與反向引子的自身二聚體的△G>-7.5千卡/莫耳；異二聚體的△G>-7.5千卡/莫耳。
由表1的實驗結果可得知，正向引子hsa-miR-18a-5p-F與反向引子hsa-miR-18a-5p-R可成功地區分合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p及hsa-miR-18b-5p。
利用第二設計方法設計的正向引子hsa-miR-18a-5p-F與反向引子hsa-miR-18a-5p-R分別對合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p與合成寡核苷酸hsa-miR-18b-5p進行qPCR反應，每一個qPCR反應皆有2,500個技術性重複(technical repeat)。將qPCR結果中的螢光強度與Ct值以邏輯斯廻歸模型(logistic regression model)計算正向引子hsa-miR-18a-5p-F與反向引子hsa-miR-18a-5p-R的專一性，可以得到95.5%的準確度，表示可以成功區分合成寡核苷酸hsa-miR-18a-5p與合成寡核苷酸hsa-miR-18b-5p。
第三設計方法
以序列相似度極高的合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p及hsa-miR-19b-3p作為模板，並分別以由第二設計方法所設計出的正向引子hsa-miR-19a-3p-V1F與反向引子hsa-miR-19a-3p-V1R以及第三設計方法所設計出的正向引子hsa-miR-19a-3p-V2F與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子作為專一性引子對，進行miRNA檢測方法，其中cDNA合成與qPCR的實驗方法如上文第一設計方法的實驗例中所述，故在此不予贅述。
hsa-miR-19a-3p：5’-TGTGCAAATCTATGCAAAACTGA-3’(SEQ ID NO：9)
hsa-miR-19b-3p：5’-TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA-3’(SEQ ID NO：10)
其中合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p及hsa-miR-19b-3p底線標示處為核苷酸差異位置。
hsa-miR-19a-3p-V1F：5’-GTTGCACGCTGTGCAAATCT-3’(SEQ ID NO：11)
hsa-miR-19a-3p-V1R：5'-GCAATTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGTTTTGCATA-3'(SEQ ID NO：12)
其中正向引子hsa-miR-19a-3p-F底線標示處為在第二調整步驟中所依序增加之具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，反向引子hsa-miR-19a-3p-R底線標示處為在第二調整步驟中所依序增加之具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
正向引子與反向引子的性質測定數據：正向引子Tm=56.9℃；反向引子Tm=58℃；正向引子的自身二聚體的△G=-10.33千卡/莫耳；反向引子的自身二聚體的△G=-7.5千卡/莫耳；異二聚體的△G=-10.94千卡/莫耳。
hsa-miR-19a-3p-V2F：5’-CGTTCGACGCTGTGCAAATCTAT-3’(SEQ ID NO：13)
其中正向引子hsa-miR-19a-3p-V2F右側底線標示處為增加3’端正向引子長度，使差異處維持在3’端最後4個核苷酸序列內，左側底線標示處為在第二調整步驟中所依序增加之具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
在第三設計方法中，因為無法避免二聚體問題，所以改用具有SEQ ID NO：2的通用反向引子取代反向引子。
正向引子與通用反向引子的性質測定數據：正向引子Tm=57.8℃；通用反向引子Tm=59.1℃；正向引子的自身二聚體的△G=-7.05千卡/莫耳；通用反向引子的自身二聚體的△G=-5.36千卡/莫耳；異二聚體的△G=-6.53千卡/莫耳。
由表2的實驗結果可得知，由於以第二設計方法所設計出的正向引子hsa-miR-19a-3p-V1F與反向引子hsa-miR-19a-3p-V1R出現嚴重的二聚體問題(二聚體的△G小於-7.5千卡/莫耳)，導致無法進行qPCR反應。相較之下，第三設計方法所設計出的正向引子hsa-miR-19a-3p-V2F與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子可成功區分合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p及 hsa-miR-19b-3p。
利用第三設計方法設計的正向引子hsa-miR-19a-3p-V2F與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子分別對合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p與合成寡核苷酸hsa-miR-19b-3p進行qPCR反應，每一個qPCR反應皆有2,500個技術性重複(technical repeat)。將qPCR結果中的螢光強度與Ct值以邏輯斯廻歸模型(logistic regression model)計算正向引子hsa-miR-19a-3p-V2F與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子的專一性，可以得到99.1%的準確度，表示可以成功區分合成寡核苷酸hsa-miR-19a-3p與合成寡核苷酸hsa-miR-19b-3p。
綜上所述，本發明提供一種核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子及引子設計方法，其中具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列能夠較容易地使正向引子的Tm值達到所需的範圍，且具有高度特異性，多種組合的SEQ ID NO：1的核苷酸序列更能夠進一步防止二聚體形成。其中的通用反轉錄引子具穩定性與專一性，且適用所有miRNA的分析，以單一通用反轉錄引子進行cDNA合成反應具有節省實驗樣品與時間、減少技術差異的優點。此外， 本發明的引子設計方法針對miRNA family(序列相似度>90%)與non-family適用不同的引子設計方法(序列相似度<90%)，且防止二聚體形成的設計方式，使得所設計出的引子具有較佳的特異性及敏感度，能夠成功擴增出專一性產物，並可成功區分序列相似度極高miRNA序列。此外，更兼具降低成本及方便使用的特性，且不需對引子進行額外修飾。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
＜110＞ 奎克生技光電股份有限公司 ＜120＞ 核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法 ＜150＞ 62/169,563 ＜151＞ 2015-06-02 ＜160＞ 13 ＜210＞ 1 ＜211＞ 10 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜220＞ ＜221＞ Misc_feature ＜222＞ (3)..(3) ＜223＞ w為a或t ＜220＞ ＜221＞ Misc_feature ＜222＞ (5)..(5) ＜223＞ s為g或c ＜220＞ ＜221＞ Misc_feature ＜222＞ (6)..(6) ＜223＞ s為g或c ＜220＞ ＜221＞ Misc_feature ＜222＞ (7)..(7) ＜223＞ r為a或g ＜220＞ ＜221＞ Misc_feature ＜222＞ (9)..(9) ＜223＞ r為a或g ＜400＞ 1 cgwtssrcrc ＜210＞ 2 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 2 caactcaggt cgtaggcaat tcgt ＜210＞ 3 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 3 tgagaaccac gtctgctc tgag ＜210＞ 4 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 4 gctgagaacc acgtctgctc ＜210＞ 5 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 5 taaggtgcat ctagtgcaga tag ＜210＞ 6 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 6 taaggtgcat ctagtgcagt tag ＜210＞ 7 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 7 gctaaggtgc atctagtgca ga ＜210＞ 8 ＜211＞ 39 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 8 tcgtaggcaa ttcgtttttt tttttttttt ttttctat ＜210＞ 9 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 9 tgtgcaaatc tatgcaaaac tga ＜210＞ 10 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 10 tgtgcaaatc catgcaaaac tga ＜210＞ 11 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 11 gttgcacgct gtgcaaatct ＜210＞ 12 ＜211＞ 41 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 12 gcaattcgtt tttttttttt tttttttttc agttttgcat a ＜210＞ 13 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的 ＜400＞ 13 cgttcgacgc tgtgcaaatc tat

Claims (9)

  1. 一種具有SEQ ID NO：2的通用反向引子，用於在miRNA qPCR檢測中進行cDNA分子擴增。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的具有SEQ ID NO：2的通用反向引子，其中所述通用反向引子的Tm值為59.1℃。
  3. 一種通用反轉錄引子，用於對待測miRNA進行cDNA合成，所述通用反轉錄引子為以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN其中R為5’端的核苷酸序列且為SEQ ID NO：2，(dT)n為中間部分n個連續的胸腺嘧啶殘基(thymine residue)，n為19，VN為3’端由核苷酸殘基組成的序列，V為腺嘌呤殘基(adenine residue)、鳥糞嘌呤殘基(guanine residue)或胞嘧啶殘基(cytosine residue)，N為腺嘌呤殘基、鳥糞嘌呤殘基、胞嘧啶殘基或胸腺嘧啶殘基。
  4. 一種引子設計方法，所述引子用於miRNA qPCR檢測，包括：確認待測miRNA與同物種中的其他miRNA之間的序列相似度，當序列相似度低於90%時，以第一設計方法設計正向引子，所述第一設計方法包括：第一調整步驟，使正向引子與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子之間的Tm值差異不超過2度，當正向引子的Tm值低於57℃時，在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列，以使正向引子的Tm值達到57℃至61℃；以及第一確認步驟，確認正向引子的二聚體的△G大於-7.5千卡/莫耳，其中當二聚體的△G小於-7.5千卡/莫耳時，刪減二聚體區域之正向引子序列，以避開形成二聚體的區域，並重新進行所述第一調整步驟及所述第一確認步驟，當序列相似度高於90%時，以第二設計方法設計正向引子及反向引子，所述第二設計方法包括：重疊設計步驟，比對待測miRNA與同物種中的其他miRNA之間的核苷酸差異位置，並使正向引子及反向引子的3’端的最後一個核苷酸殘基設計至所述核苷酸相異位置上，若仍無法區分待測miRNA與同物種中的其他miRNA，將正向引子或反向引子再往前增加一個重疊的鹼基，或將正向引子和反向引子同時再增加一個重疊的鹼基；第二調整步驟，使正向引子與反向引子之間的Tm值差異不超過2度，當正向引子的Tm值低於55℃時，在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列，當反向引子的Tm值低於55℃時，在5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：2自3’端開始的序列，以使正向引子與反向引子的Tm值達到55℃至61℃；以及第二確認步驟，確認正向引子及反向引子的二聚體的△G大於-7.5千卡/莫耳，其中當二聚體的△G小於-7.5千卡/莫耳時，更換增加於正向引子5’端的具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，以避開形成二聚體的區域，並重新進行所述第二調整步驟及所述第二確認步驟，當所述第二設計方法無法避開形成二聚體的區域時，若二聚體問題是由反向引子造成，進行第三設計方法，若二聚體問題是由正向引子造成，進行第四設計方法，所述第三設計方法包括：延長正向引子的3’端長度並縮短反向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中所述核苷酸差異位置設計在正向引子或反向引子的3’端的最後四個核苷酸內，且在縮短反向引子的3’端長度後，若Tm值不足，則在反向引子的5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：2自3’端開始的序列，所述第四設計方法包括：延長反向引子的3’端長度並縮短正向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中所述核苷酸差異位置在正向引子或反向引子的3’端的最後四個核苷酸內，且在縮短正向引子的3’端長度後，若Tm值不足，則在正向引子的5’端一個核苷酸接著一個核苷酸地加入SEQ ID NO：1自3’端開始的序列。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的引子設計方法，其中以所述第一設計方法設計出的正向引子與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子在qPCR定量檢測中進行cDNA分子擴增。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的引子設計方法，其中在所述第一設計方法中，正向引子的二聚體包括正向引子的自身二聚體或正向引子與具有SEQ ID NO：2的通用反向引子之間形成的異二聚體。
  7. 如申請專利範圍第4項所述的引子設計方法，其中在所述第二設計方法中，正向引子及反向引子的二聚體包括正向引子及反向引子各自的自身二聚體或正向引子與反向引子之間形成的異二聚體。
  8. 如申請專利範圍第4項所述的引子設計方法，其中在所述第一設計方法中，無法避開形成二聚體的區域時，以下述方式設計正向引子及反向引子，以避開形成二聚體的區域，其中反向引子不為具有SEQ ID NO：2的通用反向引子：延伸正向引子方式，延長正向引子的3’端長度並縮短反向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中正向引子的長度為12至18鹼基，或延伸反向引子方式，延長反向引子的3’端長度並縮短正向引子的3’端長度，以避開形成二聚體的區域，其中反向引子的長度為12至18鹼基。
  9. 一種miRNA檢測方法，包括：對樣品中的待測miRNA添加poly-A尾；利用通用反轉錄引子對所述待測miRNA進行cDNA合成；以及利用如申請專利範圍第4項至第8項中任一項所述的引子設計方法設計的正向引子及反向引子進行cDNA分子擴增，其中所述通用反轉錄引子為以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN其中R為5’端的核苷酸序列且為SEQ ID NO：2，(dT)n為中間部分n個連續的胸腺嘧啶殘基，n為19，VN為3’端由核苷酸殘基組成的序列，V為腺嘌呤殘基、鳥糞嘌呤殘基或胞嘧啶殘基，N為腺嘌呤殘基、鳥糞嘌呤殘基、胞嘧啶殘基或胸腺嘧啶殘基。
TW105116589A 2015-06-02 2016-05-27 核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法 TWI676679B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562169563P 2015-06-02 2015-06-02
US62/169,563 2015-06-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201643248A TW201643248A (zh) 2016-12-16
TWI676679B true TWI676679B (zh) 2019-11-11

Family

ID=57518977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105116589A TWI676679B (zh) 2015-06-02 2016-05-27 核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法

Country Status (3)

Country Link
US (2) US10415085B2 (zh)
CN (2) CN110804656B (zh)
TW (1) TWI676679B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106521019A (zh) * 2017-01-03 2017-03-22 成都仕康美生物科技有限公司 一种基于数字PCR平台的miRNA‑21的检测试剂盒及其应用
CN108004300B (zh) * 2017-09-30 2018-11-16 上海境象生物科技有限公司 一种短片段核酸链检测方法和预扩增方法
US20210002698A1 (en) * 2019-07-02 2021-01-07 Quark Biosciences Taiwan, Inc. miRNA Receptivity Analysis of the Endometrium
CN112626217B (zh) * 2020-12-31 2023-02-07 广州瑞熹生物科技有限公司 一种定量检测piRNA-54265基因的试剂盒
CN113604466B (zh) * 2021-07-29 2023-08-29 中国科学院合肥物质科学研究院 通用逆转录引物及miRNA的cDNA合成方法、合成试剂盒和miRNA检测方法
CN113943786A (zh) * 2021-11-03 2022-01-18 苏州图灵微生物科技有限公司 一种mRNA检测方法
CN113981047B (zh) * 2021-11-08 2023-11-07 中国科学院合肥物质科学研究院 一种用于miRNA检测的逆转录-链置换扩增方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154505A (zh) * 2011-04-20 2011-08-17 苟德明 一种检测miRNA的方法及引物及其应用
CN102301011A (zh) * 2009-02-02 2011-12-28 埃克西库恩公司 对小rna进行定量的方法
CN104630222A (zh) * 2014-12-05 2015-05-20 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种miRNA及对其进行检测的特异性引物和方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1735459B1 (en) * 2004-04-07 2012-01-25 Exiqon A/S Methods for quantification of micrornas and small interfering rnas
WO2010050029A1 (ja) * 2008-10-30 2010-05-06 グローリー株式会社 紙幣処理装置
CN101798595A (zh) * 2010-03-08 2010-08-11 江其生 一种新的miRNA检测技术及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102301011A (zh) * 2009-02-02 2011-12-28 埃克西库恩公司 对小rna进行定量的方法
CN102154505A (zh) * 2011-04-20 2011-08-17 苟德明 一种检测miRNA的方法及引物及其应用
CN104630222A (zh) * 2014-12-05 2015-05-20 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种miRNA及对其进行检测的特异性引物和方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Balcells I et al., "Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers", BMC Biotechology, 11:70 http://www.biomedcentral.com/1472-6750/11/70, 2011/06/25
Balcells I et al., "Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers", BMC Biotechology, 11:70 http://www.biomedcentral.com/1472-6750/11/70, 2011/06/25 Busk PK, "A tool for design of primers for microRNA-specific quantitative RT-qPCR", BMC Bioinformatics, 15:29 http://www.biomedcentral.com/1471-2105/15/29, 2014/01/28 Cirera S et al., "Quantification of miRNAs by a simple and specific qPCR method", Methods in Molecular Biology, 1182:73-81, 2014 *
Busk PK, "A tool for design of primers for microRNA-specific quantitative RT-qPCR", BMC Bioinformatics, 15:29 http://www.biomedcentral.com/1471-2105/15/29, 2014/01/28
Cirera S et al., "Quantification of miRNAs by a simple and specific qPCR method", Methods in Molecular Biology, 1182:73-81, 2014

Also Published As

Publication number Publication date
CN110804656B (zh) 2024-01-19
CN106222244A (zh) 2016-12-14
TW201643248A (zh) 2016-12-16
US10415085B2 (en) 2019-09-17
US10590478B2 (en) 2020-03-17
US20170022544A1 (en) 2017-01-26
CN110804656A (zh) 2020-02-18
CN106222244B (zh) 2020-01-07
US20190106731A1 (en) 2019-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI676679B (zh) 核苷酸序列、通用反向引子、通用反轉錄引子、引子設計方法及miRNA檢測方法
EP2419538B1 (en) Methods and compositions to detect and differentiate small rnas in rna maturation pathway
JP6933858B2 (ja) 類縁アレルを検出可能な多重核酸アッセイ法およびその試薬
Wang A PCR-based platform for microRNA expression profiling studies
US9096895B2 (en) Method for quantification of small RNA species
Wang et al. High-throughput primer and probe design
CN104805206A (zh) 检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法
WO2023025259A1 (zh) 检测微小rna的方法和试剂盒
CN109689885A (zh) Rna检测试剂盒和方法
US20230304081A1 (en) Primer and probe design method, detection composition, and kit for mirna detection
JP2024010011A (ja) 全血からの血漿分離の効率を判定する方法およびキット
WO2012032510A1 (en) Primers for amplifying dna and methods of selecting same
WO2022138899A1 (ja) 核酸増幅方法、核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキット
JPWO2009119331A1 (ja) サイトケラチン７のｍＲＮＡの検出用プライマを含む試薬
JP6569238B2 (ja) ノロウイルスｇｉｉ群の検出方法
JP2018088883A (ja) 上皮成長因子受容体遺伝子変異の検出方法
JP2019118294A (ja) プローブを用いた核酸検出用プライマーセット
JP2006511213A5 (zh)
JP2006511213A (ja) Ｒｔ−ｐｃｒによる核酸の絶対定量
JP6984137B2 (ja) マイクロｒｎａ検出方法
Pandey et al. Real-Time PCR and qRT-PCR Methodologies
JP2022031958A (ja) 分析方法及びキット
CN114901833A (zh) 用于进行快速聚合酶链式反应的组合物、试剂盒和方法
JP2023098185A (ja) 標的塩基配列の検出方法
JP2006271324A (ja) 核酸検出法