TWI670279B - 抗體純化及純度監測 - Google Patents

抗體純化及純度監測 Download PDF

Info

Publication number
TWI670279B
TWI670279B TW103109933A TW103109933A TWI670279B TW I670279 B TWI670279 B TW I670279B TW 103109933 A TW103109933 A TW 103109933A TW 103109933 A TW103109933 A TW 103109933A TW I670279 B TWI670279 B TW I670279B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
protein
impurities
antibody
purification
chromatography
Prior art date
Application number
TW103109933A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201514195A (zh
Inventor
丹尼爾Ｓ 艾利森
史蒂芬Ｄ 達文
杜華斌
馬帝茲 李奧Ｆ 賈西亞
傑佛瑞Ｆ 李
艾森Ｗ 歐加拉
馬克 楊格
約翰Ａ 雷特漢
Original Assignee
美商艾爾德生物製藥股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商艾爾德生物製藥股份有限公司 filed Critical 美商艾爾德生物製藥股份有限公司
Publication of TW201514195A publication Critical patent/TW201514195A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI670279B publication Critical patent/TWI670279B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

揭示用於生產及純化重組型蛋白質之方法。尤其，本揭示提供用於生產及純化酵母菌或絲狀真菌細胞內表現之多次級單元型蛋白質的方法。此等蛋白質之生產及/或純化較佳使用凝集蛋白結合測定法來監測雜質，以便可調整一個或多個方法參數而使所欲的重組型蛋白質的量增加至最大，且使醣化雜質的量減到最少。該方法亦監測其他非所欲的產物相關雜質，如聚集體及核酸。於例示性具體例中，該重組型蛋白質為多次級單元型蛋白質，例如抗體，該宿主細胞係酵母菌，例如巴斯德畢赤酵母菌，以及該醣化的雜質為該所欲的重組型多肽之醣化變異體，例如N-連結型及/或O-連結型醣化變異體。

Description

抗體純化及純度監測 相關申請案之交叉引述
本申請案主張2013年3月15日提申的美國臨時專利申請案案號61/792,935的利益，其係以其之全體併入本文中以作為參考資料。
發明領域
本揭示大體而言係有關於生產及純化重組型多肽之方法。尤其，本揭示提供生產及純化酵母菌或絲狀真菌細胞內表現之同聚合型或異聚合型多肽的方法，其係使用凝集蛋白結合測定法來監測經醣化雜質。因此，可以調整發酵方法及/或純化方法，以便使所欲的重組型蛋白質的量增加至最大，且使經醣化的雜質和其他非所欲的產物相關雜質，如聚集體及核酸的量減到最少。於例示性具體例中，該重組型蛋白質為多次級單元型蛋白質，例如抗體，該宿主細胞係酵母菌，例如巴斯德畢赤酵母菌，以及該醣化的雜質為該所欲的重組型多肽之醣化變異體，例如N-連結型及/或O-連結型醣化變異體。
發明背景
蛋白質之大規模、經濟性純化為生物技術產業中越來越重要的事。大體而言，蛋白質係經由使用原核，例如細菌，或真核，例如哺乳動物，或是真菌，細胞株之細胞培養來生產，該細胞株係經由***含有該蛋白質的基因之重組型質體而工程化要生產有興趣的蛋白質。既然使用的細胞株為活的有機體，所以必須供給其等有時自動物血清製劑供給之複合的生長培養基，包含糖、胺基酸及生長因子。將所欲的重組型蛋白質與供應給細胞之化合物混合物及由細胞自身產生之副產物相分離，直至達成足以用作人類治療劑之純度形成難以克服的挑戰。
多聚型(Multimeric)，例如同聚合型(homopolymeric)與異聚合型(heteropolymeric)，蛋白質表示生物分子內結構組織最複雜的位準。不止是組分多肽鏈必須摺疊(成為二級結構與三級領域)，但是其等亦必須形成互補的界面以提供穩定的次級單元交互作用。此等交互作用為高度專一的，以及可以介於同一的次級單元之間或介於不同的次級單元之間。
特別地，習知的抗體係由二個相同輕鏈與二個相同重鏈所組成的四聚體蛋白質。從天然來源純化足夠量供多種用途所用之特定類型的純人類抗體是很困難的。結果，生物科技與製藥公司轉而採用重組DNA式的方法，來大規模地製備抗體。目前已上市或是正在發展數百種治療性單株抗體(mAbs)。功能性抗體的生產作用(包括保留抗原專一性且通常顯示出改良的功能性及物理化學性質之抗體片段) 一般涉及二種多肽的合成作用，以及涉及數個轉譯後事件，包括N端分泌訊息序列的蛋白質分解性處理；將多肽適當摺疊與組裝成為四聚體；形成雙硫鍵；以及典型包括一種專一性N-連結型醣化作用。
此外，作為控制免疫及造血系統之增殖、分化，以及其他細胞功能的多效性調節劑之細胞介素，對於廣大範圍的感染性及自體免疫疾病具有潛在的治療用途。通常會用像抗體、重組表現方法之許多者來表現後續用於研究及藥學應用之重組型細胞介素。
此等蛋白質的重組合成作用典型仰賴高等真核細胞的培養作用，而產生具生物活性的物質，亦經常使用所培養的哺乳類動物細胞。然而，哺乳類動物組織培養式的生產系統導致顯著的額外費用，及併發與微生物發酵方法相關的問題。此外，由哺乳類動物細胞培養所衍生的產物可能需要額外的安全性測試，以確保不含有在所培養細胞或在培養所用的動物衍生性產物，諸如血清中，可能存在的哺乳類動物病原體(包括病毒)。
先前的研究工作已有助於確認巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)係用於生產功能性抗體之具成本效益的平臺，該功能性抗體具有適用於研究、診斷及治療的潛在用途。參見專利權共有的美國專利第7,935,340號；第7,927,863號與第8,268,582號，其中各者在此完整地併入本案以作為參考資料。文獻中亦已知用於供表現重組型蛋白質的巴斯德畢赤酵母菌發酵作用之設計方法，包括最佳化 細胞密度、肉汁(broth)體積、基質進料速率及各反應階段的長度。參見美國紐澤西州托托瓦(Totowa)的胡馬納出版社(Humana Press)出版及由Cregg,J.M.所編輯之2007，“分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)”乙書第389期的畢赤酵母菌屬操作程序(Pichia Protocols)”(第二版年)，第43-63頁之Zhang等人所著“Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations”乙文。亦參見US 20130045888，標題為MULTI-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS；以及US 20120277408，標題為HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS。
雖然可從所培養的細胞產生重組型蛋白質，但是亦可能產生非所欲的副產物。舉例來說，所培養的細胞除了可產生所欲的蛋白質之外，還產生具有非所欲或異常的醣化作用之蛋白質。此外，所培養的細胞可產生多次級單元型蛋白質，還產生游離單體及化學計量不正確的複合體。所欲的多次級單元型蛋白質之純化作用會增加生產成本，及純化作用中所涉及的步驟可能降低所欲的活性複合體的總產量。再者，即使在純化作用之後，非所欲的副產物之存在量可能令人擔心。例如，醣化副產物的存在量可能增 加投藥後免疫反應之風險，且可能不利地影響如穩定性、半生期，及專一性活性(specific activity)之性質，而異常的複合體或聚集體可能降低專一性活性，且也可能具有潛在的免疫原性。
發明概要
本發明提供一種從發酵方法產生的一個或多個樣本純化所欲的重組型多肽之方法，該發酵方法包含於以下條件下培養所欲的細胞或微生物，該條件導致該重組型多肽及一個或多個雜質表現及分泌至該發酵培養基內；其中該純化方法包括偵測該(等)樣本內經醣化雜質的量及/或種類，其係使用凝集蛋白以結合該經醣化雜質，像例如O-連結型醣化作用及/或N-連結型醣化作用產生之所欲的重組型多肽之醣化變異體(glycovariant)。
於一個具體例中，該純化方法選擇性地進一步包含使該(等)樣本接觸至少一個層析撐體且篩選性洗提該所欲的重組型多肽，以及偵測洗提液(eluate)或其餾份內經醣化雜質的量及/或種類，其係使用凝集蛋白以結合該經醣化雜質。該偵測步驟可以使用選自於以下的至少一個凝集蛋白來進行：ConA、LCH、GNA或GNL、RCA、DC-SIGN、L-SIGN、PNA、AIL、VVL、WGA、SNA、MAL、MAH、UEA及AAL。見表3。該偵測步驟可使用至少一個植物凝集蛋白來進行，例如選自於以下的凝集蛋白：PNA、SBA、PWM、PEA、PTA、ML-I-III、LEA、UDA、WGA、PHA、 LTA、BSI-B4、MPA、RCA、LCA、ECA、AAA、DBA、GSL-I、PSA、SJA、DSL、ECL、GSL-II、AIA/木菠蘿素凝集蛋白(Jacalin)、LEL、STL、HHL、LCA、NPL、ACL、ECL、EEL、MAL-I、AAL、LTL、BPL、MPL、PTL、SNA、DGL、SJA、VVA、LEA、STA，或DSA。見Rodas等人，“Separation between toxin-producing and non-toxic clones of Microcystis aeruginosa using lectins,”Anales De La Real Academia Nacional De Farmacia,2012；78(1)：123；Bies等人，“Lectin-mediated drug targeting：history and applications,”Advanced Drug Delivery Reviews,Volume 56,Issue 4,3 March 2004,Pages 425-435；Farias等人，“”,Farias等人，“Expression pattern of glycoconjugates in the Bidderian and ovarian follicles of the Brazilian toad Bufo ictericus analyzed by lectin histochemistry”Braz.J.Biol.[online].2006,vol.66,n.1a,pp.45-51；Vector Laboratories On-Line Catalog,“Specificity Guide for Lectins”and“Biotinylated Lectin Kits”；Afrough等人，“Identification and elimination of false-positives in an ELISA-based system for qualitative assessment of glycoconjugate binding using a selection of plant lectins”,BioTechniques,Vol.43,No.4,2007十月，pp.458-464，其中各者皆在此以其之全體併入本文中以作為參考資料。該偵測步驟可使用至少一個樹突狀細胞凝集蛋白來進行，例如MMR、DEC-205、戴克丁(Dectin)1、戴克丁2、蘭格素(Langerin)，或BDCA-2。見Figdor等人，“C-type lectin receptors on dendritic cells and langerhans cells”,Nature Reviews Immunology 2,77-84(2002年二月)，其在此以其之全體併入本文中以作為參考資料。該植物和樹突狀細胞凝集蛋白對於特定類型的醣化作用之親和性，諸如甘露糖型的醣化作用，可以容易地使用本文中所揭露的技術或本技藝已知的其他技術來測量，俾以判定一假定的凝集蛋白是否能用來結合一假定的醣化蛋白質。
較佳地，該凝集蛋白與一種撐體結合。於一個具體例中，該偵測步驟使用蛋白質-蛋白質交互作用監測方法，例如但不限於，光干涉術(ForteBio Octet®)、雙偏極化干涉術(Farfield AnaLight®)、靜態光散射(Wyatt DynaPro NanoStarTM)、動態光散射(Wyatt DynaPro NanoStarTM)、多角度光散射(Wyatt Calypso II)、表面電漿子共振(ProteOn XPR36或Biacore T100)、ELISA、化學發光ELISA、遠西方墨點轉漬法(far western)、電化學發光(例如使用MesoScale Discovery執行者)或其他凝集蛋白動力結合測定法。
於一具體例中，該所欲的重組型多肽為一種同聚合型(homopolymeric)或一種異聚合型(heteropolymeric)多肽。此種同聚合型或異聚合型重組型多肽包括，但不限於激素、生長因子、受體(如，GPCRs及免疫細胞受體)、抗體、細胞介素、受體配體、轉錄因子、毒素或酵素。非限制性例示的抗體或抗體片段包括專一性地結合下列之該等：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、CBP、血管收縮素(血管 收縮素I及血管收縮素II)、Nav1.7、Nav1.8、VEGF、PDGF、EPO、EGF、FSH、TSH、hCG、CGRP、NGF、TNF、HGF、BMP2、BMP7、PCSK9或是HRG。較佳地，該所欲的重組型多肽為一種抗體或抗體片段。在另一個具體例中，該抗體或抗體片段為一種人類抗體或一種人類化抗體或其片段。該人類化抗體可源自小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊，或是牛。較佳地，該人類化抗體可源自兔。在又另一個具體例中，該抗體或抗體片段包含單價、二價，或是多價抗體。
在一個具體例中，該所欲的重組型多肽係表現於宿主細胞內，宿主細胞是一酵母菌或絲狀真菌。酵母菌可選自於：阿席歐酵母菌(Arxiozyma)屬；糞盤菌(Ascobotryozyma)屬；固囊酵母菌(Citeromyces)屬；得巴利酵母菌(Debaryomyces)屬；德克酵母菌(Dekkera)屬；假囊酵母菌(Eremothecium)屬；伊薩酵母菌(Issatchenkia)屬；哈薩克酵母菌(Kazachstania)屬；克魯維酵母菌(Kluyveromyces)屬；柯達菌(Kodamaea)屬；路德酵母菌(Lodderomyces)屬；管囊酵母菌(Pachysolen)屬；畢赤酵母菌(Pichia)屬；酵母菌(Saccharomyces)屬；木黴菌屬(Saturnispora)；四重孢酵母菌屬(Tetrapisispora)；有孢圓酵母菌(Torulaspora)屬；擬威爾酵母菌(Williopsis)屬；結合酵母菌(Zygosaccharomyces)屬；耶羅威亞(Yarrowia)；紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium)；念珠菌(Candida)；漢遜酵母菌(Hansenula)；擔子菌(Filobasium)；鎖擲酵母菌(Sporidiobolus)；布勒擲孢酵母菌(Bullera)；白冬孢酵母菌(Leucosporidium)以及線擔菌 (Filobasidella)。較佳地，酵母菌為巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、安格斯畢赤酵母菌(Pichia angusta)、季也蒙畢赤酵母菌(Pichia guillermordii)、嗜甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)，或是因諾托畢赤酵母菌(Pichia inositovera)。更佳地，酵母菌為巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。在一較佳具體例中，巴斯德畢赤酵母菌表現一種抗體或抗體片段。絲狀真菌可以選自於麴菌屬(Aspergillus)、木黴菌(Trichoderma)、青黴菌屬(Penicillium)、黑黴菌屬(Rhizopus)、擬青黴菌(Paecilomyces)、鐮孢菌屬(Fusarium)、紅黴菌屬(Neurospora)以及麥角菌屬(Claviceps)。
於一個具體例中，該純化方法包括該所欲的重組型多肽之層析純化，其包含：(a)使該(等)樣本接觸親和性層析撐體且分離該所欲的重組型多肽與該撐體；(b)使步驟(a)的洗提液(eluate)或其餾份接觸混合模式層析撐體且由該撐體篩選性洗提該所欲的重組型多肽；以及(c)使步驟(b)的洗提液或其餾份接觸疏水性作用層析撐體且由該撐體篩選性洗提該所欲的重組型多肽，其中步驟(c)的洗提液或其餾份包含實質純化的所欲的重組型多肽。於一個具體例中，該親和性層析撐體包含免疫親和性配體，例如蛋白A，像MabSelect SuRe，或是凝集蛋白，像GNL或DC-SIGN。可以施用含有1M精胺酸，pH 4.0的緩衝液至該層析撐體來洗提所欲的多次級單元型複合體。於另一個具體例中，該混合模式層析撐體為陶瓷羥磷灰石。可以施用含有大約5mM磷酸鈉，pH 6.5，及大約0M至大約1.5M氯化鈉之緩衝液至 該層析撐體來洗提所欲的重組型多肽。任擇地，可以施用含有大約5mM至大約0.25M磷酸鈉，pH 6.5之緩衝液至該層析撐體來洗提所欲的重組型多肽。
於再另一個具體例中，該疏水性作用層析撐體為聚丙二醇(polypropylene glycol)(PPG)600M。可以施用含有配於大約20mM磷酸鈉，pH 7.0之大約0.7M至0M硫酸鈉之緩衝液至該層析撐體來洗提所欲的重組型多肽。
較佳地，來自步驟(a)、步驟(b)及步驟(c)之至少一者的洗提液或其餾份係與該凝集蛋白接觸，來偵測洗提液或其餾份內經醣化雜質的量及/或種類。可以以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，來并合含有該所欲的重組型多肽之不同的樣本或洗提液或其餾份。舉例來說，與重組型多肽的量相比，以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，來并合含有該所欲的重組型多肽之不同的樣本或洗提液或其餾份。於一個具體例中，將含有小於10%的醣化變異體、小於5%的醣化變異體、小於1%的醣化變異體，或是小於0.5%的醣化變異體之樣本或洗提液或其餾份并合。此外，可以以該所欲的重組型多肽之純度為基礎，來并合不同的樣本或洗提液或其餾份。舉例來說，將含有超過91%純度、超過97%純度，或是超過99%純度之該樣本或洗提液或其餾份并合。於一個具體例中，藉由測量經醣化的重鏈多肽及/或經醣化的輕鏈多肽之質量為重鏈多肽及/或輕鏈多肽之總質量的百分比，來判定純度。於一個較佳具體例中，步驟(c)之洗提液含有小於50ng/mg的醣化變異體；更 佳地，步驟(c)之洗提液含有小於25ng/mg的醣化變異體；最佳地，步驟(c)之洗提液含有小於10ng/mg的醣化變異體。於另一個較佳具體例中，當由凝集蛋白結合動力測定法測量時，步驟(c)之洗提液含有範圍從大約0.2至大約2相對單位(RU)的凝集蛋白活性；更佳地，步驟(c)之洗提液含有小於10ng/mg的真菌細胞蛋白質。於再另一個較佳具體例中，步驟(c)之洗提液含有小於5ng/mg的真菌細胞蛋白質；更佳地，步驟(c)之洗提液含有小於2ng/mg的真菌細胞蛋白質。於再一個另外的較佳具體例中，步驟(c)之洗提液含有小於10ng/mg的核酸；更佳地，步驟(c)之洗提液含有小於5ng/mg的核酸。
於另一個具體例中，以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，來丟棄某些樣本或洗提液或其餾份。於再另一個具體例中，以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，來處理某些樣本或餾份以減少及/或移除該經醣化雜質。例示性的處理包括下列的一者或多者：(i)添加一酵素或其他的化學部分(moiety)來移除醣化，(ii)藉由進行一個或多個凝集蛋白結合步驟來移除該經醣化雜質，(iii)進行粒徑篩析層析術(size exclusion chromatography)來移除該經醣化雜質。
特別地，本發明提供一種用於從包含所欲的多肽和至少一經醣化雜質的混合物來純化表現於真菌細胞，較佳為巴斯德畢赤酵母菌，內之所欲的重組型多肽之方法，該純化方法包含：(a)使該混合物接觸親和性層析撐體且由 該撐體篩選性洗提該多次級單元型蛋白質；(b)使步驟(a)的洗提液或其餾份接觸混合模式層析撐體且由該撐體篩選性洗提該多次級單元型蛋白質；以及(c)使步驟(b)的洗提液或其餾份接觸疏水性作用層析撐體且由該撐體篩選性洗提該多次級單元型蛋白質，其中步驟(c)的洗提液或其餾份包含實質純化的所欲的重組型多肽。使用凝集蛋白以結合該經醣化雜質來偵測步驟(b)及/或步驟(c)的洗提液或其餾份內經醣化雜質的量及/或種類，以及以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，選擇步驟(b)及/或步驟(c)的洗提液之一個或多個餾份用於進一步加工。較佳地，該親和性層析撐體為蛋白A管柱，及/或該混合模式層析撐體為羥磷灰石管柱，及/或該疏水性作用層析撐體為PPG-600M管柱。任擇地，該親和性層析撐體為凝集蛋白管柱。
於一個具體例中，該所欲的重組型多肽為一種多次級單元型蛋白質，較佳為一種抗體。於另一個具體例中，該偵測步驟於蛋白質-蛋白質交互作用監測方法中使用選自於以下的至少一個凝集蛋白來進行：ConA、LCH、GNA、RCA、DC-SIGN、L-SIGN、PNA、AIL、VVL、WGA、SNA、MAL、MAH、UEA及AAL，該監測方法選自於光干涉術(ForteBio Octet®)、雙偏極化干涉術(Farfield AnaLight®)、靜態光散射(Wyatt DynaPro NanoStarTM)、動態光散射(Wyatt DynaPro NanoStarTM)、多角度光散射(Wyatt Calypso II)、表面電漿子共振(ProteOn XPR36或Biacore T100)、ELISA、化學發光ELISA、遠西方墨點轉漬法(far western)、電化學發 光(例如使用MesoScale Discovery執行者)或其他凝集蛋白動力結合測定法。較佳地，該偵測步驟於光干涉術(ForteBio Octet®)測定法中使用GNA(或GNL)及/或DC-SIGN凝集蛋白來進行。
本發明進一步提供一種用於生產所欲的重組型多肽，以及從發酵培養基純化該所欲的重組型多肽之發酵方法。該方法包括：(i)於以下條件下培養宿主細胞或微生物，該條件導致該重組型多肽及一個或多個雜質表現及分泌至該發酵培養基內；(ii)隨著該發酵方法進行或是在實施不同的發酵運轉之後，週期性地取得該發酵培養基的一個或多個樣本；(iii)偵測該(等)樣本內經醣化雜質的量及/或種類，其係使用凝集蛋白以結合該經醣化雜質，以及(iv)根據該(等)樣本內偵測到經醣化雜質的量來修改該發酵方法的一個或多個操作參數或條件。該經醣化雜質可以為該重組型多肽之醣化變異體，較佳為O-連結型醣化作用及/或N-連結型醣化作用的結果。
於一個具體例中，該偵測步驟使用選自於以下的至少一個凝集蛋白，較佳為與一撐體結合的凝集蛋白來進行：ConA、LCH、GNA、RCA、DC-SIGN、L-SIGN、PNA、AIL、VVL、WGA、SNA、MAL、MAH、UEA及AAL。於另一個具體例中，該偵測步驟使用蛋白質-蛋白質交互作用監測方法，例如光干涉術(ForteBio Octet®)、雙偏極化干涉術(Farfield AnaLight®)、靜態光散射(Wyatt DynaPro NanoStarTM)、動態光散射(Wyatt DynaPro NanoStarTM)、組 成梯度多角度光散射(Wyatt Calypso II)、表面電漿子共振(ProteOn XPR36或Biacore T100)、ELISA、化學發光ELISA、遠西方墨點轉漬法(far western)、電化學發光(例如使用MesoScale Discovery執行者)或其他凝集蛋白動力結合測定法。
於一個具體例中，根據偵測到的經醣化雜質的量來改變該發酵方法的下列參數或條件之一者或多者：溫度、pH、氣體成分、進料成分、攪拌、充氣、防沫劑以及持續期間。
於另一個具體例中，該重組型多肽為一種同聚合型或一種異聚合型多肽。例示性重組型多聚型多肽包括激素、生長因子、受體、抗體、細胞介素、受體配體、轉錄因子或是酵素。較佳地，該重組型多肽為一種抗體或抗體片段。例示的抗體及抗體片段包括專一性地結合下列之該等：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、CBP、血管收縮素(血管收縮素I及血管收縮素II)、Nav1.7、Nav1.8、VEGF、PDGF、EPO、EGF、FSH、TSH、hCG、CGRP、NGF、TNF、HGF、BMP2、BMP7、PCSK9或是HRG。在一個具體例中，該抗體或抗體片段為一種人類抗體或一種人類化抗體或其片段。該人類化抗體可源自小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊，或是牛。較佳地，該人類化抗體可源自兔。在一個具體例中，該抗體或抗體片段包含單價、二價或多價抗體。
在一個具體例中，宿主細胞是一種酵母菌或絲狀 真菌。較佳地，該酵母菌宿主細胞係選自於：阿席歐酵母菌(Arxiozyma)屬；糞盤菌(Ascobotryozyma)屬；固囊酵母菌(Citeromyces)屬；得巴利酵母菌(Debaryomyces)屬；德克酵母菌(Dekkera)屬；假囊酵母菌(Eremothecium)屬；伊薩酵母菌(Issatchenkia)屬；哈薩克酵母菌(Kazachstania)屬；克魯維酵母菌(Kluyveromyces)屬；柯達菌(Kodamaea)屬；路德酵母菌(Lodderomyces)屬；管囊酵母菌(Pachysolen)屬；畢赤酵母菌(Pichia)屬；酵母菌(Saccharomyces)屬；木黴菌屬(Saturnispora)；四重孢酵母菌屬(Tetrapisispora)；有孢圓酵母菌(Torulaspora)屬；擬威爾酵母菌(Williopsis)屬；結合酵母菌(Zygosaccharomyces)屬；耶羅威亞(Yarrowia)；紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium)；念珠菌(Candida)；漢遜酵母菌(Hansenula)；擔子菌(Filobasium)；鎖擲酵母菌(Sporidiobolus)；布勒擲孢酵母菌(Bullera)；白冬孢酵母菌(Leucosporidium)以及線擔菌(Filobasidella)。更佳地，酵母菌宿主細胞為巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、安格斯畢赤酵母菌(Pichia angusta)、季也蒙畢赤酵母菌(Pichia guillermordii)、嗜甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)，或是因諾托畢赤酵母菌(Pichia inositovera)。最佳地，酵母菌宿主細胞為巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。在一較佳具體例中，巴斯德畢赤酵母菌表現一種抗體或抗體片段。於一任擇的具體例中，絲狀真菌宿主細胞係選自於麴菌屬(Aspergillus)、木黴菌(Trichoderma)、青黴菌屬(Penicillium)、黑黴菌屬(Rhizopus)、擬青黴菌(Paecilomyces)、鐮孢菌屬 (Fusarium)、紅黴菌屬(Neurospora)以及麥角菌屬(Claviceps)。
於另一個具體例中，該方法進一步包括從該發酵培養基回收或純化該重組型多肽。較佳地，該純化方法進一步包含使該(等)樣本接觸至少一個層析撐體且篩選性洗提該所欲的重組型多肽。於一個具體例中，該純化方法進一步包含以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，并合含有該所欲的重組型多肽之不同的樣本或洗提液或其餾份。舉例來說，與重組型多肽的量相比，以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，可以并合含有該所欲的重組型多肽之不同的樣本或洗提液或其餾份。
於一個具體例中，該方法進一步包含使用粒徑篩析層析術來偵測該等樣本或餾份內聚集的及/或崩解的雜質的量。較佳地，根據偵測到的聚集的及/或崩解的雜質的量來改變該發酵方法的下列參數或條件之一者或多者：溫度、pH、氣體成分、進料成分、攪拌、充氣、防沫劑以及持續期間。
圖1提供一種用於純化在轉型細胞例如畢赤酵母菌中，表現的單株抗體，去除產物相關雜質之例示性方法之綜述，其包括在純化方法整個期間監測雜質之存在。
圖2通過圖闡明凝集蛋白結合至經醣化的蛋白質。圖解凝集蛋白動力結合測定法(例如，光干涉術)，用於分析技術中來監測純化主產物，例如抗體，去除經醣化雜質。
圖3通過圖闡明與畢赤酵母菌生產的蛋白質相關之經醣化的變異體(glycosylated variants)之存在，包括O-連結型經醣化的產物。使用Octet儀器之固定化凝集蛋白(GNA，Snowdrop)來分析源自Ab-A羥磷灰石層析分離之餾份之經醣化產物的量。
圖4A-B通過圖闡明經由凝集蛋白動力結合測定法來判定之經醣化雜質的位準，與經由粒徑篩析層析術來判定之醣化雜質的位準之間有關聯。縮寫GV係提及醣化變異體。源自Ab-A羥磷灰石層析餾份(餾份1-餾份21)內之GNA與DC-SIGN的Octet測定法(RU)之凝集蛋白結合反應資料，與經由粒徑篩析(SE)-HPLC判定之相同餾份的醣化變異體百分比係用圖來表示。見圖4A。SE-HPLC層析的樣本顯示醣化變異體與IgG之分離作用。箭頭標明在室溫下於15.9分鐘時洗提出之GV峰。在室溫下於17.2分鐘時洗提出IgG峰。
圖5A-B顯示畢赤酵母菌生產的Ab-A之羥磷灰石層析餾份之經醣化雜質的含量，其使用來判定要并合那一些餾份用於進一步的純化。舉例來說，依據不同的嚴格性(stringencies)來描述二個集池(pool)：基線并合的準則-具有91%純度和5.0%變異體之集池餾份(餾份1-餾份13)；以及嚴格并合的準則-1.0%變異體之集池餾份(餾份1-餾份10)。見，圖5A。縮寫GV係提及醣化變異體。SE-HPLC資料顯示出基線集池(餾份1-餾份13)具有0.4% GV，而嚴格集池(餾份1-餾份10)具有0.1% GV。集池之O-glyco分析(mol 糖/mol mAb)顯示，與基線集池相比，嚴格集池內單甘露糖及甘露三糖是減少的(亦即，與基線集池之1.60mol單甘露糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為1.55mol單甘露糖/mol Ab-A，以及與基線集池之0.28mol甘露三糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為0.22mol甘露三糖/mol Ab-A)。GNA-Octet反應資料(RU)證實嚴格準則集池內減少的醣化變異體位準，與基線集池相比(亦即，分別為1.9RU相對於2.3RU)。見，圖5B。
圖6A-B顯示畢赤酵母菌生產的Ab-A疏水性作用層析術餾份之經醣化雜質的含量，其使用來判定要并合那一些餾份用於進一步的純化。舉例來說，依據不同的嚴格性來描述二個集池：基線并合的準則-由前部側面處第一個具有97%純度之餾份，至後部側面處最後一個具有99%純度之餾份(餾份4-餾份23)之集池；以及嚴格并合的準則-由前部側面處第一個具有10RU GNA活性之餾份，至後部側面處最後一個具有99% SE-HPLC純度之餾份(餾份8-餾份23)之集池。見，圖6A。縮寫GV係提及醣化變異體。縮寫LMW係提及低分子量雜質。SE-HPLC資料顯示出基線集池(餾份4-餾份23)具有0.4% GV，而嚴格集池(餾份8-餾份23)具有0.3% GV。集池之O-glyco分析(mol糖/mol mAb)顯示，與基線集池相比，嚴格集池內單甘露糖、甘露二糖及甘露三糖是減少的(亦即，與基線集池之1.48mol單甘露糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為1.57mol單甘露糖/mol Ab-A；與基線集池之0.14mol甘露二糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內 為0.52mol甘露二糖/mol Ab-A；以及與基線集池之0.07mol甘露三糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為0.32mol甘露三糖/mol Ab-A)。GNA-Octet資料證實嚴格準則集池內減少的醣化變異體位準，與基線集池相比(亦即，分別為1.1RU相對於1.4RU)。見，圖6B。
圖7A-B顯示畢赤酵母菌生產的Ab-A、於非還原條件及還原條件下進行的染色的SDS-PAGE凝膠(分別為圖7的A組及B組)。從蛋白A洗提液加工成CHT集池成PPG HIC集池，當產物相關的雜質之位準降低時，觀測到純化作用。於二組中：第1道及第12道：對照道(1X樣本緩衝液)；第2道、第6道及第11道：分子量標誌；第3-5道：加載至蛋白A親和性管柱上的總樣本；第7道：蛋白A親和性層析術之後的Ab-A抗體製備物；第8道：CHT層析術之後的Ab-A抗體製備物；第9道：HIC層析術之後的Ab-A抗體製備物；以及第10道：粗過濾(bulk filtration)(BDS)之後的Ab-A抗體製備物。
圖8顯示在使用GNA凝集蛋白測定法來監測Ab-B下游純化作用的整個期間，醣化變異體(GV)雜質的減少。
圖9顯示在Ab-B的HIC純化作用的整個期間醣化變異體(GV)雜質之分離作用。使用GNA凝集蛋白測定法來測試源自HIC洗提之餾份集池的GV含量。源自洗提峰前部之餾份(餾份1-餾份5)以及源自洗提峰後部之餾份(餾份26-餾份32)具有比源自峰的中部之餾份(餾份6-餾份25)更高的 凝集蛋白活性。並且，餾份6-餾份25含有所欲的純化Ab-B產物。
圖10顯示畢赤酵母菌生產的Ab-B、於非還原條件及還原條件下進行的染色的SDS-PAGE凝膠(分別為圖10的A組及B組)。從蛋白A洗提液加工成CHT集池成PPG HIC集池，當產物相關的雜質之位準降低時，觀測到純化作用。於二組中：第1道、第2道、第6道含有分子量標誌；第3道含有蛋白A洗提液；第4道含有CHT集池；以及第5道含有HIC集池。
詳細說明
本揭示提供用於生產及純化由宿主細胞或微生物表現之重組型多肽的方法。特別地，本發明提供用於生產及純化於酵母菌或絲狀真菌細胞內表現之同聚合型或異聚合型多肽，如抗體(such an antibodies)，的方法。本方法合併凝集蛋白結合作為經醣化雜質的定量指標，以使得能修飾生產及/或純化的方法而使所欲的蛋白質的產量達到最大以及減少經醣化雜質的存在。
此外，本方法包含純化的方法，其包含從該發酵方法層析分離樣本，俾以由非所欲的產物相關雜質來實質純化該所欲的重組型多肽，非所欲的產物相關雜質像是經醣化雜質(例如醣化變異體)、核酸以及聚集體/崩解體(disaggregate)。於一些具體例中，監測來自不同的層析步驟之洗提液或其餾份之凝集蛋白結合活性以偵測經醣化雜 質的種類及/或量。以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，來丟棄、處理及/或篩選性并合來自發酵方法之某些樣本及/或來自層析純化的餾份供用於進一步的純化。
於例示性的具體例中，該重組型蛋白係一抗體或抗體結合片段，該酵母菌細胞為巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)，以及該經醣化雜質為該所欲的重組型多肽之醣化變異體(glycovariant)，諸如N-連結型及/或O-連結型醣化變異體。
在一較佳具體例中，該重組型蛋白係一抗體或抗體片段，諸如由二個重鏈次級單元與二個輕鏈次級單元所組成之一人類化抗體或人類抗體。較佳的真菌細胞包括酵母菌，及特佳的酵母菌包括親甲基醇(methylotrophic)酵母菌菌株，諸如巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)(安格斯畢赤酵母菌(Pichia angusta))、季也蒙畢赤酵母菌(Pichia guillermordii)、嗜甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)、因諾托畢赤酵母菌(Pichia inositovera)，以及其他者(參見諸如，U.S.專利第4,812,405號、第4,818,700號、第4,929,555號、第5,736,383號、第5,955,349號、第5,888,768號，及第6,258,559號，其中各者完整地併入本案以作為參考資料)。酵母菌細胞可以經由本技藝中所知的方法來生產。舉例而言，含有不同的基因副本數目組合之一組二倍體或四倍體酵母菌細胞，可藉由將所含有之個別次級單元基因的副本數目不同之細胞配對(較佳在配對之前得知副本數目)而產生。
本申請人已經發現新穎的方法，用於生產及純化酵母菌或絲狀真菌細胞內生產的蛋白質，其提供高的所欲的蛋白質產量及最少的雜質。特別地，本文中所揭露的方法將純度監測的步驟合併至蛋白質生產及/或純化的方案中，以改善像經醣化雜質之產物相關雜質從有興趣的主蛋白質產物之移除，其係藉由與重組型多肽的量相比，以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，來篩選性丟棄、處理及/或純化源自生產及/或純化的方案之某些餾份。工作實施例證明使用此生產及純化監測的方法會導致高的產物純化位準(諸如至少97%純度)，同時維持高的所欲的蛋白質產物產量。
於一個具體例中，該方法包括一種用於生產所欲的重組型多肽，以及從發酵培養基純化該所欲的重組型多肽之發酵方法。大體而言，於以下條件下培養酵母菌細胞或微生物，該條件導致該重組型多肽及一個或多個雜質表現及分泌至該發酵培養基內，例如在發酵進行的整個期間或在發酵進行之後，收集一個樣本以及使用凝集蛋白來監測該(等)樣本內經醣化雜質的量及/或種類，以便可以偵測到的經醣化雜質為基礎，來修改該發酵方法的參數，例如溫度、pH、氣體成分(例如氧位準、壓力、流動速率(flow rate))、進料成分(例如葡萄糖位準或速率)、攪拌、充氣、防沫劑(例如種類或濃度)以及持續期間。
於另一個具體例中，該方法包括一種用於從發酵方法產生的一個或多個樣本純化所欲的重組型多肽之方法， 其包含於以下條件下培養所欲的細胞或微生物，該條件導致該重組型多肽及一個或多個雜質表現及分泌至該發酵培養基內，其係藉由使用凝集蛋白結合法以偵測該(等)樣本內經醣化雜質的量及/或種類。本發明人已經確定凝集蛋白動力結合測定法提供經醣化雜質之定量測量，以便可以因應偵測的雜質位準及種類，來調整純化方法。
於一個特定的具體例中，該純化方法進一步包括使來自該發酵方法之一個或多個樣本，例如含有宿主酵母菌或絲狀真菌細胞內表現之所欲的重組型蛋白質，如抗體，及雜質之發酵培養基，與至少一個層析撐體接觸，以及接而篩選性洗提該所欲的重組型多肽。舉例來說，可以使用動力凝集蛋白結合測定法來測試該發酵方法樣本之經醣化雜質，以及取決於偵測到經醣化雜質之種類及/或量，而接觸親和性層析撐體(例如蛋白A或凝集蛋白)，混合模式層析撐體(例如陶瓷羥磷灰石)以及疏水性作用層析撐體(例如聚丙二醇(PPG)600M)。該所欲的蛋白質在接觸後續的層析撐體之前，例如篩選性洗提而與各層析撐體分離，導致來自疏水性作用層析撐體之洗提液或其餾份包含實質純化的所欲的重組型蛋白質。
關於“實質純化的”所欲的蛋白質或多次級單元型蛋白質意指該樣本包含至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或是至少98.5%的所欲的重組型蛋白質具有小於3%，小於2.5%，小於2%，小於1.5%或是小於1%的雜質，亦即， 聚集體、變異體以及低分子量產物。於一個具體例中，實質純化的蛋白質包含小於50ng/mg，較佳為小於25ng/mg或更佳為小於10ng/mg醣化變異體；小於10ng/mg，較佳為小於5ng/mg或更佳為小於2ng/mg的真菌細胞蛋白質；及/或小於10ng/mg或較佳為小於5ng/mg的核酸。
該方法選擇性地進一步包括監測該發酵方法之樣本及/或源自親和性層析撐體、混合模式層析撐體以及疏水性作用層析撐體之至少一者的洗提液或其餾份之一部份，至少一產物相關雜質的存在，例如真菌細胞蛋白質、真菌細胞核酸、外來(adventitious)病毒、內源病毒、內毒素、聚集體、崩解體，或是相對於所欲的重組型蛋白質，包含至少一修飾之非所欲的蛋白質(諸如，胺基酸之取代作用、N端修飾、C端修飾、誤配的S-S鍵、摺疊、截斷、聚集作用、多聚型解離作用、變性作用、乙醯化作用、脂肪乙醯化作用(fatty acylation)、脫醯胺作用、氧化作用、胺甲醯化作用、羧化作用、甲醯化作用、γ-羧基麩胺醯化作用、醣化作用、甲基化作用、磷酸化作用、硫酸化作用、聚乙二醇化作用(PEGylation)以及泛素化作用(ubiquitination))。特別地，該生產及純化方法可包括使用粒徑篩析層析術來偵測該等樣本或餾份內聚集及/或崩解的雜質量。
雖然本揭示大部分係說明抗體之生產作用，但是本文中所述之方法立即可適用於其他多次級單元型複合體，以及單一次級單元型蛋白質。本文中所述之方法立即可使用來改良任何包含二或更多個不同次級單元的、重組型多 次級單元型複合體之產量及/或純度。此外，本發明的方法並非受限於生產多蛋白複合體，其亦可適用於核糖核蛋白(RNP)複合體，包括端粒酶、hnRNP、核糖體、snRNP、訊息辨識粒子、原核與真核生物Rnase P複合體，以及含有多個截然不同的蛋白及/或RNA次級單元之其他任何複合體。表現多次級單元型複合體之真菌細胞可以經由本技藝中所知的方法來生產。舉例而言，含有不同的基因副本數目組合之一組二倍體或四倍體酵母菌細胞，可藉由將所含有之個別次級單元基因的副本數目不同之細胞配對(較佳在配對之前得知副本數目)而產生。
重組型蛋白之表現
包括同聚合型或異聚合型多肽，諸如一種抗體或抗體片段，之重組型蛋白能表現於酵母菌及絲狀真菌細胞內。在一具體例中，該所欲的蛋白質重組表現於酵母菌內，及特別佳的酵母菌包括親甲基醇(methylotrophic)酵母菌菌株，諸如巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)(安格斯畢赤酵母菌(Pichia angusta))、季也蒙畢赤酵母菌(Pichia guillermordii)、嗜甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)、因諾托畢赤酵母菌(Pichia inositovera)，以及其他者(參見諸如，U.S.專利第4,812,405號、第4,818,700號、第4,929,555號、第5,736,383號、第5,955,349號、第5,888,768號，及第6,258,559號，其中各者完整地併入本案以作為參考資料)。其他的例示性酵母菌包括：阿席歐酵母菌(Arxiozyma)屬；糞盤菌 (Ascobotryozyma)屬；固囊酵母菌(Citeromyces)屬；得巴利酵母菌(Debaryomyces)屬；德克酵母菌(Dekkera)屬；假囊酵母菌(Eremothecium)屬；伊薩酵母菌(Issatchenkia)屬；哈薩克酵母菌(Kazachstania)屬；克魯維酵母菌(Kluyveromyces)屬；柯達菌(Kodamaea)屬；路德酵母菌(Lodderomyces)屬；管囊酵母菌(Pachysolen)屬；畢赤酵母菌(Pichia)屬；酵母菌(Saccharomyces)屬；木黴菌屬(Saturnispora)；四重孢酵母菌屬(Tetrapisispora)；有孢圓酵母菌(Torulaspora)屬；擬威爾酵母菌(Williopsis)屬；結合酵母菌(Zygosaccharomyces)屬；耶羅威亞(Yarrowia)；紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium)；念珠菌(Candida)；漢遜酵母菌(Hansenula)；擔子菌(Filobasium)；鎖擲酵母菌(Sporidiobolus)；布勒擲孢酵母菌(Bullera)；白冬孢酵母菌(Leucosporidium)以及線擔菌(Filobasidella)。
酵母菌細胞可以經由本技藝中所知的方法來生產。舉例而言，含有不同的基因副本數目組合之一組二倍體或四倍體酵母菌細胞，可藉由將所含有之個別次級單元基因的副本數目不同之細胞配對(較佳在配對之前得知副本數目)而產生。
在一具體例中，酵母菌細胞可包含一個副本以上之編碼該重組型蛋白質的一個或多個基因，或是所欲的多次級單元型蛋白質之次級單元的一個或多個基因。舉例來說，可將多個副本的次級單元基因縱排嵌入一或多個染色體基因座中。在用於生產該所欲的蛋白質或多次級單元型 複合體的培養期間，所縱排嵌入的多個副本的基因較佳保有穩定的副本數目。舉例來說，在本申請人所描述之先前的研究工作中，在含有3或4個副本縱排嵌入的輕鏈與重鏈抗體基因之巴斯德畢赤酵母菌菌株中，基因副本數目大致維持穩定(參見，U.S.20130045888)。
較佳將編碼該重組型蛋白質次級單元的一個或多個基因嵌入一真菌細胞的一個或多個染色體基因座中。可使用適合嵌入的任一染色體基因座，包括基因間序列、啟動子序列、編碼序列、終止序列、調控序列等等。在巴斯德畢赤酵母菌(P.pastoris)可供使用的例示性染色體基因座包括PpURA5；OCH1；AOX1；HIS4；及GAP。亦可將編碼基因嵌入一或多個隨機染色體基因座中，而非所標定的基因座。在較佳具體例中，染色體基因座係選自於pGAP基因座、3’AOX TT基因座及HIS4 TT基因座所組成之群組。在額外的例示性具體例中，編碼異源性蛋白質次級單元的基因可包含在一或多種染色體外因子中，例如在一或多種質體或人工染色體中。
在例示性具體例中，該蛋白質可以為多次級單元型複合體，其包含例如，二、三、四、五、六個或更多個同一及/或非同一的次級單元。此外，各次級單元可在各多次級單元型蛋白質中出現一或多次。舉例來說，該多次級單元型蛋白質可以為多重專一性抗體，諸如包含二個非同一的輕鏈與二個非同一的重鏈之雙特異性抗體。含有不同的基因副本數目組合之一組二倍體或四倍體酵母菌細胞， 可藉由將含有不同副本數目的個別次級單元基因之細胞配對，而快速產生。然後可基於諸如，相對於非所欲副產物，所欲多次級單元型蛋白質的產量或所欲多次級單元型蛋白質的純度之特性，評估由該組的各菌株所產生之抗體，而辨識出供進一步使用之菌株。
該多次級單元型之次級單元可以由單順反子基因、多順反子基因，或其任一組合來表現。各多順反子基因可以包含多個副本的相同次級單元，或是可包含一個副本或多個副本各不同的次級單元。
可用於操作巴斯德畢赤酵母菌之例示性方法(包括培養、轉形及配對方法)，係揭露於包括U.S.20080003643、U.S.20070298500及U.S.20060270045在內的公開申請案中，及揭露於美國紐澤西州托托瓦(Totowa)的胡馬納出版社(Humana Press)於1998年出版及由Higgins,D.R.與Cregg,J.M.所編輯之“分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)”乙書之“畢赤酵母菌屬操作程序(Pichia Protocols)”及美國紐澤西州托托瓦的胡馬納出版社於2007年出版及由Cregg,J.M.所編輯之“分子生物學方法”乙書之“畢赤酵母菌屬操作程序”(第二版)，其中各者在此完整地併入本案以為參考資料。
可使用的一例示性表現卡匣係由以下所組成：與編碼一分泌訊息的序列融合之甘油醛去氫酶基因(GAP基因)啟動子、接著是待表現基因的序列、接著是編碼來自巴斯德畢赤酵母菌醇氧化酶I基因(AOX1)的一種巴斯德畢赤 酵母菌轉錄終止訊息之序列。藉由篩選抵抗更高位準的吉歐黴素(Zeocin)之轉形體，吉歐黴素抗性標記基因可提供濃化菌株的方式，而濃化的菌株係在一菌株中含有所嵌入的多個副本的表現載體。同樣地，藉由篩選對於更高位準的建那黴素(Geneticin)或卡那黴素(Kanamycin)具有抗性之轉形體，G418或卡那黴素抗性標記基因可提供濃化菌株之一方式，而所濃化的菌株係在一菌株中含有所嵌入的多個副本的表現載體。
可使用的酵母菌菌株包括營養缺陷型巴斯德畢赤酵母菌或其他畢赤酵母菌屬菌株，例如具有met1、lys3、ura3及ade1或其他營養缺陷性相關基因的突變作用之菌株。突變作用較佳無法以明顯的頻率產生逆突變體(revertant)，及較佳為部分刪除型或甚至更佳為全刪除型突變體。較佳藉由將互補的營養缺陷型菌株配對，而產生原始營養型二倍體或四倍體菌株。
在轉形之前，可在與標的基因座(如，GAP啟動子序列)同源的一區域內，藉由限制酶剪切作用而將各表現載體直線化，以引導載體嵌入真菌細胞中的標的基因座。然後可藉由電穿孔或其他方法，將各載體樣本個別轉形至所欲菌株的培養物中，以及可藉由可篩選標記，如抗生素抗性或營養缺陷性之互補，篩選成功轉形體。可以挑選單離株，在篩選條件下劃接種成單一菌落，然後在從各菌株萃取的基因體DNA上，藉由南方墨點法或PCR測定法，檢視以確認編碼所欲的蛋白質或多次級單元型複合體(如一 種所欲的抗體)的次級單元之基因的副本數目。選擇性地，可藉由例如FACS、西方墨點法、菌落轉印法與免疫墨點法，以及本技藝所知的其他方式，確認所預期的次級單元基因產物之表現作用。選擇性地，對於單倍體單離株進行額外多次的轉形作用，以導入額外的異源性基因，如嵌入不同基因座之額外副本的相同次級單元，及/或多個副本的不同次級單元。然後將單倍體菌株配對，而產生可以合成該多蛋白複合體的二倍體菌株(或更高倍體的菌株)。可藉由南方墨點法、PCR及本技藝所知的其他檢測方式，確認所預期的各次級單元基因是否存在。當所欲的多蛋白複合體係一抗體時，亦可藉由菌落轉印法/免疫墨點法(Wung等人於期刊“Biotechniques”第21期第808-812頁(1996年)乙文及/或藉由FACS確認其表現作用。
選擇性地重複此轉形操作程序，以將一異源性基因標定嵌入第二基因座，該異源性基因可與標定嵌入第一基因座的基因相同或不同。當待嵌入第二基因座的建構物所編碼的一蛋白係與第一基因座所編碼的序列相同或高度相似時，可變化其序列，以降低非所欲地嵌入第一基因座之可能性。舉例來說，相對於嵌入第一基因座之序列而言，待嵌入的第二基因座之序列可在啟動子序列、終止序列、密碼子之使用方面有所差異，及/或具有其他可容許的序列差異。
可如上文之“畢赤酵母菌屬操作程序(Pichia Protocols)”(1998，2007)所述，進行單倍體巴斯德畢赤酵母 菌菌株的轉形作用，以及巴斯德畢赤酵母菌生殖週期的基因操作。
供用於本發明的方法之表現載體可以進一步包括酵母菌的特定序列，包括一用於辨識經轉形的酵母菌菌株之可選擇的營養缺陷型或藥物標記。一藥物標記可以進一步用來擴增一酵母菌細胞內的載體之副本的數目，例如藉由在升高的藥物濃度中培養細胞族群，從而篩選出表現較高的抗性基因位準之轉形體。
編碼有興趣的序列之多肽典型係操作地連結至轉錄和轉譯調控序列，該轉錄和轉譯調控序列提供用於酵母菌細胞內之多肽的表現。此等載體組份可以包括，但不限於下列的一者或多者：一增強子元素、一啟動子，以及一轉錄終止序列。也可以包括關於該多肽的分泌之序列，例如一訊息序列，和類似物。一酵母菌的複製的原點是選擇性的，因表現載體往往被併入至酵母菌的基因體之內。
於一個例示性具體例中，編碼該異源性蛋白質或其次級單元的一個或多個基因係與可誘導性啟動子偶合。例示性的適宜啟動子包括醇氧化酶1基因啟動子、甲醛去氫酶基因(FLD；參見美國公開案第2007/0298500號)及本技藝中所知的其他可誘導性啟動子。當酵母菌在最常見的碳源，諸如葡萄糖、甘油或乙醇中生長時，醇氧化酶1基因啟動子係受到緊密抑制，但是當在甲醇中生長時則被高度誘導(Tschopp等人，1987；頒證Stroman,D.W.等人之U.S.Pat.第4,855,231號)。為了生產外來的蛋白質，菌株最初可在一 抑制性碳源中生長，以產生生質，然後轉換使用甲醇作為唯一(或主要)的碳與能量來源，而誘導該外來的基因之表現。此調控系統的優點在於以外來的基因轉形之巴斯德畢赤酵母菌菌株，該外來的基因表現產物具有細胞毒性，可以在抑制性條件下生長而獲得維持。
於另一個例示性具體例中，異源性基因中之一者或多者可與一個受調控型啟動子偶合，其表現位準可在適當條件下向上調控。來自畢赤酵母菌(Pichia)的適宜啟動子之實例包括CUP1(由培養基中的銅位準所誘導)、四環黴素可誘導性啟動子、硫胺素可誘導性啟動子、AOX1啟動子(Cregg等人(1989)Mol.Cell.Biol.9：1316-1323)；ICL1啟動子(Menendez等人(2003)Yeast 20(13)：1097-108)；甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子(GAP)(Waterham等人(1997)Gene 186(1)：37-44)；以及FLD1啟動子(Shen等人(1998)Gene 216(1)：93-102)。GAP啟動子係一強力的構成性啟動子，而CUP1、AOX及FLD1啟動子係可誘導性啟動子。前述各參考文獻在此完整地併入本案以為參考資料。
其他的酵母菌的啟動子包括：ADH1、乙醇去氫酶II、GAL4、PHO3、PHO5、Pyk，以及自其衍生的嵌合啟動子。此外，可以使用於本發明中之非酵母菌的啟動子，如：哺乳動物、昆蟲、植物、爬蟲類、兩棲動物、病毒，以及鳥類的啟動子。最典型地，啟動子會包含一哺乳動物的啟動子(可能對表現的基因是內源的)，或是會包含一於酵母菌系統提供有效的轉錄之酵母菌的或病毒的啟動子。
有興趣的多肽不僅可以直接地重組生產，而且也可以為帶有一異源多肽的融合多肽，異源多肽例如訊息序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特定的***的位址之其他多肽。一般而言，訊息序列可以是載體的一組份，或是其可以是***至載體內的多肽編碼序列的一部分。選擇的異源信號訊息序列較佳係經由真菌細胞內的標準途徑的之一辨識且處理者。啤酒酵母菌脉因子原前訊息已經被證實可有效分泌來自巴斯德畢赤酵母菌之各種重組型蛋白。其他的酵母菌訊息序列包括脉配對因子訊息序列、轉化酶訊息序列，以及衍生自其他分泌的酵母菌多肽之訊息序列。此外，此等訊息胜肽序列可以是經工程設計的，以用於提高於二倍體酵母菌表現系統內的分泌。其他有興趣的分泌訊息也包括哺乳動物的訊息序列，其等對於待分泌的蛋白可以是異源的，或是可以是待分泌的蛋白之天然序列。訊息序列包括：前胜肽序列(pre-peptide sequences)，以及於一些實例中，可以包括原胜肽序列。許多此等訊息序列係本技藝中所知道的，包括免疫球蛋白鏈上發現的訊息序列，例如K28原前毒素序列、PHA-E、FACE、人類MCP-1、人類血清白蛋白訊息序列、人類Ig重鏈、人類Ig輕鏈，和類似物。舉例而言：參見Hashimoto等人，Protein Eng 11(2)75(1998)；以及Kobayashi等人，Therapeutic Apheresis2(4)257(1998)，其中各者在此完整地併入本案以作為參考資料。
轉錄可以藉由***一轉錄活化子序列至載體之內而增加。此等活化子係DNA的順式作用元素，通常大約 自10至300bp，其等作用於一啟動子上以增加其之轉錄。轉錄增強子係相對地定位且位置獨立的，已經發現轉錄增強子位於轉錄單元的5'和3'，在一***子之內，以及在編碼序列本身之內的。增強子可以予以剪接至表現載體中位於編碼序列的5'或3'的一位置，但是較佳地係座落於啟動子的5'的位址。
雖然是選擇性的，但是在本發明的一具體例中，該所欲的蛋白質或多次級單元型複合體的一個或多個次級單元係操作地連結至一分泌序列連接或與一分泌序列融合，該分泌序列係用於將所表現的多肽分泌至培養基中，其可促進該異源蛋白質或多次級單元型複合體的收獲與純化作用。甚至更佳地，該分泌序列將真菌細胞(如，酵母菌二倍體細胞)的多肽分泌作用最佳化，諸如經由選擇較佳的密碼子及/或經由密碼子選擇而改變AT的百分比。本技藝中已知分泌效率及/或穩定性可受到所選擇的分泌序列影響，以及不同蛋白質之間的最佳分泌序列也可能不同(參見，譬如Koganesawa等人，Protein Eng.2001 Sep；14(9)：705-10乙文，其在此完整地併入本案以作為參考資料)。本技藝中已知許多潛在適宜的分泌訊息，以及可很容易試驗其等對於之一特的異源蛋白質或多次級單元型複合體的產量及/或純度之效應。可能使用任一分泌序列，包括酵母菌與其他物種所分泌的蛋白質中所存在者，以及基因工程之分泌序列。參見Hashimoto等人，Protein Engineering vol.11 no.2 pp.75-77,1998；Oka等人，Biosci Biotechnol Biochem.1999 Nov；63(11)：1977-83；Gellissen等人，FEMS Yeast Research 5(2005)1079-1096；Ma等人，Hepatology.2005 Dec；42(6)：1355-63；Raemaekers等人，Eur J Biochem.1999 Oct 1；265(1)：394-403；Koganesawa等人，Protein Eng.(2001)14(9)：705-710；Daly等人，Protein Expr Purif.2006 Apr；46(2)：456-67；Damasceno等人，Appl Microbiol Biotechnol(2007)74：381-389；以及Felgenhauer等人，Nucleic Acids Res.1990 Aug 25；18(16)：4927，其中各者在此完整地併入本案以作為參考資料)。
當核酸與另一個核酸序列置於一功能關係時，則該核酸係"操作地連結"。舉例而言，設若一訊息序列的DNA係表現為參與一多肽的分泌之前蛋白，則該訊息序列的DNA係操作地連結至該多肽的DNA；設若一啟動子或增強子影響一序列的轉錄，則該啟動子或增強子係操作地連結至該編碼序列。一般而言，“操作地連結”係指連接的DNA序列係相鄰的，及在分泌前導的情況係相鄰及位於同一讀框中。然而，增強子不一定要相鄰。連結作用可以在合宜的限制位址藉由連接作用而完成，或是任擇地透過本技藝中具有技術的那些人所熟悉的PCR/重組方法(Gateway® Technology；Invitrogen,Carlsbad Calif.)予以完成。設若此等位址不存在，可以依照慣用的慣例使用合成的寡核苷酸接合體或連結子。亦可藉由化學合成作用產生所欲的核酸(包括含有以操作地連結的序列之核酸)。
在未操作地連結至一分泌訊息或與一分泌訊息 融合之情況下，亦可將該蛋白質分泌至培養基中。舉例而言，已證實當一些異源性多肽在巴斯德畢赤酵母菌中表現時，即使未與一分泌訊息連接或融合，亦被分泌至培養基中。此外，可使用本技藝中所知的方法，從真菌細胞中純化該蛋白質(例如，當該蛋白質的分泌作用不良時，這可能是較佳方式)。
要瞭解到本發明不限於所說明之特定的方法學、操作程序、細胞株、動物物種或屬，以及試劑，因這些可以變化。也要瞭解到本文中所使用的術語僅僅為了說明特定的實施例之目的，以及不欲限制本發明的範疇，其僅由附隨的申請專利範圍所限定。
當使用於本文中，單數形式"一"、"和"，以及"該"係包括複數的所指對象，除非上下文顯然另有規定。因此，舉例而言凡提及"一細胞"時，係包括數個此等細胞，以及提及"該蛋白質"時，係包括提及一或多個蛋白質和本技藝中具有技術的那些人所知道其之均等物，及依此類推。本文中所使用的所有的技術和科學術語，係與具有本發明所屬之技藝中具有通常技術的一般技能者所通常瞭解的意義相同，除非顯然另有規定。
當使用於本文中，術語“絲狀真菌細胞”和“絲狀真菌宿主細胞”係以可互換方式使用，及係指來自以下屬(genera)的任何物種的任何細胞：麴菌屬(Aspergillus)、木黴菌(Trichoderma)、青黴菌屬(Penicillium)、黑黴菌屬(Rhizopus)、擬青黴菌(Paecilomyces)、鐮孢菌屬(Fusarium)、 紅黴菌屬(Neurospora)以及麥角菌屬(Claviceps)。於本發明中，此欲廣泛地包含任何能於培養物內生長的絲狀真菌細胞。
當使用於本文中，術語“酵母菌細胞”係指來自以下屬(genera)的任何物種的任何細胞：阿席歐酵母菌(Arxiozyma)屬；糞盤菌(Ascobotryozyma)屬；固囊酵母菌(Citeromyces)屬；得巴利酵母菌(Debaryomyces)屬；德克酵母菌(Dekkera)屬；假囊酵母菌(Eremothecium)屬；伊薩酵母菌(Issatchenkia)屬；哈薩克酵母菌(Kazachstania)屬；克魯維酵母菌(Kluyveromyces)屬；柯達菌(Kodamaea)屬；路德酵母菌(Lodderomyces)屬；管囊酵母菌(Pachysolen)屬；畢赤酵母菌(Pichia)屬；酵母菌(Saccharomyces)屬；木黴菌屬(Saturnispora)；四重孢酵母菌屬(Tetrapisispora)；有孢圓酵母菌(Torulaspora)屬；擬威爾酵母菌(Williopsis)屬；結合酵母菌(Zygosaccharomyces)屬；耶羅威亞(Yarrowia)；紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium)；念珠菌(Candida)；漢遜酵母菌(Hansenula)；擔子菌(Filobasium)；鎖擲酵母菌(Sporidiobolus)；布勒擲孢酵母菌(Bullera)；白冬孢酵母菌(Leucosporidium)以及線擔菌(Filobasidella)。於本發明中，此欲廣泛地包含任何能於培養物內生長的酵母菌細胞。
在本發明的一個較佳具體例中，酵母菌細胞是畢赤酵母菌(Pichia)屬或另一種親甲基醇菌(methylotroph)的一成員。在本發明的另一較佳具體例中，畢赤酵母菌屬之真菌細胞係下列物種之一：巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)，以及多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)(安格斯畢赤酵母菌(Pichia angusta))。在本發明的一個特佳具體例中，畢赤酵母菌屬之真菌細胞係巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)物種。
此等物種可以單倍體、二倍體，或是其他多倍體形式存在。於適當的條件之下，特定的多倍體之細胞可以以該形式增殖無限數目的世代。二倍體細胞也能形成孢子以形成單倍體細胞。相繼的配對能經由進一步二倍體菌株的配對或融合而產生四倍體菌株。本發明設想單倍體酵母菌之用途，以及例如藉由配對或融合(如球形質體融合)所產生的二倍體或其他多倍體酵母菌細胞之用途。
當使用於本文中，“單倍體酵母菌細胞”係提及一細胞，其之正常的基因體(染色體)組的各基因具有一單一副本。
當使用於本文中，“多倍體酵母菌細胞”係提及一細胞，其之正常的基因體(染色體)組具有多於一個副本。
當使用於本文中，“二倍體酵母菌細胞”係提及一細胞，其之正常的基因體組之實質上每個基因具有2個副本(對偶基因)，典型地係藉由2個單倍體細胞的融合的過程(配對)而形成。
當使用於本文中，“四倍體酵母菌細胞”係提及一細胞，其之正常的基因體組之實質上每個基因具有4個副本(對偶基因)，典型地係藉由2個二倍體細胞的融合的過程(配 對)而形成。四倍體可以帶有2、3、4，或是更多不同的表現卡匣。此等四倍體可以藉由以下方式獲得：於啤酒酵母菌內選擇性配對同型接合的異宗配合的(heterothallic)a/a和α/α二倍體，以及於畢赤酵母菌內藉由相繼的單倍體配對以獲得營養缺陷型的二倍體。舉例而言：一個[met his]單倍體可以配對以[ade his]單倍體以獲得二倍體[his]；以及一個[met arg]單倍體可以配對以[ade arg]單倍體以獲得二倍體[arg]；接而該二倍體[his]可以配對以二倍體[arg]以獲得一個四倍體原質營養生物。本技藝中具有技術的那些人會瞭解到提及二倍體細胞的優勢與用途也可以應用至四倍體細胞。
當使用於本文中，“酵母菌配對”係提及二個酵母菌細胞融合以形成一個單一酵母菌細胞之過程。所融合的細胞可為單倍體細胞或更高倍體的細胞(例如，將二個二倍體細胞配對而產生一個四倍體細胞)。
當使用於本文中，“減數***”係提及一個二倍體酵母菌細胞經歷減少性***以形成四個單倍體孢子產物之過程。各孢子接而可以生長且形成一個單倍體有生長力的成長細胞株。
當使用於本文中，“折疊”係提及多肽與蛋白之三維結構，其中介於胺基酸殘基之間的交互作用係發揮功用而穩定該結構。雖然非共價的交互作用在決定結構上是重要的，但是通常有興趣的蛋白會具有由2個半胱胺酸殘基形成的分子內的及/或分子間的共價雙硫鍵。關於天然存在的 蛋白與多肽或衍生物以及其等之變異型，適當的折疊典型地導致最理想的生物活性之配置，以及能方便地藉由活性的測定法予以監測，例如配體的結合、酵素活性，等等。
於一些實例中，舉例而言，所欲的產物係合成的來源製成時，以生物活性為基礎的測定法會是較無意義的。此等分子之適當的折疊可以基於生理性質、積極的考量、模式研究，和類似物來決定。
可以藉由引進編碼提高雙硫鍵的折疊和形成的一個或多個酶，也就是折疊酶、伴護蛋白(chaperonin)，等等的序列而進一步修飾表現宿主。此等序列可以利用本技藝中所知道的載體、標記等等，而構成地或可誘導地表現於酵母菌宿主細胞內。該序列所包括的轉錄調控元素係足以促成所欲的表現模式，及該序列較佳經由一種標定方法而穩定地併入至酵母菌的基因體之內。
舉例而言，真核的蛋白質雙硫鍵異構酶(PDI)不僅是半胱胺酸氧化和雙硫鍵同分異構作用之一有效的催化劑蛋白，而且也顯現出伴護蛋白(chaperone)的活性。PDI的共表現能幫助具有多重的雙硫鍵之活性蛋白的生產。BIP(免疫球蛋白重鏈結合蛋白)；環胞菌素(cyclophilin)；和類似物的表現也是有興趣的。於本發明的一個具體例中，所欲的蛋白質或多次級單元型複合體可由配對作用而由酵母菌菌株產生，其中單倍體的親代菌株中之各者表現不同的折疊酶，例如，一菌株可以表現BIP，以及另一個菌株可以表現PDI或是其等之組合。
術語"所欲的蛋白質"及"所欲的重組型蛋白質"係以可互換方式使用，及一般係指一種異源性蛋白質，其表現於一宿主酵母菌或絲狀真菌細胞內，該異源性蛋白質包含特定的一級、二級、三級及/或四級結構，以及特定的轉譯後修飾模式及/或其他修飾。於一態樣中，該所欲的蛋白質為同聚合型或異聚合型多次級單元型蛋白質。例示性多聚型重組型蛋白質包括，但不限多聚型激素(如胰島素家族、鬆弛素家族及其他胜肽激素)、生長因子、受體、抗體、細胞介素、受體配體、轉錄因子或酵素。
較佳地，該所欲的重組型蛋白質為一種抗體或一種抗體片段，諸如人類化或人類抗體或其結合部分。於一態樣中，該人類化抗體為源自小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊，或是牛。較佳地，該人類化抗體可源自兔。在另一個態樣中，該抗體或抗體片段包含單價、二價或多價抗體。在又另一個態樣中，該抗體或抗體片段專一性地結合IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、CBP、血管收縮素(血管收縮素I及血管收縮素II)、Nav1.7、Nav1.8、VEGF、PDGF、EPO、EGF、FSH、TSH、hCG、CGRP、NGF、TNF、HGF、BMP2、BMP7、PCSK9或是HRG。
術語“抗體”係包括具有適合且辨識一抗原決定位，具特定的形狀之任何含有多肽鏈的分子結構，其中一個或多個非共價的結合交互作用係穩定分子結構和抗原決定位之間的複合體。原始型抗體分子係免疫球蛋白，以及 來自所有的來源，例如人類、齧齒動物、兔、乳牛、綿羊、豬、狗、其他的哺乳動物、雞、其他的鳥類等等，之所有種類的免疫球蛋白、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等等均被認為是“抗體”。依據本發明，適用作為生產抗體之起始材料之較佳的來源是兔子。許多的抗體編碼序列已經被描述過；以及其他可以藉由本技藝中所熟知的方法予以培育出。其等之實例包括：嵌合抗體、人類抗體與其他非人類的哺乳動物抗體、人類化抗體、人類抗體、單鏈抗體如scFvs、駱駝抗體(camelbodies)、奈米抗體(nanobodies)、IgNAR(衍生自鯊魚的單鏈抗體)、小分子免疫藥物(small-modular immunopharmaceuticals)(SMIPs)，以及抗體片段，如Fabs、Fab'、F(ab')2和類似物。參見Streltsov V A等人，Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype,Protein Sci.2005 November；14(11)：2901-9.Epub 2005 Sep.30；Greenberg A S等人，A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks,Nature.1995 Mar.9；374(6518)：168-73；Nuttall S D等人，Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks,and use as a scaffold for the display of protein loop libraries,Mol Immunol.2001 August；38(4)：313-26；Hamers-Casterman C等人，Naturally occurring antibodies devoid of light chains,Nature.1993 Jun.3；363(6428)：446-8；Gill D S等人，Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds,Curr Opin Biotechnol.2006 December；17(6)：653-8.Epub 2006 Oct.19。前述各參考文獻在此完整地併入本案以為參考資料。
舉例而言，抗體或是抗原結合片段可以藉由基因工程予以生產。於此種技術中，如同用其他的方法，生產抗體的細胞係對所欲的抗原或免疫原致敏化。使用自抗體生產細胞單離的信使RNA作為利用PCR擴增的一模板以製造cDNA。藉由在表現載體中***經擴增的免疫球蛋白cDNA之適當的區段而產生一個載體存庫，其中各載體含有保留起始的抗原專一性之一個重鏈基因和一個輕鏈基因。藉由將重鏈基因庫與輕鏈基因庫組合而建構一個組合存庫。此導致共表現一個重鏈與輕鏈(類似一抗體分子的Fab片段或是抗原結合片段)的純株的存庫。將攜帶此等基因之載體共轉染至一種宿主細胞之內。當誘導抗體基因於經轉染的宿主內合成時，重鏈與輕鏈蛋白會自行組裝以產生活性抗體，其等能藉由用抗原或是免疫原的篩選予以偵測。
有興趣的抗體編碼序列包括由天然序列所編碼的該等，以及由於遺傳密碼的簡併而與揭示的核酸在序列上不相同的核酸，以及其等之變異型。變異型多肽能包括胺基酸(aa)取代、加入或是刪除。胺基酸取代可以是守恆性胺基酸取代或是消除非必須胺基酸之取代，如改變一醣化作用的位址，或是藉由取代或刪除非功能所必需的一個或多個半胱胺酸殘基以使不當折疊最小化。可設計變異型以便保留或是提高蛋白的一特定區域(例如，一功能領域、催 化作用的胺基酸殘基等等)之生物活性。變異型也包括本文中所揭示的多肽之片段，尤其生物活性片段及/或對應於功能領域的片段。選殖的基因之活體外的致突變的技術為已知的。本發明也包括已經使用普通的分子生物技術予以修飾的多肽，從而改善其等對蛋白水解性降解之抗性，或是使溶解度性質最佳化或是使其等成為更合適作為一治療劑。
可以藉由將獲得自一物種的抗體生產細胞之變異輕鏈區與重鏈區(VL和VH)，以及帶有來自另一者的守恆輕鏈區與重鏈區組合之重組方法，來製造嵌合抗體。嵌合抗體典型係使用齧齒動物或兔的變異區以及人類的守恆區，俾以生產主要是人類領域之抗體。此等嵌合抗體的生產係本技藝中所熟知的，以及可以藉由標準的方法予以達成(如同例如於美國專利案號5,624,659中說明的，其係以其之全體併入本文中以作為參考資料)。進一步預期到的是本發明的嵌合抗體之人類守恆區可以選自於IgG1、IgG2、IgG3或是IgG4守恆區。
人類化抗體係予以工程設計以包含甚至更多的類人類的免疫球蛋白領域，以及僅併入動物衍生的抗體之互補決定區。此係透過小心地檢查單株抗體的變異區之高度變異環的序列，以及使其等適合於人類抗體鏈的結構而完成。縱然表面錯綜複雜，在實施上方法是直接明確的。參見，例如美國專利案號6,187,287，其係完全併入本文中以作為參考資料。人類化抗體之方法先前曾述於所頒證之 美國專利第7935340號，其揭露內容在此完整地併入本案以作為參考資料。在一些情況下，需判定活性之維持是否需要額外的兔架構殘基。在一些情況下，人類化抗體仍需要保留一些關鍵性兔架構殘基，以將親和性或活性之損失降至最低。在此等情況下，需要將人類胚系序列的一或多個架構胺基酸改回原有的兔胺基酸，方能具有所欲的活性。該等改變係由實驗方式測定，而識別出哪些兔殘基係保留親和性與活性所需。
除了整個免疫球蛋白(或其等之重組對應體)之外，還可以合成包含抗原決定位結合位址的免疫球蛋白片段(例如，Fab’、F(ab’)2，或是其他的片段)。“片段”，或是最小的免疫球蛋白可以使用重組免疫球蛋白的技術予以設計。例如，供用於本發明中的“Fv”免疫球蛋白可以藉由合成一個融合的變異輕鏈區與一個變異重鏈區而生產。抗體的組合也是感興趣的，例如，二聚抗體(diabodies)，其等包含二個不同的Fv的專一性。於本發明的另一個具體例中，免疫球蛋白片段包含SMIPs(小分子免疫藥物)、駱駝抗體(camelbodies)、奈米抗體(nanobodies)，以及IgNAR。
免疫球蛋白以及其等之片段可以是，例如經轉譯後修飾的，以提供可以使用於本發明的方法和組成物內之效應部分，如化學連接子，可偵測的部分，如螢光染料、酶、毒素、受質、生物發光材料、放射材料、化學發光部分和類似物，或是專一的結合部分，如鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)，或是生物素和類似 物。額外的效應分子之實例係於以下提供。
當使用於本文中，“半抗體(Half antibody)”、“半抗體物種(half-antibody species)”或“H1L1”係提及一種蛋白複合體，其包括單一抗體重鏈與單一抗體輕鏈，但缺少與第二抗體重鏈與抗體輕鏈的共價鍵結。在一些條件下，二個半抗體可能保持非共價方式的連結(其可能產生與全抗體類似的行為，如藉由粒徑篩析層析術所測定的表觀分子量)。同樣地，H2L1係指包括一種蛋白複合體，其二個抗體重鏈與單一抗體輕鏈，但缺少與第二抗體輕鏈的共價鍵結；此等複合體亦可能以非共價方式與另一抗體輕鏈連結(及同樣地產生與全抗體類似的行為)。如同全抗體，半抗體物種與H2L1物種可在還原條件下解離成為個別的重鏈與輕鏈。可在非還原SDS-PAGE凝膠上檢測半抗體物種與H2L1物種，因該物種係在比全抗體更低的表觀分子量遷移，例如H1L1係在約全抗體表觀分子量的一半(如約75kDa)處遷移。
當使用於本文中，“長時間穩定表現或表現一種所欲的分泌型異源性多肽之多倍體酵母菌”係提及一種酵母菌的培養物，其以閾的表現位準分泌該多肽歷時至少數天至1週，更佳地至少1個月，還更佳地至少1-6個月，以及甚至還更佳地歷時多於一年，所分泌的多肽典型至少50至500毫克/公升(在培養約90小時後)及較佳實質上更高。
當使用於本文中，“分泌所欲量的重組型多肽之多倍體酵母菌培養物”係提及培養物，其穩定或長時間分泌 至少至少(at least at least)50-500mg/公升，以及最佳地500-1000mg/升或更多。
設若依照遺傳密碼，轉譯多核苷酸序列會產出多肽序列(也就是，該多核苷酸序列"編碼"該多肽序列)，那麼一多核苷酸序列"對應"於一多肽序列，設若二序列編碼相同的多肽序列，那麼一多核苷酸序列"對應"於另一個多核苷酸序列。
一DNA建構物之"異源性"區域或領域是於一個更大的DNA分子內的DNA之可辨識的區段，該區段未發現與自然存在之該更大的分子有所關連。因此，當該異源性區域編碼一哺乳動物的基因時，該基因兩側的DNA在來源有機體的基因體中，通常並非側臨該哺乳類動物基因體DNA。另一個異源性區域的實例是一建構物，該編碼序列本身在自然界中不存在(例如，一cDNA，其基因體編碼序列含有***子，或是具有不同於天然的基因之密碼子的合成序列)。對偶基因的變異體或是天然發生的突變事件並不產生如本文中所界定的DNA之異源性區域。
一個"編碼序列"是一種在架構上(in-frame)的密碼子序列，其(考慮到遺傳密碼)係對應於或是編碼一蛋白或胜肽序列。設若該等序列或是其等之互補序列編碼相同的胺基酸序列，那麼2個編碼序列係互相對應的。一個編碼序列連同適當的調控序列可以予以轉錄和轉譯成一多肽。一聚腺苷酸化的訊息和轉錄終止序列通常會座落於該編碼序列的3'。一個"啟動子序列"是一DNA調控區域，其能夠結合 細胞內的RNA聚合酶以及起始下游(3'方向)的編碼序列之轉錄。啟動子序列典型地含有供影響編碼序列的轉錄之調控分子(例如，轉錄因子)結合的額外位址。當RNA聚合酶結合細胞內的啟動子序列且轉錄該編碼序列成為mRNA時，一編碼序列係在該啟動子序列的"的控制之下"或是"操作地連結"至該啟動子，該mRNA接而依序轉譯成該編碼序列所編碼的蛋白。
載體係用來引導一外來物質，如DNA、RNA或蛋白質，進入一有機體或宿主細胞內。典型的載體包括重組型病毒(用於多核苷酸)和脂質體(用於多肽)。一"DNA載體"是一複製子，如質體、噬菌體或是黏接質體，另一個多核苷酸區段可以附著至其上，而導致附著的區段之複製作用。"表現載體"是含有調節序列之一DNA載體，該調節序列引導一適當的宿主細胞之多肽合成作用。此通常意指一啟動子與RNA聚合酶結合且起始mRNA的轉錄，以及核酸體結合位址和起始訊息以指示mRNA轉譯成多肽。在恰當的的位址和於正確的閱讀架構上併入一多核苷酸序列至一表現載體內，接著由載體轉形一適當的宿主細胞，使得能夠生產由該多核苷酸序列所編碼的一多肽。
多核苷酸序列的"擴增"是一特定的核酸序列之多副本的活體外生產。經擴增的序列通常有DNA的形式。進行此擴增的各種技術係說明於下列回顧文章中：Van Brunt 1990,Bio/Technol.,8(4)：291-294；及Gill and Ghaemi,Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2008 Mar；27(3)：224-43。聚合酶連鎖反應或是PCR是核酸擴增的原型，以及本文中的PCR之使用應視為其他合適的擴增技術之例示。
現在相當地瞭解多數脊椎動物(包括哺乳類動物)體內的抗體之一般結構(Edelman,G.M.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,190：5(1971))。傳統的抗體係由分子量大概23,000道爾頓之2個相同的輕多肽鏈(“輕鏈”)，以及分子量53,000-70,000的2個相同的重鏈(“重鏈”)所構成。4條鏈係藉由雙硫鍵予以結合成“Y”構型，其中重鏈係從“Y”構型的口部開始托住輕鏈。“Y”構型的“分支”部分係稱為Fab區域；“Y”構型的柄部分係稱為FC區域。胺基酸序列定位係自“Y”構型頂部的N端末端進行至各鏈底部的C端末端。N端末端擁有變異區，變異區對於引出(elicited)其之抗原具有專一性，及在長度上大概是100個胺基酸，於輕與重鏈之間以及抗體至抗體之間有輕微的變異。
各鏈內的變異區係連結至一守恆區，其係延伸該鏈剩下的長度，以及在一特定種類的抗體中其不隨著抗體的專一性(也就是，引出其之抗原)而變化。有五種已知的主要種類的守恆區，其等決定免疫球蛋白分子的種類(IgG、IgM、IgA、IgD，以及IgE，對應於γ、μ、α、δ，和ε重鏈守恆區)。守恆區或種類會決定抗體隨後的效應功能，包括補體的活化(Kabat,E.A.,Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry,2nd Ed.,p.413-436,Holt,Rinehart,Winston(1976))，以及其他的細胞反應(Andrews,D.W.，等 人，Clinical Immunobiology,pp 1-18,W.B.Sanders(1980)；Kohl,S.，等人，Immunology,48：187(1983))；同時變異區決定其所反應的抗原。輕鏈分類為κ(kappa)或λ(lambda)。各重鏈種類能與κ或是λ輕鏈配對。當由融合瘤或是由B細胞產生免疫球蛋白時，輕鏈與重鏈係互相共價鍵結，以及2個重鏈的“尾”部係藉由共價的雙硫連結而互相鍵結。
措辭“變異區”或“VR”係提及一抗體內各對的輕鏈與重鏈內之領域，其等直接涉及抗體與抗原的結合。各重鏈在一端有一變異領域(VH)接著一些恆定領域。各輕鏈在一端有一變異領域(VL)以及在其之另一端有一恆定領域；輕鏈的恆定領域係與重鏈的第一恆定領域一起排列，以及輕鏈變異領域係與重鏈變異領域一起排列。
措辭“互補決定區”、“高度變異區”，或是“CDR”係提及一抗體的輕鏈或重鏈之變異區內存在的一或多個高度變異或互補決定區(CDRs)(參見Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,(1987))。此等措辭包括像是由Kabat等人所定義的高度變異區(“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat E.，等人，US Dept.of Health and Human Services,1983)或是抗體的3維結構中的高度變異環(Chothia和Lesk,J Mol.Biol.196 901-917(1987))。各鏈內的CDRs係藉由架構區而保持很靠近以及，與另一個鏈的CDRs一起促成抗原結合位址的形成。在CDRs之內，有已經被說明為選擇性決定區(SDRs)之選出的 胺基酸，其等代表於抗體-抗原交互作用中CDR所使用的關鍵接觸殘基(Kashmiri,S.,Methods,36：25-34(2005))。
措辭“架構區”或“FR”係提及在一抗體的輕鏈與重鏈之變異區內的一或多個架構區(參見Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,(1987))。此等措辭包括***於一抗體的輕與重鏈之變異區內的CDRs之間的胺基酸序列區域。
措辭“穩定的副本數目”係指一宿主細胞在一段較長的時間(諸如至少一天、至少一個星期或至少一個月或更長)或在較多的增殖世代數目(如至少30、40、50、75、100、200、500或1000世代或更多)實質上維持一基因(諸如一抗體鏈基因)的副本數目。舉例來說，在一特定的時間點或世代數目，培養物中的至少50%，及較佳地至少70%、75%、85%、90%、95%或更多的細胞可維持與起始細胞相同的基因副本數目。在一較佳具體例中，該宿主細胞含有穩定的副本數目的基因，該基因編碼所欲的蛋白質或編碼所欲的多次級單元型複合體(如抗體)的各次級單元。
措辭“穩定表現”係指一宿主細胞在一段較長的時間(諸如至少一天、至少一個星期或至少一個月或更長)或在較多的增殖世代數目(如至少30、40、50、75、100、200、500或1000世代或更多)維持一基因或蛋白質(諸如一抗體)相近的表現位準。舉例來說，在一特定的時間點或世代數目，該基因或蛋白質的生產速率或產量可為初始生產速率 之至少50%，及較佳至少70%、75%、85%、90%、95%或更高。在一較佳具體例中，該宿主細胞係穩定表現所欲的蛋白質或多次級單元型複合體(如抗體)。
重組型蛋白質之回收及純化作用
單株抗體已成為重要的治療劑，但是其等之純化方法必須能可靠及可預見地生產合適用於人類的產物的。像是宿主細胞蛋白質、DNA、外來及內源的病毒、內毒素、聚集體及其他物種，例如醣化變異體，之雜質必須控制，同時維持可接受產量的所欲抗體產物。另外，必須移除純化方法的整個期間引入的雜質(諸如瀝濾的蛋白A、源自樹脂和過濾器的可萃取物、方法緩衝液，以及像是清潔劑的製劑)，在該抗體可使用作為一治療劑之前也必須移除雜質。
初步回收方法
從細胞培養回收抗體之第一步驟是收穫。移除細胞及細胞碎屑以產出合適用於層析術之澄清、經過濾的流體，亦即收穫的細胞培養液(HCCF)。例示性的初期回收方法包括離心、深度過濾(depth filtration)及無菌過濾、絮凝作用、沈澱作用，及/或其他可適用的方法，視規模及設施性能而定。
離心
於一個具體例中，藉由離心作用而從肉湯移除細胞及絮凝的碎屑。試驗性及商業規模的製造可以供使用離心作用。較佳地，大規模的製造使用離心作用以自細胞培 養提供具有>3%之固體百分比之收穫的細胞培養液(亦即，增加位準的亞微粒(sub-micron)碎屑)。
標準的非密閉圓盤堆疊式(disc-stack)離心機以及完全密閉式離心機都能夠移除細胞及大的細胞碎屑，但完全密閉式離心機能藉由防止溢流及使切變減到最少而顯著減少此單元操作的整個期間已發生之細胞溶解作用，例如，達至少50%。
離心方法之澄清作用效率受收穫參數的影響，例如離心機進料速率、G力、缽(bowl)之幾何形狀、操作的壓力、排放頻率(discharge frequency)以及用來轉移細胞培養液至離心機的輔助設備。在培養方法的整個期間及收穫時，細胞培養方法的特徵，例如峰值細胞密度、總細胞密度及培養物生存力，也會影響分離作用的性能。離心方法可以使用離心機內之進料速率(Q)及等價的沈降面積(equivalent settling area)(Σ)之比例因數來選擇進料速率及缽旋轉速率予以最佳化。經最佳化的方法能使細胞溶解作用及碎屑的產生減到最少，同時使亞微粒顆粒的沈積作用(sedimentation)及產物產量達到最大。
過濾作用
細胞收穫也能使用切向流微過濾。特別地，細胞培養液切線流向微孔膜，以及驅動濾液流的壓力會使可溶解的產物與較大、不可溶的細胞分離。慣性升力及紊流穿過濾膜表面產生的切變誘導擴散作用限制了濾膜阻塞。
可以經由一連串的濃縮及透析過濾(diafiltration) 步驟來達成高生產的收穫。於前者，細胞培養液的體積減少，其導致固體團塊濃縮。透析過濾步驟接而清洗來自濃縮的細胞培養液混合物之產物。
舉例來說，TFF膜可以使用0.22μm的細孔大小，因其會生產目標品質之收穫的細胞培養液(合適用於層析術)，而不需要進一步的澄清作用。任擇地，TFF障壁之細孔大小越張開用來處理阻塞可以更好；然而，細孔大小越張開可能越需要額外的在TFF系統下游的澄清步驟(例如，正常流深度過濾)。較佳地，具有<3%之固體百分比之細胞培養物可使用TFF。
也能使用深度過濾器於細胞培養肉湯的澄清作用，以維持膜過濾器的能量或是來防護層析管柱或病毒過濾器(virus filter)。深度過濾器可以由以下所組成，例如纖維素、多孔過濾器輔助器如矽藻土，離子帶電荷的樹脂黏結劑以及黏結劑樹脂(以少的重量百分比存在，將相異的結構材料以共價方式結合在一起，提供合成的介質濕強度以及賦予介質表面正電荷)。深度過濾器依靠粒徑篩析及吸附性結合來達到分離作用。例示性的深度過濾器大概為2-4mm厚。
在收穫應用方面，深度過濾器可以直接地應用於全細胞肉湯或是與初級分離器連接，例如TFF或離心。舉例來說，當使用於全細胞肉湯深度過濾器收穫時，過濾系列含有三階段的過濾器：(1)初級階段具有高達10μm之粗糙或開放式(coarse or open)深度過濾器細孔大小，以移除全細 胞及大的顆粒；(2)二級階段具有更緊密的深度過濾器，以清除膠體及亞微粒顆粒；以及(3)第三階段具有0.2μm細孔大小的膜過濾器。雖然過濾方法大體而言成直線地按比例排列(scales linearly)，但各階段可以使用1.5X至>3X的安全係數以確保適當的過濾器能量。
於一個具體例中，舉例來說，因為可以藉由離心而移除之粒度有實施的下限，所以在離心之後使用深度過濾器以使收穫的肉湯進一步變澄清。舉例來說，深度過濾器可以包含有區別的二層(與下游比較，上游區為較粗糙的等級)，以及具有0.1-4μm的細孔大小範圍。粗糙等級的過濾器介質會捕捉較大的顆粒，以及更緊密的介質會捕捉較小的顆粒，以減少早期的阻塞及增加過濾器能量。
過濾器類型、細孔大小、表面積以及通量之最佳化可以以實驗室規模進行，然後根據例如，濃縮濁度(centrate turbidity)及粒度分佈而按比例增大至試驗性規模。深度過濾器的粒度分級(sizing)實驗大體而言於過濾階段的任一個階段或過濾階段的組合、使用壓力終點、以等通量(constant flux)予以執行。較佳地，在收穫方法終止時使用0.22μm等級的過濾器來過濾的懸浮液，以控制生物負荷量(bioburden)。經0.22μm-過濾的細胞培養懸浮液可以儲存於2-8℃幾天或更長，而不會改變抗體產物有關變異體的剖面圖。
在無意受限於理論之情況下，據信深度過濾器的吸附性機轉使其等可以廣泛的使用作為純化工具，用以移 除廣大範圍的方法污染物及雜質。特別地，介於深度過濾器的正電荷及DNA分子之間的靜電交互作用以及深度過濾器介質和DNA分子之間的疏水性作用，於DNA之吸附性縮減可能扮演重要的角色。舉例來說，已經使用荷電的深度過濾器來移除DNA，以及Zeta Plus(Cuno)90SP之電荷位準已經與其移除DNA的能力有關聯。此外，舉例來說，已經使用正電荷的深度過濾器來移除比過濾器之平均細孔大小小很多倍的大腸桿菌衍生的以及其他內源的內毒素和病毒，以及發現Zeta Plus®(Cuno)VR系列深度過濾器可經由吸附作用而結合被膜反轉錄病毒及無被膜的小病毒。深度過濾也能使用於由免疫球蛋白溶液移除刺突的普里昂蛋白(spiked prions)。再者，在蛋白A親和性層析管柱之前經由深度過濾移除宿主細胞蛋白質，已經顯示出會顯著減少蛋白A集池之pH調整期間之沈澱作用。
絮凝作用及沈澱作用
於一個具體例中，使用沈澱作用/絮凝作用為基的預處理步驟來減少細胞培養液內的細胞碎屑與膠體的量，此能勝過現存的過濾系列設備性能。絮凝作用涉及來自，例如陽離子、中性離子和陰離子聚合物對細胞及細胞碎屑之聚合物吸附作用，例如靜電吸引作用，以清除細胞的污染物，導致改良的澄清效率及高的回收產量。絮凝劑，例如添加非常低位準的氯化鈣與磷酸鉀，諸如20-60mM氯化鈣加上等莫耳量的磷酸鹽來形成磷酸鈣，據信會促成磷酸鈣與細胞、細胞碎屑及雜質之共沈澱。
於一個具體例中，本揭示之純化方法包括以達3mM的最終濃度之乙二胺四乙酸(EDTA)以及用一種絮凝劑，來處理全細胞肉湯，隨後藉由離心來移除細胞及絮凝的碎屑，接著藉由通過深度過濾器和0.2μm過濾器之澄清作用。
層析術
在生物製藥產業中，層析術因為其高度分離度(resolution)而為一種關鍵且廣泛使用的分離及純化技術。層析術利用生物分子之間的物理和化學差異用於分離作用。舉例來說，可以在收穫之後接著蛋白A層析術來產出相對純的產物，其僅需要移除小比例的方法及產物相關的雜質。然後可以使用一個或二個額外的層析步驟作為精純(polishing)步驟，例如合併離子交換層析術、疏水性作用層析術、混合模式層析術及/或羥磷灰石層析術。此等步驟能清除額外的病毒、宿主細胞蛋白質及DNA，以及移除聚集體、不需要的產物變異體物種及其他少數的污染物。最後，可以濃縮純化的產物以及透析過濾成最終的調配物緩衝液(formulation buffer)。
抗體純化作用涉及從血清(多株抗體)、腹水或細胞株的細胞培養懸浮液(單株抗體)來選擇性濃化抗體(selective enrichment)或專一性單離抗體。純化方法範圍涉及非常粗製至高度專一性的方法，以及可以分類如下：物理化學的分餾法-微差沈澱法(differential precipitation)、粒徑篩析或固相結合的免疫球蛋白，以典型 的樣本內之抗體尺寸、電荷或其他共有的化學特徵為基礎。此法單離出含括免疫球蛋白之樣本蛋白質的子集。
親和性分餾法-藉由固定化的生物配體(例如，蛋白質)來結合特定種類的抗體(例如，IgG)，其等對免疫球蛋白具有專一的親和性(其純化目標種類的所有抗體而不考慮抗原專一性)，或者僅僅親和性純化樣本內通過其等之專一性的抗原結合領域，而與特定的抗原分子結合的該等抗體(其純化結合抗原的所有抗體而不考慮抗體種類或同型(isotype))。
血清免疫球蛋白(諸如IgG和IgM)之主要種類共有相同的普遍結構，包括全部的胺基酸組成及溶解度的特徵。此等普遍的性質與血清內多數其他大量的蛋白質，例如白蛋白及運鐵蛋白，充分不同，是以可以此等識別性(differentiating)物理化學的性質為基礎來篩選及濃化免疫球蛋白。
物理化學的分餾抗體純化
硫酸銨沈澱作用
硫酸銨沈澱作用時常使用來從血清、腹水或細胞培養懸浮液(單株抗體)濃化及濃縮抗體。當樣本內的離液鹽類(lyotropic salt)的濃度增加時，蛋白質和其他的巨分子逐漸變成較不可溶解的，直到其等沈澱為止，亦即離液作用稱為"鹽析"。抗體的沈澱作用在比多數其他的蛋白質及血清之組份更低的硫酸銨的濃度下發生。
免疫球蛋白在大約40至大約50%硫酸銨飽和度 (100%飽和度等於4.32M)沈澱，而其他的蛋白質繼續存在於溶液內。參見，例如Harlow,E.and Lane,D.(1988).Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.Gagnon,P.(1996)。舉例來說，將等體積的飽和的硫酸銨溶液緩慢地添加至中和抗體的樣本，然後於室溫或4℃下孵育數小時。在離心及移除懸浮液之後，使抗體片狀沈澱物(antibody-pellet)溶解於緩衝液內，例如磷酸鹽緩衝液(PBS)。
沈澱的選擇性、產量、純度及再現性取決於數個因素，其包括但不限於時間、溫度、pH及鹽的添加速率。參見，例如Gagnon,P.S.(1996).Purification Tools for Monoclonal Antibodies.Validated Biosystems.Tuscon,AZ.硫酸銨沈澱作用對於一些抗體應用可以提供充分的純化，但其通常在管柱層析術或其他的純化方法之前執行，作為初步的步驟。使用部分純化的抗體樣本可以改善性能，以及延長親和性管柱的壽命。
除了硫酸銨外，合適用於抗體的純化情況之抗體沈澱試劑包括，舉例來說辛酸(octonoic acid)、聚乙二醇以及依沙吖啶(ethacridine)。
許多的化學為基、固相的層析方法已經適用以及予以最佳化以於特定的情況中達到抗體的純化。
離子交換層析術(IEC)
離子交換層析術(IEC)使用於假定的緩衝系統(pH)內，根據其等的淨電荷為帶正電或帶負電的樹脂來結 合蛋白質。IEC的條件可以高度專一地決定結合及釋放的目標抗體，此在涉及生產單株抗體之商業運作方面可能為特別重要的。相反地，可以找到結合抗體之外的幾乎所有的其他樣本組份的條件。一旦經最佳化，IEC是一種具成本效益、溫和又可靠的抗體純化方法。
陰離子交換層析術使用固定化至樹脂之帶正電的基團。舉例來說，陰離子交換中可以使用弱鹼性基團，例如二乙基胺基乙基(DEAE)或二甲基胺基乙基(DMAE)，或是較強的鹼性基團，例如四級胺乙基(quaternary amino ethyl)(Q)或乙基三甲銨(TMAE)或四級胺基乙基(quaternary aminoethyl)(QAE))。例示性的陰離子交換介質包括，但不限於GE Healthcare Q-Sepharose FF、Q-Sepharose BB、Q-Sepharose XL、Q-Sepharose HP、Mini Q、Mono Q、Mono P、DEAE Sepharose FF、Source 15Q、Source 30Q、Capto Q、Streamline DEAE、Streamline QXL；Applied Biosystems Poros HQ 10 and 20um self pack、Poros HQ 20及50um、Poros PI 20及50um、Poros D 50um；Tosohaas Toyopearl DEAE 650S M and C、Super Q 650、QAE 550C；Pall Corporation DEAE Hyper D、Q Ceramic Hyper D、Mustang Q膜吸收器；Merck KG2A Fractogel DMAE、FractoPrep DEAE、Fractoprep TMAE、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD TMAE；Sartorious Sartobind Q膜吸收器。
陰離子交換特別地有用於移除方法相關的雜質(例如，宿主細胞蛋白質，內源的反轉錄病毒及外來的病毒， 例如小病毒或假性狂犬病病毒、DNA、內毒素及瀝濾的蛋白A)以及產物相關的雜質(例如，二聚物/聚集體)。取決於抗體及要移除的雜質之pI，可以使用流過式模式(flow-through mode)或是使用結合及洗提模式(bind and elute mode)。舉例來說，流過式模式較佳使用來移除源自具有7.5以上的pI之抗體的雜質，例如多數的人類化或人類IgG1及IgG2抗體，因為雜質會結合至樹脂，以及有興趣的產物會流過。管柱的裝載能量(column loading capacity)，亦即，抗體的質量對樹脂的質量，可為相當高的，因為只有雜質會佔據樹脂上的結合位址。設計有二個或三個單元操作的單株抗體純化方法可以使用流過式模式之陰離子交換層析法，作為移除殘餘雜質的精純步驟，例如宿主細胞蛋白質、DNA、瀝濾的蛋白A以及各種各樣的病毒。舉例來說，操作的pH為大約8至大約8.2，具有高達10mS/cm之傳導度(conductivity)於產物裝載物及平衡以及清洗緩衝液內。
任擇地，較佳使用結合及洗提模式自具有pI酸性至中性的範圍之抗體，例如多數人類化或人類的IgG4，移除方法相關的(process-related)雜質及方法相關的雜質。關於結合-併行-洗提(bind-and-elute)模式，首先將抗體產物集池裝載至陰離子交換管柱上，以及接而以步進(step)或線性梯度之更高的鹽濃度來洗提有興趣的產物，讓大多數的雜質與管柱結合。在潔淨或再生步驟的整個期間從管柱洗提雜質。大體而言，操作的pH應該高於或接近產物的pI，俾 以獲得抗體分子的表面淨負電荷或更高的負電荷數，以及因此在層析步驟的整個期間達到更高的結合能力。同樣地，裝載物的離子強度較佳地於低的範圍內以及pH較佳小於pH 9。
此外，可使用弱分配層析術(WPC)來使包含蛋白A及陰離子交換之二種層析術回收方法能夠進行。大體而言，以等度模式進行該方法(如同流過式層析術)，但是挑選能提高產物及雜質兩者的結合之傳導度及pH(與形成對比流過式模式)，達到介於0.1-20之間的抗體分配係數(Kp)，以及較佳為介於1和3和之間。抗體及雜質兩者都結合至陰離子交換樹脂，但是雜質比流過式模式結合的更緊密，此會導致雜質的移除增加。透過含括在裝載終止時簡短的清洗可以使弱分配模式內的產物產量達到最大，例如，臨床的生產為平均90%。
陽離子交換層析術使用用帶負電的官能基修飾的樹脂。舉例來說，陽離子交換可以使用強酸性的配體(例如，磺酸丙基、磺酸乙基及磺酸丁基基團)或弱酸性的配體(例如，羧基基團)。例示性的陽離子交換樹脂包括，但不限於GE Healthcare SP-Sepharose FF、SP-Sepharose BB、SP-Sepharose XL、SP-Sepharose HP、Mini S、Mono S、CM Sepharose FF、Source 15S、Source 30S、Capto S、MacroCap SP、Streamline SP-XL、Streamline CST-1；Tosohaas Resins Toyopearl Mega Cap TI SP-550 EC、Toyopearl Giga Cap S-650M、Toyopearl 650S、M及C、Toyopeal SP650 S、M及 C、Toyopeal SP550C；JT Baker Resins Carboxy-Sulphon-5，15及40um，Sulfonic-5、15及40um；YMC BioPro S；Applied Biosystems Poros HS 20及50um，Poros S 10及20um；Pall Corp SCeramic Hyper D，CM Ceramic Hyper D；Merck KGgA Resins Fractogel EMD SO3，Fractogel EMD COO-，Fractogel EMD SE Hicap，Fracto Prep SO3；Eshmuno S；Biorad Resin Unosphere S；Sartorius Membrane Sartobind S膜吸收器。
陽離子交換層析術特別地合適用於許多範圍從中性至鹼性的pI值之單株抗體的純化方法，例如，人類的或人類化的IgG1及IgG2亞型(subclasses)。大體而言，在裝載步驟的期間抗體會結合至樹脂，以及通過增加洗提緩衝液之傳導度或增加pH來洗提抗體。裝載物及清洗的餾份內多數帶負電的方法相關的雜質，例如DNA、一些宿主細胞蛋白質、瀝濾的蛋白A以及內毒素被移除。陽離子交換層析術也會由目標抗體產物減少抗體的變異體，例如脫醯胺的產物、氧化的物種及N-端截斷的形式，以及高分子量的物種。
可達到的最大結合能力可以像>100g/L的樹脂體積一樣高，其取決於裝載條件、樹脂配體以及密度，但是雜質的移除高度取決於裝載密度。說明陰離子交換層析術有關開發洗提程式之相同的原則也適用於陽離子交換層析術。
開發洗提條件係與雜質的移除以及產物集池的 特徵相連結，其在隨後的單元操作中可以容易地加工。大體而言，可以實施線性的鹽或pH梯度洗提程式來決定最佳的洗提條件。舉例來說，pH 6之線性梯度的洗提條件範圍可以從5mM至250mM NaCl，以及線性pH梯度洗提範圍可以從pH 6進行至pH 8。
固定化的金屬螯合物層析術(IMAC)
固定化的金屬螯合物層析術(IMAC)使用螯合物固定的二價金屬離子(例如，鎳Ni2+)來結合含有三個或更多個連續的組胺酸殘基簇(clusters)之蛋白質或胜肽。此策略對於純化已經工程化而含有末端的6xHis融合標誌之重組型蛋白質為特別有效的。哺乳動物的IgGs為擁有能夠藉由固定的鎳而結合的組胺酸簇，少數血清(或單株細胞培養懸浮液)內大量的蛋白質之一者。類似於IEC，用於特定的樣本之結合及洗提的IMAC條件可以予以最佳化以提供溫和又可靠的抗體的純化。舉例來說，在標記法程序以後，可以使用IMAC來分離AP-或HRP-標記的(酵素接合的)抗體與過量的、無接合的酵素。
疏水性作用層析術(HIC)
疏水性作用層析術(HIC)以蛋白質之疏水性為基礎來分離蛋白質，以及與其他以電荷、尺寸或親和性為基礎之分離蛋白質的技術互補。舉例來說，裝載於HIC管柱上的、配於高鹽的緩衝液內的一樣本，其減少溶液內之蛋白質分子的溶劑合作用，藉此暴露樣本蛋白質分子內之疏水性區域，其因此結合至HIC樹脂。大體而言，分子疏水性越 大，促進結合需要的鹽類越少。接而可以使用遞減的鹽濃度梯度來從HIC管柱洗提樣本。特別地，當離子強度減少，暴露的分子親水性區域增加以及以遞增的疏水性順序而從管柱的洗提出分子。
流過式模式之HIC能以相對高的產量有效的移除大百分比的聚集體。結合-併行-洗提模式之HIC可以有效的分離方法相關的雜質和產物相關的雜質以及抗體產物。特別地，大多數的宿主細胞蛋白質、DNA和聚集體可以通過選擇洗提緩衝液內合適的鹽濃度或是使用梯度洗提方法，而由抗體產物移除。
例示性的HIC樹脂包括，但不限於GE Healthcare HIC樹脂(Butyl Sepharose 4 FF、Butyl-S Sepharose FF、Octyl Sepharose 4 FF、Phenyl Sepharose BB、Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepharose 6 FF High Sub、Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub、Source 15ETH、Source 15ISO、Source 15PHE、Capto Phenyl、Capto Butyl、Sreamline Phenyl)；Tosohaas HIC樹脂(TSK Ether 5PW(20um及30um)、TSK Phenyl 5PW(20um及30um)、Phenyl 650 S、M及C、Butyl 650 S、M及C、Hexyl-650M及C、Ether-650S及M、Butyl-600M、Super Butyl-550C、Phenyl-600M；PPG-600M)；Waters HIC樹脂(具120、200、300A的細孔大小之YMC-Pack Octyl Columns-3、5、10P、15及25um，具120、200、300A的細孔大小之YMC-Pack Phenyl Columns-3、5、10P、15及25um，具120、200、300A的細孔大小之YMC-Pack Butyl Columns-3、5、 10P、15及25um；CHISSO Corporation HIC樹脂(Cellufine Butyl、Cellufine Octyl、Cellufine Phenyl)；JT Baker HIC Resin(WP HI-Propyl(C3))；Biorad HIC樹脂(Macroprep t-Butyl、Macroprep methyl)；以及Applied Biosystems HIC樹脂(High Density Phenyl-HP2 20um)。舉例來說，PPG 600-M的特徵在於大概8x105道耳頓的分子量排除極限、聚丙二醇PPG配體、45-90μm粒度，假設的關係***>PPG>苯基之疏水性，以及38mg/mL-凝膠之動態結合能力(MAb：Anti LH)。
於一個具體例中，本揭示之純化方法在親和性層析術(例如，蛋白A)及混合模式層析術(例如，羥磷灰石)之後，使用疏水性作用層析術(HIC)作為精純純化步驟。參見，圖1。較佳地，聚丙二醇(PPG-600M)或苯基-600M為HIC樹脂。於一個具體例中，配於20mM磷酸鈉內，大約0.7M至0M之線性梯度(0-100%)的硫酸鈉，pH 7的緩衝液來執行洗提作用。選擇性地，監測流出物的OD280，以及收集一系列的餾份，例如大約三分之一管柱體積，用於進一步的純化分析。較佳地，收集的餾份包括由前部側面處的0.1OD至後部側面處的0.1OD。
疏水性電荷誘導層析術(Hydrophobic charge induction chromatography)(HCIC)
疏水性電荷誘導層析術(HCIC)係以配體之pH值依賴性作用為基礎，其處於低pH值下會游離。此技術使用高密度的雜環配體，以致於吸附作用會經由疏水性作用而 發生，而不需要高濃度的離液鹽類。降低pH會促進HCIC之去吸附作用而於可游離的(ionizable)配體和結合的蛋白質之間產生電荷互斥。例示性的商業HCIC樹脂為MEP-Hypercel(Pall Corporation)，其是帶有4-巰基乙基吡啶(4-mercaptoethyl pyridine)作為官能基之纖維素為基的介質。配體為帶有N-雜環系環之疏水性的部分，其於低pH值下會獲取正電荷。
喜硫的吸附作用(Thiophilic Adsorption)
喜硫的吸附作用為高度篩選性類型的蛋白質配體的交互作用，其組合疏水性作用層析術(HIC)和硫酸銨沈澱作用(亦即，離液作用)之性質，此涉及蛋白質與極接近硫醚的碸基團之結合。與嚴謹的HIC相比，喜硫的吸附作用取決於高濃度的離液鹽類(例如硫酸鉀，而不是氯化鈉)。舉例來說，已經用硫酸鉀平衡之典型的抗體樣本之結合作用是相當專一的。在未結合的組份清洗掉之後，很容易用溫和的洗提條件(例如，50mM磷酸鈉緩衝液，pH 7至8)回收抗體。喜硫的吸附劑(也稱為T-Gel)是經修飾含有碸-硫醚配體之6%的珠狀瓊脂糖，其對於源自各種各樣的動物物種之免疫球蛋白具有高的結合能力和廣泛的專一性。
親和性抗體的純化作用
親和性層析法(也稱為親和性純化作用)利用介於分子之間的專一性結合交互作用。大體而言，使特定的配體以化學方式固定或是“偶合”至固體撐體，以致於當一種複合體混合物通過管柱時，對配體具有專一性的結合親 和性之該等分子變成結合的狀態。在清洗掉其他的樣本組份之後，由撐體剝離(stripped)結合的分子，導致從原始的樣本的純化該分子。
撐體
親和性的純化作用涉及於溶液內的分子(移動相)之分離作用，其係以與固定於靜止的材料(固相)之配體之結合交互作用的差異為基礎。一種親和性的純化作用之撐體或基質為生物專一性的(biospecific)配體以共價方式附著之任何材料。典型地，要使用作為一種親和性基質的材料為於找到目標分子之系統內為不可溶的。通常，但非一直如此，不可溶的基質為固體。
具有高的表面積對體積比率、容易修飾供配體之共價附著的化學基團、極小的非專一性結合性質、良好的流動的特徵以及機械與化學的穩定性的該等撐體為有用的親和性撐體。
幾個不同形式的固定化的配體或活性化親和性撐體的化學作用可供利用，包括例如交聯的珠狀瓊脂糖或聚丙醯胺樹脂以及聚苯乙烯微孔平盤。
多孔的凝膠撐體提供鬆散的基質，其中樣本分子能自由地流動通過高表面積之固定化的配體，其也有助於對蛋白質之親和性純化作用。此等類型的撐體通常為糖或是丙烯醯胺為基的聚合物樹脂，其於溶液內(亦即水合的)產生50-150μm直徑的小珠。珠狀形式允許供應此等如濕的漿體之樹脂，能容易地分配其等裝填且"填塞"任何尺寸的 樹脂床之管柱。小珠非常多孔的且夠大的，以至於生物分子(蛋白質等等)能自由地流動至小珠內且通過小珠，因其等可處於小珠的表面且環繞小珠的表面之間。配體係藉由各種各樣的方式而共價附著至小珠狀聚合物(外部及內部的表面)。
舉例來說，典型可利用4%及6%密度的珠狀瓊脂糖(亦即，1ml樹脂床有超過90%體積計的水)。珠狀瓊脂糖可以適用於重力流、低速離心，以及低壓的程序。任擇地，大體而言不壓縮聚丙醯胺樹脂為基的、珠狀樹脂，以及可以使用於具有蠕動泵或其他的液相層析術系統之介質壓力(medium pressure)應用。兩者類型的多孔撐體大體而言都有低的非專一性結合的特徵。以下的表1提供此等親和性層析術樹脂的物理性質之摘要。
磁粒子為再另一種類型的固體親和性撐體。其等要小得多(典型為直徑1-4μm)，其會提供有效的配體固定化作用及親和性的純化作用所需要的充分的表面積對體積比率。磁粒子之親和性的純化作用係以成批方式(in-batch)執行，例如幾微升的小珠混合數百微升的樣本成為鬆散的漿體。在混合的期間，使小珠保持懸浮於樣本溶液內，允許與固定化的配體發生親和***互作用。在已經給予足夠結合的時間之後，收集小珠以及使用強力的磁鐵來與樣本分離。典型地，於微量離心管內進行簡單的桌上程序(bench-top procedures)，以及使用吸量管吸出或傾析以移除樣本(或清洗溶液等等)，同時用合適的磁鐵使磁珠保持固定在管子的底部或側面。
磁粒子特別合適用於高通過料量自動作業以及，不同於多孔的樹脂，可以使用於細胞分離程序的情況。
各個專一性的親和性系統會需要自己的一套條件，且對於假定的研究目的會出現自己特有的考驗。然而，親和性的純化作用通常涉及下述的步驟：1.用親和性撐體孵育粗製的樣本，以允許樣本內之標的分子結合至固定化的配體；2.從撐體清洗掉未結合的樣本組份；以及3.藉由改變緩衝液條件，以致於結合交互作用不再發生，而從固定化的配體洗提(解離及回收)標的分子。
結合至一般種類的蛋白質(例如抗體)或一般使用的融合蛋白質標誌(例如6xHis)的配體為商業上可買到的， 其為立即可用於親和性的純化作用之預固定化形式。任擇地，可以使用數個商業上可買到的活化親和性撐體之一者來固定更特殊化的配體，例如特定有興趣的抗原或抗體；舉例來說，可以使胜肽抗原固定至一撐體以及用來純化辨識該胜肽的抗體。
最常見地藉由於配體上特定的官能基(例如，一級胺、巰基、羧酸、醛類)和撐體上的反應活性基(見Covalent Immobilization之相關文章)之間形成共價化學鍵，而使配體固定或直接“偶合”至撐體材料。然而，間接的偶合方法也是可能的。舉例來說，一種GST-標誌的融合蛋白質可以先經由麩胱甘肽-GST親和性的交互作用而被麩胱甘肽的撐體捕獲，然後其次經由化學交聯使其固定。接而可以使用固定化的GST-標誌的融合蛋白質來親和性純化融合蛋白質的結合伙伴。
親和性純化作用之結合和洗提緩衝液
多數涉及蛋白質：配體的交互作用程序之親和性純化作用使用生理的pH和離子強度之結合緩衝液，例如磷酸鹽緩衝液(PBS)，特別在當抗體：抗原或天然的蛋白質：蛋白質的交互作用是親和性的純化作用的基礎時。一旦發生結合的交互作用，用額外的緩衝液來清洗撐體以移除未結合的樣本組份。可以藉由添加低位準的清潔劑或是藉由適度的調整結合及/或清洗緩衝液之鹽濃度，來使非專一性(例如簡單的離子)結合的交互作用減到最少。最後，添加洗提緩衝液(例如，0.1M甘胺酸˙HCl，pH 2.5-3.0)來破壞結合 的交互作用(而不永久地影響蛋白質結構)，以及釋放標的分子，接而收集純化形式的標的分子。洗提緩衝液可以藉由極端的pH(低或高的)、高鹽(離子強度)、使用清潔劑或離液劑(chaotropic agent)，使分子的一者或兩者變性、移除結合分子或是與反配體(counter ligand)競爭，來解離結合的伙伴。在一些情況中，可能需要隨後的透析或去鹽(desalting)，來將純化的蛋白質從洗提緩衝液交換至更適合的緩衝液之內供儲存或下游加工。
此外，低pH損壞了一些抗體與蛋白質，所以應該立即添加1/10th體積的鹼性的緩衝液，例如1M Tris˙HCl，pH 8.5來中和洗提的蛋白質餾份。以下的表2提供其他用於親和性純化作用之蛋白質例示性洗提緩衝液。
數種抗體純化方法涉及親和性的純化技術。親和性的純化之例示性的方法包括用硫酸銨沈澱(粗製的純化總免疫球蛋白離開其他的血清蛋白質)；親和性的純化作用，於結合&洗提模式用固定化的蛋白A、G、A/G或L(結合至多數的物種及IgG亞型)或是重組型蛋白A、G、A/G，或是L衍生物進行；以及親和性的純化作用，於結合&洗提模式用固定化的抗原(以共價方式固定化純化抗原至親和性撐體以從粗製的樣本單離專一性的抗體)。
蛋白A、蛋白G及蛋白L為三種抗體結合性質已經特徵化之細菌的蛋白質。此等蛋白質已經重組生產以及例行地使用來親和性純化各種各樣的物種之關鍵的抗體類型。此等大部分商業上可買到的，重組形式蛋白質會移除不必要的序列(例如，來自蛋白G之HSA-結合領域)以及因而比其等天然的對應體更小。也可利用一種基因工程化的重組形式蛋白A及蛋白G，稱為蛋白A/G。研究者於許多的免疫偵測及免疫親和應用方面例行使用全部的四種重組型Ig-結合蛋白質。
為了完成抗體的純化作用，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G係以共價方式固定至一撐體，例如多孔的樹脂(例如珠狀瓊脂糖)或磁珠上。因為此等蛋白質包含有數個抗體結合領域，不論其之方位，幾乎每個個別固定化的分子維持至少一個功能性及未受阻礙的結合領域。再者，因為蛋白質會與抗體上抗原結合領域之外的位址結合，所以此等蛋 白質之固定化的形式可以使用於純化方案，例如免疫沈澱作用，其中抗體結合蛋白質係透過結合一抗體而從樣本純化抗原，同時與其抗原結合。
蛋白A對IgG-類型的抗體之Fc區的高親和性是IgG、IgG片段及亞型之純化作用的基礎。大體而言，蛋白A層析術涉及使澄清的細胞培養懸浮液通過pH大約6.0至大約8.0之管柱，以便結合抗體，以及不需要的組份，例如宿主細胞蛋白質、細胞培養物培養基組份及推定的病毒會流動通過管柱。可以進行選擇性的中間物清洗步驟以由管柱移除非專一性結合的雜質，然後於pH大約2.5至大約pH 4.0下洗提產物。可以以線性梯度或步進法(step method)或是梯度和步進的組合來執行洗提步驟。於一個具體例中，洗提液立即用一種中和緩衝液(例如1M Tris，pH 8)予以中和，然後使用例如5%鹽酸或1M氫氧化鈉以將pH調整為最終pH 6.5。較佳地，中和的洗提液在進行隨後的層析術之前先過濾。於一個具體例中，中和的洗提液在進行隨後的羥磷灰石層析術步驟之前，先通過0.2μm過濾器。
因為蛋白A層析術高的篩選性、高流動速率及具成本效益的結合能力以及其廣泛移除方法相關的雜質之能力，例如宿主細胞蛋白質、DNA、細胞培養物培養基組份以及內源和外來的病毒顆粒，所以蛋白A層析術典型地使用作為抗體純化方法的第一個步驟。在此步驟之後，因為消除了可能造成降解之蛋白酶和其他的培養基組份，所以抗體產物是非常純淨且更穩定的。
現在有三種主要類型的蛋白A樹脂，以其等的樹脂骨幹組成為基礎來分類：玻璃或二氧化矽基的，例如AbSolute HiCap(NovaSep)、Prosep vA、Prosep vA Ultra(Millipore)；瓊脂糖基的，例如，Protein A Sepharose Fast Flow、MabSelect and MabSelect SuRe(GE Healthcare)；以及有機聚合物基的，例如聚苯乙烯-二乙烯苯Poros A及MabCapture(Applied Biosystems)。蛋白A樹脂較佳為瓊脂糖基的樹脂，亦即，MabSelect SuRe樹脂。所有的三種樹脂類型對高濃度的胍鹽酸鹽(guanidinium hydrochloride)、尿素、還原劑和低pH值有抵抗性。
大規模所使用的管柱床的高度介於10和30cm之間，取決於樹脂顆粒的性質，例如細孔大小、粒度及壓縮性。較佳地，管柱床的高度大約25cm。流動速率和管柱的維度會決定管柱上的抗體滯留時間。於一個具體例中，蛋白A使用的線速度為大約150至大約500cm/hr，較佳為大約200cm/h至大約400cm/h，更佳為大約200cm/h至大約300cm/h，以及最佳為大約250cm/h。動態結合能力的範圍從每公升樹脂為15-50g的抗體，以及取決於流動速率、要純化的特定抗體，以及使用的蛋白A基質。較佳地，管柱裝載不超過每公升樹脂為45g的抗體。Fahrner等人，Biotechnol Appl BioChem.30：121-128(1999)之中已經說明判定蛋白A樹脂的動態結合能力的方法。較低的裝載流動速率可增加抗體的滯留時間以及促進更高的結合能力。其也導致每循環較長的加工的時間，需要較少的循環且每批收穫的細胞 培養液消耗較少的緩衝液。
其他的親和性純化之例示性的方法包括凝集蛋白親和性層析術，凝集蛋白親和性層析術可以以流過式模式(具有非所欲的醣化的產物會與撐體結合，同時不具有非所欲的醣化的產物會通經該撐體)或是結合&洗提模式(具有所欲的醣化的產物會與撐體結合，同時不具有所欲的醣化的產物會通經該撐體)予以執行。
表現於低等的真核生物，例如巴斯德畢赤酵母菌內之蛋白質可以用只由或主要由甘露糖(Man)殘基組成的O-寡糖類來修飾。此外，表現於低等的真核生物，例如巴斯德畢赤酵母菌內之蛋白質可以用N-寡糖類來修飾。巴斯德畢赤酵母菌及其他的真菌內之N-醣化作用與更高等的真核生物內不同。即使於真菌範圍內，N-醣化作用也不同。尤其，巴斯德畢赤酵母菌內之N-連結型醣化途徑與啤酒酵母菌(S.cerevisiae)內存在的該等醣化途徑實質上不同，往Man8GN2核心具有較短的Man(α 1,6)延長部分，以及明顯缺少顯著的Man(α 1,3)添加部分，其代表巴斯德畢赤酵母菌之N-連結型聚醣主要的加工模態。在有些方面，巴斯德畢赤酵母菌可能更接近典型的哺乳動物的高甘露糖醣化模式。再者，畢赤酵母菌及其他的真菌可予以工程化來生產“人類化的醣蛋白”(亦即，基因修飾酵母菌菌株成為能夠複製發現哺乳動物體內存在之必需的醣化作用途徑，例如半乳糖苷化(galactosylation)。
根據所欲的或非所欲的O-連結型及/或N-連結型 醣化修飾的蛋白質產物，可以選擇一個或多個凝集蛋白用於流過式模式或結合&洗提模式之親和性層析術。舉例來說，設若所欲的重組型蛋白質缺少特定的O-連結型及/或N-連結型甘露糖修飾(亦即，所欲的蛋白質為未修飾的)，則可以選擇結合至甘露糖部分的凝集蛋白，例如，Con A、LCH、GNA、DC-SIGN及L-SIGN，用於流過式模式之親和性的純化作用，以便所欲的未修飾產物會通經該撐體且可利用於進一步純化或加工。相反地，設若所欲的重組型蛋白質包含有特定的O-連結型及/或N-連結型甘露糖修飾(亦即，所欲的蛋白質為未修飾的)，則可以選擇結合至甘露糖部分的凝集蛋白，例如Con A、LCH、GNA、DC-SIGN及L-SIGN，用於結合&洗提模式之親和性的純化作用，以便所欲的修飾產物結合至該撐體且非所欲的未修飾產物流通過。在後者的例子中，可以丟棄通過的物流同時由該撐體洗提所欲的修飾產物用於進一步純化或加工。相同的原則適用於含有其他的醣化修飾之重組型蛋白質產物，該醣化修飾係透過真菌表現系統引入。
另一種擬親和性(pseudo-affinity)的純化作用工具為‘混合模式’層析術。當使用於本文中，術語“混合模式層析術”係提及利用超過一種形式的靜止相和分析物之間的交互作用之層析法，俾以達成其等之分離作用，例如，混合模式層析術中之二級交互作用促成溶質的滯留。混合模式層析術的優點包括高篩選性，例如可以於單一運轉中分離陽性的、陰性的和中性的物質，以及更高的裝載能量。
可以以陶瓷或晶形磷灰石介質，例如羥磷灰石(HA)層析術及氟磷灰石(FA)層析術執行混合模式層析術。其他的混合模式樹脂包括，但不限於CaptoAdhere、Capto MMC(GE Healthcare)；HEA Hypercel，及PPA Hypercel(Pall)以及Toyopearl MX-Trp-650M(Tosoh BioScience)。此等層析術樹脂提供與更傳統的離子交換或疏水性作用技術互補之生物分子篩選性。
陶瓷羥磷灰石(Ca5(PO4)3OH)2為磷酸鈣的形式，其可以使用於蛋白質、酵素、核酸、病毒以及其他的巨分子之分離作用和純化作用。羥磷灰石具有獨特的分離作用性質以及傑出的篩選性和分離度。舉例來說，對其他的層析和電泳的技術為均相的蛋白質通常會由羥磷灰石予以分離。具有氯化鈉或磷酸鈉梯度洗提之陶瓷羥磷灰石(CHT)層析術可以使用作為單株抗體純化方法中的精純步驟，以移除二聚物、聚集體及瀝濾的蛋白A。
例示性的羥磷灰石(HA)第I型及第II型吸附劑係選自於陶瓷及晶形材料。可利用不同粒度的(例如第1型，Bio-Rad Laboratories)HA吸附劑。於例示性的具體例中，HA吸附劑的粒度係介於大約10μm和大約200μm之間，介於大約20μm和大約100μm或是介於大約30μm和大約50μm之間。於特定的實例中，HA吸附劑的粒度係大約40μm(例如，CHT，第I型)。
例示性的第I型及第II型氟磷灰石(FA)吸附劑係選自於陶瓷(例如珠狀的顆粒)及晶形材料。可利用不同粒度 的陶瓷FA吸附劑(例如，第1型及第2型，Bio-Rad Laboratories)。於例示性的具體例中，陶瓷FA吸附劑的粒度係由大約20μm至大約180μm，較佳大約20至大約100μm，更佳大約20μm至大約80μm。於一個實例中，粒度陶瓷FA介質大約為40μm(例如第1型陶瓷FA)。於另一個實例中，FA介質除了FA之外還包括HA。
使用來裝載樣本至羥磷灰石或氟磷灰石管柱上的流速(flow velocity)，及洗提流速的選擇方法係取決於羥磷灰石或氟磷灰石吸附劑的類型以及管柱之幾何形狀。於例示性的具體例中，以方法的規模，裝載流速選自於大約50至大約900cm/h，大約100至大約500cm/h，較佳為大約150至大約300cm/h，以及更佳為大約200cm/h。於例示性的具體例中，洗提緩衝液pH係選自於大約pH 5至大約pH 9，較佳為大約pH 6至大約pH 8，以及更佳為大約pH 6.5。
於一個具體例中，本揭示之純化方法在蛋白A層析術之後，通過CHT樹脂來使用羥磷灰石(HA)層析術。較佳地，以配於pH 6.5之5mM磷酸鈉內，從大約0M至1.5M之線性梯度(0-100%)的氯化鈉來執行洗提作用。可以監測洗提液的OD280。於一個具體例中，在洗提的整個期間，收集由前部側面處的0.1OD至峰值最大值之單一餾份，然後收集由峰值最大值至後部側面處的0.1OD之一系列的餾份，例如大約三分之一的管柱體積，用於進一步的純化分析。於另一個較佳具體例中，以從大約5mM至0.25M之線性梯度(0-100%)的pH 6.5之磷酸鈉緩衝液來執行洗提作用。可以 監測洗提液的OD280。在洗提的整個期間，可以收集由前部側面處的0.1OD至後部側面處的0.1OD之~1/2 CV的餾份用於進一步的純化分析。
多株抗體(例如血清的樣本)需要抗原-專一性的親和性純化作用以預防非專一性的免疫球蛋白之共純化作用(co-purification)。舉例來說，一般來說小鼠血清內僅僅2-5%的總IgG係對於用來使動物免疫的抗原為專一性的。獲得可用的抗體必要的純化作用的類型及程度取決於預期的抗體應用。然而，使用細胞株，例如融合瘤或重組型表現系統來發展，以及生產為腹水或細胞培養懸浮液之單株抗體，可以在沒有使用抗原專一性的親和性方法的情況下完全地純化。因為目標抗體(對於大部分實際的目的)為生產樣本內僅有的免疫球蛋白。
雜質的監測
生物藥學(biopharmaceutical)產物的雜質及其等相關的中間物以及賦形劑之剖析(Profiling)為受管制的預期事物。參見，例如美國食品藥物管理局Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products：Recommended Approaches。此指導建議如何評估此等雜質的安全性以及暴露閾值。歐洲藥物管理局(EMEA committee for Medicinal Products for Human Use(CHMP)也發表基因雜質毒性限度的指南(Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities)，歐洲的管理機構應用該指南於新藥產物，以及在一些情況中，也應用於藥物開發方面之藥物物質。此等 指導方針加強國際法規協和會(ICH)產業指南：Q3A(R2)Impurities in New Drug Substances,Q3B(R2)Impurities in New Drug Products,and Q3C(R3)Impurities：Residual Solvents，其等處理更普遍的方法之雜質。
雖然一些雜質的與藥物產物有關(亦即，產物相關變異體)，但是其他雜質為在合成、加工，以及製造的期間增加的雜質。此等雜質屬於數個廣泛的類別：產物相關變異體；上游引入的方法相關的物質；在該方法整個期間的殘餘雜質；下游引入的方法相關的殘餘雜質；以及拋棄式用品(disposables)引入的殘餘雜質。
當使用於本文中，“產物相關變異體”係提及存在於所欲產物的製備物及與所欲產物相關之所欲產物(如所欲的多次級單元型複合體)以外的一產物。例示性的產物相關變異體包括截斷型或延伸型肽；其醣化作用不同於所欲醣化作用之產物(例如，設若所欲者係一種無醣化(aglycosylated)產物，則任何醣化產物將被視為產物相關變異體)；具有異常的化學計量、不當組裝、異常的雙硫鍵、異常或不完整的摺疊作用、聚集作用、蛋白酶剪切作用或其他異常狀況之複合體。例示性產物相關變異體可能展現下列一或多項之改變：分子質量(如藉由粒徑篩析層析術檢測)、等電點(如藉由等電聚焦作用檢測)、電泳遷移率(如藉由凝膠電泳檢測)、磷酸化狀態(如藉由質譜法檢測)、荷質比(如藉由質譜法檢測)、蛋白分解片段之質量或一致性(如藉由質譜法或凝膠電泳檢測)、疏水性(如藉由HPLC檢測)、 電荷(如藉由離子交換層析法檢測)、親和性(如在一抗體的情況下，與蛋白A、蛋白G，及/或該所欲抗體與所結合的一抗原決定位之結合作用)，以及醣化狀態(如藉由凝集蛋白結合親和性檢測)。當所欲的蛋白質係一抗體時，產物相關變異體一詞可包括一種醣化重鏈型變異體及/或半抗體物種(如下文所述)。
例示性產物相關變異體包括含有異常的雙硫鍵之變異體形式。例如，大部分的IgG1抗體分子係藉由總共16個鏈內與鏈間雙硫橋鍵穩定，其等使得重鏈與輕鏈中的IgG領域之摺疊作用穩定，而鏈間的雙硫橋鍵使得重鏈與輕鏈之間的締合作用穩定。其他的抗體類型同樣含有特徵性的穩定化鏈內與鏈間雙硫鍵。此外，一些抗體(包括在本文中所揭露的Ab-A)含有額外的雙硫鍵，稱為非典型雙硫鍵。因此，由於穩定化的共價鍵結不存在，及/或與附加的次級單元之雙硫鍵，所以異常的鏈間雙硫鍵可能造成異常複合體化學計量。此外，異常的雙硫鍵(不論是鏈間或鏈內)可能減少抗體的結構穩定性，其可能造成活性降低、穩定性降低、形成聚集體的傾向增加，及/或免疫原性增加。可按多種方式檢測出含有異常雙硫鍵之產物相關變異體，包括非還原變性SDS-PAGE、毛細管電泳、cIEX、質譜法(選擇性地用化學修飾作用而在游離半胱胺酸中產生質量偏移)、粒徑篩析層析術、HPLC、光散射的變化及技藝中所知的其他任何適宜方法。如參見，Protein Protocols Handbook 2002，第五部，581-583，DOI：10.1385/1-59259-169-8：581。
大體而言，可以使用透析、去鹽及透析過濾來使抗體交換至特定的緩衝液內，以及移除非所欲的低分子量(MW)組份。特別地，可以使用特色為高分子量截流(high-molecular weight cut-offs)(MWCO)之透析膜、粒徑篩析樹脂，以及透析過濾裝置，來分離免疫球蛋白(>140kDa)和小蛋白質及胜肽。參見，例如Grodzki,A.C.and Berenstein,E.(2010)。Antibody purification：ammonium sulfate fractionation or gel filtration.In：C.Oliver and M.C.Jamur(eds.),Immunocytochemical Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,Vol.588：15-26.Humana Press。
可以使用粒徑篩析層析術來偵測抗體聚集體、單體，以及片段。另外，可以使用偶合質譜法之粒徑篩析層析術來測量抗體的分子量；抗體共軛物(conjugate)，以及抗體輕鏈和重鏈。
供純化及純度監測方法使用之例示性粒徑篩析樹脂包括來自Tosoh Biosciences(美國，PA，蒙哥馬利維爾(Montgomeryville))之TSKgel G3000SW及TSKgel G3000SWx1；來自Waters(美國，MA，米福特(Milford))之Shodex KW-804、Protein-Pak 300SW，及BioSuite 250；來自Thermo Scientific(美國加州，森尼維耳(Sunnyvale))之MAbPacTM SEC-1以及MAbPac TM SCX-10。
於一個具體例中，使用粒徑篩析層析術來監測於純化方法期間分離的雜質。舉例來說，可以使用Tosoh Bioscience(普魯士王市(King of Prussia)，PA)的TSKgel Guard SW x 16 x 40mm連接之經平衡的TSKgel GS3000SW 17.8 x 300mm管柱來加載樣本，使用含有pH 6.5的100mM磷酸鈉、200mM氯化鈉作為移動相之SE-HPLC緩衝液，而等度模式中的流動速率為0.5毫升/分鐘。使用具有紫外線檢測儀器的安捷倫(Agilent)(聖塔克拉拉(Santa Clara)，CA)1200系列HPLC，監測UV 215nm的吸光度。接著收集樣本，及稀釋為所欲的濃度，例如1mg/mL。接著可以將稀釋的樣本的小部分，例如30μL，加載至SE-HPLC管柱上。較佳地，使用凝膠過濾標準品(例如BioRad)來監測管柱的性能。
產物相關變異體包括了醣化變異體(glycovariant)。當使用於本文中，“醣化變異體”係提及有時存在於抗體製備物中，且含有至少部分的Fc序列之醣化型產物相關變異體。醣化變異體包含共價附著至所欲的蛋白質之側鏈側鏈聚醣。與所欲的蛋白質相比，醣化變異體可以為“醣化重鏈型”或“醣化輕鏈型”，亦即與所欲的蛋白質相比，其分別含有額外的醣化修飾，或是含有比所欲的蛋白質更少的醣化修飾。例示性醣化修飾包括，但不限於N-連結型醣化作用、O-連結型醣化作用及磷醣化作用(phosphoglycosylation)。
醣化變異體的特徵在於由SDS-PAGE觀察所得之電泳遷移率增加或降低(相對於一正常多肽鏈而言)、凝集蛋白的結合親和性、與一抗Fc抗體的結合作用，以及如藉由粒徑篩析層析術測定之含有醣化重鏈型變異體的抗體複 合體之分子量顯然較高或較低。參見例如，於2011年8月31日提出申請之美國臨時申請案序號第61/525,307號，其在此完整地併入本案以為參考資料。
當使用於本文中，“醣化雜質”係提及一種與所欲的重組型蛋白質不同的醣化作用模式之物質。醣化雜質可以包含如同所欲的重組型蛋白質相同的或是不同的一級結構、二級結構、三級結構及/或四級結構。因而，一種醣化變異體為一類的醣化雜質。
監測mAbs醣化作用之分析方法是重要的，因為生物過程(bioprocess)條件會導致，例如高甘露糖型之變異、截斷的形式、四觸角結構的減少及三觸角結構和雙觸角(biantennary)結構增加、較少唾液酸化的(sialyated)聚醣以及較少的醣化作用。可以使用本技藝所知的分析方法來監測樣本內醣化變異體的存在，例如聚醣染色或標記法、質譜法之醣蛋白質體(glycoproteome)及糖組(glycome)分析及/或醣蛋白的純化作用或濃化作用(enrichment)。於一個具體例中，使用凝集蛋白動力結合測定法來分析醣化變異體，例如，光干涉術(其可使用ForteBio Octet®來執行)、雙偏極化干涉術(其可使用Farfield AnaLight®來執行)、靜態光散射、(其可使用Wyatt DynaPro NanoStarTM來執行)、動態光散射(其可使用Wyatt DynaPro NanoStarTM來執行)、組成梯度多角度光散射(其可使用Wyatt Calypso II來執行)、表面電漿子共振(其可使用ProteOn XPR36或Biacore T100來執行)、ELISA、化學發光ELISA、遠西方墨點轉漬分析法、化學發 光法(其可使用MesoScale Discovery來執行)或其他的凝集蛋白動力結合測定法。
於一個具體例中，使用聚醣染色或標記法來偵測醣化變異體。舉例來說，可以用過碘酸來化學重建聚醣糖基團，以使糖上鄰位的羥基氧化成醛類或酮類，以致於其等對染料有反應性，例如過碘酸雪夫氏(periodic acid-Schiff)(PAS)染色，來偵測及定量假定的樣本內之醣蛋白。過碘酸也能用於使糖對交聯劑有反應性，其可以共價方式結合標記分子(例如生物素)或固定化的撐體(例如鏈黴抗生物素蛋白)用於偵測或純化作用。
於另一個具體例中，使用質譜法來辨識及量化樣本內之醣化變異體。舉例來說，可以使用酵素消化以由免疫醣蛋白釋放寡糖類，寡糖類隨後用螢光修飾劑予以衍生化，用偶合螢光偵測的正相層析術來分離(resolved)，以及用質譜法(例如MALDI-TOF)來分析。醣蛋白質體的(glycoproteomic)分析之基礎管道(basic pipeline)包括醣蛋白或醣肽濃化、液相層析術(LC)之多維分離作用、串聯式質譜法以及經由生物資訊之資料分析。
光譜圖分析可以在，例如內聚醣酶H(endoglycanase H)(endo H)或胜肽-N4-(N-乙醯基-刍-葡萄糖胺基)天冬醯胺酸醯胺酶(peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase)(PNGase)，之酵素剪切聚醣之前或之後執行，取決於實驗。此外，定量比較醣蛋白質體的(glycoproteomic)分析可以用 鑑別性的標記法(differential labeling)執行，其係於細胞培養(SILAC)試劑內用穩定的同位素標記胺基酸。再者，使用同位素方式標記的，"重(heavy)"參考胜肽，可以執行目標醣蛋白之選擇反應監測(SRM)的絕對定量法。
於一個具體例中，使用凝集蛋白來偵測及分析純化方法的整個期間所欲的重組型蛋白質之醣化變異體。凝集蛋白為聚醣結合蛋白質對有區別的糖部分有高的專一性。以下的表3提供商業上可買到的凝集蛋白之非限制性的名冊。
於一個具體例中，從發酵方法，例如在進行期間或在進行完成之後，獲得的一樣本接受凝集蛋白結合測定法以偵測該(等)樣本內經醣化雜質的量及/或種類。同樣地，於其他的具體例中，該純化方法包括於要純化所欲的重組型蛋白質之樣本內，偵測經醣化雜質的量及/或種類。舉例來說，於一個特定的具體例中，源自該純化方法之至少一個層析步驟的洗提液或餾份的一部份可以接觸一種凝集蛋白。
凝集蛋白結合的位準通常與洗提液或餾份(以慣見的粒徑篩析層析術為基礎)內存在的產物相關醣化變異體雜質之位準有關聯，以便可以根據醣化變異體雜質的含量來選擇一個或多個洗提液餾份用於進一步純化及加工，例如，選擇小於10%醣化變異體之洗提液餾份用於進一步的層析純化於一些具體例中，可以使用多種凝集蛋白(亦即， 二個或更多個凝集蛋白)來監測產物相關醣化變異體雜質的純度。
於一任擇的具體例中，以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，來丟棄某些樣本或洗提液或其餾份。於再另一個具體例中，以偵測到的經醣化雜質的量及/或種類為基礎，來處理某些樣本或洗提液或其餾份以減少及/或移除該經醣化雜質。例示性的處理包括下列的一者或多者：(i)添加一酵素或其他的化學部分(moiety)來移除醣化，(ii)藉由進行一個或多個凝集蛋白結合步驟來移除該經醣化雜質，(iii)進行粒徑篩析層析術(size exclusion chromatography)來移除該經醣化雜質。
於一個特定的具體例中，凝集蛋白與一探針接合，然後固定至一撐體。參見圖2。該撐體可以以成批方式或填塞至，例如HPLC的管柱內。例示性的探針包括生物素、鹼性磷酸酶(AP)、山葵過氧化酶(HRP)、螢光素酶、螢光黃(螢光異硫氰酸鹽，FITC)及若丹明(rhodamine)(四甲基若丹明異硫氰酸鹽，TRITC)、綠色螢光蛋白(GFP)及藻膽蛋白(例如，別藻藍蛋白、藻青蛋白(phycocyanin)、藻紅素及藻紅藍素)。例示性的撐體包括抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、NeutrAvidin(去醣化的抗生物素蛋白)以及磁珠。應該注意到本發明不限於偶合(coupling)化學作用。較佳地，凝集蛋白為生物素化的及固定至一種鏈黴抗生物素蛋白感測器之上。
可以使用標準的蛋白質-蛋白質交互作用監測方 法來分析來自純化方法的各種步驟的樣本內，凝集蛋白及醣化雜質之間的交互作用。例示性的蛋白質-蛋白質交互作用監測方法包括，但不限於光干涉術(其可使用ForteBio Octet®來執行)、雙偏極化干涉術(其可使用Farfield AnaLight®來執行)、靜態光散射(其可使用Wyatt DynaPro NanoStarTM來執行)、動態光散射(其可使用Wyatt DynaPro NanoStarTM來執行)、組成梯度多角度光散射(其可使用Wyatt Calypso II來執行)、表面電漿子共振(其可使用ProteOn XPR36或Biacore T100來執行)、ELISA、化學發光ELISA、遠西方墨點轉漬分析法、化學發光法(其可使用MesoScale Discovery來執行)或其他的凝集蛋白動力結合測定法。
光干涉術為一種光學分析的技術，其分析二個表面(生物感測器尖端上一層固定化的蛋白質，以及內部的參考層)反射的白光之干涉圖型以根據干涉圖型的位移(亦即，由與生物感測器尖端結合的分子數量之變化所引起的)，而即時(real-time)地測量生物分子的交互作用，藉此來提供關於結合專一性、締合與解離的速率，或是濃度的資訊。
雙偏極化干涉術係以雙平板波導感測器晶片為基礎，其具有一個上部感測波導器及一個下部光學參考波導器，用交替直交(alternating orthogonal)偏振雷射光照亮。建立二個不同的波導模式-明確地，橫向磁波(TM)模式及橫向電波(TE)模式。兩者模式都在頂部感測波導器的表面產生消逝場，以及探查此表面接觸的物質。當物質與感測器 的表面互相作用，其導致干涉條紋(interference fringes)的相變。於是，以數學方式分解各模式的干涉條紋圖型成RI及厚度數值。因此，感測器能測量感測器的表面上極端微細的分子變化。
靜態光散射(SLS)為一種非侵入式技術，藉此可以通過暴露於低強度的雷射光(690nm)而根據實驗方式來決定溶液內之蛋白質樣本內的絕對分子質量達到比5%更佳的準確度。散射光的強度測量為角度的函數，以及可以分析以產生莫耳質量、均方根半徑，及第二均功係數(second virial coefficient)(A2)。SLS實驗的結果除了判定溶液寡聚狀態(單體/二聚物等等)之外，還可以使用作為蛋白質製備物之品質管制(例如供結構研究)。SLS實驗可以以分批或層析術模式來執行。
動態光散射(亦稱為準彈性光散射(quasi-elastic light scattering)，QELS，或光子雙關頻譜法(photon correlation spectroscopy)，PCS)為一種根據即時強度(與靜態光散射測量的時間-平均強度相比)而用於測量分子及亞微粒顆粒的流體動力學尺寸之技術。記錄介質內的顆粒之散射光波動(暫時性偏差，典型以μs至ms時間尺度)，以及分析與延遲時間領域的相互關係。顆粒可以為懸浮液內固體的顆粒(例如，金屬氧化物、礦物碎片，及乳膠顆粒)或軟粒(例如氣泡及微胞)，或者溶液內之巨分子鏈(例如合成的聚合物及生物材料)。既然顆粒的擴散率係由假定的環境中其等的尺寸來決定，所以散射光的波動速率含有關於其等 的尺寸之資訊。
小分子的散射強度與分子量的平方成比例。確切而言，動態及靜態光散射技術對蛋白質開始聚集及其他因為條件的微細變化所引起的蛋白質結構變化非常敏感。
組成梯度多角度光散射(CG-MALS)使用一系列不同組成或濃度之未分餾的樣本，俾以特徵化巨分子的交互作用，例如蛋白質之可逆自締合作用及異體締合作用、反應速率，以及不可逆的聚集作用，或是均功係數。此等測量法提供關於專一性可逆的複合體結合(例如，K d 、化學計量、自締合作用及/或異體締合作用(heteroassociations))、非專一性的交互作用(例如，自我及交叉均功係數)、聚集作用及其他的時間相關(time-dependent)反應(例如，停流動力學(stop-flow kinetics)及t)以及齊姆圖(Zimm plots)(例如，判定MW、A2、A3(第二及第三均功係數)，或r g 的濃度梯度)之資訊。
當偏光於總內部反射的條件下，照在不同的折射率介質(亦即，感測器表面的玻璃(高折射率)和緩衝液(低折射率))之間的界面處的電導(例如金)層時，發生表面電漿子共振(SPR)現象。涵蓋一範圍入射角之楔形偏光被引導朝向感測器表面的玻璃面。當光照在玻璃時產生的電場強度(亦即，漸逝波)，會與金層內之自由電子雲互相作用，以及被自由電子雲吸收，產生稱為電漿子之電子電荷密度波且造成反射光的強度減少。發生此強度最小值之共振角度為接近感測器的表面之對向面上的金層溶液的折射率之函數。 於一監測裝置，例如ProteOn XPR36或Biacore system內偵測反射光。動力學(亦即，複合體生成(ka)及解離(kd)速率)、親合性(例如KD)，以及濃度資訊可以根據電漿子示值讀數來判定。
從此等及其他的蛋白質-蛋白質的交互作用監測方法獲得的資訊可以使用來，例如，定量酵素/抑制劑或抗體/抗原交互作用或醣蛋白/凝集蛋白交互作用之結合親和性及化學計量；研究小分子對蛋白質-蛋白質交互作用的影響；調整緩衝液參數以改善調配物穩定性及黏度；最佳化抗體的純化作用及瞭解大量的賦形劑對於調配物之作用；定量化溶劑離子強度、pH，或是賦形劑對於聚合作用或蛋白質締合作用的影響；測量自組裝以及聚集作用的動力學；以及特徵化廣大範圍的緩衝液組成、時間及溫度尺度之巨分子結合親和性及締合的複合體化學計量。
於一個較佳具體例中，凝集蛋白結合的位準(與醣化變異體雜質的量有關聯)係使用光干涉術，例如Octet分析儀(FortéBIO)來判定。
例示性上游引入的方法相關的雜質包括核酸(例如DNA及RNA)及宿主細胞蛋白質(HCP)，其等為細胞溶解之後與有興趣的蛋白質一起存在的不需要的細胞組份。此等方法相關的雜質也包括抗生素，其等為上游添加至細胞培養物培養基來控制細菌污染及維持宿主有機體之選擇壓力(selective pressure)。例示性的抗生素包括卡那黴素(Kanamycin)、氨比西林(ampicillin)、青黴素、雙性黴素 B(amphotericin B)、四環素(tetracyline)、建那黴素(gentamicin)、濕黴素(hygromycin B)，以及支原體抗生素(plasmocin)。
在該方法期間已發生之例示性的殘餘雜質包括方法增強劑或催化劑，在該純化方法整個期間添加方法增強劑或催化劑以使得一些步驟更有效及增加產物產量。舉例來說，為了發酵輸出之溶解化作用添加胍及尿素，以及在蛋白質還原及再摺疊的整個期間使用麩胱甘肽和二硫蘇糖醇(DTT)。
例示性下游引入的方法相關的雜質包括，須從方法清除之層析純化目標蛋白質需要的化學品及試劑(例如醇類以及二醇類)，以及界面活性劑(例如，Triton-X、Pluronic、Antifoam-A、B、C、妥文(Tween)，或是聚山梨醇酯)，在下游加工的整個期間添加界面活性劑來協助從程序流(process stream)分離蛋白質、胜肽，以及核酸，界面活性劑係藉由透過吸附於液體-液體界面來降低界面張力。
例示性的拋棄式用品引入的殘餘雜質包括“可萃取物”，其為能於超常的條件下而從組份萃取(例如，嚴酷的(harsh)溶劑或於提高的溫度下)以及有可能污染藥品產物之化合物，以及“可瀝濾物(leachables)”，其等為由於在正常的條件或是有時於加速的條件下直接接觸調配物，而從組份瀝濾至藥品產物的調配物內的化合物。可瀝濾物可以為可萃取物的子集。必須控制可萃取物以達到所使用的組份是適當組份的程度。必須控制可瀝濾物，以便藥品產物 不是摻雜的藥品產物。
提供下述的非限制性實施例以進一步明確有力地表達本發明。
實施例
提出下列的實施例以便於提供本技藝中具有通常技術的那些人如何做及如何使用本發明之完全的揭示和說明，以及不意欲限制視為本發明的範疇。已經努力確保有關於使用的數目(例如數量、溫度、濃度等等)之正確性，但應允許一些的實驗錯誤和誤差。除非用別的方法指出，部分是以重量計的部分，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度數；以及壓力是大氣壓力或是接近大氣壓力。
實施例1：Ab-A純化作用及回收
此實施例闡明在巴斯德畢赤酵母菌內產生的重組型抗體的純度，係藉由使用一系列初期回收和層析純化方法而改善。圖1顯示該純化方法之綜述。可以使用此等方法來純化及回收不同系統中表現的各種抗原專一性抗體。
培養連結至訊息序列之巴斯德畢赤酵母菌細胞，其含有編碼Ab-A重鏈與輕鏈(對應於如US 20120294797中列出的序列辨識編號：54與序列辨識編號：52，其完整地併入以作為參考資料)之穩定地併入的序列，及誘導抗體的表現。
以達3mM的最終濃度之乙二胺四乙酸(EDTA)以及用一種絮凝劑，來處理全發酵肉湯。藉由離心收穫的肉湯，接著藉由通過深度過濾器和0.2μm過濾器之澄清作用 來移除細胞及絮凝的碎屑。
繼而將澄清的肉湯施加至一種MabSelect SuRe(GE Healthcare Life Sciences)樹脂管柱，以藉由蛋白A親和性層析術來捕獲Ab-A。於環境溫度下執行層析術。用0.1M氫氧化鈉來消毒25cm床高度的管柱，然後在加載之前，用20mM磷酸鈉、150mM氯化鈉，pH 6.0的緩衝液(“PrA平衡緩衝液”)予以平衡。以250cm/hr的線速度來裝載管柱成為每公升樹脂不超過45g Ab-A的能量，以及然後從頭到尾以同樣的線速度操作。在實施裝載以後，用5倍管柱體積(CV)的平衡緩衝液來沖洗管柱，然後用5CV的20mM磷酸鈉、10mM EDTA、1M氯化鈉，pH 6.0來清洗管柱，以移去結合鬆散的材料。用另一個5CV的平衡緩衝液來沖洗管柱以移除清洗組份，然後用1M精胺酸，pH 4.0(“PrA洗提緩衝液”)使結合的Ab-A解吸(desorbed)。以0-100%線性梯度的洗提緩衝液進行洗提步驟達3CV，然後以100%洗提緩衝液洗提另一個3CV。監測流出物的OD280，以及收集前部側面處的1OD至後部側面處的1OD的洗提液。將洗提液收集至預裝載0.15CV的1M Tris，pH 8.0(“PrA中和緩衝液”)容器內。在收集以後，混合容器的內含物及判定其之pH值，優先依需要使用5%鹽酸或1M氫氧化鈉將pH最終調整為pH 6.5。經中和的洗提液係以0.2μm予以過濾，接而發送進行羥磷灰石層析術步驟。在產物洗提以後，用3CV之20mM醋酸鈉，pH 3.6來剝離捕獲管柱，用3CV之0.2M氫氧化鈉予以潔淨，以及在儲存20%乙醇內之前，用3CV之平衡緩衝液 予以沖洗。
Ab-A的中間物純化作用使用陶瓷羥磷灰石(CHT，第I型，40μm)樹脂之混合模式層析術。從頭到尾於環境溫度下以及以不超過200cm/hr的線速度來進行此步驟。在每次進行之前，使用3CV的1M氫氧化鈉來消毒管柱，用3CV 500mM磷酸鈉，pH 6.5(“剝離緩衝液”)來剝離，以及用至少3CV 5mM磷酸鈉，pH 6.5(“CHT平衡緩衝液”)予以平衡。CHT裝載物係藉由稀釋經過濾、用CHT平衡緩衝液中和的捕獲洗提液成傳導度不超過4mS/cm，來進行製備。然後CHT裝載物在通經放置於該管柱前方的0.2μm過濾器之後，施用於該平衡管柱。在裝載以後，管柱係用5CV的CHT平衡緩衝液來清洗，然後用20CV的0-100%線性梯度的5mM磷酸鈉、1.5M氯化鈉，pH 6.5(“CHT洗提緩衝液”)來洗提。監測流出物的OD280，以及收集前部側面處的0.1OD至峰值最大值處的單一餾份。之後，收集峰值最大值處至後部側面處的0.1OD為一系列~1/3rd CV的餾份。分析餾份的純度(參見圖3)，以及合併一組連續的餾份(包括第一個，較大的餾份)以達到具所欲的純度及減少的醣化變異體含量之CHT集池(參見圖4及圖5)。在洗提之後，CHT管柱係用3CV 500mM磷酸鈉，pH 6.5(“CHT剝離緩衝液”)予以剝離(stripped)，在適當的地方用5CV 1M氫氧化鈉來潔淨，以及用3CV0.1M氫氧化鈉儲存溶液來沖洗。
Ab-A之精純的純化作用使用聚丙二醇(PPG-)600M樹脂之疏水性作用層析術(HIC)。此步驟從頭到尾於環 境溫度下進行以及用不超過200cm/hr的線速度來進行。在每次進行之前，使用3CV的0.5M氫氧化鈉來消毒管柱，用3CV水來剝離，以及用至少3CV 20mM磷酸鈉、0.7M硫酸鈉，pH 7.0(“HIC平衡緩衝液”)予以平衡。藉由使用20mM磷酸鈉、1.1M硫酸鈉，pH 7.0(“HIC稀釋緩衝液”)，來調整經0.2μm過濾的CHT集池成為至少77.5mS/cm之傳導度，來製備HIC裝載物。然後HIC裝載物在通經放置於該管柱前方的0.2μm過濾器之後，施用於該平衡管柱。在裝載以後，管柱係用5CV的HIC平衡緩衝液來清洗，然後用20CV的0-100%線性梯度的20mM磷酸鈉，pH 7.0(“HIC洗提緩衝液”)來洗提。監測流出物的OD280，以及收集前部側面處的0.1OD至後部側面處的0.1OD為一系列~1/3rd CV的餾份。分析餾份的純度(參見圖6)，以及合併一組連續的餾份以形成具所欲的純度及減少的醣化變異體含量之HIC集池。在洗提之後，HIC管柱係用3CV的水予以剝離，在適當的地方用6CV 0.5M氫氧化鈉(於第一個3CV和最後一個3CV之間暫停60-120min)來潔淨，用3CV的水來沖洗，以及轉移至0.1M氫氧化鈉儲存溶液。
藉由裝備有30kDa分子量的截流膜之切向流過濾(TFF)系統超過濾及透析過濾(UFDF)，來調配HIC集池內之Ab-A。系統係用用水來沖洗，測試膜之完整性，消毒，以及以調配物緩衝液予以平衡準備用於裝載0.2μm過濾的HIC集池。在裝載以後，透過超過濾來濃縮溶液，然後藉由相對於6-8週轉體積的調配物緩衝液之透析過濾來交換至 調配物緩衝液內。蛋白質溶液以第二回合的超過濾來進一步濃縮，然後從TFF系統排掉滯留物(retentate)。用調配物緩衝液沖洗系統以回收殘餘的蛋白。判定滯留物及沖洗物(flush)的蛋白濃度，然後混合各個適當的部分以及以用調配物緩衝液來進一步調整以達到所欲的最終Ab-A的濃度。TFF產物係於生物安全櫃中予以0.2μm過濾至無菌的瓶子內，以及儲存於-20℃。
Ab-A(見圖7)製備物中的產物變異體顯現在蛋白質凝膠上。第1道及第12道：對照道(1X樣本緩衝液)；第2道、第6道及第11道：分子量標誌；第3-5道：加載至蛋白A親和性管柱上的總樣本；第7道：蛋白A親和性層析術之後的Ab-A抗體製備物；第8道：CHT層析術之後的Ab-A抗體製備物；第9道：HIC層析術之後的Ab-A抗體製備物；以及第10道：粗過濾(bulk filtration)(BDS)之後的Ab-A抗體製備物。因為樣本經歷變性與還原條件(分別為圖7的A組和B組)，此方法可檢測出影響個別抗體鏈的組成之異常狀況，但是不能預期該方法可檢測出其他類型的異常狀況(諸如不當的化學計量、聚集作用、不當的雙硫鍵，或其他的組裝錯誤)。抗體係藉由以上所述之蛋白A親和性層析術、CHT羥磷灰石混合模式層析術，和PPG-600M疏水性作用層析法進行純化，以及來自純化方案之不同步驟的樣本係藉由SDS-PAGE分離(resolved)及藉由考馬斯(Coomassie)藍進行染色。非還原凝膠上的主要條帶係對應於所預期的完整抗體之分子量，以及還原凝膠上的主要條帶係對應於預期的 重鏈與輕鏈分子量。在各樣本中可容易觀察到數種的相關變異體，主要的產物相關變異體為低遷移率變異體(在圖7中經箭頭標示為“低遷移率產物相關變異體”)。相對於重鏈，低遷移率產物相關變異體具有較低的電泳遷移率。在抗體製備物使用蛋白A親和性層析術、CHT羥磷灰石混合模式層析術，和PPG-600M疏水性作用層析法進行純化後，此產物相關變異體的量明顯減少(參見圖7，比較電泳道3-5和電泳道7-10)。
亦使用粒徑篩析層析術來監測抗體純度。(SE-HPLC)使用具有紫外線檢測儀器的安捷倫(Agilent)(聖塔克拉拉(Santa Clara)，CA)1200系列HPLC。就樣本分離作用而言，使用Tosoh Bioscience(普魯士王市(King of Prussia)，PA)的TSKgel Guard SW x 1 6 x 40mm連接之GS3000SWx1 7.8x300mm管柱。使用pH 6.5的100mM磷酸鈉、200mM氯化鈉作為移動相，而等度模式中的流動速率為0.5mL/min，以及監測UV 215nm的吸光度。在注入樣本之前，該管柱進行平衡，直到達到穩定的基線為止。使用移動相將樣本濃度稀釋為1mg/mL，及注入體積為30μL。為監測管柱性能，使用BioRad(赫丘里斯(Hercules)，CA)凝膠過濾標準品。
表4呈現純化作用的結果。特別地，在蛋白A親和性層析術、CHT羥磷灰石混合模式層析術、PPG-600M疏水性作用層析術，以及UF/DF 30kDa過濾器調配和裝填之後，監測Ab-B產物以及低分子量(LMW)、聚集體及醣化變異體(GV)雜質。隨著每個純化方法的階段，監測到各種雜質越 來越減少的位準(%)，導致Ab-A產物具有至少98%的純度。
執行額外的方法相關的雜質監測，來定量由於包括凝集蛋白結合監測步驟的純化方法所致之宿主細胞蛋白質、殘餘的蛋白A、dsDNA及聚醣(如ß-D-葡聚糖)之清除率(clearance)。參見表5。大體說來，純化方案導致純化的抗體樣本內之雜質位準降低。
因此，包括層析術及雜質之凝集蛋白-監測的純化方法顯示出改善的抗體純度。特別地，在蛋白A親和性層析術、CHT羥磷灰石混合模式層析術及PPG-600M疏水性作用層析術之後，終產物具有大於98%的純度。
實施例2：醣蛋白的定量
此實施例說明一種結合分析以促進快速的及精確的定量蛋白質樣本內之醣蛋白。可以使用此等方法來監測及評價蛋白質表現和蛋白質純化系統之性能。此等方法可達到的速度和再現性使得幾乎即時監測可以發生。在純化作用整個期間，可以以多種方式使用此等方法，包括辨識出應該收集和選擇性并合的餾份，監測純化作用性能，以及判定是否已經達到所欲的純度位準，或是任擇地是否 應該執行額外的或修飾的純化作用來達到所欲的純度位準。同樣地，當使用來監測基因表現系統的性能時，此等方法准許回饋控制表現系統的參數，俾以達到所欲(例如，更低的)位準的醣蛋白。
使用具有生物素化的雪花草(Galanthus nivalis)凝集素之鏈黴抗生物素蛋白生物感測器來判定，與標準品相比，溶液內之醣化變異體的濃度。特別地，使用一種Octet干涉計(ForteBio，Menlo Park，CA)，其具有經生物素化的雪花草凝集蛋白(GNL[也稱為GNA]，Cat B-1245，Vector Labs，Burlingame,CA)功能化之鏈黴抗生物素蛋白生物感測器(ForteBio)，來判定與標準品相比之下，溶液內生物分子的位準。簡言之，感測器之功能化係藉由預先浸濕於1x動力緩衝液(來自Fortebio，部件編號：18-5032，以1：10稀釋倍數配於杜貝可氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝液之10X動力緩衝液)內，然後浸沒於稀釋的生物素化的GNL凝集蛋白，以及放置於搖動平臺上規定的時間長度。
用於測量法的標準品，未知物和對照物稀釋於1X動力緩衝液內，以及以適當的重複配置於黑色的微滴定平盤內。使用GNL-功能化的感測器以及如製造商(ForteBio)所說明的標準品的定量測定方法(例如蛋白A感測器)，於Octet上讀出樣本稀釋的平盤之讀數。
用ForteBio分析軟體模組來執行資料分析。評估已知樣本之標準曲線線性和再現性。井活性(Well activity)的位準就樣本的濃度/稀釋因數作適當的調整來判定質量 正規化比活度(mass-normalized specific activity)位準，稱為相對單位(RU)。
樣本儲存和處理：樣本與標準品取決於現存的穩定性資料而儲存於4℃或是-20℃。當準備測定的時候，樣本保持於冰上。動力緩衝液(Forte Bio目錄編號.18-5032，10x及1x，含有PBS+0.1% BSA，0.02%妥文20及0.05%疊氮化鈉)儲存於4℃。GNL儲存於4℃。
功能化感測器：鏈黴抗生物素蛋白感測器(Forte Bio目錄編號.18-5019，塗覆鏈黴抗生物素蛋白的96生物感測器托盤)浸泡於1x動力緩衝液內至少5分鐘。將生物素化的GNL以1/1000稀釋至1x動力緩衝液之內以獲得以下步驟中計算的體積。由10x動力緩衝液及Hyclone DPBS+Ca+Mg製備1x動力緩衝液。每井等分120ul體積的各感測器需要的動力緩衝液至半區(half area)黑色的平盤內，例如，96-Well Black Half Area Plates Medium & High Binding(Greiner Bio-One Cat 675076或VWR Cat 82050-044)。將感測器轉移至有生物素化的GNL之平盤，以及孵育平盤伴隨搖動至少30分鐘。
感測器和樣本的製備：用多道移液器(multichannel pipettor)來處理感測器且特別小心感測器的尖端，因損壞(例如刮削)此等尖端會影響測定的結果。一個介質結合的黑色平盤使用於感測器及感測器托盤。一個單獨的黑色平盤使用於樣本與標準品。每井添加150μl未知物的、對照物與標準品。可以選擇性地包括一個介質空白 (media blank)或包含有已知的醣化變異體濃度之溶液作為對照樣本。該測定之各標準品的井使用一個新的感測器。各感測器在使用之前係以1x動力緩衝液來沖洗。8個點(points)之二重的3倍稀釋系列足夠用於標準曲線。使用1x動力緩衝液來完成稀釋。也使用1x動力緩衝液作為空白樣本。
Octet條件設定如下：定量時間(s)250；搖動速度1000rpm。透過分配樣本的井與感測器來界定平盤。特別地，分配樣本的井係透過選擇對應樣本的井，以及登錄其等的身分，例如“未知物”要輸入稀釋因數，或是“標準品”要輸入已知的濃度。此測定不會重複使用感測器。該程式選擇性包括加工樣本之前的延遲及/或搖動(例如，平盤平衡達30℃同時以200RPM搖動300秒)。
一種不同的凝集蛋白，DC-SIGN(R&D Systems cat# 161-DC-050)係用LC-LC-生物素(Pierce cat #21338)予以生物素化，以及用來功能化鏈黴抗生物素蛋白感測器，該鏈黴抗生物素蛋白感測器係如以上所述使用在相似的測定中。
羥磷灰石混合模式層析術之後以及疏水性作用層析術餾份之後收集的洗提液餾份內存在之醣化蛋白質的量，係使用以上所述之Octet凝集蛋白-結合分析來定量。特別地，判定CHT羥磷灰石混合模式層析術之後收集的21個洗提液餾份之各者以及PPG-600M疏水性作用層析術之後收集的25個洗提液餾份之各者，結合至GNA及DC-SIGN之 Octet活性(RU)數值。分別見圖5，A組及圖6，A組。就分析的各餾份而言，Octet活性(RU)數值係對照相同餾份內存在之Ab-A的濃度來繪圖。就CHT餾份而言，GNA Octet數值及DC-SIGN Octet數值二者與相關的醣化變異體濃度有良好的關聯。見圖4。
根據樣本內包含的醣化變異體雜質的位準來篩選出管柱的洗提液餾份用於進一步加工，醣化變異體雜質的位準係如同使用Octet測定，利用實施例1中討論的基線并合的準則或嚴格并合的準則來判定。特別地，在嚴格并合的準則以後，篩選出CHT羥磷灰石混合模式管柱的餾份1至餾份10用於進一步加工，而按照基線并合的準則篩選出餾份1至餾份13用於進一步加工。當經由GNA-Octet測定法來判定時，與基線并合的餾份之2.3RU相比，嚴格并合的餾份具有1.9RU。在與嚴格準則集池相比之下，由Octet測定法所測量之醣化變異體雜質的含量，係和基線準則集池增加的單甘露糖、甘露二糖及甘露三糖位準有關聯(亦即，與基線集池之1.60mol單甘露糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為1.55mol單甘露糖/mol Ab-A，以及與基線集池之0.28mol甘露三糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為0.22mol甘露三糖/mol Ab-A)。見圖5，B組。
同樣地，在嚴格并合的準則以後，篩選出PPG-600M疏水性作用管柱的餾份8至餾份23用於進一步加工，而按照基線并合的準則篩選出餾份4至餾份23用於進一步加工。當經由GNA-Octet測定法來判定時，與基線并合的 餾份之1.4RU相比，嚴格并合的餾份具有1.1RU。在與嚴格準則集池相比之下，由Octet測定法所判定之醣化變異體雜質的含量，係和基線準則集池增加的單甘露糖、甘露二糖及甘露三糖位準有關聯(亦即，與基線集池之1.48mol單甘露糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為1.57mol單甘露糖/mol Ab-A；與基線集池之0.14mol甘露二糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為0.52mol甘露二糖/mol Ab-A；以及與基線集池之0.07mol甘露三糖/mol Ab-A相比，嚴格集池內為0.32mol甘露三糖/mol Ab-A)。見圖6，B組。
因此，當定量凝集蛋白結合測定法與層析純化方法組合使用時，會改善抗體產物的純度。根據凝集蛋白結合活性的位準，可以篩選不同的層析術步驟之後的特定洗提液餾份用於進一步加工，以增加所欲的抗體產物產量且使存在之不需要的雜質減到最少。
實施例3：Ab-B純化作用及回收
此實施例闡明在巴斯德畢赤酵母菌內產生的重組型抗體的純度，係藉由使用一系列初期回收和層析純化方法而改善。圖1顯示該純化方法之綜述。可以使用此等方法來純化以及回收不同系統中表現的各種抗原專一性抗體。
培養巴斯德畢赤酵母菌細胞，其含有編碼Ab-B重鏈與輕鏈(對應於如US 20120294797中列出的序列辨識編號：681與序列辨識編號：701，其等完整地併入以作為參考資料)之穩定地併入的序列，以及誘導抗體的表現。
以達3mM的最終濃度之乙二胺四乙酸(EDTA)以及用一種絮凝劑，來處理全肉湯。藉由離心收穫的肉湯，接著藉由通過深度過濾器和0.2μm過濾器之澄清作用來移除細胞及絮凝的碎屑。
將澄清的肉湯施加至一種MabSelect SuRe樹脂管柱，以藉由蛋白A親和性層析術來捕獲Ab-B。於環境溫度下執行層析術。用0.1M氫氧化鈉來消毒23cm床高度的管柱，以及然後在加載之前，用20mM磷酸鈉、150mM氯化鈉，pH 6.0的緩衝液(“Pr A平衡緩衝液”)予以平衡。以250cm/hr的線速度來裝載管柱成為每公升樹脂不超過25g Ab-B的目標能量，然後從頭到尾以同樣的線速度操作。在應用裝載以後，用3管柱體積(CV)之捕獲平衡緩衝液來沖洗管柱，以移去結合鬆散的材料。接而用3CV之1M精胺酸，pH 4.0洗提緩衝液(“PrA洗提緩衝液”)使結合的Ab-B解吸。監測流出物的OD280，以及收集前部側面處的1OD至後部側面處的1OD的洗提液。將洗提液收集至預裝載0.15CV的1M Tris，pH 8.0中和緩衝液(“PrA中和緩衝液”)的容器內。在收集以後，混合容器的內含物及判定其之pH值，優先依需要使用5%鹽酸或1M氫氧化鈉將pH最終調整為pH 6.5。經中和的洗提液係以0.2μm予以過濾，接而發送進行羥磷灰石層析術步驟。在產物洗提以後，用3CV之0.2M氫氧化鈉予以潔淨，以及在儲存20%乙醇內之前，用3CV之平衡緩衝液予以沖洗。
Ab-B的中間物純化作用係使用陶瓷羥磷灰石 (CHT，第I型，40μm)樹脂之混合模式層析術。從頭到尾於環境溫度下以及以不超過200cm/hr的線速度來進行此步驟。在進行之前，使用3CV的1M氫氧化鈉來消毒管柱，以及用至少3CV 5mM磷酸鈉、pH6.5的平衡緩衝液(“CHT平衡緩衝液”)予以平衡。藉由稀釋經過濾的、用CHT平衡緩衝液中和的捕獲洗提液成傳導度不超過4mS/cm，來製備CHT裝載物。然後CHT裝載物在通經放置於該管柱前的0.2μm過濾器之後，施用於該平衡管柱。在裝載以後，管柱係用5CV的平衡緩衝液予以清洗，然後用20CV的線性梯度5mM至0.25M磷酸鈉，pH 6.5(“CHT洗提緩衝液2”)來洗提。監測流出物的OD280，以及由前部側面處的0.1OD至後部側面處的0.1OD處收集一系列~½CV的餾份。分析餾份的純度，以及合併一組連續的餾份以達到所欲的純度及減少的醣化變異體含量之CHT集池(參見圖8)。在洗提之後，CHT管柱係用5CV 500mM磷酸鈉，pH 6.5剝離緩衝液(“CHT剝離緩衝液”)予以剝離，在適當的地方用5CV 1M氫氧化鈉來潔淨，以及用5CV20%乙醇的儲存溶液來沖洗。
Ab-B之精純純化作用(Polish purification)使用苯基高效能(GE Healthcare)樹脂之疏水性作用層析術(HIC)。此步驟從頭到尾於環境溫度下進行以及用不超過200cm/hr的線速度來進行。在進行之前，使用3CV的1M氫氧化鈉來消毒管柱，以及用5CV 20mM磷酸鈉、0.7M硫酸鈉，pH 7.0(“HIC平衡緩衝液”)予以平衡。藉由使用20mM磷酸鈉、1.1M硫酸鈉，pH 7.0的HIC稀釋緩衝液，來調整經0.2μm 過濾的CHT集池成為傳導度77.5mS/cm，來製備HIC裝載物。然後HIC裝載物在通經0.2μm過濾器之後，施用於該平衡管柱。在裝載以後，管柱係用5CV的HIC平衡緩衝液來清洗，然後用20CV的0-100%線性梯度的20mM磷酸鈉，pH 7.0(“HIC洗提緩衝液”)來洗提。監測流出物的OD280，以及由前部側面處的0.1OD至後部側面處的0.1OD收集一系列~1/3rd CV的餾份。分析餾份的純度(參見圖9)，以及合併一組連續的餾份以形成具有所欲的純度及減少的醣化變異體含量之HIC集池。(參見圖8及圖9)。在洗提之後，HIC管柱係用4CV HIC洗提緩衝液予以剝離，在適當的地方用3CV的1M氫氧化鈉來潔淨，以及轉移至0.1M氫氧化鈉儲存溶液內。
Ab-B(見圖10)製備物中的產物變異體顯現在蛋白質凝膠上。於兩個凝膠中，第1道、第2道、第6道含有分子量標誌；第3道含有蛋白A洗提液；第4道含有CHT集池；以及第5道含有HIC集池。因為樣本經歷變性與還原條件(分別為圖10的A組和B組)，此方法可檢測出影響個別抗體鏈的組成之異常狀況，但是不能預期該方法可檢測出其他類型的異常狀況(諸如不當的化學計量、聚集作用、不當的雙硫鍵，或是其他的組裝錯誤)。抗體係藉由以上所述之蛋白A親和性層析術、CHT羥磷灰石混合模式層析術，和苯基瓊脂糖凝膠高效能(Phenyl-Sepharose High Performance)(HP)疏水性作用層析術進行純化，以及來自純化方案之不同步驟的樣本係藉由SDS-PAGE分離(resolved)及藉由考馬斯 (Coomassie)藍進行染色。非還原凝膠上的主要條帶係對應於所預期的完整抗體之分子量，以及還原凝膠上的主要條帶係對應於預期的重鏈與輕鏈分子量。在各樣本中可以容易觀察到數種的相關變異體，主要的產物相關變異體為低遷移率變異體(在圖10中經箭頭標示為“低遷移率產物相關變異體”)。相對於重鏈，低遷移率產物相關變異體具有較低的電泳遷移率。在抗體製備物使用蛋白A親和性層析術、CHT羥磷灰石混合模式層析術，以及苯基HP疏水性作用層析術進行純化後，此產物相關變異體的量明顯減少(參見圖10，比較電泳道4-5和電泳道3)。
亦使用粒徑篩析層析術來監測抗體純度。(SE-HPLC)使用具有紫外線檢測儀器的安捷倫(Agilent)(聖塔克拉拉(Santa Clara)，CA)1200系列HPLC。就樣本分離作用而言，使用Tosoh Bioscience(普魯士王市(King of Prussia)，PA)的TSKgel Guard SW x 1 6 x 40mm連接之GS3000SWx1 7.8x300mm管柱。使用pH 6.5的100mM磷酸鈉、200mM氯化鈉作為移動相，而等度模式中的流動速率為0.5mL/min，以及監測UV 215nm的吸光度。在注入樣本之前，該管柱進行平衡，直到達到穩定的基線為止。使用移動相將樣本濃度稀釋為1mg/mL，及注入體積為30μL。為監測管柱性能，使用BioRad(赫丘里斯(Hercules)，CA)凝膠過濾標準品。
表6呈現純化的結果。特別地，在蛋白A親和性層析術、CHT羥磷灰石混合模式層析術、苯基HP疏水性作用層析術進行之後，監測Ab-B產物以及低分子量(LMW)、 聚集體及醣化變異體(GV)雜質。隨著每個純化方法的階段，監測到各種雜質越來越減少的位準(%)，導致Ab-B產物具有至少95%的純度。
執行額外的方法相關的雜質監測，以定量由於包括凝集蛋白結合監測步驟的純化方法所致之宿主細胞蛋白質、殘餘的蛋白A、dsDNA及聚醣(如ß-D-葡聚糖)之清除率(clearance)。參見表7。大體說來，純化方案導致純化的抗體樣本內之雜質位準降低。
因此，層析純化法顯示出改善的抗體純度。特別地，在蛋白A親和性層析術、CHT羥磷灰石混合模式層析術以及苯基HP疏水性作用層析術之後，終產物具有大於95%的純度。另外，有關方法的中間物執行的凝集蛋白結合測定法證明了描述的純化方法導致帶有降低的GNA結合活性之純化的Ab-B(見，圖8)。於HIC餾份集池執行之凝集蛋白結合測定法證明經由排阻其他具有更高的GNA結合活性之餾份，選擇適當的HIC洗提液餾份來組合，可以導致帶有降低的GNA結合活性之HIC集池(見，圖9)。
實施例4：Ab-C Fab純化作用及回收
此實施例證明本文中所揭露的凝集蛋白結合測定法可以用來檢測巴斯德畢赤酵母菌內產生的重組型抗體 片段之醣化雜質。
培養巴斯德畢赤酵母菌細胞，其含有編碼Ab-C Fab之穩定地併入的序列，以及誘導該抗體片段的表現。任擇地，可以經由蛋白水解全長的Ab-C表現的抗體而以化學方式來產生該Ab-C Fab。
簡言之，澄清的培養懸浮液接觸低pH值和低傳導度的混合模式樹脂，進行清洗，然後用梯度策略來洗提，其同時使用提高的pH和傳導度。監測洗提的餾份之品質，以及并合適當的餾份且進行緩衝液交換成最終的緩衝液。特別地，使用以上所述之GNA凝集蛋白測定法來監測餾份的醣化雜質(RU)。
亦使用粒徑篩析層析術來監測抗體片段的純度。(SE-HPLC)使用具有紫外線檢測儀器的安捷倫(Agilent)(聖塔克拉拉(Santa Clara)，CA)1200系列HPLC。就樣本分離作用而言，使用Tosoh Bioscience(普魯士王市(King of Prussia)，PA)的TSKgel Guard SW x 1 6 x 40mm連接之GS3000SWx1 7.8x300mm管柱。使用pH 6.5的100mM磷酸鈉、200mM氯化鈉作為移動相，而等度模式中的流動速率為0.5mL/min，以及監測UV 215nm的吸光度。在注入樣本之前，該管柱進行平衡，直到達到穩定的基線為止。使用移動相將樣本濃度稀釋為1mg/mL，以及注入體積為30μL。為監測管柱性能，使用BioRad(赫丘里斯(Hercules)，CA)凝膠過濾標準品。
表8呈現純化的結果。特別地，在使用粒徑篩析 層析術之混合模式層析術進行之後，監測Ab-C Fab產物以及低分子量(LMW)、聚集體及醣化變異體(GV)雜質。此外，使用GNA凝集蛋白測定法來偵測經醣化的雜質。純化作用導致Ab-C Fab產物具有大約90%的純度。
因此，包括層析術及雜質之凝集蛋白-監測的純化方法顯示出Fab抗體片段的純度。特別地，在混合模式層析術之後，終產物具有大於90%的純度。
本發明所述各種具體例之上述說明，並非意欲窮舉或將本發明侷限於所揭露的確切形式。在此係為了說明之目的而陳述本發明的特定具體例及用於本發明的實施例，嫻熟相關技藝者所認出之各種等效修飾，在本發明的範圍內皆屬可能。本文所提供關於本發明的教示可應用在上述實施例以外的其他目的。
可用特別描述於前述說明與實例中的該等方式以外之其他方式，來實施本發明。鑑於上述教導，可能進行本發明的眾多修飾與變化，以及因此其等係落於所附申請專利範圍的範疇之內。
鑑於上述詳細說明，可在本發明進行該等與其他改變。一般而言，在下列申請專利範圍中，所用術語不應被解釋將本發明侷限於說明書與申請專利範圍中所揭露的特定具體例。因此，本發明並非受限於揭露內容，本發明的範圍完全由下列申請專利範圍所決定。
有關於獲得抗原專一性B細胞殖株種群的方法之特定的教示，係揭露於2006年5月19日提出申請之美國臨時專利申請案第60/801,412號，以及美國專利申請案第2012/0141982號之內，其等之揭露內容在此完整地併入本案以作為參考資料。
有關於兔衍生型單株抗體的人類化作用及用以維持抗原結合親和性之較佳的序列修飾作用之特定的教示，係揭露於國際申請案第PCT/US2008/064421號之內，其係對應於2008年5月21日提出申請之國際公開案第WO/2008/144757號，以及標題為“Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies”，其之揭露內容在此完整地併入本案以作為參考資料。
有關於使用配對的勝任酵母菌來生產抗體或其片段相關之特定的教示及對應的方法，係揭露於2006年5月8日提出申請之美國專利申請案第11/429,053號(美國專利申請公開案US 2006/0270045)之內，其之揭露內容在此完整地併入本案以作為參考資料。
在本發明背景、概要、詳細說明以及實施例中所引述各文獻的完整揭露內容(包括專利、專利申請案、期刊 文章、摘要、手冊、書籍或是其他的揭露內容)，係在此完整地併入本案以作為參考資料。

Claims (11)

  1. 一種用於生產一所欲的重組型抗體多肽及從發酵培養基純化該所欲的重組型抗體多肽之發酵方法，其中該方法包括：(i)實施一或多個發酵過程或運轉，其各包含於導致該所欲的重組型抗體多肽及一或多個雜質表現及分泌至該發酵培養基內之條件下培養複數個酵母菌細胞；(ii)隨著各發酵過程進行或是在實施不同的發酵運轉之後，週期性地取得該發酵培養基的一個或是多個樣本；(iii)使用結合至經醣化之雜質的凝集蛋白來偵測該(等)樣本內該經醣化之雜質的量及/或種類；(iv)當該發酵過程或運轉正在實施時，以該(等)樣本內所偵測到的經醣化之雜質的量為基礎來修改一或多個該發酵過程或運轉的一個或多個操作參數或條件，其中該操作參數或條件係選自於以下所構成之群組：溫度、pH、氣體成分、進料成分、攪拌、充氣、防沫劑(antifoam)及持續期間；以及(v)當該發酵過程或運轉正在實施時，以在不同的樣本、其洗提液或餾份(fraction)中所偵測到之經醣化的雜質之量及/或種類相對於該所欲的重組型抗體多肽的量為基礎，并合來自相同或不同的發酵過程或運轉之含有該所欲的重組型抗體多肽之該不同的樣本、其洗提液或餾份。
  2. 如請求項1之方法，其中(i)該雜質為O-連結型醣化作用的結果，(ii)該偵測步驟之進行係使用至少一個選自於以下的凝集蛋白：ConA、LCH、GNA或GNL、RCA、DC-SIGN、L-SIGN、PNA、AIL、VVL、WGA、SNA、MAL、MAH、UEA及AAL，及/或至少一個選自於以下的凝集蛋白：PNA、SBA、PWM、PEA、PTA、ML-I-III、LEA、UDA、WGA、PHA、LTA、BSI-B4、MPA、RCA、LCA、ECA、AAA、DBA、GSL-I、PSA、SJA、DSL、ECL、GSL-II、AIA/木菠蘿素凝集蛋白(Jacalin)、LEL、STL、HHL、LCA、NPL、ACL、ECL、EEL、MAL-I、AAL、LTL、BPL、MPL、PTL、SNA、DGL、SJA、VVA、LEA、STA、DSA、MMR、DEC-205、戴克丁1(Dectin 1)、戴克丁2、蘭格素(Langerin)，或是BDCA-2，其選擇性地可以結合至一撐體，(iii)該偵測步驟使用一種蛋白質-蛋白質交互作用監測方法，其中該蛋白質-蛋白質交互作用監測方法利用光干涉術、雙偏極化干涉術、靜態光散射、動態光散射、多角度光散射、表面電漿子共振、ELISA、化學發光ELISA、遠西方墨點轉漬法(far western)或電化學發光(electroluminescence)，或是(iv)(i)-(iii)之任何組合。
  3. 如請求項1之方法，其中該操作參數或條件係選自於該等操作參數或條件的至少兩者。
  4. 如請求項1之方法，其中該經醣化之雜質為該重組型抗體多肽之醣化變異體(glycovariant)且該重組型抗體多肽為一全長抗體或抗體片段。
  5. 如請求項1之方法，其中該酵母菌細胞是巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)，其表現一抗體或抗體片段。
  6. 如請求項1之方法，其進一步包括從該發酵培養基回收或純化該重組型抗體多肽。
  7. 如請求項6之方法，其中該純化步驟包含：(i)使該(等)樣本接觸至少一個層析撐體且篩選性洗提該所欲的重組型抗體多肽，(ii)以偵測到的經醣化之雜質的量及/或種類為基礎，并合含有該所欲的重組型抗體多肽之不同的樣本或其洗提液或餾份，(iii)以所偵測到之經醣化的雜質之量及/或種類相對於該所欲的重組型抗體多肽的量為基礎，并合含有該所欲的重組型抗體多肽之不同的樣本或其洗提液或餾份，或(iv)上述(i)-(iii)之任何組合。
  8. 如請求項1之方法，其進一步包含使用粒徑篩析層析術(size exclusion chromatography)來偵測步驟(iii)之該(等)樣本內聚集及/或崩解(disaggregated)的雜質的量，並修改一或多個該發酵過程或運轉的一個或多個操作參數或條件，其中該操作參數或條件係選自於溫度、pH、氣體成分、進料成分、攪拌、充氣、防沫劑以及持續期間。
  9. 如請求項1之方法，其中該重組型抗體多肽是一抗體或抗體片段，其為單價、二價或多價。
  10. 如請求項1之方法，其中該重組型抗體多肽為一抗體或抗體片段，其專一性地結合至IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、CBP、血管收縮素、Nav1.7、Nav1.8、VEGF、PDGF、EPO、EGF、FSH、TSH、hCG、CGRP、NGF、TNF、HGF、BMP2、BMP7、PCSK9或HRG。
  11. 如請求項1之方法，其中步驟(v)中之該經醣化的雜質係選自於以下所構成之群組：(i)包含少於10%的醣化變異體之樣本、其洗提液或餾份；(ii)包含少於5%的醣化變異體之樣本、其洗提液或餾份；(iii)包含少於1%的醣化變異體之樣本、其洗提液或餾份；及(iv)包含少於0.5%的醣化變異體之樣本、其洗提液或餾份。
TW103109933A 2013-03-15 2014-03-17 抗體純化及純度監測 TWI670279B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361792935P 2013-03-15 2013-03-15
US61/792,935 2013-03-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201514195A TW201514195A (zh) 2015-04-16
TWI670279B true TWI670279B (zh) 2019-09-01

Family

ID=51538079

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW103109933A TWI670279B (zh) 2013-03-15 2014-03-17 抗體純化及純度監測
TW108108923A TW201940691A (zh) 2013-03-15 2014-03-17 抗體純化及純度監測

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108108923A TW201940691A (zh) 2013-03-15 2014-03-17 抗體純化及純度監測

Country Status (8)

Country Link
US (3) US9518082B2 (zh)
EP (2) EP3754012A1 (zh)
JP (1) JP6472786B2 (zh)
AR (1) AR095615A1 (zh)
CA (1) CA2905531C (zh)
ES (1) ES2834113T3 (zh)
TW (2) TWI670279B (zh)
WO (1) WO2014145744A1 (zh)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9062106B2 (en) 2011-04-27 2015-06-23 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
CA2905010A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US10023608B1 (en) 2013-03-13 2018-07-17 Amgen Inc. Protein purification methods to remove impurities
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
WO2014145744A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibody purification and purity monitoring
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US20170198059A1 (en) * 2014-07-14 2017-07-13 Amgen Inc. Crystalline antibody formulations
CN107148283A (zh) * 2014-10-31 2017-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 抗il‑17a和il‑17f交叉反应性抗体变体、包含其的组合物及其制备和使用方法
EP3344643A4 (en) 2015-09-04 2019-05-01 Qiagen Sciences LLC METHODS FOR CO-ISOLATION OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS
GB2565664A (en) * 2016-03-07 2019-02-20 Hitachi Chemical Advanced Therapeutics Solutions Llc A closed system for labelling and selecting live cells
JP2019515671A (ja) 2016-04-15 2019-06-13 アルダー バイオファーマシューティカルズ、インコーポレイテッド 抗ｐａｃａｐ抗体及びそれらの使用
BR112019000872A2 (pt) 2016-08-16 2019-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. métodos para quantificar anticorpos individuais de uma mistura
CN106293544B (zh) * 2016-08-29 2020-06-30 成都科鸿达科技有限公司 一种高效大规模***的ltl模型检测方法
CN106371765B (zh) * 2016-08-29 2020-09-18 成都科鸿达科技有限公司 一种高效大规模***的ltl模型检测去内存抖动的方法
SG11201902667UA (en) 2016-10-25 2019-05-30 Regeneron Pharma Methods and systems for chromatography data analysis
JP6829357B2 (ja) * 2017-03-17 2021-02-10 住友ベークライト株式会社 抗体の糖鎖検出法
CN107033236B (zh) * 2017-05-05 2021-03-23 浙江大学 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法
CN107254502A (zh) * 2017-07-26 2017-10-17 兰州名德农牧科技有限公司 一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法
WO2019040671A1 (en) * 2017-08-22 2019-02-28 Biogen Ma Inc. METHODS OF PURIFYING ANTIBODIES HAVING REDUCED AGGREGATES OF HIGH MOLECULAR WEIGHT
EP3774840A1 (en) * 2018-03-27 2021-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Real-time monitoring of protein concentration using ultraviolet signal
EP3781941A1 (en) * 2018-04-20 2021-02-24 Janssen Biotech, Inc. Chromatography column qualification in manufacturing methods for produring anti-tnf antibody compositions
GB201806752D0 (en) * 2018-04-25 2018-06-06 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method in bioprocess system
TW202005694A (zh) 2018-07-02 2020-02-01 美商里珍納龍藥品有限公司 自混合物製備多肽之系統及方法
MX2021009264A (es) * 2019-01-30 2021-08-24 Regeneron Pharma Metodo de caracterizacion de particulas visibles y/o subvisibles en agentes biologicos.
JP2022548982A (ja) * 2019-09-23 2022-11-22 ジェンザイム・コーポレーション 生成物品質特性測定
CN111239408B (zh) * 2020-01-19 2023-02-10 深圳格道糖生物技术有限公司 特定凝集素组合在构建基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝纤维化的测试工具方面的应用
WO2021150996A1 (en) * 2020-01-24 2021-07-29 Amgen Inc. Methods for harvesting biomolecules
JP2020099909A (ja) * 2020-03-17 2020-07-02 ＨＯＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｓｕｒｇｉｃａｌ株式会社 処理方法、生産方法およびハイドロキシアパタイト充填剤
EP4142792A1 (en) * 2020-05-01 2023-03-08 Kashiv Biosciences, LLC An improved process of purification of protein
CN111579777B (zh) * 2020-05-29 2024-02-02 江苏省苏微微生物研究有限公司 一种以大粒径凝胶为载体的亲和介质及其应用
JP2023550372A (ja) * 2020-11-18 2023-12-01 モデルナティエックス インコーポレイテッド リボ核酸の精製
GB202105559D0 (en) * 2021-04-19 2021-06-02 Cytiva Bioprocess R & D Ab Method of clarifying a crude protein solution
CN117279929A (zh) * 2021-05-10 2023-12-22 凯奥目生物科学株式会社 抗体组合物的纯化方法
CN113416243B (zh) * 2021-08-23 2021-12-10 上海盛迪医药有限公司 一种纯化抗体的方法
CN114279968A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 中国科学院长春应用化学研究所 一种电化学-双偏振干涉光电检测池

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013028635A1 (en) * 2011-08-19 2013-02-28 Alderbio Holdings Llc Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as a antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4855231A (en) 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US4818700A (en) 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4812405A (en) 1986-02-18 1989-03-14 Phillips Petroleum Company Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation
US4929555A (en) 1987-10-19 1990-05-29 Phillips Petroleum Company Pichia transformation
WO1994021293A1 (en) 1993-03-19 1994-09-29 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
US5429746A (en) * 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
IL114909A (en) 1994-08-12 1999-10-28 Immunomedics Inc Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5955349A (en) 1996-08-26 1999-09-21 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
US6730499B1 (en) 1998-07-03 2004-05-04 Research Corporation Technologies, Inc. Promoter for the Pichia pastoris formaldehyde dehydrogenase gene FLD1
US6258559B1 (en) 1999-03-22 2001-07-10 Zymogenetics, Inc. Method for producing proteins in transformed Pichia
US20030091976A1 (en) 2001-11-14 2003-05-15 Ciphergen Biosystems, Inc. Methods for monitoring polypeptide production and purification using surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry
JPWO2004087761A1 (ja) * 2003-03-31 2006-07-27 麒麟麦酒株式会社 ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製
WO2004090549A1 (en) * 2003-04-11 2004-10-21 Novozymes A/S Method of screening for secreted glycosylated polypeptides
ES2393555T3 (es) 2003-10-22 2012-12-26 Keck Graduate Institute Métodos para la síntesis de polipéptidos hetero-multiméricos en levaduras usando una estrategia de apareamiento haploide.
KR101482791B1 (ko) * 2005-03-11 2015-01-21 와이어쓰 엘엘씨 약한 분배성 크로마토그래피법
AU2007307324B2 (en) 2006-05-19 2013-08-15 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Culture method for obtaining a clonal population of antigen-specific B cells
AU2007294122B2 (en) * 2006-09-10 2013-03-07 Glycotope Gmbh Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
ES2474940T3 (es) * 2006-12-28 2014-07-10 Janssen Biotech, Inc. Métodos y vectores que generan inmunoglobulinas sialiladas
DK2508612T3 (en) * 2007-04-03 2018-01-22 Oxyrane Uk Ltd Glycosylation of molecules
KR101615715B1 (ko) 2007-05-21 2016-04-27 앨더바이오 홀딩스 엘엘씨 Ｉｌ-６에 대한 항체 및 이의 용도
EP2162469A4 (en) 2007-05-21 2012-08-01 Alderbio Holdings Llc NEW METHODS OF HUMANIZING RABBIT ANTIBODIES AND HUMANIZED RABBIT ANTIBODIES
JP2010536355A (ja) * 2007-08-31 2010-12-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー グリコシル化プロファイル分析
EP2490780A4 (en) * 2009-10-20 2014-04-09 Merck Sharp & Dohme USE OF MIXED MODE CHROMATOGRAPHY FOR CAPTURE AND PURIFICATION OF BASIC ANTIBODY PRODUCTS
CN103038247A (zh) * 2010-05-18 2013-04-10 Abbvie公司 蛋白质提纯的装置和方法
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
CN108424452B (zh) 2011-05-20 2021-08-03 H.伦德贝克公司 抗cgrp组合物及其用途
EP2734537B1 (en) * 2011-07-20 2022-12-21 Zepteon, Incorporated Polypeptide separation methods
US10150968B2 (en) 2011-08-19 2018-12-11 Alderbio Holdings Llc Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
WO2013066707A1 (en) * 2011-10-31 2013-05-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Chromatography process for resolving heterogeneous antibody aggregates
US9249182B2 (en) * 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
WO2014145744A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibody purification and purity monitoring

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013028635A1 (en) * 2011-08-19 2013-02-28 Alderbio Holdings Llc Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as a antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014145744A1 (en) 2014-09-18
EP3754012A1 (en) 2020-12-23
EP2970865A1 (en) 2016-01-20
US9518082B2 (en) 2016-12-13
US20140288272A1 (en) 2014-09-25
EP2970865A4 (en) 2016-11-09
US20170137500A1 (en) 2017-05-18
EP2970865B1 (en) 2020-09-02
TW201514195A (zh) 2015-04-16
US10533045B2 (en) 2020-01-14
ES2834113T3 (es) 2021-06-16
US20200223913A1 (en) 2020-07-16
AR095615A1 (es) 2015-10-28
JP2016512848A (ja) 2016-05-09
CA2905531C (en) 2023-01-03
TW201940691A (zh) 2019-10-16
JP6472786B2 (ja) 2019-02-20
CA2905531A1 (en) 2014-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI670279B (zh) 抗體純化及純度監測
JP5931255B2 (ja) 免疫グロブリン溶液を精製するための方法
AU2014247034B2 (en) A method for increasing pyro-glutamic acid formation of a protein
CN102712673B (zh) 用于纯化含fc的蛋白的色谱方法
US20180142038A1 (en) Anti-glycoprotein antibodies and uses thereof
CN105073769B (zh) 利用基于a蛋白的色谱增加蛋白纯度的方法
WO2004024752A1 (ja) タンパク質精製方法
CN103814044A (zh) 纯化fc-融合蛋白的方法
WO2002072615A1 (fr) Methode de purification de proteines
EP3196646B1 (en) Methods of mapping protein variants
KR101642551B1 (ko) 칼슘인산염 침전을 이용한 불순물 제거 방법
CN111153993A (zh) 抗TNF-α单克隆抗体的制备方法
Grzeskowiak 2-D DIGE to facilitate downstream process development for recombinant therapeutic antibodies