ES2834113T3 - Purificación de anticuerpos y monitorización de la pureza - Google Patents

Abstract

Un proceso de fermentación para producir un polipéptido recombinante deseado y purificar el polipéptido recombinante deseado del medio de fermentación, en donde el proceso incluye: (i) cultivar células o microbios huésped en condiciones que den como resultado la expresión y secreción del polipéptido recombinante y una o más impurezas en el medio de fermentación; (ii) obtener periódicamente una o más muestras del medio de fermentación a medida que avanza el proceso de fermentación o después de que se realicen diferentes ciclos de fermentación; (iii) detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en la o las muestras usando una lectina que se une a dichas impurezas glicosiladas, y (iv) en función de la cantidad de impurezas glicosiladas detectadas en la o las muestras, modificar uno o más de los parámetros de operación o condiciones del proceso de fermentación, en donde las células o microbios huésped son levaduras u hongos filamentosos, en donde el polipéptido recombinante es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en donde en función de la cantidad de impurezas glicosiladas detectadas, se altera uno o más de los siguientes parámetros o condiciones del proceso de fermentación: temperatura, pH, constituyente gaseoso, constituyente de alimentación, agitación, aireación, antiespumante y duración, en donde el proceso incluye además recuperar o purificar el polipéptido recombinante del medio de fermentación, y en donde el proceso de purificación comprende además la combinación de diferentes muestras o eluatos o fracciones de los mismos que contienen el polipéptido recombinante deseado en función de la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas detectadas en relación con la cantidad del polipéptido recombinante deseado.

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de anticuerpos y monitorización de la pureza

Descripción de solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE. UU. No. de Ser. 61/792.935, presentada el 15 de marzo de 2013.

Campo de la invención

La presente descripción se refiere generalmente a procesos para producir y purificar polipéptidos recombinantes. En particular, la presente descripción proporciona procesos para producir y purificar polipéptidos homopoliméricos o heteropoliméricos expresados en células de levaduras o de hongos filamentosos usando ensayos de unión a lectina para monitorizar las impurezas glicosiladas. Como resultado, el proceso de fermentación y/o el método de purificación puede ajustarse para maximizar la cantidad de proteína recombinante deseada y minimizar la cantidad de impurezas glicosiladas y otras impurezas asociadas al producto no deseadas, tales como agregados y ácidos nucleicos. En realizaciones ejemplares, las proteínas recombinantes son proteínas con múltiples subunidades, tales como anticuerpos, la célula huésped es una levadura, tal como Pichia pastoris, y la impureza glicosilada es una glicovariante del polipéptido recombinante deseado, tal como una glicovariante unida por N y/o unida por O.

Antecedentes

La purificación económica a gran escala de proteínas es una preocupación cada vez más importante en la industria de la biotecnología. Generalmente, las proteínas se producen mediante cultivo celular usando líneas celulares procariotas, p. ej., bacterianas, o eucariotas, p. ej., de mamíferos o fúngicas, preparadas por ingeniería para producir la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que comprende el gen de esa proteína. Dado que las líneas celulares usadas son organismos vivos, deben alimentarse con un medio de crecimiento complejo, que comprende azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, a veces suministrados a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína recombinante deseada de la mezcla de compuestos alimentados a las células y de los subproductos generados por las propias células hasta una pureza suficiente para su uso como agente terapéutico humano plantea un desafío formidable.

Las proteínas multiméricas, p. ej., homopoliméricas y heteropoliméricas, representan uno de los niveles más complejos de organización estructural en las moléculas biológicas. Las cadenas polipeptídicas constituyentes no solo tienen que plegarse (en estructuras secundarias y dominios terciarios), sino que también deben formar interfaces complementarias que permitan interacciones entre subunidades estables. Estas interacciones son altamente específicas y pueden darse entre subunidades idénticas o entre subunidades diferentes.

En particular, los anticuerpos convencionales son proteínas tetraméricas compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos humanos puros de un tipo específico pueden ser difíciles de purificar a partir de fuentes naturales en cantidades suficientes para muchos propósitos. Como consecuencia, las empresas farmacéuticas y de biotecnología han recurrido a métodos basados en ADN recombinante para preparar anticuerpos a gran escala. Actualmente, hay cientos de anticuerpos monoclonales (mAb) terapéuticos en el mercado o en desarrollo. La producción de anticuerpos funcionales (incluyendo los fragmentos de anticuerpos que retienen la especificidad de antígeno y a menudo muestran una funcionalidad y propiedades físico-químicas mejoradas) generalmente implica la síntesis de los dos polipéptidos, así como una serie de eventos postraduccionales, incluyendo el procesamiento proteolítico de la secuencia señal de secreción N-terminal; plegamiento y ensamblaje apropiados de los polipéptidos en tetrámeros; formación de enlaces disulfuro; y típicamente incluye una glicosilación unida a N específica.

Además, las citoquinas, como reguladores pleiotrópicos que controlan la proliferación, la diferenciación y otras funciones celulares de los sistemas inmune y hematopoyético, tienen un uso terapéutico potencial para un amplio rango de enfermedades infecciosas y autoinmunes. Al igual que los anticuerpos, los métodos de expresión recombinante se usan a menudo para expresar citoquinas recombinantes para su uso posterior en aplicaciones de investigación y farmacéuticas.

La síntesis recombinante de dichas proteínas se ha basado típicamente en cultivos de células eucariotas superiores para producir material biológicamente activo, siendo las células de mamífero cultivadas las que se usan muy comúnmente. Sin embargo, los sistemas de producción basados en cultivos de tejidos de mamíferos incurren en un coste significativo añadido y complicaciones en relación con los métodos de fermentación microbiana. Además, los productos derivados del cultivo de células de mamíferos pueden requerir ensayos de seguridad adicionales para garantizar la ausencia de patógenos de mamíferos (incluyendo virus) que podrían estar presentes en las células cultivadas o productos derivados de animales usados en el cultivo, tal como el suero.

Los trabajos previos han ayudado a establecer la levadura Pichia pastoris como una plataforma rentable para producir anticuerpos funcionales que son potencialmente adecuados para su uso en investigación, diagnóstico y terapéutico. Véanse las Patentes de EE. UU. en copropiedad 7.935.340; 7.927.863 y 8.268.582).También se conocen métodos en la bibliografía para el diseño de fermentaciones de P. pastoris para la expresión de proteínas recombinantes, habiéndose descrito la optimización con respecto a parámetros que incluyen la densidad celular, el volumen del caldo, la velocidad de alimentación del sustrato y la duración de cada fase de la reacción. Véase, Zhang et al., "Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations" en Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2a edición), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., pág. 43-63. Véase también, US 20130045888, titulada MULTI-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH- PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS; y US 20120277408, titulada HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS.

Aunque se pueden producir proteínas recombinantes a partir de células cultivadas, también se pueden producir subproductos no deseados. Por ejemplo, las células cultivadas pueden producir la proteína deseada junto con proteínas que tienen una glicosilación no deseada o aberrante. Además, las células cultivadas pueden producir proteínas con múltiples subunidades junto con monómeros libres y complejos que tienen una estequiometría incorrecta. La purificación de la proteína con múltiples subunidades deseada puede aumentar el coste de la producción y las etapas implicadas en la purificación pueden disminuir el rendimiento total del complejo deseado. Además, incluso después de la purificación, pueden estar presentes subproductos no deseados en cantidades que causan preocupación. Por ejemplo, los subproductos glicosilados pueden estar presentes en cantidades que aumentan el riesgo de una reacción inmune después de la administración y pueden afectar de manera adversa propiedades tales como la estabilidad, la semivida y la actividad específica, mientras que los complejos o agregados aberrantes pueden disminuir la actividad específica y también pueden ser potencialmente inmunogénicos.

WO 2013/028635 A1 describe una estrategia de copias múltiples para la producción de alta pureza y títulos altos de proteínas con múltiples subunidades, tales como anticuerpos en microbios transformados, tales como Pichia Pastoris. WO 2009/027041 A1 describe el análisis del perfil de glicosilación. Sutton et al. (Journal of Biological Standardization, 1989, 17, 65-74) describe la purificación y secuenciación de variantes de glicosilación de BSF-1, como un MAF, a partir de la línea celular de leucemia EL-4. WO 03/042233 A2 describe métodos para monitorizar la producción y purificación de polipéptidos usando espectroscopía de masa con desorción/ionización por láser aumentada en superficie.

Resumen

La presente invención se define por las reivindicaciones. Cualquier contenido que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo.

La invención proporciona un proceso para purificar un polipéptido recombinante deseado a partir de una o más muestras resultantes de un proceso de fermentación que comprende cultivar una célula o microbio deseado en condiciones que dan como resultado la expresión y secreción del polipéptido recombinante y una o más impurezas en el medio de fermentación; en donde el proceso de purificación incluye detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en la o las muestras usando una lectina que se une a dichas impurezas glicosiladas, tal como una glicovariante del polipéptido recombinante deseado resultante, p. ej., de la glicosilación unida a O y/o la glicosilación unida a N.

En una realización, el proceso de purificación comprende opcionalmente además poner en contacto la o las muestras con al menos un soporte cromatográfico y eluir selectivamente el polipéptido recombinante deseado, y detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en el eluato o fracciones del mismo usando una lectina que se une a dichas impurezas glicosiladas. La etapa de detección se puede efectuar usando al menos una lectina seleccionada de ConA, LCH, GNA o GNL, RCA, DC-SIGN, L-SIGN, PNA, AIL, VVL, WGA, SNA, MAL, MAH, UEA y AAL. Véase la Tabla 3. La etapa de detección se puede efectuar usando al menos una lectina vegetal, tal como una lectina seleccionada de PNA, SBA, PWM, PEA, PTA, ML-I-III, LEA, UDA, WGA, PHA, LTA, BSI-B4, MPA, RCA, LCA, ECA, AAA, DBA, GSL-I, PSA, SJA, DSL, ECL, GSL-II, AIA/Jacalina, LEL, STL, HHL, LCA, NPL, ACL, ECL, EEL, MAL-I, AAL, LTL, BPL, MPL, PTL, SNA, DGL, SJA, VVA, LEA, STA, o DSA. Véase Rodas et al., "Separation between toxin-producing and non-toxic clones of Microcystis aeruginosa using lectins," Anales De La Real Academia Nacional De Farmacia, 2012; 78 (1): 123; Bies et al., "Lectin-mediated drug targeting: history and applications," Advanced Drug Delivery Reviews, Volumen 56, Número 4, 3 de marzo de 2004, Páginas 425-435; Farias et al., "", Farias et al., "Expression pattern of glycoconjugates in the Bidderian and ovarian follicles of the Brazilian toad Bufo ictericus analyzed by lectin histochemistry" Braz. J. Biol. [en línea]. 2006, vol.66, n.1a, p. 45-51; Vector Laboratories On-Line Catalog, "Specificity Guide for Lectins" y "Biotinylated Lectin Kits"; Afrough et al., "Identification and elimination of false-positives in an ELISA-based system for qualitative assessment of glycoconjugate binding using a selection of plant lectins", BioTechniques, Vol. 43, No. 4, octubre de 2007, p. 458-464, cada uno de los cuales se incorpora por la presente por referencia en su totalidad. La etapa de detección se puede efectuar usando al menos una lectina de células dendríticas, tal como MMR, DEC-205, Dectina 1, Dectina 2, Langerina o BDCA-2. Véase Figdor et al., "C-type lectin receptors on dendritic cells and langerhans cells", Nature Reviews Immunology 2, 77-84 (febrero: 2002). La afinidad de dichas lectinas de células vegetales y dendríticas por un tipo particular de glicosilación, tal como glicosilación de tipo manosa, puede medirse fácilmente usando las técnicas descritas en la presente memoria u otras conocidas en la técnica con el fin de determinar si una lectina dada puede usarse para la unión de una proteína glicosilada dada.

Preferiblemente, la lectina está unida a un soporte. En una realización, la etapa de detección usa un proceso de monitorización de las interacciones proteína-proteína, tal como, pero no limitado a, interferometría de luz (ForteBio Octet®), interferometría de polarización dual (Farfield AnaLight®), dispersión de luz estática (Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz dinámica (Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz con múltiples ángulos (Wyatt Calypso II), resonancia de plasmón de superficie (ProteOn XPR36 o Biacore T100), ELISA, ELISA quimioluminiscente, far western, electroquimioluminiscencia (tal como la que se realiza con un MesoScale Discovery) u otro ensayo de unión cinética de lectina.

En una realización, el polipéptido recombinante deseado es un polipéptido homopolimérico o heteropolimérico. Dichos polipéptidos recombinantes homopoliméricos o heteropoliméricos incluyen, pero no están limitados a, hormonas, factores de crecimiento, receptores (p. ej., GPCR y receptores de células inmunes), anticuerpos, citoquinas, ligandos de receptores, factores de transcripción, toxinas o enzimas. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos ejemplares no limitantes incluyen aquellos que se unen específicamente a IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, CBP, angiotensina (angiotensina I y angiotensina II), Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, TNF, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 o HRG. Preferiblemente, el polipéptido recombinante deseado es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo. El anticuerpo humanizado puede ser de origen de ratón, rata, conejo, cabra, oveja o vaca. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado es de origen de conejo. En otra realización más, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente.

En una realización, el polipéptido recombinante deseado se expresa en una célula huésped que es una levadura o un hongo filamentoso. La levadura puede seleccionarse de Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; Zygosaccharomyces; Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella. Preferiblemente, la levadura es Pichia pastoris, Pichia angusta, Pichia guillermordii, Pichia methanolica, o Pichia inositovera. Más preferiblemente, la levadura es Pichia pastoris. En una realización preferida, Pichia pastoris expresa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los hongos filamentosos pueden seleccionarse de Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus, Paecilomyces, Fusarium, Neurospora y Claviceps.

En una realización, el proceso de purificación incluye la purificación cromatográfica del polipéptido recombinante deseado que comprende: (a) poner en contacto la o las muestras con un soporte cromatográfico de afinidad y separar el polipéptido recombinante deseado del soporte; (b) poner en contacto el eluato o fracción del mismo de la etapa (a) con un soporte cromatográfico de modo mixto y eluir selectivamente el polipéptido recombinante deseado del soporte; y (c) poner en contacto el eluato o fracción del mismo de la etapa (b) con un soporte cromatográfico de interacción hidrófoba y eluir selectivamente el polipéptido recombinante deseado del soporte, en donde el eluato o fracción del mismo de la etapa (c) comprende polipéptido recombinante deseado sustancialmente purificado. En una realización, el soporte cromatográfico de afinidad comprende un ligando de inmunoafinidad, tal como Proteína A, p. ej., MabSelect SuRe, o lectina, p. ej., GNL o DC-SIGN. Un tampón que comprende aproximadamente arginina 1 M, pH 4,0 puede aplicarse al soporte cromatográfico para eluir el complejo con múltiples subunidades deseado. En otra realización, el soporte cromatográfico de modo mixto es hidroxiapatita cerámica. Un tampón que comprende fosfato de sodio aproximadamente 5 mM, pH 6,5, y cloruro de sodio aproximadamente 0 M a aproximadamente 1,5 M puede aplicarse al soporte cromatográfico para eluir el polipéptido recombinante deseado. Alternativamente, un tampón que comprende fosfato de sodio aproximadamente 5 mM a aproximadamente 0,25 M, pH 6,5, puede aplicarse al soporte cromatográfico para eluir el polipéptido recombinante deseado.

En otra realización más, el soporte cromatográfico de interacción hidrófoba es polipropilen glicol (PPG) 600 M. Un tampón que comprende sulfato de sodio de aproximadamente 0,7 M a 0 M en fosfato de sodio aproximadamente 20 mM, pH 7,0 puede aplicarse al soporte cromatográfico para eluir el polipéptido recombinante deseado.

Preferiblemente, el eluato o fracción del mismo de al menos una de la etapa (a), etapa (b) y etapa (c) se pone en contacto con la lectina para detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en el eluato o fracción del mismo. Se pueden combinar diferentes muestras o eluatos o fracciones de los mismos que contienen el polipéptido recombinante deseado en función de la cantidad y/o tipo de impureza glicosilada detectada. Por ejemplo, se combinan diferentes muestras o eluatos o fracciones de los mismos que contienen el polipéptido recombinante deseado en función de la cantidad y/o tipo de impureza glicosilada detectada en relación con la cantidad de polipéptido recombinante. En una realización, se combinan muestras o eluato o fracciones del mismo que comprenden menos del 10 % de glicovariante, menos del 5 % de glicovariante, menos del 1 % de glicovariante, o menos del 0,5 % de glicovariante. Además, se pueden combinar diferentes muestras o eluatos o fracciones de los mismos en función de la pureza del polipéptido recombinante deseado. Por ejemplo, se combinan muestras o eluato o fracciones del mismo que comprenden más del 91 % de pureza, más del 97 % de pureza o más del 99 % de pureza. En una realización, la pureza se determina midiendo la masa de polipéptido de cadena pesada glicosilado y/o polipéptido de cadena ligera glicosilado como porcentaje de la masa total de polipéptido de cadena pesada y/o polipéptido de cadena ligera. En una realización preferida, el eluato de la etapa (c) comprende menos de 50 ng/mg de glicovariante; más preferiblemente, el eluato de la etapa (c) comprende menos de 25 ng/mg de glicovariante; más preferiblemente, el eluato de la etapa (c) comprende menos de 10 ng/mg de glicovariante. En otra realización preferida, el eluato de la etapa (c) comprende actividad de lectina que varía de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 2 unidades relativas (RU) como se mide por un ensayo cinético de unión de lectina; más preferiblemente, el eluato de la etapa (c) comprende menos de 10 ng/mg de proteína de célula fúngica. En otra realización preferida más, el eluato de la etapa (c) comprende menos de 5 ng/mg de proteína de una célula fúngica; más preferiblemente, el eluato de la etapa (c) comprende menos de 2 ng/mg de proteína de una célula fúngica. En otra realización preferida más, el eluato de la etapa (c) comprende menos de 10 ng/mg de ácido nucleico; más preferiblemente, el eluato de la etapa (c) comprende menos de 5 ng/mg de ácido nucleico.

En otra realización, determinadas muestras o eluatos o fracciones de los mismos se descartan en función de la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas detectadas. En otra realización más, determinadas muestras o fracciones se tratan para reducir y/o eliminar las impurezas glicosiladas en función de la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas detectadas. Los tratamientos ejemplares incluyen uno o más de los siguientes: (i) adición de una enzima u otro resto químico que elimina la glicosilación, (ii) eliminación de las impurezas glicosiladas efectuando una o más etapas de unión a lectina, (iii) efectuando cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar las impurezas glicosiladas.

En particular, la invención proporciona un proceso para purificar un polipéptido recombinante deseado expresado en una célula fúngica, preferiblemente Pichia pastoris, a partir de una mezcla que comprende el polipéptido deseado y al menos una impureza glicosilada, comprendiendo el proceso de purificación: (a) poner en contacto la mezcla con un soporte cromatográfico de afinidad y eluir selectivamente la proteína con múltiples subunidades del soporte; (b) poner en contacto el eluato o una fracción del mismo de la etapa (a) con un soporte cromatográfico de modo mixto y eluir selectivamente la proteína con múltiples subunidades del soporte; y (c) poner en contacto el eluato o una fracción del mismo de la etapa (b) con un soporte cromatográfico de interacción hidrófoba y eluir selectivamente la proteína con múltiples subunidades del soporte, en donde el eluato o una fracción del mismo de la etapa (c) comprende polipéptido recombinante deseado sustancialmente purificado. La cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en el eluato o una fracción del mismo de la etapa (b) y/o la etapa (c) se detecta usando una lectina que se une a dichas impurezas glicosiladas y una o más fracciones del eluato de la etapa (b) y/o la etapa (c) se seleccionan para su procesamiento adicional en función de la cantidad y/o el tipo detectado de impurezas glicosiladas. Preferiblemente, el soporte cromatográfico de afinidad es una columna de Proteína A y/o el soporte cromatográfico de modo mixto es una columna de hidroxiapatita y/o el soporte cromatográfico de interacción hidrófoba es una columna PPG-600M. Alternativamente, el soporte cromatográfico de afinidad es una columna de lectina.

En una realización, el polipéptido recombinante deseado es una proteína con múltiples subunidades, preferiblemente un anticuerpo. En otra realización, la etapa de detección se efectúa usando al menos una lectina seleccionada de ConA, LCH, GNA, RCA, DC-SIGN, L-SIGN, PNA, AIL, VVL, WGA, SNA, MAL, MAH, UEA y AAL en un proceso de monitorización de interacciones proteína-proteína seleccionado de interferometría de luz (ForteBio Octet®), interferometría de polarización dual (Farfield ^naLight®), dispersión de luz estática (Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz dinámica (Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz con múltiples ángulos (Wyatt Calypso II), resonancia de plasmón de superficie (ProteOn XPR36 o Biacore T100), ELISA, ELISA quimioluminiscente, far western, electroquimioluminiscencia (como la que se hace usando un MesoScale Discovery) u otro ensayo de unión cinética de lectina. Preferiblemente, la etapa de detección se efectúa usando GNA (o GNL) y/o lectina(s) DC-SIGN en un ensayo de interferometría de luz (ForteBio Octet®).

La invención proporciona un proceso de fermentación para producir un polipéptido recombinante deseado y purificar el polipéptido recombinante deseado del medio de fermentación. El proceso incluye: (i) cultivar una célula o microbio huésped en condiciones que dan como resultado la expresión y secreción del polipéptido recombinante y una o más impurezas en el medio de fermentación; (ii) obtener periódicamente una o más muestras del medio de fermentación a medida que avanza el proceso de fermentación o después de que se realicen diferentes ciclos de fermentación; (iii) detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en la o las muestras usando una lectina que se une a dichas impurezas glicosiladas, y (iv) en función de la cantidad de impurezas glicosiladas detectadas en la o las muestras modificar uno o más de los parámetros operativos o condiciones del proceso de fermentación. La impureza glicosilada puede ser una glicovariante del polipéptido recombinante, preferiblemente el resultado de la glicosilación unida a O y/o glicosilación unida a N.

En una realización, la etapa de detección se efectúa usando al menos una lectina, preferiblemente una lectina unida a un soporte, seleccionada de ConA, LCH, GNA, RCA, DC-SIGN, L-SIGN, PNA, AIL, VVL, WGA, SNA, MAL, MAH, UEA y AAL. En otra realización, la etapa de detección usa un proceso de monitorización de interacciones proteínaproteína, tal como interferometría de luz (ForteBio Octet®), interferometría de polarización dual (Farfield AnaLighl®), dispersión de luz estática (Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz dinámica (Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz con múltiples ángulos de gradiente de composición (Wyatt Calypso II), resonancia de plasmón de superficie (ProteOn XPR36 o Biacore T100), ELISA, ELISA quimioluminiscente, far western, electroquimioluminiscencia (tal como la que se realiza con un MesoScale Discovery) u otro ensayo de unión cinética de lectina.

En una realización, en función de la cantidad de impurezas glicosiladas detectadas, se alteran uno o más de los siguientes parámetros o condiciones del proceso de fermentación: temperatura, pH, constituyente gaseoso, constituyente de alimentación, agitación, aireación, antiespumante y duración.

En otra realización, el polipéptido recombinante es un polipéptido homopolimérico o heteropolimérico. El polipéptido multimérico recombinante ejemplar incluye una hormona, factor de crecimiento, receptor, anticuerpo, citoquina, ligando del receptor, factor de transcripción o enzima. Preferiblemente, el polipéptido recombinante es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos ejemplares incluyen aquellos que se unen específicamente a IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, CBP, angiotensina (angiotensina I y angiotensina II), Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, Tⁿ F, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 o HRG. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo. El anticuerpo humanizado puede ser de origen de ratón, rata, conejo, cabra, oveja o vaca. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado es de origen de conejo. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente.

En una realización, la célula huésped es una levadura o un hongo filamentoso. Preferiblemente, la célula huésped de levadura se selecciona de Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; Zygosaccharomyces; Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella. Más preferiblemente, la célula huésped de levadura es Pichia pastoris, Pichia angusta, Pichia guillermordii, Pichia methanolica o Pichia inositovera. Lo más preferiblemente, la célula huésped de levadura es Pichia pastoris. En una realización preferida, Pichia pastoris expresa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una realización alternativa, la célula huésped de hongo filamentoso se selecciona de Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus, Paecilomyces, Fusarium, Neurospora y Claviceps.

En otra realización, el proceso incluye además recuperar o purificar el polipéptido recombinante del medio de fermentación. Preferiblemente, el proceso de purificación comprende además poner en contacto la o las muestras con al menos un soporte cromatográfico y eluir selectivamente el polipéptido recombinante deseado. En una realización, el proceso de purificación comprende además combinar diferentes muestras o eluatos o fracciones de los mismos que contienen el polipéptido recombinante deseado en función de la cantidad y/o tipo de impureza glicosilada detectada. Por ejemplo, se pueden combinar diferentes muestras o eluatos o fracciones de los mismos que contienen el polipéptido recombinante deseado en función de la cantidad y/o tipo de impureza glicosilada detectada en relación con la cantidad de polipéptido recombinante.

En una realización, el proceso comprende además detectar la cantidad de impurezas agregadas y/o desagregadas en las muestras o fracciones usando cromatografía de exclusión por tamaño. Preferiblemente, en función de la cantidad de impurezas agregadas y/o desagregadas detectadas, se alteran uno o más de los siguientes parámetros o condiciones del proceso de fermentación: temperatura, pH, constituyente gaseoso, constituyente de alimentación, agitación, aireación, antiespumante y duración.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 proporciona una descripción general de una metodología ejemplar para la purificación de anticuerpos monoclonales expresados en células transformadas, tales como Pichia, de impurezas asociadas al producto, incluyendo la monitorización de la presencia de impurezas durante todo el proceso de purificación.

La FIG. 2 ilustra gráficamente la unión de lectina a una proteína glicosilada. Los ensayos de unión cinética de lectina (tales como la interferometría de luz) se ilustran para su uso en una técnica analítica para monitorizar la purificación de un producto principal, p. ej., un anticuerpo, de impurezas glicosiladas.

La FIG. 3 ilustra gráficamente la presencia de variantes glicosiladas, incluyendo productos glicosilados unidos a O, asociados con la producción de proteínas en Pichia. Las fracciones de la separación cromatográfica de hidroxiapatita de Ab-A se analizaron para determinar la cantidad de productos glicosilados presentes usando una lectina inmovilizada (GNA, campanilla de invierno) en un instrumento Octet.

Las FIG. 4A-B ilustran gráficamente que el nivel de impurezas glicosiladas determinado por ensayos de unión cinética de lectina se correlaciona con el nivel de impurezas glicosiladas determinado por cromatografía de exclusión por tamaño. La abreviatura GV se refiere a glicovariante. Los datos de respuesta de la unión de lectina de los ensayos Octet (RU) para GNA y DC-SIGN en fracciones de cromatografía de hidroxiapatita de Ab-A (Fracción 1-Fracción 21) se representan gráficamente con el porcentaje de glicovariante determinado por (SE)-HPLC de exclusión por tamaño de las mismas fracciones. Véase la Fig. 4A. Una muestra de cromatografía SE-HPLC muestra la separación de la glicovariante de la IgG. El pico de GV, que eluyó a 15,9 minutos a temperatura ambiente) está marcado con una flecha. El pico de IgG eluyó a los 17,2 minutos a temperatura ambiente.

Las FIG. 5A-B muestran el contenido de impurezas glicosiladas de las fracciones de cromatografía de hidroxiapatita de Ab-A producidas en Pichia, que se usó para determinar qué fracciones combinar para una purificación adicional. Por ejemplo, se delinearon dos combinaciones en función de diferentes astringencias: Criterios de Combinación de la Línea base - fracciones combinadas con > 91 % de pureza y < 5,0 % de variante (Fracciónl-Fracción 13); y Criterios de Combinación Estrictos - fracciones combinadas con < 1,0 % de variante (Fracciónl-Fracción 10). Véase la Fig. 5A. La abreviatura GV se refiere a glicovariante. Los datos de SE-HPLC muestran que la Combinación de la Línea base (Fracción 1-Fraccion 13) tiene un 0,4 % de GV, mientras que la Combinación Estricta (Fracción 1-Fracción 10) tiene un 0,1 % de GV. El análisis O-glico (mol de azúcar/mol de mAb) de las combinaciones muestra monomanosa y manotriosa reducidas en la Combinación Estricta en comparación con la Combinación de la Línea Base (es decir, 1,55 moles de monomanosa/ mol de Ab-A en la Combinación Estricta en comparación con 1,60 moles de monomanosa/ mol de Ab-A en la Combinación de la Línea Base, y 0,22 moles de manotriosa/ mol de Ab-A en la Combinación Estricta en comparación con 0,28 moles de manotriosa/ mol de Ab-A en la Combinación de la Línea Base). Los datos de respuesta GNA-Octet (RU) confirmaron niveles reducidos de glicovariantes en la Combinación de Criterios Estrictos en comparación con la Combinación de la Línea Base (es decir, 1,9 RU frente a 2,3 RU, respectivamente). Véase la Fig. 5B.

Las FIG. 6A-B muestran el contenido de impurezas glicosiladas de las fracciones de cromatografía de interacción hidrófoba de Ab-A producidas en Pichia, que se usó para determinar qué fracciones combinar para una purificación adicional. Por ejemplo, se delinearon dos posibles combinaciones en función de diferentes astringencias: Criterios de Combinación de la Línea Base - combinación desde la primera fracción con > 97 % de pureza en el flanco frontal hasta la última fracción con > 99 % de pureza en el flanco trasero (Fracción 4-Fracción 23); y Criterios de Combinación Estrictos - combinación desde la primera fracción con < 10 RU de actividad GNA en el flanco frontal hasta la última fracción > 99 % de pureza por SE-HPLC en el flanco trasero (Fracción 8-Fracción 23). Véase la Fig. 6A. La abreviatura GV se refiere a glicovariante. La abreviatura LMW se refiere a impurezas de bajo peso molecular. Los datos de SE-HPLC muestran que la Combinación de la Línea Base (Fracción 4-Fracción 23) tiene un 0,4 % de GV, mientras la Combinación Estricto (Fracción 8-Fracción 23) tiene un 0,3 % de GV. El análisis O-glico (mol de azúcar/mol de mAb) de las combinaciones muestra monomanosa, manobiosa y manotriosa reducidas en la Combinación Estricta en comparación con la Combinación de la Línea Base (es decir, 1,57 moles de monomanosa/ mol de Ab-A en la Combinación Estricta en comparación con 1,48 moles de monomanosa/ mol de Ab-A en la Combinación de la Línea Base; 0,52 moles de manobiosa/, mol de Ab-A en la Combinación Estricta en comparación con 0,14 moles de manobiosa / mol de Ab-A en la Combinación de la Línea Base; y 0,32 moles de manotriosa/ mol de Ab-A en la Combinación Estricta en comparación con 0,07 moles de manotriosa/ mol de Ab-A en la Combinación de la Línea Base). Los datos de GNA-Octet confirmaron niveles reducidos de glicovariantes en la Combinación de Criterios Estrictos en comparación con la Combinación de la Línea Base (es decir, 1,1 RU frente a 1,4 RU, respectivamente). Véase la Fig. 6B.

Las FIG. 7A-B muestran geles de SDS-PAGE teñidos operados en condiciones no reductoras y reductoras (FIG. 7 panel A y panel B, respectivamente) de Ab-A producido en Pichia. La purificación se observa como niveles reducidos de impurezas relacionadas con el producto en el procesamiento desde el eluato de Proteína A hasta la combinación CHT hasta la combinación PPG HIC. En ambos paneles: Carriles 1 y 12: carriles de control (tampón de muestra 1X); carriles 2, 6 y 11: marcadores de peso molecular; carriles 3-5: muestra total cargada en la columna de afinidad de Proteína A; carril 7: preparación de anticuerpos Ab-A después de la cromatografía de afinidad de Proteína A; carril 8: preparación de anticuerpos Ab-A después de la cromatografía CHT; carril 9: preparación de anticuerpos Ab-A después de la cromatografía HIC; y carril 10: preparación de anticuerpos Ab-A después de filtración en masa (BDS).

La FIG.8 muestra una reducción de las impurezas glicovariantes (GV) durante la purificación aguas abajo de Ab-B según se monitoriza usando el ensayo de lectina GNA.

La FIG. 9 muestra una separación de impurezas glicovariantes (GV) durante la purificación de Ab-B por HIC. Se ensayaron combinaciones de fracciones de la elución de HIC para determinar el contenido de GV usando el ensayo de lectina GNA. Las fracciones del frente del pico de elución (fracción 1 - fracción 5) y las fracciones de la parte posterior del pico de elución (fracción 26 - fracción 32) tienen mayor actividad de lectina que las fracciones de la mitad del pico (fracción 6 - fracción 25). Además, la fracción 6 - fracción 25 contenía el producto Ab-B purificado deseado.

La FIG.10 muestra geles de SDS-PAGE teñidos operados en condiciones no reductoras y reductoras (FIG. 10 panel A y panel B, respectivamente) de Ab-B producido en Pichia. La purificación se observa como niveles reducidos de impurezas relacionadas con el producto en el procesamiento desde el eluato de Proteína A hasta la combinación de CHT hasta la combinación de Fenil HP HIC. En ambos paneles: los carriles 1, 2 y 6 contienen marcadores de peso molecular; el carril 3 contiene eluato de Proteína A; el carril 4 contiene la combinación de CHT; y el carril 5 contiene la combinación de HIC.

Descripción detallada

La presente descripción proporciona procesos para producir y purificar polipéptidos recombinantes expresados por una célula o microbio huésped. En particular, la presente descripción proporciona procesos para producir y purificar polipéptidos homopoliméricos o heteropoliméricos, tales como anticuerpos, expresados en células de levadura o de hongos filamentosos. Los presentes métodos incorporan la unión de lectina como un indicador cuantitativo de impurezas glicosiladas, de modo que el proceso de producción y/o purificación se pueden modificar para maximizar el rendimiento de la proteína deseada y disminuir la presencia de impurezas glicosiladas.

Además, los presentes procesos engloban procesos de purificación que comprenden la separación cromatográfica de muestras del proceso de fermentación con el fin de purificar sustancialmente el polipéptido recombinante deseado de las impurezas asociadas al producto no deseadas, tales como las impurezas glicosiladas (p. ej., glicovariantes), ácidos nucleicos y agregados/desagregados. En algunas realizaciones, el eluato o fracciones del mismo de diferentes etapas de cromatografía se monitorizan para determinar la actividad de unión de lectina para detectar el tipo y/o cantidad de impurezas glicosiladas. En función de la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas detectadas, determinadas muestras del proceso de fermentación y/o fracciones de la purificación cromatográfica se descartan, se tratan y/o se combinan selectivamente para una purificación adicional.

En realizaciones ejemplares, la proteína recombinante es un anticuerpo o un fragmento de unión de anticuerpo, la célula de levadura es Pichia pastoris y la impureza glicosilada es una glicovariante del polipéptido recombinante deseado, tal como una glicovariante unida a N y/o unida a O.

En una realización preferida, la proteína recombinante es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo humanizado o humano, que comprende dos subunidades de cadena pesada y dos subunidades de cadena ligera. Las células fúngicas preferidas incluyen levaduras, y las levaduras particularmente preferidas incluyen cepas de levaduras metilotróficas, p. ej., Pichia pastoris, Hansenula polymorpha (Pichia angusta), Pichia guillermordii, Pichia methanolica, Pichia inositovera, y otras (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. 4.812.405, 4.818.700, 4.929.555, 5.736.383, 5.955.349, 5.888.768, y 6.258.559). La célula de levadura se puede producir mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede generarse un panel de células de levadura diploides o tetraploides que contienen diferentes combinaciones de números de copias de genes mediante el apareamiento de células que contienen números variables de copias de los genes de subunidades individuales (cuyo número de copias se conoce preferiblemente antes del apareamiento).

Los solicitantes han descubierto nuevos procesos para la producción y purificación de proteínas producidas en células de levaduras o de hongos filamentosos que proporcionan un alto rendimiento de la proteína deseada con impurezas mínimas. En particular, los procesos descritos en la presente memoria incorporan etapas de monitorización de la pureza en los esquemas de producción y/o purificación de la proteína para mejorar la eliminación de impurezas asociadas al producto, p. ej., impurezas glicosiladas, del producto proteico principal de interés, p. ej., descartando selectivamente, tratando y/o purificando determinadas fracciones de los esquemas de producción y/o purificación en función de la cantidad y/o tipo de impureza glicosilada detectada en relación con la cantidad de polipéptido recombinante. Los ejemplos de trabajo demuestran que el empleo de dichos métodos de monitorización de la producción y la purificación da como resultado altos niveles de purificación del producto (p. ej., al menos un 97 % de pureza) mientras se mantiene un alto rendimiento del producto proteico deseado.

En una realización, los métodos incluyen un proceso de fermentación para producir un polipéptido recombinante deseado y purificar el polipéptido recombinante deseado del medio de fermentación. Generalmente, una célula de levadura o microbio se cultiva en condiciones que dan como resultado la expresión y secreción del polipéptido recombinante, así como una o más impurezas en el medio de fermentación, se recoge una muestra, p. ej., durante o después de la fermentación, y se monitoriza la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en la o las muestras usando una lectina, de modo que se pueden modificar los parámetros del proceso de fermentación, p. ej., temperatura, pH, constituyentes gaseosos (p. ej., nivel de oxígeno, presión, velocidad de flujo), constituyentes de la alimentación (p. ej., nivel o tasa de glucosa), agitación, aireación, antiespumante (p. ej., tipo o concentración) y duración, en función de las impurezas glicosiladas detectadas.

En otra realización, los métodos incluyen un proceso para purificar un polipéptido recombinante deseado de una o más muestras, resultante de un proceso de fermentación que comprende cultivar una célula o microbio deseado en condiciones que dan como resultado la expresión y secreción del polipéptido recombinante y una o más impurezas en el medio de fermentación, usando la unión de lectina para detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en la o las muestras. Los inventores han determinado que los ensayos de unión cinética de lectina proporcionan una medida cuantitativa de las impurezas glicosiladas, de modo que el proceso de purificación se puede ajustar en respuesta al nivel y tipo de impureza detectados.

En una realización particular, el proceso de purificación incluye además poner en contacto una o más muestras del proceso de fermentación, p. ej., medio de fermentación que contiene la proteína recombinante deseada, p. ej., un anticuerpo, expresado en una célula huésped de levadura o de hongo filamentoso y una impureza, con al menos un soporte cromatográfico y después eluir selectivamente el polipéptido recombinante deseado. Por ejemplo, la muestra del proceso de fermentación puede ensayarse para detectar las impurezas glicosiladas usando un ensayo de unión cinética de lectina y, dependiendo del tipo y/o cantidad de impurezas glicosiladas detectadas, poner en contacto con un soporte cromatográfico de afinidad (p. ej., Proteína A o lectina), un soporte cromatográfico de modo mixto (p. ej., hidroxiapatita cerámica) y un soporte cromatográfico de interacción hidrófoba (p. ej., polipropilen glicol (PPG) 600M). La proteína deseada se separa, p. ej., se eluye selectivamente, de cada soporte cromatográfico antes de ponerla en contacto con el soporte cromatográfico posterior, dando como resultado que el eluato o una fracción del mismo del soporte cromatográfico de interacción hidrófoba comprende una proteína recombinante deseada sustancialmente purificada.

"Sustancialmente purificada" respecto a la proteína o proteína con múltiples subunidades deseada significa que la muestra comprende al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 98,5 % de la proteína recombinante deseada con menos de un 3 %, menos de un 2,5 %, menos de un 2 %, menos de un 1,5 % o menos de un 1 % de impurezas, es decir, producto agregado, variante y de bajo peso molecular. En una realización, la proteína sustancialmente purificada comprende menos de 50 ng/mg, preferiblemente menos de 25 ng/mg o más preferiblemente menos de 10 ng/mg de glicovariante; menos de 10 ng/mg, preferiblemente menos de 5 ng/mg o más preferiblemente menos de 2 ng/mg de proteína de células fúngicas; y/o menos de 10 ng/mg o preferiblemente menos de 5 ng/mg de ácido nucleico.

Los métodos incluyen además opcionalmente monitorizar una muestra del proceso de fermentación y/o una porción del eluato o una fracción del mismo de al menos uno del soporte cromatográfico de afinidad, el soporte cromatográfico de modo mixto y el soporte cromatográfico de interacción hidrófoba para determinar la presencia de al menos una impureza asociada al producto, tal como una proteína de células fúngicas, un ácido nucleico de células fúngicas, un virus adventicio, un virus endógeno, una endotoxina, un agregado, un desagregado o una proteína no deseada que comprende al menos una modificación respecto a la proteína recombinante deseada (p. ej., una sustitución de aminoácido, modificación N-terminal, modificación C-terminal, enlaces S-S mal emparejados, plegamiento, truncamiento, agregación, disociación multimérica, desnaturalización, acetilación, acilación grasa, desamidación, oxidación, carbamilación, carboxilación, formilación, gamma-carboxiglutamilación, glicosilación, metilación, fosforilación, sulfatación, PEGilación y ubiquitinación). En particular, los procesos de producción y purificación pueden incluir la detección de la cantidad de impurezas agregadas y/o desagregadas en las muestras o fracciones usando cromatografía de exclusión por tamaño.

Aunque gran parte de la presente descripción describe la producción de anticuerpos, los métodos descritos en la presente memoria se adaptan fácilmente a otros complejos con múltiples subunidades, así como a proteínas de una sola subunidad. Los métodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse fácilmente para mejorar el rendimiento y/o pureza de cualquier complejo recombinante con múltiples subunidades que comprenda dos o más subunidades diferentes. Además, los presentes métodos no se limitan a la producción de complejos de múltiples proteínas, sino que también se pueden adaptar fácilmente para su uso con complejos de ribonucleoproteína (RNP) que incluyen telomerasa, hnRNP, ribosomas, snRNP, partículas de reconocimiento de señales, complejos de ARNasa P procariotas y eucariotas, y cualquier otro complejo que contenga múltiples subunidades distintas de proteínas y/o ARN. La célula fúngica que expresa el complejo con múltiples subunidades se puede producir mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede generarse un panel de células de levadura diploides o tetraploides que contienen diferentes combinaciones de números de copias de genes mediante el apareamiento de células que contienen números variables de copias de los genes de subunidades individuales (cuyo número de copias se conoce preferiblemente antes del apareamiento).

Expresión de proteínas recombinantes

Las proteínas recombinantes, que incluyen polipéptidos homopoliméricos o heteropoliméricos, p. ej., un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, pueden expresarse en células de levadura y de hongos filamentosos. En una realización, la proteína deseada se expresa recombinantemente en levadura, y las levaduras particularmente preferidas incluyen cepas de levadura metilotróficas, p. ej., Pichia pastoris, Hansenula polymorpha (Pichia angusta), Pichia guillermordii, Pichia methanolica, Pichia inositovera, y otras (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. 4.812.405, 4.818.700, 4.929.555, 5.736.383, 5.955.349, 5.888.768, y 6.258.559). Otras levaduras ejemplares incluyen Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; Zygosaccharomyces; Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella.

La célula de levadura se puede producir mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede generar un panel de células de levadura diploides o tetraploides que contienen diferentes combinaciones de números de copias de genes mediante el apareamiento de células que contienen números variables de copias de los genes de subunidades individuales (cuyo número de copias se conoce preferiblemente antes del apareamiento).

En una realización, la célula de levadura puede comprender más de una copia de uno o más de los genes que codifican la proteína recombinante o las subunidades de la proteína con múltiples subunidades deseada. Por ejemplo, pueden integrarse múltiples copias del gen de una subunidad en tándem en uno o más loci cromosómicos. Las copias de genes integradas en tándem se retienen preferiblemente en un número estable de copias durante el cultivo para la producción de la proteína deseada o complejo con múltiples subunidades. Por ejemplo, en un trabajo anterior descrito por los presentes solicitantes, el número de copias de genes fue generalmente estable para las cepas de P. pastoris que contienen de tres a cuatro copias integradas en tándem de genes de anticuerpos de cadena ligera y pesada (véase, U.S. 20130045888).

Uno o más de los genes que codifican las subunidades de proteínas recombinantes se integran preferiblemente en uno o más loci cromosómicos de una célula fúngica. Puede utilizarse cualquier locus cromosómico adecuado para la integración, incluyendo secuencias intergénicas, secuencias promotoras, secuencias codificantes, secuencias de terminación, secuencias reguladoras, etc. Los loci cromosómicos ejemplares que se pueden usar en P. pastoris incluyen PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4 y GAP. Los genes codificantes también pueden integrarse en uno o más loci cromosómicos aleatorios en lugar de ser dirigidos. En realizaciones preferidas, los loci cromosómicos se seleccionan del grupo que consiste en el locus pGAP, el locus 3'AOX TT y el locus HIS4 TT. En realizaciones ejemplares adicionales, los genes que codifican las subunidades de proteínas heterólogas pueden estar contenidos en uno o más elementos extracromosómicos, por ejemplo, uno o más plásmidos o cromosomas artificiales.

En realizaciones ejemplares, la proteína puede ser una proteína con múltiples subunidades que comprende, p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subunidades idénticas y/o no idénticas. Además, cada subunidad puede estar presente una o más veces en cada proteína con múltiples subunidades. Por ejemplo, la proteína con múltiples subunidades puede ser un anticuerpo multiespecífico tal como un anticuerpo biespecífico que comprende dos cadenas ligeras no idénticas y dos cadenas pesadas no idénticas. Un panel de células de levadura diploides o tetraploides que contienen diferentes combinaciones de números de copias de genes puede generarse rápidamente mediante el apareamiento de células que contienen diferentes números de copias de los genes de subunidades individuales. La producción de anticuerpos de cada cepa en el panel puede evaluarse entonces para identificar una cepa para uso adicional en función de una característica tal como el rendimiento de la proteína con múltiples subunidades deseada o la pureza de la proteína con múltiples subunidades deseada en relación con los subproductos no deseados.

Las subunidades de una multisubunidad pueden expresarse a partir de genes monocistrónicos, genes policistrónicos o cualquier combinación de los mismos. Cada gen policistrónico puede comprender múltiples copias de la misma subunidad, o puede comprender una o más copias de cada subunidad diferente.

Los métodos ejemplares que pueden usarse para la manipulación de Pichia pastoris (incluyendo los métodos de cultivo, transformación y apareamiento) se describen en las Solicitudes Publicadas que incluyen U.S. 20080003643, U.S. 20070298500 y U.S. 20060270045, y en Higgins, D.R., y Cregg, J.M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., y Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2a edición), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J.

Un casete de expresión ejemplar que se puede utilizar está compuesto por el promotor del gen de gliceraldehído deshidrogenasa (gen GAP), fusionado con secuencias que codifican una señal de secreción, seguido de la secuencia del gen que se va a expresar, seguido de secuencias que codifican una señal de terminación transcripcional de P. pastoris del gen de la alcohol oxidasa I (AOX1) de P. pastoris. El gen marcador de resistencia a la zeocina puede proporcionar un medio de enriquecimiento para las cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa mediante la selección de transformantes que son resistentes a niveles más altos de zeocina. De manera similar, los genes marcadores de resistencia a G418 o kanamicina pueden usarse para proporcionar un medio de enriquecimiento para cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa mediante la selección de transformantes que son resistentes a niveles más altos de geneticina o kanamicina.

Las cepas de levadura que se pueden utilizar incluyen P. pastoris auxotrófica u otras cepas de Pichia, por ejemplo, cepas que tienen mutaciones en met1, lys3, ura3 y ade1 u otros genes asociados a auxotrofía. Las mutaciones preferidas son incapaces de dar lugar a revertantes a una frecuencia apreciable y son preferiblemente mutantes de deleción parcial o incluso más preferiblemente completa. Preferiblemente, las cepas prototróficas diploides o tetraploides se producen mediante el apareamiento de conjuntos complementarios de cepas auxotróficas.

Antes de la transformación, cada vector de expresión puede linealizarse mediante escisión con enzima de restricción dentro de una región homóloga al locus genómico diana (p. ej., la secuencia promotora GAP) para dirigir la integración de los vectores en el locus diana en la célula fúngica. Las muestras de cada vector se pueden transformar entonces individualmente en cultivos de las cepas deseadas mediante electroporación u otros métodos, y los transformantes exitosos se pueden seleccionar por medio de un marcador seleccionable, p. ej., resistencia a antibióticos o complementación de una auxotrofía. Los aislados se pueden recoger, sembrar en estrías para colonias individuales en condiciones selectivas y luego examinarse para confirmar el número de copias del gen que codifica la proteína o subunidad deseada del complejo con múltiples subunidades (p. ej., un anticuerpo deseado) mediante transferencia Southern o ensayo de PCR en ADN genómico extraído de cada cepa. Opcionalmente, la expresión del producto del gen de la subunidad esperado puede confirmarse, p. ej., mediante FACS, transferencia Western, transferencia de colonias e inmunotransferencia, y otros medios conocidos en la técnica. Opcionalmente, los aislados haploides se transforman más veces para introducir genes heterólogos adicionales, p. ej., copias adicionales de la misma subunidad integradas en un locus diferente, y/o copias de una subunidad diferente. Las cepas haploides se aparean entonces para generar cepas diploides (o cepas de ploidía superior) capaces de sintetizar el complejo de múltiples proteínas. La presencia de cada gen de subunidad esperado puede confirmarse mediante transferencia Southern, PCR y otros medios de detección conocidos en la técnica. Cuando el complejo de múltiples proteínas deseado es un anticuerpo, su expresión también puede ser confirmada por un método de transferenciade colonias/inmunotransferencia (Wung et al. Biotechniques 21 808-812 (1996)) y/o por FACS.

Este protocolo de transformación se repite opcionalmente para dirigir un gen heterólogo a un segundo locus, que puede ser el mismo gen o un gen diferente al que se dirigió al primer locus. Cuando la construcción que se va a integrar en el segundo locus codifica una proteína que es igual o muy similar a la secuencia codificada por el primer locus, su secuencia puede variarse para disminuir la probabilidad de integración no deseada en el primer locus. Por ejemplo, la secuencia que se va a integrar en el segundo locus puede tener diferencias en la secuencia del promotor, la secuencia de terminación, el uso de codones, y/u otras diferencias de secuencia tolerables con respecto a la secuencia integrada en el primer locus.

La transformación de cepas haploides de P. pastoris y la manipulación genética del ciclo sexual de P. pastoris se pueden realizar como se describe en Pichia Protocols (1998, 2007), supra.

Los vectores de expresión para su uso en los métodos de la invención pueden incluir además secuencias específicas de levadura, incluyendo un marcador auxotrófico o de fármaco seleccionable para identificar las cepas de levadura transformadas. Puede usarse además un marcador de fármaco para amplificar el número de copias del vector en una célula de levadura, p. ej., cultivando una población de células en una concentración elevada del fármaco, seleccionando así transformantes que expresan niveles elevados del gen de resistencia.

La secuencia codificante del polipéptido de interés está típicamente unida operativamente a secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales que proporcionan la expresión del polipéptido en células de levadura. Estos componentes del vector pueden incluir, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. También se pueden incluir secuencias para la secreción del polipéptido, p. ej., una secuencia de señal, y similares. Un origen de replicación de levadura es opcional, ya que los vectores de expresión a menudo se integran en el genoma de la levadura.

En una realización ejemplar, uno o más de los genes que codifican la proteína heteróloga o las subunidades de la misma se acoplan a un promotor inducible. Los promotores ejemplares adecuados incluyen el promotor del gen de la alcohol oxidasa 1, genes de la formaldehído deshidrogenasa (FLD; véase la Pub. de EE. UU. No. 2007/0298500), y otros promotores inducibles conocidos en la técnica. El promotor del gen de la alcohol oxidasa 1 está firmemente reprimido durante el crecimiento de la levadura en las fuentes más comunes de carbono, tales como glucosa, glicerol, o etanol, pero está altamente inducido durante el crecimiento en metanol (Tschopp et al., 1987; Pat. de EE. UU. No. 4.855.231 de Stroman, D. W., et al). Para la producción de proteínas extrañas, las cepas pueden crecerse inicialmente en una fuente de carbono represora para generar biomasa y luego cambiarse a metanol como única (o principal) fuente de carbono y energía para inducir la expresión del gen extraño. Una ventaja de este sistema regulador es que las cepas de P. pastoris transformadas con genes extraños cuyos productos de expresión son tóxicos para las células pueden mantenerse creciendo en condiciones represoras.

En otra realización ejemplar, uno o más de los genes heterólogos pueden acoplarse a un promotor regulado, cuyo nivel de expresión puede regularse al alza en condiciones apropiadas. Los ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el CUP 1 (inducido por el nivel de cobre en el medio), promotores inducibles por tetraciclina, promotores inducibles por tiamina, promotor AOX1 (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); promotor de ICL1 (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13):1097-108); promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); y promotor de FLD1 (Shen et al. (1998) Gene 216(1):93-102). El promotor de GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores de CUP1, AOX y FLD1 son inducibles.

Otros promotores de levadura incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk y promotores quiméricos derivados de los mismos. Además, en la invención pueden usarse promotores que no sean de levadura, tales como promotores de mamíferos, insectos, plantas, reptiles, anfibios, virales y aviares. Más típicamente, el promotor comprenderá un promotor de mamíferos (potencialmente endógeno para los genes expresados) o comprenderá un promotor de levadura o viral que proporcione una transcripción eficaz en sistemas de levadura.

Los polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, p. ej., una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N del polipéptido o la proteína maduros. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte de la secuencia codificante del polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que se reconoce y procesa a través de una de las rutas estándar disponibles en la célula fúngica. La señal pre-pro del factor alfa de S. cerevisiae ha demostrado ser eficaz en la secreción de una variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris. Otras secuencias señal de levadura incluyen la secuencia señal del factor de apareamiento alfa, la secuencia señal de invertasa y las secuencias señal derivadas de otros polipéptidos de levadura secretados. Además, estas secuencias de péptidos señal pueden prepararse por ingeniería para proporcionar una secreción mejorada en sistemas de expresión de levaduras diploides. Otras señales de secreción de interés también incluyen secuencias señal de mamíferos, que pueden ser heterólogas para la proteína que se está secretando, o pueden ser una secuencia nativa para la proteína que se está secretando. Las secuencias señal incluyen secuencias pre-peptídicas y, en algunos casos, pueden incluir secuencias propeptídicas. Muchas de estas secuencias señal son conocidas en la técnica, incluyendo las secuencias señal que se encuentran en las cadenas de inmunoglobulina, p. ej., secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humano, secuencias señal de albúmina de suero humano, cadena pesada de Ig humana, cadena ligera de Ig humana y similares. Por ejemplo, véase Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); y Kobayashi et. al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).

La transcripción se puede aumentar insertando una secuencia activadora de la transcripción en el vector. Estos activadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores de la transcripción son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado en 5' y 3' de la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia codificante. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia codificante, pero está situado preferiblemente en un sitio en 5' del promotor.

Aunque es opcional, en una realización, una o más subunidades de la proteína deseada o del complejo con múltiples subunidades están unidas operativamente, o fusionadas, a una secuencia de secreción que proporciona la secreción del polipéptido expresado en el medio de cultivo, lo que puede facilitar la recogida y purificación. de la proteína heteróloga o complejo con múltiples subunidades. Incluso más preferiblemente, las secuencias de secreción proporcionan una secreción optimizada del polipéptido de las células fúngicas (p. ej., células diploides de levadura), tal como mediante la selección de codones preferidos y/o alteración del porcentaje de pares de bases AT mediante la selección de codones. Se sabe en la técnica que la eficacia de la secreción y/o la estabilidad pueden verse afectadas por la elección de la secuencia de secreción y la secuencia de secreción óptima puede variar entre diferentes proteínas (véase, p. ej., Koganesawa et al., Protein Eng. 2001 sep;14(9):705-10). Se conocen en la técnica muchas señales de secreción potencialmente adecuadas y se pueden ensayar fácilmente para determinar su efecto sobre el rendimiento y/o pureza de una proteína heteróloga o complejo con múltiples subunidades particular. Se puede usar potencialmente cualquier secuencia de secreción, incluyendo las presentes en proteínas secretadas de levaduras y otras especies, así como secuencias de secreción preparadas por ingeniería. Véase, Hashimoto et al., Protein Engineering vol. 11 no. 2 p.75-77, 1998; Oka et al., Biosci Biotechnol Biochem. 1999 nov; 63(11):1977-83; Gellissen et al., FEMS Yeast Research 5 (2005) 1079-1096; Ma et al., Hepatology. 2005 dic;42(6):1355-63; Raemaekers et al., Eur J Biochem. 1999 oct 1;265(1):394-403; Koganesawa et al., Protein Eng. (2001) 14 (9): 705­ 710; Daly et al., Protein Expr Purif. 2006 abr;46(2):456-67; Damasceno et al., Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:381-389; y Felgenhauer et al., Nucleic Acids Res. 1990 ago 25; 18(16): 4927).

Los ácidos nucleicos están "unidos operativamente” cuando se ponen en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia señal está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión puede lograrse mediante la ligación en sitios de restricción convenientes o, de manera alternativa, mediante un método de PCR/recombinación familiar para los expertos en la técnica (Gateway® Technology; Invitrogen, Carlsbad Calif.). Si dichos sitios no existen, se pueden usar adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. Los ácidos nucleicos deseados (incluyendo los ácidos nucleicos que comprenden secuencias unidas operativamente) también pueden producirse mediante síntesis química.

La proteína también puede secretarse en el medio de cultivo sin estar unida o fusionada operativamente a una señal de secreción. Por ejemplo, se ha demostrado que algunos polipéptidos heterólogos se secretan en el medio de cultivo cuando se expresan en P. pastoris incluso sin estar unidos o fusionados a una señal de secreción. Además, la proteína se puede purificar a partir de células fúngicas (lo que, por ejemplo, puede ser preferible si la proteína se secreta poco) usando métodos conocidos en la técnica.

Tal y como se usa en la presente memoria, las formas en singular “un/una”, “y” y “el/la” incluyen referentes en plural a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. A no ser que se indique claramente otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Ta y como se usan en la presente memoria, los términos "célula de hongo filamentoso" y "célula huésped de hongo filamentoso" se usan indistintamente y pretenden significar cualquier célula de cualquier especie de los géneros Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus, Paecilomyces, Fusarium, Neurospora y Claviceps. En la presente invención, se pretende que esto englobe de manera amplia cualquier célula de hongo filamentoso que pueda crecer en cultivo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "célula de levadura" se refiere a cualquier célula de cualquier especie de los géneros Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; Zygosaccharomyces; Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella. En la presente invención, se pretende que esto englobe de manera amplia cualquier célula de levadura que pueda crecer en cultivo.

En una realización preferida de la invención, la célula de levadura es un miembro del género Pichia o es otro metilotrofo. En otra realización preferida de la invención, la célula fúngica es del género Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha (Pichia angusta). En una realización particularmente preferida de la invención, la célula fúngica del género Pichia es la especie Pichia pastoris.

Dichas especies pueden existir en una forma haploide, diploide u otra forma poliploide. Las células de una ploidía dada pueden, en condiciones apropiadas, proliferar durante un número indefinido de generaciones en esa forma. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede dar como resultado cepas tetraploides mediante apareamiento o fusión adicionales de cepas diploides. La presente invención contempla el uso de levadura haploide, así como de células de levadura diploides u otras células de levadura poliploides producidas, por ejemplo, por apareamiento o fusión (p. ej., fusión de esferoplastos).

Tal y como se usa en la presente memoria, "célula de levadura haploide" se refiere a una célula que tiene una única copia de cada gen de su complemento genómico (cromosómico) normal.

Tal y como se usa en la presente memoria, "célula de levadura poliploide" se refiere a una célula que tiene más de una copia de su complemento genómico (cromosómico) normal.

Tal y como se usa en la presente memoria, "célula de levadura diploide" se refiere a una célula que tiene dos copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides.

Tal y como se usa en la presente memoria, "célula de levadura tetraploide" se refiere a una célula que tiene cuatro copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células diploides. Las tetraploides pueden tener dos, tres, cuatro o más casetes de expresión diferentes. Dichas tetraploides podrían obtenerse en S. cerevisiae mediante el apareamiento selectivo heterotálico homocigótico diploides a/a y alfa/alfa y en Pichia por el apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos. Por ejemplo, un haploide [met his] se puede aparear con haploide [ade his] para obtener diploide [his]; y un haploide [met arg] haploide se puede aparear con haploide [ade arg] para obtener diploide [arg]; luego el diploide [his] se puede aparear con el diploide [arg] para obtener un protótrofo tetraploide. Los expertos en la técnica entenderán que la referencia a los beneficios y usos de células diploides también se puede aplicar a células tetraploides.

Tal y como se usa en la presente memoria, "apareamiento de levaduras" se refiere al proceso por el cual dos células de levadura se fusionan para formar una sola célula de levadura. Las células fusionadas pueden ser células haploides o células de ploidía superior (p. ej., apareamiento de dos células diploides para producir una célula tetraploide).

Tal y como se usa en la presente memoria, "meiosis" se refiere al proceso mediante el cual una célula de levadura diploide sufre una división reductora para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede germinar entonces y formar una línea celular haploide que crece vegetativamente.

Tal y como se usa en la presente memoria, "plegamiento" se refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, donde las interacciones entre los residuos de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Si bien las interacciones no covalentes son importantes para determinar la estructura, habitualmente las proteínas de interés tendrán enlaces disulfuro covalentes intra y/o intermoleculares formados por dos residuos de cisteína. Para proteínas y polipéptidos naturales o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento apropiado es típicamente la disposición que da como resultado una actividad biológica óptima, y puede monitorizarse convenientemente mediante ensayos para determinar su actividad, p. ej., unión de ligandos, actividad enzimática, etc.

En algunos casos, por ejemplo, cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en actividad biológica serán menos significativos. El plegamiento apropiado de dichas moléculas puede determinarse sobre la base de propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelado y similares.

El huésped de expresión se puede modificar adicionalmente mediante la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que potencian el plegamiento y la formación de enlaces de disulfuro, es decir, foldasas, chaperoninas, etc. Dichas secuencias se pueden expresar de forma constitutiva o inducible en la célula huésped de levadura usando vectores, marcadores, etc., según se conoce en la técnica. Preferiblemente, las secuencias, incluyendo los elementos reguladores de la transcripción suficientes para el patrón de expresión deseado, se integran de forma estable en el genoma de la levadura a través de una metodología dirigida.

Por ejemplo, la proteína disulfuro isomerasa (PDI) eucariota no solo es un catalizador eficiente de la oxidación de cisteínas de proteínas y la isomerización del enlace disulfuro, sino que también exhibe actividad de chaperona. La coexpresión de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que tienen múltiples enlaces disulfuro. También es de interés la expresión de BIP (proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina); ciclofilina; y similares. En una realización de la invención, la proteína deseada o el complejo con múltiples subunidades se puede expresar a partir de una cepa de levadura producida por apareamiento, en donde cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distinta, p. ej., una cepa puede expresar BIP y la otra cepa. puede expresar PDI o combinaciones de los mismos.

Los términos "proteína deseada" y "proteína recombinante deseada" se utilizan indistintamente y se refieren generalmente a una proteína heteróloga expresada en una levadura o célula de hongo filamentoso huésped que comprende una estructura primaria, secundaria, terciaria y/o cuaternaria particular con un patrón particular de modificaciones postraduccionales y/u otras modificaciones. En un aspecto, la proteína deseada es una proteína con múltiples subunidades homopolimérica o heteropolimérica. Las proteínas recombinantes multiméricas ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, una hormona multimérica (p. ej., familia de la insulina, familia de la relaxina y otras hormonas peptídicas), factor de crecimiento, receptor, anticuerpo, citoquina, ligando del receptor, factor de transcripción o enzima.

La proteína recombinante deseada según la invención es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo humanizado o humano o una porción de unión del mismo. En un aspecto, el anticuerpo humanizado es de origen de ratón, rata, conejo, cabra, oveja o vaca. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado es de origen de conejo. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente. En otro aspecto más, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-alfa, IFN -gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, CBP, angiotensina (angiotensina I y angiotensina II), Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, TNF, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 o HRG.

El término "anticuerpo" incluye cualquier estructura molecular que contiene una cadena polipeptídica con una forma específica que se ajusta y reconoce un epítopo, donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, p. ej., humana, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mamíferos, pollo, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente preferida para producir anticuerpos útiles como material de partida según la invención son los conejos. Se han descrito numerosas secuencias que codifican anticuerpos; y otros pueden generarse por métodos muy conocidos en la técnica. Los ejemplos de los mismos incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos de mamíferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena simple tales como scFv, anticuerpos de camélidos, nanocuerpos, IgNAR (anticuerpos de cadena simple derivados de tiburones), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fab', F(ab')² y similares. Véase Streltsov V A, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci. 2005 noviembre; 14(11 ):2901-9. Epub 2005 sep. 30; Greenberg A S, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 mar. 9; 374(6518):168-73; Nuttall S D, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 agosto; 38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 jun. 3; 363(6428):446-8; Gill D S, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 diciembre; 17(6):653-8. Epub 2006 oct. 19.

Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden producirse mediante ingeniería genética. En esta técnica, como con otros métodos, las células productoras de anticuerpos se sensibilizan para el antígeno o inmunógeno deseado. El ARN mensajero aislado de las células productoras de anticuerpos se usa como molde para producir ADNc mediante amplificación por PCR. Se produce una biblioteca de vectores, cada uno de los cuales contiene un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que retienen la especificidad antigénica inicial, mediante la inserción de secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresión. Se construye una biblioteca combinatoria combinando la biblioteca de genes de cadena pesada con la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que coexpresan una cadena pesada y ligera (que se asemeja al fragmento Fab o al fragmento de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo). Los vectores que portan estos genes se cotransfectan en una célula huésped. Cuando se induce la síntesis de genes de anticuerpos en el huésped transfectado, las proteínas de cadena pesada y ligera se autoensamblan para producir anticuerpos activos que pueden detectarse mediante el cribado con el antígeno o inmunógeno.

Las secuencias codificantes de anticuerpos de interés incluyen aquellas codificadas por secuencias nativas, así como ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticos en secuencia a los ácidos nucleicos descritos y variantes de los mismos. Los polipéptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos (aa). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas o sustituciones para eliminar los aminoácidos no esenciales, tales como para alterar un sitio de glicosilación, o para minimizar el plegamiento erróneo mediante la sustitución o deleción de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para la función. Las variantes se pueden diseñar para retener o tener una actividad biológica potenciada de una región particular de la proteína (p. ej., un dominio funcional, residuos de aminoácidos catalíticos, etc). Las variantes también incluyen fragmentos de los polipéptidos descritos en la presente memoria, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen técnicas para la mutagénesis in vitro de genes clonados. También se incluyen en la invención en cuestión polipéptidos que han sido modificados usando técnicas ordinarias de biología molecular para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para volverlos más adecuados como agentes terapéuticos.

Los anticuerpos quiméricos se pueden preparar por medios recombinantes combinando las regiones variables de cadena ligera y pesada (VL y VH), obtenidas a partir de células productoras de anticuerpos de una especie con las regiones constantes de cadena ligera y pesada de otra. Típicamente, los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedores o conejos y regiones constantes humanas, con el fin de producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de dichos anticuerpos quiméricos es muy conocida en la técnica, y puede conseguirse por medios estándar (como se describe, p. ej., en la Pat. de EE. UU. No. 5.624.659, incorporada en la presente memoria por referencia en su totalidad). Se contempla además que las regiones constantes humanas de los anticuerpos quiméricos de la invención se pueden seleccionar de las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Los anticuerpos humanizados se preparan por ingeniería para contener aún más dominios de inmunoglobulina de tipo humano e incorporar solo las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado de animal. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal y ajustándolas a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque el proceso parezca complejo, es sencillo en la práctica. Véase, p. ej., la Pat. de EE. UU. No. 6.187.287. Los métodos para humanizar anticuerpos se han descrito anteriormente en la Patente de EE. UU. No. 7935340 expedida. En algunos casos, es necesaria una determinación de si se requieren residuos de marco de conejo adicionales para mantener la actividad. En algunos casos, los anticuerpos humanizados todavía requieren que se retengan algunos residuos de marco de conejo críticos para minimizar la pérdida de afinidad o actividad. En estos casos, es necesario cambiar los aminoácidos marco únicos o múltiples de las secuencias de la línea germinal humana de nuevo a los aminoácidos originales del conejo con el fin de tener la actividad deseada. Estos cambios se determinan experimentalmente para identificar qué residuos de conejo son necesarios para preservar la afinidad y la actividad.

Además de inmunoglobulinas completas (o los equivalentes recombinantes de las mismas), pueden sintetizarse fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epítopo (p. ej., Fab', F(ab')2 u otros fragmentos). Puede diseñarse un "fragmento" o inmunoglobulinas mínimas utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención se pueden producir sintetizando una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable fusionadas. Las combinaciones de anticuerpos también son de interés, p. ej., los diacuerpos, que comprenden dos especificidades de Fv distintas. En otra realización de la invención, los SMIP (inmunofármacos que son moléculas pequeñas), los anticuerpos de camélido, los nanocuerpos y las IgNAR están englobados por fragmentos de inmunoglobulina.

Las inmunoglobulinas y los fragmentos de las mismas se pueden modificar después de la traducción, p. ej., para añadir restos efectores tales como enlazadores químicos, restos detectables, tales como tintes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, restos quimioluminiscentes y similares, o se pueden utilizar restos de unión específica, tales como estreptavidina, avidina o biotina y similares, en los métodos y composiciones de la presente invención. En lo sucesivo se proporcionan ejemplos de moléculas efectoras adicionales.

Tal y como se usa en la presente memoria, "medio anticuerpo", "especie de medio anticuerpo" o "H1L1" se refieren a un complejo proteico que incluye una única cadena pesada y única ligera de anticuerpo, pero que carece de un enlace covalente con una segunda cadena de anticuerpo pesada y ligera. Dos medios anticuerpos pueden permanecer asociados de forma no covalente en algunas condiciones (lo que puede dar un comportamiento similar a un anticuerpo completo, p. ej., peso molecular aparente determinado por cromatografía de exclusión por tamaño). De manera similar, H2L1 se refiere a un complejo proteico que incluye dos cadenas pesadas de anticuerpo y una sola cadena ligera de anticuerpo, pero carece de un enlace covalente a una segunda cadena ligera de anticuerpo; estos complejos también pueden asociarse de forma no covalente con otra cadena ligera de anticuerpo (y de igual manera dar un comportamiento similar a un anticuerpo completo). Al igual que los anticuerpos completos, las especies de medio anticuerpo y las especies de H2L1 pueden disociarse en condiciones reductoras en cadenas ligeras y pesadas individuales. La especie de medio anticuerpo y la especie de H2L1 se pueden detectar en un gel de SDS-PAGE no reducido como una especie que migra a un peso molecular aparente menor que el anticuerpo completo, p. ej., H1L1 migra a aproximadamente la mitad del peso molecular aparente del anticuerpo completo (p. ej., aproximadamente 75 kDa).

Tal y como se usa en la presente memoria, "levadura poliploide que expresa de manera estable o expresa un polipéptido heterólogo secretado deseado durante un tiempo prolongado" se refiere a un cultivo de levadura que secreta dicho polipéptido durante al menos varios días a una semana, más preferiblemente al menos un mes, aún más preferiblemente al menos 1-6 meses, e incluso más preferiblemente durante más de un año en niveles de expresión umbral, típicamente al menos 50-500mg/litro (después de aproximadamente 90 horas en cultivo) y preferiblemente sustancialmente mayor.

Tal y como se usa en la presente memoria, "cultivo de levadura poliploide que secreta cantidades deseadas de polipéptido recombinante" se refiere a cultivos que secretan de manera estable o durante períodos prolongados al menos al menos 50-500mg/litro, y lo más preferiblemente 500-1.000 mg/litro o más.

Una secuencia polinucleotídica "corresponde" a una secuencia polipeptídica si la traducción de la secuencia polinucleotídica de acuerdo con el código genético rinde la secuencia polipeptídica (es decir, la secuencia polinucleotídica "codifica" la secuencia polipeptídica), una secuencia polinucleotídica "corresponde" a otra secuencia polinucleotídica si las dos secuencias codifican la misma secuencia polipeptídica.

Una región o un dominio “heterólogo” de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN mayor que no se encuentra asociado a la molécula mayor en la naturaleza. Por tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen estará normalmente flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una región heteróloga es una construcción donde la secuencia codificante en sí misma no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADNc donde la secuencia codificante genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes al gen nativo). Las variaciones alélicas o los eventos mutacionales de origen natural no generan una región heteróloga de ADN como se define en la presente memoria.

Una "secuencia codificante " es una secuencia de codones en marco que (en vista del código genético) corresponde a o codifica una proteína o secuencia peptídica. Dos secuencias codificantes se corresponden entre sí si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia codificante en asociación con secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción normalmente se ubicarán en 3' con respecto a la secuencia codificante. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). Las secuencias promotoras contienen típicamente sitios adicionales para la unión de moléculas reguladoras (p. ej., factores de transcripción) que afectan la transcripción de la secuencia codificante. Una secuencia codificante está "bajo el control" de la secuencia promotora o "unida operativamente" al promotor cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia promotora en una célula y transcribe la secuencia codificante en ARNm, que a su vez se traduce en la proteína codificada por la secuencia codificante.

Los vectores se usan para introducir una sustancia extraña, tal como ADN, ARN o proteína, en un organismo o célula huésped. Los vectores típicos incluyen virus recombinantes (para polinucleótidos) y liposomas (para polipéptidos). Un "vector de ADN" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento de polinucleótido, para producir la replicación del segmento unido. Un "vector de expresión" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigirán la síntesis de polipéptidos por una célula huésped apropiada. Esto significa habitualmente un promotor para unir a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de ARNm, así como sitios de unión a ribosomas y señales de inicio para dirigir la traducción del ARNm en un o unos polipéptidos. La incorporación de una secuencia de polinucleótidos en un vector de expresión en el sitio apropiado y en el marco de lectura correcto, seguida de la transformación de una célula huésped apropiada por el vector, permite la producción de un polipéptido codificado por dicha secuencia de polinucleótidos.

La “amplificación” de secuencias de polinucleótidos es la producción in vitro de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico particular. La secuencia amplificada está habitualmente en forma de ADN. En los siguientes artículos de revisión se describen diversas técnicas para llevar a cabo dicha amplificación: Van Brunt 1990, Bio/Technol., 8(4):291-294; y Gill y Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008 mar;27(3):224-43. La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificación de ácido nucleico, y el uso de la PCR en la presente memoria debería considerarse ejemplar de otras técnicas de amplificación adecuadas.

Actualmente, se conoce bien la estructura general de los anticuerpos en la mayoría de los vertebrados (incluyendo los mamíferos) (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Los anticuerpos convencionales consisten en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas con un peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons (la "cadena ligera"), y dos cadenas pesadas idénticas con un peso molecular de 53.000-70.000 (la "cadena pesada"). Las cuatro cadenas están unidas mediante enlaces disulfuro en una configuración “Y” donde las cadenas ligeras rodean a las cadenas pesadas comenzando en la boca de la configuración "Y". La parte “rama” de la configuración “Y” se designa región F^ab; la parte tallo de la configuración “Y” se designa región F^c . La orientación de la secuencia de aminoácidos va desde el extremo N-terminal en la parte superior de la configuración "Y" hasta el extremo C-terminal en la parte inferior de cada cadena. El extremo N-terminal posee la región variable que tiene especificidad por el antígeno que lo incitó, y tiene una longitud de aproximadamente 100 aminoácidos, existiendo ligeras variaciones entre la cadena ligera y pesada y de anticuerpo a anticuerpo.

La región variable está unida en cada cadena a una región constante que se extiende en la longitud restante de la cadena y que dentro de una clase particular de anticuerpo no varía con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antígeno que lo incita). Hay cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de la molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE correspondientes a las regiones constantes de cadena pesada gamma, mu, alfa, delta y épsilon). La región o clase constante determina la función efectora posterior del anticuerpo, incluyendo la activación del complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2a Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), y otras respuestas celulares (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, p 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983)); mientras que la región variable determina el antígeno con el que reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Cada clase de cadena pesada se puede emparejar con cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada están unidas covalentemente entre sí y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan bien por hibridomas o por células B.

La expresión "región variable" o "VR" se refiere a los dominios dentro de cada par de cadenas ligera y pesada en un anticuerpo que están directamente implicados en la unión del anticuerpo al antígeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V^l) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.

Las expresiones “región determinante de la complementariedad”, “región hipervariable” o “CDR” se refieren a una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o hipervariables que se encuentran en las regiones variables de las cadenas ligera o pesada de un anticuerpo (Véase Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones hipervariables que se definen en Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia y Lesk, J Mol. Biol. 196901-917 (1987)). Las CDR de cada cadena se mantienen en gran proximidad mediante regiones marco y, junto con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno. Dentro de las CDR hay aminoácidos selectos que han sido descritos como las regiones determinantes de la selectividad (SDR) que representan los residuos de contacto críticos usados por las CDR en la interacción anticuerpo-antígeno (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).

Las expresiones "región marco" o "FR" se refieren a una o más de las regiones marco en las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo (Véase Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen aquellas regiones de secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo.

La expresión "número de

de copias de un gen (tal como un gen de cadena de anticuerpos) durante un período de tiempo prolongado (tal como al menos un día, al menos una semana, o al menos un mes o más) o durante un número prolongado de generaciones de propagación (p. ej., al menos 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500 o 1.000 generaciones, o más). Por ejemplo, en un punto de tiempo o número de generaciones dado, al menos el 50 %, y preferiblemente al menos el 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más de las células en el cultivo puede mantener el mismo número de copias del gen que en la célula de partida. En una realización preferida, la célula huésped contiene un número de estable del gen que codifica la proteína deseada o que codifica cada subunidad del complejo con múltiples subunidades deseado (p. ej., anticuerpo).

La expresión "expresa de manera estable" se refiere a una célula huésped que mantiene niveles similares de expresión de un gen o proteína (tal como un anticuerpo) durante un período de tiempo prolongado (tal como al menos un día, al menos una semana, o al menos un mes, o más) o durante un número prolongado de generaciones de propagación (p. ej., al menos 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500 o 1.000 generaciones, o más). Por ejemplo, en un punto de tiempo o número de generaciones dado, la tasa de producción o rendimiento del gen o proteína puede ser al menos el 50 %, y preferiblemente al menos el 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más de la tasa inicial de producción. En una realización preferida, la célula huésped expresa de manera estable la proteína o el complejo con múltiples subunidades deseado (p. ej., anticuerpo).

Recuperación y purificación de proteínas recombinantes

Los anticuerpos monoclonales se han convertido en agentes terapéuticos prominentes, pero su proceso de purificación debe producir de manera fiable y predecible un producto adecuado para su uso en los seres humanos. Las impurezas tales como proteínas de la célula huésped, ADN, virus adventicios y endógenos, endotoxina, agregados y otras especies, p. ej., glicovariantes, deben controlarse mientras se mantiene un rendimiento aceptable del producto de anticuerpo deseado. Además, las impurezas introducidas durante el proceso de purificación (p. ej., Proteína A lixiviada, extraíbles de resinas y filtros, tampones del proceso y agentes tales como detergentes) también deben eliminarse antes de que el anticuerpo pueda usarse como un agente terapéutico.

Procesos de recuperación primarios

La primera etapa en la recuperación de un anticuerpo de un cultivo celular es la recogida. Las células y los restos celulares se eliminan para rendir un fluido filtrado clarificado adecuado para cromatografía, es decir, fluido de cultivo celular recogido (HCCF). Los métodos ejemplares para la recuperación primaria incluyen centrifugación, filtración de profundidad y filtración estéril, floculación, precipitación y/u otros enfoques aplicables dependiendo de la escala y la capacidad de la instalación.

Centrifugación

En una realización, las células y los restos celulares floculados se eliminan del caldo mediante centrifugación. La centrifugación se puede usar para la fabricación a escala piloto y comercial. Preferiblemente, la centrifugación se usa en la fabricación a gran escala para proporcionar fluido de cultivo celular recogido de cultivos celulares con un porcentaje de sólidos de > 3 % (es decir, niveles elevados de restos celulares submicrónicos).

Las centrífugas estándar de pila de discos no herméticas, así como las centrífugas completamente herméticas son capaces de eliminar células y restos celulares grandes, aunque las centrífugas completamente herméticas pueden reducir significativamente la cantidad de lisis celular que se produce durante la operación de esta unidad, p. ej., al menos un 50 %, evitando el desbordamiento y minimizando el cizallamiento.

La eficiencia de la clarificación del proceso de centrifugación se ve afectada por parámetros de la recogida tales como la velocidad de alimentación de la centrífuga, la fuerza G, la geometría del tazón, las presiones operativas, la frecuencia de descarga y el equipo auxiliar usado en la transferencia de fluido de cultivo celular a la centrífuga. Las características del proceso de cultivo celular, tales como la densidad celular máxima, la densidad celular total y la viabilidad del cultivo durante el proceso de cultivo y en la recogida, también pueden afectar el rendimiento de la separación. El proceso de centrifugación se puede optimizar para seleccionar la velocidad de alimentación y la velocidad de rotación del tazón usando los factores de escala de la velocidad de alimentación (Q) y el área de sedimentación equivalente (X) en la centrífuga. El proceso optimizado puede minimizar la lisis celular y la generación de restos celulares mientras maximiza la sedimentación de partículas submicrónicas y el rendimiento del producto.

Filtración

La microfiltración de flujo tangencial también se puede usar en la recogida de las células. En particular, el fluido de cultivo celular fluye tangencialmente a la membrana microporosa, y el flujo de filtrado impulsado por presión separa el producto soluble de las células insolubles más grandes. El ensuciamiento de la membrana está limitado por la elevación inercial y la difusión inducida por el cizallamiento generada por el flujo turbulento a través de la superficie de la membrana.

Se puede lograr una recogida de alto rendimiento mediante una serie de etapas de concentración y diafiltración. En la primera, se reduce el volumen del fluido de cultivo celular, lo que da como resultado la concentración de la masa sólida. La etapa de diafiltración lava entonces el producto de la mezcla de fluido de cultivo celular concentrado. Como ejemplo, se puede emplear un tamaño de poro de 0,22 pm para la membrana TFF, ya que produce el fluido de cultivo celular recogido con la calidad diana (adecuado para cromatografía) sin la necesidad de clarificación adicional. Alternativamente, se pueden usar tamaños de poros más abiertos en la barrera TFF para manejar mejor el ensuciamiento; sin embargo, los tamaños de poros más abiertos pueden requerir una etapa de clarificación adicional (p. ej., filtración de profundidad de flujo normal) aguas abajo del sistema TFF. Preferiblemente, se usa TFF para cultivos celulares con un porcentaje de sólidos de < 3 %.

Los filtros de profundidad también se pueden usar en la clarificación de caldos de cultivo celular, para mantener la capacidad de los filtros de membrana o para proteger las columnas de cromatografía o filtros de virus. Los filtros de profundidad pueden estar compuestos, p. ej., de celulosa, un auxiliar de filtro poroso tal como tierra de diatomeas, un aglutinante de resina con carga iónica y una resina aglutinante (presente en un pequeño porcentaje en peso para unir covalentemente materiales de construcción diferentes entre sí, proporcionando al medio resultante fuerza húmeda y confiriendo carga positiva a las superficies del medio). Los filtros de profundidad se basan tanto en la exclusión por tamaño como en la unión por adsorción para efectuar la separación. Los filtros de profundidad ejemplares tienen un espesor de aproximadamente 2-4 mm.

Para aplicaciones de recogida, los filtros de profundidad se pueden aplicar directamente con el caldo de células completo o junto con un separador primario, p. ej., TFF o centrifugación. Por ejemplo, cuando se usa para la recogida con filtro de profundidad del caldo de células completo, el tren de filtración contiene tres estadios de filtros: (1) el primer estadio con un filtro grueso o de profundidad abierto con un tamaño de poro de hasta 10 pm para eliminar las células completas y las partículas grandes; (2) el estadio secundario con un filtro de profundidad más ajustado para clarificar las partículas coloidales y submicrónicas; y (3) el tercer estadio con un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,2 pm. Aunque el proceso de filtración se escala generalmente linealmente, se puede emplear un factor de seguridad de 1,5X a >3X para cada estadio para asegurar una capacidad adecuada de los filtros.

En una realización, se emplea un filtro de profundidad después de la centrifugación para clarificar aún más el caldo recogido, p. ej., porque existe un límite inferior práctico para el tamaño de partícula que puede eliminarse mediante centrifugación. Por ejemplo, el filtro de profundidad puede comprender dos capas distintas (siendo la zona aguas arriba un grado grueso en comparación con la de aguas abajo) y tiene un rango de tamaño de poro de 0,1-4 pm. Las partículas más grandes quedan atrapadas en el medio de filtro de grado grueso y las partículas más pequeñas quedan atrapadas en el medio más compacto, lo que reduce el taponamiento prematuro y aumenta la capacidad de la filtración.

La optimización del tipo de filtro, tamaño de poro, área de superficie y flujo se puede realizar a escala de laboratorio y luego aumentar de escala a escala piloto en función, p. ej., de la turbidez centrada y la distribución del tamaño de partículas. Los experimentos de dimensionamiento del filtro de profundidad se realizan generalmente a un flujo constante usando puntos finales de presión en una cualquiera o una combinación de etapas de filtración. Preferiblemente, se usa un filtro de grado 0,22 pm para filtrar el sobrenadante al final del proceso de recogida para controlar la carga biológica. El sobrenadante filtrado a través de 0,22 pm se puede almacenar a 2-8 °C durante varios días o más sin que cambie el perfil de variante relacionada con producto de anticuerpo.

Sin pretender la vinculación a ninguna teoría, se cree que el mecanismo de adsorción de los filtros de profundidad permite su uso extensivo como una herramienta de purificación para eliminar un amplio rango de impurezas y contaminantes del proceso. En particular, las interacciones electrostáticas entre las cargas positivas de los filtros de profundidad y las moléculas de ADN, así como las interacciones hidrófobas entre los medios de filtración de profundidad y las moléculas de ADN, pueden desempeñar un papel importante en la reducción por adsorción del ADN. Por ejemplo, se han usado filtros de profundidad cargados para eliminar el ADN, y el nivel de cargas en Zeta Plus (Cuno) 90SP se ha correlacionado con su capacidad para eliminar el ADN. Además, a modo de ejemplo, se han usado filtros de profundidad cargados positivamente para eliminar endotoxinas derivadas de Escherichia coli y otras endotoxinas endógenas y virus, muchas veces más pequeñas que el tamaño promedio de poro del filtro, y se encontró que los filtros de profundidad de la serie Zeta Plus® (Cuno) VR se unen a retrovirus con cubierta y parvovirus sin cubierta por adsorción. También se empleó la filtración en profundidad para eliminar los priones enriquecidos de una disolución de inmunoglobulina. Además, se ha mostrado que la eliminación de proteínas de la célula huésped mediante filtración de profundidad antes de una columna de cromatografía de afinidad de Proteína A reduce significativamente la precipitación durante el ajuste del pH del combinado de la Proteína A.

Floculación y precipitación

En una realización, se usan etapas de pretratamiento basadas en precipitación/floculación para reducir la cantidad de restos celulares y coloides en el fluido de cultivo celular, que puede exceder la capacidad del equipo del tren de filtración existente. La floculación implica la adsorción de polímeros, p. ej., atracción electrostática, a la célula y los restos celulares mediante, p. ej., polímeros catiónicos, neutros y aniónicos, para eliminar los contaminantes celulares dando como resultado una mejor eficiencia de clarificación y un alto rendimiento de recuperación. Se cree que los reactivos de floculación, p. ej., cloruro de calcio y fosfato de potasio, a niveles muy bajos, p. ej., cloruro de calcio 20­ 60 mM con una cantidad equimolar de fosfato añadido para formar fosfato de calcio, contribuyen a la coprecipitación de fosfato de calcio con células, restos celulares e impurezas.

En una realización, los procesos de purificación descritos incluyen el tratamiento del caldo de células completo con ácido etilen diamina tetraacético (EDTA) a una concentración final 3 mM y con un agente floculante, eliminación posterior de células y restos celulares floculados por centrifugación, seguido de clarificación a través de filtros de profundidad y de 0,2 pm.

Cromatografía

En la industria biofarmacéutica, la cromatografía es una tecnología de separación y purificación crítica y ampliamente usada debido a su alta resolución. La cromatografía explota las diferencias físicas y químicas entre biomoléculas para la separación. Por ejemplo, la cromatografía de Proteína A puede seguir a la recogida para rendir un producto relativamente puro que requiere la eliminación de solo una pequeña proporción de impurezas relacionadas con el proceso y el producto. A continuación, se pueden emplear una o dos etapas de cromatografía adicionales como etapas de pulido, p. ej., incorporando cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de modo mixto y/o cromatografía de hidroxiapatita. Estas etapas pueden proporcionar un aclaramiento adicional de virus, proteínas y ADN de la célula huésped, así como eliminar agregados, especies variantes del producto no deseadas y otros contaminantes menores. Por último, el producto purificado se puede concentrar y diafiltrar en el tampón de formulación final.

La purificación de anticuerpos implica el enriquecimiento selectivo o el aislamiento específico de anticuerpos del suero (anticuerpos policlonales), líquido ascítico o sobrenadante de cultivo celular de una línea celular (anticuerpos monoclonales). Los métodos de purificación varían desde muy crudos hasta muy específicos y se pueden clasificar de la siguiente manera:

Fraccionamiento físico-químico - precipitación diferencial, exclusión por tamaño o unión en fase sólida de inmunoglobulinas según el tamaño, la carga u otras características químicas compartidas de los anticuerpos en muestras típicas. Esto aísla un subconjunto de proteínas de la muestra que incluye las inmunoglobulinas.

Fraccionamiento por afinidad -: unión de clases particulares de anticuerpos (p. ej., IgG) por ligandos biológicos inmovilizados (p. ej., proteínas) que tienen afinidad específica por las inmunoglobulinas (que purifica todos los anticuerpos de la clase diana sin tener en cuenta la especificidad del antígeno) o purificación por afinidad solo de los anticuerpos en una muestra que se unen a una molécula de antígeno particular a través de sus dominios de unión a antígeno específicos (que purifica todos los anticuerpos que se unen al antígeno sin tener en cuenta la clase o isotipo del anticuerpo).

Las principales clases de inmunoglobulinas séricas (p. ej., IgG e IgM) comparten la misma estructura general, incluyendo la composición general de aminoácidos y las características de solubilidad. Estas propiedades generales son lo suficientemente diferentes de la mayoría de las otras proteínas abundantes en suero, p. ej., albúmina y transferrina, como para que las inmunoglobulinas puedan seleccionarse y enriquecerse en función de estas propiedades físico-químicas diferenciadoras.

Purificación de anticuerpos por fraccionamiento físico-químico

Precipitación con sulfato de amonio

La precipitación con sulfato de amonio se usa con frecuencia para enriquecer y concentrar anticuerpos del suero, líquido ascítico o sobrenadante de cultivo celular. A medida que aumenta la concentración de la sal liotrópica en una muestra, las proteínas y otras macromoléculas se vuelven progresivamente menos solubles hasta que precipitan, es decir, el efecto liotrópico se denomina "precipitación con sales". Los anticuerpos precipitan a concentraciones más bajas de sulfato de amonio que la mayoría de las demás proteínas y componentes del suero.

A aproximadamente 40 a aproximadamente el 50 % de saturación de sulfato de amonio (siendo el 100 % de saturación igual a 4,32M), las inmunoglobulinas precipitan, mientras otras proteínas permanecen en disolución. Véase, p. ej., Harlow, E. y Lane, D. (1988). Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Gagnon, P. (1996). A modo de ejemplo, se añade lentamente un volumen igual de disolución saturada de sulfato de amonio a una muestra de anticuerpo neutralizada, seguido de incubación durante varias horas a temperatura ambiente o 4 °C. Después de la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, el sedimento de anticuerpos se disuelve en tampón, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS).

La selectividad, rendimiento, pureza y reproducibilidad de la precipitación depende de varios factores que incluyen, pero no están limitados a, tiempo, temperatura, pH y velocidad de adición de sal. Véase, p. ej., Gagnon, P.S. (1996). Purification Tools for Monoclonal Antibodies. Validated Biosystems. Tuscon, AZ. La precipitación con sulfato de amonio puede proporcionar una purificación suficiente para algunas aplicaciones de anticuerpos, pero a menudo se realiza como una etapa preliminar antes de la cromatografía en columna u otro método de purificación. El uso de muestras de anticuerpos parcialmente purificadas puede mejorar el rendimiento y prolongar la vida útil de las columnas de afinidad.

Los reactivos de precipitación de anticuerpos adecuados distintos del sulfato de amonio para situaciones de purificación de anticuerpos incluyen, a modo de ejemplo, ácido octonoico, polietilenglicol y etacridina.

Se han adaptado y optimizado numerosos métodos de cromatografía en fase sólida de base química para lograr la purificación de anticuerpos en situaciones particulares.

Cromatografía de intercambio iónico (IEC)

La cromatografía de intercambio iónico (IEC) usa resinas cargadas positiva o negativamente para unir proteínas en función de sus cargas netas en un sistema tampón (pH) dado. Se pueden determinar las condiciones de IEC que se unen y liberan el anticuerpo diana con un alto grado de especificidad, lo que puede ser especialmente importante en operaciones comerciales que implican la producción de anticuerpos monoclonales. A la inversa, se pueden encontrar condiciones que se unen a casi todos los demás componentes de la muestra, excepto a los anticuerpos. Una vez optimizada, la IEC es un método rentable, suave y fiable para la purificación de anticuerpos.

La cromatografía de intercambio aniónico usa un grupo cargado positivamente inmovilizado en la resina. Por ejemplo, Se pueden usar grupos débilmente básicos tales como dietilamino etilo (DEAE) o dimetilamino etilo (DMAE), o grupos fuertemente básicos tales como amino etilo cuaternario (Q) o trimetilamonio etilo (TMAE) o aminoetilo cuaternario (QAE)) en intercambio aniónico. Los medios de intercambio aniónico ejemplares incluyen, pero no están limitados a, GE Healthcare Q-Sefarosa FF, Q-Sefarosa BB, Q-Sefarosa XL, Q-Sefarosa HP, Mini Q, Mono Q, Mono P, DEAE Sefarosa FF, Source 15Q, Source 30Q, Capto Q, Streamline DEAE, Streamline QXL; Applied Biosystems Poros HQ 10 y 20 um auto empaquetada, Poros HQ 20 y 50 um, Poros PI 20 y 50 um, Poros D 50 um; Tosohaas Toyopearl DEAE 650S M y C, Super Q 650, QAE 550C; Pall Corporation DEAE Hyper D, Q Ceramic Hyper D, absorbente de membrana Mustang Q; Merck KG2A Fractogel DMAE, FractoPrep DEAE, Fractoprep TMAE, Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE; absorbente de membrana Sartorious Sartobind Q.

El intercambio aniónico es particularmente útil para eliminar impurezas relacionadas con el proceso (p. ej., proteínas de la célula huésped, retrovirus endógenos y virus adventicios tales como parvovirus o virus de la pseudorrabia, ADN, endotoxina y Proteína A lixiviada), así como impurezas relacionadas con el producto (p. ej., dímero/agregado). Se puede usar bien en modo de flujo continuo o en modo de unión y elución, dependiendo del pI del anticuerpo y de las impurezas a eliminar. Por ejemplo, el modo de flujo continuo se usa preferiblemente para eliminar impurezas de anticuerpos que tienen un pI superior a 7,5, p. ej., la mayoría de los anticuerpos IgG1 e IgG2 humanizados o humanos, porque las impurezas se unen a la resina y el producto de interés fluye a través. La capacidad de carga de la columna, es decir, masa de anticuerpo frente a masa de resina, puede ser bastante alta ya que los sitios de unión en la resina están ocupados únicamente por las impurezas. La cromatografía de intercambio aniónico en modo de flujo continuo se puede usar como una etapa de pulido en los procesos de purificación de anticuerpos monoclonales diseñados con dos o tres operaciones unitarias para eliminar las impurezas residuales tales como proteína de la célula huésped, ADN, Proteína A lixiviada y una variedad de virus. A modo de ejemplo, el pH operativo es de aproximadamente 8 a aproximadamente 8,2, con una conductividad de hasta 10 mS/cm en la carga de producto y los tampones de equilibrado y lavado.

Alternativamente, el modo de unión y elución se usa preferiblemente para eliminar impurezas relacionadas con el proceso y relacionadas con el producto de los anticuerpos que tienen un pI en el rango ácido a neutro, p. ej., la mayoría de las IgG4 humanizadas o humanas. Para el modo de unión y elución, el combinado de productos de anticuerpos se carga primero en una columna de intercambio aniónico y luego el producto de interés se eluye con una concentración de sal más alta en un gradiente lineal o escalonado, dejando la mayoría de las impurezas unidas a la columna. Las impurezas se eluyen de la columna durante la etapa de limpieza o regeneración. Generalmente, el pH operativo debe estar por encima o cerca del pI del producto con el fin de obtener una carga negativa neta o un número de carga negativa más alto en la superficie de las moléculas de anticuerpo y, por lo tanto, lograr una mayor capacidad de unión durante la etapa de cromatografía. De manera similar, la fuerza iónica para la carga está preferiblemente en el rango bajo y el pH es preferiblemente menor de pH 9.

Además, la cromatografía de partición débil (WPC) se puede usar para permitir un proceso de recuperación de dos cromatografías que comprende la Proteína A y el intercambio aniónico. Generalmente, el proceso se opera de manera isocrática (como con la cromatografía de flujo continuo), pero la conductividad y el pH se eligen de manera que se aumenta la unión tanto del producto como de las impurezas (en contraste con el modo de flujo continuo), consiguiendo un coeficiente de partición del anticuerpo (Kp) entre 0,1-20, y preferiblemente entre 1 y 3. Tanto el anticuerpo como las impurezas se unen a la resina de intercambio aniónico, pero las impurezas se unen mucho más firmemente que en el modo de flujo continuo, lo que puede dar lugar a un incremento en la eliminación de las impurezas. El rendimiento del producto en el modo de partición débil puede maximizarse incluyendo un lavado corto al final de la carga, p. ej., un promedio del 90 % para la producción clínica.

La cromatografía de intercambio catiónico usa una resina modificada con grupos funcionales cargados negativamente. Por ejemplo, pueden usarse ligandos ácidos fuertes (p. ej., grupos sulfopropilo, sulfoetilo y sulfoisobutilo) o ligandos ácidos débiles (p. ej., grupo carboxilo) en el intercambio catiónico. Las resinas de intercambio catiónico ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, GE Healthcare SP-Sefarosa FF, SP-Sefarosa BB, SP-Sefarosa XL, SP-Sefarosa HP, Mini S, Mono S, CM Sefarosa FF, Source 15S, Source 30S, Capto S, MacroCap SP, Streamline SP-XL, Streamline CST-1; Tosohaas Resinas Toyopearl Mega Cap TI SP-550 EC, Toyopearl Giga Cap S-650M, Toyopearl 650S, M y C, Toyopeal SP650S, M, y C, Toyopeal SP550C; JT Baker Resinas Carboxi-Sulfona-5, 15 y 40 um, Sulfónico-5, 15, y 40 um; YMC BioPro S; Applied Biosystems Poros HS 20 y 50 um, Poros S 10 y 20 um; Pall Corp S Ceramic Hyper D, CM Ceramic Hyper D; Merck KGgA Resinas Fractogel EMD SO³ , Fractogel EMD COO-, Fractogel EMD SE Hicap, Fracto Prep SO3; Eshmuno S; Biorad Resina Unosphere S; absorbente de membrana Sartorius Membrana Sartobind S.

La cromatografía de intercambio catiónico es particularmente adecuada para los procesos de purificación de muchos anticuerpos monoclonales con valores de pI que varían de neutros a básicos, p. ej., subclases de IgG1 e IgG2 humanas o humanizadas. En general, el anticuerpo se une a la resina durante la etapa de carga y se eluye aumentando la conductividad o aumentando el pH en el tampón de elución. Las impurezas relacionadas con el proceso con carga más negativa, tal como el ADN, algunas proteínas de la célula huésped, la Proteína A lixiviada y la endotoxina, se eliminan en la fracción de carga y lavado. La cromatografía de intercambio catiónico también puede reducir las variantes de anticuerpos del producto de anticuerpo diana, tales como productos desamidados, especies oxidadas y formas truncadas en el extremo N, así como especies de alto peso molecular.

La capacidad de unión máxima alcanzada puede ser tan alta como > 100 g/L de volumen de resina dependiendo de las condiciones de carga, ligando de resina y densidad, pero la eliminación de impurezas depende en gran medida de la densidad de carga. Los mismos principios descritos para la cromatografía de intercambio aniónico con respecto al desarrollo del programa de elución se aplican también a la cromatografía de intercambio catiónico.

El desarrollo de las condiciones de elución está relacionado con la eliminación de impurezas y las características del combinado de productos que se pueden procesar fácilmente en la operación unitaria posterior. Generalmente, se puede realizar un programa de elución de gradiente lineal de sal o de pH para determinar la mejor condición de elución. Por ejemplo, las condiciones de elución de gradiente lineal pueden variar de NaCl 5 mM a 250 mM a pH 6 y las operaciones de elución de gradiente de pH lineal pueden variar de pH 6 a pH 8.

Cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados (IMAC)

La cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados (IMAC) usa iones metálicos divalentes inmovilizados con quelato (p. ej., níquel Ni2+) para unir proteínas o péptidos que contienen grupos de tres o más residuos de histidina consecutivos. Esta estrategia puede ser particularmente útil para la purificación de proteínas recombinantes que han sido preparadas por ingeniería para contener una etiqueta de fusión terminal 6xHis. Las IgG de mamíferos son una de las pocas proteínas abundantes en el suero (o en el sobrenadante del cultivo de células monoclonales) que poseen agrupaciones de histidina capaces de unirse a níquel inmovilizado. Al igual que la IEC, las condiciones de IMAC para la unión y elución se pueden optimizar para muestras particulares para proporcionar una purificación de anticuerpos suave y fiable. Por ejemplo, puede usarse IMAC para separar el anticuerpo marcado con AP o HRP (conjugado con enzima) del exceso de enzima no conjugada después de un procedimiento de marcaje.

Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC)

La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) separa las proteínas en función de su hidrofobicidad y es complementaria a otras técnicas que separan proteínas en función de la carga, el tamaño o la afinidad. Por ejemplo, una muestra cargada en la columna de HIC en un tampón con alto contenido de sal que reduce la solvatación de las moléculas de proteína en disolución, exponiendo así regiones hidrófobas en las moléculas de proteína de muestra que, en consecuencia, se unen a la resina HIC. Generalmente, cuanto más hidrófoba es la molécula, menos sal se necesita para promover la unión. A continuación, se puede usar un gradiente de concentración de sal decreciente para eluir muestras de la columna de HIC. En particular, a medida que disminuye la fuerza iónica, aumenta la exposición de las regiones hidrófilas de las moléculas y las moléculas eluyen de la columna en orden de hidrofobicidad creciente.

La HIC en modo de flujo continuo puede ser eficiente para eliminar un gran porcentaje de agregados con un rendimiento relativamente alto. La HIC en el modo de unión y elución puede proporcionar una separación eficaz de las impurezas relacionadas con el proceso y relacionadas con el producto del producto del anticuerpo. En particular, la mayoría de la proteína, el ADN y los agregados de la célula huésped pueden eliminarse del producto de anticuerpo mediante la selección de una concentración de sal adecuada en el tampón de elución o el uso de un método de elución en gradiente.

Las resinas de HIC ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, GE Healthcare Resinas HIC (Butil Sefarosa 4 FF, Butil-S Sefarosa FF, Octil Sefarosa 4 FF, Fenil Sefarosa BB, Fenil Sefarosa HP, Fenil Sefarosa 6 FF High Sub, Fenil Sefarosa 6 FF Low Sub, Source 15ETH, Source 15ISO, Source 15PHE, Capto Fenilo, Capto Butilo, Sreamline Fenilo); Tosohaas Resinas HIC (TSK Éter 5PW (20 um y 30 um), TSK Fenilo 5PW (20 um y 30 um), Fenil 650S, M, y C, Butil 650S, M y C, Hexil-650M y C, Éter-650S y M, Butil-600M, Super Butil-550C, Fenil-600M; PPG-600M); Waters Resinas HIC (YMC-Pack Octil Columnas-3, 5, 10P, 15 y 25 um con tamaños de poro 120, 200, 300A, YMC-Pack Fenil Columnas-3, 5, 10P, 15 y 25 um con tamaños de poro 120, 200 y 300A, YMC-Pack Butil Columnas-3, 5, 10P, 15 y 25 um con tamaños de poro 120, 200 y 300A); CHISSO Corporation Resinas HIC (Cellufine Butilo, Cellufine Octilo, Cellufine Fenilo); JT Baker Resina HIC (WP HI-Propil (C3)); Biorad Resinas HIC (Macroprep t-Butilo, Macroprep metilo); y Applied Biosystems Resina HIC (Alta Densidad Fenil-HP220 um). Por ejemplo, p Pg 600-M se caracteriza por un peso molecular límite de exclusión de aproximadamente 8x105 Dalton, un ligando polipropilenglicol PPG, un tamaño de partícula de 45-90 pm, hidrofobicidad dada por la relación Éter > PPG > Fenilo y capacidad de unión dinámica (MAb: Anti LH) de 38mg/mL-gel.

En una realización, los procesos de purificación descritos emplean cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) como etapa de purificación de pulido después de cromatografía de afinidad (p. ej., Proteína A) y cromatografía de modo mixto (p. ej., hidroxiapatita). Véase, la Figura 1. Preferiblemente, la resina de HIC es polipropilenglicol (PPG-600M) o Fenil-600M. En una realización, la elución se realiza como un gradiente lineal (0-100 %) de sulfato de sodio de aproximadamente 0,7 M a 0 M en un tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 7. Opcionalmente, se monitoriza la DO280 del efluente y se recoge una serie de fracciones, p. ej., aproximadamente un tercio del volumen de recogida, para su posterior análisis de pureza. Preferiblemente, las fracciones recogidas incluyen de 0,1 de DO en el flanco frontal a 0,1 de DO en el flanco trasero.

Cromatografía de inducción de carga hidrófoba (HCIC)

La cromatografía de inducción de carga hidrófoba (HCIC) se basa en el comportamiento dependiente del pH de los ligandos que se ionizan a un pH bajo. Esta técnica emplea ligandos heterocíclicos a altas densidades de modo que la adsorción puede ocurrir a través de interacciones hidrófobas sin la necesidad de altas concentraciones de sales liotrópicas. La desorción en HCIC se facilita reduciendo el pH para producir repulsión de carga entre el ligando ionizable y la proteína unida. Una resina de HCIC comercial ejemplar es MEP-Hypercel (Pall Corporation), que es un medio a base de celulosa con 4-mercaptoetil piridina como el grupo funcional. El ligando es un resto hidrófobo con un anillo N-heterocíclico que adquiere una carga positiva a pH bajo.

Adsorción tiofílica

La adsorción tiofílica es un tipo de interacción proteína-ligando altamente selectiva, que combina las propiedades de la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y la precipitación con sulfato de amonio (es decir, el efecto liotrópico), que implica la unión de proteínas a un grupo sulfona muy cerca de un tioéter. En contraste con la HIC estricta, la adsorción tiofílica depende de una alta concentración de sal liotrópica (p. ej., sulfato de potasio en oposición al cloruro de sodio). Por ejemplo, la unión es bastante específica para una muestra de anticuerpo típica que se ha equilibrado con sulfato de potasio. Después de eliminar por lavado los componentes no unidos, los anticuerpos se recuperan fácilmente con condiciones de elución suaves (p. ej., tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7 a 8). El adsorbente tiofílico (también llamado T-Gel) es agarosa en perlas al 6 % modificada para contener el ligando sulfona-tioéter, que tiene una alta capacidad de unión y una amplia especificidad hacia la inmunoglobulina de varias especies animales.

Purificación de anticuerpos por afinidad

La cromatografía de afinidad (también llamada purificación por afinidad) hace uso de interacciones de unión específicas entre moléculas. Generalmente, un ligando particular se inmoviliza químicamente o se "acopla" a un soporte sólido de modo que cuando se pasa una mezcla compleja por la columna, se unen las moléculas que tienen afinidad de unión específica para el ligando. Una vez que se eliminan por lavado otros componentes de la muestra, la molécula unida se quita del soporte, lo que resulta en su purificación de la muestra original.

Soportes

La purificación por afinidad implica la separación de moléculas en disolución (fase móvil) en función de las diferencias en la interacción de unión con un ligando que está inmovilizado en un material estacionario (fase sólida). Un soporte o matriz en purificación por afinidad es cualquier material al que se une covalentemente un ligando bioespecífico. Típicamente, el material que se va a usar como matriz de afinidad es insoluble en el sistema en el que se encuentra la molécula diana. Habitualmente, pero no siempre, la matriz insoluble es un sólido.

Los soportes de afinidad útiles son aquellos con una alta relación de área superficial a volumen, grupos químicos que se modifican fácilmente para la unión covalente de ligandos, propiedades de unión no específica mínimas, buenas características de flujo y estabilidad mecánica y química.

Los ligandos inmovilizados o las químicas de soporte de afinidad activadas están disponibles para su uso en varios formatos diferentes, que incluyen, p. ej., resinas de agarosa o poliacrilamida en forma de perlas reticuladas y microplacas de poliestireno.

Los soportes de gel poroso proporcionan una matriz suelta en la que las moléculas de muestra pueden fluir libremente a través de una gran área superficial de ligando inmovilizado, lo que también es útil para la purificación por afinidad de proteínas. Estos tipos de soportes son normalmente resinas poliméricas basadas en azúcar o acrilamida que se producen en disolución (es decir, hidratadas) como perlas de 50-150 pm de diámetro. El formato de perlas permite que estas resinas se suministren como suspensiones de sólidos húmedas que se pueden dispensar fácilmente para llenar y "empaquetar" columnas con lechos de resina de cualquier tamaño. Las perlas son extremadamente porosas y lo suficientemente grandes como para que las biomoléculas (proteínas, etc.) puedan fluir tan libremente dentro y a través de las perlas como entre y alrededor de la superficie de las perlas. Los ligandos se unen covalentemente al polímero en forma de perlas (superficies externas e internas) por diversos medios.

Por ejemplo, la agarosa en forma de perlas reticulada está disponible típicamente en densidades del 4 % y 6 % (es decir, un lecho de resina de 1 ml es más del 90 % de agua en volumen). La agarosa en forma de perlas puede ser adecuada para procedimientos de flujo por gravedad, centrifugación a baja velocidad y baja presión. Alternativamente, las resinas en forma de perlas basadas en poliacrilamida generalmente no se comprimen y pueden usarse en aplicaciones de presión media con una bomba peristáltica u otros sistemas de cromatografía líquida. Ambos tipos de soporte poroso tienen generalmente características de unión no específica bajas. En la Tabla 1 a continuación se proporciona un resumen de las propiedades físicas de estas resinas de cromatografía de afinidad.

Tabla 1. Propiedades físicas de las resinas de cromatografía de afinidad

Las partículas magnéticas son otro tipo más de soporte de afinidad sólido. Son mucho más pequeñas (típicamente 1-4 pm de diámetro), lo que proporciona la relación suficiente de área superficial a volumen necesaria para una inmovilización eficaz del ligando y una purificación por afinidad. La purificación por afinidad con partículas magnéticas se realiza en lotes, p. ej., se mezclan unos pocos microlitros de perlas con varios cientos de microlitros de muestra como una suspensión de sólidos suelta. Durante el mezclado, las perlas permanecen suspendidas en la disolución de muestra, lo que permite que se produzcan interacciones de afinidad con el ligando inmovilizado. Después de haber dado un tiempo suficiente para la unión, las perlas se recogen y se separan de la muestra utilizando un imán potente. Típicamente, los procedimientos simples de mesa se realizan en tubos de microcentrífuga, y el pipeteo o decantación se usa para extraer la muestra (o disoluciones de lavado, etc.) mientras las perlas magnéticas se mantienen en su lugar en la parte inferior o lateral del tubo con un imán adecuado.

Las partículas magnéticas son particularmente adecuadas para la automatización de alto rendimiento y, a diferencia de las resinas porosas, se pueden usar en lugar de los procedimientos de separación celular.

Cada sistema de afinidad específico requiere su propio conjunto de condiciones y presenta sus propios desafíos peculiares para un propósito de investigación dado. Sin embargo, la purificación por afinidad generalmente implica las siguientes etapas:

1. Incubar la muestra cruda con el soporte de afinidad para permitir que la molécula diana en la muestra se una al ligando inmovilizado;

2. Eliminar por lavado del soporte los componentes de la muestra que no estén unidos; y

3. Eluir (disociar y recuperar) la molécula diana del ligando inmovilizado alterando las condiciones del tampón para que ya no se produzca la interacción de unión.

Los ligandos que se unen a clases generales de proteínas (p. ej., anticuerpos) o etiquetas de proteínas de fusión usadas comúnmente (p. ej., 6xHis) están disponibles comercialmente en formas preinmovilizadas listas para usar para la purificación por afinidad. Alternativamente, se pueden inmovilizar ligandos más especializados tales como anticuerpos o antígenos específicos de interés usando uno de varios soportes de afinidad activados disponibles comercialmente; por ejemplo, un antígeno peptídico puede inmovilizarse en un soporte y usarse para purificar anticuerpos que reconocen el péptido.

Lo más comúnmente, los ligandos se inmovilizan o "acoplan" directamente al material de soporte sólido mediante la formación de enlaces químicos covalentes entre grupos funcionales particulares en el ligando (p. ej., aminas primarias, sulfhidrilos, ácidos carboxílicos, aldehídos) y grupos reactivos en el soporte (véase el artículo relacionado sobre Inmovilización Covalente). Sin embargo, también son posibles los enfoques de acoplamiento indirecto. Por ejemplo, una proteína de fusión etiquetada con GST se puede capturar primero en un soporte de glutatión mediante la interacción de afinidad glutatión-GST y luego se puede reticular químicamente de forma secundaria para inmovilizarla. La proteína de fusión etiquetada con GST inmovilizada se puede usar luego para purificar por afinidad compañero(s) de unión de la proteína de fusión.

Tampones de unión y elución para purificación por afinidad

La mayoría de los procedimientos de purificación por afinidad que implican interacciones proteína:ligando usan tampones de unión a pH y fuerza iónica fisiológicos, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS), particularmente cuando las interacciones anticuerpo:antígeno o proteína:proteína nativa son la base para la purificación por afinidad. Una vez que se produce la interacción de unión, el soporte se lava con tampón adicional para eliminar los componentes no unidos de la muestra. Las interacciones de unión no específicas (p. ej., iónicas simples) se pueden minimizar añadiendo niveles bajos de detergente o mediante ajustes moderados de la concentración de sal en el tampón de unión y/o lavado. Finalmente, se añade tampón de elución (p. ej., glicina 0,1M^HCl, pH 2,5-3,0) para romper la interacción de unión (sin afectar permanentemente la estructura de la proteína) y liberar la molécula diana, que se recoge entonces en su forma purificada. El tampón de elución puede disociar los compañeros de unión por extremos de pH (bajo o alto), alto contenido de sal (fuerza iónica), el uso de detergentes o agentes caotrópicos que desnaturalizan una o ambas moléculas, la eliminación de un factor de unión o la competición con un contraligando. En algunos casos, puede ser necesaria una diálisis o desalación posterior para intercambiar la proteína purificada del tampón de elución a un tampón más adecuado para el almacenamiento o el procesamiento posterior.

Además, algunos anticuerpos y proteínas se dañan con un pH bajo, por lo que las fracciones de proteínas eluidas deben neutralizarse inmediatamente mediante la adición de 1/10 de volumen de tampón alcalino, p. ej., Tris 1M^HCl, pH 8,5. Otros tampones de elución ejemplares para la purificación por afinidad de proteínas se proporcionan en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Sistemas de tampones de elución ejemplares para la purificación de proteínas por afinidad

Varios métodos de purificación de anticuerpos implican técnicas de purificación por afinidad. Los enfoques ejemplares para la purificación por afinidad incluyen la precipitación con sulfato de amonio (purificación cruda de inmunoglobulina total a partir de otras proteínas del suero); purificación por afinidad con Proteína A, G, A/G o L inmovilizada (se une a la mayoría de las especies y subclases de IgG) o derivados de Proteína A, G, A/G, o L recombinante en modo de unión y elución; y purificación por afinidad con antígeno inmovilizado (antígeno purificado inmovilizado covalentemente a un soporte de afinidad para aislar el anticuerpo específico de muestras crudas) en modo de unión y elución.

La Proteína A, la Proteína G y la Proteína L son tres proteínas bacterianas cuyas propiedades de unión a anticuerpos se han caracterizado bien. Estas proteínas se han producido de forma recombinante y se han usado de forma rutinaria para la purificación por afinidad de tipos de anticuerpos clave de una variedad de especies. La mayoría de las formas recombinantes disponibles comercialmente de estas proteínas tienen secuencias innecesarias eliminadas (p. ej., el dominio de unión a HSA de la Proteína G) y, por lo tanto, son más pequeñas que sus equivalentes nativos. Una forma recombinante preparada por ingeniería genética de la Proteína A y Proteína G, llamada Proteína A/G, también está disponible. Los investigadores usan de forma rutinaria las cuatro proteínas de unión a Ig recombinantes en numerosas aplicaciones de inmunodetección e inmunoafinidad.

Para lograr la purificación de anticuerpos, con Proteína A, Proteína G, Proteína A/G se inmovilizan covalentemente sobre un soporte, p. ej., resinas porosas (tales como agarosa en forma de perlas) o perlas magnéticas. Debido a que estas proteínas contienen varios dominios de unión a anticuerpos, casi todas las moléculas inmovilizadas individuales, sin importar su orientación, mantienen al menos un dominio de unión funcional y sin obstáculos. Además, debido a que las proteínas se unen a los anticuerpos en sitios distintos del dominio de unión a antígeno, las formas inmovilizadas de estas proteínas se pueden usar en esquemas de purificación, tales como inmunoprecipitación, en los que la proteína de unión a anticuerpo se usa para purificar un antígeno de una muestra mediante la unión de un anticuerpo mientras está unido a su antígeno.

La alta afinidad de la Proteína A por la región Fc de los anticuerpos de tipo IgG es la base para la purificación de IgG, fragmentos y subclases de IgG. Generalmente, la cromatografía de Proteína A implica el paso de un sobrenadante de cultivo celular clarificado sobre la columna a un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, de manera que los anticuerpos se unen y los componentes no deseados, p. ej., proteínas de la célula huésped, componentes del medio del cultivo celular y virus potenciales, fluyen a través de la columna. Puede llevarse a cabo una etapa de lavado intermedia opcional para eliminar las impurezas unidas inespecíficamente de la columna, seguido de elución del producto a un pH de aproximadamente 2,5 a aproximadamente pH 4,0. La etapa de elución se puede realizarse como un gradiente lineal o un método por etapas o una combinación de gradiente y etapas. En una realización, el eluato se neutraliza inmediatamente con un tampón de neutralización (p. ej., Tris 1 M, pH 8), y después se ajusta a un pH final de 6,5 usando, p. ej., ácido clorhídrico al 5 % o hidróxido de sodio 1 M. Preferiblemente, el eluato neutralizado se filtra antes de la cromatografía posterior. En una realización, el eluato neutralizado se pasa a través de un filtro de 0,2 pm antes de la etapa de cromatografía de hidroxiapatita posterior.

Debido a su alta selectividad, alta velocidad de flujo y capacidad de unión rentable y su capacidad para eliminar en gran medida las impurezas relacionadas con el proceso, tales como proteínas de la célula huésped, ADN, componentes de los medios de cultivo celular y partículas de virus endógenos y adventicios, la cromatografía de Proteína A se usa típicamente como la primera etapa en un proceso de purificación de anticuerpos. Después de esta etapa, el producto de anticuerpo es altamente puro y más estable debido a la eliminación de proteasas y otros componentes del medio que pueden causar su degradación.

Actualmente, existen tres tipos principales de resinas de Proteína A, clasificadas en función de la composición de su estructura de resina: a base de vidrio o sílice, p. ej., AbSolute HiCap (NovaSep), Prosep vA, Prosep vA Ultra (Millipore); a base de agarosa, p. ej., Proteína A Sefarosa Fast Flow, MabSelect y MabSelect SuRe (GE Healthcare); y a base de polímero orgánico, p. ej., poliestireno-divinilbenceno Poros A y MabCapture (Applied Biosystems). Preferiblemente, la resina de Proteína A es una resina a base de agarosa, es decir, resina MabSelect SuRe. Los tres tipos de resina son resistentes a altas concentraciones de hidrocloruro de guanidinio, urea, agentes reductores y pH bajo.

La altura del lecho de la columna empleada a gran escala es de entre 10 y 30 cm, dependiendo de las propiedades de las partículas de la resina tales como el tamaño de los poros, el tamaño de las partículas y la compresibilidad. Preferiblemente, la altura del lecho de la columna es de aproximadamente 25 cm. La tasa de flujo y las dimensiones de la columna determinan el tiempo de residencia del anticuerpo en la columna. En una realización, la velocidad lineal empleada para la Proteína A es de aproximadamente 150 a aproximadamente 500 cm/hr, preferiblemente aproximadamente 200 cm/h a aproximadamente 400 cm/h, más preferiblemente aproximadamente 200 cm/h a aproximadamente 300 cm/h, y lo más preferiblemente aproximadamente 250 cm/h. La capacidad de unión dinámica varía de 15-50 g de anticuerpo por litro de resina, y depende de la tasa de flujo, del anticuerpo particular que se va a purificar, así como de la matriz de Proteína A usada. Preferiblemente, la columna se carga con no más de 45 g de anticuerpo por litro de resina. Un método para determinar la capacidad de unión dinámica de las resinas de Proteína A ha sido descrito por Fahrner et al. Biotechnol Appl BioChem. 30:121-128 (1999). Una tasa de flujo de carga más baja puede aumentar el tiempo de residencia del anticuerpo y promover una mayor capacidad de unión. También da como resultado un tiempo de procesamiento más largo por ciclo, requiere menos ciclos y consume menos tampón por lote de fluido de cultivo celular recogido.

Otros enfoques ejemplares para la purificación por afinidad incluyen cromatografía de afinidad de lectina, que se puede realizar en modo de flujo continuo (el producto con la glicosilación no deseada se une al soporte mientras que el producto sin la glicosilación no deseada pasa a través del soporte) o modo de unión y elución (el producto con la glicosilación deseada se une al soporte mientras que el producto sin la glicosilación deseada pasa a través del soporte).

Las proteínas expresadas en eucariotas inferiores, p. ej., P. pastoris, pueden modificarse con O-oligosacáridos compuestos única o principalmente de residuos de manosa (Man). Además, las proteínas expresadas en eucariotas inferiores, p. ej., P. pastoris, pueden modificarse con N-oligosacáridos. La N-glicosilación en P. pastoris y otros hongos es diferente que en eucariotas superiores. Incluso dentro de los hongos, la N-glicosilación difiere. En particular, las rutas de glicosilación unidas a N en P. pastoris son sustancialmente diferentes de las encontradas en S. cerevisiae, con extensiones más cortas de Man(alfa 1,6) en el núcleo Man8GN2 y la aparente falta de adiciones significativas de Man(alfa 1,3) que representan la principal modalidad de procesamiento de glicanos unidos a N en P. pastoris. En algunos aspectos, P. pastoris puede estar más cerca del patrón típico de glicosilación con alto contenido de manosa en mamíferos. Además, Pichia y otros hongos pueden modificarse por ingeniería para producir "glicoproteínas humanizadas" (es decir, modificar genéticamente cepas de levadura para que sean capaces de replicar las rutas de glicosilación esenciales que se encuentran en los mamíferos, tales como la galactosilación.

En función de la modificación de glicosilación unida a O y/o unida a N deseada o no deseada de un producto proteico, se pueden seleccionar una o más lectinas para cromatografía de afinidad en modo de flujo continuo o en modo de unión y elución. Por ejemplo, si una proteína recombinante deseada carece de modificaciones particulares de manosa unida a O y/o unida a N (es decir, la proteína deseada no está modificada), se puede seleccionar una lectina que se une a restos de manosa, p. ej., Con A, LCH, GNA, DC-SIGN y L-SIGN, para la purificación por afinidad en modo de flujo continuo, de manera que el producto deseado sin modificar pasa a través del soporte y está disponible para su posterior purificación o procesamiento. Por el contrario, si una proteína recombinante deseada contiene modificaciones particulares de manosa unida a O y/o unida a N (es decir, la proteína deseada no está modificada), se puede seleccionar una lectina que se une a restos de manosa, p. ej., Con A, LCH, GNA, DC-SIGN y L-SIGN, para la purificación por afinidad en modo de unión y elución, de manera que el producto modificado deseado se une al soporte y el producto no modificado no deseado pasa a través. En el último ejemplo, el flujo a través se puede descartar mientras que el producto modificado deseado se eluye del soporte para una purificación o procesamiento adicional. El mismo principio se aplica a los productos de proteínas recombinantes que contienen otras modificaciones de glicosilación introducidas por el sistema de expresión fúngico.

Otra herramienta de purificación de pseudo-afinidad es la cromatografía de "modo mixto". Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cromatografía de modo mixto" se refiere a métodos cromatográficos que utilizan más de una forma de interacciones entre la fase estacionaria y los analitos con el fin de lograr su separación, p. ej., las interacciones secundarias en la cromatografía de modo mixto contribuyen a la retención de los solutos. Las ventajas de la cromatografía de modo mixto incluyen una alta selectividad, p. ej., las sustancias positivas, negativas y neutras podrían separarse en una sola operación y una mayor capacidad de carga.

La cromatografía de modo mixto se puede realizar en medios de apatita cerámica o cristalina, tales como cromatografía de hidroxiapatita (HA) y cromatografía de fluoroapatita (FA). Otras resinas de modo mixto incluyen, pero no están limitadas a, CaptoAdhere, Capto MMC (GE Healthcare); HEA Hypercel y PPA Hypercel (Pall); y Toyopearl MX-Trp-650M (Tosoh BioScience). Estas resinas de cromatografía proporcionan una selectividad de biomoléculas complementaria a las técnicas más tradicionales de intercambio iónico o interacción hidrófoba.

La hidroxiapatita cerámica (Ca5(PO4)3OH)2 es una forma de fosfato de calcio que se puede usar para la separación y purificación de proteínas, enzimas, ácidos nucleicos, virus y otras macromoléculas. La hidroxiapatita tiene propiedades de separación únicas y una excelente selectividad y resolución. Por ejemplo, a menudo separa proteínas que parecen ser homogéneas mediante otras técnicas cromatográficas y electroforéticas. La cromatografía de hidroxiapatita cerámica (CHT) con una elución en gradiente de cloruro de sodio o fosfato de sodio se puede usar como etapa de pulido en los procesos de purificación de anticuerpos monoclonales para eliminar dímeros, agregados y Proteína A lixiviada.

Los sorbentes de hidroxiapatita (HA) de tipo I y tipo II ejemplares se seleccionan de materiales cerámicos y cristalinos. Los sorbentes de HA están disponibles en diferentes tamaños de partículas (p. ej., tipo 1, Bio-Rad Laboratories). En una realización ejemplar, el tamaño de partícula del sorbente de HA es entre aproximadamente 10 pm y aproximadamente 200 pm, entre aproximadamente 20 pm y aproximadamente 100 pm o entre aproximadamente 30 pm y aproximadamente 50 pm. En un ejemplo particular, el tamaño de partícula del sorbente de HA es de aproximadamente 40 pm (p. ej., CHT, Tipo I).

Los sorbentes de fluoroapatita (FA) de tipo I y tipo II ejemplares se seleccionan de materiales cerámicos (p. ej., partículas en forma de perlas) y cristalinos. Los sorbentes de FA cerámica están disponibles en diferentes tamaños de partículas (p. ej., tipo 1 y tipo 2, Bio-Rad Laboratories). En una realización ejemplar, el tamaño de partícula del sorbente de F^a cerámica es de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 180 pm, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 pm, más preferiblemente de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 80 pm. En un ejemplo, el tamaño de partícula del medio de FA cerámica es de aproximadamente 40 pm (p. ej., FA cerámica de tipo 1). En otro ejemplo, el medio de FA incluye HA además de FA.

La selección de la velocidad de flujo usada para cargar la muestra en la columna de hidroxiapatita o fluoroapatita, así como la velocidad de flujo de elución depende del tipo de sorbente de hidroxiapatita o fluoroapatita y de la geometría de la columna. En una realización ejemplar, a escala del proceso, la velocidad del flujo de carga se selecciona de aproximadamente 50 a aproximadamente 900 cm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 cm/h, preferiblemente de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 cm/h y, más preferiblemente, aproximadamente 200 cm/h. En una realización ejemplar, el pH del tampón de elución se selecciona de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, preferiblemente de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8, y más preferiblemente aproximadamente pH 6,5.

En una realización, los procesos de purificación descritos emplean cromatografía de hidroxiapatita (HA) en resina CHT después de la cromatografía de proteína A. Preferiblemente, la elución se realiza como un gradiente lineal (0­ 100 %) de cloruro de sodio de aproximadamente 0 M a 1,5 M en un tampón fosfato de sodio 5 mM a pH 6,5. La DO280 del efluente se puede monitorizar. En una realización, durante la elución, se recoge una única fracción de DO 0,1 en el flanco frontal al pico máximo y después se recoge una serie de fracciones, p. ej., aproximadamente un tercio del volumen de la columna desde el pico máximo a DO 0,1 en el flanco trasero para un análisis de pureza adicional. En otra realización preferida, la elución se realiza como un gradiente lineal (0-100 %) de tampón de fosfato de sodio de aproximadamente 5 mM a 0,25 M a pH 6,5. La DO280 del efluente se puede monitorizar. Durante la elución, pueden recogerse fracciones de ~1/2 de CV desde DO 0,1 en el flanco frontal a DO 0,1 en el flanco trasero para un análisis de pureza adicional.

Los anticuerpos policlonales (p. ej., muestras de suero) requieren una purificación por afinidad específica de antígeno para evitar la copurificación de inmunoglobulinas no específicas. Por ejemplo, generalmente solo el 2-5 % de la IgG total en el suero de ratón es específica para el antígeno usado para inmunizar al animal. El tipo o tipos y grado de purificación que son necesarios para obtener un anticuerpo utilizable dependen de la aplicación o aplicaciones previstas para el anticuerpo. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales que se desarrollaron usando líneas celulares, p. ej., hibridomas o sistemas de expresión recombinante, y produjeron como líquido ascítico o sobrenadante de cultivo celular pueden purificarse completamente sin usar un método de afinidad específico de antígeno porque el anticuerpo diana es (para la mayoría de los propósitos prácticos) la única inmunoglobulina en la muestra de producción.

Monitorización de impurezas

El perfilado de impurezas en productos biofarmacéuticos y sus intermedios y excipientes asociados es una expectativa reglamentaria. Véase, p. ej., Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE. UU. Esta guía proporciona recomendaciones sobre cómo evaluar la seguridad de estas impurezas y los umbrales de exposición. La Agencia Europea de Medicamentos (el comité de EMEA de Medicamentos de Uso Humano (CHMP) también publicó la Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities, que las autoridades europeas están aplicando para nuevos productos farmacéuticos y, en algunos casos, también para sustancias farmacéuticas en el desarrollo de fármacos. Estas guías amplían las guías de la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH) para la industria: Q3A(R2) Impurities in New Drug Substances, Q3B(R2) Impurities in New Drug Products y Q3C(R3) Impurities: Residual Solvents que abordan las impurezas en un enfoque más general.

Aunque algunas impurezas están relacionadas con el producto farmacéutico (es decir, la variante asociada al producto), otras se añaden durante la síntesis, el procesamiento y la fabricación. Estas impurezas se encuentran en varias clases amplias: variantes asociadas al producto; sustancias relacionadas con el proceso introducidas aguas arriba; impurezas residuales durante todo el proceso; impurezas residuales relacionadas con el proceso introducidas aguas abajo; e impurezas residuales introducidas de desechables.

Tal y como se usa en la presente memoria, "variante asociada al producto" se refiere a un producto distinto del producto deseado (p. ej., el complejo con múltiples subunidades deseado) que está presente en una preparación del producto deseado y relacionado con el producto deseado. Las variantes asociadas al producto ejemplares incluyen péptidos truncados o elongados, productos que tienen una glicosilación diferente a la glicosilación deseada (p. ej., si se desea un producto aglicosilado, entonces cualquier producto glicosilado se consideraría una variante asociada al producto), complejos que tienen una estequiometría anormal, ensamblaje incorrecto, enlaces disulfuro anormales, plegamiento anormal o incompleto, agregación, escisión por proteasa u otras anomalías. Las variantes asociadas al producto ejemplares pueden presentar alteraciones en una o más de la masa molecular (p. ej., detectada por cromatografía de exclusión por tamaño), punto isoeléctrico (p. ej., detectado por enfoque isoeléctrico), movilidad electroforética (p. ej., detectada por electroforesis en gel), estado de fosforilación (p. ej., detectado por espectrometría de masa), relación de carga a masa (p. ej., detectado por espectrometría de masa), masa o identidad de fragmentos proteolíticos (p. ej., detectado por espectrometría de masa o electroforesis en gel), hidrofobicidad (p. ej., detectado por HPLC), carga (p. ej., detectado por cromatografía de intercambio iónico), afinidad (p. ej., en el caso de un anticuerpo, detectado por unión a proteína A, proteína G, y/o un epítopo al que se une el anticuerpo deseado) y el estado de glicosilación (p. ej., detectado por afinidad de unión de lectina). Cuando la proteína deseada es un anticuerpo, el término variante asociada al producto puede incluir una variante glico-pesada y/o una especie de medio anticuerpo (descrita a continuación).

Las variantes asociadas al producto ejemplares incluyen formas variantes que contienen enlaces disulfuro aberrantes. Por ejemplo, la mayoría de las moléculas de anticuerpo IgG1 están estabilizadas por un total de 16 puentes disulfuro intracatenarios e intercatenarios, que estabilizan el plegamiento de los dominios de IgG tanto en las cadenas pesadas como ligeras, mientras que los puentes disulfuro intercatenarios estabilizan la asociación entre cadenas pesadas y ligeras. Asimismo, otros tipos de anticuerpos contienen enlaces disulfuro intracadena e intercadena estabilizadores característicos. Además, algunos anticuerpos (incluyendo el Ab-A descrito en la presente memoria) contienen enlaces disulfuro adicionales denominados enlaces disulfuro no canónicos. Por lo tanto, los enlaces disulfuro intercatenarios aberrantes pueden dar como resultado una estequiometría del complejo anormal, debido a la ausencia de un enlace covalente estabilizador y/o enlaces disulfuro a subunidades adicionales. Además, los enlaces disulfuro aberrantes (ya sea intercadena o intracadena) pueden disminuir la estabilidad estructural del anticuerpo, lo que puede resultar en una disminución de la actividad, una disminución de la estabilidad, una mayor propensión a formar agregados, y/o un aumento de la inmunogenicidad. Las variantes asociadas al producto que contienen enlaces disulfuro aberrantes se pueden detectar de diversas formas, incluyendo ^s DS-PAGE desnaturalizante no reducida, electroforesis capilar, cIEX, espectrometría de masa (opcionalmente con modificación química para producir un desplazamiento de masa en cisteínas libres), cromatografía de exclusión por tamaño, HPLC, cambios en la dispersión de la luz y cualquier otro método adecuado conocido en la técnica. Véase, p. ej., The Protein Protocols Handbook 2002, Parte V, 581-583, DOI: 10.1385/1 -59259-169-8:581.

Generalmente, se pueden usar diálisis, desalación y diafiltración para intercambiar anticuerpos en tampones particulares y eliminar componentes de bajo peso molecular (PM) no deseados. En particular, las membranas de diálisis, las resinas de exclusión por tamaño y los dispositivos de diafiltración que presentan puntos de corte de alto peso molecular (MWCO) se pueden usar para separar inmunoglobulinas (>140kDa) a partir de pequeñas proteínas y péptidos. Véase, p. ej., Grodzki, A.C. y Berenstein, E. (2010). Antibody purification: ammonium sulfate fractionation or gel filtration. En: C. Oliver y M.C. Jamur (eds.), Immunocytochemical Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 588:15-26. Humana Press.

La cromatografía de exclusión por tamaño se puede usar para detectar agregados, monómeros y fragmentos de anticuerpos. Además, la cromatografía de exclusión por tamaño se puede usar acoplada a espectrometría de masa para medir los pesos moleculares del anticuerpo; conjugados de anticuerpos y cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos.

Las resinas de exclusión por tamaño ejemplares para su uso en los métodos de purificación y monitorización de la pureza incluyen TSKgel G3000SW y TSKgel G3000SWx1 de Tosoh Biosciences (Montgomeryville, PA, EE.UU.); Shodex KW-804, Protein-Pak 300SW y BioSuite 250 de Waters (Milford, MA, EE.UU.); MAbPac™ SEC-1 y MAbPac TM SCX-10 de Thermo Scientific (Sunnyvale, California, EE. UU.).

En una realización, la cromatografía de exclusión por tamaño se usa para monitorizar la separación de impurezas durante el proceso de purificación. A modo de ejemplo, se puede cargar una columna TSKgel GS3000SW 17,8 x 300 mm equilibrada conectada a una precolumna TSKgel SW x 16 x 40 mm de Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA) con muestra, usando un tampón de SE-HPLC que comprende fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 200 mM pH 6,5 como una fase móvil con una tasa de flujo de 0,5 mL/min en modo isocrático. Usando un HPLC Agilent (Santa Clara, CA) Serie 1200 con instrumento de detección de UV, se puede monitorizar la absorbancia a UV 215 nm. Las muestras se pueden recoger y diluir hasta una concentración deseada, p. ej., 1 mg/mL. La muestra diluida de una fracción de la misma, p. ej., 30 pl, se puede cargar entonces en la columna de SE-HPLC. Preferiblemente, el rendimiento de la columna se monitoriza usando estándares de filtración en gel (p. ej., BioRad).

Las variantes asociadas al producto incluyen glicovariantes. Tal y como se usa en la presente memoria, "glicovariante" se refiere a una variante asociada al producto glicosilada que a veces está presente en preparaciones de anticuerpos y que contiene al menos una secuencia Fc parcial. La glicovariante contiene glicanos unidos covalentemente a cadenas laterales polipeptídicas de la proteína deseada. La glicovariante puede ser "glico-pesada" o "glico-ligera" en comparación con el producto proteico deseado, es decir, contiene modificaciones de glicosilación adicionales en comparación con la proteína deseada o contiene menos modificaciones de glicosilación que la proteína deseada, respectivamente. Las modificaciones de glicosilación ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, glicosilación unida a N, glicosilación unida a O, glicosilación C y fosfoglicosilación.

La glicovariante se caracteriza por una movilidad electroforética aumentada o disminuida observable por SDS-PAGE (en relación con una cadena polipeptídica normal), afinidad de unión de lectina, unión a un anticuerpo anti-Fc y peso molecular aparente mayor o menor de los complejos de anticuerpos que contienen la glicovariante como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño. Véase, p. ej., Solicitud Provisional de EE. UU. No. de Ser.

61/525.307, presentada el 31 de agosto de 2011.

Tal y como se usa en la presente memoria, "impureza de glicosilación" se refiere a un material que tiene un patrón de glicosilación diferente al de la proteína recombinante deseada. La impureza de glicosilación puede contener la misma o diferente estructura primaria, secundaria, terciaria y/o cuaternaria a la de la proteína recombinante deseada. Por lo tanto, una glicovariante es un tipo de impureza de glicosilación.

Los métodos analíticos para monitorizar la glicosilación de los mAb son importantes porque las condiciones del bioproceso pueden causar, p. ej., variación en el tipo de manosa alta, formas truncadas, reducción de tetraantenarias y aumento de estructuras tri y biantenarias, menos glicanos sializados y menos glicosilación. La presencia de glicovariantes en una muestra se puede monitorizar usando medios analíticos conocidos en la técnica, tales como tinción o marcaje de glicanos, análisis de glicoproteomas y glicomas por espectrometría de masa y/o purificación o enriquecimiento de glicoproteínas. En una realización, las glicovariantes se analizan usando ensayos de unión cinética de lectina, p. ej., interferometría de luz (que se puede realizar usando un ForteBio Octet®), interferometría de polarización dual (que se puede realizar usando un Farfield AnaLight®), dispersión de luz estática (que se puede realizar usando un Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz dinámica (que se puede realizar usando un Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz con múltiples ángulos de gradiente de composición (que se puede realizar usando un Wyatt Calypso II), resonancia de plasmón de superficie (que se puede realizar usando ProteOn XPR36 o Biacore T100), ELISA, ELISA quimioelectroluminiscente, análisis de far western, quimioluminiscencia (que se puede realizar usando un MesoScale Discovery) u otro ensayo de unión cinética de lectina.

En una realización, la tinción o marcaje de glicanos se usa para detectar glicovariantes. Por ejemplo, los grupos de azúcar de los glicanos se pueden reestructurar químicamente con ácido peryódico para oxidar los hidroxilos vecinos de los azúcares a aldehídos o cetonas para que sean reactivos a los colorantes, p. ej., tinción de ácido peryódico de Schiff (PAS), para detectar y cuantificar las glicoproteínas en una muestra dada. El ácido peryódico también puede usarse para hacer que los azúcares sean reactivos frente a los reticulantes, que pueden unirse covalentemente a moléculas marcadoras (p. ej., biotina) o soporte inmovilizado (p. ej., estreptavidina) para detección o purificación.

En otra realización, la espectrometría de masa se usa para identificar y cuantificar glicovariantes en una muestra. Por ejemplo, la digestión enzimática puede usarse para liberar oligosacáridos de la inmunoglicoproteína, donde el oligosacárido se derivatiza posteriormente con un modificador fluorescente, que se resuelve mediante cromatografía de fase normal acoplada con detección de fluorescencia y se analiza mediante espectrometría de masa (p. ej., MALDI-TOF). La línea básica para el análisis glicoproteómico incluye el enriquecimiento de glicoproteínas o glicopéptidos, la separación multidimensional por cromatografía líquida (LC), la espectrometría de masa en tándem y el análisis de los datos mediante bioinformática.

El análisis espectrométrico se puede realizar antes o después de la escisión enzimática de los glicanos mediante, p. ej., endoglicanasa H (endo H) o péptido-N4-(N-acetil-beta-glucosaminil)asparagina amidasa (PNGasa), dependiendo del experimento. Además, el análisis cuantitativo comparativo de glicoproteomas puede realizarse mediante marcaje diferencial con marcaje con isótopos estables mediante reactivos de aminoácidos en cultivo celular (SILAC). Además, la cuantificación absoluta mediante la monitorización de reacciones seleccionadas (SRM) se puede realizar en glicoproteínas diana usando péptidos de referencia "pesados" marcados isotópicamente.

En una realización, las lectinas se usan para detectar y analizar glicovariantes de la proteína recombinante deseada durante el proceso de purificación. Las lectinas son proteínas de unión a glicanos que tienen una alta especificidad por distintos restos de azúcares. En la Tabla 3 a continuación se proporciona una lista no limitante de lectinas disponibles comercialmente.

Tabla 3. Lectinas ejemplares disponibles comercialmente.

En una realización, una muestra obtenida del proceso de fermentación, p. ej., durante la operación o después de que se complete la operación, se somete a un ensayo de unión a lectina para detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en la o las muestras. De manera similar, en otras realizaciones, el proceso de purificación incluye detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en una muestra a partir de la cual se purifica la proteína recombinante deseada. Por ejemplo, en una realización particular, una porción del eluato o una fracción del mismo de al menos una etapa cromatográfica en el proceso de purificación puede ponerse en contacto con una lectina.

El nivel de unión de lectina a menudo se correlaciona con el nivel de la impureza de glicovariante asociada al producto presente en el eluato o una fracción del mismo (según los métodos convencionales de cromatografía de exclusión por tamaño), de manera que una o más fracciones del eluato puede seleccionarse para una purificación y procesamiento adicionales en función del contenido de impurezas de glicovariantes, p. ej., fracciones seleccionadas del eluato con menos del 10 % de glicovariantes para una purificación cromatográfica adicional. En algunas realizaciones, se pueden usar múltiples lectinas (es decir, dos o más lectinas) para monitorizar la pureza de las impurezas glicovariantes asociadas al producto.

En una realización alternativa, determinadas muestras o eluatos o fracciones de los mismos se descartan en función de la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas detectadas. En otra realización más, determinadas muestras o fracciones se tratan para reducir y/o eliminar las impurezas glicosiladas en función de la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas detectadas. El tratamiento ejemplar incluye uno o más de los siguientes: (i) adición de una enzima u otro resto químico que elimina la glicosilación, (ii) eliminación de las impurezas glicosiladas efectuando una o más etapas de unión a lectina, (iii) efectuando cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar las impurezas glicosiladas.

En una realización particular, la lectina se conjuga con una sonda y luego se inmoviliza en un soporte. Véase la Figura 2. El soporte puede estar en lotes o empaquetado en una columna, p. ej., para HPLC. Las sondas ejemplares incluyen biotina, fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano picante (h Rp ), luciferasa, fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína, FITC) y rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina, TRITC), proteína fluorescente verde (GFP) y ficobiliproteínas (p. ej., aloficocianina, ficocianina, ficoeritrina y ficoeritrocianina). Los soportes ejemplares incluyen avidina, estreptavidina, NeutrAvidina (avidina desglicosilada) y perlas magnéticas. Debe indicarse que la invención no está limitada por la química del acoplamiento. Preferiblemente, la lectina se biotinila e inmoviliza en un sensor de estreptavidina.

Pueden usarse procesos estándar de monitorización de la interacción proteína-proteína para analizar la interacción entre la lectina y las impurezas de glicosilación en las muestras de varias etapas del proceso de purificación. Los procesos ejemplares de monitorización de las interacciones proteína-proteína incluyen, pero no están limitados a, interferometría de luz (que se puede realizar usando un ForteBio Octet®), interferometría de polarización dual (que se puede realizar usando un Farfield AnaLight®), dispersión de luz estática (que se puede realizar usando un Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz dinámica (que se puede realizar usando un Wyatt DynaPro NanoStar™), dispersión de luz con múltiples ángulos de gradiente de composición (que se puede realizar usando un Wyatt Calypso II), resonancia de plasmón de superficie (que se puede realizar usando ProteOn XPR36 o Biacore T100), ELISA, ELISA quimioelectroluminiscente, análisis de far western, quimioluminiscencia (que se puede realizar usando un MesoScale Discovery) u otro ensayo de unión cinética de lectina.

La interferometría de luz es una técnica analítica óptica que analiza el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada desde dos superficies (una capa de proteína inmovilizada en la punta del biosensor y una capa de referencia interna) para medir interacciones biomoleculares en tiempo real en función de un desplazamiento en el patrón de interferencia (es decir, causado por un cambio en el número de moléculas unidas a la punta del biosensor), proporcionando así información sobre la especificidad de unión, las tasas de asociación y disociación o la concentración.

La interferometría de polarización dual se basa en un chip sensor de guía de onda de doble placa que tiene una guía de onda de detección superior y una guía de onda de referencia óptica inferior iluminada con un rayo láser polarizado ortogonal alterno. Se crean dos modos de guía de ondas diferentes - específicamente, el modo magnético transversal (TM) y el modo eléctrico transversal (TE). Ambos modos generan un campo evanescente en la superficie de la guía de ondas de detección superior y sondean los materiales que entran en contacto con esta superficie. A medida que el material interacciona con la superficie del sensor, provoca cambios de fase en las franjas de interferencia. Después, el patrón de franjas de interferencia para cada modo se resuelve matemáticamente en valores de RI y de espesor. Por lo tanto, el sensor puede medir cambios moleculares extremadamente sutiles en la superficie del sensor.

La dispersión de luz estática (SLS) es una técnica no invasiva mediante la cual se puede determinar experimentalmente una masa molecular absoluta de una muestra de proteína en disolución con una precisión mayor del 5 % por exposición a luz láser de baja intensidad (690 nm). La intensidad de la luz dispersada se mide en función del ángulo y se puede analizar para obtener la masa molar, el radio cuadrático medio y el segundo coeficiente virial (A2). Los resultados de un experimento de SLS se pueden usar como control de calidad en la preparación de proteínas (p. ej., para estudios estructurales) además de la determinación del estado oligomérico en disolución (monómero/dímero etc.). Los experimentos de SLS se pueden realizar bien en modo por lotes o cromatográfico.

La dispersión de luz dinámica (también conocida como dispersión de luz cuasi elástica, QELS, o espectroscopia de correlación de fotones, PCS) es una técnica para medir el tamaño hidrodinámico de moléculas y partículas submicrónicas basada en intensidades en tiempo real (en comparación con intensidades promedio en el tiempo, medidas por dispersión de luz estática). Las fluctuaciones (variación temporal, típicamente en una escala de tiempo de ps a ms) de la luz dispersada de una partícula en un medio se registran y analizan en el dominio del tiempo de retardo de correlación. Las partículas pueden ser partículas sólidas (p. ej., óxidos metálicos, detritos minerales y partículas de látex) o partículas blandas (p. ej., vesículas y micelas) en suspensión, o cadenas macromoleculares (p. ej., polímeros sintéticos y biomateriales) en disolución. Dado que la velocidad de difusión de las partículas está determinada por su tamaño en un entorno dado, la información sobre su tamaño está contenida en la velocidad de fluctuación de la luz dispersada.

La intensidad de la dispersión de una molécula pequeña es proporcional al cuadrado del peso molecular. Como tales, las técnicas de dispersión de luz dinámica y estática son muy sensibles al inicio de la agregación de proteínas y otros cambios en la estructura de las proteínas que surgen de cambios sutiles en las condiciones.

La dispersión de luz con múltiples ángulos de gradiente de composición (CG-MALS) emplea una serie de muestras no fraccionadas de diferente composición o concentración con el fin de caracterizar interacciones macromoleculares tales como autoasociación y heteroasociación reversible de proteínas, velocidades de reacción y afinidades de agregación irreversible, o coeficientes viriales. Dichas mediciones proporcionan información sobre la unión compleja reversible específica (p. ej., Kd, estequiometría, auto y/o heteroasociaciones), interacciones no específicas (p. ej., coeficientes del virial propio y cruzado), agregación y otras reacciones dependientes del tiempo (p. ej., cinética de parada-flujo y gráficos t) y Zimm (p. ej., gradientes de concentración para determinar Mw, A2, A3 (segundo y tercer coeficiente del virial), o r^g).

El fenómeno de resonancia de plasmón de superficie (SPR) ocurre cuando la luz polarizada, en condiciones de reflexión interna total, incide en una capa eléctricamente conductora (p. ej., oro) en la interfaz entre medios de diferente índice de refracción (es decir, el vidrio de la superficie de un sensor (índice de refracción alto) y un tampón (índice de refracción bajo)). Una cuña de luz polarizada, que cubre un rango de ángulos de incidencia, se dirige hacia la cara de vidrio de la superficie del sensor. Una intensidad de campo eléctrico (es decir, onda evanescente), que se genera cuando la luz incide en el vidrio, interacciona con y es absorbida por nubes de electrones libres en la capa de oro, generando ondas de densidad de carga de electrones llamadas plasmones y provocando una reducción en la intensidad de la luz reflejada. El ángulo de resonancia en el que se produce este mínimo de intensidad es una función del índice de refracción de la disolución cerca de la capa de oro en la cara opuesta de la superficie del sensor. La luz reflejada se detecta dentro de un dispositivo de monitorización, p. ej., el sistema ProteOn XPR36 o Biacore. La información sobre cinética (es decir, las velocidades de formación de complejos (k^a) y disociación (k^d)), la afinidad (p. ej., K^d ) y concentración se puede determinar basándose en la lectura del plasmón.

La información obtenida de estos y otros procesos de monitorización de las interacciones proteína-proteína se puede utilizar, p. ej., para cuantificar la afinidad de unión y la estequiometría de las interacciones enzima/inhibidor o anticuerpo/antígeno o glicoproteína/lectina; estudiar el impacto de las moléculas pequeñas en las interacciones proteína-proteína; ajustar los parámetros del tampón para mejorar la estabilidad y la viscosidad de la formulación; optimizar la purificación de anticuerpos y comprender los efectos de los excipientes grandes en las formulaciones; cuantificar el impacto de la fuerza iónica del disolvente, el pH o los excipientes sobre la polimerización o las asociaciones de proteínas; medir la cinética del autoensamblaje y agregación; y caracterizar la afinidad de unión macromolecular y la estequiometría del complejo asociado en un amplio rango de composiciones de tampón, escalas de tiempo y temperatura.

En una realización preferida, el nivel de unión de lectina (que se correlaciona con la cantidad de impureza glicovariante) se determina usando interferometría de luz, p. ej., instrumentos de análisis Octet (FortéBIO).

Las impurezas relacionadas con el proceso ejemplares introducidas aguas arriba incluyen ácidos nucleicos (p. ej., ADN y ARN) y proteínas de la célula huésped (HCP) que son componentes celulares no deseados que se encuentran con la proteína de interés después de la lisis celular. Estas impurezas relacionadas con el proceso también incluyen antibióticos que se añaden aguas arriba a los medios de cultivo celular para controlar la contaminación bacteriana y mantener la presión selectiva sobre los organismos huésped. Los antibióticos ejemplares incluyen kanamicina, ampicilina, penicilina, anfotericina B, tetraciclina, sulfato de gentamicina, higromicina B y plasmocina.

Las impurezas residuales ejemplares en las que se incurre a lo largo del proceso incluyen agentes potenciadores del proceso o catalizadores, que se añaden a lo largo del proceso para hacer que algunas de las etapas sean más eficientes y para aumentar el rendimiento del producto. Por ejemplo, se añaden guanidina y urea para la solubilización de la producción de fermentación, y se usan glutatión y ditiotreitol (DTT) durante la reducción y replegamiento de proteínas.

Las impurezas relacionadas con el proceso ejemplares introducidas aguas abajo incluyen productos químicos y reactivos (p. ej., alcoholes y glicoles) necesarios para la purificación cromatográfica de proteínas diana que deben eliminarse del proceso, así como tensioactivos (p. ej., Triton-X, Plurónico, Antiespumante-A, B, C, Tween o Polisorbato) que se añaden durante el procesamiento aguas abajo para ayudar a separar la proteína, el péptido y los ácidos nucleicos de la corriente del proceso al disminuir la tensión interfacial mediante la adsorción en la interfaz líquido-líquido.

Las impurezas residuales ejemplares introducidas a partir de materiales desechables incluyen "extraíbles", que son compuestos que pueden extraerse de un componente en condiciones exageradas (p. ej., disolventes agresivos o a temperaturas elevadas) y que tienen el potencial de contaminar el producto farmacéutico y "lixiviables", que son compuestos que se filtran a la formulación del producto farmacéutico desde el componente como resultado del contacto directo con la formulación en condiciones normales o, a veces, en condiciones aceleradas. Los lixiviables pueden ser un subconjunto de extraíbles. Los extraíbles deben controlarse en la medida en que los componentes usados sean apropiados. Los lixiviables deben controlarse para que los productos farmacéuticos no se adulteren.

Para articular adicionalmente la invención descrita anteriormente, se proporcionan los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar la presente invención.Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (p. ej., cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero se deberán tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se da en grados centígrados; y la presión es la atmosférica o cercana a esta.

Ejemplo 1: Purificación y recuperación de Ab-A

Este ejemplo ilustra que la pureza de los anticuerpos recombinantes generados en P. pastoris se mejoró usando una serie de procesos de recuperación primaria y de purificación cromatográfica. En la FIG. 1 se muestra una descripción general del método de purificación. Estos métodos pueden usarse para purificar y recuperar una variedad de anticuerpos específicos de antígeno expresados en diferentes sistemas.

Se cultivaron células de P. pastoris que contienen secuencias integradas de manera estable que codifican las cadenas pesada y ligera de Ab-A (correspondientes a la SEQ ID NO:54 y SEQ ID NO:52 como se enumeran en US 20120294797) ligadas a una señal de secreción y se indujo la expresión de anticuerpos.

El caldo de fermentación completo se trató con ácido etilen diamino tetraacético (EDTA) hasta una concentración final de 3 mM y con un agente floculante. Las células y los restos celulares floculados se eliminaron del caldo recogido por centrifugación, seguido de clarificación a través de filtros de profundidad y de 0,2 pm.

El caldo clarificado se aplicó entonces a una columna de resina MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences) para capturar Ab-A mediante cromatografía de afinidad de Proteína A. La cromatografía se realizó a temperatura ambiente. Una columna con una altura de lecho de 25 cm se desinfectó con hidróxido de sodio 0,1 M y después se equilibró con tampón fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6,0 ("tampón de equilibrado PrA") antes de la carga. La columna se cargó a una capacidad de no más de 45 g de Ab-A por L de resina a 250 cm/hr de velocidad lineal, y después se operó a la misma velocidad lineal en todo momento. Después de la aplicación de la carga, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna (CV) con tampón de equilibrado, y después se lavó con 5 CV con fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 6,0 para eliminar los materiales unidos débilmente. La columna se lavó con otros 5 CV de tampón de equilibrado para eliminar los componentes de lavado, y después el Ab-A unido se desadsorbió con arginina 1 M, pH 4,0 ("tampón de elución PrA"). La etapa de elución se llevó a cabo como un gradiente lineal de tampón de elución del 0-100 % en 3 CV seguido de elución con tampón de elución al 100 % en otros 3 CV. La DO280 del efluente se monitorizó, y el eluato se recogió de 1 DO en el flanco frontal a 1 DO en el flanco trasero. El eluato se recogió en un recipiente precargado con 0,15 CV de Tris 1 M, pH 8,0 ("tampón de neutralización PrA"). Después de la recogida, los contenidos del recipiente se mezclaron y se determinó su valor de pH, antes de un ajuste final a pH 6,5 usando bien ácido clorhídrico al 5 % o hidróxido de sodio 1 M, según fue necesario. El eluato neutralizado se filtró a través de 0,2 pm, después se llevó a la etapa de cromatografía de hidroxiapatita. Después de la elución del producto, la columna de captura se trató con acetato de sodio 20 mM, pH 3,6 en 3 CV, se limpió con hidróxido de sodio 0,2 M en 3CV, y se lavó con tampón de equilibrado en 3 CV antes de su almacenamiento en etanol al 20 %.

La purificación intermedia de Ab-A usó cromatografía de modo mixto en resina de hidroxiapatita cerámica (CHT, Tipo I, 40 pm). Esta etapa se llevó a cabo a temperatura ambiente y a no más de 200 cm/hr de velocidad lineal en todo momento. Antes de cada operación, la columna se desinfectó usando 3 CV de hidróxido de sodio 1 M, se trató con 3 CV de fosfato de sodio 500 mM, pH 6,5 ("tampón de tratamiento"), y se equilibró con al menos 3 CV de fosfato de sodio 5 mM, pH 6,5 ("tampón de equilibrado CHT"). La carga de CHT se preparó diluyendo el eluato de captura neutralizado filtrado con tampón de equilibrado CHT hasta una conductividad de no más de 4 mS/cm. La carga de CHT se aplicó entonces a la columna equilibrada después de pasar a través de un filtro de 0,2 pm situado antes de la columna. Después de la carga, la columna se lavó con 5 CV de tampón de equilibrado CHT y después se eluyó con un gradiente lineal de 20 CV del 0-100 % de fosfato de sodio 5 mM, cloruro de sodio 1,5 M, pH 6,5 ("tampón de elución CHT"). La DO280 del efluente se monitorizó, y se recogió una única fracción desde 0,1 DO en el flanco frontal hasta el pico máximo. Posteriormente, se recogió una serie de fracciones de ~ 1/3 de CV desde el pico máximo hasta 0,1 DO en el flanco trasero. Se analizó la pureza de las fracciones (véase la FIG. 3), y se combinó un conjunto de fracciones contiguas (incluyendo la primera fracción más grande) para lograr un combinado de CHT de la pureza deseada y contenido de glicovariante reducido (véanse la FIG. 4y la FIG. 5). Después de la elución, la columna de CHT se trató con 3 CV de fosfato de sodio 500 mM, pH 6,5 ("tampón de tratamiento CHT"), se lavó allí mismo con 5 CV de hidróxido de sodio 1 M, y se lavó con 3 CV de disolución de almacenamiento de hidróxido de sodio 0,1 M.

La purificación de pulido de Ab-A usó cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en resina de polipropilenglicol (PPG-) 600M. Esta etapa se llevó a cabo a temperatura ambiente y a no más de 200 cm/hr de velocidad lineal en todo momento. Antes de cada operación, la columna se desinfectó usando 3 CV de hidróxido de sodio 0,5 M, se trató con 3 CV de agua, y se equilibró con al menos 3 CV de fosfato de sodio 20 mM, sulfato de sodio 0,7 M, pH 7,0 ("tampón de equilibrado HIC"). La carga de HIC se preparó ajustando el combinado de CHT filtrado a través de 0,2 pm a una conductividad de al menos 77,5 mS/cm usando fosfato de sodio 20 mM, sulfato de sodio 1,1 M, pH 7,0 ("tampón de dilución HIC"). La carga de HIC se aplicó entonces a la columna equilibrada después de pasar a través de un filtro de 0,2 pm situado antes de la columna. Después de la carga, la columna se lavó con 5 CV de tampón de equilibrado HIC y después se eluyó con un gradiente lineal de 20 CV del 0-100 % de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0 ("tampón de elución HIC"). La DO280 del efluente se monitorizó, y se recogió una serie de fracciones de ~ 1/3 de CV desde 0,1 DO en el flanco frontal a 0,1 DO en el flanco trasero. Se analizó la pureza de las fracciones (véase la FIG.6) y se combinó un conjunto de fracciones contiguas para formar un combinado de HIC de la pureza deseada y contenido de glicovariante reducido. Después de la elución, la columna de HIC se trató con 3 CV de agua, se limpió allí mismo con 6 CV de hidróxido de sodio 0,5 M (con una pausa de 60-120 min entre los primeros 3 y los últimos 3 CV), se lavó con 3 CV de agua, y se transfirió a una disolución de almacenamiento de hidróxido de sodio 0,1 M.

El Ab-A en el combinado de HIC se formuló mediante ultrafiltración y diafiltración (UFDF) en un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) equipado con membranas con un punto de corte de peso molecular de 30 kDa. El sistema se lavó con agua, se ensayó para determinar la integridad de la membrana, se desinfectó, y se equilibró en un tampón de formulación como preparación para la carga con el combinado de HIC filtrado a través de 0,2 pm. Después de la carga, la disolución se concentró mediante ultrafiltración y luego se intercambió en tampón de formulación mediante diafiltración frente a 6-8 volúmenes de recambio de tampón de formulación. La disolución de proteína se concentró adicionalmente en una segunda ronda de ultrafiltración y luego se drenó el retenido del sistema TFF. El sistema se lavó abundantemente con tampón de formulación para recuperar la proteína residual. Se determinaron las concentraciones de proteína del retenido y el lavado, y luego se mezclaron las porciones apropiadas de cada uno y se ajustaron adicionalmente con tampón de formulación para lograr la concentración final deseada de Ab-A. El producto de TFF se filtró a través de 0,2 pm en botellas estériles en una cabina de seguridad biológica y se almacenaron a < -20 °C.

Las variantes del producto en las preparaciones de Ab-A se visualizaron en geles de proteínas (véase la FIG. 7). Carriles 1 y 12: carriles de control (tampón de muestra IX); carriles 2, 6 y 11: marcadores de peso molecular; carriles 3-5: muestra total cargada en la columna de afinidad de Proteína A; carril 7: preparación de anticuerpo Ab-A después de cromatografía de afinidad de Proteína A; carril 8: preparación de anticuerpo Ab-A después de la cromatografía CHT; carril 9: preparación de anticuerpo Ab-A después de la cromatografía HIC; y carril 10: preparación de anticuerpo Ab-A después de la filtración en masa (BDS). Debido a que las muestras se sometieron a condiciones de desnaturalización y reducción (FIG. 7 panel A y panel B, respectivamente), este método puede detectar anomalías que afectan la constitución de cadenas de anticuerpos individuales, pero no se esperaría que detectara otros tipos de anomalías (tales como estequiometría incorrecta, agregación, enlaces disulfuro inadecuados u otros errores de ensamblaje). El anticuerpo se purificó mediante cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y cromatografía de interacción hidrófoba PPG-600M, como se ha descrito anteriormente, y una muestra de las diferentes etapas a lo largo del esquema de purificación se resolvió mediante SDS-PAGE y se tiñó con azul de Coomassie. Las bandas principales correspondían al peso molecular predicho del anticuerpo intacto en el gel no reducido y a las cadenas pesadas y ligeras en el gel reducido. Varias especies de variantes asociadas al producto eran fácilmente observables en cada muestra, siendo la más prominente una variante de baja movilidad (FIG.7, flecha marcada "variante asociada al producto de baja movilidad"). La variante asociada al producto de baja movilidad tenía una movilidad electroforética disminuida en relación con la cadena pesada. La cantidad de esta variante asociada al producto se redujo visiblemente en la preparación de anticuerpos después de la purificación usando cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y cromatografía de interacción hidrófoba PPG-600M (véase la FIG. 7, comparar los carriles 3-5 con los carriles 7-10).

La pureza de los anticuerpos también se monitorizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. (SE-HPLC) utilizando una HPLC Agilent (Santa Clara, CA) Serie 1200 con instrumento de detección de UV. Para la separación de muestras, se usó una columna TSKgel GS3000SWx1 7,8x300 mm conectada con una precolumna TSKgel SWx1 6x40 mm de Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA). Se usó una disolución de fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 200 mM pH 6,5 como fase móvil con una velocidad de flujo de 0,5 mL/min en modo isocrático y se monitorizó la absorbancia a UV 215nm. Antes de la inyección de las muestras, la columna se equilibró hasta que se alcanzó una línea base estable. Las muestras se diluyeron a una concentración de 1 mg/mL usando fase móvil y se inyectó un volumen de 30 pL. Para monitorizar el rendimiento de la columna, se usaron estándares de filtración en gel BioRad (Hercules, CA).

Los resultados de la purificación se presentan en la Tabla 4.En particular, el producto Ab-A, así como las impurezas de bajo peso molecular (LMW), agregados y glicovariantes (GV) se monitorizaron después de la cromatografía de afinidad de proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT, cromatografía de interacción hidrófoba PPG-600M y formulación de filtro UF/DF de 30 kDa y llenado. Con cada etapa del proceso de purificación, hubo niveles cada vez más reducidos (%) de cada impureza que se monitorizó, dando como resultado un producto Ab-A con al menos un 98 % de pureza.

Tabla 4. Evaluación cuantitativa de la pureza de Ab-A a lo largo del método de purificación. El porcentaje de agregado, variante, Ab-A y variante asociada al producto de baja movilidad después de la cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT, cromatografía de interacción hidrófoba PPG-600M y formulación UF/DF y llenado se muestran para tres preparaciones de purificación diferentes de Ab-A.

Se realizó una monitorización adicional de impurezas relacionadas con el proceso para cuantificar la eliminación de proteínas de la célula huésped, Proteína A residual, ADNds y glicanos (p. ej., p-D-glucano) como resultado de los métodos de purificación que incluyen una etapa de monitorización de unión a lectina. Véase la Tabla 5. En general, el esquema de purificación dio lugar a niveles reducidos de impurezas en la muestra de anticuerpo purificado.

Tabla 5. Evaluación cuantitativa de la eliminación de impurezas relacionadas con el proceso proporcionada por los métodos de purificación. Se muestra la concentración (relativa al anticuerpo) de la proteína de la célula huésped (HCP) de P. pastoris, la proteína de la célula huésped (HCP) de S. cerevisiae, la Proteína A residual, el ADNds y el p-D-glucano después de la cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y cromatografía de interacción hidrófoba PPG-600M para una preparación de purificación ejemplar de Ab-A.

Por lo tanto, los métodos de purificación que incluyen cromatografía y monitorización con lectina de impurezas demostraron una mayor pureza de los anticuerpos. En particular, el producto final tenía una pureza superior al 98 % después de la cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y cromatografía de interacción hidrófoba PPG-600M.

Ejemplo 2: Cuantificación de glicoproteínas

Este ejemplo describe un ensayo de unión para facilitar la cuantificación rápida y precisa de glicoproteínas en muestras de proteínas. Estos métodos pueden usarse para monitorizar y evaluar el rendimiento de la expresión de proteínas y los sistemas de purificación de proteínas. La velocidad y la reproducibilidad que se pueden lograr con estos métodos permiten que la monitorización ocurra casi en tiempo real. Durante la purificación de proteínas, estos métodos se pueden usar de múltiples maneras, incluyendo la identificación de fracciones que deben recogerse y opcionalmente combinarse, monitorización del rendimiento de la purificación y determinación de si se ha logrado el nivel de pureza deseado o, alternativamente, si se deben realizar etapas de purificación adicionales o modificadas para alcanzar el nivel de pureza deseado. De manera similar, cuando se usan para monitorizar el rendimiento de un sistema de expresión génica, estos métodos permiten el control por retroalimentación de los parámetros del sistema de expresión con el fin de lograr el nivel deseado (p. ej., más bajo) de glicoproteínas.

Se usaron biosensores de estrepavidina con aglutinina de Galanthus nivalis biotinilada para determinar la concentración de glicovariantes en disolución con respecto a un estándar. En particular, se usó un interferómetro Octet (ForteBio, Menlo Park, CA) con biosensores de estreptavidina (ForteBio) funcionalizados con lectina de Galanthus nivalis biotinilada (GNL [también denominada GNA], Cat B-1245, Vector Labs, Burlingame, CA) para determinar el nivel de actividad de una biomolécula en disolución con respecto a un estándar. Brevemente, los sensores se funcionalizaron mediante prehumedecimiento en tampón cinético 1x (una dilución 1:10 en disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco de tampón cinético 10x de Fortebio, No. de Parte: 18-5032), después se sumergieron en una dilución de lectina GNL biotinilada y se pusieron en una plataforma de agitación durante un período de tiempo prescrito.

Los estándares, las incógnitas y los controles para la medición se diluyeron en tampón cinético 1X y se dispusieron en una placa de microtitulación negra, con réplicas según fuera apropiado. La placa con las diluciones de la muestra se leyó en el Octet usando los sensores funcionalizados con GNL y los métodos de ensayo de cuantificación estándar (tal como para los sensores de Proteína A) como se describe por el fabricante (ForteBio).

El análisis de los datos se realizó con un módulo de software ForteBio Analysis. Se evaluó la linealidad de la curva estándar y la reproducibilidad de muestras conocidas. Los niveles de actividad de los pocillos se ajustaron adecuadamente por un factor de concentración/dilución de la muestra para determinar los niveles de actividad específica normalizados respecto a la masa, denominados Unidades Relativas (RU).

Almacenamiento y manipulación de las muestras: las muestras y los estándares se almacenaron a 4 °C o - 20 °C, dependiendo de los datos de estabilidad existentes. Mientras se preparaba el ensayo, las muestras se mantuvieron en hielo. Los tampones de cinética (Forte Bio No. de Catálogo 18-5032, 10x y 1x, que contenían PBS BSA al 0,1 %, Tween20 al 0,02 % y azida sódica al 0,05 %) se almacenaron a 4 °C. GNL se almacena a 4 °C.

Funcionalización de los sensores: los sensores de estreptavidina (Forte Bio No. de Catálogo 18-5019, bandeja de 96 biosensores recubiertos con estreptavidina) se empaparon en tampón cinético 1x durante al menos 5 minutos. Se diluyó la GNL biotinilada 1/1.000 en tampón cinético 1x para obtener el volumen calculado en la etapa siguiente. Se preparó tampón cinético 1x a partir de tampón cinético 10x e Hyclone DPBS Ca Mg. Se añadieron partes alícuotas de 120 ul de tampón cinético por pocillo para cada sensor necesario en una placa negra de media área, p. ej., placas de media área negras de 96 pocillos con unión media y alta (Greiner Bio-One Cat 675076 o VWR Cat 82050-044). Los sensores se transfirieron a placas con GNL biotinilada y las placas se incubaron con agitación durante al menos 30 minutos.

Preparación de los sensores y las muestras: los sensores se manipularon con una pipeta multicanal prestando especial atención a las puntas de los sensores, ya que los daños (p. ej., raspaduras) en estas puntas pueden afectar los resultados del ensayo. Se usó una placa negra de unión media para los sensores con bandeja de sensor. Se usó una placa negra separada para muestras y estándares. Se añadieron 150 pl por pocillo para las incógnitas, los controles y los estándares. Opcionalmente, se puede incluir como muestra de control un blanco de medio o una disolución que contenga una concentración de glicovariante conocida. Se usó un nuevo sensor para cada pocillo estándar del ensayo. Cada sensor se enjuagó en tampón cinético 1x antes de su uso. Una serie de diluciones de 3 veces por duplicado de 8 puntos fue suficiente para una curva estándar. Las diluciones se realizaron usando tampón cinético 1x. También se usó tampón cinético 1x como muestra de blanco.

Las condiciones de Octet se establecieron de la siguiente manera: tiempo (s) de cuantificación 250; velocidad de agitación 1.000 rpm. La placa se definió asignando los pocillos de muestra y los sensores. En particular, los pocillos de muestra se asignaron seleccionando los pocillos correspondientes a las muestras e ingresando su identidad, p. ej., "desconocido" para introducir un factor de dilución o "estándar" para introducir una concentración conocida. Los sensores no se reusaron para este ensayo. El programa incluyó opcionalmente un retraso y/o agitación antes de procesar la muestra (p. ej., la placa se equilibró a 30 °C mientras se agitaba a 200 RPM durante 300 segundos).

Una lectina diferente, DC-SIGN (R& D Systems no. de cat .161-DC-050) se biotiniló con LC-LC-biotina (Pierce no. de cat. 21338) y se usó para funcionalizar los sensores de estreptavidina que se emplearon en un ensayo similar como se ha descrito anteriormente.

El ensayo de unión de lectina Octet descrito anteriormente se usó para cuantificar la cantidad de proteínas glicosiladas presentes en fracciones del eluato recogido después de la cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita y después de la cromatografía de interacción hidrófoba. En particular, se determinaron los valores de actividad Octet (RU) para la unión a GNA y DC-SIGN para cada una de las 21 fracciones del eluato recogido después de la cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y para cada una de las 25 fracciones del eluato recogido después de la cromatografía de interacción hidrófoba PPG-600M. Véase, la FIG. 5, panel A y la FIG. 6, panel A, respectivamente. Para cada fracción analizada, el valor de la actividad Octet (RU) se representó frente a la concentración de Ab-A presente en la misma fracción. Para las fracciones de CHT, tanto los valores de GNA Octet como los de DC-SIGN Octet se correlacionaron bien con la concentración relativa de glicovariantes. Véase la FIG. 4.

Se seleccionaron fracciones del eluato de la columna para su procesamiento adicional en función del nivel de impurezas glicovariantes contenidas en la muestra, según se determinó usando los ensayos Octet, usando los criterios de combinación de la línea de base o los criterios de combinación estrictos descritos en el Ejemplo 1. En particular, siguiendo los criterios de combinación estrictos, la fracción 1 a la fracción 10 de la columna de modo mixto de hidroxiapatita CHT se seleccionaron para su procesamiento adicional, mientras que la fracción 1 a la fracción 13 se seleccionaron para su procesamiento adicional según los criterios de combinación de la línea de base. Las fracciones combinadas estrictas tenían una RU de 1,9, en comparación con una RU de 2,3 para las fracciones combinadas de la línea base, según se determina por el ensayo GNA-Octet. El contenido de impurezas de glicovariantes según se mide por el ensayo Octet se correlacionó con niveles incrementados de monomanosa, manobiosa y manotriosa en el combinado de criterios de la línea base en comparación con el combinado de criterios estrictos (es decir, 1,55 moles de monomanosa/ mol de Ab-A en el Combinado Estricto en comparación con 1,60 moles de monomanosa/ mol de Ab-A en el Combinado de la Línea Base, y 0,22 moles de manotriosa/ mol de Ab-A en el Combinado Estricto en comparación con 0,28 moles de manotriosa/ mol de Ab-A en el Combinado de la Línea Base). Véase la FIG. 5, panel B.

De manera similar, siguiendo criterios de combinación estrictos, se seleccionaron la fracción 8 a la fracción 23 de la columna de interacción hidrófoba PPG-600M para su procesamiento adicional, mientras que se seleccionaron la fracción 4 a la fracción 23 para su procesamiento adicional según los criterios de combinación de la Línea Base. Las fracciones combinadas estrictas tenían una RU de 1,1, en comparación con una RU de 1,4 para as fracciones combinadas de la Línea Base, según se determina por el ensayo GNA-Octet. El contenido de impurezas de glicovariantes según se mide por el ensayo Octet se correlacionó con niveles incrementados de monomanosa, manobiosa y manotriosa en el combinado de criterios de la Línea base en comparación con el combinado de criterios estrictos (es decir, 1,57 moles de monomanosa/ mol de Ab-A en el Combinado Estricto en comparación con 1,48 moles de monomanosa/ mol de Ab-A en el Combinado de la Línea Base; 0,52 moles de manobiosa/ mol de Ab­ A en el Combinado Estricto en comparación con 0,14 moles de manobiosa/ mol de Ab-A en el Combinado de la Línea Base; y 0,32 moles de manotriosa/ mol de Ab-A en el Combinado Estricto en comparación con 0,07 moles de manotriosa/ mol de Ab-A en el Combinado de la Línea Base). Véase la FIG. 6, panel B.

Por tanto, el ensayo cuantitativo de unión a lectina cuando se usa en combinación con métodos de purificación cromatográfica mejora la pureza del producto de anticuerpo. Tomando como base el nivel de actividad de unión a lectina, se pueden seleccionar fracciones particulares del eluato después de diferentes etapas de cromatografía para su procesamiento adicional para aumentar el rendimiento del producto de anticuerpo deseado y minimizar la presencia de impurezas no deseadas.

Ejemplo 3: Purificación y recuperación de Ab-B

Este ejemplo ilustra que la pureza de los anticuerpos recombinantes generados en P. pastoris se mejoró usando una serie de procesos de recuperación primaria y purificación cromatográfica. En la FIG. 1 se muestra una descripción general del método de purificación. Estos métodos pueden usarse para purificar y recuperar una variedad de anticuerpos específicos de antígeno expresados en diferentes sistemas.

Se cultivaron células de P. pastoris que contienen secuencias integradas de manera estable que codifican las cadenas pesada y ligera de Ab-B (correspondientes a la SEQ ID NO:681 y SEQ ID NO:701 como se enumeran en US 20120294797) y se indujo la expresión de anticuerpos.

El caldo completo se trató con ácido etilen diamino tetraacético (EDTA) hasta una concentración final de 3 mM y con un agente floculante. Las células y los restos celulares floculados se eliminaron del caldo recogido por centrifugación, y fue seguido por clarificación a través de filtros de profundidad y de 0,2 pm.

El caldo clarificado se aplicó a una columna de resina MabSelect SuRe para capturar Ab-B mediante cromatografía de afinidad de Proteína A. La cromatografía se realizó a temperatura ambiente. Una columna con una altura de lecho de 23 cm se desinfectó con hidróxido de sodio 0,1 M y después se equilibró con tampón fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6,0 ("tampón de equilibrado Pr A") antes de la carga. La columna se cargó a una capacidad diana de 25 g de Ab-B por L de resina a 250 cm/hr de velocidad lineal, y después se operó a la misma velocidad lineal en todo momento. Después de la aplicación de la carga, la columna se enjuagó en > 3 volúmenes de columna (CV) con tampón de equilibrado de captura para eliminar los materiales unidos débilmente. El Ab-B unido de desadsorbió entonces con > 3 CV de tampón de elución de arginina 1 M, pH 4,0 ("tampón de elución PrA"). La DO280 del efluente se monitorizó, y el eluato se recogió de 1 DO en el flanco frontal a 1 DO en el flanco trasero. El eluato se recogió en un recipiente precargado con 0,15 CV de tampón de neutralización de Tris 1 M, pH 8,0 ("tampón de neutralización PrA"). Después de la recogida, el contenido del recipiente se mezcló, y se determinó su valor de pH, antes del ajuste final a pH 6,5 usando bien ácido clorhídrico al 5 % o hidróxido de sodio 1 M, según fue necesario. El eluato neutralizado se filtró a través de 0,2 pm, después se llevó a la etapa de cromatografía de hidroxiapatita. Después de la elución del producto, la columna de Proteína A se limpió con hidróxido de sodio 0,2 M en 3CV, y se lavó con tampón de equilibrado en 3 CV antes de su almacenamiento en etanol al 20 %.

La purificación intermedia de Ab-B usa cromatografía de modo mixto en resina de hidroxiapatita cerámica (CHT, Tipo I, 40 pm). Esta etapa se llevó a cabo a temperatura ambiente y a no más de 200 cm/hr de velocidad lineal en todo momento. Antes de la operación, la columna se desinfectó usando 3 CV de hidróxido de sodio 1 M y se equilibró con al menos 3 CV de tampón de equilibrado de fosfato de sodio 5 mM, pH 6,5 ("tampón de equilibrado CHT"). La carga de CHT se preparó diluyendo el eluato de captura neutralizado filtrado con tampón de equilibrado CHT hasta una conductividad de no más de 4 mS/cm. La carga de CHT se aplicó entonces a la columna equilibrada después de pasar a través de un filtro de 0,2 pm. Después de la carga, la columna se lavó con 5 CV de tampón de equilibrado y después se eluyó con un gradiente lineal de 20 CV de fosfato de sodio de 5 mM a 0,25 M, pH 6,5 ("tampón de elución CHT 2"). La DO280 del efluente se monitorizó, y se recogió una serie de fracciones de ~ A CV de 0,1 DO en el flanco frontal a 0,1 DO en el flanco trasero. Se analizó la pureza de las fracciones, y se combinó un conjunto de fracciones contiguas para lograr un Combinado de CHT de la pureza deseada y contenido de glicovariante reducido (véase la FIG. 8). Después de la elución, la columna de CHT se trató con 5 CV de tampón de tratamiento de fosfato de sodio 500 mM, pH 6,5 ("tampón de tratamiento CHT"), se limpió con 5 CV de hidróxido de sodio 1 M, y se lavó con 5 CV de disolución de almacenamiento de etanol al 20 %.

La purificación de pulido de Ab-B usó cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en resina de Fenilo de Alto Rendimiento (GE Healthcare). Esta etapa se llevó a cabo a temperatura ambiente y a no más de 200 cm/hr de velocidad lineal en todo momento. Antes de la operación, la columna se desinfectó usando 3 CV de hidróxido de sodio 1 M, y se equilibró con 5CV de tampón de equilibrado de fosfato de sodio 20 mM, sulfato de sodio 0,7 M, pH 7,0 ("tampón de equilibrado HIC"). La carga de HIC se preparó ajustando el Combinado de CHT filtrado a través de 0,2 pm a una conductividad > 77,5 mS/cm usando tampón de dilución de HIC de fosfato de sodio 20 mM, sulfato de sodio 1,1 M, pH 7,0. La carga de HIC se aplicó entonces a la columna equilibrada después de pasar a través de un filtro de 0,2 pm. Después de la carga, la columna se lavó con 5 CV de tampón de equilibrado HIC y después se eluyó con un gradiente lineal de 20 CV del 0-100 % de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0 ("tampón de elución HIC"). La DO280 del efluente se monitorizó, y se recogió una serie de fracciones de ~ 1/3 de CV de 0,1 DO en el flanco frontal a 0,1 DO en el flanco trasero. Se analizó la pureza de las fracciones (véase la FIG. 9) y se combinó un conjunto de fracciones contiguas para formar un Combinado de HIC de la pureza deseada y contenido de glicovariante reducido (véase la FIG. 8 y la FIG. 9). Después de la elución, la columna de HIC se trató con 4 CV de tampón de elución de HIC, se limpió allí mismo con >3 CV de hidróxido de sodio 1 M, y se transfirió a una disolución de almacenamiento de hidróxido de sodio 0,1 M.

Las variantes del producto en las preparaciones de Ab-B se visualizaron en geles de proteínas (véase la FIG. 10). En ambos geles, los carriles 1, 2 y 6 contienen marcadores de peso molecular; el carril 3 contiene eluato de Proteína A; el carril 4 contiene el combinado de CHT; y el carril 5 contiene el combinado de HIC. Debido a que las muestras se sometieron a condiciones de desnaturalización y reducción (FIG.10 panel A y panel B, respectivamente), este método puede detectar anomalías que afectan la constitución de cadenas de anticuerpos individuales, pero no se esperaría que detectara otros tipos de anomalías (tales como estequiometría inadecuada, agregación, enlaces disulfuro inadecuados u otros errores de ensamblaje). El anticuerpo se purificó mediante cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y cromatografía de interacción hidrófoba con fenil-sefarosa de alto rendimiento (HP), como se ha descrito anteriormente, y una muestra de diferentes etapas a lo largo del esquema de purificación se resolvió mediante SDS-PAGE y se tiñó con azul de Coomassie. Las bandas principales correspondían al peso molecular predicho del anticuerpo intacto en el gel no reducido y a las cadenas pesadas y ligeras en el gel reducido. Varias especies de variantes asociadas al producto fueron fácilmente observables en cada muestra, siendo la más prominente una variante de baja movilidad (FIG.10, marcada con una flecha como "variante asociada al producto de baja movilidad"). La variante asociada al producto de baja movilidad tenía una movilidad electroforética disminuida en relación con la cadena pesada. La cantidad de esta variante asociada al producto se redujo visiblemente en la preparación de anticuerpo después de la purificación usando cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y cromatografía de interacción hidrófoba Fenil HP (véase la FIG. 10, comparar los carriles 4-5 con el carril 3).

La pureza del anticuerpo también se monitorizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. (SE-HPLC) usando un HPLC Agilent (Santa Clara, CA) Serie 1200 con instrumento de detección de UV. Para la separación de las muestras, se usó una columna TSKgel GS3000SWx1 de 7,8x300 mm conectada con una precolumna TSKgel SWx1 6x40 mm de Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA). Se usó fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 200 mM pH 6,5 como una fase móvil con una velocidad de flujo de 0,5 mL/min en modo isocrático y se monitorizó la absorbancia a UV 215nm. Antes de la inyección de las muestras, la columna se equilibró hasta que se alcanzó una línea base estable. Las muestras se diluyeron a una concentración de 1 mg/mL usando fase móvil y se inyectó un volumen de 30 pL. Para monitorizar el rendimiento de la columna, se usaron estándares de filtración en gel BioRad (Hercules, CA).

Los resultados de la purificación se presentan en la Tabla 6. En particular, el producto Ab-B, así como las impurezas de bajo peso molecular (LMW), agregados y glicovariantes (GV) se monitorizaron después de la cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT, cromatografía de interacción hidrófoba Fenil HP. Con cada etapa del proceso de purificación, hubo niveles cada vez más reducidos (%) de cada impureza que se monitorizó, dando como resultado un producto Ab-B con al menos un 95 % de pureza.

Tabla 6. Evaluación cuantitativa de la pureza de Ab-B a lo largo del método de purificación. El porcentaje de agregado, variante, Ab-B y variante asociada al producto de baja movilidad después de la cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y cromatografía de interacción hidrófoba Feni1HP se muestra para una preparación de purificación ejemplar de Ab-B.

Se realizó una monitorización adicional de impurezas relacionadas con el proceso para cuantificar la eliminación de proteínas de la célula huésped, Proteína A residual, ADNds y glicanos (p. ej., p-D-glucano) como resultado de los métodos de purificación que incluyen una etapa de monitorización de la unión de lectina. Véase la Tabla 7. En general, el esquema de purificación dio lugar a niveles reducidos de impurezas en la muestra de anticuerpo purificado.

Tabla 7. Evaluación cuantitativa de la eliminación de impurezas relacionadas con el proceso proporcionada por los métodos de purificación. Se muestra para Ab-B la concentración (relativa al anticuerpo) de la proteína de la célula huésped (HCP) de P. pastoris, la proteína de la célula huésped (HCP) de S. cerevisiae, la Proteína A residual, el ADNds y el p-D-glucano después de la cromatografía de afinidad de Proteína A, la cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y la cromatografía de interacción hidrófoba Fenil HP.

Por lo tanto, los métodos de purificación cromatográfica demostraron una pureza mejorada del anticuerpo. En particular, el producto final tenía una pureza superior al 95 % después de cromatografía de afinidad de Proteína A, cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita CHT y cromatografía de interacción hidrófoba Fenil-HP. Además, el ensayo de unión a lectina realizado en intermedios del proceso demostró que el proceso de purificación descrito daba lugar a Ab-B purificado con actividad de unión a GNA reducida (véase la FIG.8). El ensayo de unión de lectina realizado en combinados de fracciones de HIC demostró que la selección de fracciones de elución de HIC apropiadas para combinar puede dar lugar a un Combinado de HIC con actividad de unión a GNA reducida, mediante la exclusión de otras fracciones que tienen una actividad de unión a GNA más alta (véase la FIG. 9).

Ejemplo 4: Purificación y recuperación de Fab de Ab-C

Este ejemplo demuestra que el ensayo de unión a lectina descrito en la presente memoria puede usarse para detectar impurezas de glicosilación de fragmentos de anticuerpos recombinantes generados en P. pastoris.

Se cultivaron células de P. pastoris que contenían secuencias integradas de manera estable que codifican el Fab de Ab-C y se indujo la expresión del fragmento de anticuerpo. Alternativamente, el Fab de Ab-C se puede producir químicamente mediante proteólisis del anticuerpo expresado Ab-C de longitud completa.

Brevemente, el sobrenadante de cultivo clarificado se puso en contacto con una resina de modo mixto a un pH bajo y conductividad baja, se lavó y después se eluyó con una estrategia de gradiente que empleaba elevar el pH y la conductividad simultáneamente. Se monitorizó la calidad de las fracciones eluidas y se combinaron las fracciones apropiadas y se intercambió el tampón en un tampón final. En particular, las fracciones se monitorizaron para determinar las impurezas de glicosilación (RU) usando el ensayo de lectina GNA descrito anteriormente.

La pureza del fragmento de anticuerpo también se monitorizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. (SE-HPLC) usando un HPLC Agilent (Santa Clara, CA) Serie 1200 con instrumento de detección de UV. Para la separación de muestras, se usó una columna TSKgel GS3000SWx1 7,8x300 mm conectada con una precolumna TSKgel SWx1 6x40 mm de Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA). Se usó fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 200 mM pH 6,5 como fase móvil con una velocidad de flujo de 0,5 mL/min en modo isocrático y se monitorizó la absorbancia a UV 215nm. Antes de la inyección de las muestras, la columna se equilibró hasta que se alcanzó una línea base estable. Las muestras se diluyeron a una concentración de 1 mg/mL usando fase móvil y se inyectó un volumen de 30 pL. Para monitorizar el rendimiento de la columna, se usaron estándares de filtración en gel BioRad (Hercules, CA).

Los resultados de la purificación se presentan en la Tabla 8. En particular, el producto Fab de Ab-C, así como las impurezas de bajo peso molecular (LMW), agregados y glicovariantes (GV), se monitorizaron después de la cromatografía de modo mixto usando cromatografía de exclusión por tamaño. Además, se detectaron las impurezas glicosiladas usando el ensayo de lectina GNA. La purificación dio como resultado un producto de Fab de Ab-C con aproximadamente un 90 % de pureza.

Tabla 8. Evaluación cuantitativa de la pureza de Fab de Ab-C a lo largo del método de purificación. Se muestra el porcentaje de agregado, variante, Fab de Ab-C y variante asociada al producto de baja movilidad después de la cromatografía de modo mixto para una preparación de purificación de Fab de Ab-C.

Tabla 8.

Por lo tanto, los métodos de purificación que incluyen cromatografía y monitorización por lectina de impurezas demostraron la pureza del fragmento de anticuerpo Fab. En particular, el producto final tenía una pureza superior al 90 % después de la cromatografía de modo mixto.

Determinadas enseñanzas relacionadas con los métodos para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno se describen en la solicitud de patente provisional de EE.UU. 60/801.412, presentada el 19 de mayo de 2006 y la Pub. de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2012/0141982.

Determinadas enseñanzas relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales derivados de conejo y modificaciones de secuencia preferidas para mantener la afinidad de unión a antígeno se describieron en la Solicitud Internacional No. PCT/US2008/064421, correspondiente a la Publicación Internacional No. WO/2008/144757, titulada "Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies", presentada el 21 de mayo de 2008.

Determinadas enseñanzas relacionadas con la producción de anticuerpos o fragmentos de los mismos usando apareamiento de levaduras competentes y los correspondientes métodos se describen en la solicitud de Patente de EE.UU. no. 11/429.053, presentada el 8 de mayo de 2006, (Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US2006/0270045).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de fermentación para producir un polipéptido recombinante deseado y purificar el polipéptido recombinante deseado del medio de fermentación, en donde el proceso incluye:

(i) cultivar células o microbios huésped en condiciones que den como resultado la expresión y secreción del polipéptido recombinante y una o más impurezas en el medio de fermentación;

(ii) obtener periódicamente una o más muestras del medio de fermentación a medida que avanza el proceso de fermentación o después de que se realicen diferentes ciclos de fermentación;

(iii) detectar la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas en la o las muestras usando una lectina que se une a dichas impurezas glicosiladas, y

(iv) en función de la cantidad de impurezas glicosiladas detectadas en la o las muestras, modificar uno o más de los parámetros de operación o condiciones del proceso de fermentación,

en donde las células o microbios huésped son levaduras u hongos filamentosos,

en donde el polipéptido recombinante es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo,

en donde en función de la cantidad de impurezas glicosiladas detectadas, se altera uno o más de los siguientes parámetros o condiciones del proceso de fermentación: temperatura, pH, constituyente gaseoso, constituyente de alimentación, agitación, aireación, antiespumante y duración,

en donde el proceso incluye además recuperar o purificar el polipéptido recombinante del medio de fermentación, y en donde el proceso de purificación comprende además la combinación de diferentes muestras o eluatos o fracciones de los mismos que contienen el polipéptido recombinante deseado en función de la cantidad y/o tipo de impurezas glicosiladas detectadas en relación con la cantidad del polipéptido recombinante deseado.

2. El proceso de la reivindicación 1, en donde

(i) las impurezas son el resultado de la glicosilación unida a O,

(ii) la etapa de detección se efectúa usando al menos una lectina seleccionada de ConA, LCH, GNA o GNL, RCA, DC-SIGN, L-SIGN, PNA, AIL, VVL, WGA, SNA, MAL, MAH, UEA y AAL, y/o al menos una lectina seleccionada de PNA, SBA, PWM, PEA, PTA, ML-I-III, LEA, UDA, WGA, PHA, LTA, BSI-B4, MPA, RCA, LCA, ECA, AAA, DBA, GSL-I, PSA, SJA, DSL, ECL, GSL-II, AIA/Jacalina, LEL, STL, HHL, LCA, NPL, ACL, ECL, EEL, MAL-I, AAL, LTL, BPL, MPL, PTL, SNA, DGL, SJA, VVA, LEA, STA, DSA, MMR, DEC-205, Dectina 1, Dectina 2, Langerina, o BDCA-2, que opcionalmente puede estar unida a un soporte,

(iii) la etapa de detección usa un proceso de monitorización de las interacciones proteína-proteína, en donde opcionalmente el proceso de monitorización de las interacciones proteína-proteína usa interferometría de luz, interferometría de polarización dual, dispersión de luz estática, dispersión de luz dinámica, dispersión de luz con múltiples ángulos, resonancia de plasmón de superficie, ELISA, ELISA quimioluminiscente, far western o electroluminiscencia, o cualquier combinación de (i) -(iii).

3. El proceso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la impureza glicosilada es una glicovariante del polipéptido recombinante.

4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la levadura u hongos filamentosos son células huésped de levadura seleccionadas de Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; Zygosaccharomyces; Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella, o células huésped de hongos filamentosos seleccionados de Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus, Paecilomyces, Fusarium, Neurospora y Claviceps.

5. El proceso de la reivindicación 4, en donde las células huésped de levadura se seleccionan de Pichia pastoris, Pichia angusta, Pichia guillermordii, Pichia methanolica o Pichia inositovera.

6. El proceso de la reivindicación 4, en donde las células huésped de levadura son Pichia pastoris.

7. El proceso de cualquier reivindicación anterior, que incluye además recuperar o purificar el polipéptido recombinante del medio de fermentación mediante un proceso de purificación que comprende:

(i) poner en contacto la o las muestras con al menos un soporte cromatográfico y eluir selectivamente el polipéptido recombinante deseado, y/o

(ii) combinar diferentes muestras o eluatos o fracciones de los mismos que contienen el polipéptido recombinante deseado en función de la cantidad y/o tipo de impureza glicosilada detectada.

8. El proceso de cualquier reivindicación anterior, que comprende además detectar la cantidad de impurezas agregadas y/o desagregadas en las muestras o fracciones usando cromatografía de exclusión por tamaño, en donde en función de la cantidad de impurezas agregadas y/o desagregadas detectadas se alteran uno o más de los siguientes parámetros o condiciones del proceso de fermentación: temperatura, pH, constituyente gaseoso, constituyente de alimentación, agitación, aireación, antiespumante y duración.

9. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, en donde opcionalmente el anticuerpo humanizado es de origen de ratón, rata, conejo, cabra, oveja o vaca, preferiblemente un anticuerpo humanizado que es de origen de conejo, y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente.

10. El proceso de cualquier reivindicación anterior, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-alfa, IFN-gamma, BAFF, CXCL13, IP-10, c Bp , angiotensina (angiotensina I y angiotensina II), Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, TNF, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 o HRG.