TWI626313B - 增加植物萃取液中果糖基化芒果苷含量的方法 - Google Patents

增加植物萃取液中果糖基化芒果苷含量的方法 Download PDF

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Abstract

一種使用保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。該用途的一具體化實施態樣包括將芒果皮萃取液中的果糖基化芒果苷含量增加的一種方法。

Description

增加植物萃取液中果糖基化芒果苷含量的方法
本發明係關於一種使用保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)將芒果皮萃取液中的果糖基化芒果苷含量增加的一種方法,以及一種以保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
芒果苷是一種四羥基吡酮的碳酮苷,屬雙苯吡酮類黃酮類化合物,在多種植物中存在,如芒果樹、扁桃樹、東北龍膽及知母等。芒果苷分子式:C19H18O11,分子量:422.3。芒果苷具有多種生物活性和藥理作用,如抗氧化、抗腫瘤、免疫調節、抗糖尿、抗炎等(鄧家剛,蕈驪蘭.長春中醫藥大學學報,2008,24(4):463-464.)。
芒果苷雖具有廣泛藥理活性,但其溶解度很差,嚴重限制了其製劑的開發,為方便應用,需要改善芒果苷溶解性和生物利用度。
對於複雜結構的天然活性成分來說,利用化學合成來進行結構修飾存在著產率低、反應專一性差、副產物多 等缺點,特別是有些反應目前利用化學手段較難實現,生物轉化技術卻可彌補化學合成的不足。Cantagrel等(公開號:FR 2882762 A1)以來源於兩株腸膜狀明串珠菌的葡萄糖基轉移酶,對芒果苷進行糖基化修飾,在芒果苷為糖基受體,蔗糖為糖基供體時,得到葡萄糖基-β-(1,6)-芒果苷(CASRN:908570-23-0)。當Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299菌株作為生物催化劑,在0.4g/L芒果苷,40g/L蔗糖條件下,糖基化反應收率為25%;當Leuconostoc mesenteroides NRRL 521-F菌株作為生物催化劑,在0.4g/L芒果苷,40g/L蔗糖條件下,糖基化反應收率為28%。
中國專利申請案公開號CN 102863484 A揭示了一種果糖基化芒果苷的製備方法,該方法包括將具有果糖基化酶活性的物質加入含有芒果苷的轉化液中,進行生物轉化反應,使芒果苷轉化為果糖基化芒果苷,所述轉化液中含有芒果苷和糖基供體,該具有果糖基化酶活性的物質為來源自煙草節桿菌,其保藏號為CCTCC M2010164,的發酵液。
在前述法國公開號FR 2882762 A1及中國公開號CN 102863484 A的專利申請案中均使用了純化的芒果苷來進行芒果苷的果糖基化。
本發明的一主要目的是提供一種直接以含有芒果苷的植物萃取液作為基質進行生物轉化反應,使該芒果苷轉化為果糖基化芒果苷的方法。
本發明的另一目的是提供一種合適的微生物,來進行直接以含有芒果苷的植物萃取液作為基質的生物轉化反應,使該芒果苷轉化為果糖基化芒果苷。
本發明的又一目的是提供一種合適的微生物及方法,將芒果皮萃取液中的果糖基化芒果苷的含量提昇。
本發明的一種增加植物萃取液中的果糖基化芒果苷含量的方法,包含下列步驟:提供一含有芒果苷的植物萃取液;及將一糖基供體加入該植物萃取液中,於一具有果糖基化酶活性的物質的存在下進行生物轉化反應,使該芒果苷轉化為果糖基化芒果苷,其中該具有果糖基化酶活性的物質係通過保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的發酵而產生。
較佳的,該植物萃取液為芒果皮萃取液。
較佳的,該糖基供體為蔗糖或葡萄糖。更佳的,該糖基供體為蔗糖。
較佳的,該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)被加入於該植物萃取液中。
較佳的,該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵液被加入於該植物萃取液中。
較佳的,該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液被加入於該植物萃取液中。
較佳的,純化自該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液的果糖基化酶被加入於該植物萃取液中。
較佳的,該生物轉化反應係於一乳酸菌培養基中、20-40℃及不攪拌或攪拌速度不大於400rpm下進行0.5至96小時,且以100mL的該培養基為基準,該糖基供體的用量為1-20克,該植物萃取液的用量為1-60mL,及該乳酸菌的用量為105~107CFU/mL。
本發明提供一種使用保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
本發明提供一種使用保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵液進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
本發明提供一種使用保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
本發明提供一種使用純化自該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液的果糖基化酶進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
圖1為果糖基化芒果苷標準品在不同波長下之紫外光吸收光譜。
圖2為依本發明方法以Lactobacillus plantarum乳酸菌轉化後離心去除菌體後的上清液在不同波長下之紫外光吸收光譜。
圖3為果糖基化芒果苷標準品的液相層析質譜(LC-MS)圖譜。
圖4為依本發明方法以Lactobacillus plantarum乳酸菌轉化後離心去除菌體後的上清液LC-MS圖譜。
圖5顯示不同糖基供體對本發明菌株將芒果苷轉化成果糖基化芒果苷之影響。
圖6顯示不同用量(比例)的蔗糖糖基對本發明菌株將芒果苷轉化成果糖基化芒果苷之效率的比較結果。
依本發明內容所完成的一較佳具體實施態樣包括一種將芒果皮萃取液中的果糖基化芒果苷含量增加的方法,主要包含將一糖基供體加入該芒果皮萃取液中,於一具有果糖基轉化酶活性的物質的存在下進行生物轉化反應,使該芒果皮萃取液中所含有的芒果苷轉化為果糖基化芒果苷,其中該具有果糖基轉化酶活性的物質係通過保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的發酵而產生。透過上述方法可以使芒果皮更有效率的被製備成果糖基化芒果苷,不僅解決芒果盛產時將芒果製成果汁或芒果乾或芒果果 肉罐頭時,芒果皮的出處,有利於減少環境汙染,也達到全果利用、提升芒果的經濟價值的目標。
一適合製備用於本發明的芒果皮萃取液的方法包括(但不限於)下列步驟:將芒果皮清洗及攪碎;接著以纖維酵素(Cellulase)於室溫至50℃進行均質處理60~180分鐘;於60℃烘乾去除水分,再粉碎成粉末;將該粉末以1:5~1:20g/mL的比例與一極性溶劑混合,且於室溫至50℃及較佳地於超音波振盪例如125~500W/L功率下,於50℃萃取60分鐘,移除該極性溶劑,可得到含芒果苷之果皮萃取液。
合適的極性溶劑例如水、C1-C3的醇及其等之混合液,較佳地為乙醇與水的混合,例如50%(v/v)乙醇。
前述芒果皮萃取液為本發明應用微生物轉化芒果苷的基質材料來源,本發明應用纖維酵素(Cellulase)或其它類似能分解植物細胞璧之酵素來促進細胞內物質之萃取效益。另外,萃取時輔以超音波振盪,能進一步提升芒果皮中類黃酮物質之萃取效果。本發明經過探討溶劑比例、超音波功率與萃取時間等參數,得到以50%(v/v)乙醇水溶液,超音波功率500W/L,於50℃萃取60分鐘,可得到較高含量之芒果多酚及富含芒果苷之芒果皮萃取液。於一較佳具體實施例中,經HPLC定量分析芒果皮萃取液中的果糖基化芒果苷含量為18μg/mL。
一適合用於本發明的糖基供體包括(但不限於)蔗糖、葡萄糖及果糖,以蔗糖或葡萄糖為較佳,而以蔗糖為 最佳。
較佳地,於本發明方法的生物轉化反應中該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液被加入於該芒果皮萃取液。一適合用於該BCRC 11697的乳酸菌的培養基配方包含:葡萄糖2~80g/L,蛋白腖5~50g/L,KH2PO4 0.4~4g/L,MgSO4.7H2O 0.05~1.0g/L,MnSO4 H2O 0.01~0.1g/L,pH 6~8的乳酸菌培養基。
本發明方法較佳地進一步包含將該生物轉化反應得到的果糖基化芒果苷含量增加的產物純化,例如藉由樹脂純化的手段得到其中的水相部份。該水相部份可以直接或濃縮後被使用作為抗氧化劑,添加於防曬乳等保養品或化妝品。選擇性,也可通過已知純化方法將果糖基化芒果苷從該液體部份分離出來而得到純化的果糖基化芒果苷。
實施例 材料與方法 一、材料與方法
1.培養基配方及菌株培養
(1)乳酸菌培養基(MRS培養基)
MRS培養基配方:依序加入1g月示蛋白腖(Proteose peptone)No.3、1g的牛肉汁(Beef extract)、0.5g的酵母菌萃取物(Yeast extract)、2g的葡萄糖(Dextrose)、0.1g Tween 80界面活性劑、0.2g檸檬酸銨(Ammonium citrate)、0.5g的CH3COONa、10mg的MgSO4.7H2O、 5mg MnSO4.H2O、0.2g K2HPO4,隨後補水使其體積達到100mL,調pH至6.5後進行高壓滅菌。菌株於培養基活化後,菌株接種量為培養基體積的10%。生長溫度為37℃、pH 6.5、靜置培養(0rpm)培養,菌液之OD600達到10時離心去除菌體,得到上清液。
(2)細菌培養基(Nutrient培養基)
依序加入0.3g牛肉汁(Beef extract)、0.5g蛋白腖(peptone),隨後補水使其體積達到100mL,調pH至7.0後進行高壓滅菌。菌株於培養基活化後,菌株接種量為培養基體積的10%。生長溫度為26℃、pH 7.0、100rpm培養,菌液之OD600達到10時離心去除菌體,得到上清液。
(3)酵母菌培養基(YPD培養基)
依序加入2g蛋白腖(peptone)、2g葡萄糖(Dextrose)和1g酵母菌萃取物(Yeast extract),隨後補水使其體積達到100mL後進行高壓滅菌。菌株於培養基活化後,菌株接種量為培養基體積的10%。生長溫度為25℃、pH 7.0、100rpm培養,菌液之OD600達到10時離心去除菌體,得到上清液。
(4)絲狀真菌培養基(麥芽萃取物)
依序加入2.0g葡萄糖(Glucose)、1.0g蛋白腖(peptone)和2.0g麥芽汁(Malt extract),隨後補水使其體積達到100mL後進行高壓滅菌。菌株於培養基活化後,菌株接種量為培養基體積的10%。生長溫度為24-30 ℃、pH 7.0、100rpm培養,菌液之OD600達到10時離心去除菌體,得到上清液。
2.芒果皮萃取液之製備
將芒果皮洗淨攪碎,以2%(w/w)比例加入纖維酵素(Cellulase)於50℃進行水解反應180分鐘,後於60℃烘箱內烘乾去除水分,均質粉碎成芒果皮粉末後,進行超音波輔助萃取製程,萃取條件為50%(v/v)乙醇、料液比1:5、超音波功率500W/L、超音波頻率40Hz、萃取溫度50℃,萃取60分鐘後,於60℃真空烘箱去除乙醇,得到含芒果苷之果皮萃取液。
3.果糖基化芒果生物轉化反應:
將上述菌液、上述芒果皮萃取液、及一糖基供體的水溶液添加於水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中,於37℃進行生物轉化反應,使芒果苷轉化成為果糖基化芒果苷,反應時間為96小時。該菌液的添加為全部轉化反應液體積之10%,該芒果皮萃取液的添加量為全部轉化反應液體積之10%,而糖基供體的水溶液的添加量為每100mL的轉化反應液含0~20克的糖基(0~20 w/v %)。以高效液相層析法來分析果糖基化芒果苷含量。
除了不添加前述菌液外重覆上述生物轉化反應的步驟,而得到作為對照之用的一控制組的數據。
4.果糖基化芒果苷之高效液相層析法(HPLC)定量
精密稱取1mg果糖基化芒果苷(Fructosylated mangiferin)標準品,用50%乙醇溶解,製成1mL中含0.01~1mg的對照品溶液。測試樣品為轉化反應完成後的液體,以8000rpm離心5分鐘,取上清液,將1mL的樣品溶液,利用HPLC Atlantis T3管柱(C18,4.6mm內徑×250mm,5μm粒徑),移動相溶液為乙腈:1%冰醋酸溶液(15:85),反應溫度25℃,流速設定為1.0mL/min,偵測器波長設定為254nm,注射樣品體積為20μl。用針筒吸取出樣品,再以0.22um PVDF過濾後,做HPLC定量分析(郭伶伶、張諱、劉二偉、韓立峰、王濤。2013。芒果葉中芒果苷含量的測定。天津中醫藥大學學報,32(1):43-45)。
5.果糖基化芒果苷之液相層析質譜(LC-MS)鑑定
使用ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow Bore RR管柱(2.1 x150mm,3.5μm)。流動相分別為0.02%甲酸水溶液及0.02%甲酸甲醇溶液,流速設定為0.2ml/min。溶離過程如下:
使用Micromass ZQ質譜儀以電灑游離質譜儀 (eletrospray Ionozation,ESI-MS)得到圖譜,其中Cone電壓為10V,15V,20V,35V,50V。
結果與討論
1.具將芒果苷轉化為果糖基化芒果苷的潛力菌株之篩選
從財團法人食品工業發展研究所(台灣,新竹市)的生物資源保存及研究中心(BCRC)生物資源線上目錄中的乳酸菌、細菌、酵母菌與絲狀真菌中初步篩選出具有果糖基化酵素活性(β-fructofuranosidase、fructosyl transferase)或是具有酪氨酸酶(Tyrosinase)抑制活性之潛力菌株,分別有2株細菌、1株酵母菌、10株乳酸菌以及6株絲狀真菌共19株潛力菌。依前述方法將各菌株活化,進行生物轉化反應,及以高效液相層析法來分析果糖基化芒果苷含量,列果被列於表一。由表一結果可看出其中四株具有潛力,分別是2株細菌Arthrobacter nicotiande BCRC 11219、Arthrobacter globiforms BCRC 10598、1株酵母菌Saccharomyces cerevisiae BCRC 20855、以及1株乳酸菌Lactobacillus plantarum BCRC 11697。基於產業之應用性,以GRAS菌株以及果糖基化芒果苷含量高者作為標的,因此篩選乳酸菌Lactobacillus plantarum作為用於本發明的潛力菌株。
2. 不同之Lactobacillus plantarum菌株轉化生成果糖基化芒果苷之能力分析
收集不同之L.plantarum菌株,分別是L.plantarum BCRC 11697、BCRC 12327、BCRC 14059、BCRC 15478、BCRC 17178、BCRC 17638,依前述方法將各菌株活化,進行生物轉化反應,及以高效液相層析法來分析果糖基 化芒果苷含量,列果被列於表二。如表二所示,Lactobacillus plantarum BCRC 11697轉化生成果糖基化芒果苷之能力最好。
3. 紫外光吸收光譜分析結果
圖1及圖2分別是50μg/mL果糖基化芒果苷標準品溶液以及以Lactobacillus plantarum BCRC 11697進行生物轉化反應後得到的液體產品在200.0~400.0nm的紫外光吸收光譜圖。由圖1及圖2可知,果糖基化芒果苷標準品與以Lactobacillus plantarum BCRC 11697進行生物轉化反應後得到的液體產品的吸收曲線峰形一致,且分別在238、254、317和367nm波長處均有吸收峰,其中以254nm處的吸收峰最強。因此,在本發明中以254nm為果糖基化芒果苷標準品和進行生物轉化反應後得到的液體產品的果糖基化芒果苷含量 的測定波長。
4. LC-MS分析結果
圖3及圖4分別是果糖基化芒果苷標準品及以Lactobacillus plantarum BCRC 11697進行生物轉化反應後離心菌體得到的上清液的LC-MS圖譜。比較圖3及圖4的LC-MS圖譜,可以看出以本發明方法進行生物轉化反應後得到的轉化物中確實含有果糖基化芒果苷。
5. 比較不同糖基供體對菌株轉化生成果糖基化芒果苷之影響
於前述方法中使用Lactobacillus plantarum BCRC 11697及不同糖基供體(蔗糖、葡萄糖、果糖)進行生物轉化反應的結果被示於圖5,從其中可以看出蔗糖具有最高的果糖基化芒果苷轉化效率,當轉化時間在24小時內,果糖基化芒果苷含量可達相對高點35μg/mL。
6. 探討不同比例蔗糖糖基對果糖基化芒果苷轉化效率之比較
圖6是比較在添加0.5%~20%(w/v)的蔗糖糖基下,對果糖基化芒果苷轉化效率之影響。控制組是不加Lactobacillus plantarum BCRC 11697菌液,只添加0.5%糖基進行轉化之結果。果糖基化芒果苷含量在0小時為25μg/mL。由圖6結果可得知,在蔗糖糖基高濃度(20%)與低濃度(0.5%)之間,進行生物轉化反應的時間在6小時時,果糖基化芒果苷的含量可以達到相對高值。另外在0.5%蔗糖糖基這組其平均轉化效率優於其他高濃度組。圖6中0.5%糖基及6小時轉化的條件具有最高的果糖基化芒果苷含量,可達57μg/mL比控制組25μg/mL提升1倍以上。

Claims (15)

  1. 一種增加植物萃取液中的果糖基化芒果苷含量的方法,包含下列步驟:提供一含有芒果苷的植物萃取液;及將一糖基供體加入該植物萃取液中,於一具有果糖基化酶活性的物質的存在下進行生物轉化反應,使該芒果苷轉化為果糖基化芒果苷,其中該具有果糖基化酶活性的物質係通過保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的發酵而產生。
  2. 如請求項1的方法,其中該植物萃取液為芒果皮萃取液。
  3. 如請求項1的方法,其中該糖基供體為蔗糖或葡萄糖。
  4. 如請求項1的方法,其中該糖基供體為蔗糖。
  5. 如請求項1至4項中任一項所述的方法,其中該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)被加入於該植物萃取液中。
  6. 如請求項1至4項中任一項所述的方法,其中該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵液被加入於該植物萃取液中。
  7. 如請求項1至4項中任一項所述的方法,其中該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液被加入於該植物萃取液中。
  8. 如請求項1至4項中任一項所述的方法,其中純化自該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液的果糖基化酶被加入於該植物萃取液中。
  9. 如請求項5的方法,其中該生物轉化反應係於一乳酸菌培養基中、20-40℃及不攪拌或攪拌速度不大於400rpm下進行0.5至96小時,且以100mL的該培養基為基準,該糖基供體的用量為1-20克,該植物萃取液的用量為1-60mL,及該乳酸菌的用量為105~107CFU/mL。
  10. 如請求項6的方法,其中該生物轉化反應係於一乳酸菌培養基中、20-40℃及不攪拌或攪拌速度不大於400rpm下進行0.5至96小時,且以100mL的該培養基為基準,該糖基供體的用量為1-20克,該植物萃取液的用量為1-60mL,及該發酵液的用量為1-60mL。
  11. 如請求項7的方法,其中該生物轉化反應係於一乳酸菌培養基中、20-40℃及不攪拌或攪拌速度不大於400rpm下進行0.5至96小時,且以100mL的該培養基為基準,該糖基供體的用量為1-20克,該植物萃取液的用量為1-60mL,及該發酵上清液的用量為1-60mL。
  12. 一種使用保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
  13. 一種使用保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵液進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
  14. 一種使用保藏號為BCRC 11697乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
  15. 一種使用純化自該保藏號為BCRC 11697的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的一發酵上清液的果糖基化酶進行芒果苷和糖基供體的生物轉化反應生成果糖基化芒果苷的用途。
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