CN109234347B - 一种转化原人参三醇型皂苷生成c25-oh衍生物的方法 - Google Patents

一种转化原人参三醇型皂苷生成c25-oh衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种转化原人参三醇型皂苷生成C25‑OH衍生物的方法，属于天然产物结构修饰方法。选取生物转化菌种：冬虫夏草菌，配置种子液、转化培养基，将种子液加入已灭菌的转化培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，恒温培养，向转化培养基加入皂苷底物，转化6～8天后，向反应体系中加入等体积的正丁醇试剂，搅匀，将目标产物与其他副产物分离，最终得到PPT型人参皂苷的C25‑OH衍生物纯品。本发明采用的技术为生物转化法，催化体系为生物安全性和遗传稳定性较高的食用真菌，催化底物专属性强，结构的变化属于定向转化，副产物少，化学背景简明清晰，利于该类成分的大规模制备和开发应用。

Description

一种转化原人参三醇型皂苷生成C25-OH衍生物的方法
技术领域
本发明属于天然产物结构修饰方法，尤其是指一种原人参三醇型皂苷生成C25-OH衍生物的方法。
背景技术
人参皂苷是五加科人参属植物的主要活性成分，对人体心脑血管***、神经***、免疫***以及内分泌***等有广泛的生物活性，具有极大的应用和开发价值。
原人参三醇(PPT)型皂苷：是以20(R/S)-达玛烷-3β,6β,12β,20-四醇为结构母核，通过6位和20位糖苷键与糖基结合形成的皂苷，是人参属植物中的主要活性成分之一，化学结构如下：
Figure BDA0001818711760000011
C25-OH衍生物，系指具有如下结构特点的PPT型人参皂苷衍生物：
Figure BDA0001818711760000012
药物代谢实验表明，人参皂苷经口服进入体内之后主要受到胃酸、肠道微生物及肝脏代谢酶的影响，导致化学结构发生一定程度的变化，而这些经过代谢后的衍生物才是人参皂苷发挥药理作用的主要物质基础；C25位羟基化是达玛烷型人参皂苷体内代谢的一种常见反应，研究者们通过构效关系分析发现，C25-OH显著影响着达玛烷型人参皂苷的药理活性与生物利用度，尤其在抗肿瘤方面，一些C25-OH衍生物甚至比其原型化合物活性强几十倍，可以作为非常有发展前景的抗肿瘤候选药物。然而，这些C25-OH达玛烷型人参皂苷在自然界中含量极少，目前已报道的多数是从人参属植物的体内代谢产物和加工产品中发现的，难以满足科研和医药市场的需求；虽然可以通过化学方法修饰特定底物来得到这些衍生物，但是这些方法普遍存在反应专属性差、副产物多、转化效率低、环境污染严重等问题，限制了该研究领域的可持续发展。相对而言，生物催化法条件较为温和，结构、立体选择性好，产物纯度高，在合适的条件下可以达到极高的转化效率，是天然产物结构修饰的一项重要手段。
目前尚未有通过生物转化手段定向催化PPT型皂苷C24-C25位双键生成C25-OH衍生物的报道，与本发明最相近的实验方案为：赵余庆等，通过酸水解的方法对人参茎叶总皂苷、或人参根总皂苷、或人参果总皂苷、或人参花总皂苷等人参皂苷的粗体物进行混合反应，从复杂的反应产物中分离得到了这类C25-OH衍生物；其反应过程涉及大量的有机试剂，不利于放大生产，且反应体系为复杂的混合体系，反应结果具有一定的随机性，专属性差、副产物多、反应产物成分复杂、分离过程比较繁琐、不属于高效、定向的结构修饰过程。
发明内容
本发明提供一种转化原人参三醇型皂苷生成C25-OH衍生物的方法，以解决采用化学方法制备时存在的反应过程涉及强酸和大量的有机试剂，不利于放大生产，且反应体系为复杂的混合体系，反应结果具有一定的随机性，专属性差、副产物多、反应产物成分复杂、分离过程比较繁琐的问题。
本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：
(1)选取生物转化菌种：冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis/OphiocordycepsSinensis)
(2)生物转化菌种的种子液配置
1)生物转化菌种的斜面培养
制备PDA斜面培养基，将复苏或活化的冬虫夏草菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，25～30℃培养3～4天，即可取出使用；
2)种子液的培养
制备种子液培养基，用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗3～4天菌龄的冬虫夏草菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至107孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比2.5％～7.5％接入到制备好的种子液培养基中，在150～180转/分钟、25～30℃的恒温摇床中进行培养2～3天后停止发酵，可直接使用，或在4℃下保存，备用；
(3)生物转化过程
1)转化培养基的配制
碳源：15～25g/L；
氮源：2.5～7.5g/L；
在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，121℃灭菌15～25分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
.2)生物转化参数及产物处理
生物转化参数：将种子液按照5％～7.5％(V/V)的接菌量加入已灭菌的转化培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，在25℃～30℃的温度下恒温培养2～3天，向转化培养基加入0.5g/L～1g/L的皂苷底物，转化6～8天后，向反应体系中加入等体积的正丁醇试剂，超声、振荡或搅匀、终止反应；
产物处理方法：用等体积的正丁醇萃取3次、合并正丁醇溶液，回收溶剂，溶质称重，用40～60倍体积(ml/g)的20％～25％色谱乙腈溶液溶解样品，在反相C18制备色谱柱上进行分离，色谱条件为20％～25％的色谱乙腈溶液等度洗脱，即可将目标产物与其他副产物分离，最终得到PPT型人参皂苷的C25-OH衍生物纯品。
本发明所述步骤(2)中PDA斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂24g/L，pH自然，将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂(用玻璃棒能戳破即可)，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌15～25分钟，待灭菌器内温度降到50℃左右时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面。
本发明所述步骤(2)中种子液培养基的组成和配制方法如下：蛋白胨10g/L，酵母浸粉2g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然；在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，按适当量分装于干净的锥形瓶中，用无菌滤膜封好锥形瓶，放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌15～25分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用。
本发明所述步骤(3)中碳源是麦芽糖、葡萄糖、聚木糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖或蔗糖中的一种。
本发明所述步骤(3)中氮源是硫酸铵。
本发明所述步骤(3)中还可加入催化因子0.05～0.15g/L。
本发明所述步骤(3)催化因子是MgSO4、KH2PO4或NaH2PO4中的一种。
本发明所述步骤(3)中所述皂苷底物是人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rh1、Rg2、F1、Notoginsenoside R1中的一种或一种以上的混合物。
转化结果：经过以上步骤，原型PPT皂苷几乎全部转化，产物中C25-OH衍生物所占比例极高，根据原型PPT皂苷的结构不同，以上结果会在一定区间内浮动，普遍而言，原型PPT皂苷转化率在90％以上，C25-OH衍生物在转化产物中所占摩尔比均高于60％。
本发明的优点是：本发明提出的是一种高效、绿色、定向的结构修饰方法，采用的技术为生物转化法，催化体系为生物安全性和遗传稳定性较高的食用真菌，催化底物专属性强，结构的变化属于定向转化，副产物少，化学背景简明清晰，利于该类成分的大规模制备和开发应用。
附图说明
图1是人参皂苷Re转化过程分析图；
图2是人参皂苷Re的生物转化途径图；
图3是人参皂苷Re转化变化曲线图；
图4是人参皂苷Rg1转化过程分析图；
图5是人参皂苷Rg1的生物转化途径图；
图6是人参皂苷Rg1转化变化曲线图。
具体实施方式
实施例1
包括下列步骤：
(1)选取生物转化菌种：冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis/OphiocordycepsSinensis)
(2)生物转化菌种的种子液配置
1)生物转化菌种的斜面培养
PDA斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂24g/L，pH自然，将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂(用玻璃棒能戳破即可)，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌15分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面；
将复苏或活化的冬虫夏草菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，25℃培养4天，观察到白色菌丝布满整个斜面，即可取出使用；
2)种子液的培养
种子液培养基的组成和配制方法如下：蛋白胨10g/L，酵母浸粉2g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然；在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，按适当量分装于干净的锥形瓶中，用无菌滤膜封好锥形瓶，放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌15分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗4天菌龄的冬虫夏草菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至107孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比2.5％接入到制备好的种子液培养基中，在150转/分钟、25℃的恒温摇床中进行培养3天后停止发酵，可直接使用，或在4℃下保存，备用；
(3)生物转化过程
1)转化培养基的配制
碳源：麦芽糖15g/L，
氮源：硫酸铵2.5g/L；
在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，121℃灭菌15分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
.2)生物转化参数及产物处理
生物转化参数：将种子液按照5％(V/V)的接菌量加入已灭菌的转化培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，在25℃的温度下恒温培养3天，向转化培养基加入0.5g/L的皂苷底物，该皂苷底物是人参皂苷Re，转化6天后，向反应体系中加入等体积的正丁醇试剂，超声、振荡或搅匀、终止反应；
产物处理方法：用等体积的正丁醇萃取3次、合并正丁醇溶液，回收溶剂，溶质称重，用40倍体积(ml/g)的20％色谱乙腈溶液溶解样品，在反相C18制备色谱柱上进行分离，色谱条件为20％色谱乙腈溶液等度洗脱，即可将目标产物与其他副产物分离，最终得到PPT型人参皂苷的C25-OH衍生物纯品。
实施例2
包括下列步骤：
(1)选取生物转化菌种：冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis/OphiocordycepsSinensis)
(2)生物转化菌种的种子液配置
1)生物转化菌种的斜面培养
PDA斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂24g/L，pH自然，将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂(用玻璃棒能戳破即可)，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面；
将复苏或活化的冬虫夏草菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，30℃培养3天，观察到白色菌丝布满整个斜面，即可取出使用；
2)种子液的培养
种子液培养基的组成和配制方法如下：蛋白胨10g/L，酵母浸粉2g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然；在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，按适当量分装于干净的锥形瓶中，用无菌滤膜封好锥形瓶，放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌25分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗3天菌龄的冬虫夏草菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至107孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比7.5％接入到制备好的种子液培养基中，在180转/分钟、30℃的恒温摇床中进行培养2天后停止发酵，可直接使用，或在4℃下保存，备用；
(3)生物转化过程
1)转化培养基的配制
碳源：葡萄糖25g/L，
氮源：硫酸铵7.5g/L；
催化因子：MgSO40.15g/L；
在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，121℃灭菌25分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
.2)生物转化参数及产物处理
生物转化参数：将种子液按照7.5％(V/V)的接菌量加入已灭菌的转化培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，在30℃的温度下恒温培养2天，向转化培养基加入1g/L的皂苷底物，该皂苷底物是人参皂苷Rg1、Rf的混合物，转化8天后，向反应体系中加入等体积的正丁醇试剂，超声、振荡或搅匀、终止反应；
产物处理方法：用等体积的正丁醇萃取3次、合并正丁醇溶液，回收溶剂，溶质称重，用60倍体积(ml/g)的25％色谱乙腈溶液溶解样品，在反相C18制备色谱柱上进行分离，色谱条件为25％的色谱乙腈溶液等度洗脱，即可将目标产物与其他副产物分离，最终得到PPT型人参皂苷的C25-OH衍生物纯品。
实施例3
包括下列步骤：
(1)选取生物转化菌种：冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis/OphiocordycepsSinensis)
(2)生物转化菌种的种子液配置
1)生物转化菌种的斜面培养
PDA斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂24g/L，pH自然，将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂(用玻璃棒能戳破即可)，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面；
将复苏或活化的冬虫夏草菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，27.5℃培养3.5天，观察到白色菌丝布满整个斜面，即可取出使用；
2)种子液的培养
种子液培养基的组成和配制方法如下：蛋白胨10g/L，酵母浸粉2g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然；在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，按适当量分装于干净的锥形瓶中，用无菌滤膜封好锥形瓶，放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗3.5天菌龄的冬虫夏草菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至107孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比5.0％接入到制备好的种子液培养基中，在165转/分钟、27.5℃的恒温摇床中进行培养2.5天后停止发酵，可直接使用，或在4℃下保存，备用；
(3)生物转化过程
1)转化培养基的配制
碳源：可溶性淀粉20g/L；
氮源：硫酸铵5.0g/L；
催化因子：KH2PO40.05g/L；
在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，121℃灭菌20分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
.2)生物转化参数及产物处理
生物转化参数：将种子液按照6.5％(V/V)的接菌量加入已灭菌的转化培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，在27.5℃的温度下恒温培养2.5天，向转化培养基加入0.75g/L的皂苷底物，该皂苷底物是人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rh1、Rg2、F1的混合物，转化7天后，向反应体系中加入等体积的正丁醇试剂，超声、振荡或搅匀、终止反应；
产物处理方法：用等体积的正丁醇萃取3次、合并正丁醇溶液，回收溶剂，溶质称重，用50倍体积(ml/g)的22.5％色谱乙腈溶液溶解样品，在反相C18制备色谱柱上进行分离，色谱条件为22.5％的色谱乙腈溶液等度洗脱，即可将目标产物与其他副产物分离，最终得到PPT型人参皂苷的C25-OH衍生物纯品。
实施例4
包括下列步骤：
(1)选取生物转化菌种：冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis/OphiocordycepsSinensis)
(2)生物转化菌种的种子液配置
1)生物转化菌种的斜面培养
PDA斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂24g/L，pH自然，将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂(用玻璃棒能戳破即可)，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面；
将复苏或活化的冬虫夏草菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，27℃培养4天，观察到白色菌丝布满整个斜面，即可取出使用；
2)种子液的培养
种子液培养基的组成和配制方法如下：蛋白胨10g/L，酵母浸粉2g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然；在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，按适当量分装于干净的锥形瓶中，用无菌滤膜封好锥形瓶，放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗4天菌龄的冬虫夏草菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至107孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比5.0％接入到制备好的种子液培养基中，在165转/分钟、27℃的恒温摇床中进行培养3天后停止发酵，可直接使用，或在4℃下保存，备用；
(3)生物转化过程
1)转化培养基的配制
碳源：蔗糖20g/L；
氮源：硫酸铵5.0g/L；
催化因子：NaH2PO40.10g/L；
在适当容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，121℃灭菌20分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
.2)生物转化参数及产物处理
生物转化参数：将种子液按照6％(V/V)的接菌量加入已灭菌的转化培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，在27℃的温度下恒温培养3天，向转化培养基加入0.8g/L的皂苷底物，该皂苷底物是人参皂苷Re、Rg1、Notoginsenoside R1的混合物，转化7天后，向反应体系中加入等体积的正丁醇试剂，超声、振荡或搅匀、终止反应；
产物处理方法：用等体积的正丁醇萃取3次、合并正丁醇溶液，回收溶剂，溶质称重，用50倍体积(ml/g)的23％色谱乙腈溶液溶解样品，在反相C18制备色谱柱上进行分离，色谱条件为23％的色谱乙腈溶液等度洗脱，即可将目标产物与其他副产物分离，最终得到PPT型人参皂苷的C25-OH衍生物纯品。
转化结果：经过以上步骤，原型PPT皂苷几乎全部转化，产物中C25-OH衍生物所占比例极高，根据原型PPT皂苷的结构不同，以上结果会在一定区间内浮动，普遍而言，原型PPT皂苷转化率在90％以上，C25-OH衍生物在转化产物中所占摩尔比均高于60％。
下边通过实验例来进一步说明本发明。
实验例人参皂苷Re和Rg1的结构修饰
1、转化过程及供试品溶液制备方法
在超净工作台上进行操作，从冬虫夏草菌的斜面上刮取孢子接入到已经灭菌过的种子培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，28℃培养72小时，作为转化原人参三醇型皂苷的种子液。
配制两瓶转化培养基，组成均为20g/L葡萄糖，5g/L硫酸铵。在121℃下，高压蒸汽灭菌20分钟，取出放凉，备用。将种子液按照体积比5％分别接种于已灭菌的2瓶转化培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，在28℃的温度下恒温培养扩充生物量。培养2天后，分别向两瓶转化培养基中加入0.5g/L的人参皂苷Re和Rg1。自加入皂苷底物起，每隔24小时，吸取一定体积的转化样品溶液，作好标记，备用。
配制内标溶液：以原人参二醇型皂苷Rb1为内标物，称取人参皂苷Rb1标准品用水溶解，配制成一定浓度的内标溶液。向待测的转化样品中加入一定体积的Rb1的内标溶液，充分混匀后，用等体积的水饱和正丁醇萃取样品溶液3次，合并萃取液，回收溶剂，用一定体积的色谱甲醇溶解，过0.22微米滤膜，转移到液相小瓶中，作为供试品，备用。
2、人参皂苷Re和Rg1转化过程分析
2.1高效液相-三重四级杆-质谱(HPLC-TQ-MS)参数设定
液相色谱的检测是在Shim-pack XR-ODSⅡHPLC PACKED COLUMN(3.0mm×75mm,2.2μm)色谱柱上进行的，柱温设定为40℃；流动相A为1‰甲酸水，流动相B为乙腈；洗脱顺序如下表1，流速设定为0.2mL/min，样品的进样量设定为5ul。
表1色谱洗脱条件
Figure BDA0001818711760000111
质谱检测是在岛津8040TQ mass spectrometer***上进行的，离子源为双通道ESI，质量扫描范围设定为m/z 300～1300，扫描模式设定为负离子模式，优化后的质谱参数为：干燥气流速9L/min，干燥气温度350℃，喷雾气压力为30psi，毛细管电压为4500V，碎裂电压为175V，锥孔电压为65V。分子式计算参数设定为C[0-80]，H[0-150]，O[0-60]，其他元素如N，S，P和Cl并未考虑在内。
皂苷底物、转化中间产物和终产物的定量是在HPLC-MS的多反应监测(MRM)模式下进行的，参数设置如下：
Rb1:m/z 1107→945[M-H]-
Re:m/z 991→946[M-H]-
Rg2:m/z 829→783[M-H]-
Rf2:m/z 847→801[M-H]-
Rg1:m/z 845→799[M-H]-
Rh1:m/z:683→475[M-H]-
25OH-Rh1:m/z:701→493[M-H]-
2.2人参皂苷Re转化过程分析结果
将步骤1中处理过的人参皂苷Re转化后的供试品溶液通过HPLC-TQ-MS进行检测，对转化产物进行定性和相对定量分析。检测图谱见图1。
过以上的图谱我们可以发现，人参皂苷Re在转化至第7天时，已基本不可检出，说明转化比较完全，主要的转化产物有4个，分别为20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rf2、20(R)-人参皂苷Rf2，其中20(S/R)-人参皂苷Rf2是原人参三醇型皂苷的C25-OH衍生物，其具体的转化途径见图2：
为了阐明人参皂苷Re及其转化产物在反应过程中的含量变化，利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(Multiple reaction monitor,MRM)进行了相对定量分析，结果如表2和图3所示：
表2人参皂苷Re及其转化产物的相对含量变化
Figure BDA0001818711760000121
通过上表，我们可以发现，在本反应体系中，C25-OH衍生物是人参皂苷Re的主要转化产物，其含量在所有转化产物中占比超过70％。
2.3人参皂苷Rg1转化过程分析结果
将步骤1中处理过的人参皂苷Rg1转化后的供试品溶液通过HPLC-TQ-MS进行检测，对转化产物进行定性和相对定量分析。检测图谱见图4。
通过以上的图谱我们可以发现，人参皂苷Rg1在转化终止后，已基本不可检出，说明转化比较完全，主要的转化产物有4个，分别为20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、20(S)-25-OH-人参皂苷Rh1、20(R)-25-OH-人参皂苷Rh1，其中20(S/R)-25-OH-人参皂苷Rh1是原人参三醇型皂苷的C25-OH衍生物，其具体的转化途径见图5：
为了阐明人参皂苷Rg1及其转化产物在反应过程中的含量变化，利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(Multiple reaction monitor,MRM)进行了相对定量分析，结果如表3和图6所示：
表3人参皂苷Rg1及其转化产物的相对含量变化
Figure BDA0001818711760000131
通过上表，可以发现，在本反应体系中，C25-OH衍生物是人参皂苷Rg1的主要转化产物，其含量在所有转化产物中占比超过65％。

Claims (4)

1.一种转化原人参三醇型皂苷生成C25-OH衍生物的方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）选取生物转化菌种：冬虫夏草菌（Cordyceps sinensis/Ophiocordyceps Sinensis）
（2）生物转化菌种的种子液配置
1）生物转化菌种的斜面培养
制备PDA斜面培养基，将复苏或活化的冬虫夏草菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，25～30℃培养3~4天，即可取出使用；
2）种子液的培养
制备种子液培养基，用无菌0.9%氯化钠水溶液冲洗3~4天菌龄的冬虫夏草菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读数，将洗下来的孢子液稀释至107孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比2.5%～7.5%接入到制备好的种子液培养基中，在150～180转/分钟、25～30℃的恒温摇床中进行培养2～3天后停止发酵，可直接使用，或在4℃下保存，备用；
（3）生物转化过程
1）转化培养基的配制
碳源：15～25g/L；
氮源：2.5～7.5g/L；
催化因子：0.05～0.15g/L；
其中氮源是硫酸铵，催化因子是MgSO4、KH2PO4或NaH2PO4中的一种；
在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，121℃灭菌15～25分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用；
2）生物转化参数及产物处理
生物转化参数：将种子液按照5%～7.5% V/V的接菌量加入已灭菌的转化培养基中，无菌滤膜封口，放入恒温摇床中，在25℃～30℃的温度下恒温培养2～3天，向转化培养基加入0.5g/L～1g/L的皂苷底物，该皂苷底物是人参皂苷Re和Rg1，转化6～8天后，向反应体系中加入等体积的正丁醇试剂，超声、振荡或搅匀、终止反应；
产物处理方法：用等体积的正丁醇萃取3次、合并正丁醇溶液，回收溶剂，溶质称重，用40～60倍体积ml/g的20%～25%色谱乙腈溶液溶解样品，在反相C18制备色谱柱上进行分离，色谱条件为20%～25%的色谱乙腈溶液等度洗脱，即可将目标产物与其他副产物分离，最终得到PPT型人参皂苷的C25-OH衍生物纯品。
2.根据权利要求1所述的一种转化原人参三醇型皂苷生成C25-OH衍生物的方法，其特征在于：步骤（2）中PDA斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂24g/L，pH自然，将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌15～25分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面。
3.根据权利要求1所述的一种转化原人参三醇型皂苷生成C25-OH衍生物的方法，其特征在于：步骤（2）中种子液培养基的组成和配制方法如下：蛋白胨10g/L，酵母浸粉2g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然；在容器中按比例加入各固体试剂和蒸馏水，然后搅拌至固体全部溶解，按适当量分装于干净的锥形瓶中，用无菌滤膜封好锥形瓶，放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌15～25分钟，取出摇匀，放入无菌接种室中放凉备用。
4.根据权利要求1所述的一种转化原人参三醇型皂苷生成C25-OH衍生物的方法，其特征在于：步骤（3）中碳源是麦芽糖、葡萄糖、聚木糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖或蔗糖中的一种。
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