TWI626311B - 製造２，４－二羥丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明論及一種藉由一合成途徑製造2,4-二羥基丁酸(2,4-DHB)的方法，該合成途徑包含有使用一蘋果酸激酶轉換蘋果酸成4-磷-蘋果酸，該4-磷-蘋果酸使用一蘋果酸半醛去氫酶而被轉換成蘋果酸-4-半醛以及該蘋果酸-4-半醛使用一DHB去氫酶而被轉換成2,4-DHB。

Description

製造2,4-二羥丁酸的方法
本發明是有關於一種藉由實施一包含有分別具有蘋果酸激酶(malate kinase)、蘋果酸半醛去氫酶(malate semialdehyde dehydrogenase)以及2,4-二羥基丁酸去氫酶(2,4-dihydroxybutyrate dehydrogenase)活性的酵素之合成途徑而從蘋果酸(malate)製造2,4-二羥基丁酸(2,4-dihydroxybutyric acid)的新穎方法。
在本申請案中所引用的羧酸根據它們的鹽類[例如2,4-二羥基丁酸鹽(2,4-dihydroxyburyrate)]或酸形式[例如2,4-二羥基丁酸(2,4-dihydroxybutyric acid)]而被同樣地命名。
2,4-二羥基丁酸(相同地2,4-DHB或DHB)是一種具有相當大的經濟利益的化合物。DHB可藉由調整適當的pH而容易地在水性介質中被轉化成α-羥基-γ-丁內酯(α-hydroxy-γ-butyrolactone)。α-羥基-γ-丁內酯是一種用於製造在動物營養上具有一大的市場的甲硫胺酸取代物(methionine substitute) 2-羥基-4-(甲硫基)-丁酸[2-hydroxy-4-(methylthio)-butyrate,HMTB]的重要前驅物(Deck et al.,2008)。現今，α-羥基-γ-丁內酯藉由一暗指在位置α鹵化γ-丁內酯以及隨後在鹼性介質中藉由一羥基基團取代鹵素原子的多階段方法而被衍生自γ-丁內酯(Deck et al.,2008)。
由於成長的油價，對於從可再生的資源製造DHB的需要上升。微生物能夠轉換生物質衍生的粗材料(biomass-derived raw material)(例如糖或有機酸)成為一大的多樣性的不同化學化合物(Werpy & Petersen,2004)。隨著越來越多的生物化學與基因組資訊，修飾微生物藉此它們過度製造具有高產量以及製造率的天然存在的代謝中間物是可能的(Bailey,1991)。最佳化製造微生物通常需要合理的工程化代謝網路(尤其確保生物合成感興趣的代謝物所需的酵素的過度表現以及減輕產物回饋抑制)。另一個可能性是實施催化一感興趣的代謝物的製造的新穎酵素系統。
代謝工程化方法以及酵素催化需要在生物化學上的詳細知識以及調節代謝途徑導致感興趣的代謝物。在DHB製造的例子中，這個資訊不是可獲得的。僅少數的研究報導DHB出現在具有琥珀酸半醛去氫酶缺乏(succinic semialdehyde dehydrogenase deficiency)的病患中(Shinka et al.,2002)，然而沒有鑑定在DHB製造中所牽連的酵素反應。因此，發酵性(zymotic)或酵素性製造DHB需要(i)鑑定一種轉換一可得到的前驅物成為DHB的熱力學地可能途徑，(ii)鑑定或建構能夠催化在途徑中的個別反應步驟的酵素以及(iii)途徑酵素在一適當的製造生物中的功能性表現。
本發明具有有如一標的以滿足這些需要。
因此，本發明的一標的是一種製造2,4-DHB的方法，其包含有一使用一蘋果酸激酶轉換蘋果酸成4-磷-蘋果酸(4-phospho-malate)的第一步驟、一使用一蘋果酸半醛去氫酶轉換4-磷-蘋果酸成蘋果酸-4-半醛(malate-4-semialdehyde)的第二步驟、一使用一DHB去氫酶轉換蘋果酸-4-半醛成2,4-DHB的第三步驟。
在第一反應(參見第1(i)圖)中，蘋果酸(1)藉由一擁有蘋果酸激酶活性的酵素的作用而被轉化成4-磷-蘋果酸(2)(A)。在第二反應(B)中，4-磷-蘋果酸藉由一擁有蘋果酸半醛去氫酶活性的酵素的作用而被轉化成蘋果酸-4-半醛(3)。更準確地，反應(B)在該途徑的生物合成效用中藉由一帶有去磷作用(dephosphorylating)的4-磷-蘋果酸還原酶活性(4-phospho-malate reductase activity)的酵素而被催化。在第三反應(C)中，蘋果酸-4-半醛藉由一擁有DHB去氫酶活性的酵素的作用而被轉化成DHB(4)。更準確地，反應(C)在該途徑的生物合成效用中藉由一帶有蘋果酸-4-半醛還原酶活性(malate-4-semialdehyde reductase activity)的酵素而被催化。
上面所引用的酵素以及中間產物至今沒有已被描述或在活細胞中被鑑定。蘋果酸激酶、蘋果酸半醛去氫酶、DHB去氫酶以及4-磷-蘋果酸本身進一步是本發明的標的。
在本發明的另一個方面，該製造2,4-DHB的方法的該第一步驟涉及一特徵在於它轉換蘋果酸成為4-磷-蘋果酸的蘋果酸激酶。該酵素藉由一酵素的至少一突變而可獲得的，該突變(們)改善該經突變的酵素對於蘋果酸的活性和/或基質親和力(substrate affinity)。
在本發明中，措辭“改善活性和/或基質親和力”意指該酵素在突變之前是
-　不能使用基質(蘋果酸、4-磷-蘋果酸或蘋果酸-4-半醛)，和/或
-　在一至少3倍較低的最大比速率(specific rate)下合成反應的產物(4-磷-蘋果酸或蘋果酸-4-半醛或DHB)，和/或
-　具有一至少3倍較低的對蘋果酸、4-磷-蘋果酸或蘋果酸-4-半醛的親和力，和/或
-　具有一至少3倍較高的對天然基質[天冬胺酸(aspartate)、4-磷-天冬胺酸(4-phospho-asparte)、天冬胺酸-4-半醛(aspartate-4-semialdehyde)]的親和力。
在另一個它的方面，本發明論及一蘋果酸激酶轉換蘋果酸成為4-磷-蘋果酸的用途。
該蘋果酸激酶活性可藉由在實施例1中所描述的酵素試驗(參見“酵素分析”)而被測量。
依據本發明的另一個方面，該蘋果酸激酶可藉由突變一天冬胺酸激酶而被獲得。
第2圖顯示不同生物來源的天冬胺酸激酶的胺基酸序列的比對。針對胺基酸的位置的所有參考是根據由大腸桿菌(E. coli)的LysC基因所編碼的天冬胺酸激酶的胺基酸序列(由序列辨識編號4所表示)而被做出。在來自不同生物的其它天冬胺酸激酶中的對應保守區域(conserved regions)的相對位置可容易地由熟習此技藝者藉由如在第2圖中所表示具有下列例示的酵素的簡單序列比對而被發現：
-　AKIII-大腸桿菌的天冬胺酸激酶III(序列辨識編號4)，
-　AKI(序列辨識編號87)大腸桿菌的天冬胺酸激酶I，
-　AKII(序列辨識編號88)-大腸桿菌的天冬胺酸激酶II，
-　MJ-詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(序列辨識編號89)，
-　TT-嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(序列辨識編號90)，
-　CG-麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)(序列辨識編號91)，
-　AT-***芥(Arabidopsis thaliana)(序列辨識編號92)，
-　SC-啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)(序列辨識編號93)。
該比對可以ClustalW2軟體而被做出。例如，由序列辨識編號4所表示的天冬胺酸激酶的E119殘基(residue)對應於***芥的天冬胺酸激酶的E207殘基(序列辨識編號50)或啤酒酵母菌的天冬胺酸激酶的E147殘基(序列辨識編號51)。
當相較於野生型酵素時，依據本發明的經突變的天冬胺酸激酶包含有至少一突變在下列位置的至少一者：S39、T45、V115、E119、F184和/或S201，其中在該等位置的天然發生的胺基酸藉由其他19種天然存在的蛋白胺基酸(proteinogenic amino acids)的任一者而被替換，那是藉由丙胺酸(alanine)、精胺酸(arginine)、天冬醯胺酸(asparagine)、天冬胺酸(aspartic acid)、半胱胺酸(cysteine)、麩胺酸(glutamic acid)、麩醯胺酸(glutamine)、甘胺酸(glycine)、組胺酸(histidine)、異白胺酸(isoleucine)、白胺酸(leucine)、離胺酸(lysine)、甲硫胺酸(methionine)、***酸(phenylalanine)、脯胺酸(proline)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine)或纈胺酸(valine)。
在一非除外的實例中，藉由定點突變(site directed mutagenesis)建構一蘋果酸激酶是使用大腸桿菌的天冬胺酸激酶Lys C作為模板而被證明。依據本發明的一個方面，LysC的基質專一性藉由由天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或甘胺酸替換在位置119的麩胺酸而被改變針對蘋果酸。
在本發明的一進一步方面，該蘋果酸激酶由序列辨識編號9以及更特別地由序列辨識編號12、序列辨識編號14、序列辨識編號16、序列辨識編號18、序列辨識編號20、序列辨識編號22、序列辨識編號24或序列辨識編號26所表示。
天冬胺酸激酶典型地藉由甲硫胺酸、蘇胺酸或離胺酸而被抑制。因此，藉由隨機或定點突變天冬胺酸激酶所建構的蘋果酸激酶亦可藉由該等胺基酸而被抑制。在本發明的一進一步方面，藉由甲硫胺酸、離胺酸或蘇胺酸抑制蘋果酸激酶是藉由突變該蘋果酸激酶而被減輕。
在本發明的一特別方面，上面所描述的經突變的LysC(蘋果酸激酶)藉由突變下列胺基酸E250、M318、S321、V339、S338、F324、L325、V339、S345、E346、D340、T344和/或T352的至少一者而成為對離胺酸抑制不敏感的(參見實施例3)。
本發明亦包含有此等經修飾的酵素以及更特別地由序列辨識編號39、序列辨識編號41、序列辨識編號43或序列辨識編號45所表示的那些。
在一又進一步的方面，依據本發明的製造2,4-DHB的方法的該第二步驟涉及一特徵在於它轉換4-磷-蘋果酸成蘋果酸-4-半醛的蘋果酸半醛去氫酶，該酵素在該途徑的生物合成效用中帶有一去磷化的4-磷-蘋果酸還原酶活性。
該蘋果酸半醛去氫酶活性可藉由在實施例4所描述的酵素試驗(參見“酵素分析”)而被測量。
這個酵素藉由一酵素的至少一突變而可獲得的，該突變(們)改善該經突變的酵素對於4-磷-蘋果酸的活性和/或基質親和力。
依據另一個方面，本發明的蘋果酸半醛去氫酶可藉由突變一具有被報導的半醛去氫酶活性(更特別地在反應的還原效用中具有去磷化的活性，更特別地在由3、4或5個碳分子所構成的有機分子上作用)的酵素而被獲得。在本發明的一特別方面，該蘋果酸半醛去氫酶藉由突變一天冬胺酸半醛去氫酶而被獲得。
天冬胺酸半醛去氫酶大腸桿菌的Asd以及啤酒酵母菌的Hom2天然地展現出在4-磷-蘋果酸2上的去氫酶活性。
依據本發明的另一個方面，該蘋果酸半醛去氫酶可藉由突變天冬胺酸半醛去氫酶而被改善。
第3圖顯示不同生物來源的天冬胺酸半醛去氫酶的胺基酸序列的比對。針對胺基酸的所有參考可根據由大腸桿菌的Asd基因所編碼的天冬胺酸半醛去氫酶(如由序列辨識編號20所表示)而被做出。在來自不同生物的其他天冬胺酸半醛去氫酶中的對應保守區域的相對位置可容易地由熟習此技藝者藉由如在第3圖所表示具有下列例示的酵素的簡單序列比對而被發現：-EC-大腸桿菌(序列辨識編號49)，-MJ-詹氏甲烷球菌(序列辨識編號94)，-TT-嗜熱棲熱菌(序列辨識編號95)，-BS-枯草桿菌(Bacillus subtilis)(序列辨識編號96)，-CG-麩胺酸棒狀桿菌(序列辨識編號97)，-AT-***芥(序列辨識編號98)，-SC-啤酒酵母菌(序列辨識編號99)
該比對可容易地使用ClustalW2軟體而被做出。
具有經改善的蘋果酸半醛去氫酶活性的酵素的建構可如下而被做出：依據本發明的蘋果酸半醛去氫酶在一特別方面對應於當相較於野生型酵素時一包含有至少一突變在位置T136、Q162、I230、E241和/或H274的至少一者的天冬胺酸半醛去氫酶，其中在該等位置的天然發生的胺基酸藉由其他19種天然存在的蛋白胺基酸的任一者而被替換，那是藉由丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、***酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸。
如在實施例5所證明的，來自大腸桿菌的asd的定點突變可改善該經突變的酵素對於4-磷-蘋果酸的活性以及基質親和力，在相同的時間下減少該酵素對於它的天然基質4-磷-天冬胺酸的偏好。
為了改善Asd在4-磷-蘋果酸上的活性以及根據本發明的一方面，E241藉由定點突變由一麩醯胺酸、丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸或甲硫胺酸殘基所替換。
在本發明的一進一步方面，該蘋果酸半醛去氫酶是由序列辨識編號68以及更特別地由序列辨識編號54、序列辨識編號56、序列辨識編號58、序列辨識編號60、序列辨識編號62、序列辨識編號64或序列辨識編號66所表示。
在另一個它的方面，本發明論及一蘋果酸半醛去氫酶轉換4-磷-蘋果酸成蘋果酸-4-半醛的用途。
在另一個方面，依據本發明製造2,4-DHB的方法的該第三步驟涉及一特徵在於它轉換蘋果酸-4-半醛成為2,4-DHB的DHB去氫酶，該酵素在該途徑的生物合成效用中帶有蘋果酸-4-半醛還原酶活性。
已潛在地擁有DHB去氫酶活性的候選物DHB去氫酶酵素可選自於在C3、C4或C5化合物上作用的β-羥基酸去氫酶(beta hydroxyacid dehydrogenases)的種類。
依據本發明的一又進一步方面，該DHB去氫酶酵素可結構上以及機制上與β-羥基酸去氫酶有關，諸如羥丙二酸半醛還原酶(tartronate semialdehyde reductases)、琥珀酸半醛還原酶(succinate semialdehyde reductases)、丙二酸半醛還原酶(malonate semialdehyde reductases)、甲基丁醛還原酶(methylbutyraldehyde reductases)、鋅類型醇去氫酶(zinc-type alcohol dehydrogenases)、L-蘇胺酸-3-去氫酶(L-threonine-3-dehydrogenases)或高絲胺酸還原酶(homoserine reductases)。
本發明亦論及一甲基丁醛還原酶或一琥珀酸半醛還原酶轉換蘋果酸-4-半醛成2,4-DHB的用途。在特別的具體例中，該甲基丁醛還原酶是由序列辨識編號74所表示以及該琥珀酸半醛還原酶是由序列辨識編號76所表示。該DHB去氫酶活性可藉由在實施例6所描述的酵素試驗(參見“酵素分析”)而被測量。
DHB去氫酶對於蘋果酸-4-半醛的親和力可藉由一酵素的至少一突變而被增加，該突變(們)增加該經突變的酵素對於蘋果酸-4-半醛的活性和/或基質親和力，和/或降低對於它的天然基質的活性或親和力達至少係數2。
依據本發明的DHB去氫酶在一特別方面對應於當相較於野生型酵素時包含有至少一突變在位置S40、N43、H39 T49、F85、Q108、L281以及N305的至少一者的勤奮金屬球菌(M. sedula)琥珀酸半醛還原酶(序列辨識編號76)，其中在該等位置的天然發生的胺基酸藉由其他19種天然存在的蛋白胺基酸的任一者而被替換，那是丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、***酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸。
如在一非除外的實施例中所證明的，非勤奮金屬球菌琥珀酸半醛還原酶對於(L)-蘋果酸-4-半醛的親和力藉由定點突變導入雙突變(double mutation)H39R N43H(如由序列辨識編號81所表示)而被增加。簡單突變體H39R(序列辨識編號225)以及N43H(序列辨識編號227)亦由本發明所包含(實施例7)。
DHB去氫酶可被使用以轉換蘋果酸-4-半醛成為2,4-DHB，這構成本發明的一進一步方面。
基因的核酸序列可適用於該宿主生物的密碼子使用(codon usage)，藉此增加被異質地表現的蛋白質的製造。這個構成本發明的一進一步方面。
一編碼勤奮金屬球菌琥珀酸半醛還原酶H39R N43H的合成基因(它的核苷酸序列被最佳化用於該酵素在大腸桿菌中的表現，如由序列辨識編號228所表示)的合成是本發明的一進一步方面。
在一又進一步方面，本發明亦論及核酸，以及更特別地編碼一如上所描述的蘋果酸激酶的經分離的核酸序列。
在另一個方面，該等核酸是由序列辨識編號13、序列辨識編號15、序列辨識編號17、序列辨識編號19、序列辨識編號21、序列辨識編號23、序列辨識編號25、序列辨識編號27、序列辨識編號38、序列辨識編號40、序列辨識編號42或序列辨識編號44所表示。
在一又進一步方面，本發明亦論及編碼一如上所描述的蘋果酸半醛去氫酶的經分離的核酸序列。
更特別地，該等核酸優先地由序列辨識編號55、序列辨識編號57、序列辨識編號59、序列辨識編號61、序列辨識編號63、序列辨識編號65或序列辨識編號67所表示。
在一又進一步方面，本發明亦論及編碼一如上所描述的DHB去氫酶的核酸序列。
在另一個方面，該核酸是由序列辨識編號73或序列辨識編號75、序列辨識編號224、序列辨識編號226或序列辨識編號82所表示。
依據這個發明，一“核酸序列”意指一呈單或雙股形式的DNA或RNA分子，較佳地一DNA分子。如此處所用的，一“經分離的DNA”意指一非天然發生或不再在它最初存在的天然環境中的DNA，例如，一在一嵌合基因(chimeric gene)中與其他調節要素(regulatory element)組合的DNA編碼序列、一被轉移至另一個宿主細胞的DNA或者一相較於任何天然發生的DNA序列具有一不同的核苷酸序列的人工合成地製造的DNA序列。
本發明亦有關於一嵌合基因，其包含有互相功能性地連接的至少一在一宿主生物中有功能的啟動子、一編碼依據本發明的蘋果酸激酶、蘋果酸半醛去氫酶或DHB去氫酶的任一者的聚核苷酸以及一在相同宿主生物中有功能的終止子要素(terminator element)。一嵌合基因可含有的各種不同的要素首先是調節蛋白質的轉錄(transcription)、轉譯(translation)以及成熟的要素(諸如一啟動子、一編碼一單一胜肽或一運輸胜肽(transit peptide)的序列或者一構成一聚腺苷酸化信號(polyadenylation signal)的終止子要素，以及其次一編碼一蛋白質的聚核苷酸。措辭“互相功能性地連接”意指該嵌合基因的該等要素以這些要素的一者的功能由另一者所具者所影響的此一方式而被互相連接。經由實例，一啟動子被功能性地連接至一編碼序列，當它能夠影響該編碼序列的表現。依據本發明的嵌合基因的建構以及它的各種不同的要素的組合可使用那些熟習此技藝者所熟知的技術而被進行。建構該嵌合基因的調節要素的選擇實質上視它們必須作用的宿主生物而定，並且那些熟習此技藝者能夠選擇在一特定宿主生物中有功能的調節要素。術語“有功能的(functional)”被意欲意指能夠在一特定宿主生物中起作用。
依據本發明的嵌合基因可含有的啟動子是固有的(constitutive)或可誘導的(inducible)。經由實例，該等被使用於在細菌中表現的啟動子可被選自於下面所提及的啟動子。關於在大腸桿菌中表現，lac、trp、lpp、phoA、recA、afaBAD、prou、cst-1,tetA,cadA、nar,tac,trc,lpp-lac,Psyn,cspA,PL,PL-9G-50,PR-PL,T7,[λ]PL-PT7([lambda]PL-PT7)、T3-lac、T5-lac、T4基因32、nprM-lac、VHb以及蛋白質A啟動子或其他Ptrp啟動子(WO 99/64607)可被提到。關於在革蘭氏陽性菌(Gram-positive bacteria)[諸如棒狀桿菌數(Corynebacteria)或鏈絲菌屬(Streptomyces)]中表現，PtipA或PS1以及PS2(FR91/09870)啟動子或者在申請案EP0629699A2中所描述的那些可被提到。關於在酵母菌(yeasts)以及真菌(fungus)中表現，乳酸克魯維酵母菌(K. lactis)PLAC4啟動子或乳酸克魯維酵母菌Ppgk啟動子(專利申請案FR 91/05294)、木黴屬(Trichoderma) tef1或cbh1啟動子(WO 94/04673)、青黴菌屬(Penicillium) his、csl或apf啟動子(WO 00/68401)以及麴菌屬(Aspergillus) gla啟動子可被提到。
依據本發明，該嵌合基因亦可包含有位在啟動子與編碼序列之間的其它調節序列{諸如轉錄活化子(transcription activators)[增強子(enhancers)]}。
就其本身而論，本發明的嵌合基因在一特別具體例中包含有至少在轉錄的方向功能性地連接一在一宿主生物中有功能的啟動子調節序列、一編碼本發明的蘋果酸激酶、蘋果酸半醛去氫酶的核酸序列以及一在該宿主生物中有功能的終止子調節序列。
本發明亦有關於一包含有一依據本發明的嵌合基因或一本發明的核酸序列的選殖(cloning)和/或表現載體(expression vector)。依據本發明的載體對於轉形一宿主生物以及在這個生物體中表現蘋果酸激酶、蘋果酸半醛去氫酶和/或DHB去氫酶的任一者是有用的。這個載體可以是一質體(plasmid)、一黏質體(cosmid)、一噬菌體(bacteriophage)或一病毒。優先地，依據本發明的轉形載體是一質體。一般而言，這個載體的主要性質應該是一在該宿主生物的細胞中維持它自己和自我複製(self-replicate)[特別地藉由一複製原點(origin of replication)的存在]以及表現裡面的蘋果酸激酶、蘋果酸半醛去氫酶和/或DHB去氫酶的任一者的能力。為了安定轉形一宿主生物的目的，該載體亦可併入基因組中。此一載體的選擇以及***依據本發明的嵌合基因至這個載體內的技術是那些熟習此技藝者的一般知識的部分。有利地，除了依據本發明的嵌合基因，在本發明中所使用的載體亦含有一編碼一可選擇的標記(selectable marker)的嵌合基因。這個可選擇的標記使選擇該等被有效地轉形的宿主生物(亦即，併入該載體的那些)是可能的。依據本發明的一特別具體例，該要被轉形的宿主生物是一細菌、一酵母菌、一真菌。在該等可被使用的可選擇的標記之中，含有對抗生素(antibiotics)抗性的基因[諸如，例如，濕黴素磷轉移酶基因(hygromycin phosphotransferase gene)]的標記可被提及。其他標記可以是補充一營養缺陷性(auxotrophy)的基因(諸如pyrA、pyrB、pyrG、pyr4、arg4、argB以及trpC基因)、鉬喋呤合成基因(molybdopterin synthase gene)或具有乙醯胺酶(acetamidase)者。編碼容易地可鑑定的酵素(諸如GUS酵素)的基因或者編碼色素或調節色素在該等被轉形的細胞中的製造的酵素的基因亦被提到。此等可選擇的標記基因特別被描述在專利申請案WO 91/02071、WO 95/06128、WO 96/38567以及WO 97/04103。
本發明亦有關於含有至少一依據本發明的嵌合基因[被併入它們的基因組或被攜帶在一染色體外的基因要素(extrachromosomal genetic element)(例如一質體)上]的經轉形的宿主生物。在本發明的一更特別方面，該經轉形的宿主生物包含有一編碼一蘋果酸激酶的本發明的核酸或一包含有一編碼一蘋果酸激酶的核酸的嵌合基因或一包含有一編碼一蘋果酸激酶的核酸和/或一編碼一蘋果酸半醛去氫酶的核酸的表現載體，或一包含有一編碼一蘋果酸半醛去氫酶的核酸的嵌合基因或一包含有一編碼一蘋果酸半醛去氫酶的核酸和/或一編碼一DHB去氫酶的核酸的表現載體、一包含有一編碼一DHB去氫酶的核酸的嵌合基因或者一包含有一編碼一DHB去氫酶的核酸的表現載體。
在本發明的一特別方面，該編碼該蘋果酸激酶的核酸是由序列辨識編號13、序列辨識編號15、序列辨識編號17、序列辨識編號19、序列辨識編號21、序列辨識編號23、序列辨識編號25、序列辨識編號27、序列辨識編號38、序列辨識編號40、序列辨識編號42或序列辨識編號44所表示，該編碼該蘋果酸半醛去氫酶的核酸是由序列辨識55、序列辨識編號57、序列辨識編號59、序列辨識編號61、序列辨識編號63、序列辨識編號65或序列辨識編號67所表示，以及該編碼該DHB去氫酶的核酸是由序列辨識編號73、序列辨識編號75、序列辨識編號224、序列辨識編號226或序列辨識編號82所表示。
術語“宿主生物”被意欲意指為了製造2,4-DHB依據本發明的嵌合基因(們)、核酸(們)或載體(們)可被導入的任何低等單細胞生物。較佳地，該宿主生物是一微生物，特別是一真菌[例如青黴菌屬(Penicillium)、麴菌屬(Aspergillus)以及更特別地黃麴菌(Aspergillus flavus)、金孢子菌屬(Chrysosporium)或木黴屬(Trichoderma genus)]、一酵母菌[特別是釀母菌屬(Saccharomyces)、克鲁维酵母屬(Kluyveromyces)或畢赤酵母菌屬(Pichia genus)以及更特別地魯氏接合酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)]、一細菌[例如大腸菌屬(Escherichia genus)(特別是大腸桿菌)或棒狀桿菌屬(Corynebacterium genus)(更特別地麩胺酸棒狀桿菌)或鏈絲菌屬(Streptomyces genus)]或者一桿狀病毒(baculovirus)。
該宿主生物可以是一從糖(諸如葡萄糖)天然地過度製造蘋果酸或琥珀酸的宿主生物或一被工程化以從糖(諸如葡萄糖)過度製造蘋果酸或琥珀酸並且促進有機酸[諸如蘋果酸、丙酮酸(pyruvate)、琥珀酸以及反丁烯二酸(fumarate)]輸出的所有可能的膜轉運子(membrane transporters)已被刪除的宿主生物。該宿主生物可以是一被工程化以過度製造DHB並且促進有機酸(諸如蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸以及反丁烯二酸)輸出的所有膜轉運子已被刪除的生物。促進蘋果酸以及其他有機酸的輸出的通透酶(permeases)的實例是來自裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的Mae1(Camarasa et al.,2001;Grobler et al.,1995)、來自枯草桿菌的DctA(Groeneveld et al.,2010)、來自大腸桿菌的Dct1-4、來自啤酒酵母菌(S. cerevisiae)的Jen1(Akita et al.,2000)。對於一專家，根據序列同源性(sequence homology)鑑定在其他微生物中的候選通透酶是可能的。這些建構物將作為保留蘋果酸以及其他有機酸在該細胞內以使它們可獲得的用於DHB製造。
措辭“經轉形的宿主生物”被意欲意指至少一依據本發明的嵌合基因已併入至它的基因組或在一外染色體的基因要素(例如一質體)中並且隨後在它的組織或在一培養基中製造蘋果酸激酶、蘋果酸半醛去氫酶和/DHB去氫酶的任一者的一宿主生物。為了獲得依據本發明的宿主生物，那些熟習此技藝者可使用許多已知的轉形方法的一者。
這些方法的一者在於使該等要被轉形的宿主生物的細胞與聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)以及依據本發明的載體接觸。電穿孔(electroporation)是另一種方法，它在於令該等要被轉形的細胞以及本發明的載體至一電場。另一種方法在於藉由微注射(microinjection)直接注射該等載體至該等細胞或該等組織內。“基因槍(biolistic)”方法可被使用。它在於以本發明的載體所吸附的顆粒轟擊細胞或組織(美國專利第4,945,050號)。
數種用於轉形細菌的方法被描述在關於大腸桿菌以及其它革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)的文獻中。接合(conjugation)亦可被使用。對於革蘭氏陽性菌(特別是對於鏈絲菌屬的細菌)，電穿孔以及原生質體(protoplast)轉形可被使用。
數種用於轉形真菌的方法亦被描述在文獻中。以PEG的原生質體轉形用於麴菌屬被描述在EP 0260762中，並且這個方法對於繩狀青黴菌(Penicillium funiculosum)物種的一適用被描述在WO 00/36120中。藉由限制酵素調節的合併或REMI的轉形亦被知曉有如使用農桿菌屬(Agrobacterium genus)的細菌的原生質體轉形。用於轉形酵母菌的技術亦被描述在文獻中，在一另一個方面，本發明論及一種製造2,4-DHB的方法，其包含有培養一本發明的經轉形的微生物的步驟。
對於製造DHB，各種不同的碳水化合物(carbohydrates)可個別地或者有如一混合物而被利用，諸如葡萄糖、蔗糖(sucrose)、糖蜜(molasses)、麥芽糖(maltose)、赤糖糊(blackstrap molasses)、澱粉水解物(starch hydrolysate)[葡萄糖、寡糖(oligosaccharides)]、乳糖(lactose)、麥芽糖(maltose)、澱粉(starch)與澱粉水解物(starch hydrolysates)、纖維素(cellulose)、纖維素水解物(cellulose hydrolysate)、甘油(glycerol)以及無疑地烴(hydrocarbons)、油與脂肪[諸如大豆油(soy bean oil)、葵花油(sunflower oil)、花生油(groundnut oil)與椰子油(coconut oil)]以及脂肪酸(fatty acids)[諸如例如棕櫚酸(palmitic acid)、硬脂酸(stearic acid)與亞麻油酸(linoleic acid)]。那些物質可個別地或者有如混合物而被使用。
各種不同來源的氮可個別地或有如混合物而被利用於商業的與試驗規膜的製造，包括無機化合物[諸如氣體與水性氨(gaseous and aqueous ammonia)]、無機或有機酸的銨鹽(ammonium salts)[諸如硫酸銨(ammonium sulphate)、硝酸銨(ammonium nitrate)、磷酸銨(ammonium phosphate)、氯化銨(ammonium chloride)、醋酸銨(ammonium acetate)以及碳酸銨(ammonium carbonate)]。另擇地，含有天然氮的有機材料[像大豆水解物(soybean-hydrolysate)、大豆蛋白HCl-水解物(soy protein HCl-hydrolysate)(大約7%的總氮)、大豆粉(soy bean meal)、大豆餅水解物(soybean cake hydrolysate)、玉米浸液(corn steep liquor)、酪蛋白水解物(casein hydrolysate)、酵母菌萃取物(yeast extract)、肉萃取物(meat extract)、麥芽萃取物(malt extract)、尿素(urea)、蛋白腖(peptones)以及胺基酸]亦可被利用。
該製造方法可在有氧(aerobic)、厭氧(anaerobic)以及氧限制的條件下被進行。它可有如一饋料-批次方法(fed-batch process)或一批次方法(batch process)而被進行。
該2,4-DHB的製造可藉由在蘋果酸[或另一種有機酸(諸如丙酮酸、琥珀酸或反丁烯二酸)]單獨或與另一種確保生長的碳來源一起被添加的介質中培養該宿主生物而被做出。蘋果酸(與其他有機酸)可直接地或者藉由設計一種2階段發酵方法(two-stage fermentation process)[其中蘋果酸(與其他有機酸)在一第一方法階段中藉由一蘋果酸-過度製造微生物而被製造，以及2,4-DHB製造在下一個階段藉由一依據本發明的宿主生物而被實現]而被添加。
產物分離以及純化是非常重要的因子巨大地影響總加工效率以及產物成本。用於產物回收的方法通常地包含有細胞分離以及分別地產物純化、濃縮以及乾燥的步驟。
細胞分離
超過濾(ultrafiltration)以及離心(centrifugation)可被使用以從發酵介質中分離細胞。由於高的介質黏性，從發酵介質分離細胞經常是複雜的。因此，吾人可添加添加劑(additives)[諸如礦酸(mineral acid)或鹼金屬鹽(alkali salts)]或加熱培養液(culture broth)以最佳化細胞分離。
產物回收
各種不同的離子交換層析法(ion-exchange chromatographic methods)可被應用於在生物質(biomass)移除之前或之後分離DHB。它們包括依據它們的等電點(isoelectric point)促進產物的分離的一級陰離子交換樹脂(primary cation exchange resins)的使用。典型地，樹脂以溶液而被充電，並且被保留的產物隨著在洗提液(eluent)中增加的pH(例如藉由添加氫氧化銨)而被分離地洗提。另一種可能性代表使用固定的或仿造的移動床樹脂(moving bed resins)的離子交換層析法的使用。為了達到足夠的產物純度，不同的層析步驟可能必須被組合。那些純化方法相較於一昂貴的結晶(crystallization)步驟是更經濟的，亦提供關於最終產物的形式的額外優點以及彈性。
產物濃縮以及乾燥
純化方法亦可包含有一可涉及任何適合的乾燥元件[諸如一噴霧粒化機(spray granulator)、噴霧乾燥機(spray dryer)、滾筒乾燥機(drum dryer)、旋轉乾燥機(rotary dryer)以及隧道式乾燥機(tunnel dryer)]的乾燥步驟。經濃縮的DHB溶液可藉由使用一多用途濃縮機(multipurpose concentrator)或薄膜蒸發器(thin film evaporator)在減壓、130℃下經由蒸氣加熱發酵液而被獲得。
DHB的有效製造可藉由在該宿主生物的代謝網路中最佳化碳通量再分配(carbon flux repartitioning)以及藉由確保足夠的NADPH與ATP供應給DHB途徑的3種酵素而被保證。輸送碳通量至一所欲的代謝途徑內以及供應NAD(P)H輔因子(cofactor)通常地藉由刪除或減輕競爭天然的發酵途徑而被促進。非除外的實例是
-　藉由妨礙乙醇的形成最佳化在啤酒酵母菌中的蘋果酸製造[藉由刪除丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylases)(Zelle et al.,2008;Zelle et al.,2010)。
-　藉由妨礙乳酸的形成(例如刪除ldhA)、醋酸的形成(例如刪除pta、ackA)、乙醇的形成(例如刪除adhE)、甲酸(formate)的形成(例如刪除pflB,focA)、丙酮酸的氧化(例如刪除poxB)、蘋果酸的降解(刪除maeB與scfA)、琥珀酸的形成(例如刪除frdBC)、甲基乙二醛(methylglyoxal)的形成(刪除mgsA)最佳化在大腸桿菌中的琥珀酸或蘋果酸製造(Jantama et al.,2008a;Jantama et al.,2008b;Lin et al.,2005;Sanchez et al.,2005a;Zhang et al.,2011)。
增加碳通量以及ATP供應用於製造有機酸的另一種可能性是工程化磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)/丙酮酸/草醯乙酸(oxaloacetate)分支節點(branch node)[在(Sauer & Eikmanns,2005)中回顧]。關於確保從磷酸烯醇丙酮酸至草醯乙酸的碳通量的增加的代謝工程策略的非除外實例是
-藉由阻礙丙酮酸激酶的功能以及增加PEP羧激酶(PEP carboxykinase)的活性最佳化在啤酒酵母菌中的蘋果酸製造(Zelle et al.,2010)。
-藉由增加天然或異質地表現的PEP羧酶(PEP carboxylase)、PEP羧激酶或丙酮酸羧酶(pyruvate carboxylase)的活性最佳化在大腸桿菌中的琥珀酸製造(Millard et al.,1996;Sanchez et al.,2005b;Zhang et al.,2009)。
增加碳通量以及ATP供應用於在採用PEP-消耗的磷酸轉移酶系統(phosphotransferase system,PTS)用於葡萄糖的初始磷酸化步驟的大腸桿菌以及其他細菌中製造有機酸的另一種可能性是刪除PTS系統的必需組份(例如ptsI或ptsG)(Lin et al.,2005;Zhang et al.,2009)。為了確保在攜帶PTS系統的有害突變的突變體(mutants)中進一步的葡萄糖攝取，另擇的葡萄糖攝取系統(例如GalP)的活性必須被確保。
增加碳通量至用於製造有機酸的所欲途徑中的另一種可能性是工程化檸檬酸(citric acid)以及乙醛酸循環(glyoxylate cycle)。非除外的實例是
-　藉由增加異檸檬酸解離酶(isocitrate lyase)的活性[刪除轉錄抑制子(transcriptional repressor)iclR]最佳化在大腸桿菌中的琥珀酸製造(Lin et al.,2005;Sanchez et al.,2005a)。
-　藉由刪除異檸檬酸去氫酶和/或琥珀酸去氫酶最佳化琥珀酸製造(Lin et al.,2005)。
-
增加碳通量至用於製造DHB的所欲途徑中的另一種可能性是在製造生物中表現適當的丙酮酸去氫酶以及檸檬酸合成酶(citrate synthases)。大腸桿菌的天然的丙酮酸去氫酶以及檸檬酸合成酶藉由高的細胞內NADH濃度使得這些酵素在厭氧條件下較少活性而被抑制。在大腸桿菌中，一對NADH不敏感的丙酮酸去氫酶突變體的表現導致乙醯-CoA(acetyl-CoA)在厭氧條件下的過度製造以及經修飾的碳通量在發酵終產物(醋酸、乳酸、乙醇、甲酸以及丙酮酸)之間再分配(Wang et al.,2010)。對NADH不敏感的枯草桿菌檸檬酸合成酶的異質表現增加在經工程化的大腸桿菌菌株中的琥珀酸製造(Sanchez et al.,2005a)。與上面所描述的突變組合，適當的丙酮酸去氫酶與檸檬酸合成酶(NADH敏感的或不敏感的)的使用能夠調整在厭氧與有氧條件下在乙醛酸與檸檬酸循環反應與發酵途徑之間的碳通量再分配。
增加碳通量遍及DHB途徑的另一種可能性是刪除可降解途徑中間物4-磷蘋果酸、4-蘋果酸半醛的酵素反應。可降解蘋果酸半醛的候選酵素是琥珀酸半醛去氫酶(sad、gabD)，以及能夠氧化具有的末端醛基團的C4分子的其他去氫酶。
增加該宿主生物的DHB製造率的另一種可能性是刪除降解DHB的代謝反應。DHB是一蘋果酸酵素的競爭抑制劑，因此具有對這個酵素的活性位址比較高的親和力(Rognstad & Katz,1979)。因此，DHB可藉由其他酵素而被辨識並且可能地被降解。這些酵素可被鑑定並且從該宿主生物被刪除。
當2,4-DHB製造是根據添加蘋果酸或其他有機酸時，該等2,4-DHB-製造微生物應該功能地表現一促進蘋果酸[或其他有機酸(諸如丙酮酸、琥珀酸等等)]的攝取的膜運送蛋白質。
下列實施例例示本發明。這些實施例僅為了例示的目的並且沒有被解釋為以任何方式限制本發明的範疇。
圖式簡單說明
第1圖：(i)描述轉化(L)-蘋果酸成為(L)-2,4-二羥基丁酸(DHB)的反應途徑，以及(ii)轉化(L)-天冬胺酸成為(L)-高絲胺酸的類比。
第2圖：來自不同生物的天冬胺酸激酶的胺基酸序列的比對。(Ec_AKIII-天冬胺酸激酶III(序列辨識編號4)，大腸桿菌的LysC、Ec_AKI(序列辨識編號87)-天冬胺酸激酶I，大腸桿菌的ThrA、Ec_AKII(序列辨識編號88)-天冬胺酸激酶II，大腸桿菌的MetL、Mj-詹氏甲烷球菌(序列辨識編號89)、Tt-嗜熱棲熱菌(序列辨識編號90)、Cg-麩胺酸棒狀桿菌(序列辨識編號91)、At-***芥(序列辨識編號92)、Sc-啤酒酵母菌(序列辨識編號93))。該圖使用Clustal W2(Larkin et al.,2007)而被產生。
第3圖：來自不同生物的天冬胺酸半醛去氫酶的胺基酸序列的比對。(Ec-大腸桿菌(序列辨識編號49)、Mj-詹氏甲烷球菌(序列辨識編號94)、Tt-嗜熱棲熱菌(序列辨識編號95)、Bs-枯草桿菌(序列辨識編號96)、Cg-麩胺酸棒狀桿菌(序列辨識編號97)、At-***芥(序列辨識編號98)、Sc-啤酒酵母菌(序列辨識編號99))。該圖使用ClustalW2(Larkin et al.,2007)而被產生。
第4圖：在對應於DHB的滯留時間(retention time)的區域上拉近的GC層析圖顯示：(A) DHB標準品(濃度=1 mM)；(B)含有蘋果酸激酶(MK)、蘋果酸半醛去氫酶(MSA-Dh)以及蘋果酸半醛還原酶(MSA-Red)的反應A的組成物；(C)對照反應B的組成物(與A相同但缺乏MSA-Red)；(D)對照反應C的組成物(與A相同但缺乏MSA-Dh)。
第5圖：經純化的LysC E119G、LysC E119G E250K、LysC E119G T344M、LysC E119G S345L、LysC E119G T344M以及LysC E119G T352I突變體關於在反應緩衝液中的離胺酸濃度的相關活性。
 實施例 實施例1：分別來自大腸桿菌以及啤酒酵母菌的天冬胺酸激酶LysC以及Hom3對於天冬胺酸以及蘋果酸激酶活性的試驗
建構含有天冬胺酸激酶的野生型基因的質體：質體pLYSCwt藉由PCR使用高精確聚合酶(polymerase)PhusionTM(Finnzymes)以及導入一分別在起始密碼子的上游與終止密碼子的下游的NdeI與BamHI限制位址(restriction sites)的順向與反向引子5'CACGAGGTACATATGTCTGAAATTGTTGTCTCC3'(序列辨識編號1)與5'CTTCCAGGGGATCCAGT-ATTTACTCAAAC3'(序列辨識編號2)擴增lysC基因而被建構。來自大腸桿菌DH5α的基因組DNA被使用作為模板。該PCR產物以NdeI與BamHI予以消化、使用T4DNA連接酶(ligase)(Biolabs)連接至pET28a(Novagen)表現載體的對應位址，並且予以轉形至大腸桿菌DH5α細胞中。所形成的pAKIIIwt質體被分離並且藉由DNA定序而被顯示含有具有正確序列的全長lysC基因(序列辨識編號3)。對應的蛋白質由序列辨識編號4所表示。
質體pHOM3wt藉由PCR使用高精確聚合酶PhusionTM(Finnzymes)以及導入分別在起始密碼子的上游與終止密碼子的下游的一NdeI與一EcoRI限制位址的順向與反向引子5'TATAATGCTAGCATGCCAATGGATTTCCAACC3'(序列辨識編號5)與5TATAATGAATTCT-TAAATTCCAAGTCTTTTCAATTGTTC3'(序列辨識編號6)擴增HOM3基因而被建構。來自啤酒酵母菌BY4741 wt的基因組被使用作為模板。該PCR產物以NdeI與EcoRI予以消化、使用T4 DNA連接酶(ligase)(Biolabs)連接至pET28a(Novagen)表現載體的對應位址，並且予以轉形至大腸桿菌DH5α細胞中。所形成的pHOM3wt質體被分離並且藉由DNA定序而被顯示含有具有正確序列的全長HOM3基因(序列辨識編號7)。對應的蛋白質由序列辨識編號8所表示。
酵素的表現：大腸桿菌BL21D3星狀細胞(BL21 D3 star cells)以適當的質體予以轉形。在蛋白質表現藉由添加1 mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖哌喃糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)至該培養基而被誘導之前，具有一N-端六-His標籤(tag)的酵素在被接種自一為0.1的OD600的過夜培養物並且生長至0.6的OD600的250 mL LB培養基中被表現。在蛋白質表現3小時之後，細胞藉由在13000g下離心歷時10分鐘而被收集並且在-20℃下被儲存直到進一步分析。生長和蛋白質表現在37℃下被進行。培養基含有50μg/L康黴素(kanamycin)。
酵素的純化：表現培養物的冷凍細胞沉澱物被再懸浮在0.5 mL的破裂緩衝液(breakage buffer)(50 mM Hepes,300mM NaCl,pH 7.5)中並且藉由4個連續循環的具有功率輸出設定至30%的音波處理(sonication)(Bioblock Scientific,VibraCellTM 72437)而被破壞打開。細胞碎片藉由在4℃在13000 g下離心粗萃取物歷時15分鐘而被移除並且保留清澈的上澄液(supernatant)。RNA與DNA藉由添加15 mg/mL鏈黴素(streptomycin)(Sigma)、在4℃在13000 g下離心該等樣品歷時10分鐘而從萃取物中被移除並且保留上澄液。清澈的蛋白質萃取物與0.75 mL床體積(bed volumes)的TalonTM鈷親和樹脂(Cobalt affinity resin)(Clontech)在4℃下被培育歷時1小時。懸浮液在一桌上型離心機中在700 g下被離心並且上澄液被移除。該樹脂在天冬胺酸激酶以0.5 mL的洗提緩衝液(elution buffer)[50 mM Hepes、300 mM NaCl、500 mM咪唑(Imidazole)，pH 7.5]予以洗提之前以10床體積的清洗緩衝液(50 mM Hepes、300 mM NaCl、15 mM咪唑，pH 7.5)予以清洗。經洗提的酵素的純度藉由SDS-PAGE分析而被證明。
酵素分析：天冬胺酸或蘋果酸激酶活性藉由在磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶以及乳糖去氫酶的存在下偶合在激酶反應中的ADP製造至NADH氧化而被分析。
反應途徑：
天冬胺酸(或蘋果酸)激酶
天冬胺酸(或蘋果酸)+ATP→4-磷-(L)-天冬胺酸(或4-磷-(L)-蘋果酸)+ADP
丙酮酸激酶
ADP+磷酸烯醇丙酮酸→ATP+丙酮酸
乳糖去氫酶
丙酮酸+NADH→NAD++乳糖
分析混合物含有50 mM Hepes(pH 7.5)、50 mM KCl、5 mM MgCl2、0.24 mM NADH、0.96 mM ATP、0.96 mM PEP、9 μg/mL的乳糖去氫酶(Sigma,L2500)、12.4 μg/mL丙酮酸激酶(Sigma,P1506)以及適當數量的經純化的天冬胺酸(蘋果酸)激酶。反應藉由添加50 mM(L)-天冬胺酸或(L)-蘋果酸而被起始。酵素分析在30℃下在一為250 μL的總體積在96-井平底微滴定盤(96-well flat bottomed microtiter plates)中被進行。該等反應藉由在一微盤讀取機(BioRad 680XR)中在340 nm下的NADH的特有吸收而被追蹤。
羥肟酸分析(hydroxamate assay)：為了證明藉由野生型或經突變的天冬胺酸激酶磷酸化該基質[亦即，形成一醯基磷酸酐(acylphosphate anhydride)]，該激酶反應的產物與羥基胺被培育以形成對應的天冬胺酸或蘋果酸羥肟酸衍生物。該分析混合物含有120 mM Hepes(pH 8)、200 mM KCl、10 mM ATP、200 mM羥基胺、10 mM天冬胺酸或蘋果酸以及適當數量的經純化的蛋白質。該反應在藉由添加一相等體積的配於氫氯酸(hydrochloric acid)的1.7%(w/v)FeCl3 30分鐘之後被停止。羥肟酸-鐵複合物的形成藉由在一微盤讀取機中測量它在540 nm下的特有吸收而被證明。含有除了ATP以外的所有組份的分析混合物被使用作為一空白對照。
結果：如由羥肟酸分析所證明的，經純化的LysC(沒有His-標籤，序列辨識編號4)與Hom3(沒有His-標籤，序列辨識編號7)酵素展現出天冬胺酸激酶活性但是不能夠磷酸化蘋果酸(Keng & Viola,1996)。關於LysC與Hom3在天冬胺酸上的最大活性分別是4.5 μmol/(min* mgprot)以及1.6μmol/(min*mgprot)。對於天冬胺酸的Km值以伊迪(Eadie)與霍夫斯蒂(Hofstee)的方法藉由測量在不同基質濃度(c)下的初始反應速率(v)以及藉由取得v對v/c圖的斜率而被評估。經純化的His-標籤LysC的Km被評估大約0.6 Mm，顯示該His-標籤的蛋白質具有如被報導為0.6 mM的未被標籤的經純化的酵素(Marco-Marin et al.,2003)的相同基質親和力。
實施例2：來自大腸桿菌的天冬胺酸激酶LysC的定點突變以及突變酵素對於蘋果酸激酶活性的試驗
定點突變使用被例示在表1的寡核苷酸對以及pLYSCwt(序列辨識編號3)質體作為模板而被進行。改變胺基酸序列的點突變(point mutations)藉由PCR[Phusion 1U、HF緩衝液20%(v/v)、dNTPs 2.5 mM、順向與反向引子各個1 μM、模板質體200 ng、水]使用被例示在表1的寡核苷酸對而被導入。除了功能性突變以促進經突變的克隆的鑑定以外，由PCR所產生的質體含有一關於Nco1的新限制位址[使用靜默突變(silent mutations)而被導入]。該等PCR產物在37℃下藉由DpnI而被消化歷時1小時以移除模板DNA，並且予以轉形至NEB 5-α勝任大腸桿菌細胞(NEB)。該等經突變的質體藉由限制位址分析而被鑑定並且藉由DNA定序被證明攜帶所欲的突變。
表示一在位置119的突變的序列可由序列辨識編號9所表示，其中在位置119的殘基是X，X是19種天然發生的胺基酸(除了麩醯胺酸)的任一者。
突變酵素如在實施例1中所描述的而被表現、純化以及試驗對於天冬胺酸與蘋果酸激酶活性。結果被概述在表2中。
在表2中所例示的突變體不具有在天冬胺酸上的活性。
結果顯示天冬胺酸激酶可藉由由半胱胺酸、甘胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸替換在位置119的保守的麩胺酸而被轉形成蘋果酸激酶。
該等在表2所例示的酵素的對應核酸序列是序列辨識編號13、序列辨識編號15、序列辨識編號17、序列辨識編號19、序列辨識編號21、序列辨識編號23、序列辨識編號25以及序列辨識編號27。
實施例3：建構一對於由離胺酸的抑制具有強大地被降低的敏感性的蘋果酸激酶
定點突變使用被例示在表3的寡核苷酸對以及pLYSC_E119G質體作為模板[該pLYSC_E119G質體如在實施例2所描述的藉由導入在lysC基因的DNA序列中的下列變化：(序列辨識編號15)而被獲得]而被進行。改變胺基酸序列的點突變藉由PCR[Phusion 1U、HF緩衝液20%(v/v)、dNTPs 2.5 mM、順向與反向引子各個1 μM、模板質體200 ng、水]使用被例示在表1的寡核苷酸對而被導入。當可能時，除了功能性突變以促進經突變的克隆的鑑定以外，由PCR所產生的質體含有一新的限制位址(使用靜默突變而被導入)。該等PCR產物在37℃下藉由DpnI而被消化歷時1小時以移除模板DNA，並且被轉形至NEB 5-α勝任大腸桿菌細胞(NEB)。該等經突變的質體藉由限制位址分析而被鑑定並且藉由DNA定序被證明攜帶所欲的突變。
該包含有一額外突變的蛋白質LysC E119G的核酸序列對應於(i)藉由一離胺酸替換在位置250的麩胺酸是由序列辨識編號38所表示；它的對應胺基酸序列由序列辨識編號39所表示；(ii)藉由甲硫胺酸替換在位置344的蘇胺酸是由序列辨識編號40所表示；它的對應胺基酸序列由序列辨識編號41所表示；(iii)藉由異白胺酸替換在位置352的蘇胺酸是由序列辨識編號42所表示；它的對應胺基酸序列由序列辨識編號43所表示，(iv)藉由白胺酸替換在位置345的絲胺酸是由序列辨識編號44所表示；它的對應胺基酸序列由序列辨識編號45所表示。
酵素的表現與純化：關於該等His-標籤的酵素LysC E119G、LysC E119G E250K、LysC E119G T344M、LysC E119G S345L、LysC E119G T352I的蛋白質表現如在實施例1所描述的被進行。
酵素分析：蘋果酸激酶活性如在實施例1所描述的被分析。在反應緩衝液中的離胺酸濃度被變化。
結果：導入突變體E250K、T344M或S345L至LysC E119G內使得蘋果酸激酶活性廣泛地對提高的離胺酸濃度不敏感的(參見第5圖)。
實施例4：來自大腸桿菌的天冬胺酸半醛去氫酶Asd對於天冬胺酸與蘋果酸半醛去氫酶活性的試驗
建構含有天冬胺酸半醛去氫酶的野生型基因的質體：質體pASDwt藉由PCR使用高精確聚合酶PhusionTM(Finnzymes)以及導入一分別在起始密碼子的上游與終止密碼子的下游的NheI與BamHI限制位址的順向與反向引子5'TATAATGCTAGCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGG3'(序列辨識編號46)與5'TATAATGGATCCTTACGCCAGTTGACGAAGC3'(序列辨識編號47)擴增大腸桿菌的asd基因而被建構。來自大腸桿菌DH5α的基因組DNA被使用作為模板。該PCR產物以NheI與BamHI予以消化、使用T4 DNA連接酶(Biolabs)連接至pET28a(Novagen)表現載體的對應位址，並且予以轉形至大腸桿菌DH5α細胞中。所形成的pASDwt質體被分離並且藉由DNA定序而被顯示含有具有正確序列的全長asd基因(序列辨識編號48)。該酵素的對應胺基酸序列由序列辨識 編號49所表示。
酵素的表現與純化：關於該等His-標籤的酵素Asd的蛋白質表現如在實施例1所描述的被進行。
酵素分析：天冬胺酸或蘋果酸半醛去氫酶活性分別在氧化天冬胺酸或蘋果酸半醛成4-磷-(L)-天冬胺酸或4-磷-(L)-蘋果酸的期間在逆生物合成方向藉由追蹤NADP的還原而被分析(Roberts et al.,2003)。
(L)-天冬胺酸半醛[或(L)-蘋果酸半醛]+NADP+Pi→4-磷-(L)-天冬胺酸[或4-磷-(L)-蘋果酸]+NADPH
分析混合物含有200mM Hepes(pH 9)、50mM K2HPO4、0.25mM NADP。反應藉由添加(L)-天冬胺酸半醛或(L)-蘋果酸半醛而被起始。(L)-天冬胺酸半醛以L-天冬胺酸β-半醛水合物三氟醋酸(L-aspartic acid β-semialdehyde hydrate trifluoroacetate)(被維持在pH3以預防降解)(一種用於高絲胺酸去氫酶與天冬胺酸半醛去氫酶的酵素試驗的適當基質)的形式被添加(Roberts et al.,2003)。不安定的蘋果酸半醛在酵素試驗之前藉由去保護(deprotection)安定的蘋果酸半醛衍生物2-[(4S)-2,2-二甲基-5-氧基-1,3-二氧戊環-4-基]乙醛{2-[(4S)-2,2-dimethyl-5-oxo-1,3-dioxolan-4-yl]acetaldehyde,DMODA}而被新鮮地製造。蘋果酸半醛藉由在25℃下培育DMODA在2M氫氯酸中歷時15分鐘並且蒸發被釋放的丙酮(35℃,50mbar)而被獲得。該蘋果酸半醛溶液的pH使用碳酸氫鈉而被固定在3。
酵素分析在30℃下在一為250μL的總體積在96-井平底微滴定盤中被進行。該等反應在一微盤讀取機(BioRad 680XR)中藉由在340 nm下的NADH的特有吸收而被追蹤。
結果：His-標籤的野生型天冬胺酸半醛去氫酶Asd以一為160 μmol/(min*mgprot)的最大比活性氧化(L)-天冬胺酸半醛成4-磷-(L)-天冬胺酸。該酵素具有一為0.01 μmol/(min*mgprot)的活性在(L)-蘋果酸半醛上。
實施例5：來自大腸桿菌的天冬胺酸半醛去氫酶Asd的定點突變以及突變酵素對於蘋果酸半醛去氫酶活性的試驗
在Asd的胺基酸序列的點突變使用pASDwt質體作為模板並且跟隨在實施例2所概述的操作程序而被導入。被例示在表4的寡核苷酸對被使用以突變在位置241的麩胺酸殘基或在位置136的蘇胺酸殘基。該等被突變的質體藉由限制位址分析而被鑑定並且藉由DNA定序被證明攜帶所欲的突變。
在位置241被突變的Asd蛋白質可由序列辨識編號68所表示，其中在位置241的殘基是X，X是19種天然發生的胺基酸(除了麩醯胺酸)的任一者。
結果：在位置E241中被突變的Asd的活性與Km值被概述在表5中。麩胺酸241由丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或麩醯胺酸所替換的Asd突變體以一要比野生型酵素顯著更高的最大比活性氧化(L)-天冬胺酸-4-半醛成4-磷-(L)-天冬胺酸。該雙突變體Asd E241Q T136N(序列辨識編號231)具有一為0.25 μmol/(min*mgprot)的最大比活性以及一為0.25 mM的Km。
該等對應的核酸由序列辨識編號55、序列辨識編號57、序列辨識編號48、序列辨識編號59、序列辨識編號61、序列辨識編號63、序列辨識編號65以及序列辨識編號67所表示。
雙突變體Asd E241Q T136N具有一由序列辨識編號230所表示的核酸序列。
實施例6：鑑定一2,4DHB去氫酶
為了鑑定一適合的2,4DHB去氫酶，來自不同生物來源的β-羥基酸去氫酶被試驗它們還原蘋果酸半醛的能力。被試驗的酵素是來自啤酒酵母菌的甲基丁醛還原酶Ypr1(Ford & Ellis,2002))(序列辨識編號73與序列辨識編號74)；以及來自勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)的琥珀酸半醛還原酶Ms-Ssr(Kockelkorn & Fuchs,2009)(序列辨識編號75與序列辨識編號76)。基因YPR1與Ms-SSR分別使用在表6中所例示的引子而被擴增並且被選殖至載體pET28(限制酵素參見表3)內產生質體pYPR1與pMs-SSR。蛋白質如在實施例1所描述的被表現以及純化。
用於蘋果酸半醛還原酶活性的試驗：
反應：
(L)-蘋果酸半醛+NAD(P)H→(L)-2,4-二羥基丁酸+NAD(P)
分析反應物含有200 mM Hepes(pH 7.5)、50 mM KCl、5 mM MgCl2、0.24 mM NADH或NADPH以及適當數量的經純化的酵素。反應藉由添加10 mM(L)-蘋果酸半醛(蘋果酸半醛被新鮮地製備用於各個試驗，參見實施例4)而被起始。酵素分析在30℃下在一為250 μL的最終體積在96-井平底微滴定盤中被進行。該等反應在一微盤讀取機(BioRad 680XR)中藉由在340 nm下的NAD(P)H的特有吸收而被追蹤。結果被例示在表7中。
該來自勤奮金屬球菌的琥珀酸半醛去氫酶以及該來自啤酒酵母菌的甲基丁醛還原酶具有蘋果酸半醛還原酶活性Ms-SSR對於蘋果酸半醛的Km是1.1 mM
實施例7：來自勤奮金屬球菌的琥珀酸半醛還原酶的定點突變
定點突變使用被例示在表8的寡核苷酸對以及pMs-SSR質體作為模板而被進行。改變胺基酸序列的點突變藉由PCR[Phusion 1U、HF緩衝液20%(v/v)、dNTPs 2.5 mM、順向與反向引子各個1 μM、模板質體200 ng、水]而被導入。當可能時，除了功能性突變以促進經突變的克隆的鑑定以外，由PCR所產生的質體含有一新的限制位址(使用靜默突變而被導入)。該等PCR產物在37℃下藉由DpnI而被消化以移除模板DNA，並且予以轉形至NEB 5-α勝任大腸桿菌細胞(NEB)。該等經突變的質體藉由限制位址分析而被鑑定並且藉由DNA定序被證明攜帶所欲的突變。表9概述該等突變體的動力學參數。結果證明當相較於野生型酵素時，雙突變體Ms-SSR H39R N43H(序列辨識編號81、序列辨識編號82)對於蘋果酸半醛具有經改善的親和力。
對應的核酸序列由序列辨識編號224、序列辨識編號226以及序列辨識編號82所表示。
實施例8：活體外製造DHB
酵素蘋果酸激酶(LysC E119G，序列辨識編號15)、蘋果酸半醛去氫酶(Asd E241Q；序列辨識編號67)以及蘋果酸半醛還原酶(Ms SSrR，序列辨識編號76)如在實施例1所描述的被表現以及純化。DHB的製造藉由添加50 mM蘋果酸至一含有50 mM Hepes(pH 7.5)、50 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM NADPH、180 μg/mL的蘋果酸激酶(Lys E119G)、325 μg/mL的蘋果酸半醛去氫酶(Asd E241Q)以及130 μg/mL的蘋果酸半醛還原酶(Ms_Ssr)的反應混合物(反應A)而被活體外證明。對照反應含有所有組份但是缺乏蘋果酸半醛還原酶(反應B)或蘋果酸半醛去氫酶(反應C)。在30℃下培育30分鐘之後，該反應混合物藉由氣相層析法(gas chromatography)[CPG Varian Series 430；被裝配以FID偵測器；自動取樣器(autosampler) CP8400；無分流的注射器(splitless injector) 1177(230℃)；管柱(column)：CP-WAX58/FFAP，30 m×0.53 mm，df0.50 μm；以及襯墊(liner)：Inlet Sleeve，鵝頸狀物(gooseneck) 6.5 x 78.5 x 4 mm GWOL(Varian)而被分析。載體氣體(carrier gas)是在一為25 mL/min的流速下的氮。火焰游離(flame ionization)使用一空氣-氫混合物(流速分別是300 mL/min與30 mL/min)而被進行。偵測器溫度是240℃。被注射的樣品體積是1 μL。溫度計劃被提供在表10中。
DHB製造在反應A(存在所有酵素)中被偵測，但是在對照反應B與C中缺乏(第4圖)。
實施例9：最佳化勤奮金屬球菌琥珀酸半醛還原酶的編碼序列用於它在大腸桿菌中的表現
包括突變H39R與N43H的勤奮金屬球菌琥珀酸半醛還原酶的編碼序列使用GeneOptimizer®軟體而被最佳化用於在大腸桿菌中最大表現。該合成基因藉由GeneArt®基因合成(Invitrogen Life Technologie)而被製造。NheI與EcoRI限制位址分別被導入在起始密碼子的上游以及終止密碼子的下游，容許直接選殖至pET28a+(Novagen)內。
所形成的pSSR-H39RN43H-opt質體被分離並且藉由DNA定序而被顯示含有具有正確序列的全長勤奮金屬球菌SSR H39R N43H基因(序列辨識編號228)。
實施例10：建構一使用大腸桿菌作為宿主生物促進蘋果酸激酶(來自大腸桿菌的lysC基因的突變體)、蘋果酸半醛去氫酶(來自大腸桿菌的asd基因的突變體)以及DHB去氫酶(勤奮金屬球菌琥珀酸半醛還原酶基因的突變體)的同時表現的質體
質體pLYSC-E119G E250K(序列辨識編號38)被使用作為操縱子(operon)建構的骨架。一含有pET28(Novagen)核醣體結合位址(ribosome binding site,rbs)以及ASD-E241Q的編碼區域的DNA片段藉由PCR[高精確聚合酶PhusionTM(Finnzymes)]使用pASD-E241Q(序列辨識編號55作為模板以及導入分別在rbs的上游與終止密碼子的下游的一BamHI與一EcoRI限制位址的順向與反向引子5'TATAAGGATCCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGG3'(序列辨識編號83)與5'TATAAGAATTCTTACGCCAGTTGACGAAG3'(序列辨識編號84)而被獲得。該等PCR產物以BamHI與EcoRI予以消化、使用T4 DNA連接酶(Biolabs)連接至pLYSC-E119G E250K的對應位址，並且予以轉形至大腸桿菌DH5α細胞中。所形成的pLYSC-E119G-E250K_ASD-E241Q質體被分離並且藉由DNA定序而被顯示具有正確序列。
一含有pET28核醣體結合位址(rbs)以及該密碼子被最佳化的Ms-SSR-H39RN43H-opt的編碼區域的DNA片段藉由PCR使用pSSR-H39RN43H-opt作為模板以及入分別在rbs的上游與終止密碼子的下游的一NotI與一PspXI限制位址的順向與反向引子5'TATAAGCGGCCGCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT3'(序列辨識編號85)與5’TATAAACTCGAGCTTACGGAATAATCAGG3’(序列辨識編號86)而被獲得。該等PCR產物以NotI與PspXI予以消化、使用T4 DNA連接酶(Biolabs)連接至pLYSC-E119G-E250K_ASD-E241Q的對應位址，並且予以轉形至大腸桿菌DH5α細胞中。所形成的pET28-DHB質體(序列辨識編號229)被分離並且藉由DNA定序而被顯示具有正確序列。
同時地調節3種基因的表現的5’上游啟動子區域(亦即在pET28-DHB T7的啟動子)可藉由以SphI與XbaI消化pET28-DHB並且選殖具有適當的限制位址的另一個啟動子區域而被替換以任何其他誘導的或固有的啟動子。使用一可誘導的啟動子作為一實例，pET28-DHB骨架的T7啟動子藉由特徵為在葡萄糖的存在下容許蛋白質表現的tac啟動子而被替換(de Boer et al.,1983)。該tac啟動子藉由以SphI與XbaI消化質體pEXT20(Dykxhoorn et al.,1996)而從該質體被獲得。含有該啟動子的DNA片段被純化並且被選殖至該經SphI/XbaI消化的pET28-DHB質體內。所形成的pTAC-DHB質體被分離並且藉由DNA定序而被顯示具有正確序列。
實施例11：建構大腸桿菌菌株以最佳化碳通量再分配以及NADPH-輔因子供應用於發酵的DHB製造
為了最佳化碳通量再分配以及輔因子用於DHB製造，數種基因在大腸桿菌菌株MG1655中被破壞。基因刪除使用依據Datsenko等人的λ紅重組酶方法(lambda red recombinase method)(Datsenko & Wanner,2000)被進行。
刪除盒(deletion cassettes)藉由PCR使用使用高精確聚合酶PhusionTM(Finnzymes)以及質體pKD4的FRT-側接的康黴素抗性基因(kan)作為模板而被製備(Datsenko & Wanner,2000)。正義引子(sense primers)含有對應於各個標靶基因(劃線)的5’端繼而20 bp對應於pKD4的FRT-kan-FRT盒的序列。反義引子(anti-sense primers)含有對應於各個標靶基因(劃線)的3’端繼而20 bp對應於該盒的序列。該等引子被描述在表12中。PCR產物在轉形之前以DpnI予以消化並且予以純化。
大腸桿菌MG1655菌株藉由在37℃下在LB液體培養基中生長該等細胞至一為0.6的OD600、濃縮該等細胞100倍以及以冰-冷的10%甘油予以清洗2次而成為電勝任的(electro-competent)。該等細胞藉由電穿孔[2.5 kV、200 Ω、25 μF、在2 mm裂口小玻璃管(gap cuvettes)中]以質體pKD46(Datsenko & Wanner,2000)而被轉型。轉形體在30℃下在安比西林(ampicillin)(100 μg/mL)LB固體培養基上被選擇。
破壞盒(disruption cassettes)被轉形至懷有λ紅重組酶-表現質體pKD46的電勝任大腸桿菌菌株中。該等細胞在30℃被生長在含有安比西林(100 μg/mL)的液體SOB培養基中。當該等培養物的OD600達到0.1時，該λ紅重組酶系統藉由添加10 mM***糖(arabinose)而被誘導。細胞在它們藉由離心被收穫之前進一步生長至一為0.6的OD600、以冰-冷的10%甘油予以清洗2次，並且藉由電穿孔以破壞盒予以轉形。在一於30℃、LB液體培養基中的過夜表現型表現(phenotypic expression)之後，細胞被放在含有25 μg/mL康黴素的LB培養基上。轉形體在30℃下培養之後被選擇。
基因替換藉由選殖PCR使用Crimson Taq聚合酶(NEB)而被證明。一第一反應以側接基因座-專一性引子(locus-specific primers)(參見表13)而被進行以證明同時損失親代片段(parental fragment)以及獲得新的突變專一性片段。2個額外的反應藉由使用鄰近的基因座-專一性引子與在FRT-康黴素抗性盒(正義基因座引子/k1rev以及k2for/反向基因座引子)中的個別普通試驗引子k1rev或k2for(參見表13)而被做出。
抗性基因(FRT-kan-FRT)隨後使用懷有FLP重組酶的質體pCP20(Cherepanov & Wackernagel,1995)而從染色體被切除留下一含有FRT位址的scar區域。pCP20是一顯示溫度敏感複製以及FLP重組酶合成的熱誘發的安比西林與CmR質體。康黴素抗性突變體以pCP20予以轉形，以及安比西林-抗性轉形體在30℃下被選擇。轉形體接著在37℃下被生長在固體LB培養基上並且被試驗失去所有抗生素抗性(antibiotic resistances)。切除FRT-康黴素盒藉由選殖PCR使用crimson taq聚合酶以及側接基因座-專一性引子(表13)而被分析。多重刪除藉由重複上面所描述的步驟而被獲得。
攜帶單一或多重刪除的菌種如上面所描述的成為電勝任的，以容許DHB途徑酵素的IPTG-誘發表現的pTAC-DHB質體予以轉形(參見實施例10)，並且在含有50 μg/mL康黴素的固體LB培養基上被選擇。
懷有大腸桿菌的PEP羧基酶(PEP carboxykinase)編碼的pck基因的質體pACT3-pck藉由使用來自大腸桿菌MG1655的基因組DNA作為模板以及分別地5'TATAATCCCGGGATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC3'(序列辨識編號100)與5'TATAATTCTAGATTACAGTTTCGGACCAGCCG3'(序列辨識編號101)的順向與反向引子擴增pck編碼序列而被建構。該DNA片段以XmaI與XbaI予以消化、使用T4 DNA連接酶(Biolabs)連接至pACT3表現載體(Dykxhoorn et al.,1996)的對應位址，並且予以轉形至大腸桿菌DH5α細胞中。該等轉形體在含有氯黴素(chloramphenicol)(25 μg/mL)的固體LB培養基上被選擇。所形成的質體被分離並且pck基因的正確***藉由定序而被確認。分別懷有aceA、ppc、galP或pykA(所有大腸桿菌)或來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的pycA的質體pACT3-ace、pACT3-ppc、pACT3-galP、pACT3-pykA以及pACT3-pyc使用在表14中所例示的引子而被類似地建構。
上面所提到的pACT3-衍生的質體以及pTAC-DHB質體被轉形至攜帶在表12中所例示的刪除的組合的大腸桿菌MG1655突變體中。含有這兩者質體的轉形體在含有氯黴素(25 μg/mL)以及康黴素(康黴素)(50 μg/mL)的固體LB培養基上被選擇。關於被建構的菌株的實例被例示在表15中。
實施例12：藉由發酵葡萄糖製造2,4-二羥基丁酸
菌株與培養條件：實驗以共表現來自質體pTAC-DHB(參見實施例11)的蘋果酸激酶、蘋果酸半醛去氫酶以及DHB去氫酶的菌株大腸桿菌ECE1以及一僅含有空的質體(亦即pTAC骨架而沒有上面所提及的酵素的編碼序列)的同基因型對照菌株(isogenic control strain)而被進行。1升的培養基含有20 g葡萄糖、18 g Na2HPO4 * 12 H2O、3 g KH2PO4、0.5 g NaCl、2 g NH4Cl、0.5 g MgSO4 * 7 H2O、0.015 CaCl2 * 2 H2O、1 mL的被製備在100倍經稀釋的濃縮HCl中的0.06 mol/L FeCl3母液(stock solution)、2 mL的10 mM硫胺素HCl母液(thiamine HCl stock solution)、20 g MOPS、50 μg硫酸康黴素以及1 mL的微量元素溶液(trace element solution)(每公升含有：0.04 g Na2EDTA * 2H2O、0.18 g CoCl2 * 6 H2O、ZnSO4 * 7 H2O、0.04 g Na2MoO4 * 2 H2O、0.01 g H3BO3、0.12 g MnSO4 * H2O、0.12 g CuCl2 * H2)。pH被調整至7以及培養基被無菌過濾。所有培養在37℃下在一於170 rpm下運轉的Infors旋轉振盪器(Infors rotary shaker)上被進行。過夜培養物(3 mL培養基在試驗管中)被接種自甘油母液並且被使用以調整一為0.05的初始OD600在被培養於500 mL搖瓶的100 mL生長培養物中。當在生長培養基中的OD600達到0.2時，IPTG以一為1 mmol/L的濃度被添加。
藉由LC-MS/MS分析評估DHB濃度：培養基藉由離心(Beckmann-Coulter Allegra 21R，Rotor Beckmann S4180，10分鐘，4800 rpm)與該等細胞被分離。清澈的上澄液被儲存在-20℃下直到進一步分析。DHB含量使用一HPLC(Waters){被裝配一ACQUITY UPLC BEH管柱(C18，1.7 μm，100 x 2.1 mm，Waters)、被連接至一物質敏感的偵測器(mass sensitive detector)[TQ，Waters，ESI mode，毛細管電壓(capillary voltage)：2.5 kV、錐電壓(cone voltage) 25 V、萃取器電壓(extractor voltage)：3V、來源溫度(source temperature)：150℃、溶媒揮散溫度(desolvation temperature)：450℃、錐氣體流速(cone gas flow)：50 L/h、溶媒揮散氣體流速(desolvation gas flow)：750 L/h]}而被定量。管柱溫度被保持在30℃。移動相是一具有88%的一0.08%氫氧化四正丁基銨溶液(tetra-n-butylammonium hydroxide solution)以及12%乙腈(acetonitrile)的混合物。流速被固定在0.4 mL/min。該等樣品的注射體積是5 μL。
結果：
菌株大腸桿菌ECE1以及該對照菌株的培養基的DHB含量在藉由添加IPTG誘發蘋果酸激酶、天冬胺酸半醛去氫酶以及DHB去氫酶的表現之後8小時以及24小時被評估。如可在表16中所見的，該表現DHB途徑酵素的菌株ECE1要比該對照菌株製造顯著較高數量的DHB證明經由被顯示在第1(i)圖中的代謝途徑發酵製造DHB的可能性。
<110>　艾迪索法國股份有限公司
<120>　一種生產2,4-二羥基丁酸的方法
<130>　BR073152
<150>　PCT/IB2010/003153
<151>　2010-10-28
<150>　PCT/IB2011/001559
<151>　2011-05-23
<160>　231
<170>　PatentIn version 3.5
<210>　1
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<212>　DNA
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<220>
<223>　用於擴增的引子
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<211>　29
<212>　DNA
<213>　人工序列
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<223>　用於擴增的引子
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<221>　混合特徵(MISC_FEATURE)
<222>　(119)..(119)
<223>　X是除了E之外的任一胺基酸
<400>　9
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<221>　混合特徵
<222>　(17)..(19)
<223>　nnn編碼除了麩醯胺酸之外的其他19種天然存在的蛋白胺基酸的任一者
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<223>　用於擴增的引子
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<221>　混合特徵
<222>　(17)..(19)
<223>　nnn編碼除了麩醯胺酸之外的其他19種天然存在的蛋白胺基酸的任一者
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<221>　混合特徵
<222>　(20)..(22)
<223>　nnn編碼除了麩醯胺酸之外的其他19種天然存在的蛋白胺基酸的任一者
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<223>　勤奮金屬球菌密碼子最佳化的序列
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<223>　用於表現蘋果酸激酶、蘋果酸半醛去氫酶以及DHB去氫酶的嵌合基因
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<213>　大腸桿菌
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<213>　大腸桿菌
<400>　231
第1圖：(i)描述轉化(L)-蘋果酸成為(L)-2,4-二羥基丁酸(DHB)的反應途徑，以及(ii)轉化(L)-天冬胺酸成為(L)-高絲胺酸的類比。
第2圖：來自不同生物的天冬胺酸激酶的胺基酸序列的比對。(Ec_AKIII-天冬胺酸激酶III(序列辨識編號4)，大腸桿菌的LysC、Ec_AKI(序列辨識編號87)-天冬胺酸激酶I，大腸桿菌的ThrA、Ec_AKII(序列辨識編號88-天冬胺酸激酶II，大腸桿菌的MetL、Mj-詹氏甲烷球菌(序列辨識編號89)、Tt-嗜熱棲熱菌(序列辨識編號90)、Cg-麩胺酸棒狀桿菌(序列辨識編號91)、At-***芥(序列辨識編號92)、Sc-啤酒酵母菌(序列辨識編號93))。該圖使用ClustalW2(Larkin et al.,2007)而被產生。
第3圖：來自不同生物的天冬胺酸半醛去氫酶的胺基酸序列的比對。(Ec-大腸桿菌(序列辨識編號49)、Mj-詹氏甲烷球菌(序列辨識編號94)、Tt-嗜熱棲熱菌(序列辨識編號95)、Bs-枯草桿菌(序列辨識編號96)、Cg-麩胺酸棒狀桿菌(序列辨識編號97)、At-***芥(序列辨識編號98)、Sc-啤酒酵母菌(序列辨識編號99))。該圖使用ClustalW2(Larkin et al.,2007)而被產生。
第4圖：在對應於DHB的滯留時間(retention time)的區域上拉近的GC層析圖顯示：(A)DHB標準品(濃度=1 mM)；(B)含有蘋果酸激酶(MK)、蘋果酸半醛去氫酶(MSA-Dh)以及蘋果酸半醛還原酶(MSA-Red)的反應A的組成物；(C)對照反應B的組成物(與A相同但缺乏MSA-Red)；(D)對照反應C的組成物(與A相同但缺乏MSA-Dh)。
第5圖：經純化的LysC E119G、LysC E119G E250K、LysC E119G T344M、LysC E119G S345L、LysC E119GT344M以及LysC E119G T352I突變體關於在反應緩衝液中的離胺酸濃度的相關活性。

Claims (20)

  1. 一種製造2,4-二羥基丁酸(2,4-DHB)的方法，其包含有：-一使用一蘋果酸激酶轉換蘋果酸成為4-磷-蘋果酸的第一步驟，其中該蘋果酸激酶係藉由一天冬胺酸激酶的至少一突變來獲得，該(等)突變改善該經突變的多肽對於蘋果酸的活性和/或基質親和力，該經突變的天冬胺酸激酶相較於野生型酵素包含有至少一突變在位置E119，該位置涉及序列辨識編號4，其中在該位置的天然發生的胺基酸藉由其他19種天然存在的蛋白胺基酸的任一者而被替換，亦即藉由丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、***酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸而被替換，-一使用一蘋果酸半醛去氫酶轉換4-磷-蘋果酸成為蘋果酸-4-半醛的第二步驟，其中該蘋果酸半醛去氫酶係藉由一天冬胺酸半醛去氫酶的至少一突變來獲得，該(等)突變改善該經突變的酵素對於4-磷-蘋果酸的活性和/或基質親和力，且係選自序列辨識編號54、序列辨識編號56、序列辨識編號58、序列辨識編號60、序列辨識編號62、序列辨識編號64或序列辨識編號66或序列辨識編號231，-一使用一DHB去氫酶轉換蘋果酸-4-半醛成為2,4-DHB的第三步驟，其中該DHB去氫酶選自琥珀酸 半醛還原酶、甲基丁醛還原酶或包含至少一突變之經突變的琥珀酸半醛還原酶，該(等)突變改善該經突變的多肽對於蘋果酸-4-半醛的活性和/或基質親和力，且係選自序列辨識編號74、序列辨識編號76、序列辨識編號81或序列辨識編號225。
  2. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該蘋果酸激酶係選自序列辨識編號9、序列辨識編號12、序列辨識編號14、序列辨識編號16、序列辨識編號18、序列辨識編號20、序列辨識編號22、序列辨識編號24或序列辨識編號26。
  3. 如申請專利範圍第2項的方法，其中該蘋果酸激酶對離胺酸抑制係不敏感的，進一步包含有至少一突變在下列胺基酸上：E250，且係選自序列辨識編號39、序列辨識編號41、序列辨識編號43或序列辨識編號45。
  4. 一種蘋果酸激酶，其特徵在於其會轉換蘋果酸成為4-磷-蘋果酸，其中該蘋果酸激酶係藉由一酵素的至少一突變來獲得，該(等)突變改善該經突變的多肽對於蘋果酸的活性和/或基質親和力，且由序列辨識編號12、序列辨識編號14、序列辨識編號16、序列辨識編號18、序列辨識編號20、序列辨識編號22、序列辨識編號24或序列辨識編號26所構成。
  5. 如申請專利範圍第4項的蘋果酸激酶，其對離胺酸抑制係不敏感的，進一步包含有至少一突變，且係選自序列辨識編號39、序列辨識編號41、序列辨識編號43或序列辨識編號45。
  6. 一種蘋果酸半醛去氫酶，其特徵在於其會轉換4-磷-蘋果酸成蘋果酸-4-半醛，其中該蘋果酸半醛去氫酶係藉由一酵素的至少一突變來獲得，該(等)突變改善該經突變的多肽對於4-磷-蘋果酸的活性和/或基質親和力，且由序列辨識編號54、序列辨識編號56、序列辨識編號58、序列辨識編號60、序列辨識編號62、序列辨識編號64、序列辨識編號66或序列辨識編號231所構成。
  7. 一種DHB去氫酶，其特徵在於它轉換蘋果酸-4-半醛成2,4-DHB，當相較於野生型酵素，其係藉由一琥珀酸半醛還原酶的至少一突變在位置N43和/或H39而被獲得，該等位置涉及序列辨識編號76，且選自序列辨識編號81或序列辨識編號225。
  8. 一種經分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第4或5項中任一項的蘋果酸激酶，其是由序列辨識編號13、序列辨識編號15、序列辨識編號17、序列辨識編號19、序列辨識編號21、序列辨識編號23、序列辨識編號25、序列辨識編號27、序列辨識編號38、序列辨識編號40、序列辨識編號42或序列辨識編號44所構成。
  9. 一種經分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第6項的蘋果酸半醛去氫酶，其是由序列辨識編號55、序列辨識編號57、序列辨識編號59、序列辨識編號61、序列辨識編號63、序列辨識編號65、序列辨識編號67或序列辨識編號230所構成。
  10. 一種經分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第7項的 DHB去氫酶，其是由序列辨識編號82或序列辨識編號224所構成。
  11. 一種嵌合基因，其包含有至少在轉錄的方向上功能性地連接一在一宿主生物中有功能的啟動子調節序列、如申請專利範圍第8至10項中任一項的核酸的至少一者以及一在該宿主生物中有功能的終止子調節序列，其是由序列辨識編號229所表示。
  12. 一種表現載體，其包含有如在申請專利範圍第8至10項中任一項所請求的核酸或如申請專利範圍第11項的嵌合基因。
  13. 一種宿主微生物，其表現如申請專利範圍第4至7項的一蘋果酸激酶、和/或一蘋果酸半醛去氫酶和/或一DHB去氫酶，該宿主微生物為一細菌、一酵母菌或一真菌。
  14. 如申請專利範圍第13項的宿主微生物，其被轉形以申請專利範圍第7至9項的核酸的至少一者、至少一如申請專利範圍第10項的嵌合基因或如申請專利範圍第12項的表現載體。
  15. 如申請專利範圍第13或14項的宿主微生物，它是進一步包含有一破壞下列基因的至少一者：ldhA、adhE、ackA、focA-pflB、pta、poxB、sad、gabD、gadA、gadB、gadC、sfcA、maeB、ppc、pykA、pykF、mgsA、iclR、icd、sucA、sucB、frdA、frdB、frdC、frdD、ptsG以及ptsI，和/或過度表現下列基因的至少一者：Ec_pck、Ec_ppc、Ec_pykA、Ec_aceA、Ll_pycA以及Ec_galP的大腸桿菌。
  16. 一種製造2,4-DHB的方法，其包含培養如申請專利範圍第13至15項中任一項的表現一蘋果酸激酶、一蘋果酸半醛去氫酶以及一DHB去氫酶的宿主微生物的步驟，該宿主微生物被培養在添加有一蘋果酸或另一種有機酸之介質中。
  17. 如申請專利範圍第1項之製造2,4-DHB的方法，其包含有一藉由蘋果酸過度製造微生物製造蘋果酸或其他有機酸的第一步驟。
  18. 一種一甲基丁醛還原酶或一琥珀酸半醛還原酶轉換蘋果酸-4-半醛成2,4-DHB的用途，該甲基丁醛還原酶是由序列辨識編號74所構成，該琥珀酸半醛還原酶是由序列辨識編號76、序列辨識編號81或序列辨識編號225所構成。
  19. 一種如申請專利範圍第4或5項中任一項的蘋果酸激酶轉換蘋果酸成4-磷-蘋果酸的用途。
  20. 一種如申請專利範圍第6項的蘋果酸半醛去氫酶轉換4-磷-蘋果酸成蘋果酸-4-半醛的用途。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103270155B (zh) * 2010-10-28 2016-02-10 安迪苏法国联合股份有限公司 2,4-二羟基丁酸的生产方法
MY175391A (en) 2012-04-26 2020-06-23 Adisseo France Sas Method of production of 2,4-dihydroxybutyric acid
TW201410865A (zh) 2012-06-04 2014-03-16 Genomatica Inc 製造４－羥基丁酸酯、１，４－丁二醇及相關化合物之微生物及方法
WO2014009435A1 (en) * 2012-07-11 2014-01-16 Adisseo France S.A.S. Method for the preparation of 2,4-dihydroxybutyrate
ES2672883T3 (es) 2012-07-11 2018-06-18 Institut National Des Sciences Appliquees Microorganismo modificado para la producción de 1,3-propanodiol
CN102864196B (zh) * 2012-10-09 2014-07-02 南京工业大学 一种二氢乳清酸酶法制备α-天冬氨酰小肽的方法
CN108486082A (zh) * 2012-10-18 2018-09-04 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用
JP2016165225A (ja) * 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
CN107771214B (zh) * 2015-04-07 2022-01-18 代谢探索者公司 用于具有增加的2,4-二羟基丁酸外排物的优化的2,4-二羟基丁酸产生的修饰的微生物
US10415062B2 (en) 2015-04-07 2019-09-17 Metabolic Explorer Modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxybutyrate
JP6806716B2 (ja) 2015-06-25 2021-01-06 ダイナミック フード イングリディエンツ コーポレーションＤｙｎａｍｉｃ Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ． ２，４−ジヒドロキシ酪酸の製造方法
CN108624627B (zh) * 2017-03-22 2021-07-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用
JPWO2021162099A1 (zh) * 2020-02-14 2021-08-19
CN112322597B (zh) * 2020-11-23 2022-08-23 天津法莫西生物医药科技有限公司 一种羰基还原酶突变体及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
JP4088982B2 (ja) * 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
DE10014546A1 (de) * 2000-03-23 2001-09-27 Degussa Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
CN101208427A (zh) * 2003-05-30 2008-06-25 米克罗比亚股份有限公司 氨基酸制备的方法和组合物
RU2275424C2 (ru) * 2003-12-05 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
DE102006017760A1 (de) * 2006-03-24 2007-09-27 Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren
KR100837842B1 (ko) * 2006-08-10 2008-06-13 씨제이제일제당 (주) 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성이증가된 ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌 생산 방법
WO2008115840A2 (en) 2007-03-16 2008-09-25 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
BRPI0914521A2 (pt) 2008-10-27 2016-07-26 Butamax Advanced Biofuels Llc célula hospedeira microbiana recombinante, método de aumento da produção de isobutanol e método de produção de isobutanol
CN103270155B (zh) * 2010-10-28 2016-02-10 安迪苏法国联合股份有限公司 2,4-二羟基丁酸的生产方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Marco-Marín C et al., "Site-directed mutagenesis of Escherichia coli acetylglutamate kinase and aspartokinase III probes the catalytic and substrate-binding mechanisms of these amino acid kinase family enzymes and allows three-dimensional modelling of aspartokinase", J. Mol. Biol. 334(3):459-76, 2003/11/28
Marco-Marín C et al., "Site-directed mutagenesis of Escherichia coli acetylglutamate kinase and aspartokinase III probes the catalytic and substrate-binding mechanisms of these amino acid kinase family enzymes and allows three-dimensional modelling of aspartokinase", J. Mol. Biol. 334(3):459-76, 2003/11/28 張平中 等人，江西九江地區晚更新世生態變遷的土壤有機質碳同位素證據，冰川凍土，第20卷第2期，1998年6月 *
張平中 等人，江西九江地區晚更新世生態變遷的土壤有機質碳同位素證據，冰川凍土，第20卷第2期，1998年6月。

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Publication number Publication date
JP2017070285A (ja) 2017-04-13
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US20160153013A1 (en) 2016-06-02
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AR083589A1 (es) 2013-03-06
JP6345747B2 (ja) 2018-06-20
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BR112013010268B1 (pt) 2020-09-08
RU2626531C2 (ru) 2017-07-28
US9238829B2 (en) 2016-01-19
KR101990014B1 (ko) 2019-06-17
WO2012056318A1 (en) 2012-05-03
RU2013123481A (ru) 2014-12-10

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