CN108624627B - 催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用 - Google Patents

催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用 Download PDF

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CN108624627B CN201710173829.5A CN201710173829A CN108624627B CN 108624627 B CN108624627 B CN 108624627B CN 201710173829 A CN201710173829 A CN 201710173829A CN 108624627 B CN108624627 B CN 108624627B
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
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    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01011—Aspartate-semialdehyde dehydrogenase (1.2.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明公开了催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用。本发明提供了A和B在催化甲酸合成甲醛中的应用，所述A为stAckA蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；所述B为ASD蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。本发明的实验证明，本发明发现stAckA和ASD酶的新功能可用于甲酸合成甲醛，为甲酸合成甲醛创造了一条新途径。

Description

催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用。
背景技术
从生态角度讲，甲酸是糖发酵的中间产物，易于在发酵过程中累积。同时，甲酸还可以作为生成下游还原性代谢产物的原料，例如，生成乙醇，甲烷，氢气等。从生物技术角度讲，甲酸可以来源于二氧化碳还原、生物质选择性氧化、天然气部分氧化及合成气的氢化。因此甲酸可以作为连接物理化学与生物领域的桥梁，研究甲酸的同化途径具有重要的意义。
自然界存在的甲酸固定反应主要有甲酸直接还原反应、甲酸激酶反应、甲酸与乙酰辅酶缩合反应、乳酸合成反应等。甲酸的直接还原反应由甲醛脱氢酶催化，将甲酸直接还原为甲醛从热力学上是不利的，因此反应效率低下。甲酸激酶反应由甲酸-四氢叶酸连接酶催化，此同化途径路线长，需在厌氧条件下反应，因此应用受到限制。用乙酰辅酶A合成酶可以实现甲酸还原为甲醛，但目前利用效率依然不高。甲酸与乙酰辅酶缩合反应丙酮酸-甲酸裂合酶催化，此反应也是热力学甲酸有利的。乳酸合成反应即甲酸与乙醛缩合反应，目前还没有在体外成功实现。
这些甲酸固定反应是甲酸同化途径的重要组成部分，目前最优的甲酸同化途径是人工合成途径：甲酸还原为甲醛，甲醛聚合生成二羟基丙酮，二羟基丙酮磷酸化直接进入中心代谢。
stAckA为acetate kinase(stAckA)乙酸激酶，stAckA用于催化乙酸磷酸化，aspartate-semialdehyde dehydrogenase(ASD)天冬氨酸半醛脱氢酶，ASD蛋白催化磷酸天冬氨酸生成为天冬氨酸-4-半醛。
发明内容
本发明的一个目的是提供A和B的新用途，
所述A为stAckA蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述B为ASD蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。
本发明提供了A和B在催化甲酸合成甲醛中的应用；
还提供了A和B在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用；
所述A为stAckA蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述B为ASD蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。
上述应用中，所述stAckA蛋白来源于Salmonella typhimurium；
或所述ASD蛋白来源于Streptococcus pneumoniae serotype 4。
上述应用中，所述stAckA蛋白为如下1)或2)：
1)由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；
2)由1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能由1)衍生的多肽；
或所述ASD蛋白为如下1)或2)：
1)由序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；
2)由1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能由1)衍生的多肽。
上述应用中，所述stAckA蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一种：
1)编码区为序列3的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子有大于70％同一性且编码具有相同功能多肽的DNA分子；
或，所述ASD蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一种：
1)编码区为序列4的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子有大于70％同一性且编码具有相同功能多肽的DNA分子。
本发明另一个的目的是提供一种催化甲酸合成甲醛产品。
本发明提供的产品，包括A和B；
所述A为stAckA蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述B为ASD蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。
上述产品还包括NADPH、ATP和MgCl2；
或，上述产品为试剂盒。
本发明第三个目的是提供一种催化甲酸合成甲醛的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：以甲酸为底物，用所述stAckA蛋白和所述ASD蛋白催化甲酸合成甲醛。
上述方法中，所述催化反应的条件为37℃反应2h。
上述方法中，所述催化反应的所需的pH值为pH7.4。
上述方法中，所述催化所在的体系包括NADPH、ATP、MgCl2、甲酸、所述stAckA蛋白和所述ASD蛋白。
本发明的实验证明，本发明发现stAckA和ASD酶的新功能可用于甲酸合成甲醛，为甲酸合成甲醛创造了一条新途径。
附图说明
图1为重组质粒pET-28a-stAckA的质粒图谱示意图。
图2为重组质粒pET-28a-ASD的质粒图谱示意图。
图3为甲醛检测标准曲线。
图4为不同酶催化甲酸生成的甲醛浓度示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、stAckA和ASD的获得
1、stAckA、ASD基因获得、载体构建
stAckA种属来源为Salmonella typhimurium(strain LT2/SGSC1412/ATCC700720)，其氨基酸序列如序列1所示；ASD种属来源为Streptococcus pneumoniaeserotype 4(strain ATCC BAA-334/TIGR4)，其氨基酸序列如序列2所示。在不改变StAckA、ASD编码的氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如序列3、序列4所示。
分别将上述基因序列合成在pET-28a载体(Novagen，Kan+，见图1、图2)上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，重组质粒分别命名为pET-28a-stAckA、pET-28a-ASD。
pET-28a-stAckA为将序列3所示的CAR基因替换pET-28a载体的NdeI和XhoI位点间的DNA片段得到的载体；
pET-28a-ASD为将序列4所示的CAR基因替换pET-28a载体的NdeI和XhoI位点间的DNA片段得到的载体。
2、基因的表达
为了体外检测stAckA、ASD酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。
(1)分别将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-stAckA、pET-28a-ASD转入E.coliBL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan+，100mg/mL)，37℃过夜培养；
(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD600为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；
(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；
(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，200mM NaCl，5mM MgCl2，pH7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。
3、蛋白纯化
(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；
(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
a：柱平衡：挂上清前，先用ddH2O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；
b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；
c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，然后分别用50mL含50mM、100mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；
d：洗脱目的蛋白：用20mL含200mM咪唑的蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测。
(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加15mL不含咪唑的蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化蛋白stAckA、ASD。
(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度并稀释至10mg/mL，即得到stAckA、ASD蛋白，其氨基酸序列分别如序列1、序列2所示。
实施例2、stAckA和ASD在催化甲酸生成甲醛中的应用
1、stAckA/ASD可以催化甲酸生成甲醛，反应方程式如下：
Figure BDA0001251817980000041
2、酶活性检测:
显色法检测甲醛生成量：利用《中华人民共和国国家环境保护标准HJ601-2011》中的甲醛测定方法检测甲醛含量。具体流程如下：
A：配置乙酰丙酮溶液：将50g乙酸铵(CH3COONH4)、6mL冰乙酸(CH3COOH)及0.5mL乙酰丙酮(C5H8O2)试剂溶于100mL水中。此溶液在4℃冷藏可稳定保存一个月。
B：标准曲线的制备：分别配置浓度为0mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的甲醛标准溶液。
取2.5mL各浓度甲醛标准溶液，加入0.25mL乙酰丙酮溶液，混匀。60℃水浴加热15min，冷却后414nm下检测吸光值。绘制标准曲线，如图3所示。
C:酶活性检测反应体系(200μL)：终浓度为1mM的NADPH，1mM ATP，5mM MgCl2，5mM甲酸，加入实施例1制备的stAckA蛋白和ASD蛋白各1.5mg/ml，再用pH7.4浓度为50mM磷酸钾缓冲液(0.1M K2HPO3水溶液、0.1M KH2PO3水溶液、dH2O按照体积比为4:1:5混匀)补足至200ul，37℃反应2h。
用显色法检测甲醛生成量，根据甲醛浓度标准曲线计算甲醛浓度，结果如图4所示。
可以看出，在所提供反应条件下stAckA和ASD蛋白共同作用可以催化甲酸生成甲醛，加入5mM的甲酸可得到0.0163mM的甲醛。
自然界存在的酶是可逆反应，主要催化甲醛生成甲酸，检验此酶催化活性(以甲酸为底物)，检测甲醛，没有检测到产物。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Met Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Leu Asn Cys Gly Ser Ser Ser Leu
1 5 10 15
Lys Phe Ala Ile Ile Asp Ala Val Asn Gly Asp Glu Tyr Leu Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Glu Cys Phe His Leu Pro Glu Ala Arg Ile Lys Trp Lys Met
35 40 45
Asp Gly Ser Lys Gln Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala His Ser
50 55 60
Glu Ala Leu Asn Phe Ile Val Asn Thr Ile Leu Ala Gln Lys Pro Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ala Gln Leu Thr Ala Ile Gly His Arg Ile Val His Gly Gly
85 90 95
Glu Lys Tyr Thr Ser Ser Val Val Ile Asp Glu Ser Val Ile Gln Gly
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Ala Ser Phe Ala Pro Leu His Asn Pro Ala His Leu
115 120 125
Ile Gly Ile Ala Glu Ala Leu Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Asp Lys
130 135 140
Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Glu Glu
145 150 155 160
Ser Tyr Leu Tyr Ala Leu Pro Tyr Ser Leu Tyr Lys Glu His Gly Val
165 170 175
Arg Arg Tyr Gly Ala His Gly Thr Ser His Phe Tyr Val Thr Gln Glu
180 185 190
Ala Ala Lys Met Leu Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Asn Ile Ile Thr
195 200 205
Cys His Leu Gly Asn Gly Gly Ser Val Ser Ala Ile Arg Asn Gly Lys
210 215 220
Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met
225 230 235 240
Gly Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Ala Ile Ile Phe His Leu His
245 250 255
Asp Thr Leu Gly Met Ser Val Asp Gln Ile Asn Lys Met Leu Thr Lys
260 265 270
Glu Ser Gly Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Thr Ser Asp Cys Arg Tyr
275 280 285
Val Glu Asp Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Ala Lys Arg Ala Met Asp
290 295 300
Val Tyr Cys His Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Gly Ser Tyr Thr Ala Leu
305 310 315 320
Met Asp Gly Arg Leu Asp Ala Val Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Glu
325 330 335
Asn Ala Ala Met Val Arg Glu Leu Ser Leu Gly Lys Leu Gly Val Leu
340 345 350
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Thr Asn Glu Glu Leu Val Ile Ala Gln Asp Ala Ser Arg Leu Thr Ala
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<212> PRT
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<220>
<223>
<400> 2
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1 5 10 15
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35 40 45
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Gly Gly Asp Lys Lys His Tyr Pro Ile Ala Phe Asn Ala Leu Pro Gln
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<211> 1200
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<213> 人工序列
<220>
<223>
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<223>
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aaagaagttg ctccgatcga agaagttaaa gctgctatcg ctgctttccc gggtgctgtt 840
ctggaagacg acgttgctca ccagatctac ccgcaggcta tcaacgctgt tggttctcgt 900
gacaccttcg ttggtcgtat ccgtaaagac ctggacgctg aaaaaggtat ccacatgtgg 960
gttgtttctg acaacctgct gaaaggtgct gcttggaact ctgttcagat cgctgaaacc 1020
ctgcacgaac gtggtctggt tcgtccgacc gctgaactga aattcgaact gaaa 1074

Claims (7)

1.A和B在催化甲酸合成甲醛中的应用；
所述A为stAckA蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述B为ASD蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述stAckA蛋白为由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；
所述ASD蛋白为由序列2所示的氨基酸序列组成的多肽。
2.A和B在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用；
所述A为stAckA蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述B为ASD蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述stAckA蛋白为由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；
所述ASD蛋白为由序列2所示的氨基酸序列组成的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述stAckA蛋白来源于Salmonella typhimurium；
或所述ASD蛋白来源于Streptococcus pneumoniae serotype 4。
4.根据权利要求1或2任一所述的应用，其特征在于：
所述stAckA蛋白的编码基因为编码区为序列3的DNA分子；
所述ASD蛋白的编码基因为编码区为序列4的DNA分子。
5.一种催化甲酸合成甲醛的方法，包括如下步骤：以甲酸为底物，用stAckA蛋白和ASD蛋白催化甲酸合成甲醛；
所述stAckA蛋白为由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；
所述ASD蛋白为由序列2所示的氨基酸序列组成的多肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述催化反应的条件为37℃反应2h；或，所述催化反应所需的pH值为pH7.4。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述催化所在的体系包括NADPH、ATP、MgCl2、甲酸、所述stAckA蛋白和所述ASD蛋白。
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