JP2017070285A - 2,4−ジヒドロキシ酪酸の生成の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
−基質(リンゴ酸、4−ホスホ−リンゴ酸もしくはリンゴ酸−4−セミアルデヒド)を使用することができなかった、および/または
−反応の生成物(4−ホスホ−リンゴ酸もしくはリンゴ酸−4−セミアルデヒドもしくはDHB)を、少なくとも3倍低い最大比速度で合成するものであった、および/または−リンゴ酸、4−ホスホ−リンゴ酸もしくはリンゴ酸−4−セミアルデヒドへの少なくとも3倍低い親和性を有していた、および/または
−天然基質(アスパラギン酸、4−ホスホ−アスパラギン酸、アスパラギン酸−4−セミアルデヒド)への少なくとも3倍高い親和性を有していた
のいずれかであったことを意味する。
−AKIII−E.coliのアスパラギン酸キナーゼIII(配列番号4)、−AKI(配列番号87)E.coliのアスパラギン酸キナーゼI、
−AKII(配列番号88)−E.coliのアスパラギン酸キナーゼII、−MJ−Methanococcus jannaschii(配列番号89)、−TT−Thermus thermophilus(配列番号90)、
−CG−Corynebacterium glutamicum(配列番号91)、−AT−Arabidopsis thaliana(配列番号92)、
−SC−Saccharomyces cerevisiae(配列番号93)。
例えば、配列番号4によって表されるアスパラギン酸キナーゼのE119残基は、A.thalianaのアスパラギン酸キナーゼ(配列番号50)のE207残基またはS.cerevisiaeのアスパラギン酸キナーゼ(配列番号51)のE147残基に対応する。
−EC−E.Coli(配列番号49)、
−MJ−Methanococcus jannaschii(配列番号94)、−TT−Thermus thermophilus(配列番号95)、
−BS−Bacillus subtilis(配列番号96)、
−CG−Corynebacterium glutamicum(配列番号97)、−AT−Arabidopsis thaliana(配列番号98)、
−SC−Saccharomyces cerevisiae(配列番号99)。
alcohol dehydrogenase)、L−トレオニン−3−脱水素酵素またはホモセリン還元酵素などの、β−ヒドロキシ酸脱水素酵素に構造的および機構的に関連し得る。
N43Hをコード化する合成遺伝子の合成は、本発明の別の態様である。
限外ろ過および遠心分離を使用して、細胞を発酵培地から分離することができる。発酵培地からの細胞分離は、高い培地粘度によって、しばしば複雑化される。したがって、我々は、添加剤、例えば鉱酸またはアルカリ塩を加えて、または培養ブロスを加熱して、細胞分離を最適化することができる。
いろいろなイオン交換クロマトグラフィーの方法を、バイオマス除去の前または後のいずれかに、DHBの分離に適用することができる。それらは、生成物の等電点による生成物の分離を促進する一次の陽イオン交換樹脂の使用を含む。典型的には、樹脂に溶液を投入し、保持された生成物は、(例えば、水酸化アンモニウムを加えることによる)溶出剤におけるpHの増加に続いて別々に溶出される。固定または疑似移動床式の樹脂(fixed or simulated moving bed resins)を使用したイオン交換クロマトグラフィーの使用も可能である。種々のクロマトグラフィーのステップを、十分な生成物純度を達成するために、組み合わせる必要があり得る。それらの精製方法は、高価な結晶化ステップと比較して、より経済的であり、また最終生成物の形態に関して追加の利点および適応性を提供する。
精製プロセスは、噴霧式造粒機、噴霧式乾燥機、ドラム乾燥機、回転式乾燥機およびトンネル乾燥機などの任意の適した乾燥手段を伴ってもよい乾燥ステップも含んでもよい。濃縮されたDHB溶液は、多目的の濃縮機または薄膜蒸発機を使用して、130℃の蒸気によって、減圧下で発酵ブロスを加熱することによって得ることができる。
−(ピルビン酸脱炭酸酵素の欠失によって、)エタノールの形成を妨害することによる、S.cerevisiaeにおけるリンゴ酸生成の最適化(Zelleら、2008;Zelleら、2010)、
−乳酸の形成(例えばIdhAの欠失)、酢酸の形成(例えばpta、ackAの欠失)、エタノールの形成(例えばadhEの欠失)、ギ酸の形成(例えばpflB、focAの欠失)、ピルビン酸の酸化(例えばpoxBの欠失)、リンゴ酸の分解(maeBおよびscfAの欠失)、サクシネートの形成(例えばfrdBCの欠失)、メチルグリオキサールの形成(mgsAの欠失)を妨害することによる、E.coliにおけるサクシネートまたはリンゴ酸生成の最適化(Jantamaら、2008a;Jantamaら、2008b;Linら、2005;Sanchezら、2005a;Zhangら、2011)、
である。
ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への炭素フラックスの増加を保証する代謝操作戦略に関する非排他的な例は、
−ピルビン酸キナーゼの機能を妨害することおよびPEPカルボキシキナーゼの活性を増加させることによる、S.cerevisiaeにおけるリンゴ酸生成の最適化(Zelleら、2010)、
−天然または異種性に発現したPEPカルボキシラーゼ、PEPカルボキシキナーゼまたはピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増加させることによる、E.coliにおけるサクシネート生成の最適化(Millardら、1996;Sanchezら、2005b;Zhangら、2009)、
である。
−イソクエン酸脱水素酵素、および/またはサクシネート脱水素酵素の欠失による、コハク酸生成の最適化(Linら、2005)、
である。
したがって、DHBを他の酵素によって認識し、潜在的に分解することができる。これらの酵素は、宿主生物から同定し欠失させることができる。
例1:アスパラギン酸およびリンゴ酸キナーゼに関する、Escherichia coliおよびSaccharomyces cerevisiaeそれぞれに由来するアスパラギン酸キナーゼLysCおよびHom3の試験
アスパラギン酸キナーゼの野生型遺伝子を含有するプラスミドの構築:プラスミドpLYSCwtを、高忠実度ポリメラーゼ(high fidelity polymerase)Phusion(商標)(Finnzymes)、ならびに、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流にNdeIおよびBamHI制限部位を導入するダイレクトおよび逆方向プライマー5’CACGAGGTACATATGTCTGAAATTGTTGTCTCC3’(配列番号1)および5’CTTCCAGGGGATCCAGT−ATTTACTCAAAC3’(配列番号2)を使用して、PCRによって、lysC遺伝子を増幅することによって構築した。E.coli DH5α由来のゲノムDNAを、鋳型として使用した。PCR生成物をNdeIおよびBamHIで消化し、T4 DNAリガーゼ(Biolabs)を使用して、pET28a(Novagen)発現ベクターの対応する部位中にライゲートし、E.coli DH5α細胞に形質転換した。生じたpAKIIIwtプラスミドを単離し、DNA配列決定によって、正確な配列(配列番号3)を有する全長lysC遺伝子を含有することが示された。対応するタンパク質は、配列番号4によって表される。
アスパラギン酸(またはリンゴ酸)キナーゼ
アスパラギン酸(またはリンゴ酸)+ATP→4−ホスホ−(L)−アスパラギン酸(または4−ホスホ−(L)−リンゴ酸)+ADP
ピルビン酸キナーゼ
ADP+ホスホエノールピルビン酸→ATP+ピルビン酸
乳酸脱水素酵素
ピルビン酸+NADH→NAD++乳酸
アッセイ混合物は、50mM Hepes(pH7.5)、50mM KCl、5mM
MgCl2、0、24mM NADH、0、96mM ATP、0、96mM PEP、9μg/mLの乳酸脱水素酵素(Sigma、L2500)、12.4μg/mLピルビン酸キナーゼ(Sigma、P1506)、および適切な量の精製されたアスパラギン酸(リンゴ酸)キナーゼを含有した。反応を、50mM (L)−アスパラギン酸または(L)−リンゴ酸を加えることによって、開始した。酵素アッセイを、250μLの最終体積において、96ウェル平底のマイクロタイタープレートにおいて、30℃で行った。
反応の後、マイクロプレートリーダー(BioRad 680XR)における340nmでのNADHの特性吸収が続いた。
部位特異的な変異誘発を、表3において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対およびpLYSC_E119Gプラスミドを鋳型として使用して、行った。(pLYSC_E119Gプラスミドは、例2において記載したように、lysC遺伝子:(配列番号15)のDNA配列における以下の変化を導入することによって得た。アミノ酸配列を変化させるための点変異を、表1において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対を使用して、PCR(Phusion 1U、HF緩衝液20%(v/v)、dNTP 2.5mM、ダイレクトおよび逆方向プライマー各1μΜ、鋳型プラスミド200ng、水)によって導入した。
可能な場合、PCRによって作られたプラスミドは、変異クローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、(サイレント変異を使用して導入された)新しい制限部位を含有した。PCR生成物をDpnIによって37℃で1時間、消化して鋳型DNAを取り出し、NEB 5−アルファコンピテントE.coli細胞(NEB)に形質転換した。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、DNA配列決定によって、望ましい変異を有することを検証した。
E119Gの核酸配列は、配列番号40によって表され;その対応するアミノ酸配列は、配列番号41によって表され;(iii)位置352におけるトレオニンのイソロイシンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質LysC E119Gの核酸配列は、配列番号42によって表され;その対応するアミノ酸配列は、配列番号43によって表され;(iv)位置345におけるセリンのロイシンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質LysC E119Gの核酸配列は、配列番号44によって表され;その対応するアミノ酸配列は、配列番号45によって表される。
アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素の野生型遺伝子を含有するプラスミドの構築:プラスミドpASDwtを、高忠実度ポリメラーゼPhusion(商標)(Finnzymes)、ならびに、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流にNheIおよびBamHI制限部位を導入するダイレクトおよび逆方向プライマー5’TATAATGCTAGCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGG3’(配列番号46)および5’TATAATGGATCCTTACGCCAGTTGACGAAGC3’(配列番号47)を使用して、PCRによって、E.coliのasd遺伝子を増幅することによって構築した。E.coli DH5α由来のゲノムDNAを、鋳型として使用した。PCR生成物をNheIおよびBamHIで消化し、T4 DNAリガーゼ(Biolabs)を使用して、pET28a(Novagen)発現ベクターの対応する部位中にライゲートし、E.coli DH5α細胞に形質転換した。生じたpASDwtプラスミドを単離し、DNA配列決定によって、正確な配列(配列番号48)を有する全長asd遺伝子を含有することが示された。前記酵素の対応するアミノ酸配列は、配列番号49によって表される。
アッセイ混合物は、200mM Hepes(pH9)、50mM K2HPO4、0、25mM NADPを含有した。反応を、(L)−アスパラギン酸セミアルデヒドまたは(L)−リンゴ酸セミアルデヒドを加えることによって、開始した。(L)−アスパラギン酸セミアルデヒドを、ホモセリン脱水素酵素およびアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素の酵素試験に適した基質である、(分解を防ぐためにpH3で維持した)L−アスパラギン酸β−セミアルデヒド水和物トリフルオロ酢酸(L−aspartic acid β−semialdehyde hydrate trifluoroacetate)の形で加えた(Robertsら、2003)。不安定なリンゴ酸セミアルデヒドを、安定なリンゴ酸セミアルデヒド誘導体2−[(4S)−2,2−ジメチル−5−オキソ−1,3−ジオキソラン−4−イル]アセトアルデヒド(DMODA)の脱保護によって、酵素試験に先立って、新たに作製した。DMODAを2M塩酸において25℃で15分間インキュベートし、遊離したアセトンの蒸発(35℃、50mbar)によって、リンゴ酸セミアルデヒドを得た。リンゴ酸セミアルデヒド溶液のpHは、重炭酸ナトリウムを使用して、3で固定した。
680XR)における340nmでのNADPHの特性吸収が続いた。
グルタメート241が、アラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニンまたはグルタミンによって置き換えられた、Asd変異体は、野生型酵素より著しく高い最大比活性で、(L)−アスパラギン酸−4−セミアルデヒドを4−ホスホ−(L)−アスパラギン酸に酸化した。二重変異体Asd E241Q T136N(配列番号231)は、0.25μmol/(min*mgprot)の最大比活性および0.25mMのKmを有した。
適した2,4 DHB脱水素酵素を同定するために、種々の生物学的源由来のベータ−ヒドロキシ酸脱水素酵素を、リンゴ酸セミアルデヒドを還元するそれらの能力に関して試験した。試験した酵素の中に、Saccharomyces cerevisiae由来のメチルブチルアルデヒド還元酵素、Ypr1(Ford&Ellis、2002))(配列番号73および配列番号74);およびMetallosphaera sedula由来のコハク酸セミアルデヒド還元酵素、Ms−Ssr(Kockelkorn&Fuchs、2009)(配列番号75および配列番号76)があった。遺伝子YPR1およびMs−SSRを、表6において一覧表にしたプライマーを使用して増幅し、ベクターpET28(制限酵素表3を参照)中にクローニングし、それぞれ、プラスミドpYPR1およびpMs−SSRをもたらした。例1において記載したように、タンパク質を発現させ精製した。
反応:
(L)−リンゴ酸セミアルデヒド+NAD(P)H→(L)−2,4−ジヒドロキシ酪酸+NAD(P)
アッセイ混合物は、200mM Hepes(pH7.5)、50mM KCl、5mM MgCl2)0、24mM NADHまたはNADPH、および適切な量の精製された酵素を含有した。反応を、10mM(L)−リンゴ酸セミアルデヒドを加えることによって、開始した(リンゴ酸セミアルデヒドは各試験のために新たに調製した、例4を参照)。酵素アッセイを、250μLの最終体積において、96ウェル平底のマイクロタイタープレートにおいて30℃で行った。反応の後、マイクロプレートリーダー(BioRad 680XR)における340nmでのNAD(P)Hの特性吸収が続いた。結果を、表7において一覧表にする。
部位特異的な変異誘発を、表8において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対およびpMs−SSRプラスミドを鋳型として使用して行った。アミノ酸配列を変化させるための点変異を、PCR(Phusion 1U、HF緩衝液20%(v/v)、dNTP 2.5mM、ダイレクトおよび逆方向プライマー各1μΜ、鋳型プラスミド200ng、水)によって導入した。可能な場合、PCRによって作られたプラスミドは、変異クローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、(サイレント変異を使用して導入された)新しい制限部位を含有した。PCR生成物をDpnIによって37℃で1時間消化して鋳型DNAを取り出し、NEB 5−アルファコンピテントE.coli細胞(NEB)に形質転換した。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、DNA配列決定によって、望ましい変異を有することを検証した。表9は、変異体の動態パラメーターを要約したものである。結果は、二重変異体Ms−SSR H39R N43H(配列番号81、配列番号82)が、野生型酵素と比較した場合、リンゴ酸セミアルデヒドへの親和性を改善したことを実証している。
酵素リンゴ酸キナーゼ(LysC E119G、配列番号15)、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素(Asd E241Q;配列番号67)、およびリンゴ酸セミアルデヒド還元酵素(Ms SSrR、配列番号76)を、例1において記載したように発現させ精製した。50mMリンゴ酸を、50mM Hepes(pH7.5)、50mM KCl、5mM MgCl2、1mM NADPH、180μg/mLのリンゴ酸キナーゼ(Lys E119G)、325μg/mLのリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素(Asd E241Q)、および130μg/mLのリンゴ酸セミアルデヒド還元酵素(Ms_Ssr)(反応A)を含有する反応混合物に加えることによって、DHBの生成をインビトロで実証した。対照反応は、すべての成分を含有したが、リンゴ酸セミアルデヒド還元酵素(反応B)またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素(反応C)のいずれかを欠いていた。30℃でのインキュベーションの30分後、反応混合物を、ガスクロマトグラフィー[CPG Varian Series 430;FID検出器を備えた;オートサンプラーCP8400;スプリットレスインジェクター(splitless injector)1177(230℃);カラム:CP−WAX58/FFAP、30m×0.53mm、df0.50μm;およびライナー:Inlet Sleeve、グースネック6.5×78.5×4mm GWOL(Varian)によって分析した。キャリアーガスは、25mL/minの流速で、窒素であった。水素炎イオン化を、空気−水素混合物(流速は、それぞれ、300mL/minおよび30mL/minであった)を使用して、行った。検出器温度は、240℃であった。注入された試料体積は、1μLであった。温度プログラムを、表10において規定する。
DH5α細胞に形質転換した。生じたpET28−DHBプラスミド(配列番号229)を単離し、DNA配列決定によって、正確な配列を有することが示された。
いくつかの遺伝子を、DHB生成のための炭素フラックス再分割および補助因子供給を最適化するために、E.coli株MG1655において破壊した。遺伝子欠失を、Datsenkoらによるラムダredリコンビナーゼ法(lambda red recombinase method)(Datsenko&Wanner、2000)を使用して行った。
株および培養条件:プラスミドpTAC−DHB(例11を参照)由来の、リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素およびDHB脱水素酵素を同時発現する株E.coli ECE1、および空のプラスミド(すなわち上記酵素のコード配列を有さないpTAC主鎖)のみを含有する同質遺伝子型対照株で、実験を行った。1リットル培養培地は、20gグルコース、18g Na2HPO4*12H2O、3g KH2PO4、0.5g NaCl、2g NH4Cl、0.5g MgSO4*7H2O、0.015 CaCl2*2H2O、100倍希釈した濃縮したHClにおいて調製した1mLの0.06mol/L FeCl3保存液、2mLの10mM チアミンHCl保存液、20g MOPS、50μg硫酸カナマイシン、および1mLの微量元素溶液(1リットル当たり:0.04g Na2EDTA*2H2O、0.18g CoCl2*6H2O、ZnSO4*7H2O、0.04g Na2MoO4*2H2O、0.01g H3BO3、0.12g MnSO4*H2O、0.12g CuCl2*H2Oを含有する)を含有した。pHを7に調整し、培地をフィルター滅菌した。すべての培養を、170rpmで運転しているInfors回転振とう機上で、37℃で行った。一晩培養物(試験管における3mL培地)を、グリセロールストックから播種し、500mL振とうフラスコにおいて培養した100mL増殖培養物における0.05の最初のOD600を調整するために使用した。増殖培養物におけるOD600が0.2に達した際、IPTGを1mmol/Lの濃度で加えた。
移動層は、88%の0.08%テトラ−n−ブチルアンモニウムヒドロキシド溶液、および12%アセトニトリルの混合物であった。流速を0.4mL/minで固定した。試料の注入体積は、5μLであった。
株E.coli ECE1および対照株の培養培地のDHB含有量を、IPTGの追加によって、リンゴ酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびDHB脱水素酵素の発現を誘導した後、8時間および24時間で推定した。表16において参照することができるように、DHB経路酵素を発現した株ECE1は、対照株よりも著しく高い量のDHBを生成し、これは、図1(i)において示した代謝経路を通してのDHBの発酵による生成の可能性を実証している。
株E.coli ECE1および対照株の培養培地のDHB含有量を、IPTGの追加によって、リンゴ酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびDHB脱水素酵素の発現を誘導した後、8時間および24時間で推定した。表16において参照することができるように、DHB経路酵素を発現した株ECE1は、対照株よりも著しく高い量のDHBを生成し、これは、図1(i)において示した代謝経路を通してのDHBの発酵による生成の可能性を実証している。
[1]
2,4−ジヒドロキシ酪酸(2,4−DHB)を生成する方法であって、
リンゴ酸キナーゼを使用して、リンゴ酸を4−ホスホ−リンゴ酸に変換する第1のステップ、
リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素を使用して、4−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−4−セミアルデヒドに変換する第2のステップ、
DHB脱水素酵素を使用して、リンゴ酸−4−セミアルデヒドを2,4−DHBに変換する第3のステップ
を含む方法。
[2]
前記リンゴ酸キナーゼが、酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および/または基質親和性を改善する、[1]に記載の方法。
[3]
前記リンゴ酸キナーゼが、アスパラギン酸キナーゼである、[2]に記載の方法。
[4]
前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S39、T45、V115、E119、F154および/またはS201の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、[3]に記載の方法。
[5]
前記変異アスパラギン酸キナーゼが、以下のアミノ酸:E250、M318、S321、V339、S338、F324、L325、V339、S345、E346、D340、T344および/またはT352に、少なくとも1つの変異を含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、[4]に記載の方法。
[6]
前記リンゴ酸キナーゼが、配列番号9、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号39、配列番号41、配列番号43または配列番号45によって表される、[1]から[5]の何れか1に記載の方法。
[7]
前記リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素が、酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、4−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、[1]から[6]の何れか1に記載の方法。
[8]
前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、[7]に記載の方法。
[9]
前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:T136、Q162、I230、E241および/またはH274の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、[8]に記載の方法。
[10]
配列番号68、より明確には配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64もしくは配列番号66または配列番号231によって表される、[9]に記載の方法。
[11]
前記DHB脱水素酵素が、タルトロン酸セミアルデヒド還元酵素、コハク酸セミアルデヒド還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素、メチルブチルアルデヒド還元酵素、亜鉛型アルコール脱水素酵素、L−トレオニン−3−脱水素酵素またはホモセリン還元酵素といったβ−ヒドロキシ酸脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、[1]から[10]の何れか1に記載の方法。
[12]
前記DHB脱水素酵素が、酵素の少なくとも1つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸−4−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、[11]に記載の方法。
[13]
前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S40、N43、H39、T49、F85、Q108、L281および/またはN305の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、[12]に記載の方法。
[14]
配列番号74、配列番号76または配列番号81、配列番号225または配列番号227によって表される、[11]から[13]に記載の方法。
[15]
リンゴ酸を4−ホスホ−リンゴ酸に変換することを特徴とする、リンゴ酸キナーゼ。
[16]
酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および/または基質親和性を改善する、[15]に記載のリンゴ酸キナーゼ。
[17]
前記酵素が、アスパラギン酸キナーゼである、[16]に記載のリンゴ酸キナーゼ。
[18]
前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S39、T45、V115、E119、F154および/またはS201の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、[17]に記載のリンゴ酸キナーゼ。
[19]
配列番号9、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26によって表される、[88]に記載のリンゴ酸キナーゼ。
[20]
リシン阻害に対して非感受性であり、以下のアミノ酸:E250、M318、S321、V339、S338、F324、L325、V339、S345、E346、D340、T344および/またはT352に、少なくとも1つの変異をさらに含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、[18]または[19]に記載のリンゴ酸キナーゼ。
[21]
配列番号39、配列番号41、配列番号43または配列番号45によって表される、[20]に記載のリンゴ酸キナーゼ。
[22]
4−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−4−セミアルデヒドに変換することを特徴とする、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
[23]
酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、4−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、[22]に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
[24]
前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、[22]または[23]に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
[25]
前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:T136、Q162、I230、E241および/またはH274の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、[24]に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
[26]
配列番号68、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66または配列番号231によって表される、[24]に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
[27]
リンゴ酸−4−セミアルデヒドを2,4−DHBに変換することを特徴とする、DHB脱水素酵素。
[28]
β−ヒドロキシ−脱水素酵素またはホモセリン脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、[27]に記載のDHB脱水素酵素。
[29]
酵素の少なくとも1つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸−4−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、[27]または[28]に記載のDHB脱水素酵素。
[30]
前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S40、N43、H39、T49、F85、Q108、L281および/またはN305の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、[29]に記載のDHB脱水素酵素。
[31]
配列番号81、配列番号225または配列番号227によって表される、[30]に記載のDHB脱水素酵素。
[32]
[15]から[21]の何れか1に記載のリンゴ酸キナーゼをコードする、単離された核酸配列。
[33]
配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号38、配列番号40、配列番号42または配列番号44によって表される、[32]に記載の単離された核酸。
[34]
[12]から[16]の何れか1に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。
[35]
配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、または配列番号230によって表される、[34]に記載の単離された核酸。
[36]
[27]から[31]の何れか1に記載のDHB脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。
[37]
配列番号82、配列番号224、配列番号226または配列番号228によって表される、[36]に記載の単離された核酸。
[38]
転写の方向に、機能的に連結した、宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、[22]から[27]の何れか1に記載の少なくとも1つの核酸配列および前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列を少なくとも含む、キメラ遺伝子。
[39]
転写の方向に、機能的に連結した、
宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、
[22]または[23]に記載の核酸配列、
[24]または[25]に記載の核酸配列、
[26]もしくは[27]に記載の、または配列番号73もしくは配列番号75もしくは配列番号82によって表される核酸配列、および
前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列
を含む、[38]に記載のキメラ遺伝子。
[40]
配列番号229によって表される、[39]に記載のキメラ遺伝子。
[41]
[32]から[37]のいずれか1に記載の核酸または[38]から[40]に記載のキメラ遺伝子を含む、発現ベクター。
[42]
リンゴ酸キナーゼ、および/またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素および/またはDHB脱水素酵素を発現する、宿主微生物。
[43]
[32]から[37]に記載の核酸の少なくとも1つで、[38]または[39]に記載のキメラ遺伝子の少なくとも1つで、および/または[31]に記載の発現ベクターの少なくとも1つで形質転換された、[42]に記載の宿主微生物。
[44]
細菌、酵母または真菌である、[42]または[43]に記載の宿主微生物。
[45]
Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Corynebacterium glutamicum、Zygosaccharomyces rouxiiまたはAspergillus flavusの中からより詳細には選択される、[44]に記載の宿主微生物。
[46]
Escherichia coliであり、表12において一覧表にした遺伝子の少なくとも1つにおける破壊をさらに含むおよび/または表14において一覧表にした遺伝子の少なくとも1つを過剰発現する、[45]に記載の宿主生物。
[47]
リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素およびDHB脱水素酵素を発現する[42]から[46]の何れか1に記載の宿主微生物を培養するステップを含む、2,4−DHBの生成の方法。
[48]
前記宿主生物が、リンゴ酸または別の有機酸、例えばピルビン酸、サクシネートまたはフマル酸が加えられた培地において培養される、請[47]に記載の2,4−DHBの生成の方法。
[49]
前記培養培地が、別の炭素源をさらに含む、[48]に記載の方法。
[50]
リンゴ酸を過剰生成する微生物による、リンゴ酸または他の有機酸の生成である第1のステップを含む、2,4 DHBの生成の方法。
[51]
リンゴ酸−4−セミアルデヒドを2,4−DHBに変換するための、メチルブチルアルデヒド還元酵素またはコハク酸セミアルデヒド還元酵素の使用。
[52]
前記メチルブチルアルデヒド還元酵素が、配列番号74によって表される、[51]に記載の使用。
[53]
コハク酸セミアルデヒド還元酵素が、配列番号76、配列番号81または配列番号;225もしくは配列番号227によって表される、[51]に記載の使用。
[54]
リンゴ酸を4−ホスホ−リンゴ酸に変換するための、[15]から[21]の何れか1項に記載のリンゴ酸キナーゼの使用。
[55]
4−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−4−セミアルデヒドに変換するための、[22]から[26]の何れか1に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素の使用。
[56]
4−ホスホ−リンゴ酸。
Claims (56)
- 2,4−ジヒドロキシ酪酸(2,4−DHB)を生成する方法であって、
リンゴ酸キナーゼを使用して、リンゴ酸を4−ホスホ−リンゴ酸に変換する第1のステップ、
リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素を使用して、4−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−4−セミアルデヒドに変換する第2のステップ、
DHB脱水素酵素を使用して、リンゴ酸−4−セミアルデヒドを2,4−DHBに変換する第3のステップ
を含む方法。 - 前記リンゴ酸キナーゼが、酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および/または基質親和性を改善する、請求項1に記載の方法。
- 前記リンゴ酸キナーゼが、アスパラギン酸キナーゼである、請求項2に記載の方法。
- 前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S39、T45、V115、E119、F154および/またはS201の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項3に記載の方法。
- 前記変異アスパラギン酸キナーゼが、以下のアミノ酸:E250、M318、S321、V339、S338、F324、L325、V339、S345、E346、D340、T344および/またはT352に、少なくとも1つの変異を含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項4に記載の方法。
- 前記リンゴ酸キナーゼが、配列番号9、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号39、配列番号41、配列番号43または配列番号45によって表される、請求項1から5の何れか1項に記載の方法。
- 前記リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素が、酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、4−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、請求項1から6の何れか1項に記載の方法。
- 前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項7に記載の方法。
- 前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:T136、Q162、I230、E241および/またはH274の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項8に記載の方法。
- 配列番号68、より明確には配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64もしくは配列番号66または配列番号231によって表される、請求項9に記載の方法。
- 前記DHB脱水素酵素が、タルトロン酸セミアルデヒド還元酵素、コハク酸セミアルデヒド還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素、メチルブチルアルデヒド還元酵素、亜鉛型アルコール脱水素酵素、L−トレオニン−3−脱水素酵素またはホモセリン還元酵素といったβ−ヒドロキシ酸脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、請求項1から10の何れか1項に記載の方法。
- 前記DHB脱水素酵素が、酵素の少なくとも1つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸−4−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、請求項11に記載の方法。
- 前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S40、N43、H39、T49、F85、Q108、L281および/またはN305の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項12に記載の方法。
- 配列番号74、配列番号76または配列番号81、配列番号225または配列番号227によって表される、請求項11から13に記載の方法。
- リンゴ酸を4−ホスホ−リンゴ酸に変換することを特徴とする、リンゴ酸キナーゼ。
- 酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および/または基質親和性を改善する、請求項15に記載のリンゴ酸キナーゼ。
- 前記酵素が、アスパラギン酸キナーゼである、請求項16に記載のリンゴ酸キナーゼ。
- 前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S39、T45、V115、E119、F154および/またはS201の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項17に記載のリンゴ酸キナーゼ。
- 配列番号9、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26によって表される、請求項88に記載のリンゴ酸キナーゼ。
- リシン阻害に対して非感受性であり、以下のアミノ酸:E250、M318、S321、V339、S338、F324、L325、V339、S345、E346、D340、T344および/またはT352に、少なくとも1つの変異をさらに含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項18または19に記載のリンゴ酸キナーゼ。
- 配列番号39、配列番号41、配列番号43または配列番号45によって表される、請求項20に記載のリンゴ酸キナーゼ。
- 4−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−4−セミアルデヒドに変換することを特徴とする、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
- 酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、4−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、請求項22に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
- 前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項22または23に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
- 前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:T136、Q162、I230、E241および/またはH274の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項24に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
- 配列番号68、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66または配列番号231によって表される、請求項24に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
- リンゴ酸−4−セミアルデヒドを2,4−DHBに変換することを特徴とする、DHB脱水素酵素。
- β−ヒドロキシ−脱水素酵素またはホモセリン脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、請求項27に記載のDHB脱水素酵素。
- 酵素の少なくとも1つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸−4−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、請求項27または28に記載のDHB脱水素酵素。
- 前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S40、N43、H39、T49、F85、Q108、L281および/またはN305の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項29に記載のDHB脱水素酵素。
- 配列番号81、配列番号225または配列番号227によって表される、請求項30に記載のDHB脱水素酵素。
- 請求項15から21の何れか1項に記載のリンゴ酸キナーゼをコードする、単離された核酸配列。
- 配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号38、配列番号40、配列番号42または配列番号44によって表される、請求項32に記載の単離された核酸。
- 請求項12から16の何れか1項に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。
- 配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、または配列番号230によって表される、請求項34に記載の単離された核酸。
- 請求項27から31の何れか1項に記載のDHB脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。
- 配列番号82、配列番号224、配列番号226または配列番号228によって表される、請求項36に記載の単離された核酸。
- 転写の方向に、機能的に連結した、宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、請求項22から27の何れか1項に記載の少なくとも1つの核酸配列および前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列を少なくとも含む、キメラ遺伝子。
- 転写の方向に、機能的に連結した、
宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、
請求項22または23に記載の核酸配列、
請求項24または25に記載の核酸配列、
請求項26もしくは27に記載の、または配列番号73もしくは配列番号75もしくは配列番号82によって表される核酸配列、および
前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列
を含む、請求項38に記載のキメラ遺伝子。 - 配列番号229によって表される、請求項39に記載のキメラ遺伝子。
- 請求項32から37のいずれか1項に記載の核酸または請求項38から40に記載のキメラ遺伝子を含む、発現ベクター。
- リンゴ酸キナーゼ、および/またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素および/またはDHB脱水素酵素を発現する、宿主微生物。
- 請求項32から37に記載の核酸の少なくとも1つで、請求項38または39に記載のキメラ遺伝子の少なくとも1つで、および/または請求項31に記載の発現ベクターの少なくとも1つで形質転換された、請求項42に記載の宿主微生物。
- 細菌、酵母または真菌である、請求項42または43に記載の宿主微生物。
- Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Corynebacterium glutamicum、Zygosaccharomyces rouxiiまたはAspergillus flavusの中からより詳細には選択される、請求項44に記載の宿主微生物。
- Escherichia coliであり、表12において一覧表にした遺伝子の少なくとも1つにおける破壊をさらに含むおよび/または表14において一覧表にした遺伝子の少なくとも1つを過剰発現する、請求項45に記載の宿主生物。
- リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素およびDHB脱水素酵素を発現する請求項42から46の何れか1項に記載の宿主微生物を培養するステップを含む、2,4−DHBの生成の方法。
- 前記宿主生物が、リンゴ酸または別の有機酸、例えばピルビン酸、サクシネートまたはフマル酸が加えられた培地において培養される、請求項47に記載の2,4−DHBの生成の方法。
- 前記培養培地が、別の炭素源をさらに含む、請求項48に記載の方法。
- リンゴ酸を過剰生成する微生物による、リンゴ酸または他の有機酸の生成である第1のステップを含む、2,4 DHBの生成の方法。
- リンゴ酸−4−セミアルデヒドを2,4−DHBに変換するための、メチルブチルアルデヒド還元酵素またはコハク酸セミアルデヒド還元酵素の使用。
- 前記メチルブチルアルデヒド還元酵素が、配列番号74によって表される、請求項51に記載の使用。
- コハク酸セミアルデヒド還元酵素が、配列番号76、配列番号81または配列番号;225もしくは配列番号227によって表される、請求項51に記載の使用。
- リンゴ酸を4−ホスホ−リンゴ酸に変換するための、請求項15から21の何れか1項に記載のリンゴ酸キナーゼの使用。
- 4−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−4−セミアルデヒドに変換するための、請求項22から26の何れか1項に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素の使用。
- 4−ホスホ−リンゴ酸。
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