TWI609083B - Blood coagulation reaction assessment method - Google Patents
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Description
本發明係關於藉由具有第Ⅷ凝血因子(FⅧ)機能替代活性的物質評估血液凝固反應之方法。本發明亦關於用於評估含有活性化第XI凝血因子(FXIa)的血液凝固反應之藥劑以及藉由含有該藥劑之具有第Ⅷ凝血因子(FⅧ)機能替代活性之物質評估血液凝固反應之套組等。
血友病為起因於第Ⅷ凝血因子(FⅧ)或第Ⅸ凝血因子(FⅨ)先天性缺乏或機能不全的出血性疾病。前者稱為血友病A,後者為血友病B。因其所有的基因均存在於X染色體上,使基因異常以性聯隱性遺傳傳遞,因此發病的患者99%以上為男性。盛行率約為出生男童每1萬人為1人,血友病A與血友病B之比例,已知約為5:1。
血友病患者主要之出血部位在如關節內、肌肉內、皮下、口腔內、頭蓋內、消化管、鼻腔內等。其中在關節內反複出血,會再擴大而伴隨關節損傷、步行困難的血友病性關節炎,亦有最終須關節置換手術之情形。因此,成為血友病患者QOL降低之大要因。
血友病之疾病嚴重度與血液中FⅧ活性或FⅨ活性密切相關。活性未滿1%之患者分類為重症,活性為1%以上未
達5%之患者為中等症,活性為5%以上未達40%之患者為輕症。在占血友病患者約半數之重症患者中,會呈月中數次出血之症狀,此與中等症患者及輕症患者比較,顯著為高頻度。因此,在重症血友病患者中,以FⅧ或FⅨ作補充療法,維持血液中FⅧ活性或FⅨ活性在1%以上,應該可有效阻止出血症狀出現(非專利文獻1)。
相關的出血異常症,除血友病、後天性血友病之外,亦有已知起因於馮威理氏因子(vWF)(von Willebrand factor)之機能異常或缺損的馮威理氏病。vWF,血小板不只需要正常地黏著在血管壁損傷部位內皮下組織中,而且,還必須與FⅧ形成複合體,正常地維持血液中FⅧ濃度。在馮威理氏病患者中,這些機能會降低,因此造成止血機能異常。
在預防及/或治療血友病患者之出血方面,主要使用由血漿精製或以基因重組技術所製作的凝血因子。
監測FⅧ等凝血因子藥效之方法方面,已知有活性化部分凝血酶原激酶時間(APTT)(activated partial thromboplastin time)、依據APTT之一段式凝血酶原時間法(one step prothrombin time)、凝血酶生成試驗(TGA)(thrombin generation assay)等。APTT及一段式凝血酶原時間法係已往以來廣泛使用之FⅧ藥劑藥效的監測法。APTT係在檢測血漿中加入APTT製劑後,再添加CaCl2,之後測定血纖維蛋白原轉換為不溶性血纖維蛋白之時間,亦即測定至開始凝血的時間之方法。一段式凝血酶原時間法係將以固定比例稀釋在緩衝溶液中的檢測血漿添加在缺少FⅧ之血漿中,以如
APTT相同之操作法測定凝血時間的方法,並由取代檢測血漿而使用階段稀釋的正常血漿所得之檢量曲線,求出檢測血漿的FⅧ活性。TGA係使用對凝血酶之螢光基質,再以酵素活性在經時測定凝血反應升高中所生成之凝血酶量的試驗(非專利文獻2)。TGA可由凝血反應在凝血酶開始生成階段,至凝血反應擴增時凝血酶生成為止連續地評估凝血反應。再者,對於TGA用的凝血開始藥劑方面,已有報告以低濃度之磷脂溶液(4μM)為主劑,組合低濃度組織因子之藥劑(非專利文獻2)、組合FⅨa之藥劑(非專利文獻3、4)、組合FXⅡ活化劑(ellagic acid)之藥劑(非專利文獻5)、組合低濃度組織因子與FXⅡ活化劑(ellagic acid)的混合溶液之藥劑(非專利文獻5)。
近來,已發現可與活化第Ⅸ凝血因子(FⅨa)及第X凝血因子(FX)雙方結合,而有替代FⅧ輔因子機能,亦即以FⅨa促進FX活化之機能的雙特異性抗體(專利文獻1至3)。然而,此種雙特異性抗體雖然可替代FⅧ之機能,但其作用的表現機制與FⅧ本身並不完全相同。例如,FⅧ係在由FXa及凝血酶活化後開始表現輔因子之活性,但上述雙特異性抗體,並不須此種活化程序,即可表現輔因子之活性。因此,以現有之FⅧ藥效監測方法未必可以適用。
非專利文獻
【非專利文獻1】Astermark J. Haemophilia., 2003, 9(Suppl. 1) 32
【非專利文獻2】Pathophysiol. Haemost. Thromb., 2003,
33(1): 4
【非專利文獻3】J. Thromb. Haemost., 2011 Aug, 9(8): 1549-55
【非專利文獻4】J. Thromb. Haemost., 2003 May, 1(5): 1005-11
【非專利文獻5】Int. J. Hematol., 2009 Dec, 90(5): 576-82
專利文獻
【專利文獻1】WO 2005/035756
【專利文獻2】WO 2006/109592
【專利文獻3】WO 2012/067176
本發明係鑑於此狀況而進行。本發明之目的,在提供評估具有第Ⅷ凝血因子(FⅧ)替代活性之物質在血液凝固反應中的藥效之方法、該方法中所使用之血液凝固起始藥劑、及含該藥劑之套組。
本發明人等為解決上述問題,以各種止血效果之評估方法並以各種血液凝固起始藥劑為對象,以具有第Ⅷ凝血因子(FⅧ)替代活性之物質嘗試建立血液凝固反應的評估方法。結果本發明人等發現,使用含活性化第XI凝血因子(FXIa)之血液凝固起始藥劑者,以血液樣品中之凝血酶(thrombin)生成量為指標,對在血液凝固反應中具有第Ⅷ凝血因子(FⅧ)
替代活性的物質在血液凝固反應中之效果,可以適當的感度評估。又本發明人等亦成功地發現使用含活性化第XI凝血因子(FXIa)之血液凝固起始藥劑的凝血酶生成試驗方法。本發明即根據此發現,關於以下〔1〕至〔9〕。
〔1〕一種藉由具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質評估血液凝固反應之方法,其中該方法包含步驟(i)及(ii):(i)於含有具第Ⅷ凝血因子替代活性的物質之來自受試者所分離之血液來源樣品中,加入含有活性化第XI凝血因子之血液凝固起始藥劑的步驟;及(ii)測定步驟(i)所得之血液來源樣品之凝血酶(thrombin)生成量的步驟。
〔2〕如〔1〕項中記載之方法,其中具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質為結合於第Ⅸ凝血因子或活性化第Ⅸ凝血因子、及第X凝血因子之雙特異性抗體。
〔3〕如〔1〕或〔2〕項中記載之方法,其中受試者為出血性疾病患者。
〔4〕如〔3〕項中記載之方法,其中出血性疾病為原因為以第Ⅷ凝血因子或活性化第Ⅷ凝血因子的活性減低或缺損為原因的疾病。
〔5〕如〔3〕或〔4〕項中記載之方法,其中出血性疾病為選自由血友病、後天性血友病、及起因於馮威理氏因子(vWF)機能異常或缺損的馮威理氏病所組成之群組之疾病。
〔6〕如〔1〕至〔5〕項之任一項中記載之方法,其中血液凝固起始藥劑為含有活性化第XI凝血因子及磷脂之藥劑。
〔7〕一種用於如〔1〕至〔6〕項之任一項中記載之方法的血液凝固起始藥劑,其包含活性化第XI凝血因子。
〔8〕如〔7〕項中記載之血液凝固起始藥劑,其更包含磷脂。
〔9〕一種用於如〔1〕至〔6〕項之任一項中記載之方法的套組,其包含如〔7〕或〔8〕項中記載之血液凝固起始藥劑。
本發明提供以來自於血液樣品之凝血酶生成量為指標,藉由含有第Ⅷ凝血因子替代活性的物質評估血液凝固反應之方法。藉由含有第Ⅷ凝血因子替代活性的物質,特別是結合於第Ⅸ凝血因子或活性化第Ⅸ凝血因子、及第X凝血因子之雙特異性抗體的輔因子活性之表現機制,與經由第Ⅷ凝血因子本身的輔因子活性之表現機制不完全相同。因此,在以雙特異性抗體治療血友病等出血性疾病中,廣泛使用的藥效評估方法並不一定適用,有雙特異性抗體之效果無法適當地評估的可能。但根據本發明,在以上述雙特異性抗體治療出血性疾病中,亦可以高靈敏度評估其效果。
第1圖顯示以結合於活性化第Ⅸ凝血因子及第X凝血因子之雙特異性抗體之一的hBS23之FⅧ機能替代活性。hBS23,在FIXa/FX/磷脂存在下,顯示促進FXa產生的活性。
第2圖顯示在缺乏FⅧ的血漿、或保有抑制因子之缺乏FⅧ血漿之凝血酶生成試驗的參數(最大凝血酶量(Peak height)
(A)及總凝血酶量(ETP)(B))中,hBS23及基因重組人類第Ⅷ凝血因子(rhFⅧ)之效果。各批血漿係由已確定為重症血友病A(Plasma 1、2、3)或保有抑制因子之重症血友病A(Plasma with inhibitor 1、2)的單一提供者所得到。抑制因子的力價,在Plasma with inhibitor 1、2中各為292、148貝塞斯達單位(Bethesda unit)。hBS23,在缺乏FⅧ血漿及保有抑制因子之缺乏FⅧ血漿中,以FXIa/磷脂藥劑誘發之條件下,最大凝血酶量(Peak height)及總凝血酶量(ETP)以濃度依存性上升。
發明之實施形態
本發明關於包含以下步驟(i)及(ii)之藉由含有第Ⅷ凝血因子替代活性的物質評估血液凝固反應之方法。
(i)於含有具第Ⅷ凝血因子替代活性的物質之來自受試者所分離之血液來源樣品中,加入含有活性化第XI凝血因子之血液凝固起始藥劑的步驟;及(ii)測定步驟(i)所得之來自血液來源樣品之凝血酶(thrombin)生成量的步驟。
使用本發明之方法,可藉由含有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質適當地評估輔因子活性。特別是,與先前以來廣泛使用作為凝血因子藥效監測方法的活性化部分凝血酶原激酶時間(APTT)值所使用之方法、及以含低濃度組織因子之血液凝固起始藥劑誘發之凝血酶生成試驗比較,應該可以適當之感度監測止血效果。
本發明之「藉由具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質評估血液凝固反應之方法」,可稱為「藉由具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質評估輔因子活性之方法」。也可稱為「藉由具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質評估出血性疾病之治療效果的方法」。或者,也可稱為「藉由具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質評估出血性疾病之預防效果的方法」。有「評估方法」也可表現為「判定方法」、「測定方法」。
第Ⅷ凝血因子係關於血液凝固之一連串分子的1種,受到凝血酶及活性化第X凝血因子活化,呈現輔因子活性,經由活性化第Ⅸ凝血因子促使第X凝血因子活性化反應。本發明之具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質,在經由活性化第Ⅸ凝血因子促進第X凝血因子活性化之點上,與第Ⅷ凝血因子相同,但是,例如在不需藉由凝血酶及活化第X凝血因子而活性化之點上,則與第Ⅷ凝血因子不同。
本發明之具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質,也可稱為具有類第Ⅷ凝血因子活性之物質。本發明中之「替代第Ⅷ凝血因子之機能」,意指第Ⅸ凝血因子(FⅨ)或第Ⅸa凝血因子(FⅨa)、及辨識第X凝血因子(FX)、經FⅨa促進FX活性化(以FⅨa促進FXa產生)。促進FXa產生的活性,可如以由FⅨa、FX、合成基質S-2222(FXa之合成基質)、磷脂所構成之測定系統評估。此測定系統顯示血友病A病例中疾病嚴重度與臨床症狀有相關性(Rosen S.Andersson M.Blomback M.et.al.,Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FⅧ activity.Thromb.
Haemost.1985,54:811-23)。
本發明所載具有替代第Ⅷ凝血因子機能之活性的物質之較佳樣態,可例舉如結合於第Ⅸ凝血因子或活性化第Ⅸ凝血因子、及第X凝血因子之雙特異性抗體。這類抗體可依照WO 2005/035756、WO 2006/109592、WO 2012/067176等所載之方法而得到。具體言之,可基於對第Ⅸ凝血因子及/或活化第Ⅸ凝血因子之抗體及對第X凝血因子之抗體的序列,使用本技術領域公知之基因重組技術,製作抗體。即依照對第Ⅸ凝血因子及/或活性化第Ⅸ凝血因子之抗體及對第X凝血因子之抗體的序列建構編碼抗體的多核苷酸,將其導入表現載體後,以適當宿主細胞表現(可參照如:Co,M.S.et.al.,J.Immunol.,(1994)152,2968-2976;Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.,(1989)178,476-496;Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.,(1989)178,497-515;Lamoyi,E.,Methods Enzymol.,(1986)121,652-663;Rousseaux,J.et.al.,Methods Enzymol.,(1986)121,663-669;Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.,(1991)9,132-137)。
本發明之雙特異性抗體,可由宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離,實質的純化作為均依的抗體而精製。抗體的分離、精製,可使用在通常抗體之精製上所使用之分離、精製方法,但並無任何限定。例如,由:層析管柱、濾膜、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯醯胺電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等適當選擇、組合,分離、精製抗體。本發明之雙特異性抗體亦包含WO 2005/035756、WO
2006/109592、WO 2012/067176等所載之抗體。
雙特異性抗體包含可對至少2種不同抗原特異性結合之第一抗原結合部位及第二抗原結合部位。第一抗原結合部位及第二抗原結合部位只要各對第Ⅸ凝血因子及/或活性化第Ⅸ凝血因子及第X凝血因子具有結合活性,無特別限定,例如:抗體、Scaffold分子(類抗體分子)、胜肽等與抗原結合必要之部位,或含該部位之片段。所謂Scaffold分子,係在與標的分子結合時發揮機能的分子。只要為可與至少1種標的抗原結合、在立體構造上安定的多胜肽,任何種類之多胜肽均可使用。此多胜肽例如,抗體可變區域、纖維結合蛋白(fibronectin)(WO 2002/032925)、Protein A區域(WO 1995/001937)、LDL受體A區域(WO 2004/044011、WO 2005/040229)、錨蛋白(ankyrin)(WO 2002/020565)等,以及在Nygren等(Current Opinion in Structural Biology,7:463-469(1997)、Journal of Immunol.Methods,290:3-28(2004))、Binz等(Nature Biotech.,23:1257-1266(2005))、Hosse等(Protein Science,15:14-27(2006))中所載之分子。又,亦可使用如Curr.Opin.Mol.Ther.,2010Aug,12(4):487-95及Drugs,2008,68(7):901-12所載之可與標的抗原結合之胜肽分子。
雙特異性抗體可以例如基因重組技術製造(參照如:Borrebaeck CAK and Larrick J.W.,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD.,1990)。重組
型抗體可藉由與編碼其之DNA雜交,或以產生抗體之致敏淋巴球等的抗體產生細胞選殖,引入適當載體,將其導入宿主(宿主細胞)中生產而得。
雙特異性抗體中,不只可包含整段抗體,亦可包含抗體片段及小分子化抗體、及抗體修飾物。
例如抗體片段及小分子化抗體含有雙功能抗體(diabody,Db)、線狀抗體、單鏈抗體(以下,亦記載為scFv)分子等。其中,「Fv」片段為最小的抗體片段,包含完全的抗原辨識部位及結合部位。
雙特異性抗體,包含人體抗體、小鼠抗體、大鼠抗體等,其由來並無限定。亦可為嵌合抗體及人體化抗體等基因修飾抗體。
人體抗體可以已知之方法獲得,例如,從具有人體抗體基因全基因庫(repertory)的基因轉殖動物以目標抗原免疫,得到目標的人體抗體(參照國際專利申請公開編號WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/333735)。
基因修飾抗體,可以已知之方法製造。具體地,例如嵌合抗體為由免疫動物抗體之H鏈及L鏈之可變區域,與人體抗體之H鏈及L鏈之恒定區域所構成之抗體。以來自免疫動物之抗體的可變區域編碼之DNA,與人體抗體之恒定區域編碼之DNA連結,將此嵌入表現載體而導入宿主中生產,可得到嵌合抗體。
人體化抗體,係亦稱為重構(reshaped)人體抗體
之修飾抗體。人體化抗體可由來自免疫動物之抗體的CDR移殖至人體抗體之互補決定區而建構。其一般之基因重組方法亦已為一般所知(參照歐洲專利申請公開編號EP 239400、國際專利申請公開編號WO 96/02576、Sato K.et.al.,Cancer Research,1993,53:851-856、國際專利申請公開編號WO 99/51743)。
本發明中,分離自受試者之含有具第Ⅷ凝血因子替代活性之物質的血液樣品。該血液樣品,可由投予具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質的受試者獲得。受試者,例如體內有任何部位伴隨出血性症狀之患者(出血性疾病患者)。主要出血部位可舉如關節內、肌肉內、皮下、口腔內、頭蓋內、消化管、鼻腔內等,但並不限定於此。出血性疾病患者,例如以第Ⅷ凝血因子及/或活性化第Ⅷ凝血因子活性降低或缺損為原因的出血性疾病患者較佳。以第Ⅷ凝血因子及/或活性化第Ⅷ凝血因子活性降低或缺損為原因的出血性疾病患者,為具有出血性症狀之患者,可舉如先天性或後天性,第Ⅷ凝血因子及活性化第Ⅷ凝血因子之一者或兩者的活性降低或缺損的患者。所謂第Ⅷ凝血因子、活性化第Ⅷ凝血因子之活性降低,為相較於健康者,該活性未滿40%(如:未滿40%、未滿30%、未滿20%、未滿10%)者為佳,未滿10%(如:未滿10%、未滿9%、未滿8%、未滿7%、未滿6%)者更佳,未滿5%(如:未滿5%、未滿4%、未滿3%、未滿2%)者又更佳,特別以未滿1%之患者再更佳,但並不限定於此。第Ⅷ凝血因子、活性化第Ⅷ凝血因子之活性的測定方法為本技術領域所周知(如:「大眾利用
之血友病的基礎與臨床」,白幡聰,醫藥雜誌社,2009年等)。
更具體地說,此類疾病之例,如選自:血友病(血友病A、血友病B)、後天性血友病、及起因於馮威理氏因子(vWF)之機能異常或缺損的馮威理氏病之疾病,但並不限定於此。血液來源樣品,可包含血清、血漿、或全血。本發明中,以使用血漿樣品較佳。由受試者取得血液來源樣品的方法亦為本技術領域所週知。
本發明中,在上述獲得自受試者之血液來源樣品中,加入活性化第XI凝血因子、或含有活性化第XI凝血因子之血液凝固起始藥劑。
本發明之活性化第XI凝血因子,可經由活性化第XⅡ凝血因子及凝血酶等使第XI凝血因子活化,之後再藉離子交換、逆相、膠體過濾等層析法,或經由固定有對活性化第XI凝血因子之抗體的管柱之親和性層析法,或者,組合上述複數種管柱,精製、調製。
人體第XI凝血因子之胺基酸序列及其編碼之核酸鹼基序列,已知分別為GenBank:NP 000119(序列編號:1)及NM 000128(序列編號:2)。但是,此處所謂的第XI凝血因子不限定於人體第XI凝血因子,亦可為其他種類動物(如:馬、牛、豬、兔、大鼠、小鼠)的第XI凝血因子。第XI凝血因子,除天然蛋白質外,亦可利用一般公知的基因重組技術的重組蛋白而調製。重組蛋白可以此技術領域之人士公知方法調製。即重組蛋白可經由例如將編碼第XI凝血因子之核酸嵌入適當的表現載體,將其導入適當之宿主細胞,回收所得的轉形
體,獲得萃取物後,以離子交換、逆相、膠體過濾等之層析法,或經由固定有對活化第XI凝血因子之抗體的管柱之親和性層析法,或者組合上述複數種管柱而精製、調製。
又做為第XI凝血因子與麩胱苷肽-S-轉移酶蛋白質之融合聚胜肽、或加成複數個組胺酸的重組多胜肽,在宿主細胞(如動物細胞及大腸菌等)內表現的情形,表現之重組多胜肽亦可藉由麩胱苷肽管柱或鎳親和性管柱而精製。
上述載體,例如,以大腸菌為宿主的情形,為使載體可在大腸菌(如:JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue)等大量增殖而大量調製,只要具有在大腸菌中增殖所須的「ori」,同時具有轉形的大腸菌篩選基因(如任何可以藥劑(安比西林及四環黴素、康納黴素、氯黴素)判別之藥劑耐受性基因)即可,並無特別限定。載體之例,可舉如M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。又,cDNA之次選殖(subcloning),在以切出為目的之情形,除上述載體外,可再舉如:pGEM-T、pDIRECT、pT7等。在目的為生產第XI凝血因子而使用載體之情形,特別以表現載體為有用。表現載體,例如,在目的為在大腸菌中表現的情形,載體除了具有在大腸菌中增殖的上述特點外,在以JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大腸菌為宿主時,不可缺少可在大腸菌中有效率地表現之啟動子,如:lacZ啟動子(Ward等人,Nature(1989)341,544-546;FASEB J,(1992)6,2422-2427)、araB啟動子(Better等人,Science(1988)240,1041-1043)、或T7啟動子等。這類載體,除上述載體外,亦可舉pGEX-5X-1(Pharmacia
公司生產)、「QIA express system」(QIAGENE公司生產)、pEGFP、或pET等。
又,載體中,亦可含有使多胜肽分泌之訊息序列。分泌多胜肽之訊息序列,在於大腸菌之細胞間質中產生的情形,可使用pelB訊息序列(Lei,S.P.,et al.,J.Bacteriol.,(1987)169,4379)。將對宿主細胞的載體導入,可如以氯化鈣法、電孔法進行。
除大腸菌以外,可舉例如來自於哺乳動物之表現載體(如:pcDNA3(Invitrogen公司生產)、及pEGF-BOS(Nucleic Acids Res.,1990,18(17)p5322、pEF、pCDM8)、來自於昆蟲細胞之表現載體(如:「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO-BRL公司生產)、PBacPAK8)、來自於植物之表現載體(如:pMH1、pMH2)、來自於動物病毒之表現載體(如:pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自於反轉錄病毒之表現載體(如:pZIPneo)、來自於酵母之表現載體(如:「Pichia Expression Kit」(Invitrogen公司生產)、pNV11、SP-Q01)、來自於枯草菌之表現載體(如:pPL608、pKTH50)等。
以在CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞中表現為目的之情形,不可缺少具有在細胞內表現所須的啟動子,例如SV40啟動子(Mulligan等,Nature,(1979)277,108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等,Nucleic Acid Res.,(1990)18,5322)、CMV啟動子等,以具有對細胞轉形篩選所須之基因(例如可以藥劑(新黴素、G418等)判
別之藥劑耐受性基因)為更佳。具有此種特性之載體,可舉如:pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
又,體內(in vivo)生產多胜肽的系統,可舉例如使用動物之生產系統及使用植物之生產系統。在該動物或值物中導入編碼第XI凝血因子之核酸,於動物或值物體內生產第XI凝血因子而回收。
在使用動物時,可使用哺乳類動物、昆蟲之生產系統。哺乳類動物方面,可使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)又,在使用哺乳類動物之情形,可使用轉殖動物。
如此操作所得之第XI凝血因子,可由宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離,為實質上純粹之均一多胜肽而精製。多胜肽的分離、精製,可使用一般在多胜肽精製中所使用之分離、精製方法,無特別之限定。例如可由層析管柱、濾膜、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯醯胺電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等適當選擇、組合,分離、精製多胜肽。
又,第XI凝血因子亦可在精製前或精製後以適當之蛋白質修飾酵素作用,任意地增加修飾或去除部分胜肽。蛋白質修飾酵素之例,可舉如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、離胺酸胜肽內切酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。
又第XI凝血因子中亦包含1個或複數個胺基酸改變,使第Ⅸ凝血因子活化,潛在性地具有成為具有活性化第IX凝血因子之機能的蛋白質。又此限定中,亦包含第XI凝血因
子之片段。
在改變胺基酸殘基的情形,希望以保留胺基酸側鏈之性質而將其他胺基酸變異。例如,胺基酸側鏈的性質為,例如疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂族側鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羥基之側鏈的胺基酸(S、T、Y)、具有含硫原子之側鏈的胺基酸(C、M)、具有含羧酸及醯胺之側鏈的胺基酸(D、N、E、Q)、具有含鹽基之側鏈的胺基酸(R、K、H)、及具有含芳族之側鏈的胺基酸(H、F、Y、W)(括號內表示各胺基酸的單字母符號)。這些各群中之胺基酸取代稱為保守性取代。已知對某胺基酸序列具有1個或複數個(如2、3、4、5、10、20、30、40、50、或100個)胺基酸殘基的缺失、加成及/或由其他胺基酸取代之修飾胺基酸序列的多胜肽可維持其生物活性(Mark,D.F.,et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1984)81:5662-6;Zoller,M.J.and Smith,M.,Nucleic Acid Res.,(1982)10:6487-500;Wang,A.,et.al.,Science,(1984)224:1431-3;Dalbadie-McFarland,G.,et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1982)79:6409-13)。如此的變異體,以與胺基酸改變前之第XI凝血因子或第XI凝血因子之片段的胺基酸序列所具有的胺基酸序列之相同性至少為70%,較佳為至少75%,更佳為至少80%,再更佳為至少85%,又更佳為至少90%,最佳為至少95%。本說明書中序列之相同性係定義為使序列相同性成為最大而視須要使序列排列,在導入適當之間隙(gap)後,與原先之重鏈可變區域或輕鏈可變區域
的胺基酸序列之殘基相同的殘基比例。
胺基酸序列及鹼基序列的相同性,可使用Karlin及Altschul所提出之BLAST算法(Algorithm BLAST)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873,1993)確認。已開發根據BLAST算法之稱為BLASTN及BLASTX之程式(Altschul S.F.,et.al.:J.Mol.Biol.,215:403,1990)。在使用BLASTN解析鹼基序列之情形,其參數為如score=100、wordlength=12。又在使用BLASTX解析胺基酸序列時,其參數為如score=50、wordlength=3。在使用BLAST及Gapped BLAST程式時,使用各程式之定參數(default parameter)。這些解析方法具體之方法已為一般所知。
調製編碼胺基酸序列改變之蛋白質的DNA之方法,例如site-directed mutagenesis法(Kramer,W.and Fritz,H.-J.,(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA,Methods in Enzymology,154:350-367)、及雜交技術(Southern,E.M.,(1975)Journal of Molecular Biology,98,503)、PCR技術(Saiki,R.K.,et.al.,(1985)Science,230,1350-1354;Saiki,R.K.,et.al.,(1988)Science,239,487-491)等,為本技術領域所熟知。
又本發明中,較佳在活性化第XI凝血因子中加入磷脂。本發明中之磷脂無特別之限定。磷脂可舉如磷脂絲胺酸、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油、二磷脂醯甘油、神經磷脂及其2種以上之組合,但並不限定於
此。本發明中以磷脂絲胺酸、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺之組合為佳。
本發明中,活性化第XI凝血因子為藥劑的型態,可加入於來自於分離自受試者之血液的樣品中。本發明中,此類藥劑稱為「血液凝固起始藥劑」。本發明之「血液凝固起始藥劑」除活性化第XI凝血因子之外,亦可含有磷脂、鈣、鎂等鹽。
活性化第XI凝血因子及/或磷脂,可以後述凝血酶生成量測定之充足量,加入血液來源樣品中。活性化第XI凝血因子,以血漿樣品每1mL,可如添加0.00001pmol至1000nmol間之量,但並不限定於此。又磷脂,以血漿樣品每1mL,可如添加0.001nmol至10000nmol間之量,但並不限定於此。
本發明中,經過上述步驟,測定血液來源樣品的凝血酶生成量。本發明人等了解以血液來源樣品的凝血酶生成量為指標,評估結合於第Ⅸ凝血因子或活性化第Ⅸ凝血因子、及第X凝血因子之雙特異性抗體的輔因子活性為可能之事。亦即根據本發明,提供以血液來源樣品的凝血酶生成量為指標,對具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質(較佳為結合於第Ⅸ凝血因子或活性化第Ⅸ凝血因子、及第X凝血因子之雙特異性抗體)的血液凝固反應之評估方法。血液來源樣品的凝血酶生成量可根據本技術領域周知方法測定。例如,添加換算樣品中凝血酶量之藥劑,經由市售裝置計算最大凝血酶量(Peak height)及總凝血酶量(ETP)而測定,但並不限定於此。
本發明中,以血液來源樣品的凝血酶生成量為指標,可以適當之感度評估結合於第Ⅸ凝血因子或活性化第Ⅸ凝
血因子、及第X凝血因子之雙特異性抗體的輔因子活性。止血作用所須之輔因子活性,應該有如:以含有具第Ⅷ凝血因子替代活性之物質的臨床效果與本發明方法中從凝血酶生成量之相關數據判斷之方法、及以本發明方法中含有具第Ⅷ凝血因子替代活性之物質之來自血液樣品中的凝血酶生成量、與含第Ⅷ凝血因子活性之來自血液樣品的凝血酶生成量比較的方法等。例如,本發明中,具有第Ⅷ凝血因子(FⅧ:C)1%之來自血液樣品或加入成為FⅧ:C為1%之第Ⅷ凝血因子之來自血液樣品中,以顯示檢出感度的下限之凝血酶生成反應,來調整血液凝固起始藥劑中活性化第XI凝血因子及磷脂之濃度,可藉由凝血酶生成反應,評估投予受試者之具有第Ⅷ凝血因子替代活性的物質引發血液凝固反應之活性,亦即具有止血效果。或者,本發明中,由投予具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質的受試者(重症血友病A患者)所分離之血液來源樣品的凝血酶生成量,與不含具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質或不顯示由相同物質作用的狀態之相同受試者的血液來源樣品中添加第Ⅷ凝血因子0.01U/mL的樣品(比較樣品)之凝血酶生成量比較,在相同程度或其以上之情形時,評估投予受試者具有第Ⅷ凝血因子替代活性的物質引發血液凝固反應之活性,亦即具有止血效果。所謂凝血酶生成量為相同程度,例如以在投予具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質的受試者之血液來源樣品的凝血酶生成量,相對於比較樣品的凝血酶生成量,以例如在正負100%以內為佳,在50%以內更佳,特別以在20%以內又更佳,但並不限定於此。凝血酶生成量可以例如最大凝血酶量(Peak
height)、總凝血酶量(ETP)作為指標。
又,本發明亦提供用於本發明之血液凝固反應之評估中的血液凝固起始藥劑。本發明之血液凝固起始藥劑,包含活性化第XI凝血因子。本發明之血液凝固起始藥劑可更包含磷脂。磷脂之例如上所述。本發明之血液凝固起始藥劑也可包含其他鈣、鎂等鹽。
本發明之用於血液凝固反應的評估中之血液凝固起始藥劑,也可稱為「用於評估血液凝固反應之血液凝固起始藥劑之製造中的活性化第XI凝血因子、或活性化第XI凝血因子及磷脂之使用」。也可稱為「用於評估血液凝固反應之活性化第XI凝血因子、或活性化第XI凝血因子及磷脂」。而且本發明之血液凝固起始藥劑亦可表現為「包含將活性化第XI凝血因子、或活性化第XI凝血因子及磷脂、與藥學或生理學上容許之載劑製劑化的步驟之評估血液凝固反應用的血液凝固起始藥劑之製造方法」。本說明書中之活性化第XI凝血因子限於額外添加於血液來源樣品,也可包含第XI凝血因子。本發明之活性化第XI凝血因子可為市售商品、由血漿精製者、或以基因重組技術製作者。這些獲得方法為本技術領域所周知。
根據本發明之血液凝固反應的評估方法中所必須之血液凝固起始藥劑等的各種藥劑類可以事先包裝做成套組(kit)來提供。本發明之套組中,除血液凝固起始藥劑之外,亦可包含從血液中第Ⅷ凝血因子活性及第Ⅸ凝血因子活性正常之人體所分離的血漿樣品之陽性對照、具有第Ⅷ凝血因子替代
活性之物質、可使用於凝血酶生成分析之物質(例如對凝血酶之螢光基質、用以換算樣品中凝血酶量之藥劑等)。又套組中所含之各種藥劑,視其使用樣態可為粉末狀或液狀。又可將這些包裝在適當的容器中,適時地使用。
又本說明書中所引用之所有先前技術文獻,均包含於本說明書中作為參考。
實施例
以下,以實施例更詳細說明本發明,惟本發明,並不受此等實施例之限定。
具有FⅧ機能替代活性之抗FⅨa/FX雙特異性抗體的調製及FⅧ機能替代活性之測定
具有FⅧ機能替代活性之抗FⅨa/FX雙特異性抗體,可以WO 2005/035756、WO 2006/109592、WO 2012/067176所載之方法獲得。以WO 2005/035756、WO 2006/109592、WO 2012/067176所載之抗體基因,嵌入動物細胞表現載體,將其轉染於HEK293細胞中,暫時性表現雙特異性抗體。之後,將細胞培養上清液中所含之雙特異性抗體,以Protein A及膠過濾精製。
如此操作所精製之雙特異性抗體的FⅧ機能替代活性之測定,以下示之酵素分析進行。在室溫下,將1nM之人FⅨa(Enzyme Research Laboratories公司)、140nM之人FX(Enzyme Research Laboratories公司)、20μM之磷脂(10%磷脂絲胺酸、60%磷脂醯膽鹼、30%、磷脂醯乙醇胺)、及雙特異性抗體,以含5mM CaCl2及0.1%牛血清白蛋白之Tris緩
衝生理食鹽水溶液混合後靜置2分鐘,進行經FⅨa使FX活化之反應。本反應以添加EDTA而停止。之後,添加FXa特異性之呈色基質溶液S-2222(CHROMOGENIX公司),使用SpectraMax 340PC384(Molecular Devices公司)測定405nm下之吸光度變化。以已知濃度的人FXa(Enzyme Research Laboratories公司)的吸光度變化製作檢量曲線,評估因雙特異性抗體的FXa產生促進活性。
APTT之測定
APTT藥劑係使用Thrombocheck APTT-SLA(Sysmex),依照標準APTT測定操作步驟測定。在含有雙特異性抗體或重組人FⅧ(rhFⅧ,Bayer公司)之缺乏第Ⅷ凝血因子(FⅧ)之人血漿(商品,George King Bio-Medical公司)或缺乏保有抑制因子(inhibitor)之FⅧ血漿(商品,George King Bio-Medical公司)50μL中,添加APTT藥劑50μL。靜置3分鐘後,添加0.02mol/L氯化鈣溶液50μL使凝固反應開始,並以血液凝固自動測定裝置(KC4 Delta,Trinity Biotech公司)測定APTT。
凝血酶生成分析
使用具備激發波長390nm/螢光波長460nm之濾光組、分注器、分析軟體(Thrombinoscope software version 3.0.0.29,Thrombinoscope BV公司)之96孔螢光微盤螢光光度計(Thermo Fisher Scientific Instruments公司),以自動校正血栓圖像儀(calibrated automated thrombography)得到凝血酶生成曲線。於各孔中各添加含有雙特異性抗體或重組人FⅧ(rhF
Ⅷ,Bayer公司)之缺乏第Ⅷ凝血因子(FⅧ)之人血漿或缺乏保有抑制因子之FⅧ血漿(George King Bio-Medical公司)80μL。之後添加含0.47nM之人第FXIa凝血因子(Enzyme Research Laboratories公司)及20μM磷脂的血液凝固起始藥劑(FXIa/磷脂藥劑)或PPP-Reagent LOW(Thrombinoscope BV公司)20μL。為了換算為凝血酶量,添加凝血酶校正劑(Thrombin Calibrator)(Thrombinoscope BV公司)20μL以取代血液凝固起始藥劑。反應開始以程式控制裝置,自動分注以FluCa套組(Thrombinoscope BV公司)調製之FluCa試劑20μL。經由裝置之軟體,計算凝血酶生成曲線、最大凝血酶量(Peak height)及總凝血酶量(ETP)。
血友病A模式
首先,以人FⅧ免疫之小鼠製作融合瘤細胞,確認其為與長尾猴有交叉反應且與豬無交叉反應之抗FⅧ中和抗體。與長尾猴及豬之交叉反應的測定,係經由於各檸檬酸血漿中添加該抗體,以APTT或凝血酶生成試驗測定是否抑制凝固而確認。將此抗FⅧ抗體以延長APTT的2倍之用量投予長尾猴,做為後天性血友病A之狀態。之後,以雙特異性抗體之一的hBS23的0.3mg/kg(n=3)或以豬FⅧ的1U/kg(n=3)做為被檢測藥,動物靜脈內投藥。豬FⅧ係以常法之基因重組方法調製/精製。控制試驗設定為未投予藥劑之組(n=6)。在麻醉下人工誘發動物出血(在前腕、上腕及大腿肌肉中以18G針穿刺),之後觀察動物至3日。投予1U/kg之豬FⅧ之組,以1日2次(計6次,最終觀察日未投藥),經動物靜脈內追加投藥1U/kg豬
FⅧ。此係使血漿中FⅧ活性維持在0.01U/mL或以上所設計之歷程。出血的指標採用血紅素值(反映因失血之貧血)及皮膚變紫部分(出血痕)面積。
結果
<雙特異性抗體之FⅧ機能替代活性>
雙特異性抗體之一的hBS23,在FⅨa/FX/磷脂存在下,顯示促進FXa產生之活性,表示具有FⅧ機能替代活性(第1圖)。
<雙特異性抗體之體內止血活性>
控制試驗之動物中,至3日後,可見到血紅素值漸進地減少及皮膚變紫部分擴大。這些情形經由hBS23單次靜脈內投藥或1U/kg豬FⅧ反複靜脈內投藥(1日2次)而被抑制。其程度,兩者約略同等。
實驗期間hBS23在血漿中之濃度為30nM前後(組平均為40至18nM),在此濃度左右,應該已具有與維持血漿中FⅧ活性為0.01U/mL(FⅧ活性為1%)或以上之歷程(以1U/kg豬FⅧ反複靜脈內投藥(1日2次))同等的止血活性。
<血漿分析中雙特異性抗體之活性>
雙特異性抗體之一種的hBS23,在FⅧ缺乏的血漿中,在FXIa/磷脂藥劑誘發之條件下,血紅素生成指數之最大凝血酶量(Peak height)及總凝血酶量(ETP)以濃度依存性上升(第2圖)。在最大凝血酶量(Peak height)之解析中,hBS23在30nM下有相當於0.01U/mL之rhFⅧ(FⅧ活性為1%)之活性,在300nM下有近於0.1U/mL之rhFⅧ(FⅧ活性為10%)之活性。如前述之情形,在體內試驗中,保持血漿中hBS23
濃度在30nM左右時,可得到與維持血漿中FⅧ活性為0.01U/mL(FⅧ活性為1%)或以上之歷程同等的止血活性。因此教示凝血酶生成試驗為以適當地感度反映hBS23的止血作用之監測法。
另一方面,以PPP-試劑LOW(含低濃度組織因子之血液凝固起始藥劑)誘發之條件下進行凝血酶生成試驗,相較於在FXIa/磷脂藥劑誘發之條件下,hBS23活性及hFⅧ之測定感度低,判斷難以適當地反映在體內(in vivo)止血作用。又使用APTT值評估hBS23之FⅧ比活性者,計算出hBS23在30nM以上時具有FⅧ(FⅧ活性為100%)1U/mL以上之比活性。此結果教示,以APTT值計算的hBS23之FⅧ比活性較體內(in vivo)試驗的止血作用更大的可能性。
產業上利用之可能性
根據本發明,提供在血液凝固反應中具有FⅧ機能替代活性之雙特異性抗體效果之評估方法。根據本發明之方法,在以該雙特異性抗體治療血友病等的出血性疾病中,可以適當之感度判定其效果。
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Claims (10)
- 一種藉由具有第Ⅷ凝血因子替代活性之物質評估血液凝固反應之方法,其中該方法包含步驟(i)及(ii):(i)於含有具第Ⅷ凝血因子替代活性的物質之來自受試者所分離之血液來源的樣品中,加入含有活性化第XI凝血因子之血液凝固起始藥劑的步驟;及(ii)測定步驟(i)所得之血液來源樣品之凝血酶(thrombin)生成量的步驟。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該具有第Ⅷ凝血因子替代活性的物質為結合於第Ⅸ凝血因子或活性化第Ⅸ凝血因子、及第X凝血因子之雙特異性抗體。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法,其中,該受試者為出血性疾病患者。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法,其中,該出血性疾病為以第Ⅷ凝血因子或活性化第Ⅷ凝血因子的活性減低或缺損為原因的疾病。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法,其中,該出血性疾病為選自由血友病及起因於馮威理氏因子(vWF)機能異常或缺損的馮威理氏病所組成之群組之疾病。
- 如申請專利範圍第5項所述之方法,其中,該血友病為後天性血友病。
- 如申請專利範圍第1至6項任一項所述之方法,其中,該血液凝固起始藥劑為含有活性化第XI凝血因子及磷脂之藥劑。
- 活性化第XI凝血因子作為如申請專利範圍第1至7項任一項所述之方法中所使用的血液凝固起始藥劑的用途。
- 如申請專利範圍第8項所述之用途,其中該血液凝固起始藥劑更包含磷脂。
- 活性化第XI凝血因子或活性化第XI凝血因子及磷脂作為血液凝固起始藥劑於製造用於如申請專利範圍第1至7項任一項所述之方法中的套組的用途。
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