JP6883899B1 - 血液凝固検査試薬、および血液凝固検査方法 - Google Patents
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Abstract
Description
<2> 前記血液凝固第XI因子を、0.5pM〜1,000pM、前記組織因子を、1fM〜1,000fM含み、前記血液凝固第XI因子と、前記組織因子との比率(血液凝固第XI因子/組織因子)が、30〜10,000である、前記<1>記載の血液凝固検査試薬。
<3> 血液凝固活性の低下によって引き起こされる出血性の疾患に関する指標を検査するためのものである、前記<1>または<2>に記載の血液凝固検査試薬
<4> 被験検体である生体試料と、0.5pM〜1,000pMの活性型の血液凝固第XI因子と、1fM〜1,000fMの組織因子とを含む検査試薬と、を反応させることで形成するトロンビンの量を測定する工程を有する、血液凝固検査方法。
本発明の血液凝固検査試薬は、活性型の血液凝固第XI因子(FXIa)と、組織因子(tissue factor, TF)と、を含む。本発明の血液凝固検査試薬を、以下、単に、本発明の検査試薬と呼ぶ。
本発明の血液凝固検査方法は、被験検体である生体試料と、0.5pM〜1,000pMの活性型の血液凝固第XI因子と、1fM〜1,000fMの組織因子とを含む検査試薬と、を反応させることで形成するトロンビンの量を測定する工程を有する。このトロンビンの形成量から、被験検体や、反応条件における血液凝固を検査することができる。本発明の血液凝固検査方法を、以下、単に、本発明の検査方法と呼ぶ。
本発明の検査試薬は、活性型の血液凝固第XI因子(FXIa)を含む。本願において、活性型の血液凝固第XI因子は、単に「FXIa」と記載する場合がある。
本発明の検査試薬は、組織因子(tissue factor, TF)を含む。本願において、組織因子は、単に「TF」と記載する場合がある。
本発明の検査試薬は、血液凝固第XI因子と、組織因子との比率(血液凝固第XI因子/組織因子)が、30〜10,000であることが好ましい。「血液凝固第XI因子/組織因子の比」を、単に、「FXIa/TF」と記載する場合がある。FXIa/TFは、検査試薬におけるモル濃度比である。FXIa/TFが、上記範囲内のとき、検査に必要な量成分が適した量となり、安定して検査ができる。FXIa/TFは、60〜5,000であることがより好ましく、150〜2,000であることがさらに好ましい。
1)臨床性能研究の対象患者と血漿検体の調製
臨床性能研究は北海道医療大学の倫理審査委員会の承認を得た後、非弁膜症性心房細動と診断され心原性脳塞栓症予防のためにDOAC療法を行なっている患者を対象として実施した。血液検体を採取する際には、担当医から患者に口頭及び文書による説明を行い、その上で同意書への署名を得て採取した。DOAC服用に関連して生じた出血は、International Society on Thrombosis and Haemostasis(国際血栓止血学会)及びROCKET AF出血基準に従って定義し、該当する患者を出血患者とみなした。
以下の(1)〜(3)にて、FIXa−FVIIIa依存的に形成するトロンビンの試験を行った。
トロンビン形成開始試薬は、以下のものを混合することで調整した。なお、適宜、0.5%ウシ血清アルブミン(富士フィルム和光純薬から購入)および0.15M塩化ナトリウム(富士フィルム和光純薬から購入)を含む、50mMトリス緩衝液(BSA/TBS、pH7.4)によって希釈した。
・ヒトTF(Dade Innovin、シスメックスから購入)溶液
・ヒトFXIa(フナコシから購入)溶液
・合成リン脂質(Haematexから購入)溶液
・塩化カルシウム(富士フィルム和光純薬から購入)溶液
トロンビン検出試薬は、トロンビン蛍光基質(Pefafluor TH:D−cyclohexylalanine−alanine−arginine−amido−methylcoumarin、DSM Nutritional Productsから購入)溶液とエチレンジアミン四酢酸(EDTA、東京化成から購入)溶液を混合して調製した。
代表的な実施例として、50μMトロンビン蛍光基質と10mM EDTAを用いた。
まず、被験の血漿検体を96ウエルのマイクロタイタープレート(サーモフィッシャーから購入)のウエルに分注した。最初の反応として、トロンビン形成開始試薬を血漿検体に添加して37℃で2.5分間インキューベーションし、トロンビンを形成させた。
血液凝固検査としてAPTTとPT−INRの検査法を用いて被験血漿検体の凝固活性を試験した。両方法とも血液凝固の開始試薬を血漿検体に添加して血漿が凝固する時間を測定することで凝固活性を調べる。血漿中のDOAC濃度は血漿にFXaを添加した後、FXa活性に対する阻害活性をもとに決定した。
トロンビン形成に対するDOACsの抑制作用は、血漿にリバーロキサンバン(rivaroxaban)、アピキサバン(apixaban)、あるいはエドキサバン(edoxaban)を添加(スパイク)した被験検体を調製し、それらの血漿のトロンビン形成を調べる事で評価した。
2群間の有意差の検定は統計解析ソフトのGraphpad Prism 8(GraphPad Softwareから購入)を用いて行った。
1)実施例1:コントロール血漿の血液凝固活性に対するDOACsの影響
コントロール血漿の血液凝固活性に対するDOACsの影響を調べる目的で、コントロール血漿に3種のDOACs(rivaroxaban、apixaban、edoxaban)をそれぞれ18.5ng/mL〜500ng/mLで添加し、トロンビン形成を調べた。
なお、試験に用いたDOACsの濃度範囲は、患者が薬を服用した後、血漿中に検出されるDOAC濃度の範囲とほぼ同一である。
図中の値は二回の実験の平均値と標準偏差値を示している。
DOACのトロンビン形成抑制作用における個人差を明らかにするために、3名の患者(ID#:001,002,003)から得た血漿に125、250、500ng/mLになるようにapixabanを添加して、血漿のトロンビン形成に対するapixabanの抑制作用を調べた。
10mgのapixabanを服用した2人の患者(ID#:004と005)において、服用開始直後から経時的に採血して血漿中のapixaban濃度、トロンビン形成、APTT及びPT−INRによる血液凝固活性の経時変化を調べた。その結果、apixaban濃度は開始後2時間から4時間でピークに達し、その後血液中からのクリアランスによって濃度が低下した(図4のパネルAとC)。
A.患者#004からの血漿のapixaban濃度とトロンビン形成の測定値。
B.患者#004からの血漿のAPTT及びPT−INRで測定した血液凝固活性値。
C.患者#005からの血漿のapixaban濃度とトロンビン形成の測定値。
D.患者#005からの血漿のAPTT及びPT−INRで測定した血液凝固活性値。
トロンビン形成と出血イベントとの関連を調べるために、apixabanを服用した患者を出血した患者群(検体数:6)と非出血患者群(検体数:83)に分けて、本発明による検査試薬を用いて血漿中のトロンビン形成を比較した。トロンビン形成を開始させる混合試薬は図3と同じ試薬を用いた。加えて、特表2019−521324号公報に記載の混合開始薬(TFを150fM、FIXaを100pM、合成リン脂質を20μM、塩化カルシウムを16mM)を用いて血漿中のトロンビン形成を比較した。その他、血漿中のapixaban濃度、APTT及びPT−INRで測定した凝固活性値についても同様に比較した。血漿検体はapixabanを服用後1時間から4時間の間(ピーク時)に採血して調製した。
A.本発明によるトロンビン形成値。
B.特表2019−521324号公報に記載のTFとFIXaを用いた検査によるトロンビン形成値
C.apixaban濃度。
D.APTTによる血液凝固活性値。
E.PT−INRによる血液凝固活性値。測定値は対数値に変換した後、中央値、最小値、最大値を示すBox&Whiskerでプロットした。2群間の差はMann−Whitney試験により判定し、p<0.05を有意とした。NS:not significant。
Claims (4)
- 活性型の血液凝固第XI因子(FXIa)と、組織因子(tissue factor, TF)と、を含む血液凝固検査試薬。
- 前記血液凝固第XI因子を、0.5pM〜1,000pM、
前記組織因子を、1fM〜1,000fM含み、
前記血液凝固第XI因子と、前記組織因子との比率(血液凝固第XI因子/組織因子)が、30〜10,000である、請求項1記載の血液凝固検査試薬。 - 血液凝固活性の低下によって引き起こされる出血性の疾患に関する指標を検査するためのものである、請求項1または2に記載の血液凝固検査試薬
- 被験検体である生体試料と、0.5pM〜1,000pMの活性型の血液凝固第XI因子と、1fM〜1,000fMの組織因子とを含む検査試薬と、を反応させることで形成するトロンビンの量を測定する工程を有する血液凝固検査方法。
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