CN110881570A - 饲料添加剂及包含其的饲料 - Google Patents

Abstract

一种饲料添加剂及包含其的饲料，增强动物免疫力，提升疫苗免疫效果，得以对抗病原菌的感染以及肥胖症。本发明的饲料添加剂包括：一菌体萃取物，包含多个菌株内含物，其中该些菌株内含物包括一多肽，该多肽包括：一转位肽，其用于转位；以及一结合表位。

Description

饲料添加剂及包含其的饲料

技术领域

本发明涉及一种饲料添加剂及包含其的饲料，尤其涉及一种可增强动物免疫力，提升疫苗免疫效果，得以对抗病原菌的感染以及肥胖症的饲料添加剂及包含其的饲料。

背景技术

在家畜饲养时，为了使家畜长出比较多的瘦肉而较少的肌间脂肪，得以卖出好价钱，因故不良的饲养者会添加瘦肉精，以提升家畜瘦肉率。然而，瘦肉精是一种乙型交感神经受体致效剂，当人类因食用含有瘦肉精的肉类时，可能会造成心跳加速等不良影响，特别是对于高血压或心脏病患者影响更为显著；故现今已禁止添加瘦肉精作为饲料添加剂。因此，若能发展出一种可取代瘦肉精而不具有前述不良影响的饲料添加剂，将对家畜的饲养上有显著贡献。

鸡新城病(俗称鸡瘟)及禽鸟流行性感冒(简称禽流感)则为禽鸟类具有高度传染力及高度致病力的病毒性疾病。一旦有禽鸟类确诊感染后，为了杜绝后续感染其他区域的禽鸟，则必须进行大量扑杀，而造成重大的经济损失。因此，若能发展出一种可提升禽鸟类抵抗鸡瘟或禽流感的饲料添加剂，以在喂食饲料的同时提升禽鸟类抗鸡瘟或禽流感的抗体，则将可避免因染病而造成的重大经济损失。

此外，猪蓝耳病为猪生殖与呼吸综合症，其为一种高传染性、高致死率且高接触性的传染病，并有发病面积广、传播速度快等特点。此外，一但与猪瘟病毒混合感染时，则对于仔猪群的呼吸道疾病感染率将更加显著，尤其猪场管理不善状况下，仔猪死亡率几乎可高达80％。因此，一旦养猪场有蓝耳病毒入侵以及猪瘟防疫工作疏乎时，就很容易造成呼吸道疾病的群聚感染，对于养殖物造成重大的经济损失。因此，倘若能发展出一种可提升猪只免疫力抵抗蓝耳病及猪瘟的一种饲料添加剂予以母猪及仔猪喂食，提升猪只抵抗蓝耳病的抗体，则将可避免因该病毒染病而造成的重大经济损失。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种饲料添加剂及包含其的饲料，增强动物免疫力，提升疫苗免疫效果，得以对抗病原菌的感染以及肥胖症。本发明的饲料添加剂包括：一去活化菌体萃取物，包含多个菌株内含物，其中该些菌株内含物包括一多肽，该多肽包括：一转位肽，其用于转位；以及一结合表位。其中，转位肽可位于多肽的N-末端，而结合表位可位于多肽的C-末端；反之亦可。

在本发明的饲料添加剂中，多肽可更选择性的包括：一连接多肽。其中，连接多肽可位于转位肽与结合表位间；或转位肽位于连接多肽与结合表位间。然而，本发明并不仅限于此；可根据所要达成的目的，变更转位肽、结合表位及连接多肽的相对位置。

在本发明的饲料添加剂中，为组合多肽配方，可为一M细胞标靶多肽或一肠道上皮标靶多肽。举例来说，连接多肽可包含一氨基酸序列，其选自SEQ ID NO：1至4。

在本发明的饲料添加剂中，转位肽主要是来自绿脓杆菌外毒素。在本发明的一实施例中，转位肽可包含一仅去除功能区III的绿脓杆菌外毒素A片段。在本发明的另一实施例中，转位肽可包含一去除功能区Ib及III的绿脓杆菌外毒素A片段。在本发明的再一实施例中，转位肽可包含一去除功能区II、Ib及III的绿脓杆菌外毒素A片段。在本发明的更一实施例中，转位肽可包含绿脓杆菌外毒素A片段的部分N-端氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

在本发明的饲料添加剂中，结合表位可依所要对抗特定疾病设计。例如，结合表位可为一鸡新城病(Newcastle disease，ND)病毒表位、一禽流感(Avian Influenza，AI)病毒表位、一肌肉生长抑制素蛋白结合表位、一猪生殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)表位或一猪瘟(Class swinefever virus，CSFV)表位。

在本发明的饲料添加剂中，所使用的菌株并无特殊限制，只要能表达多肽，优选为大量表达多肽的菌株均可用于本发明的饲料添加剂中。例如，菌株可为大肠杆菌菌株、枯草杆菌菌株、乳酸杆菌菌株或肠球菌菌株。

本发明的饲料添加剂除了前述含有多肽萃取物的去活化菌体萃取物外，可更包括滑石粉、乙基纤维素及抗性淀粉等。其中，去活化的菌体多肽萃取物的含量可为0.1量百分比至1重量百分比，滑石粉的含量可为67重量百分比至87重量百分比，乙基纤维素的含量可为10.5重量百分比至18重量百分比；而为了增强缓释效果还可再添加抗性淀粉，其含量可为1.5重量百分比至15重量百分比。

本发明的饲料添加剂的制备方法可包括下列步骤：培养如前所述的菌株；将所培养的菌株进行裂解及分离内含体(Inclusion body)，并选择性的将菌株裂解，而可得到一多肽萃取物；将多肽萃取物与滑石粉、乙基纤维素混合，还可再添加抗性淀粉等，而可得到本发明的饲料添加剂。

此外，本发明更提供一种饲料，包括：如前所述的饲料添加剂及一饲料基质。其中，饲料添加剂的含量可为0.03重量百分比至5重量百分比，而饲料基质的含量可为95重量百分比至99.97重量百分比。或者，饲料添加剂的含量可为0.05至1.5重量百分比，而饲料基质的含量可为98.5至99.95重量百分比。饲料基质可根据所欲喂养的动物(例如：鸡、猪、羊、牛、人类等)，选择本技术领域常用的饲料作为饲料基质。

将本发明的饲料添加剂与饲料基质混合后，可得到本发明的饲料。当将本发明的饲料提供一动物时，可有效提升疫苗注射效价，增强动物对抗特定疾病(例如：鸡新城病、鸡禽流感或猪肥胖症、猪生殖与呼吸综合症、猪瘟等)的功效，进而提升此动物的免疫力及生产力。

附图说明

图1及图2为本发明实施例2的服用含饲料添加剂的饲料的鸡只对于鸡新城病病毒的免疫功效结果图；

图3为本发明实施例3的服用含饲料添加剂的饲料的鸡只对于禽流感病毒的免疫功效结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可通过其他不同的具体实施例加以施行或应用，本说明书中的各项细节还可针对不同观点与应用，在不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更。

实施例1-肥胖症

在本实施例中，提供两种融合蛋白多肽，来诱发动物产生肌肉生长抑制素蛋白结合表位抗体，用于阻断肌肉生长抑制素活性。其中，融合蛋白多肽的建构方法大致如下。

将肌肉生长抑制素结合表位的DNA片段(Mt4)分别连接到用EcoR1和XhoI限制酶切割的pP49或pPE407质体(pET23a和PE类毒素载体衍生物质体)中，使肌肉生长抑制素结合表位的DNA片段被加至P49或PE407片段的C末端。将含有***片段的质体分别转殖到大肠杆菌中，并通过安比西林抗药性筛选出菌株。一旦获得样品，机器将自动产生DNA序列并且在计算机上显示其结果。进行序列分析以鉴定核酸中的核苷酸序列或多肽中的氨基酸。

1-1：P49L-Mt4融合蛋白多肽的建构

P49L-Mt4融合蛋白多肽，包括：转位肽、肌肉生长抑制素结合表位及连接多肽。其中，转位肽来自绿脓杆菌外毒素，且不含PE功能区II、Ib和III片段，并且不含细胞器接合区PEIa，而只剩下N端的49氨基酸(PE49)的融合蛋白

pPE49质体的建构

绿脓杆菌外毒素A(PE)多肽含有功能区(domain)Ia、II、Ib和III。共具有613个氨基酸，其全长PE-DNA片段已被公开(Liao CW等人，Applied Microbiology andBiotechnology，July 1995，Volume 43，Issue3，pp 498-507)，并且次转殖的菌株被储存在Liao Lab。利用遗传工程技术，将含有PE-DNA的pET23a质体的PE功能区(domain)Ia的部分以及功能区II、Ib和III-DNA片段删除掉，只剩下不含细胞器接合区PEIa的N端的49氨基酸(PE49)，如下表1所示。在强噬菌体T7转录和(选择性地)转译信号的控制下，目标基因转殖到pET15b质体中；通过在宿主细胞中提供T7 RNA聚合酶来诱导表现。

表1：转位肽PE49序列

通过使用如下表2所示引子对PE-F1和PE-R1的PCR，合成一编码PE aa 1-49的核苷酸序列的159bp(碱基对)DNA片段，在这DNA的5’-端含有NdeI，DNA的3’-端含有EcoR1及XhoI。用XhoI和NdeI切割165bp的PCR产物，以分离一159bp片段。然后将其次转殖到用XhoI和NdeI切割pET15b而得的5.9kb的大DNA片段中，以产生pPE-49(6079bp)3’-端含有EcoR1及XhoI的质体。

表2

含连接多肽的pPE49质体的建构

在pPE-49的EcoR 1及Xho 1切位***linker-aDNA片段，如下表3所示。完成的pPE-49-linker2(pPE49L)质体的DNA片段及氨基酸片段序列如下表4所示。其中，pPE49L的氨基酸片段包括：位于N-端的转位肽及位于C-端的连接多肽

表3：连接端肽Linker-a序列

表4

Mt4基因设计以及含Mt4的P49L-Mt4的质体构筑

肌肉生长抑制素蛋白结合表位(Mt4)选自肌肉生长抑制素结合区的部分片段，其DNA片段及氨基酸片段序列如下表5所示。

表5

在Mt4合成DNA切取的Sal I及XhoI切位，***pP49L质体的XhoI切位，如下表6所示。完成的pP49L-Mt4质体具有如下表7所示的多肽序列。最后，将含有***片段的质体分别转殖到大肠杆菌中，并通过安比西林抗药性筛选出菌株。

表6

表7

1-2：PE407-Mt4融合蛋白多肽的建构

PE407-Mt4融合蛋白多肽包括：转位肽及肌肉生长抑制素结合表位。其中，转位肽来自绿脓杆菌外毒素，不含PE功能区Ib和III片段，但是含细胞器接合区PE功能区Ia及II片段。

pPE407质体的建构

在强噬菌体T7转录和(选择性地)转译信号的控制下，将PE407目标基因转殖到pET15b质体中；通过在宿主细胞中提供T7 RNA聚合酶来诱导表现。如以下建构质体pPE407。通过使用如下表8所示引子对PE-F2和PE-R2的PCR，合成一编码PE aa 1-407的核苷酸序列的一1224bp DNA片段。用XhoI和NdeI切割1238bp的PCR产物，以分离一1224bp片段。然后将其次转殖到用XhoI和NdeI切割pET15b而得的5.9kb的大DNA片段中，以产生质体pPE-407(7159bp)。

上述PE片段的核苷酸和氨基酸序列为多组氨酸(poly-His)表位，在5′-和3′-(或N-和C-)末端分别侧接有连接序列MGSSHHHHHH和LEHHHHHHZ。

表8

含Mt4的PE407-Mt4的质体构筑

将肌肉生长抑制素蛋白结合表位(Mt4)的DNA片段(如表6所示)连接到用EcoR1和XhoI限制酶切割的pPE407质体中(pET和PE类毒素载体衍生物质体)，使得Mt4被加在PE(ΔIII)片段C-末端。完成的pPE407-Mt4质体具有如下表9所示的多肽序列。最后，将含有***片段的质体分别转殖到大肠杆菌中，并经由安比西林抗药性筛选出菌株。

表9

1-3：小鼠试验-添加PE407-Mt4及P49L-Mt4作为饲料添加剂

前述所制得的PE407-Mt4及P49L-Mt4质体分别转殖到大肠杆菌中，进行培养。而后，将所培养的大肠杆菌进行细胞裂解及分离内含体(Inclusion body)，并选择性的将菌株裂解，而可得到一多肽萃取物。将多肽萃取物含量为1重量百分比，滑石粉的含量为80重量百分比，抗性淀粉的含量为1重量百分比，而乙基纤维素的含量为18重量百分比，而可得到本发明的饲料添加剂。将饲料添加剂与饲料基质以1.5∶98.5的重量比混合，则可得到本小鼠试验所使用的饲料。

购入4周龄雄性黄金鼠，每4只放在一个笼子中，并且每笼的小鼠调整成相似平均重量，以便在以后的实验中对于进行不同处理的组别维持相同的环境，实验前提供丸状饲料及水令其可自由采食将其隔离一周。在第5周龄起，动物笼随机分配成组如下表10所示，并且提供每头摄食丸状饲料添加各种样品以及低油脂(1％)饲料样品10g及水令其可自由采食，饲养至少1周后，在第6周龄再投予每头摄食丸状饲料添加各种样品以及高油脂(10％)的饲料样品5-10g及水令其可自由采食，再饲养至少4周至第10周龄。

实验期间记录每日饲料投量与残余量，计得每日消耗量。实验期间每周秤量老鼠体重，比较实验开始时与实验结束时的体重。计算饲料转换率(Feed Conversion Rate，FCR)其计算公式：日消耗量＝饲料投量-残余量。并使用Stat View软件进行Anova统计分析。结果如下表11所示。

口服含有PE407-Mt4及P49L-Mt4多肽的饲料添加剂的饲料，在第6、8、10周龄，通过穿刺眼窝后丛收集三只小鼠的血液。从血清中检测特异性抗体针对Mt4抗原的力价。采集血液样品，并且利用连续10倍稀释在ELISA中检测抗-Mt4特异性抗体的力价。结果如下表12所示。

表10

表11

表12：在不同血清样品中，通过ELISA试验在连续血稀释(1∶200-1∶1250)中检测Mt4特异性血清IgG活性。

前述结果证实，当PE407-Mt4及P49L-Mt4用于动物用的肌肉生长抑制素多肽饲料添加剂，包括含有Mt表位的PE407-Mt4及P49L-Mt4具有肌肉生长抑制素蛋白结合表位特异性抗体的诱发效果。因此，重组肌肉生长抑制素可通过饲料添加剂途径诱发对肌肉生长抑制素的免疫反应，导致黄金鼠体重增加，增强了饲料转换率。这是将细胞转型为食用疫苗以改善农场动物的肉类生产和对抗肌肉萎缩遗传病的重要步骤(Zhang T等人，BMCBiotechnol.2012Dec 19；12：97；Aravind S等人，J Virol Methods.2012 Nov；185(2)：234-8)。

此外，本实施例的饲料添加剂，以0.05％或0.025％比例添加于中猪或大猪料饲料中，进行肉猪体态试验。由试验结果确认三元猪种的中猪以及大猪，服用含有本实施例饲料添加剂的饲料，一个月后凸状的腹脐线消失，并且可以看到双脊双股的美体猪，屠体后猪肉质量特优，肌间脂肪细致，不再呈现劣质的水样肉。因此，本实施例的饲料添加剂，可以取代瘦肉精，是一种安全与环保产品。

实施例2-增强鸡只对抗抗鸡新城病(鸡瘟)的免疫力

在本实施例中，提供一种融合蛋白多肽饲料添加剂，添加饲料中可以增强鸡只新城病疫苗注射的免疫功效。其中，融合蛋白多肽的建构方法约略如下。

表13

含NDV-1的PE425-NDV-1的质体构筑

将新城病病毒NDV的Th1表位(NDV-1)的DNA片段(如表13所示)连接到用EcoR1和XhoI限制酶切割的pPE425质体中(pET和PE类毒素载体衍生物质体)，使得NDV-1被加在PE(ΔIII)片段C-末端。完成的pPE425-NDV-1质体具有如下表14所示的多肽序列。最后，将含有***片段的质体分别转殖到大肠杆菌中，并通过安比西林抗药性筛选出菌株。

表14

增强免疫力的鸡只试验(一)

前述所制得的质体分别转殖到大肠杆菌中，进行培养。而后，将所培养的大肠杆菌进行细胞裂解以及分离析出内含体(Inclusion bodies)，经清洗后可得到一多肽萃取物。析取多肽萃取物含量为1重量百分比，与滑石粉的含量为81重量百分比，及乙基纤维素的含量为18重量百分比等增量剂相混后，通过超威粉机的粉碎研磨，可得到本发明的饲料添加剂。

以300只体重相近、健康良好1日龄商用母蛋鸡，随机分成抗生素组(添加0.03w/w％Colistin及0.03w/w％Enramycin)、对照组(无添加抗生素及饲料添加剂)、及饲料添加剂组(添加低剂量0.025w/w％、中剂量0.05w/w％、高剂量0.1w/w％饲料添加剂)，每处理组4重复，每重复15只。饲料添加剂及抗生素分别于0-4周及10-13周添加于饲料中，观察0-15周龄蛋鸡的体增重、采食量并计算饲料效率。19-26周龄鸡只的产蛋率、蛋重、蛋产量及饲料换蛋率，并在6、16、26周测定血清的抗体力价。此外，鸡只在0-16周饲养于平面栏位并在第16周移至产蛋笼内，所有鸡只在6-15周，分别于饲粮中添加0.05％的球虫药(Decoguinate及Lasalocid)。结果如图1及图2所示。

如图1及图2结果显示，0-4周龄的鸡只及10-13周龄的鸡只，服用含有本实施例饲料添加剂的饲料，可显著增强鸡新城病病毒的免疫功效(p＜0.01)。此外，服用含有本实施例饲料添加剂的饲料，对于蛋鸡不存在副作用，与对照组相比，其产蛋率、蛋重、蛋产量及饲料换蛋率均不具有显著的差异。

实施例3-增强鸡只对抗禽流感的免疫力

在本实施例中，提供一种融合蛋白多肽，可以增强鸡只诱发禽流感M2抗原的抗体力价。其中，融合蛋白多肽的建构方法约略如下。

表15

将禽流感病毒的Th1表位(M2-Nr7)的DNA片段(如表15所示)连接到用EcoR1和Sal1限制酶切割的pPE425质体中(pET和PE类毒素载体衍生物质体)，使得M2-Nr7被加在PE(ΔIII)片段C-末端。完成的pPE425-M2-Nr7质体具有如下表16所示的多肽序列。最后，将含有***片段的质体分别转殖到大肠杆菌中，并通过安比西林抗药性筛选出菌株。

表16

增强免疫力的鸡只试验(二)

本实施例的鸡只试验与实施例2相同，其差异仅在于：本实施例的鸡只所服用的饲料中所添加的饲料添加剂，含有转殖有本实施例所制得融合蛋白多肽植体的大肠杆菌产制出来的多肽添加剂。结果如图3所示。

如图3结果所示，0-4周龄的鸡只及10-13周龄的鸡只，服用添加有0.1w/w％本实施例饲料添加剂的饲料，可增强禽流感表面抗原M2的抗体力价，且相对于对照组抗体力价，具有显著性差异(P＜0.01)。至于添加有0.05w/w％本实施例饲料添加剂的饲料的组别，相对于对照组抗体力价，也具有显著性差异(P＜0.05)。而添加有0.025w/w％本实施例饲料添加剂的饲料的组别，相对于对照组抗体力价，具有差异趋势(P＜0.1)。此外，服用含有本实施例饲料添加剂的饲料，与对照组相比，其产蛋率、蛋重、蛋产量及饲料换蛋率均不具有显著的差异。

增强免疫力的猪只试验

实施例4-增强免疫力对抗猪生殖与呼吸综合症及猪瘟的抵抗力

在本实施例中，提供两种融合蛋白多肽，来诱发猪只免疫力增强猪生殖与呼吸综合症及猪瘟的抵抗力。其中，两个融合蛋白多肽的建构方法大致如下。

融合蛋白多肽SEQ ID NO.28及SEQ ID NO.29的建构方法及序列

表17

表18

将蓝耳病病毒的Th1表位PR17及猪瘟的Th1表位SF1的DNA片段(如表17及表18所示)连接到用EcoR1和Xho1限制酶切割的pPE425质体中(pET和PE类毒素载体衍生物质体)，使得PR17及SF1被加在PE(ΔIII)片段C-末端。完成的pPE425-PR17及pPE425-CF1质体具有如下表19及表20所示的多肽序列。最后，将含有***片段的质体分别转殖到大肠杆菌中，并通过安比西林抗药性筛选出菌株。

表19

表20

猪只试验的试验方法

怀孕母猪(二元白猪)试验的安排

试验采用单因子实验设计，选择胎次为第二胎或第三胎，共27头正常怀孕且健康的怀孕100日的母猪，随机分成三个处理组(两试验组A.5，A.10以及一个对照组B)，每处理组分三重复，每重复为三头母猪。每处理组分开饲喂，母猪的蓝耳病活毒疫苗及猪瘟疫苗皆在配种前施打一剂量，怀孕期间不再施打此两种疫苗，其他免疫程序及日常护理则遵照猪场平日的管理方法。

前述所制得的PE425-PR17及PE425-SF1质体分别转殖到大肠杆菌中。而后，将所培养的大肠杆菌进行细胞裂解及分离内含体(Inclusion body)，而可得到多肽萃取物。并选择性的将菌株裂解而得到多肽萃取物。试验组所发明的饲料添加剂中都添加两个多肽萃取物(PE425-PR17及PE425-SF1)，这两个多肽萃取物添加含量分别为1％重量百分比，滑石粉的含量为81％重量百分比，而乙基纤维素的含量为18％重量百分比，而得到饲料添加剂YYP。将该饲料添加剂YYP与饲料基质(如下表21所示)以0.05％∶99.95％的重量比混合，则可得到本试验试验组A.5的饲料组合。饲料添加剂与饲料基质以0.1％∶99.9％的重量比混合，则可得到本试验试验组A.10的饲料组合。将以上配方搅拌均匀，每试验组的三个处理每日饲喂两次(早晚各一次)。母猪怀孕百日开始饲喂到小猪断奶及出栏后始结束试验(约32天)。对照组不服用本添加剂外其他都一样处理。采血安排在尚未服用的阶段(母猪怀孕99日)所有母猪，第二次采血是在乳猪出生后的第一天，第三次采血是在断奶前3天，采血间隔时间大约15天左右。

表21：母猪怀孕后期母猪料及哺乳期的基础日粮组成及营养水平

*：预混料：每千克预混料含有Cu 12.6mg，Fe 135.3mg，Zn 98.3mg，Mn 44.5mg，Co1.1mg，Se 0.7mg，I 0.6mg，维生素A 16000IU，维生素D 34550IU，维生素E 53.5IU，维生素K4.1mg，维生素B2 6.7mg，维生素B3 41.50mg，维生素B6 3.50mg，维生素B12 0.04mg，叶酸6.73mg，生物素0.36mg，胆碱0.34mg。

怀孕母猪(二元白猪)试验结果

与对照组相比，在母猪生产性能方面，日粮中添加多肽饲料添加剂YYP，在母猪产仔总数、断奶仔猪数、断奶仔猪成活率上影响不具统计学上的显著差异性(P＞0.05)。但是添加多肽饲料添加剂YYP(0.05％及％)对母猪的采食量、仔猪增重效果方面具有提高的作用(P＜0.05)，缩短母猪的断奶-发情间隔以及减少哺乳仔猪拉稀的比率具备统计显著的改善效率(P＜0.05)。

与对照组相比较，在母猪的日粮中添加一定量的多肽饲料添加剂YYP后，检测其血清中对于猪蓝耳病毒抗体力价，在一定程度上会增强母猪抗体IgG水平，同时维持极高水平猪蓝耳抗体IgG的S/P值(P＜0.05)。比较对照组可知，试验组A.5及A.10皆有效降低群组的抗体力价离散度，获得百分百的抗体转阳率(P＜0.05)。

表22：多肽添加剂对于母猪血清中蓝耳病毒抗体力价(S/P)及阳转率的影响

**：比照对照组，A.5及A.10的数据，其T-test统计结果达到显著差异水平(P＜0.05)。

检测其血清中对于猪瘟抗体力价，在一定程度上会推迟母猪猪瘟病毒抗体IgG水平下降，同时维持高水平猪瘟病毒抗体IgG的阳性率(P＜0.05)，但是不会影响母猪血清中猪瘟病毒抗体IgA含量(P＞0.05)。

表23：多肽添加剂对于母猪血清中猪瘟抗体力价及阳转率的影响

仔猪试验的安排

试验采用单因子实验设计，选择60头胎次相近，品种一致(二元白猪)，公母各半，体重相近的21日龄断奶猪仔，将仔猪随机分为三个处理(a.0.5、b.1、对照组c)，每个处理4重复，每重复5头仔猪。各组分栏饲喂，仔猪的免疫程序，猪蓝耳活毒疫苗以及猪瘟疫苗于20日龄施打第一针，于55日龄施打第二次猪瘟疫苗不施打蓝耳病疫苗，其他的疫苗防治以及日常护理遵照猪场平日的管理方法。

前述所制得的PE425-PR17及PE425-SF1质体分别转殖到大肠杆菌中。而后，将所培养的大肠杆菌进行细胞裂解及分离内含体(Inclusion body)，而可得到多肽萃取物。并选择性的将菌株裂解而得到多肽萃取物。试验组所公开的饲料添加剂中都添加两个多肽萃取物(PE425-PR17及PE425-SF1)，这两个多肽萃取物添加含量分别为1％重量百分比，滑石粉的含量为79％重量百分比，而乙基纤维素的含量为18％重量百分比而得到饲料添加剂YYP。将该饲料添加剂YYP与饲料基质(如下表24所示)以0.05％∶99.9％的重量比混合，则可得到本试验试验组a.0.5的饲料组合。饲料添加剂YYP与饲料基质以0.1％∶99.9％的重量比混合，则可得到本试验试验组b.1的饲料组合。将以上配方搅拌均匀，每试验组的4个处理。试验时把饲料添加到饲料塔中，一但发现饲料桶内剩量不多时得再追加，随时保持仔猪有饲料可吃。

表24：仔猪育成饲料配方

仔猪试验结果

仔猪在日粮中添加一定量的多肽饲料添加剂(0.05％或0.1％)YYP可以显著提高仔猪的采食量和增重效果(P＜0.05)。不会影响它们的料肉比(P＞0.05)，不会促使断奶仔猪的咳喘、腹泻及死亡的发生和加重(P＞0.05)。

一般而言对于仔猪有效的猪瘟防疫措施，猪瘟疫苗必需有两次的免疫注射(如三周及六或八周龄)，主要是第一次的注射后其保护效率仍不足。在20日龄通过免疫注射猪瘟疫苗施打后的仔猪试验，其中的对照组，其45日龄仔猪的血清阳转反应仍很差，无法达到血清中和力价1∶16。CSFVIDEXX试剂盒的抗体覆盖率(％)而言，如下表25所示，45日龄对照组仔猪的血清阻断率30％以下的猪数比上总猪数高达6/16，而阻断率＞40％者只有7/16。该对照组的血清，只有4.4成的仔猪于免疫注射两周后达40％覆盖率，其他5.6成的猪仔血清未达40％(无法达到40％覆盖率视为阴性反应)。

如下表25所示，试验组a.0.5仔猪45日龄的血清阻断率在30％以下的猪数比上总猪数只有2/16，而。试验组b.1仔猪45日龄的血清阻断率在30％以下的猪数比上总猪数亦为2/16，而阻断率在40％者试验组a.1仔猪高达14/16。

此外，对照组c在45日龄尚未施打第二次的猪瘟疫苗阶段，40％覆盖率阳性率只达44％，显示该猪群尚不具对抗猪瘟疾病保护力。在50％阻断率基准来检测保护力时，可知试验组a.0.5仔猪高达62.5％尚不具保护力，但是45日龄仔猪试验组b.1在50％阻断率阳性率高达87.5％，已经具备对抗猪瘟疾病保护力。

经统计分析多肽饲料添加剂YYP(0.1％)配方的试验猪b.1组的血清抗体检测结果，可知该猪群具备极显着的提高仔猪的猪瘟抗体阻断值(P＝0.004，P＜0.05)，而多肽饲料添加剂YYP(0.05％)配方的试验猪a.0.5组略达差异水平(P＝0.053，P＜0.1)。

表25：多肽添加剂YYP对于仔猪血清中猪瘟抗体力价及阳转率的影响

判断标准：a.0.5*：p＝0.053，b.1**：p＝0.004(T.test)

猪瘟抗体(阻断值)：该抗体检测采用ELISA法，疫苗免疫后，抗体阻断率≥40％，表示抗体阳性；阻断率≤30％，表示抗体阴性；阻断率在30～40％之间，应在数日后再对该动物重新检测。猪群猪瘟抗体阻断率＞40％达到100％，或者＞50％达到85％，离散度＜25％，表示猪群免疫状况很好；离散度在25％-40％表示免疫效果一般。母猪猪瘟抗体阻断率＞50％表示免疫合格。《IDEXX试剂盒》。

此外，目前野外毒的病毒株非常复杂，蓝耳疫苗的有效性很难评估。在一般的猪场，仔猪在0周至5周龄以前蓝耳病抗体力价低下，阳转率仍低，以及仔猪群力价离散率高，为一般的通病。一但猪场或周遭有蓝耳病疫情时，这段空窗期仔猪群最容易遭受蓝耳病毒侵犯，因而快速疫情扩散而来不及防范。

如下表26结果所示，试验组b.1仔猪45日龄的血清S/P值在0.4以下的猪数为0％，其血清阳转率达100％，由平均值及标准差值及T-test的P＝0.04，可知比照对照组c而言，该试验组的血清反应具备统计上的显著差异(P＜0.05)。

试验组a.0.5仔猪45日龄的血清S/P值在0.4以下的猪数比上总猪数者为30％，其血清阳转率只达70％。对照组c在45日龄的血清S/P值在0.4以下的猪数比上总猪数者为40％，显示该两组的猪群在45日龄期的免疫力仍低下尚不具备对抗蓝耳疾病的能力。

表26：YYP添加剂对于仔猪血清中猪蓝耳病的抗体力价及阳转率的影响

判断标准：a.0.5：p＝0.33，b.1**：p＝0.04(T.test)

该抗体检测采用《IDEXX试剂盒》PRRS-ELISA法，疫苗免疫后，抗体S/P值达0.4以上，表示抗体阳性；0.4以下，表示抗体阴性。施打疫苗后的S/P值的离散度在50％以下的仔猪群组，具备疫苗的集体免疫反应。离散度过大时表示有病毒侵犯的现象。

综上所述，仔猪猪蓝耳活毒疫苗以及猪瘟疫苗于20日龄施打后，在日粮中添加0.1％的多肽饲料添加剂YYP的试验组b.1与对照组相比较，可知试验组b.1猪仔增强了这两种疫苗施打的免疫效率，抗体力价水平以及阳性率皆显著提高(P＜0.05)。

种猪场田间试验

由上述的怀孕母猪及仔猪试验后，在母猪和断奶仔猪的基础日粮中添加一定量的YYP产品后，一定程度上能够提高母猪和断奶仔猪的生产效益。于是我们将YYP 0.05％量添加在母猪料(母后料及哺乳料)，YYP 0.1％量添加于仔猪的教槽料及保育料中。在千头的母猪的种猪场进行扩大田间试验，观察该添加剂对于一个蓝耳病感染场的效益。

试验地点选择于中国广东省博罗县某大型种猪场，该猪场蓝耳病成为常在疾病，烦恼好几年。在2017/1/10进行活毒蓝耳病疫苗的普免措施后，在分娩舍流产及仔猪死亡率并没有改善。因此于2017/1/15开始，将YYP 0.05％量添加在母猪料(母后料及哺乳料)中，YYP 0.1％量添加于仔猪的教槽料及保育料中。由于YYP饲料添加剂不是药物作用机理，而且蓝耳病的感染机制非常复杂，传播的管道也是多方面的，因此需要长期的观察才能理出效果。由以下表27分析，进行YYP饲料添加剂在该种猪场的效益评估，经四个月(2017/1-4)在该猪场的分娩舍，观察母猪生产的弱仔产率来判断YYP对于阻断繁殖障碍症的功效。而且在五月后保育舍的保育猪产生呼吸症亦明显获得改善。

表27

如表27结果所示，当喂食添加有本实施例饲料添加剂的饲料的试验猪只，罹患蓝耳病而产生弱仔的比率大幅降低。

综上所述，喂食添加有本发明饲料添加剂的饲料于动物时，可有效提升此动物对抗特定疾病(例如：鸡新城病、禽流感、肥胖症或猪生殖与呼吸综合症)的功效，进而提升此动物的生产力。

上述实施例仅系为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利保护范围所述为准，而非仅限于上述实施例。

Claims (14)

1.一种饲料添加剂，包括：

一菌体萃取物，包含多个菌株内含物，其中该些菌株内含物包括一多肽，该多肽包括：

一转位肽，其用于转位；以及

一结合表位。

2.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其中该转位肽位于该多肽的N-末端，而该结合表位位于该多肽的C-末端。

3.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其中该多肽更包括：一连接多肽，该连接多肽位于该转位肽与该结合表位间。

4.根据权利要求3所述的饲料添加剂，其中该连接多肽为一M细胞标靶多肽或一肠道上皮标靶多肽。

5.根据权利要求3所述的饲料添加剂，其中该连接多肽包含一氨基酸序列，其选自SEQID NO：1至4。

6.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其中该转位肽来自绿脓杆菌外毒素。

7.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其中该转位肽包含一仅去除功能区III的绿脓杆菌外毒素A片段。

8.根据权利要求7所述的饲料添加剂，其中该转位肽包含一去除功能区Ib及III的绿脓杆菌外毒素A片段。

9.根据权利要求8所述的饲料添加剂，其中该转位肽包含一氨基酸序列，如SEQ ID NO：5所示。

10.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其中该结合表位为一鸡新城病病毒表位、一禽流感病毒表位、一肌肉生长抑制素蛋白结合表位或一猪生殖与呼吸综合症病毒表位。

11.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其中该菌株为大肠杆菌菌株、乳酸杆菌菌株或肠球菌菌株。

12.根据权利要求1所述的饲料添加剂，更包括：

0.1重量百分比至1重量百分比的该菌体萃取物；

67重量百分比至87重量百分比的滑石粉；以及

10.5重量百分比至18重量百分比的乙基纤维素。

13.根据权利要求1所述的饲料添加剂，更包括：1.5重量百分比至15重量百分比的抗性淀粉。

14.一种饲料，包括：

0.03重量百分比至5重量百分比的如权利要求1至13任一项所述的饲料添加剂；以及

95重量百分比至99.97重量百分比的饲料基质。

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