TWI586364B - 調節血管新生與周圍細胞組成的方法與組合物 - Google Patents

Description

調節血管新生與周圍細胞組成的方法與組合物

本發明係關於調節血管新生與周圍細胞組成的方法與組合物。

血管新生(形成新血管的過程)在許多正常與非正常生理狀況中係重要的。正常生理狀況下，人類與動物在特定且有限的情況下進行血管新生。例如，通常在傷口癒合、胚胎發育以及黃體、子宮內膜與胎盤形成中發現血管新生。

不欲或非適當調節的血管新生發生於許多異常中，其中異常內皮生長會造成或參與病理過程。例如，血管新生參與許多腫瘤的生長。已經知道失去調控的血管新生牽涉於病理過程中，諸如類風濕性關節炎、視網膜病變、血管瘤(hemangiomas)與牛皮癬。已經將存在有非受控制之血管新生的不同病理疾病狀態歸類成血管新生相關之疾病。

咸信受控制與非受控制之血管新生兩者以相似方式進行。微血管主要係由內皮細胞與周圍細胞(pericyte)組成，由基底膜所環繞。血管新生開始於內皮細胞與白血球釋出之酵素對基底膜的侵蝕。血管內腔之襯裡的內皮細胞接著突出穿過基底膜。血管新生因子引發內皮細胞 遷移穿過侵蝕之基底膜。遷移細胞形成自原本血管突出之「嫩芽」，其中內皮細胞進行有絲***與增殖。內皮嫩芽彼此融合而形成微血管圈，產生新血管。

已經證實抑制血管新生的試劑可有效治療多種異常。已經證實結合血管內皮生長因子(VEGF)之單株抗體Avastin^TM(貝伐單抗(bevacizumab))可有效治療多種癌症。已經證實結合VEGF之適體(aptamer)Macugen^TM可有效治療新血管性(濕)年齡相關之斑部退化。SDF/CXCR4信號路徑的拮抗劑可抑制腫瘤新血管作用並有效地對抗小鼠模式中的癌症(Guleng等人，Cancer Res.2005 Jul 1；65(13)：5864-71)。異香豆素2-(8-羥-6-甲氧-1-側氧-1H-2-苯并哌喃-3-基)丙酸(NM-3)已經完成第1期臨床評估，其係口服生物可用之血管新生抑制劑。NM-3在試管內直接殺死內皮與腫瘤細胞兩者，且係有效於治療不同的人類腫瘤異種移植之小鼠(Agata等人，Cancer Chemother Pharmacol.2005 Dec；56(6)：610-4.)。已經顯示沙利竇邁(thalidomide)與相關化合物在癌症治療中的有利作用，且雖然作用的分子機制尚未明瞭，但血管新生的抑制似乎係抗-腫瘤作用的重要構成要素(參閱例如，Dredge等人，Microvasc Res.2005 Jan；69(1-2)：56-63)。TNF-α拮抗劑在治療類風濕性關節炎中的成功部分係歸因於在紅腫關節組織上的抗血管新生作用(Feldmann等人，Annu Rev Immunol.2001；19： 163-96)。廣泛地預期抗血管新生治療具有對其他炎性疾病(特別係牛皮癬)的有利作用。雖然許多抗血管新生劑具有在血管新生上的作用而不需理會影響之組織為何，但其他血管新生劑傾向具有組織選擇性作用。

周圍細胞係血管組織之一組成細胞類型，伴隨著內皮細胞與平滑肌細胞。周圍細胞對內皮細胞的比例在中央神經系統中最高，而咸信周圍細胞在血腦障壁中扮演重要的角色。糖尿病性視網膜病變以視網膜微血管中之周圍細胞損失著名，且咸信這種周圍細胞損失對疾病的進展具有重要的病生理作用。

樂見有額外的組合物與方法來抑制血管新生且提高血管化組織中的周圍細胞覆蓋。這些包括能抑制不欲之血管生長(不論是普遍性或是在某些組織與/或疾病狀態中)的方法與組合物。

某種程度上，本揭露呈現類活化素激酶I(ALK1)-介導之調控系統的特性描述以及此系統在活體內血管新生與調控血管化組織中周圍細胞覆蓋的角色。某些態樣中，本揭露提供ALK-1配體的拮抗劑以及上述拮抗劑作為抗血管新生劑或提高周圍細胞覆蓋的應用。此外，本揭露提供ALK-1本身的拮抗劑以及上述拮抗劑作為抗血管新生劑的應用。如本文所述，ALK1係配體GDF5類(包括 GDF6與GDF7)的受體，並亦為配體BMP9類(包括BMP10)的受體。本揭露顯示ALK1介導之信號傳遞與上述配體係牽涉於活體內血管新生作用中，且此調控系統的抑制具有有效的抗血管新生作用。此外，本揭露顯示ALK1調控系統的抑制造成提高血管化組織中之周圍細胞覆蓋。因此某些態樣中，本揭露提供ALK1調控系統的拮抗劑(包括受體或一或更多配體的拮抗劑)用於抑制血管新生。某些態樣中，本揭露提供ALK1配體的拮抗劑用於治療癌症，特別係多發性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、胰臟癌(特別係胰臟內分泌組織的腫瘤)、乳癌(諸如，原發性乳癌或轉移性乳癌；動情素受體陽性(ER+)或動情素受體陰性(ER-))、類風濕性關節炎、眼睛中病理血管新生相關之異常以及血管化組織中周圍細胞損失相關之異常，例如糖尿病性視網膜病變。

某些態樣中，本揭露提供包括ALK1之細胞外區塊之配體結合部分的聚胜肽(「ALK1 ECD聚胜肽」)用於抑制血管新生。雖然不希望受到任何特定作用機制的束縛，但預期上述聚胜肽藉由結合至ALK1之配體並抑制這些配體與ALK1以及其他受體交互作用的能力而作用。某些實施例中，ALK1 ECD聚胜肽包含之胺基酸序列係至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同於序列編號：1之人類ALK1序列的22-118胺基酸序列。ALK1 ECD聚胜肽可應用成小單體蛋白或二聚化 形式(例如，表現成融合蛋白)，特別係用於局部施加至組織(例如，眼睛)。亦可將ALK1 ECD融合至第二聚胜肽部分以提供改良之特性，例如半生期提高或者生產或純化的較大便利。融合至免疫球蛋白之Fc部分或鍵結至聚氧乙烯部分(例如，聚乙二醇)可特別有用於提高ALK1 ECD聚胜肽在全身性施加(諸如，靜脈內、動脈內與腹膜內施加)的血清半生期。如本文所示，全身性施加之ALK1-Fc聚胜肽具有眼睛中之有效抗血管新生作用並亦提供類風濕性關節炎與多種腫瘤之鼠科模式中的正面作用。某些實施例中，ALK1-Fc融合蛋白包括一聚胜肽的胺基酸序列係至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同於序列編號：1之胺基酸序列22-118，以間隔連接子或不以間隔連接子任一者方式將聚胜肽融合至免疫球蛋白之Fc部分，且其中ALK1-Fc融合蛋白以低於1 x 10^-7M的K_D結合至GDF5、GDF7與BMP9且以高於1 x 10^-6的K_D結合至TGFβ-1。可選擇與有機體相稱的Fc部分。Fc部分選擇性地係人類IgG1的Fc部分。較佳實施例中，ALK1-Fc融合蛋白包括序列編號：1之胺基酸22-118。ALK1-Fc融合蛋白選擇性地包括序列編號：3之胺基酸序列。ALK1-Fc融合蛋白係選擇性地藉由在哺乳類細胞株(特別係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株)中表現序列編號：4之核酸產生的蛋白。可將ALK1-ECD聚胜肽配置成實質無熱源(pyrogen free)藥學配製物。可將藥學配製物配置用於全身性施加(諸 如，靜脈內、動脈內或皮下輸送)或局部施加(例如，至眼睛)。

某些態樣中，本揭露確定發展用於治療背景之ALK1-Fc融合蛋白的相當同質性製備物的難題。如本文所述，ALK1-Fc融合蛋白傾向聚集成較高階的多聚體。本揭露提供針對這些難題的解決方法並因此提供包括ALK1-Fc融合蛋白之藥學製備物，其中上述製備物係至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%由二聚體式ALK1-Fc融合蛋白所構成。因此某些態樣中，本揭露提供包括ALK1-Fc融合蛋白之藥學製備物，ALK1-Fc融合蛋白包括：胺基酸序列係至少97%相同於序列編號：1之胺基酸序列22-118的聚胜肽，聚胜肽係融合至免疫球蛋白之Fc部分，且其中ALK1-Fc融合蛋白以低於1 x 10^-7M的K_D結合至GDF5、GDF7與BMP9並以高於1 x 10^-6的K_D結合至TGFβ-1，且其中至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的ALK1-Fc融合蛋白係以二聚體形式存在。ALK1-Fc融合蛋白之Fc部分可為人類IgG1之Fc部分。ALK1-Fc融合蛋白可包括序列編號：3之胺基酸序列。藉由在哺乳類細胞株(特別係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株)中表現序列編號：4之核酸產生ALK1-Fc融合蛋白。可將上述藥學製備物配置成適合施加至眼睛，特別係藉由注射。揭露之藥學製備物可用於多種本文所述之治療目的，包括抑制血管新生、治療腫瘤、治療類風濕 性關節炎、治療血管新生相關之眼睛異常及治療血管化組織中周圍細胞覆蓋損失相關之異常(例如，糖尿病性視網膜病變)。可搭配抑制血管新生的第二藥劑(例如，VEGF拮抗劑(諸如，Avastin^TM、索拉非尼(sorafenib)與VEGF受體陷阱)來應用ALK1-Fc藥學製備物。

本揭露顯示ALK1信號路徑的拮抗劑提高血管化組織中之周圍細胞覆蓋。因此，本揭露提供促進提高哺乳類血管化組織中之周圍細胞覆蓋的方法。上述拮抗劑可為任何本文所述之拮抗劑，包括ALK1 ECD蛋白(例如，ALK1-Fc)、DAN蛋白以及指向ALK1與任何其之配體(包括BMP9、BMP10、GDF5、GDF6與GDF7)的抗體。某些態樣中，本揭露提供促進提高有需要之哺乳類血管化組織中之周圍細胞覆蓋的方法，該方法包括對哺乳類施加有效劑量的ALK1 ECD蛋白。ALK1 ECD蛋白可為ALK1-Fc融合蛋白，而ALK1-Fc融合蛋白包括之一聚胜肽的胺基酸序列係至少90%相同於序列編號：1之胺基酸序列22-118，聚胜肽係融合至免疫球蛋白之Fc部分，且其中ALK1-Fc融合蛋白以高於1 x 10^-6的K_D結合至TGFβ-1。ALK1 ECD蛋白可結合至一或更多選自下列所構成之群組的ALK1配體：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10。ALK1 ECD聚胜肽包括之胺基酸序列係至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同於對應序列編號：1之胺基酸34-95的胺基酸序列。ALK1 ECD可 包括在嚴格雜合條件下與序列編號：2之核苷酸100-285(或編碼相同胺基酸序列的序列編號：2之核苷酸100-285變體)雜合之核酸所編碼的胺基酸序列。ALK1-Fc融合蛋白可具有序列編號：3之序列。可靜脈內或局部地輸送ALK1 ECD融合蛋白至眼睛。某些態樣中，本揭露提供促進提高有需要之哺乳類血管化組織中之周圍細胞覆蓋的方法，該方法包括對哺乳類施加有效劑量的抗體，其結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成之ALK1聚胜肽並抑制至少一選自下列所構成之群組之ALK1配體的結合：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10。抗體以低於5 x 10^-8M、低於1 x 10^-9M或低於1 x 10^-10M的K_D結合至ALK1聚胜肽。抗體可抑制ALK1對ALK1配體的結合，其中ALK1配體係選自下列所構成之群組：BMP9與BMP10。可靜脈內或眼睛內地施加抗體。WO 2007/040912中描述之抗體可用於上述方法中。可以與抑制血管新生的第二試劑(例如，VEGF拮抗劑)一起施加ALK1信號拮抗劑。欲治療之哺乳類可具有糖尿病性視網膜病變或其他視網膜異常(特徵係視網膜血管組織中之周圍細胞覆蓋的損失)或選自下列所構成之群組的腫瘤：黑色素瘤、肺腫瘤、多發性骨髓瘤、胰臟腫瘤(例如，胰臟內分泌組織的腫瘤)、乳癌(諸如，原發性乳癌或轉移性乳癌；動情素受體陽性(ER+)或動情素受體陰性(ER-))。

某些態樣中，本揭露提供抑制哺乳類之血管新生的方法，其藉由施加任何本文普遍或特定描述之ALK1 ECD聚胜肽。一實施例中，方法包括對哺乳類施加有效劑量的ALK1-Fc融合蛋白，其中ALK1 Fc融合蛋白包括之一聚胜肽的胺基酸序列係至少90%相同於序列編號：1之胺基酸序列22-118，聚胜肽係融合至免疫球蛋白的Fc部分，且其中ALK1-Fc融合蛋白以高於1 x 10^-6的K_D結合至TGFβ-1。ALK1-Fc融合蛋白選擇性地結合至一或更多選自下列所構成之群組的ALK1配體：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10。ALK1-Fc融合蛋白選擇性地具有序列編號：3之序列。可局部地(例如，至眼睛)或全身性地(諸如，靜脈內、動脈內或皮下)施加ALK1 ECD聚胜肽。特定實施例中，本揭露提供抑制哺乳類眼睛之血管新生的方法，其藉由在一遠離眼睛的位置施加ALK1-Fc蛋白至哺乳類，例如全身性施加。

某些態樣中，本揭露提供結合至ALK1(特別係位於細胞外區塊、序列編號：1之胺基酸22-118中的表位)並抑制ALK1對至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體之結合的抗體：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10。根據這些配體對ALK1的親合力，抗體可以低於5 x 10^-8M且選擇性介於5 x 10^-8與1 x 10^-10間之K_D結合。預期親合力在此範圍間之抗體可抑制一或更多GDF5、6與7的信號，但對BMP9與10的信號具有較少的作用。上述 抗體較佳地抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體所引發的血管新生：GDF5、GDF6與GDF7。雖然不希望受到特定機制的束縛，但預期上述抗體將直接地抑制ALK1活性，這應與ALK1-Fc融合蛋白(預期可抑制ALK1配體之活性)之活性相反。並不預期抗-ALK1抗體干擾GDF5、GDF6、GDF7、BMP9或BMP10透過替代受體系統(諸如，BMPR1a、BMPR1b與BMPRII複合體)的信號傳遞能力。然而，預期抗-ALK1抗體會干擾ALK1低親合力配體(例如，TGF-β，其通常歸類成透過ALK-1觸發明顯信號事件，即便結合係相當弱)透過ALK1傳遞信號的能力，即便ALK1 ECD可能不結合或抑制上述低親合力配體。抗體可以低於1 x 10^-10M的K_D結合ALK1聚胜肽。將預期親合力位於此範圍內的抗體可抑制經由BMP9或10的信號傳遞。上述抗體較佳地抑制BMP9與BMP10對ALK1的結合。尤其，根據本文所揭露之數據，結合ALK1相當差的抗體可抑制TGFβ結合至ALK1但卻無法抑制結合較緊的配體(諸如，GDF5或BMP9)。本文所述之抗體較佳係重組抗體，意謂已經利用分子生物技術構築之核酸表現的抗體，諸如單鏈抗體發展而來的人類化抗體或完全人類抗體。Fv、Fab與單鏈抗體亦包括於詞彙「重組抗體」中。抗體亦可為多株或非重組性單株抗體(包括人類或鼠科類型以及取自基因轉殖小鼠之人類抗體)。可將抗體與ALK1-ECD聚胜肽配置成實質無熱源的藥學製備物。可將藥學製備物配置用於全身性施 加(諸如，靜脈內、動脈內或皮下輸送)或局部施加(例如，至眼睛)。WO 2007/040912中描述之抗體可用於本文所述之多種方法中。

某些態樣中，本揭露提供抑制哺乳類之血管新生的方法，其藉由對哺乳類施加有效劑量的本文普遍或特定描述之抗體(結合至ALK1聚胜肽)。用於此目的之抗體可結合至ALK1之細胞外區塊(例如，結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成之聚胜肽)或ALK1的另一部分。抗體可結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成的聚胜肽並抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體之結合：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10。抗體可以低於5 x 10^-8M與選擇性5 x 10^-8與1 x 10^-10之間的K_D結合至ALK1聚胜肽。抗體可抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體所刺激的血管新生：GDF5、GDF6與GDF7。選擇性抑制GDF5、6或7所介導之信號傳遞(相對於BMP9或10所介導之信號傳遞)的抗體可用來作為發生在GDF5、6或7所在組織(主要係骨頭或關節)中之血管新生的選擇性抑制劑。抗體可以低於1 x 10^-10M的K_D結合至ALK1聚胜肽。抗體可抑制ALK1對ALK1配體的結合，其中ALK1配體係選自下列所構成之群組：BMP9與BMP10。可局部地(例如，至眼睛)或全身性地(諸如，靜脈內、動脈內或皮下)施加抗-ALK1抗體。特定實施例中，本揭露提供抑制哺乳類眼睛之血 管新生的方法，其藉由施加抗-ALK1抗體。另一特定實施例中，本揭露提供治療具有多發性骨髓瘤之患者的方法。特定實施例中，本揭露提供在因為多個促血管新生因子(諸如，VEGF、PDGF與/或FGF)之病理血管新生異常中抑制血管新生的方法。

某些態樣中，本揭露提供結合本文揭露之ALK1配體並抑制ALK1配體對ALK1之結合的抗體。雖然不希望受到任何特定機制的束縛，但預期結合ALK1配體之抗體將具有性質類似ALK1 ECD聚胜肽的作用，因為兩種類型的試劑結合至配體而不是受體本身。某些實施例中，抗體結合至選自GDF5、GDF6、GDF7所構成之群組的配體。抗體可以低於5 x 10^-8M的K_D結合至ALK1配體。可針對抑制ALK1配體促進之血管新生來選擇抗體。CAM試驗係選擇所欲抗體的適當試驗系統。上述抗體較佳係重組抗體，且可配置成實質無熱源的藥學製備物。可將藥學製備物配置用於全身性施加(諸如，靜脈內、動脈內或皮下輸送)或局部施加(例如，至眼睛)。

某些態樣中，本揭露提供結合至ALK1配體且抑制ALK1配體對ALK1之結合的抗體，其中ALK1配體係選自BMP9與BMP10所構成之群組。抗體可以低於1 x 10^-10M的K_D結合至ALK1配體。上述抗體較佳係重組抗體，且可配置成實質無熱源的藥學製備物。可將藥學製備物 配置用於全身性施加(諸如，靜脈內、動脈內或皮下輸送)或局部施加(例如，至眼睛)。

某些態樣中，本揭露提供抑制哺乳類之血管新生的方法，該方法包括對哺乳類施加有效劑量的抗體，該抗體結合至ALK1配體且抑制ALK1配體對ALK1的結合，其中ALK1配體係選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10所構成之群組。抗體可抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體所刺激之血管新生：GDF5、GDF6與GDF7。

BMP/GDF家族的成員(包括BMP9、BMP10、GDF5、GDF6與GDF7)結合至第I型與第II型受體以形成功能性信號複合體。這些受體的結合位置係不同的。因此，某些實施例中，結合至ALK1配體且抑制配體對ALK1結合之抗體係在第I型受體之配體結合位置處或附近結合之抗體。

某些態樣中，本揭露提供抑制哺乳類之血管新生的方法，其藉由施加本文揭露之ALK1信號傳遞系統的其他抑制劑。上述抑制劑可包括減少ALK1、GDF5、GDF6、GDF7、BMP9或BMP10之生產的核酸(諸如，反義(antisense)或RNAi構築體)。亦可應用多種親合性結合試劑，諸如適體、隨機胜肽、蛋白支架，其經修飾而可結合至選擇之目標(上述支架的實例包括anticalins與FNIII區塊)；各個實例中，可針對破壞本文所述之ALK1 調控系統的能力來選擇親合性結合試劑，藉由破壞ALK1-配體交互作用或藉由抑制結合後發生之信號傳遞任一者。

進一步實施例中，本揭露描述DAN作為ALK1調控系統之調節者的角色。如本文所示，DAN結合至GDF5類的配體但無法結合至BMP9類的配體。因此，預期DAN可抑制GDF5、GDF6或GDF7介導之血管新生但無法抑制BMP9或BMP10介導之血管新生。因此，DAN可應用成抑制骨頭或關節(其中主要表現GDF5類的蛋白)中血管新生的選擇性試劑。因此某些實施例中，本揭露提供在骨頭或關節血管新生背景(包括類風濕性關節炎以及牽涉骨頭或關節之癌症(諸如，多發性骨髓瘤與骨頭轉移))應用成抗血管新生試劑之DAN蛋白。DAN蛋白通常結合至一或更多選自下列所構成之群組的ALK1配體：GDF5、GDF6與GDF7，但對BMP9或BMP10的結合相當差。DAN蛋白包括之一胺基酸序列係至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同於對應序列編號：10之胺基酸17-180(成熟的人類DAN)或對應序列編號：10之胺基酸21-125(DAN的保留性半胱胺酸結區塊)之胺基酸序列。DAN蛋白亦可由一核酸所編碼，該核酸序列之互補在嚴格雜合條件下雜合至序列編號：11之核苷酸153-467或具有相同編碼序列之序列編號：11之核苷酸153-467變體(「靜默」變體，例如在三聯 密碼之搖擺位置處包含一或更多改變)、或雜合至序列編號：11之核苷酸93-635或其之靜默變體。某些態樣中，DAN蛋白係融合蛋白，例如Fc融合蛋白。雖然預期DAN特別有用於抑制骨頭與關節(包括位於骨頭或關節中之腫瘤，諸如多發性骨髓瘤與骨頭轉移)中之血管新生，但其亦可用於其他背景中，例如位於別處之腫瘤或眼睛中。

某些態樣中，本揭露提供治療哺乳類之類風濕性關節炎的方法，該方法包括對具有類風濕性關節炎之哺乳類施加有效劑量之選自下列所構成之群組的試劑：ALK1 ECD蛋白；結合至ALK1配體且抑制ALK1配體對ALK1之結合的抗體，其中ALK1配體係選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10所構成之群組；結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成的ALK1聚胜肽且抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體之結合的抗體：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10；及DAN聚胜肽。

某些態樣中，本揭露提供治療哺乳類之腫瘤的方法。上述方法可包括對具有腫瘤之哺乳類施加有效劑量之選自下列所構成之群組的試劑：ALK1 ECD蛋白(例如，ALK1-Fc)；結合至ALK1配體且抑制ALK1配體對ALK1之結合的抗體，其中ALK1配體係選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10所構成之群組；結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成的ALK1聚胜肽且抑制至 少一選自下列所構成之群組的ALK1配體之結合的抗體：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10；及DAN聚胜肽。方法可進一步包括施加抑制血管新生之第二試劑。腫瘤可以為骨頭相關之腫瘤，諸如白血病、骨髓腫瘤、多發性骨髓瘤或骨頭轉移(例如，通常伴隨乳癌或***癌之那些骨頭轉移)。腫瘤可以係黑色素瘤、肺癌腫瘤、胰臟腫瘤(例如，胰臟內分泌組織之腫瘤)、或乳癌(諸如，原發性乳癌或轉移性乳癌)。乳癌可以係動情素受體陽性(ER+)或動情素受體陰性(ER-)。腫瘤亦可為應用多個促血管新生因子之腫瘤，例如對抗-VEGF治療有抗性之腫瘤。

某些態樣中，本揭露提供眼用配方。上述配方可包括選自下列所構成之群組的試劑：ALK1 ECD蛋白；結合至ALK1配體且抑制ALK1配體對ALK1之結合的抗體，其中ALK1配體係選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10所構成之群組；結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成的ALK1聚胜肽且抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體之結合的抗體：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10；及DAN聚胜肽。

某些態樣中，本揭露提供治療眼睛之血管新生相關疾病的方法。上述方法包括全身性施加或對眼睛施加藥學配方，其包括有效劑量之選自下列所構成之群組的試劑：ALK1 ECD蛋白；結合至ALK1配體且抑制ALK1 配體對ALK1之結合的抗體，其中ALK1配體係選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10所構成之群組；結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成的ALK1聚胜肽且抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體之結合的抗體：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10；及DAN聚胜肽。

各個實例中，本文描述之試劑可搭配抑制血管新生之第二試劑加以施加。在欲抑制腫瘤之血管新生的位置處，可搭配具有抗-癌症作用之第二試劑(諸如，化學治療劑或生物抗-癌症劑)施加該試劑。

本揭露亦提供包括ALK1-Fc融合蛋白之眼用藥學配方，ALK1-Fc融合蛋白的一胺基酸序列係至少97%、98%或99%相同於序列編號：1之胺基酸序列22-118，聚胜肽係融合至免疫球蛋白之Fc部分，且其中ALK1-Fc融合蛋白以低於1 x 10^-7M的K_D結合至GDF5、GDF7與BMP9並以高於1 x 10^-6的K_D結合至TGFβ-1。一實施例中，融合蛋白具有序列編號：3之序列。一實施例中，Fc部分係來自人類IgG1。一實施例中，融合蛋白係藉由在哺乳類細胞株中表現序列編號：4之核酸所產生。一實施例中，細胞株係中國倉鼠卵巢細胞株。配方可進一步包括一或更多下列藥劑：培加尼布(pegaptanib)、雷珠單抗(ranibizumab)或醣皮質素(glucocorticoid)。一實施例中，配方係實質無熱源。

申請案亦提供包括一抗體之眼用藥學配方，抗體結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成之ALK1聚胜肽且抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體之結合：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10。一實施例中，抗體抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體所刺激之血管新生：GDF5、GDF6與GDF7。一實施例中，抗體以低於5 x 10^-8M的K_D結合至ALK1聚胜肽。另一實施例中，抗體以低於1 x 10^-10M的K_D結合至ALK1聚胜肽。一實施例中，抗體抑制GDF5、GDF6、GDF7、BMP9或BMP10所刺激之血管新生。配方可進一步包括一或更多下列藥劑：培加尼布、雷珠單抗或醣皮質素。一實施例中，配方係實質無熱源。

某些態樣中，本揭露提供包括一抗體之眼用藥學配方，抗體結合至本文所揭露之ALK1配體且抑制ALK1配體對ALK1之結合。某些實施例中，抗體結合至選自GDF5、GDF6與GDF7所構成之群組的配體。抗體可以低於5 x 10^-8M的K_D結合至ALK1配體。可針對抑制ALK1配體所刺激之血管新生來選擇抗體。CAM試驗係選擇所欲抗體之適當試驗系統。上述抗體較佳係重組抗體。配方可進一步包括一或更多下列藥劑：培加尼布、雷珠單抗或醣皮質素。一實施例中，配方係實質無熱源。

申請案亦提供治療眼睛之血管新生相關疾病的方法，其包括對眼睛施加包括ALK1-Fc融合蛋白之眼用藥學配方，ALK1-Fc融合蛋白包括：一聚胜肽，其之胺基酸序 列係至少97%、98%或99%相同於序列編號：1之胺基酸序列22-118，聚胜肽係融合至免疫球蛋白之Fc部分，且其中ALK1-Fc融合蛋白以低於1 x 10^-7M的K_D結合至GDF5、GDF7與BMP9並以高於1 x 10^-6的K_D結合至TGFβ-1。一實施例中，融合蛋白具有序列編號：3之序列。一實施例中，Fc部分係來自人類IgG1。一實施例中，融合蛋白係藉由在哺乳類細胞株表現序列編號：4之核酸所產生。一實施例中，細胞株係中國倉鼠卵巢細胞株。配方可進一步包括一或更多下列藥劑：培加尼布、雷珠單抗或醣皮質素。一實施例中，配方係實質無熱源。

申請案亦提供治療眼睛之血管新生相關疾病的方法，其包括對眼睛施加包括一抗體之眼用藥學配方，該抗體結合至序列編號：1之胺基酸22-118所構成之ALK1聚胜肽且抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體之結合：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10。一實施例中，抗體抑制至少一選自下列所構成之群組的ALK1配體所刺激之血管新生：GDF5、GDF6與GDF7。一實施例中，抗體以低於5 x 10^-8M的K_D結合至ALK1聚胜肽。另一實施例中，抗體以低於1 x 10^-10M的K_D結合至ALK1聚胜肽。一實施例中，抗體抑制GDF5、GDF6、GDF7、BMP9或BMP10所刺激之血管新生。配方可進一步包括一或更多下列藥劑：培加尼布、雷珠單抗或醣皮質素。一實施例中，配方係實質無熱源。

本揭露方法之一實施例中，血管新生相關疾病係選自 下列所構成之群組：腫瘤、對抗-VEGF治療有抗性之腫瘤、多發性骨髓瘤腫瘤、轉移至骨頭之腫瘤、關節或骨頭發炎、類風濕性關節炎、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity)、斑部退化、角膜移植排斥、新生血管性青光眼與晶狀體後纖維增生症(retrolental fibroplasias)。

1. 概述

ALK1係TGF-β超家族配體之第I型細胞-表面受體，並亦稱為ACVRL1與ACVRLK1。已經暗指ALK1為TGF-β1、TGF-β3與BMP-9的受體(Marchuk等人，Hum Mol Genet.2003；Brown等人，J Biol Chem.2005 Jul 1；280(26)：25111-8)。

小鼠中，ALK1中的功能喪失突變導致多種發育血管組織中的異常(Oh等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 2000,97,2626-2631；Urness等人，Nat.Genet.2000,26,328-331)。

人類中，ALK1中的功能喪失突變係相關於遺傳性出血性血管擴張症(HHT，或Osler-Rendu-Weber症候群)，其中患者形成動靜脈畸形，其產生由動脈直接流動(交流)至靜脈(動靜脈分流)而不具有間隔的微血管床。具有HHT之患者的典型症狀包括復發性鼻出血(recurrent epistaxis)、胃腸道出血、皮膚與黏膜皮膚毛細血管擴張 以及肺、腦或肝臟血管組織中的動靜脈畸形(AVM)。

David等人(Blood.2007 Mar 1；109(5)：1953-61.)與Scharpfenecker等人(J Cell Sci.2007 Mar 15；120(Pt 6)：964-72)的近期刊物斷定內皮細胞中BMP9與BMP10活化ALK1，且此活化的結果係抑制內皮細胞增殖與遷移。這些作用與那些促血管新生因子(例如，VEGF)正好相反。因此，這些刊物斷定BMP9與BMP10本身係抗-血管新生因子，並進一步斷定ALK1活化具有抗血管新生作用。相反地，本揭露顯示BMP9與BMP10之拮抗劑(而不是致效劑)具有抗血管新生作用。

本揭露係關於發現包含ALK1細胞外區塊之部分的聚胜肽(「ALK1 ECD聚胜肽」)可用於活體內抑制血管新生，包括與VEGF無關的血管新生以及由多個血管新生因子(包括VEGF、FGF與PDGF)介導之血管新生。本揭露部分地提供生理上ALK1的高親合力配體身分並顯示ALK1 ECD聚胜肽抑制血管新生。數據顯示即便在ALK1 ECD聚胜肽未顯示對TGF-β1有意義結合的實例中，ALK1 ECD聚胜肽可發揮抗血管新生作用。再者，ALK1 ECD聚胜肽抑制許多不同促血管新生因子(包括VEGF、FGF與GDF7)所刺激之血管新生。因此，本揭露提供ALK1調控系統的描述，其中ALK1係GDF5類配體(包括GDF6與GDF7)的受體，並亦是BMP9類配體(包括BMP10)的受體，這兩類配體的親合性不同。再者，本揭 露顯示ALK1與上述配體所介導之信號傳遞係活體內促血管新生，且抑制此調控系統具有有效的活體內抗血管新生作用。因此某些態樣中，本揭露提供ALK1調控系統的拮抗劑(包括受體或一或更多配體之拮抗劑)用於抑制血管新生，包括VEGF-依賴性血管新生及與VEGF無關的血管新生兩者。然而，應當注意預期指向ALK1本身與指向ALK1 ECD聚胜肽之抗體具有不同作用。預期針對ALK1之全中和抗體(pan-neutralizing antibody)(一種抑制所有強與弱配體之結合的抗體)將抑制上述配體透過ALK1的信號傳遞，但不預期會抑制上述配體透過其他受體(諸如，GDF5-7實例中的BMPR1a、BMPR1b、BMPRII以及TGFβ實例中的BMP9-10、TBRI與TBRII)之信號傳遞的能力。另一方面，預期ALK1 ECD聚胜肽將抑制所有其緊密結合之配體，包括實施例中顯示之構築體、GDF5-7與BMP9-10；但不會影響其虛弱結合之配體，例如TGF-β。因此，當針對ALK1之全中和抗體阻擋BMP9與TGF-β透過ALK1的信號傳遞時，其不會阻擋BMP9與TGF-β透過另一受體的信號傳遞，且當ALK1 ECD聚胜肽可抑制BMP9透過所有受體(甚至ALK1以外之受體)的信號傳遞時，並不預期其抑制TGF-β透過任何受體(甚至係ALK1)的信號傳遞。

除非另有明示，否則本文所述之蛋白係人類形式。蛋白的Genbank參考如下：人類GDF5，CAA56874；人類 GDF6，AAH43222；人類GDF7，NP_878248；人類BMP9，Q9UK05；人類BMP10，O95393；人類DAN，BAA92265。ALK1序列係於第1-5圖中提出。

人類DAN胺基酸序列(序列編號：10)(Genbank BAA92265)：

預期成熟的DAN蛋白對應於胺基酸17-180。DAN的保留性半胱胺酸結區塊對應於胺基酸21-125(底線)。

人類DAN cDNA序列(序列編號：11)(Genbank BC012037)：

DAN前驅物的編碼序列對應於核酸93-635。成熟DAN蛋白的編碼序列對應於核酸141-632。DAN之保留性半胱胺酸結部分的編碼序列對應於核酸153-467。

在此揭露背景中以及各個詞彙應用的特定背景中，本說明說中應用之詞彙通常具有其在技術中的普遍涵義。在說明書中論述某些詞彙以提供從事者額外引導於描述本文揭露之組合物與方法以及如何產生並利用。由詞彙應用之特定背景中可清楚理解詞彙之任何應用的範圍或涵義。

2. 可溶的ALK1聚胜肽

自然存在之ALK1蛋白係穿膜蛋白，具有位於細胞外之部分蛋白(細胞外部分)以及位於細胞內之部分蛋白(細胞內部分)。本揭露之態樣包括含有ALK1細胞外區塊部 分之聚胜肽。

某些實施例中，本揭露提供「ALK1 ECD聚胜肽」。詞彙「ALK1 ECD聚胜肽」意圖代表包括或由自然存在之ALK1聚胜肽細胞外區塊之胺基酸序列所構成的聚胜肽，其包括或排除任何信號序列及信號序列N-端的序列；或包括或由至少33%相同於自然存在之ALK1聚胜肽細胞外區塊的胺基酸序列所構成，且選擇性至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%相同於自然存在之ALK1聚胜肽之細胞外區塊序列，如序列編號：1之胺基酸34-95的半胱胺酸結區域或半胱胺酸結加上細胞外區塊之N-端與C-端的額外胺基酸，例如序列編號：1之胺基酸22-118。同樣地，ALK1 ECD聚胜肽可包括序列編號：2之核苷酸100-285、或其之靜默變體或在嚴格雜合條件下雜合至其之互補的核酸所編碼之聚胜肽，嚴格雜合條件通常係技術所習知的，例如包括在65℃下50% v/v甲醯胺、5x SSC、2% w/v阻擋試劑、0.1% N-月桂肌胺酸、0.3% SDS中雜合整夜並在例如約65℃下5xSSC中清洗。此外，ALK1 ECD聚胜肽可包括序列編號：2之核苷酸64-384、或其之靜默變體或在嚴格雜合條件下雜合至其之互補的核酸所編碼之聚胜肽，嚴格雜合條件通常係技術所習知的，例如包括在65℃下50% v/v甲醯胺、5x SSC、2% w/v阻擋試劑、 0.1% N-月桂肌胺酸、0.3% SDS中雜合整夜並在例如約65℃下5xSSC中清洗。因此，詞彙「ALK1 ECD聚胜肽」包括單離之ALK1聚胜肽細胞外部分、其之變體(包括例如在對應序列編號：1之胺基酸22-118的序列包含不超過2、3、4、5或10個胺基酸取代、添加或刪除的變體且包括在對應序列編號：1之胺基酸34-95的序列包含不超過2、3、4、5或10個胺基酸取代、添加或刪除的變體)、其之片段以及包含任何前述之融合蛋白，但在各個實例中，任何前述之ALK1 ECD聚胜肽較佳係保有針對一或更多GDF5、GDF6、GDF7、BMP9或BMP10的實質親合力。詞彙「ALK1 ECD聚胜肽」明確地意圖排除任何全長自然存在之ALK1聚胜肽。一般而言，ALK1 ECD聚胜肽將經設計以在生物恰當溫度、pH水平與滲透壓下溶於水溶液中。

如上所述，本揭露提供與自然存在之ALK1聚胜肽共有特定程度之序列相同性或相似性的ALK1 ECD聚胜肽。為了確定兩個胺基酸序列的相同百分比，針對最理想的比對意圖來排列序列(例如，可將缺口導入第一與第二胺基酸或核酸序列之一者或兩者以得到最理想排列，並為了比對意圖可不理會非同源序列)。接著比對位在對應胺基酸位置之胺基酸殘基。當第一序列中之位置係由與第二序列中對應位置相同之胺基酸殘基所佔據，那麼分子在該位置處係相同的(本文所用之胺基酸「相同性」 係等同於胺基酸「同源性」)。兩個序列之間的相同性百分比係序列共有之相同位置數目的函數，並考慮需要導入以得到兩個序列之最理想排列之缺口數目、各個缺口長度。

可利用數學演算法達成序列之比對以及兩個序列間之相同百分比與相似百分比的確定。(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.與Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.與Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。

一實施例中，利用Needleman與Wunsch(J Mol.Biol.(48)：444-453(1970))演算法來確定兩個胺基酸序列之間的相同性百分比，該演算法已經併入GCG軟體套件(可自http：//www.gcg.com取得)之GAP程式中。特定實施例中，下列參數係用於GAP程式中：Blosum 62矩陣或PAM250矩陣任一者，及16、14、12、10、8、6或4的缺口加權以及1、2、3、4、5或6的長度加權。又另一實施例中，利用GCG軟體套裝(可自http：//www.gcg.com 取得)中之GAP程式來確定兩個核苷酸序列間之相同性百分比(Devereux,J.，等人，Nucleic Acids Res.12(1)：387(1984))。示範性參數包括利用NWSgapdna.CMP矩陣以及40、50、60、70或80的缺口加權以及1、2、3、4、5或6的長度加權。除非另有明示，否則欲確定兩個胺基酸序列之間的相同性百分比係利用GAP程式，該程式利用Blosum 62矩陣、10的GAP加權以及3的長度加權，且若上述演算法無法計算所欲之相同性百分比，那麼應選擇本文所揭露之適當替代方案。

另一實施例中，利用E.Myers與W.Miller(CABIOS,4：11-17(1989))的演算法(已經併入ALIGN程式(第2.0版)中)來確定兩個胺基酸序列之間的相同性百分比，其利用PAM120加權殘基表(weight residue table)、12的缺口長度罰分(penalty)與4的缺口罰分。

另一確定兩個胺基酸序列之間的最好整體排列之實施例利用基於Brutlag等人之演算法的FASTDB電腦程式(Comp.App.Biosci.,6：237-245(1990))。序列排列中，詢問與討論之序列均係胺基酸序列。上述總體序列排列之結果係以相同性百分比方式呈現。一實施例中，利用基於Brutlag等人之演算法的FASTDB電腦程式來執行胺基酸序列相同分析(Comp.App.Biosci.,6：237-245(1990))。特定實施例中，用來計算胺基酸排列之相同性與相似性百分比之參數包括：矩陣=PAM 150、k-變數值 組=2、錯配罰分(Mismatch Penalty)=1、連結罰分(Joining Penalty)=20、隨機群組長度(Randomization Group Length)=0、切斷分數(Cutoff Score)=1、缺口罰分(Gap Penalty)=5以及缺口大小罰分(Gap Size Penalty)=0.05。

某些實施例中，ALK1 ECD聚胜肽包括自然存在之ALK1蛋白(例如，序列編號：1之序列)的細胞外部分，且較佳係包括ALK1細胞外區塊之配體結合部分。某些實施例中，可溶的ALK1聚胜肽包括之一胺基酸序列係至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同於序列編號：1之胺基酸22-118的胺基酸序列。某些實施例中，截斷之細胞外ALK1聚胜肽包括至少30、40或50個序列編號：1之細胞外部分胺基酸序列的連續胺基酸。

較佳實施例中，ALK1 ECD聚胜肽結合至一或更多GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與BMP10。ALK1聚胜肽選擇性地不顯示對TGF-β1或TGF-β3的實質結合。可利用溶液或表面電漿子共振系統(例如，Biacore^TM系統)中的純化蛋白來評估結合。較佳的可溶ALK1聚胜肽將顯示抗血管新生活性。血管新生抑制活性的生物試驗包括雞胚胎絨毛膜(CAM)試驗、小鼠角膜微袋試驗(mouse corneal micropocket assay)、測量施加單離或合成之蛋白於植入腫瘤上作用的試驗。CAM試驗係由O'Reilly等人在"Angiogenic Regulation of Metastatic Growth" Cell, vol.79(2),Oct.1,1994,pp.315-328中描述。簡單的說，將3天大的雞胚及完整卵黃與蛋分離並置入培養皿中。培養3天後，將含有欲測試蛋白之甲基纖維素盤施加至各個胚胎的CAM。培養48小時後，觀察胚胎與CAM以確定是否已經抑制內皮生長。小鼠角膜微袋試驗包括將含有生長因子之片狀物以及另一含有疑似內皮生長抑制劑之片狀物植入小鼠角膜中，並觀察在角膜中變得複雜之微血管形態。其他試驗係描述於實施例中。

可藉由移除ALK1聚胜肽之細胞質尾部與穿膜區域來產生ALK1 ECD聚胜肽。或者，可藉由刪除來使穿膜區塊去活化、或藉由以親水胺基酸殘基取代通常構成穿膜區塊之恐水胺基酸殘基來使穿膜區塊去活化。任一實例中，產生實質親水性分布圖，這將減少脂質親合性並改善水溶解度。刪除穿膜區塊係較佳於以親水胺基酸殘基取代，因為其可避免導入可能的免疫表位。

ALK1 ECD聚胜肽可額外地在N-端包括任一不同引導序列。上述序列將讓胜肽表現並指向真核系統中的分泌路徑。參閱例如Ernst等人，U.S.Pat.No.5,082,783(1992)。或者，可利用自然ALK1信號序列來造成自細胞排出。可能的引導序列包括自然的、tPa與蜜蜂蜂毒肽(mellitin)引導序列(分別為序列編號：7-9)。取決於選擇之引導序列、應用之細胞類型與培養條件等其他變數，信號胜肽的處理會有所改變，因此成熟ALK1 ECD聚胜 肽(包括序列編號：5)之實際N-端開始位置會在N-端或C-端方向任一者中平移1-5胺基酸。

某些實施例中，本揭露考慮到ALK1聚胜肽的特定突變以改變聚胜肽的醣化。可選擇上述突變以導入或排除一或共多醣化位置，諸如O-連接或N-連接醣化位置。天冬醯胺酸-連接之醣化辨別位置通常包括三胜肽序列，天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(或天冬醯胺酸-X-絲胺酸)(其中「X」係任一胺基酸)，其由適當的細胞醣化酵素明確地辨別。亦可藉由添加一或更多絲胺酸或蘇胺酸殘基至野生型ALK1聚胜肽序列或以一或更多絲胺酸或蘇胺酸殘基取代野生型ALK1聚胜肽序列來產生改變(針對O-連接醣化位置)。多種在醣化辨別位置之第一或第三胺基酸位置之一或兩者的胺基酸取代或刪除(與/或第二位置的胺基酸刪除)造成修飾之三胜肽序列的無-醣化。另一提高ALK1聚胜肽上醣類部分數目的手段係藉由化學或酵素耦接配糖至ALK1聚胜肽。取決於應用之耦接模式，可將糖類附加至(a)精胺酸與組胺酸；(b)自由羧基基團；(c)自由氫硫基基團，例如半胱胺酸的那些基團；(d)自由羥基基團，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸的那些基團；(e)芳香族殘基，諸如***酸、酪胺酸或色胺酸的那些基團；或(f)麩醯胺酸的醯胺基團。這些方法係描述於WO 87/05330(1987年9月11日出版)及Aplin與Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306中，其在此 以參考資料併入。可化學與/或酵素地完成ALK1聚胜肽上存在之一或更多醣類部分的移除。化學去醣化可包括例如將ALK1聚胜肽暴露至化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理造成除了連接糖類(N-乙醯葡萄胺糖或N-乙醯半乳胺糖)以外的大部分或所有糖類的斷裂，同時保留胺基酸序列完整。化學去醣化係進一步由Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.259：52以及Edge等人(1981)Anal.Biochem.118：131所描述。可藉由利用Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.138：350所述之多種內切-糖苷酶與外切-糖苷酶來達成ALK1聚胜肽上醣類部分的酵素切割。取決於應用之表現系統類型可適當地調整ALK1聚胜肽序列，因為哺乳類、酵母菌、昆蟲與植物細胞均可導入受到胜肽胺基酸序列影響之不同醣化型態。一般而言，將在提供適當醣化之哺乳類細胞株(諸如，HEK293或CHO細胞株)中表現用於人類中之ALK1蛋白，然而預期亦可應用其他哺乳類表現細胞株、具有經設計醣化酵素之酵母菌細胞株以及昆蟲細胞。

此揭露進一步考慮到產生突變的方法，特別係ALK1聚胜肽組合突變以及截斷突變之群組；一群組合突變係特別有用於辨別功能性變體序列。篩選上述組合庫的目的係產生例如ALK1聚胜肽變體，其可作為致效劑或拮抗劑任一者，或者其一起具有新活性。多種篩選試驗係提供於下，且上述試驗可用來評估變體。例如，可針對 結合ALK1配體能力來篩選ALK1聚胜肽變體，以避免ALK1配體對ALK1聚胜肽的結合或干擾ALK1配體引起的信號傳遞。亦可在細胞式或活體內試驗中試驗ALK1聚胜肽或其變體之活性，特別係實施例揭露之任一試驗。

可產生組合衍生之變體，其相對於包括自然存在之ALK1聚胜肽之細胞外區塊的ALK1 ECD聚胜肽具有選擇性或大致提高的效力。同樣地，突變可造成變體具有與對應野生型ALK1 ECD聚胜肽截然不同的血清半生期。例如，可讓改變之蛋白變成對蛋白質裂解或其他造成破壞之處理更為穩定或更不穩定，或是排除自然ALK1 ECD聚胜肽或使其去活性。上述變體與編碼其之基因可藉由調節ALK1聚胜肽之半生期來改變ALK1 ECD聚胜肽水平。例如，短的半生期可造成更短暫的生物效應，並可更緊密地控制患者中的重組ALK1 ECD聚胜肽水平。Fc融合蛋白中，在連接子(若有的話)與/或Fc部分中進行突變以改變蛋白的半生期。

可藉由編碼聚胜肽庫之基因的退化性庫產生組合式庫，各個聚胜肽包括可能的ALK1聚胜肽序列的至少一部分。例如，可酵素連接合成寡核苷酸的混合物進入基因序列，以致可能的ALK1聚胜肽核苷酸序列之退化組可表現成個別的聚胜肽，或者表現成一組較大的融合蛋白(例如，噬菌體呈現)。

有許多方式可自退化性寡核苷酸序列產生可能的 ALK1 ECD變體庫。可在自動DNA合成機中進行退化性基因序列的化學合成，並接著將合成之基因連接進入適當載體以進行表現。技術中習知退化性寡核苷酸的合成(參閱諸如，Narang,SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人，(1981)Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules,ed.AG Walton,Amsterdam：Elsevier pp273-289；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人，(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。上述技術已經應用於其他蛋白的定向演化(參閱諸如Scott等人，(1990)Science 249：386-390；Roberts等人，(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等人，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS USA 87：6378-6382；以及美國專利號5,223,409、5,198,346與5,096,815)。

或者，可利用其他種突變方法來產生組合式庫。例如，可產生並利用下列方式篩選自庫中單離ALK1聚胜肽變體，方式諸如丙胺酸掃描突變方法等(Ruf等人，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等人，(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等人，(1993)Gene 137：109-118；Grodberg等人，(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等人，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等人，(1991)Biochemistry 30： 10832-10838；與Cunningham等人，(1989)Science 244：1081-1085)；連接子掃描突變方法(Gustin等人，(1993)Virology 193：653-660；Brown等人，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等人，(1982)Science 232：316)；飽和突變方法(Meyers等人，(1986)Science 232：613)；PCR突變方法(Leung等人，(1989)Method Cell Mol Biol 1：11-19)；或隨機突變方法，包括化學突變方法等(Miller等人，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY；與Greener等人，(1994)Strategies in Mol Biol 7：32-34)。連接子掃描突變方法特別在組合式設定中為具有吸引力的辨別ALK1聚胜肽之截斷(生物活性)形式之方法。

技術中習知許多技術用於篩選點突變與截斷產生組合性庫的基因產物，以及針對該情勢用於針對具有某些特性之基因產物篩選cDNA庫。上述技術通常適合用於ALK1聚胜肽之組合性突變方法產生之基因庫的快速篩選。篩選大基因庫最廣泛應用的技術包括將基因庫選殖入可複製的表現載體中、以得到的載體庫轉形適當細胞、並在所欲活性之偵測有助於相當容易地單離載體(編碼偵測之產物的基因)的情況下表現組合性基因。較佳試驗包括ALK1配體結合試驗與配體-介導之細胞信號傳遞試驗。

某些實施例中，本揭露之ALK1 ECD聚胜肽除了任何 自然存在於ALK1聚胜肽中之修飾外可進一步包括轉譯後修飾。上述修飾包括(但不限於)乙醯化、羧化、醣化、磷酸化、脂化與醯化。因此，修飾之ALK1 ECD聚胜肽可包含非-胺基酸成分，諸如聚乙二醇、脂質、多糖類或單糖類與磷酸根。可如同本文對其他ALK1 ECD聚胜肽變體所述般測試上述非-胺基酸成分在ALK1 ECD聚胜肽功能上的作用。當藉由在細胞中切割ALK1聚胜肽未成熟形式來產生ALK1 ECD聚胜肽時，轉譯後處理對蛋白的正確摺疊與/或功能亦是重要的。不同細胞(諸如，CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有針對上述轉譯後活性的特定細胞裝置與獨特機制，並經選擇以確保ALK1聚胜肽的正確修飾與處理。

某些態樣中，ALK1 ECD聚胜肽的功能性變體或修飾形式包括具有至少部分之ALK1 ECD聚胜肽與一或更多融合區塊的融合蛋白。上述融合區塊的習知實例包括(但不限於)聚組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白(thioredoxin)、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、麥芽糖結合蛋白(MBP)或人類血清白蛋白。可選擇融合區塊以給予所欲特性。例如，某些融合區塊特別有用於藉由親合性層析來單離融合蛋白。為了親合性純化之目的，應用親合性層析之相關基質，諸如結合麩胱甘肽之樹脂、結合澱粉酵素之樹脂與結合鎳之樹脂或結合鈷之樹脂。許多上述基質可以「套組」形式 取得，例如Pharmacia GST純化系統以及用於(HIS₆)融合夥伴之QIAexpress^TM系統(Qiagen)。另一實施例，可選擇融合區塊以促進ALK1 ECD聚胜肽的偵測。上述偵測區塊的實例包括不同的螢光蛋白(例如，GFP)以及「表位標誌」，其通常係短的胜肽序列(可取得其之特定抗體)。習知表位標誌(可輕易取得其之特定單株抗體)包括FLAG、流感病毒凝血素(HA)與c-myc標誌。某些實例中，融合區塊具有蛋白酶切割位置(例如，Factor Xa或Thrombin的切割位置)，其可讓相關蛋白酶部分地分解融合蛋白並因此由其釋出重組蛋白。接著可藉由隨後之層析分離將釋出之蛋白與融合區塊分離。某些較佳實施例中，ALK1 ECD聚胜肽與在活體內穩定ALK1聚胜肽(「穩定子」區塊)之區塊融合。「穩定」意指任何提高血清半生期的事情，而不論這係因為破壞減小、腎臟清除減小或其他藥學動力學作用。習知與免疫球蛋白之Fc部分融合會給予多種蛋白所欲之藥學動力特性。同樣地，融合至人類血清白蛋白可給予所欲特性。可選擇之其他類型的融合區塊包括多聚體化(諸如，二聚體化、四聚體化)區塊與功能性區塊。

特定實施例，本揭露提供包含融合至Fc區塊之可溶的ALK1細胞外區塊之融合蛋白(例如，序列編號：6)。

Fc區塊選擇性具有一或更多突變位於諸如Asp-265、離胺酸322與Asn-434殘基。某些實例中，具有一或更多這些突變(例如，Asp-265突變)之突變Fc區塊具有減少的結合Fc受體能力(相對於野生型Fc區塊)。其他實例中，具有一或更多這些突變(例如，Asn-434突變)之突變Fc區塊具有提高的結合MHC第I型-相關之Fc-受體(FcRN)能力(相對於野生型Fc區塊)。

可理解可以任何方式(與所欲功能性相符)來排列融合蛋白之不同片段。例如，可將ALK1 ECD聚胜肽置於異源性區塊的C-端，或者將異源性區塊置於ALK1 ECD聚胜肽的C-端。ALK1 ECD聚胜肽區塊與異源性區塊在融合蛋白中不需相鄰，且可在任一區塊之C-端或N-端或區塊之間包括額外的區塊或胺基酸序列。

本文所用之詞彙「免疫球蛋白Fc區」或簡單的「Fc」係可理解用來意指免疫球蛋白鏈恆定區(較佳係免疫球蛋白重鏈恆定區或其之部分)之羧基-端部分。例如，免疫球蛋白Fc區可包括1)CH1區塊、CH2區塊與CH3區塊，2)CH1區塊與CH2區塊，3)CH1區塊與CH3區塊，4)CH2區塊與CH3區塊，或5)二或更多區塊與免疫球蛋白鉸鏈區之組合。較佳實施例中，免疫球蛋白Fc區至少包括免疫球蛋白鉸鏈區、CH2區塊與CH3區塊，且較佳係缺少CH1區塊。

一實施例中，重鏈恆定區衍生之免疫球蛋白類型係IgG(Igγ)(γ子集1、2、3或4)。可應用其他類型的免疫球蛋白IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)與IgM(Igμ)。適當免疫球蛋白重鏈恆定區的選擇係詳細論述於美國專利號5,541,087與5,726,044中。自某些免疫球蛋白類型與子集選擇特定免疫球蛋白重鏈恆定區序列而達到特定結果係視為技術習知水平。編碼免疫球蛋白Fc區之DNA構築體的部分較佳係包括至少一部分的鉸鏈區塊，且較佳係Fc γ之CH₃區塊的至少一部分或任何IgA、IgD、IgE或IgM中的同源區塊。

再者，考慮到免疫球蛋白重鏈恆定區中胺基酸的取代或刪除係有用於實行本文揭露之方法與組合物。一實施例係在上游CH2區中導入胺基酸取代以產生對Fc受體親合力減小之Fc變體(Cole等人，(1997)J.Immunol.159：3613)。

某些實施例中，本揭露產生可用的ALK1 ECD聚胜肽之單離與/或純化形式，其係單離自、或實質不具有(諸如，至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%不具有)其他蛋白與/或其他ALK1 ECD聚胜肽物種。通常藉由重組核酸表現來產生ALK1聚胜肽。

某些實施例中，本揭露包括編碼可溶的ALK1聚胜肽之核酸，其包括ALK1蛋白之細胞外部分的編碼序列。進一步實施例中，此揭露亦有關於包含上述核酸之宿主 細胞。宿主細胞可為任何原核或真核細胞。例如，本揭露之聚胜肽可表現於細菌細胞(例如，E.coli)、昆蟲細胞(例如，利用桿狀病毒表現系統)、酵母菌或哺乳類細胞中。熟悉技術人士習知其他適當宿主細胞。因此，本揭露之某些實施例進一步關於產生ALK1 ECD聚胜肽之方法。已經確定ALK1-Fc融合蛋白(提出於序列編號：3中且表現於CHO細胞中)具有有效的抗血管新生活性。

可如同上述參照ALK1 ECD蛋白來產生與特性描述DAN聚胜肽，包括野生型DAN的變體以及包含DAN蛋白之融合蛋白。

3. 編碼ALK1聚胜肽之核酸

某些態樣中，本揭露提供編碼任一本文所揭露之ALK1聚胜肽(例如，ALK1 ECD聚胜肽)(包括片段、功能性變體與融合蛋白)的單離與/或重組核酸。例如，序列編號：2編碼自然存在之人類ALK1前驅聚胜肽，而序列編號：4編碼融合至IgG1 Fc區塊之ALK1細胞外區塊前驅物。討論之核酸可為單股或雙股。上述核酸可為DNA或RNA分子。這些核酸可用於例如產生ALK1聚胜肽之方法中或用來作為直接治療劑(例如，反義、RNAi或基因治療方法)。

某些態樣中，編碼ALK1聚胜肽之討論之核酸係進一步理解成包括序列編號：2或4之變體的核酸。變體核苷酸序列包括差異為一或更多核苷酸取代、添加或刪除之序列，例如對偶基因變體。

某些實施例中，本揭露提供單離或重組核酸序列，其係至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同於序列編號：2或4。熟悉技術人士可理解與序列編號：2或4互補之核酸序列以及序列編號：2或4之變體亦位於本揭露之範圍內。進一步實施例中，本揭露之核酸序列可被單離、重組與/或與異源性核苷酸序列融合或於DNA庫中。

其他實施例中，本揭露之核酸亦包括在高度嚴格條件下雜合至序列編號：2或4所表明之核苷酸序列的核苷 酸序列、序列編號：2或4之互補序列或其之片段。如上所論述般，熟悉技術人士可輕易理解促進DNA雜合之適當嚴格條件可有所不同。熟悉技術人士可輕易理解促進DNA雜合之適當嚴格條件可有所不同。例如，可在約45℃下6.0 x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中實行雜合作用，接著在50℃下以2.0 x SSC清洗。例如，清洗步驟中的鹽濃度可選擇為50℃約2.0 x SSC的低嚴格度至50℃約0.2 x SSC的高嚴格度。此外，清洗步驟的溫度可由室溫(約22℃)下的低嚴格度條件提高至約65℃的高嚴格條件。可改變溫度與鹽類兩者，或者可在其他變數改變時維持溫度或鹽類濃度恆定。一實施例中，本揭露提供在室溫下6 x SSC之低嚴格度條件雜合並接著在室溫下以2 x SSC清洗之核酸。

因為遺傳密碼退化性而與序列編號：2或4提出之核酸不同的單離核酸亦位於本揭露之範圍中。例如，許多胺基酸係由超過一三聯體所指定。確定相同胺基酸之密碼子或同義密碼子(例如，CAU與CAC係同義代表組胺酸)會造成「靜默」突變，其不會影響蛋白之胺基酸序列。然而，預期確實導致討論之蛋白之胺基酸序列改變的DNA序列多型(polymorphism)存在於哺乳類細胞之間。熟悉技術人士可理解這些在編碼特定蛋白之核酸中的一或更多核苷酸變化(高達約3-5%的核苷酸)可存在於特定物種的個體之間(因為自然對偶基因變化)。任何與所有 上述核苷酸變化與得到之胺基酸多型係位於本揭露之範圍中。

某些實施例中，本揭露之重組核酸可在表現構築體中操作性連接至一或更多調控核苷酸序列。調控核苷酸序列通常係適合於用來表現之宿主細胞。技術中習知不同宿主細胞之多種類型的適當表現載體與適當調控序列。一般而言，上述一或更多調控核苷酸序列可包括(但不限於)啟動子序列、引導或信號序列、核糖體結合位置、轉錄開始與終止序列、轉譯開始與終止序列及增強子或活化子序列。本揭露亦考慮到技術中習知的持續型或誘發型啟動子。啟動子可為自然存在之啟動子或雜合啟動子(結合超過一啟動子之片段)之任一者。表現構築體可以附加體(例如，質體)方式存在於細胞中，或者表現構築體可***染色體中。較佳實施例中，表現載體包含可篩選之標記基因以選擇經轉形之宿主細胞。技術中習知可篩選之標記基因並隨著應用之宿主細胞而有所不同。

本文揭露之某些態樣中，討論之核酸係提供於表現載體中，其包括編碼ALK1聚胜肽之核苷酸序列且操作性連接至至少一調控序列。調控序列係技術中所習知的並經選擇以引導ALK1聚胜肽的表現。因此，詞彙調控序列包括啟動子、增強子與其他表現控制片段。示範性調控序列係描述於Goeddel；Gene表現Technology：Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego,CA (1990)。例如，多種表現控制序列(在操作性連接至DNA序列時控制其之表現)之任何一個可用於這些載體以表現編碼ALK1聚胜肽之DNA序列。上述有用的表現控制序列包括諸如SV40的早期與晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細胞病毒早期立即啟動子、RSV啟動子、lac系統、trp系統、TAC或TRC系統、T7啟動子(其之表現係由T7 RNA聚合酶所引導)、噬菌體λ之主要操作子與啟動子區、fd塗層蛋白的控制區、3-磷甘油酸激酶或其他糖分解酵素的啟動子、酸性磷酸酶之啟動子(例如，Pho5)、酵母菌α-交配因子之啟動子、桿狀病毒系統的多面體啟動子、以及其他習知控制原核或真核細胞或其之病毒之基因表現的序列與上述之不同組合。應當理解表現載體的設計可取決於上述因子，如欲被轉形之宿主細胞的選擇與/或欲被表現之蛋白類型。再者，應當考慮載體的複製數目(copy number)、控制複製數目與載體編碼之任何其他蛋白(例如，抗生素標記)表現的能力。

將選殖基因或其之部分黏合進入適合表現在原核細胞或真核細胞(酵母菌、鳥類、昆蟲或哺乳類)任一者或兩者中之載體來產生本揭露包括之重組核酸。產生重組ALK1聚胜肽之表現載體包括質體與其他載體。例如，適當載體包括下列類型的質體：pBR322-衍生之質體、pEMBL-衍生之質體、pEX-衍生之質體、pBTac-衍生之質體以及pUC-衍生之質體，以表現於原核細胞(例如，E. coli.)中。

某些哺乳類表現載體包含原核序列(用以促進載體在細菌中增殖)與一或更多真核轉錄單元(表現於真核細胞中)兩者。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo與pHyg衍生之載體係適合真核細胞轉染之哺乳類表現載體實例。某部分這些載體係以細菌質體(例如，pBR322)之序列修飾以促進於原核細胞與真核細胞兩者中的複製與抗藥性篩選。或者，諸如牛乳突瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP-衍生與p205)之病毒衍生物可用來短暫表現蛋白於真核細胞中。其他病毒(包括反轉錄病毒)表現系統的實例可見於下方基因治療輸送系統之描述中。技術中習知用來製備質體與宿主有機體轉形知不同方法。關於原核與真核細胞兩者的其他適當表現系統以及一般重組步驟，參閱Sambrook,Fritsch與Maniatis的Molecular Cloning A Laboratory Manual,3rd Ed.,ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)。某些實例中，樂見藉由應用桿狀病毒表現系統來表現重組聚胜肽。上述桿狀病毒表現系統的實例包括pVL-衍生之載體(諸如，pVL1392、pVL1393與pVL941)、pAcUW-衍生之載體(例如，pAcUW1)與pBlueBac-衍生之載體(例如，包含ß-gal之pBlueBac III)。

較佳實施例中，將載體設計用來在CHO細胞中產生討論之ALK1聚胜肽，諸如Pcmv-Script載體(Stratagene,La Jolla,Calif.)、pcDNA4載體(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)與pCI-neo載體(Promega,Madison,Wisc.)。相當明顯，討論之基因構築體可用來造成培養基內增殖細胞中表現討論之ALK1聚胜肽，例如以產生蛋白(包括融合蛋白或變體蛋白)好進行純化。

本揭露亦關於以重組基因轉染之宿主細胞，重組基因包括一或更多討論之ALK1聚胜肽的編碼序列(例如，序列編號：2或4)。宿主細胞可為任何原核或真核細胞。例如，本文揭露之ALK1聚胜肽可表現於細菌細胞(例如，E.coli)、昆蟲細胞(例如，利用桿狀病毒表現系統)、酵母菌或哺乳類細胞中。熟悉技術人士習知其他適當的宿主細胞。

因此，本揭露進一步關於產生討論之ALK1聚胜肽(包括ALK1 ECD聚胜肽)的方法。例如，以編碼ALK1聚胜肽之表現載體轉染之宿主細胞可培養於適當條件下好讓ALK1聚胜肽表現發生。ALK1聚胜肽可被分泌且可自細胞與含有ALK1聚胜肽之培養基的混合物分離。或者，ALK1聚胜肽可保留在細胞質或細胞膜部分中，並收集、裂解細胞且單離蛋白。細胞培養基包括宿主細胞、培養基與其他副產物。技術中習知細胞培養的適當培養基。討論之ALK1聚胜肽可自細胞培養基、宿主細胞或兩者 單離，利用技術中習知的純化蛋白技術，包括離子交換層析法、凝膠過濾層析法、超過濾、電泳、免疫親和性純化(以對ALK1聚胜肽之特定表位專一的抗體)及親和性純化(以結合融合至ALK1聚胜肽之區塊的試劑)(例如，A蛋白管柱可用來純化ALK1-Fc融合物)。較佳實施例中，ALK1聚胜肽係包含促進其純化之區塊的融合蛋白。較佳實施例中，藉由連續管柱層析步驟來達成純化，層析步驟包括例如任何順序的三或更多下列步驟：A蛋白層析、Q瓊脂糖凝膠(sepharose)層析、苯基瓊脂糖凝膠層析、大小排除層析與陽離子交換層析。純化可完成於病毒過濾與緩衝液交換。

另一實施例中，編碼純化引導序列(例如，重組ALK1聚胜肽之所欲部分N-端的聚-(His)/腸激酶切割位置序列)之融合基因可讓表現之融合蛋白藉由利用Ni²⁺金屬樹脂的親和性層析而加以純化。可接著以腸激酶處理來移除純化引導序列以提供純化之ALK1聚胜肽(例如，參閱Hochuli等人，(1987)J.Chromatography 411：177；與Janknecht等人，PNAS USA 88：8972)。

習知產生融合基因的技術。實質上，依照常見技術來執行連結編碼不同聚胜肽序列的不同DNA片段，應用鈍端或交錯端來連結、限制酶剪切以提供適當端、適當地填滿黏性端、鹼性磷酸酶處理以避免不欲連接、以及酵素連結。另一實施例中，可藉由常見技術(包括自動DNA 合成機)來合成融合基因。或者，可利用錨定引子(anchor primer)來實行基因片段的PCR擴增，錨定引子可引起兩個連續基因片段之間的互補突出而接著被黏合以產生嵌合式基因序列(參閱例如，Current Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubel等人，John Wiley & Sons：1992)。

ALK1、BMP9、BMP10、GDF5、GDF6或GDF7之拮抗劑的核酸化合物種類實例包括反義核酸、RNAi構築體與催化性核酸構築體。核酸化合物可為單股或雙股。雙股化合物亦可包括突出或非互補區，其中一或其他股係單股。單股化合物可包括自我互補區，意謂著化合物形成稱為「髮夾」或「莖-環」的結構，具有雙螺旋結構區。核酸化合物可包括與一區域互補之核苷酸序列，該區域係由不超過1000、不超過500、不超過250、不超過100或不超過50、35、30、25、22、20或18個全長ALK1核酸序列或配體核酸序列的核苷酸所構成。互補區域較佳係至少8個核苷酸，且選擇性至少10個或至少15個核苷酸，且選擇性介於15與25個核苷酸之間。互補區域可位於目標轉錄本的內子(intron)、編碼序列或非編碼序列，例如編碼序列部分。一般而言，核酸化合物將具有長度約8至約500個核苷酸或鹼基對的長度，且該長度選擇性為約14至約50個核苷酸。核酸可為DNA(特別係用作反義時)、RNA或RNA：DNA雜合體。任何一股可包括DNA與RNA的混合物以及無法輕易歸類成 DNA或RNA任一者的修飾型態。同樣地，雙股化合物可為DNA：DNA、DNA：RNA或RNA：RNA，且任何一股亦可包括DNA與RNA的混合物以及無法輕易歸類成DNA或RNA任一者的修飾型態。核酸化合物可包括多種修飾的任何一種，修飾包括一或更多對骨幹(自然核酸中的醣-磷酸根部分，包括核苷酸間之連接)或對鹼基部分(自然核酸之嘌呤或嘧啶部分)的修飾。反義核酸化合物較佳具有約15至約30個核苷酸的長度且通常包含一或更多修飾以改善特性，諸如血清、細胞或可能輸送化合物之位置(諸如，口服施加化合物實例中的胃以及吸入化合物的肺)中的穩定性。RNAi構築體的實例中，與目標轉錄本互補之股通常係RNA或其之修飾。另一股可為RNA、DNA或任何其他變體。雙股或單股「髮夾」RNAi構築體的雙股部分較佳係具有18至40個核苷酸的長度，且選擇性係約21至23個核苷酸的長度，如此長度可讓其作為Dicer基質。催化性或酵素性核酸可為核糖酶(ribozyme)或DNA酵素且亦可包含修飾形式。當核酸化合物在生理條件下且在無意義或有意義對照具有小或不具有作用的濃度下與細胞接觸時，其可抑制目標表現約50%、75%、90%或更多。試驗核酸化合物作用的較佳濃度係1、5與10微莫耳(micromolar)。亦可試驗核酸化合物在例如血管新生上的作用。

可如同上參照編碼ALK1 ECD蛋白之核酸所述般產生並描述編碼DAN聚胜肽(包括野生型DAN的變體)之核酸以及那些編碼包含DAN蛋白之融合蛋白的核酸。

4. 抗體

本揭露之另一態樣係關於與ALK1聚胜肽之細胞外部分反應的抗體，較佳係與ALK1聚胜肽專一性反應的抗體。較佳實施例中，上述抗體會干擾ALK1結合至配體，諸如GDF5、GDF6、GDF7、BMP-9或BMP-10-應當理解針對ALK1之配體的抗體應當結合至相關蛋白的成熟、處理過形式。本揭露亦提供結合至GDF5、GDF6、GDF7、BMP9與/或BMP10且抑制ALK1結合至上述配體的抗體。較佳抗體將在生物試驗中呈現抗血管新生活性，生物試驗係諸如CAM試驗或角膜微袋試驗(參見上方)。

本文所用之詞彙「抗體」意圖包括全體抗體，例如任何同型(isotype)(IgG、IgA、IgM、IgE等)且包括與選定抗原反應之免疫球蛋白之片段或區塊。可利用傳統技術將抗體片段化，並針對效用與/或與關注之特定表位的交互作用來篩選片段。因此，詞彙包括能夠選擇性與某些蛋白反應之抗體分子的蛋白水解切割或重組製備部分的片段。上述蛋白水解與/或重組片段的非限制性實例包括Fab、F(ab')2、Fab'、Fv以及包含胜肽連接子接合之V[L]與/或V[H]區塊的單鏈抗體(scFv)。可共價或非共價地連 接scFv以形成具有二或更多結合位置的抗體。詞彙抗體亦包括抗體與重組抗體的多株、單株或其他純化製備物。詞彙「重組抗體」意指已經利用分子生物技術構築之核酸所表現之抗體或免疫球蛋白的抗原結合區塊，諸如人類化抗體或由單鏈抗體發展而來之完全人類抗體。單一區塊與單鏈抗體亦包括於詞彙「重組抗體」中。

可藉由技術習知的不同方法的任何一個來產生抗體，包括施加抗原至動物、施加抗原至帶有人類免疫球蛋白基因的動物、或以抗原對著抗體庫(通常係單鏈抗體或抗體區塊)的篩選。一但偵測到抗原結合活性，可將蛋白的相關部分移植進入其他抗體框架，包括全長IgG框架。例如，藉由利用衍生自ALK1聚胜肽或ALK1配體之免疫原，可藉由標準方案來產生抗-蛋白/抗-胜肽抗血清或單株抗體(參閱例如，Harlow與Lane的Antibodies：A Laboratory Manual ed.(Cold Spring Harbor Press：1988))。可用胜肽的免疫形式(諸如，ALK1聚胜肽或能夠引出抗體反應的抗原片段或融合蛋白)來免疫哺乳類(諸如，小鼠、倉鼠或兔子)。給予蛋白或胜肽免疫原性的技術包括耦接至載體或其他技術中習知技術。可在佐劑存在下施加ALK1聚胜肽之免疫原部分(較佳係細胞外部分)。可藉由偵測血漿或血清中抗體效價來監控免疫反應進展。標準ELISA或其他免疫試驗可應用免疫原作為抗原來評估抗體水平。

以ALK1聚胜肽之抗原製備物免疫動物之後，可取得抗-ALK1抗血清，且若想要的話可自血清單離抗-ALK1多株抗體。為了產生單株抗體，可自經免疫之動物取得產生抗體之細胞(淋巴細胞)，並藉由標準體細胞融合步驟與永生化細胞(例如，骨髓癌細胞)融合以產生雜合瘤細胞。技術中習知上述技術，且包括諸如雜合瘤技術(最早由Kohler與Milstein,(1975)Nature,256：495-497所開發)、人類B細胞雜合瘤技術(Kozbar等人，(1983)Immunology Today,4：72)與EBV-雜合瘤技術，以產生人類單株抗體(Cole等人，(1985)Monoclonal Antidodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.pp.77-96)。可針對產生與本揭露知哺乳類ALK1聚胜肽專一性反應的抗體來篩選雜合瘤細胞並自包含上述雜合瘤細胞之培養基單離單株抗體。

本文所用之詞彙抗體意圖包括與討論之ALK1聚胜肽之一專一性反應的其之片段。可利用傳統技術片段化抗體並以上述針對整個抗體篩選效用的相同方式來篩選片段。例如，可藉由以胃蛋白脢(pepsin)處理抗體來產生F(ab)₂片段。得到之F(ab)₂片段可經處理以減少雙硫鍵結好產生Fab片段。本揭露之抗體進一步意圖包括對ALK1聚胜肽具有親合性(由抗體之至少一CDR區所給予)之雙專一性、單鏈、與嵌合式與人類化分子。較佳實施例中， 抗體進一步包括與其附著且能被偵測之標記，該標記可為諸如放射性同位素、螢光化合物、酵素或酵素輔酶。

某些較佳實施例中，本揭露之抗體係重組抗體，特別係人類化單株抗體或全長人類重組抗體。

提及抗體所用之形容詞「專一性反應」係預期意指(且為技術中所普遍理解)抗體在關注之抗原(例如，ALK1聚胜肽或ALK1配體)與非關注之其他抗原之間係具有足夠選擇性，抗體最少有用於在特定類型的生物樣本中偵測關注之抗原的存在。某些應用抗體的方法中，樂見結合中較高程度的專一性。例如，用來在一或更多非關注之非常高含量蛋白存在下偵測關注之低含量蛋白的抗體若具有較高程度的選擇性(關注之抗原與其他交互反應物之間)的話表現較佳。單株抗體通常具有較高傾向來有效區別所欲之抗原與交互反應聚胜肽(相對於多株抗體)。此外，在一類型生物樣本(例如，糞便樣本)中有效選擇性辨別關注之抗原的抗體，在不同類型生物樣本(例如，血液樣本)中可能並不有效地選擇性辨別相同抗原。同樣地，在純化蛋白製備物(缺少其他生物物染物)中有效辨別關注之抗原的抗體，在粗製生物樣本(諸如，血液或尿液樣本)中可能並不有效地辨別關注之抗原。因此，較佳實施例中，本申請案提供已經在樣本類型(很可能是選擇應用抗體之樣本類型)顯示對關注之抗原之專一性的抗體。

影響抗體：抗原交互作用專一性的一特徵係抗體對抗原的親合力。雖然可以不同範圍的親合力來達到所欲知專一性，但較佳抗體通常具有約10^-6、10^-7、10^-8、10^-9或更少的親合力(解離常數)。已知TGFβ對ALK1明顯低的結合親合性，預期許多抗-ALK1抗體將抑制TGFβ結合。然而，GDF5、6、7類的配體以約5x10^-8M的K_D結合而BMP9、10配體以約1x10^-10M的K_D結合。因此，可選擇適當親合性之抗體來干擾這些配體的信號傳遞活性。

此外，用來篩選抗體以辨別所欲抗體之技術會影響得到之抗體的特性。例如，用於某些治療目的之抗體將較佳地能夠針對特定細胞類型。因此，為了得到此類型的抗體，樂於篩選結合至表現關注之抗原之細胞的抗體(例如，藉由螢光活化細胞分選)。同樣地，若抗體欲用於在溶液中結合抗原，樂見試驗溶液結合性。許多不同技術可用來試驗抗體：抗原交互作用以辨別特定所欲之抗體。上述技術包括ELISA、表面電漿子共振結合試驗(例如，Biacore結合試驗，Bia-core AB,Uppsala,Sweden)、三明治試驗(例如，IGEN International,Inc.的順磁珠系統，Gaithersburg,Maryland)、西方墨點法、免疫沉澱試驗及免疫組織化學。

5. 抗體與Fc-融合蛋白中的改變

本申請案進一步提供抗體、ALK1-Fc融合蛋白及具有 設計過或變體Fc區之DAN-Fc融合蛋白。上述抗體與Fc融合蛋白可用於例如調控作用子功能，諸如抗原依賴性細胞毒性(ADCC)與補體依賴性細胞毒性(CDC)。此外，修飾可改善抗體與Fc融合蛋白的穩定度。藉由導入適當核苷酸改變進入DNA或藉由胜肽合成來製備抗體與Fc融合蛋白之胺基酸序列變體。上述變體包括諸如在本文揭露之抗體與Fc融合蛋白之胺基酸序列中刪除與/或***與/或取代殘基。則對最終構築體進行刪除、***與取代的任何組合，前提是最終構築體具有所欲特性。胺基酸改變亦會改變抗體與Fc融合蛋白的轉譯後處理，例如改變醣化位置之數目或地點。

可藉由於胺基酸序列中導入改變來產生效應子功能減小之抗體與Fc融合蛋白，改變包括(但不限於)Bluestone等人所述之Ala-Ala突變(參閱WO 94/28027與WO 98/47531；亦可參見Xu等人，2000 Cell Immunol 200；16-26)。因此某些實施例中，恆定區中具有突變(包括Ala-Ala突變)的本揭露之抗體與Fc融合蛋白可用來減小或廢止效應子功能。根據這些實施例，抗體與Fc融合蛋白可包括位置234突變至丙胺酸或位置235突變至丙胺酸、或其之組合。一實施例中，抗體或Fc融合蛋白包括IgG4框架，其中Ala-Ala突變將描述位置234由***酸至丙胺酸的突變與/或位置235由白胺酸至丙胺酸的突變。另一實施例中，抗體或Fc融合蛋白包括IgG1框架，其中Ala-Ala突變將描述位置234由白胺酸至丙胺酸的 突變與/或位置235由白胺酸至丙胺酸的突變。抗體或Fc融合蛋白可替代地或額外地帶有其他突變，包括CH2區塊中的點突變K322A(Hezareh等人，2001 J Virol.75：12161-8)。

特定實施例中，抗體或Fc融合蛋白可經修飾以提高或抑制補體依賴性細胞毒性(CDC)。可藉由在Fc區導入一或更多胺基酸取代、***或刪除來達到調控之CDC活性(參閱，例如美國專利號6,194,551)。替代或額外地，可在Fc區中導入一或更多半胱胺酸殘基，藉此讓鏈間雙硫鍵形成於此區中。藉此產生之同元二聚型(homodimeric)抗體可具有改善或減小的內化能力與/或提高或降低的補體介導之細胞謀殺能力。參見Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)與Shopes,B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)、WO99/51642、Duncan & Winter Nature 322：738-40(1988)；美國專利號5,648,260、5,624,821與WO94/29351。

6. 調節血管新生、周圍細胞覆蓋與某些異常的方法與組合物

本揭露提供在哺乳類中抑制血管新生與/或提高周圍細胞覆蓋的方法，其藉由對受體施加有效劑量的ALK1 ECD聚胜肽(例如，ALK1-Fc融合蛋白)、DAN蛋白(例如，DAN-Fc融合蛋白)或本文揭露之抗體(諸如，針對 GDF5、GDF6、GDF7、BMP9、BMP10或ALK1之ECD的抗體)或任何上述之核酸拮抗劑(諸如，反義或siRNA)，通稱為「治療劑」。呈現之數據明確地指出本文揭露之抗血管新生治療劑可用來抑制哺乳類眼睛中之血管新生。預期這些治療劑亦可用於抑制骨頭與關節以及腫瘤(特別係與骨頭及關節相關之腫瘤)中之血管新生。

血管新生相關疾病包括(但不限於)血管新生-依賴性癌症，包括諸如實體腫瘤、血液產生之腫瘤(例如，白血病)與腫瘤轉移；良性腫瘤，諸如血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、氣管瘤(trachomas)、與化膿性肉芽腫；類風濕性關節炎；牛皮癬；虹膜紅變(rubeosis)；奧韋綜合症(Osler-Webber Syndrome)；心肌性血管新生(myocardial angiogenesis)；血小板新血管化(plaque neovascularization)；毛細管擴張(telangiectasia)；血友病關節(hemophiliac joint)；及血管纖維瘤(angiofibroma)。

明確地說，本揭露之聚胜肽治療劑可用於治療或避免癌症(腫瘤)，且特別係例如習知依靠血管新生過程以支撐生長之癌症。不像大部分的抗血管新生劑，ALK1 ECD聚胜肽對由多個因子所刺激之血管新生作用。這在癌症中相當有意義，因為癌症通常需要多個因子來支撐腫瘤血管新生。因此，本文揭露之治療劑將特別有用於治療 對以針對單一血管新生因子之藥劑(例如，貝伐單抗，其針對VEGF)的處理有抗性之腫瘤。如本文所示，ALK1-Fc融合蛋白係有效於降低黑色素瘤、肺癌、胰臟癌(例如，胰臟內分泌組織之腫瘤)、多發性骨髓瘤與乳癌(諸如，原發性乳癌或轉移性乳癌；動情素受體陽性(ER+)或動情素受體陰性(ER-))的病理作用。

多發性骨髓瘤係廣泛地被承認為包括顯著血管新生組成之癌症。因此，預期ALK1-Fc融合蛋白與其他本文揭露之治療劑將有用於治療多發性骨髓瘤與其他與骨頭相關之腫瘤。如本文所示，本文揭露之治療劑可用以減緩多發性骨髓瘤相關之骨頭傷害，並因此可用來減緩其他腫瘤(諸如，***或***腫瘤)之骨頭轉移相關之骨頭傷害。如本文所示，GDF5-7配體係高度表現於骨頭中，且雖然不希望受限於任何特定機制，但干擾這些配體會破壞骨頭中腫瘤發展所需之過程。

上述方法的某些實施例中，可一起(同時)或在不同時間(接連地)施加一或更多聚胜肽治療劑。此外，可搭配治療癌症或抑制血管新生的另一類型化合物來施加聚胜肽治療劑。

某些實施例中，可單獨應用本揭露之討論方法。或者，可搭配其他用於治療或避免增殖異常(例如，腫瘤)之傳統抗-癌症治療方法來應用討論之方法。例如，上述方法可用於預防性癌症避免、手術後癌症復發與轉移的避 免、及作為其他傳統癌症治療的輔助方法。本揭露確認可透過利用討論之聚胜肽治療劑來提高傳統癌症治療(諸如，化療、放射性治療、光線療法、免疫療法與外科手術)的有效性。

已經顯示許多傳統化合物具有抗-血管新生活性。這些化合物已經用為化療中的藥劑來縮減實體腫瘤、避免轉移與進一步生長、或減少白血病或骨髓惡性腫瘤中惡性細胞的數目。雖然化療已經有效於治療不同類型的惡性腫瘤，但許多抗-血管新生化合物會引發不欲之副作用。已經顯示在結合二或更多種不同治療時，治療會協同作用且可減少各個治療的劑量，藉此減少各個化合物在較高劑量下所發揮的有害副作用。其他實例中，對一治療有抗性之惡性腫瘤會對二或更多不同治療的組合性療法有所反應。

當搭配另一傳統抗-血管新生劑來施加本文揭露之聚胜肽治療劑時(同時或接連地)，上述治療劑可提高抗-血管新生劑之治療作用或克服對上述抗-血管新生劑的細胞抗性。這可減少抗-血管新生劑的劑量，藉此減少不欲之副作用、或恢復抗-血管新生劑在有抗性之細胞中的效力。

根據本揭露，可搭配其他治療疾病的組合物與步驟來應用本文揭露之抗血管新生劑。例如，可傳統地以外科手術、放射性或化學治療搭配ALK1或ALK1配體拮抗 劑來治療腫瘤，並接著隨之對患者施加拮抗劑以延長微轉移的休眠且穩定任何殘餘的原發腫瘤。

亦可對已知有發展新癌症或復發癌症高風險的個體預防性給予血管新生-抑制劑。因此，本揭露之態樣包括在受體中預防性避免癌症的方法，其包括對受體施加有效劑量的ALK1或ALK1配體拮抗劑與/或其之衍生物、或本揭露之另一血管新生-抑制劑。

如本文所示，ALK1-Fc係有效於縮減類風濕性關節炎之鼠科模式的表現型。因此，本文揭露之治療劑可用於治療類風濕性關節炎與其他類型的骨頭或關節發炎。

某些正常的生理過程亦與血管新生有關，諸如***、月經與胎盤。本揭露之血管新生抑制蛋白係有用於治療內皮細胞之過度或異常刺激的疾病。這些疾病包括(但不限於)腸黏連(intestinal adhesion)、動脈硬化、硬皮症及肥厚性疤痕(hypertrophic scar)，即疤腫。其亦有用於治療具有血管新生作為病理結果之疾病，諸如貓抓病(Rochele minalia quintosa)與潰瘍(Helicobacter pylori)。

一般血管新生抑制蛋白可用作為生產控制劑，其藉由減少或避免胚胎植入所需之子宮血管化。因此，當對雌性施加足夠避免胚胎植入之抑制性蛋白數量時，本揭露提供有效的生產控制方法。生產控制方法的一態樣中，可在已經發生***與受精之前或之後，施加足以妨礙胚胎植入的抑制性蛋白數量，藉此提供有效的生產控制方 法，可能係「黎明後」方法。雖然不欲受限於此項陳述，但咸信抑制子宮內膜血管化會干擾囊胚的植入。相似的輸卵管黏膜血管化的抑制可干擾囊胚的植入，而避免輸卵管妊娠的發生。施加方法可包括(但不限於)藥丸、注射(靜脈內、皮下、肌肉內)、栓劑、***綿(vaginal sponge)、***棉球(vaginal tampon)與子宮內裝置。亦咸信施加本揭露之血管新生抑制劑將干擾正常的胎盤血管增生、且亦干擾順利植入之囊胚與發育中胚胎與胎兒內的血管發育。

眼睛中，血管新生係與下列有關：諸如糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變、斑部退化、角膜移植排斥、新生血管性青光眼與晶狀體後纖維增生症。可藉由眼睛內或其他局部施加至眼睛的方式來施加本文揭露之治療劑。再者，如實施例所示，可全身性地施加ALK1-Fc並依然對眼睛血管新生具有所欲作用。

其他與眼睛血管新生相關之疾病包括(但不限於)流行性角膜結膜炎(epidemic keratoconjunctivitis)、維他命A缺乏、隱形眼鏡超戴症(contact lens overwear)、異位性角膜炎(atopic keratitis)、上輪部角膜炎(superior limbic keratitis)、翼狀贅片亁性角膜炎(pterygium keratitis sicca)、修格蘭氏症候群(sjogrens)、酒糟性痤瘡(acne rosacea)、phylectenulosis、梅毒(syphilis)、分支桿菌感染(Mycobacteria infection)、脂質變性(lipid degeneration)、化學灼傷(chemical burn)、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純皰疹感染(Herpes simplex infection)、帶狀疱疹感染(Herpes zoster infection)、原生動物感染(protozoan infection)、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、蠶蝕性角膜潰瘍(Mooren ulcer)、特瑞恩邊緣變性(Terrien's marginal degeneration)、邊緣角質層分離症(mariginal keratolysis)、類風濕性關節炎、系統性狼瘡(systemic lupus)、多發動脈炎(polyarteritis)、傷口、韋格納氏類肉瘤(Wegeners sarcoidosis)、鞏膜炎(Scleritis)、史帝文生強生症(Steven's Johnson disease)、類天疱瘡角膜放射狀切開(periphigoid radial keratotomy)及角膜移植排斥、鎌刀型貧血症、肉樣瘤(sarcoid)、彈力纖維性偽黃色瘤(pseudoxanthoma elasticum)、柏哲德氏症(Pagets disease)、靜脈阻塞(vein occlusion)、動脈阻塞(artery occlusion)、頸動脈阻塞性疾病(carotid obstructive disease)、慢性葡萄膜炎/玻璃膜炎(chronic uveitis/vitritis)、分支桿菌感染、萊姆病(Lyme's disease)、系統性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosis)、早產兒視網膜病變、愛爾氏病(Eales disease)、貝西氏病(Bechets disease)、造成視網膜炎或脈絡膜炎之感染、疑似演部組織胞漿菌病(presumed ocular histoplasmosis)、貝斯特病變(Bests disease)、近視、視盤小凹(optic pit)、斯特格病變(Stargarts disease)、睫狀體扁平部炎(pars planitis)、慢性視網膜 剝離、黏滯性過高症候群(hyperviscosity syndrome)、弓漿蟲症(toxoplasmosis)、傷口及雷射後併發症。其他疾病包括(但不限於)與虹膜紅變相關之疾病(角的新血管化)及維管組織或纖維組織之異常增殖所導致之疾病(包括所有類型的增生性玻璃體視網膜病變)。

可藉由諸如全身性、局部性、眼內注射治療劑或藉由嵌入持續釋放裝置(釋出治療劑)來治療或避免眼睛的症狀。可以用藥學可接受之眼用載體來傳送治療劑，以致維持化合物接觸眼睛表面足夠的時間週期好讓化合物滲入角膜與眼睛的內部區域，諸如前房(anterior chamber)、後房(posterior chamber)、玻璃體、水樣液(aqueous humor)、玻璃狀液(vitreous humor)、角膜、虹膜/睫狀體、晶體、脈絡膜/視網膜與鞏膜。藥學可接受之眼用載體可為諸如藥膏、植物油或封裝材料。或者，本揭露之治療劑可直接注射進入玻璃狀液與水樣液。進一步替代中，可全身性施加(例如，靜脈內灌注或注射)化合物來治療眼睛。

可施加一或更多治療劑。本揭露之方法亦包括共同施加其他用來治療眼睛症狀的藥劑。當施加超過一個試劑或施加試劑與藥劑之組合時，施加可同時發生或接連發生。可藉由不同施加路徑或相同施加路徑來施加治療劑與/或藥劑。一實施例中，治療劑與藥劑可一起施加於眼用藥學配方中。

一實施例中，治療劑係藉由與其他藉由藥理機制來妨礙血管新生之藥劑同時施加來治療眼睛中血管新生相關之疾病。可與本揭露之治療劑同時施加之藥劑包括(但不限於)培加尼布(Macugen^TM)、雷珠單抗(Lucentis^TM)、鯊胺乳酸鹽(squalamine lactate)(Evizon^TM)、肝素酶(heparinase)及醣皮質素(例如，曲安奈德(Triamcinolone))。一實施例中，提供之方法係用來治療血管新生相關之疾病，其藉由施加包含至少一本文揭露之治療劑與至少一下列藥劑的眼用藥學配方來治療：培加尼布(Macugen^TM)、雷珠單抗(Lucentis^TM)、鯊胺乳酸鹽(Evizon^TM)、肝素酶及醣皮質素(例如，曲安奈德)。

7. 配方與有效劑量

本文揭露之治療劑可配置成藥學組合物。可以傳統方式利用一或更多生理可接受之載體或賦形劑來配置根據本揭露來應用之藥學組合物。上述配方依照大部分的調控需求通常係實質不具熱源。

某些實施例中，本揭露之治療方法包括全身性或局部性以植入物或裝置來施加組合物。當施加時，用於本揭露之治療組合物係不具熱源、生理可接受之形式。亦可選擇性包含ALK1信號傳遞拮抗劑以外之其他治療有用試劑於上述之組合物中，可在本文揭露之方法中與討論之化合物(諸如，ALK1 ECD聚胜肽或任何本文揭露之抗 體)同時或接連地施加。

一般而言，可用腸胃外施加(特別係靜脈內或皮下)來施加本文揭露之蛋白治療劑。適合腸胃外施加之藥學組合物可包括一或更多ALK1 ECD聚胜肽或其他抗體搭配一或更多藥學可接受之無菌等張水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳狀液、或無菌粉末(可在應用之前重新構成無菌注射液或分散液)，其可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、使配方與預期接受者之血液等張之溶質、或懸浮劑或增稠劑。可用於本揭露之藥學組合物的適當水性與非水性載體之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)與上述之適當混合物、植物油(例如，橄欖油)及可注射之有機酯(例如，油酸乙酯)。可維持適當流動性，諸如藉由應用塗層材料(例如，卵磷脂)、在分散液實例中藉由維持所需微粒大小、及藉由應用表面活性劑。

一實施例中，本文揭露之抗體與ALK1 ECD蛋白係施加於眼用藥學配方中。某些實施例中，眼用藥學配方係無菌水溶液(較佳係具有適當注射濃度)、或是軟膏或藥膏。上述軟膏或藥膏通常包括本文揭露之一或更多抗體或ALK1 ECD蛋白溶解或懸浮於無菌藥學可接受之軟膏或藥膏基質，例如礦物油-白軟石蠟基質。軟膏或藥膏組合物中，亦可包括無水羊毛脂於配方中。同樣較佳地添加局部抗菌劑或氯丁醇至上述藥膏作為抗微生物劑。一 實施例中，無菌水溶液係如同美國專利號6,071,958中所述。

本揭露提供之配方可經改變以包括酸類與鹼類來調節pH；及包括緩衝劑來維持pH位於狹窄範圍中。可添加額外藥劑至配方。這些藥劑包括(但不限於)培加尼布、肝素酶、雷珠單抗或醣皮質素。藉由無菌操作或在製備之適當階段執行無菌化來製備根據本揭露之眼用藥學配方。

若想要的話可將組合物與配方呈現於包裝或分散裝置中，其可包含一或更多單位劑量形式(包含活性成分)。包裝可包括例如金屬或塑膠片，例如罩板包裝(blister pack)。包裝或分散裝置可伴隨有施加之操作指南。

實施例：

實施例1：ALK1-Fc融合蛋白的表現

申請人構築可溶的ALK1融合蛋白，其具有融合至人類Fc之人類ALK1細胞外區塊(其間具有極小的連接子)或融合至鼠科Fc區塊之小鼠ALK1(其間具有極小的連接子)。構築體係分別稱為hALK1-Fc與mALK1-Fc。

自CHO細胞株純化之hALK1-Fc係顯示於第3圖中(序列編號：3)。顯著地，雖然人類ALK1蛋白之細胞外區塊常見的C-端係序列編號：1之胺基酸118，發明者已 經確定樂於避免具有終結於麩醯胺酸殘基之區塊。因此，衍生自人類ALK1之序列編號：3部分在Q118的c-端包括兩個殘基，白胺酸與丙胺酸。因此，本揭露提供具有ALK1衍生之序列之c-端的ALK1 ECD聚胜肽(包括Fc融合蛋白)，其係Q118的1至5個上游胺基酸(113-117，相對於序列編號：1)或下游胺基酸(119-123)。

hALK1-Fc與mALK1-Fc蛋白係表現於CHO細胞株中。三個不同引導序列係：

(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(序列編號：7)

(ii)組織胞漿素原活化子(TPA)：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(序列編號：8)

(iii)自然的：MTLGSPRKGLLMLLMALVTQG(序列編號：9)。

利用TPA引導子且具有未經處理之胺基酸序列之選擇形式係顯示於第4圖中(序列編號：5)。

此聚胜肽係由第4圖中顯示之核酸序列所編碼(序列編號：4)。

純化可藉由一系列管柱層析步驟加以完成，包括例如三或更多下列(任何順序)：A蛋白層析、Q瓊脂糖凝膠層析、苯基瓊脂糖凝膠層析、大小排除層析與陽離子交換層析。純化可完成於病毒過濾與緩衝液交換。hALK1-Fc 蛋白係純化至>98%的純度(由大小排除層析所確定)與>95%的純度(由SDS PAGE所確定)。

蛋白產生與純化的過程中，發明者發現hALK1-Fc傾向表現成二聚體與較高級聚集體的混合物，其在變性、還原條件(例如，還原SDS-PAGE)下顯露純粹時對施加至患者係有問題的。聚集體可為免疫原性或不充足的生物可利用性，且因為其之異質性，這些聚集體難以在樂於藥物發展之水平上描述藥學製備物的特性。因此，試驗不同方法以減小最終製備物中的聚集體數量。

一方法中，試驗許多不同的細胞培養基。IS CHO-CD(目錄編號91119，Irvine Scientific,Santa Ana,CA)顯示聚集產物產生中顯著的減少，同時維持hALK1-Fc的高水平產生。此外，在8.0的pH下自恐水***互作用管柱(例如，苯基瓊脂糖凝膠)洗提材料造成聚集產物的進一步解析。得到之材料係由高於99%的二聚體所構成。與R&D系統所賣之ALK1-Fc融合蛋白(目錄編號370-AL，Minneapolis,MN)的比較顯示NSO細胞中產生之此種蛋白係84%的二聚體，而由大小排除層析顯示殘餘蛋白為高分子量物種。製備物的大小管柱剖面圖之比較係顯示於第11圖中。已經確認聚集體形成係ALK1-Fc產生中的顯著問題，預期可發展出其他方法，包括包含額外純化步驟的方法(雖然上述方法會造成較低產量的純化蛋白)。

實施例2：ALK1-Fc配體的辨別

ALK1係TGFβ家族成員的第1型受體。利用Biacore^TM系統針對結合至人類ALK1-Fc融合蛋白來試驗TGFβ家族的許多成員。TGFβ本身、GDF8、GDF11、BMP2與BMP4均無法顯示實質結合至hALK1-Fc蛋白。BMP2與BMP4顯示有限的結合。GDF5、GDF7與BMP9分別顯示K_D值約5 x 10^-8M、5x 10^-8M與1 x 10^-10M的結合。基於GDF5與GDF7對GDF6的相似性，預期GDF6將以相似親合力結合。BMP10係緊密相關於BMP9且亦預期可以相似親合力結合。

實施例3：ALK1-Fc與抗-ALK1抗體在內皮細胞上作用的特性描述

利用受到四個接連共有SBE位置控制之冷光酶報導構築體(SBE4-luc)，其對Smad1/5/8-介導之信號傳遞有所反應，發明者可在HMVEC細胞中且hALK1-Fc藥物或中性化ALK1專一單株抗體存在與不存在的情況下測量BMP-9介導之活性。以rhBMP-9(50ng/ml)刺激HMVEC細胞，其引發Smad1/5/8-介導之轉錄活性，這可藉由SBE4-luc調控之轉錄向上調節的增加而加以驗證。hALK1-Fc化合物(10μg/ml)或抗體(10μg/ml)在添加時會減小(各自將近60%)此種轉錄反應，這代表ALK1-Fc的 存在明顯地降低BMP9信號傳遞，此外，BMP9信號傳遞係有關於ALK1活性。

SMAD磷酸化作用的活化係通常用來試驗上游活化素受體的活化作用。習知ALK1在由其之配體活化之後可調控SMAD蛋白1、5與8的磷酸化。在此，發明人添加rhBMP-9(50ng/ml)以引發HUVEC細胞(一種人類內皮細胞株，其固有地表現ALK1受體)中SMAD磷酸化超過30分鐘的時間週期。在以配體處理細胞後5分鐘可以看見SMAD 1/5/8的磷酸化，並在整個30分鐘周期中維持磷酸化。相當低濃度之hALK1-Fc(250ng/ml)存在的情況下，SMAD 1/5/8磷酸化係減少的，這證實此試劑可抑制內皮細胞中之Smad1/5/8活化。

為了評估ALK1-Fc在試管內系統中的血管新生效應，發明人試驗化合物在Matrigel基質上減少內皮細胞形成管的效力。此技術通常用來評估新血管作用，可提供快速與高度可再現性兩者之結果。內皮細胞生長補充物(ECGS)係用來引發Matrigel上之內皮細胞形成微管，且接著在超過18小時時間周期以藥物與ECGS兩者存在下索狀組織形成(cord formation)的減少來評估抗血管新生化合物的效力。如同預期般，相對於陰性對照組(不添加處理)(這代表Matrigel基質上產生之內皮細胞索狀組織形成的基本水平)，添加ECGS(200ng/ml)會引發明顯的索狀組織形成(第5圖)。一但添加hALK1-Fc(100ng/ml) 或mALK1-Fc(100ng/ml)任一者，可明顯地減少索狀組織形成。所有樣本中管長度的最終定量顯示出hALK1-fc或mALK1-Fc的每個濃度減少新血管化至基本水平。此外，hALK1-Fc與mALK1-Fc在強力促血管新生因子ECGS存在下維持著血管化的強力抑制，這顯示出比陰性對照組血管內皮抑制素(endostatin)(100ng/ml)更有效的抗血管新生活性。

實施例4：CAM試驗

習知VEGF與FGF可刺激血管新生。CAM(雞胚胎絨毛膜)試驗系統係用來評估GDF7的血管新生作用。如第6圖所示，GDF7以相似VEGF的效力來刺激血管新生。GDF5與GDF6發現相似結果。

在CAM試驗中測試ALK1-Fc融合蛋白的抗血管新生活性。這些融合蛋白顯示在VEGF、FGF與GDF7所刺激之血管新生上的有效抗血管新生作用。參閱第7圖。BMP9與PDGF在此試驗中顯示相對差的引發血管新生能力，但是上述這些因子的血管新生作用仍然受到ALK1的抑制。

在CAM試驗中比較ALK1-Fc蛋白與商業上可取得之抗血管新生的抗-VEGF單株抗體。ALK1-Fc蛋白具有與抗-VEGF相比之下相似的效力。抗-VEGF抗體貝伐單抗現今用來治療人類中之癌症與斑部退化。參閱第8圖。

有趣的是，抗-ALK1抗體(R&D系統)無法在此試驗系統中明顯地抑制血管新生。發明人預期這可能反應出不同物種中ALK1序列的差異。

實施例5：小鼠角膜微袋試驗

小鼠角膜微袋試驗係用來評估ALK1-Fc對小鼠眼睛中之血管新生的作用。腹膜內施加之hALK1-Fc可明顯地抑制眼睛血管新生。如第9圖所示，hALK1-Fc與抗-VEGF抑制眼睛血管新生至相同程度。以相同的重量/重量劑量來應用hALK1-Fc與抗-VEGF。當充滿VEGF之Matrigel栓植入非眼睛位置時可得到相似數據。

這些數據顯示ALK1的高親合力配體可促進血管新生而ALK1-Fc融合蛋白具有有效的抗血管新生活性。ALK1的配體分為兩個種類，對ALK1具有中等親合力的GDF5、6、7群組以及對ALK1具有高親合力的BMP9、10群組。

GDF5、6與7主要位於骨頭與關節，而BMP9係循環於血液中。因此，顯露有包括ALK1、GDF5、6與7之骨頭與關節的促血管新生系統以及包括ALK1與BMP9(且可能的BMP10)之全身性血管新生系統。

實施例6：類風濕性關節炎的鼠科模式

鼠科膠原-引發之關節炎模式係公認的類風濕性關節炎模式。此研究中，以載體、抗-VEGF(貝伐單抗-作為陰性對照組，因為貝伐單抗不會抑制鼠科VEGF)、或是1mg/kg、10mg/kg或25mg/kg劑量的mALK1-Fc(「RAP-041」)來治療10隻小鼠的群組。第21天膠原增加之後，關節炎分數(參見第10圖)與腳爪腫脹在所有群組中穩定地提高，在第38天左右到達高峰。以mALK1-Fc處理之小鼠(「RAP-041」)顯示兩者特徵分數的減少，特別係在最高劑量(25mg/kg)下，雖然減少並沒有達到統計顯著性。然而，明顯有劑量相關之趨勢。

在第42天研究結果，關節炎發生率在載體對照處理小鼠中達到10/10、在貝伐單抗處理小鼠中達到9/10、在1mg/kg mALK1-Fc處理群組中達到8/10、且在10mg/kg mALK1-Fc處理群組中達到9/10。在25mg/kg mALK1-Fc處理群組中，疾病發生率降低至6/10。

實施例7：DAN的配體結合特性

DAN係分泌之胱胺酸結狀蛋白家族(抑制BMP活性)的成員。習知DAN可結合並拮抗GDF5。發明人確定DAN亦緊密地結合至GDF7，但不會結合至BMP9。因此，發明人推斷DAN抑制ALK1位於骨頭與關節之配體的系列，且預期DAN係骨頭與關節相關之血管新生的有效拮抗劑。因此，DAN可用於治療骨頭的癌症(諸如，多發性 骨髓瘤與骨頭轉移)、以及類風濕性關節炎與骨關節炎。

總結，這些實施例揭露之發現提供許多本文所述之試劑，用於活體內抑制血管新生(且特別係眼睛血管新生)。這些發現亦指出針對GDF5、6與7之試劑可用來選擇性抑制骨頭與關節的血管新生。這些發現更指出上述試劑可用來治療癌症與類風濕性關節炎。

實施例8：ALK1-Fc在CAM試驗中減少腫瘤血管新生

腫瘤如同任何組織般具有基本的營養與氧氣需求。雖然小腫瘤能夠通過擴散自鄰近血管取得足夠的數量，但隨著腫瘤大小的增加，必須藉由補充與維持現有微血管來確保營養。為了試驗ALK1-Fc蛋白透過血管抑制限制腫瘤生長的能力，發明人在黑色素瘤外植CAM試驗中試驗不同濃度的mALK1-Fc。如同上述之CAM試驗，在各個雞蛋表面上產生小型窗口，經由此植入5x10⁵個B16黑色素瘤細胞。接著每天以0.02mg/ml mALK1-Fc、0.2mg/ml mALK1-Fc處理雞蛋或保持不處理長達一周。實驗結束時，小心地移除腫瘤、秤重且取得數位影像。源自以mALK1-Fc處理之CAM的腫瘤與未處理之CAM腫瘤相比顯示大小的明顯減少。腫瘤重量的定量顯示每天以0.02mg/ml或0.2mg/ml mALK1-Fc任一者處理之腫瘤的重量相對於未處理之CAM顯示65%與85%的減少(第6E圖)。總結，一但添加ALK1-Fc可明顯地抑制新血管化與 腫瘤生長(反應劑量方式)，這指出ALK1-Fc係強大的抗血管新生劑。

實施例9：肺癌實驗模式

為了進一步證實ALK1-Fc在腫瘤進展上的作用，試驗一種肺癌的小鼠模式。透過尾巴靜脈將螢光標記之鼠科Lewis肺癌細胞(LL/2-luc)施加至白化Black 6小鼠。同一天，開始以腹膜內施加PBS對照(n=7)或10mg/kg mALK1-Fc(n=7)任一者來處理小鼠。活體螢光影像顯示對照小鼠中位於肺部之腫瘤的實質發展，到達小鼠瀕死的程度並在植入後22天犧牲。相較之下，ALK1-Fc處理之小鼠顯示肺部腫瘤的實質延遲生長並顯示第22天100%的存活。參見第12圖。

這些數據顯示ALK1-Fc在肺癌的小鼠模式中對腫瘤生長具有實質效應且提供存活優點。

實施例10. ALK1-Fc蛋白在胰臟腫瘤模式上的作用

SV40大T抗原係致癌基因(oncogene)，其可表現在小鼠之許多不同組織中以促進小鼠中自發性、原位腫瘤的形成。這些腫瘤比起通常應用之移植模式更像自然存在之腫瘤。RIP1-Tag2小鼠中，小鼠係經基因修飾以在胰島素啟動子之控制下表現T抗原，以致小鼠發展出明確位 於胰臟之內分泌組織中的腫瘤。發明人試驗ALK1-Fc在RIP1-Tag2腫瘤上的作用。

發明人發現RIP1-Tag2小鼠的胰臟組織經歷過一系列的階段，開始為正常的組織、接著發展出增生外觀、進行血管新生以發展出實質全新的血管系統、且最終變成完全構型之腫瘤。在這些不同階段監控組織中之ALK-1與BMP9表現。結果係顯示於第13圖中。ALK1的表現在發展之血管新生階段的過程中達到高峰，而BMP9表現在整個腫瘤發展過程中持續增加。

在10周大(早期腫瘤發展)或12周大(成熟腫瘤發展)開始以mALK1-Fc或對照Fc處理RIP1-Tag2小鼠(每隻小鼠300微克，或大約12mg/kg，每周兩次持續兩周)。任一實例中，mALK1-Fc的處理實質上暫停腫瘤生長。參見第14圖。注意在10周大處理之小鼠的腫瘤體積無法在10周至12周之間增加，然而以對照Fc蛋白處理之小鼠在相同時間週期顯示三倍的腫瘤體積。同樣地，在12周大處理之小鼠的腫瘤體積無法在12周至14周之間增加，然而對照組顯示額外30%的腫瘤體積增加。

處理之與對照腫瘤的螢光染色顯示出mALK1-Fc處理造成血管化的減少，藉由染色CD31(內皮細胞的標記)來測量。第15圖。顯著地，mALK1-Fc處理造成腫瘤血管組織周圍細胞覆蓋的提高，由NG2陽性細胞(周圍細胞)比上CD31陽性細胞的比例所測量。第16圖。周圍細胞 係形成血管部分的細胞且在調控血管穩定性與滲透性中扮演重要角色。ALK1-Fc處理CaLu6非-小細胞肺癌細胞株移植腫瘤模式中發現相似的周圍細胞覆蓋提高。

這些數據共同地顯示ALK1-Fc係RIP1-Tag2小鼠中形成之自發、原位胰臟腫瘤中之腫瘤生長的有效抑制劑，且腫瘤抑制係相關於腫瘤血管化顯著的減少與腫瘤血管組織周圍細胞覆蓋顯著的增加。後者與腫瘤生物學相關的意義仍待釐清。然而，應當注意糖尿病性視網膜病變的病狀大部分歸因於周圍細胞的損失以及糖尿病性視網膜之血管的流體滲露。因此，這些數據顯示ALK1-Fc可用作抗-腫瘤/抗血管新生劑，且再者，此種試劑可用來促進血管化組織中周圍細胞的形成。

實施例11. ALK1-Fc融合蛋白在乳癌腫瘤模式上的作用

mALK1-Fc係有效於延遲乳癌腫瘤細胞株(衍生自動情素受體陽性(ER+)與動情素受體陰性腫瘤細胞(ER-)兩者)的生長。

以冷光酶基因穩定地轉染MDA-MB-231乳癌細胞株(衍生自ER-細胞)好在活體內偵測腫瘤生長與可能的轉移。此研究中，將1 x 10⁶個MDA-MB-231-Luc細胞原位地植入無胸線裸鼠(Harlan)的乳腺脂肪墊(fat pad)。藉由利用IVIS光譜成像系統(Caliper Life Sciences)之生物 冷光偵測來注意腫瘤進展。冷光(偵測之光子數目)的提高對應於腫瘤負擔的增加。

注射1 x 10⁶個腫瘤細胞進入三十隻雌性裸鼠之乳腺脂肪墊。腫瘤植入後三天，藉由每週兩次皮下(SC)注射載體對照或mALK1-Fc(30mg/kg)任一者來處理小鼠。持續處理並藉由生物冷光成像監控腫瘤進展10周。如同生物冷光偵測所確定般，30mg/kg下的mALK1-Fc處理相對於載體處理之對照組可減緩腫瘤進展(第17圖)。mALK1-Fc的處理可減緩但無法逆轉此模式中的腫瘤生長。可以預期有抗血管新生化合物在腫瘤中，腫瘤需要新血管形成以支援繼續成長之前可存活至某種大小。相似實驗中，hALK1-Fc在如3mg/kg一樣低的劑量水平下產生相似(若輕微地較小)作用。

亦在原位植入模式中試驗動情素-受體-陽性(ER+)、冷光酶表現細胞株MCF-7。此模式中，將17β-***的60天緩慢釋出片皮下植入雌性裸鼠。植入片兩天後，將5 x 10⁶個MCF-7腫瘤細胞植入乳腺脂肪墊。每週兩次藉由IP路徑以3、10與30mg/kg的hALK1-Fc、或載體對照組處理小鼠。以每週一次方式在IVIS-Spectrum成像機(Caliper Life Sciences)上藉由生物冷光成像注意腫瘤進展。載體處理小鼠中，腫瘤快速地進展直到研究第26天(第18圖)。第26天後，腫瘤冷光中有上下波動直到第60天研究結束(當***片耗盡時)。這些波動係因為此 模式的常見特徵，其中快速腫瘤生長會超過宿主動物的血管新生反應，導致腫瘤壞死與伴隨的冷光信號下降。殘餘的細胞持續生長而導致提高的信號。相較於載體處理之對照組，以10或30mg/kg的hALK1-Fc處理之小鼠能夠在研究過程中維持腫瘤大小於恆定水平，這表示此分子在腫瘤生長上的有效作用。

併入參考

本文提及之所有刊物與專利在此以參考資料併入，如同明確且個別地指出各個單獨刊物或專利以參考資料併入。不一致的情況下，包括本文任何定義之本申請案將優先。

等效物

雖然本文明確地揭露討論之發明的特定實施例，但上述說明書係描述性且無限制性。熟悉技術人士在回顧此說明書與下方之申請專利範圍後能理解本發明的許多變化。應參照申請專利範圍及等效物的完整範圍、以及說明書及上述變化來確定本發明之完整範圍。

第1圖顯示人類類活化素激酶1(ALK1)的胺基酸序列(序列編號：1)。單底線顯示預料之細胞外區塊。雙底線 顯示細胞內區塊。信號胜肽與穿膜區塊係無底線。

第2圖顯示人類ALK1 cDNA之核酸序列(序列編號：2)。編碼序列係有底線。編碼細胞外區塊之部分係雙底線。

第3圖顯示人類ALK1之細胞外區塊與Fc區塊之融合的實例(序列編號：3)。hALK1-Fc蛋白包括人類ALK1蛋白之胺基酸22-120在C-端融合至連接子(底線)與IgG1 Fc區。

第4圖顯示用以表現序列編號：3之hALK1-Fc聚胜肽的核酸序列。亦顯示編碼之胺基酸序列。引導序列係經切割以致Asp 22係分泌之蛋白的N-端胺基酸。

第5圖顯示鼠科ALK1-Fc(「RAP」)與人類ALK1-Fc(「ACE」)在內皮細胞管形成試驗中的抗血管新生作用。 所有濃度的RAP與ACE減少回應內皮細胞生長補充物(ECGF)的管形成程度至高於陽性對照血管內皮抑制素(endostatin)的程度。

第6圖顯示GDF7在雞胚胎絨毛膜(CAM)試驗中的血管新生作用。GDF7作用係與VEGF作比較。

第7圖顯示人類ALK1-Fc融合在CAM試驗中的抗血管新生作用。hALK1-Fc抑制VEGF、FGF與GDF7所刺激之血管新生。

第8圖顯示鼠科ALK1-Fc(mALK1-Fc)、hALK1-Fc、 商業上可取得之抗-ALK1單株抗體(抗-ALK1 mAb)與商業上可取得之中性化抗-VEGF單株抗體的對照抗血管新生作用。ALK1-Fc構築體的抗血管新生作用係與抗-VEGF抗體的作用相比較。

第9圖顯示hALK1-Fc與抗-VEGF抗體的活體內抗血管新生作用。hALK1-Fc與抗-VEGF具有在眼睛之血管新生上可比較的作用，如小鼠角膜微袋試驗所測量般。

第10圖顯示mALK1-Fc在類風濕性關節炎的鼠科膠原-引發之關節炎(CIA)模式中的作用。圖表顯示在42天觀察周期過程之膠原-引發DBA/1關節炎雄性小鼠中所測定之關節炎分數的中間群組(mean group)。RAP-041係mALK1-Fc。Avastin^TM係抗-VEGF抗體，貝伐單抗。

第11圖顯示hALK1-Fc(序列編號：3)與來自R&D系統(Minneapolis,MN)之hALK1-Fc融合蛋白藉由Superose 12 10/300 GL大小排除管柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)的解析。R&D系統材料包含約13%的聚集蛋白(如圖示左手邊的尖峰所示)以及某些分子量較小的物種。序列編號：3之材料係高於99%由適當分子大小的二聚體所構成。

第12圖顯示以PBS(圓形)與mALK1-Fc(三角形)處理之小鼠中來自冷光酶-表現之Lewis肺癌(LL/2-luc)細胞的螢光信號。將腫瘤細胞注射進入尾巴靜脈並在細胞施加當天開始處理(PBS或10mg/kg mALK1-Fc IP，每週兩 次)。在第22天將瀕死的PBS-處理之小鼠犧牲。處理與對照組各自由七隻動物所構成(n=7)。

第13圖顯示胰臟內分泌腫瘤之RIP1-Tag2小鼠模式中ALK1與BMP9在腫瘤發展的不同階段之表現水平。ALK1表現在最大血管新生活性之階段過程中達到高峰，而BMP9表現在整個腫瘤發展中持續增加。

第14圖顯示mALK1-Fc處理在RIP1-Tag2小鼠中之腫瘤生長上的作用。在10周大或12周大任一者開始以mALK1-Fc或對照Fc任一者(各個實例中，每隻小鼠300微克，每週兩次)處理小鼠長達兩星期。mALK1-Fc處理完全阻止腫瘤生長。

第15圖顯示以mALK1-Fc或對照Fc處理之RIP1-Tag2小鼠的腫瘤血管密度(CD31⁺細胞)。mALK1-Fc處理減少腫瘤血管密度約50%。

第16圖顯示以mALK1-Fc或對照Fc處理之RIP1-Tag2小鼠的腫瘤血管中之周圍細胞覆蓋(NG2+細胞與CD31+細胞的比例)。mALK1-Fc處理提高周圍細胞覆蓋約100%。

第17圖顯示mALK1-Fc在原位移植模式上的作用，其利用MDA-MB-231細胞株，一種衍生自ER-乳癌細胞之細胞株。30mg/kg的劑量下，mALK1-Fc在移植腫瘤上具有明顯的生長延遲作用。

第18圖顯示hALK1-Fc在原位移植模式上的作用，其利用MCF7細胞株，一種衍生自ER+乳癌細胞之細胞株。30mg/kg的劑量下，hALK1-Fc在移植腫瘤上具有明顯的生長延遲作用。

<110> ACCELERON PHARMA,INC. LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH LTD. Grinberg,Asya Knopf,John Kumar,Ravindra Pearsall,Robert S Seehra,Jasbir Pietras,Kristian

<120> 調節血管新生與周圍細胞組成的方法與組合物

<130> A0904.70003US01

<140> not yet assigned

<141> 2009-05-01

<150> US 61/050,168

<151> 2008-05-02

<150> US 61/144,131

<151> 2009-01-12

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 503

<212> PRT

<213> 人類

<400> 1

<210> 2

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人類

<400> 2

<210> 3

<211> 328

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 重組蛋白

<400> 3

<210> 4

<211> 1075

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 重組DNA

<400> 4

<210> 5

<211> 352

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 重組蛋白

<400> 5

<210> 6

<211> 225

<212> PRT

<213> 人類

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (43)..(43)

<223> 殘基可選擇性突變至丙胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (100)..(100)

<223> 殘基可選擇性突變至丙胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (212)..(212)

<223> 殘基可選擇性突變至丙胺酸

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 重組引導胜？

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 重組引導胜？

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 重組引導胜？

<400> 9

<210> 10

<211> 180

<212> PRT

<213> 人類

<400> 10

<210> 11

<211> 2003

<212> DNA

<213> 人類

<400> 11

Claims (17)

1. 一種包含一ALK1-Fc融合蛋白之藥學製備物，該ALK1-Fc融合蛋白包括：一聚胜肽，其具有至少97%相同於序列編號：1之胺基酸22-118序列的一胺基酸序列，該聚胜肽係融合至一免疫球蛋白之一Fc部分，其中至少90%的ALK1-Fc融合蛋白係以一二聚體形式存在，其中該ALK1-Fc融合蛋白包括序列編號：3之胺基酸序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之藥學製備物，其中該ALK1-Fc融合蛋白之Fc部分係一人類IgG1之一Fc部分。
3. 如申請專利範圍第1項所述之藥學製備物，其中該ALK1-Fc融合蛋白係由一哺乳類細胞株中序列編號：4之核酸的表現所產生。
4. 如申請專利範圍第3項所述之藥學製備物，其中該ALK1-Fc融合蛋白係由一中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株中序列編號：4之核酸的表現所產生。
5. 如申請專利範圍第1項所述之藥學製備物，其中該藥學製備物係一適合施加至眼睛的藥學製備物。
6. 如申請專利範圍第1-5項任何一項所述之藥學製備物，其中至少95%的ALK1-Fc融合蛋白係以二聚體形式存在。
7. 如申請專利範圍第1-5項任何一項所述之藥學製備物，其中至少99%的ALK1-Fc融合蛋白係以二聚體形式存在。
8. 一種ALK1-Fc融合蛋白，該ALK1-Fc融合蛋白包括：一聚胜肽，其具有至少97%相同於序列編號：1之胺基酸22-118序列的一胺基酸序列，該聚胜肽係融合至一免疫球蛋白之一Fc部分，其中至少90%的ALK1-Fc融合蛋白係以一二聚體形式存在，其中該ALK1-Fc融合蛋白包括序列編號：3之胺基酸序列，在製備一藥學組成物上之用途，該藥學組成物係用於在一需要之哺乳類中抑制血管新生。
9. 一種ALK1-Fc融合蛋白，該ALK1-Fc融合蛋白包括：一聚胜肽，其具有至少97%相同於序列編號：1之胺基酸22-118序列的一胺基酸序列，該聚胜肽係融合至一免疫球蛋白之一Fc部分，其中至少90%的ALK1-Fc融合蛋白係以一二聚體形式存在，其中該ALK1-Fc融合蛋白包括序列編號：3之胺基酸序列，在製備一藥 學組成物上之用途，該藥學組成物係用於在一需要之哺乳類中處理一腫瘤。
10. 一種ALK1-Fc融合蛋白，該ALK1-Fc融合蛋白包括：一聚胜肽，其具有至少97%相同於序列編號：1之胺基酸22-118序列的一胺基酸序列，該聚胜肽係融合至一免疫球蛋白之一Fc部分，其中至少90%的ALK1-Fc融合蛋白係以一二聚體形式存在，其中該ALK1-Fc融合蛋白包括序列編號：3之胺基酸序列，在製備一藥學組成物上之用途，該藥學組成物係用於在一需要之哺乳類中處理一與血管新生相關之眼睛異常。
11. 一種ALK1-Fc融合蛋白，該ALK1-Fc融合蛋白包括：一聚胜肽，其具有至少97%相同於序列編號：1之胺基酸22-118序列的一胺基酸序列，該聚胜肽係融合至一免疫球蛋白之一Fc部分，其中至少90%的ALK1-Fc融合蛋白係以一二聚體形式存在，其中該ALK1-Fc融合蛋白包括序列編號：3之胺基酸序列，在製備一藥學組成物上之用途，該藥學組成物係用於在一需要之哺乳類中處理類風濕性關節炎。
12. 如申請專利範圍第8-11項任何一項所述之用途，其中該藥學組成物更包括一抑制血管新生之第二試劑。
13. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該腫瘤係選自下列所構成之群組：黑色素瘤、一肺腫瘤、多發性骨髓瘤、胰臟腫瘤與乳癌。
14. 如申請專利範圍第1項所述之藥學製備物，其中該ALK1-Fc融合蛋白以低於1 x 10^-7M的K_D結合至BMP9。
15. 如申請專利範圍第1項所述之藥學製備物，其中該ALK1-Fc融合蛋白以高於1 x 10^-6的K_D結合至TGFβ-1。
16. 如申請專利範圍第1項所述之藥學製備物，其中該ALK1-ECD聚胜肽的C-端胺基酸殘基不是序列編號：1的麩醯胺酸118(Q118)。
17. 如申請專利範圍第1項所述之藥學製備物，其中該ALK1-ECD聚胜肽的C-端胺基酸殘基為序列編號：1的P113、G114、T115、D116、G117、L119、A120、L121、I122，或L123。