TWI571512B - 抗原類及針對人腸病毒之疫苗類 - Google Patents

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Description

抗原類及針對人腸病毒之疫苗類
本發明關於小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)之病毒，特別是可能有效預防及治療由該等病毒引起之感染之抗原類及疫苗類。
小核糖核酸病毒(picornavirus)係多樣化之病毒家族，其造成許多常見疾病。在小核糖核酸病毒科中之腸病毒(Enterovirus)屬皆具有密切相關性，它們的重要性在於所造成之疾病數量。
腸病毒屬(Enterovirus)之病毒每年影響全世界數百萬計之人，其常見於受感染人之呼吸道分泌物(例如唾液、痰或鼻涕)及糞便中。腸病毒會影響腸道，它們的名稱即是源自「腸(enteric)」之字根。過去，小兒麻痺症(poliomyelitis)係由腸病毒即脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)所引起之最重要之疾病。共有62種非脊髓灰白質炎腸病毒可在人造成疾病：23種柯沙奇(Coxsackie)A型病毒、6種柯沙奇B型病毒、28種伊科病毒及5種其他腸病毒。脊髓灰白質炎病毒以及柯沙奇病毒和伊科病毒皆經由糞口途徑傳播。感染可造成廣泛症狀，從輕微的呼吸道疾病(感冒)、手足口症、急性出血性結膜炎、無菌性腦膜炎、心肌炎、嚴重新生兒敗血症樣疾病到急性弛緩性麻痺。
在小核糖核酸病毒中，腸病毒代表一屬為數眾多且變化廣泛之小RNA病毒，其特徵為單正鏈基因組RNA。所有腸病毒皆包含大約7,500個鹼基之基因組，且以具有因低信度複製及經常重組所致之高突變率而聞名。在感染宿主細胞後，病毒之基因組係以帽蓋非依賴性方式被轉譯成單一多聚蛋白，接著被病毒編碼之蛋白酶處理成結構性殼體蛋白及非結構性蛋白，該等非結構性蛋白主要負責病毒之複製。
腸病毒係與許多人及哺乳動物之疾病有關。以抗體中和測試為基礎之血清學試驗已鑑別出66種人腸病毒血清型。其他抗原性變異體也根據變異株之間減少或非交互之交叉中和反應被定義於數種血清型之內。根據彼等對人及動物之致病機轉，腸病毒原本被分成四種，即脊髓灰白質炎病毒、柯沙奇病毒A型(CA)、柯沙其病毒B型(CB)及伊科病毒，但科學界很快發現不同種類之病毒之間的生物特性有顯著重疊。
腸病毒屬包括下列10種：
￭牛腸病毒(Bovine enterovirus)
￭人腸病毒A型(Human enterovirus A)
￭人腸病毒B型(Human enterovirus B)
￭人腸病毒C型(Human enterovirus C)
￭人腸病毒D型(Human enterovirus D)
￭人鼻病毒A型(Human rhinovirus A)
￭人鼻病毒B型(Human rhinovirus B)
￭人鼻病毒C型(Human rhinovirus C)
￭豬腸病毒B型(Porcine enterovirus B)
￭猴腸病毒A型(Simian enterovirus A)
這十種病毒之內包含許多血清型，例如：腸病毒血清型HEV71、EV-76、EV-89、EV-90、EV-91、EV-92及柯沙奇病毒A16係見於人腸病毒A型之下。
血清型柯沙奇病毒B1(CV-B1)、CV-B2、CV-B3、CV-B4、CV-B5(包括豬水泡病病毒[SVDV])、CV-B6、CV-A9、伊科病毒1型(E-1；包括E-8)、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7、E-9(包括CV-A23)、E-11、E-12、E-13、E-14、E-15、E-16、E-17、E-18、E-19、E-20、E-21、E-24、E-25、E-26、E-27、E-29、E-30、E-31、E-32、E-33、腸病毒B69(EV-B69)、EV-B73、EV-B74、EV-B75、EV-B77、EV-B78、EV-B79、EV-B80、EV-B81、EV-B82、EV-B83、EV-B84、EV-B85、EV-B86、EV-B87、EV-B88、EV-B93、EV-B97、EV-B98、EV-B100、EV-B101、EV-B106、EV-B107、EV-B110(源自黑猩猩)及猴腸病毒SA5係見於人腸病毒B型之下。
血清型EV-95、EV-96、EV-99、EV-102、EV-104、EV-105及EV-109係見於人腸病毒C型之下。
血清型EV-68、EV-70及EV-94係見於人腸病毒D型之下。
脊髓灰白質炎病毒血清型PV-1、PV-2及PV-3係見於人腸病毒C型之下。
腸病毒感染所造成之疾病包括小兒麻痺症，其為最受到注意之由腸病毒感染造成之疾病。然而，非特定之發熱疾病係腸病毒感染最常見之表現。
腸病毒係兒童無菌性腦膜炎最常見之病因。在美國，腸病毒造成30,000至50,000例之腦膜炎。腦炎係腸病毒感染之罕見表徵；當發生時，最常被發現造成腦炎之腸病毒係伊科病毒9型。
由腸病毒引起之肋肌痛的特徵在於胸腹部之嚴重陣發性疼痛，伴隨發燒，有時出現噁心、頭痛及嘔吐。
心包炎及/或心肌炎通常係由腸病毒引起。心律不整、心臟衰竭及心肌梗塞亦有報告。
急性出血性結膜炎可由腸病毒引起。
手足口症係兒童疾病，最常由柯沙奇病毒A型或HEV71感染造成。
一項2007年之研究指出，與腸病毒有關之急性呼吸道或胃腸道感染可能是慢性疲倦症候群之因素。
腸病毒屬之所有成員(包括HEV71、脊髓灰白質炎病毒及柯沙奇病毒A16)皆具有單股正鏈RNA基因組，該基因組具有編碼多聚蛋白P1(由殼體蛋白VP4、VP2、VP3及VP1組成)及數個非結構性蛋白之單一開放閱讀框，該 等非結構性蛋白包括病毒蛋白酶3C及3CD，負責將多聚蛋白P1切割成個別之殼體蛋白VP1、VP3及VP0，該VP0最後再被切割成VP2及VP4。該等殼體蛋白可能組裝成病毒樣顆粒(VLP)。
人腸病毒71型(HEV71)及柯沙奇病毒A16型係值得注意的造成手足口症(HFMD)之主要致病性腸病毒血清型，HEV71有時會造成嚴重的中樞神經系統疾病。HEV71最先是在1969年加州的神經疾病病例中被分離及特徵化。到目前為止，我們對於HEV71感染之宿主反應之分子機轉所知甚少，但認為與編碼趨化激素之mRNA、與蛋白質降解之有關之蛋白質、補體蛋白及促細胞凋亡蛋白質之量增加有關。
手足口症(HFMD)係兒童常見之自限性疾病，由一群A型腸病毒(小核糖核酸病毒科(Picornaviridae))諸如人柯沙奇病毒A16型(CVA16)、柯沙奇病毒A10型(CVA10)及人腸病毒A71型(HEV71)造成。該病毒被分泌於糞便中，亦可見於咽喉分泌物。傳染與兒童近距離接觸及環境污染有關。疾病之特徵為急性發燒伴隨手掌、腳掌、臀部及膝蓋起疹，及通常於7至10天內消退之口腔水泡。僅少部分感染HFMD之兒童會發展成嚴重疾病。
嚴重疾病通常僅發生於HEV71感染，其主要與神經系統及心血管系統有關，以諸如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫及心臟衰竭之症候群表現。在亞太地區，最嚴重之神經系統症候群係腦幹腦炎，其死亡率可達40 至80%。罹患嚴重HFMD之兒童可能需要數月恢復，有些病例可能有永久神經損害。目前，並無針對HFMD之特定抗病毒療法，亦無疫苗可預防除小兒麻痺症以外之腸病毒感染。
HEV71首先在1969年加州一名死於腦炎之病童身上分離出來，1974年首先被報告。雖然自此世界各地均檢測到該病毒，最近HFMD於亞洲之地區性流行令人憂心該區域可能出現更具致病性之HEV71。首次發現造成高死亡病例數之HFMD爆發於1997年馬來西亞沙勞越(Sarawak)。當時造成該爆發之病毒係HEV71。台灣在1998年報告129,106例之HFMD流行，其中405例發生嚴重疾病，造成78例死亡。新加坡在2000-2001年報告9000個流行病例，其中7例死亡，自此每二至三年發生復發性流行。在2008年的前8個月，新加坡報告19,530個HFMD病例及一例死亡。之後HEV71爆發規律地出現在新加坡、泰國、馬來西亞、台灣、日本、韓國及越南。
中國在2007年報告83,344例，其中17例死亡，2008年在安徽省阜陽市出現大型爆發並擴散至中國許多地區。這些大型爆發受到媒體之廣泛報導，最引人注意的是家長對兒童健康之擔憂，以及公衛部門為了阻斷疫情擴散下令停課及關閉日托中心所造成之社會擾亂。自此中國每年都發生大型爆發。
至於小核糖核酸病毒科之其他成員所造成之疾病，自古小兒麻痺這種感染性疾病之天然感染及盛行僅發生在 人類。在開發中國家每年仍有許多人受到脊髓灰白質炎病毒感染。因此，根除脊髓灰白質炎仍須持續進行。
脊髓灰白質炎病毒(Polioviruses)先前被分類在小核糖核酸病毒科之腸病毒屬。現在脊髓灰白質炎病毒已自腸病毒屬除名。脊髓灰白質炎病毒依血清型分類為人脊髓灰白質炎病毒1型(PV-1)、人脊髓灰白質炎病毒2型(PV-2)及人脊髓灰白質炎病毒3型(PV-3)，其被認為是小核糖核酸病毒科腸病毒屬中之人腸病毒C型之亞型。腸病毒屬下之模式種於2008年自脊髓灰白質炎病毒改變成人腸病毒C型。
人腸病毒C型之三個亞型PV-1、PV-2及PV-3的特徵係稍微不同之殼體蛋白。殼體蛋白定義細胞性受體專一性及病毒抗原性。PV-1係天然最常見之形式，然而所有三種形式皆極具感染性，可感染脊髓造成脊髓灰白質炎。
人腸病毒C型之感染已成為廣泛問題，失活之全病毒疫苗被用於大眾免疫接種且為目前所用。失活之脊髓灰白質炎疫苗獲得良好的結果，其係根據沙克(Salk)發展之方法製備，後來也在多方面加以改善。通常，這些疫苗包含失活脊髓灰白質炎病毒株Mahoney、MEF1及Saukett之混合物。
儘管減毒之人腸病毒C型已被產製並用來作為減毒口服脊髓灰白質炎疫苗，該經減毒之人腸病毒C型可能具有危險性，因為在經投予或接觸全病毒之人其致病性可能反轉(麻痺基底之神經毒性)。因此，需要沒有該致病性之安 全且有效之脊髓灰白質炎疫苗。
就像所有腸病毒，四種不同的人腸病毒C型外套/殼體多肽已被鑑別及命名為VP1、VP2、VP3及VP4，彼等相連以形成二十面體病毒殼體。通常，以人腸病毒C型之個別多肽免疫顯示該經分離之多肽無法在人或動物引起中和抗體(Meloen,et al.,J.Gen.Virol.45：761-763,1979)。
美國專利第4,508,708號揭示脊髓灰白質炎病毒及手足口症病毒之個別多肽VP1、VP2、VP3及VP4無法在人及動物引起中和抗體，且在手足口症病毒之個別多肽中僅VP1具有此能力。美國專利第4,508,708號顯示在人腸病毒C型第2類MEF1病毒粒子VP1、VP2及VP3多肽中，僅VP3可誘發中和抗體，雖然該抗體力價低。然而研究發現，VP1、VP2及VP3只有在以含有阿立酮(arildone)之製劑進行免疫接種時方能誘發中和抗體，阿立酮經顯示係能選擇性抑制小核糖核酸病毒複製之廣效性抗病毒劑(Langford,et al.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 28：578-580,1985)。
因此，所欲解決之問題係製備有效之疫苗，其提供對人腸病毒感染之保護免疫性，且不需使用抗病毒化合物。希望加以防範之人腸病毒係例如人腸病毒A型(包括柯沙奇病毒A16及人腸病毒71型)、人腸病毒B型(包括柯沙奇病毒B型、伊科病毒及腸病毒血清型)、人腸病毒C型(包括人脊髓灰白質炎病毒1型、人脊髓灰白質炎病毒2型及人脊髓灰白質炎病毒3型)及人腸病毒D型(包括EV 68)。
以本發明之目的而言，疫苗係該領域之技藝人士所理解，可進一步被定義為含有源自一或多種致病性有機體之抗原的預防性或治療性材料，當該材料被投予至人個體或動物時將刺激主動免疫及防範這些或相關有機體之感染(即產生保護性免疫作用)。
另外，保護性免疫作用可為該領域之技藝人士所廣為了解。然而，保護性免疫作用至少包含誘導或誘發將中和該病毒之中和性抗體及/或T細胞免疫反應。
在疫苗領域所公認了解的是，並不清楚源自病原體之抗原是否能誘發保護性免疫作用。Ellis(Vaccines,Plotkin,et al.(eds)WB Saunders,Philadelphia第29章571頁，1998)在下列引文中說明此一問題：「解決(疫苗發展)問題的關鍵在於識別本身即可誘發產生保護抗體之病毒或微生物病原體之蛋白成份…，藉以保護宿主不受該病原體之攻擊。」
製備經改善之小核糖核酸病毒疫苗之方法為模擬可能誘發保護性抗體之病毒殼體結構或彼之成份，其誘發之保護性抗體就像由死全病毒疫苗所產製者。此種方法比死疫苗、失活疫苗或減毒疫苗來得安全，因為其致病性沒有機會反轉。
所有小核糖核酸病毒分享相同之基因組結構，包括4個在P1基因內之結構基因(VP1、VP2、VP3及VP4，該VP4及VP2係一起表現為VP0)，及在3C及3D基因內之 病毒蛋白酶。該病毒蛋白酶將切割P1基因，藉以允許病毒組裝成腸病毒之病毒樣顆粒(VLP)、病毒次蛋白衣、複合體及/或抗原類。
目前關於疫苗之提議並無成效上的差異。有提議指出利用包含腸病毒之主要殼體蛋白VP1之次單位疫苗作為疫苗基礎，以預防及治療腸病毒感染，包括HEV71感染(Wu,et al.,2001)。
就預防腸病毒感染方面，可能設想死病毒疫苗之方法，其已經顯示能誘發保護性抗體。但通常僅達成低病毒力價，使得製造該種腸病毒疫苗成為挑戰。
本發明關於疫苗類，該等疫苗包括小核糖核酸病毒科之病毒的抗原性外套/殼體蛋白，且該等疫苗不具有可能造成神經毒性之病毒RNA。本發明之疫苗可能包含抗原類、多肽P1或VP0或殼體蛋白(VP)(被稱為VP1、VP2、VP3及/或VP4)或彼之免疫或生物活性片段，其誘發拮抗腸病毒之中和性抗體。
本發明關於疫苗類，其中小核糖核酸病毒抗原類係以一或多種小核糖核酸病毒多肽(特別是人腸病毒肽VP2、VP3或VP0)、彼等之免疫原性片段及/或彼等之抗原性決定簇之形式存在。該小核糖核酸病毒多肽可能藉由化學合成，或利用已知之人腸病毒胺基酸或核酸序列之重組DNA技術獲得。
一種疫苗，其包含一或多種免疫活性抗原，該等免疫活性抗原包含一或多種選自VP0、VP1、VP2、VP3、VP4之人腸病毒(Enterovirus)多肽或彼等之免疫活性片段。
如上述疫苗，其誘發針對人腸病毒之保護性及/或中和性免疫反應。
如上述疫苗，其中該人腸病毒係選自人腸病毒A型、人腸病毒B型、人腸病毒C型或人腸病毒D型。
如上述疫苗，其中該人腸病毒A型係選自人腸病毒71型(HEV71)或柯沙奇病毒(Coxsackievirus)A16型，其中該人腸病毒B型係選自柯沙奇病毒B型或伊科病毒(echovirus)，其中該人腸病毒C型係選自人脊髓灰白質炎病毒1型、人脊髓灰白質炎病毒2型或人脊髓灰白質炎病毒3型，且其中人腸病毒D型係EV68。
如上述疫苗，其中該疫苗包含免疫活性腸病毒VP0多肽。
如上述疫苗，其中該疫苗包含免疫活性腸病毒VP2多肽。
如上述疫苗，其中該疫苗包含免疫活性腸病毒VP3多肽。
如上述疫苗，其中該疫苗包含免疫活性腸病毒VP1多肽。
如上述疫苗，其中該疫苗包含源自一或多個腸病毒物種或血清型之多肽。
如上述疫苗，其中該物種或血清型可為選自HEV71 或柯沙奇病毒A16型之人腸病毒A型。
如上述疫苗，其中該物種或血清型可為選自PV-1、PV-2或PV-3之人腸病毒C型。
如上述疫苗，其中該一或多種包含一或多種選自VP0、VP1、VP2、VP3、VP4之人腸病毒多肽或彼等之免疫活性片段之免疫活性抗原係呈病毒樣顆粒、次蛋白衣(capsomer)、複合體及/或聚集體。
如上述疫苗，其中該病毒樣顆粒包含免疫活性腸病毒VP0多肽。
如上述疫苗，其中該病毒樣顆粒包含免疫活性腸病毒VP2多肽。
如上述疫苗，其中該病毒樣顆粒包含免疫活性腸病毒VP3多肽。
如上述疫苗，其中該病毒樣顆粒包含免疫活性腸病毒VP1多肽。
一種針對腸病毒感染之免疫個體之方法，該方法包含對該個體投予包含一或多種免疫活性抗原之疫苗，該一或多種免疫活性抗原包含一或多種選自VP0、VP1、VP2、VP3、VP4之人腸病毒多肽或彼等之免疫活性片段，當對個體投予時該疫苗之量能有效誘發保護性及/或中和性免疫反應。
如上述方法，其中該疫苗包含免疫活性腸病毒VP0多肽。
如上述方法，其中該疫苗包含免疫活性腸病毒VP1 多肽。
如上述方法，其中該疫苗包含免疫活性腸病毒VP3多肽。
如上述方法，其中該疫苗包含免疫活性腸病毒VP2多肽。
如上述方法，其中該一或多種包含一或多種選自VP0、VP1、VP2、VP3、VP4之人腸病毒多肽或彼等之免疫活性片段之免疫活性抗原係呈病毒樣顆粒、次蛋白衣(capsomer)、複合體及/或聚集體。
如上述方法，其中該病毒樣顆粒包含免疫活性腸病毒VP0多肽。
如上述方法，其中該病毒樣顆粒包含免疫活性腸病毒VP2多肽。
如上述方法，其中該病毒樣顆粒包含免疫活性腸病毒VP3多肽。
如上述方法，其中該病毒樣顆粒包含免疫活性腸病毒VP1多肽。
如上述方法，其中該疫苗包含源自一或多個腸病毒物種或血清型之多肽。
如上述方法，其中該腸病毒物種或血清型可為選自HEV71或柯沙奇病毒A16型之人腸病毒A型。
如上述方法，其中該腸病毒物種或血清型可為選自PV-1、PV-2或PV-3之人腸病毒C型。
一種表現卡匣，其包含與編碼人腸病毒P1多肽之核 酸可操作性連接之啟動子、內部核糖體進入位點(IRES)及編碼人腸病毒3CD蛋白酶之核酸。
如上述表現卡匣，其中該多肽係人腸病毒P1。
如上述表現卡匣，其中該人腸病毒3CD蛋白酶處理該人腸病毒P1多肽。
如上述表現卡匣，其中該經處理之人腸病毒P1多肽相連以形成病毒樣顆粒、次蛋白衣、複合體及/或聚集體。
如上述表現卡匣，其中該人腸病毒P1多肽包含選自VP0、VP1、VP2、VP3、VP4之多肽或彼等之免疫活性片段的組合。
如上述表現卡匣，其中該人腸病毒係選自人腸病毒A型及人腸病毒C型。
如上述表現卡匣，其中該人腸病毒A型係選自HEV71及柯沙奇病毒A16。
如上述表現卡匣，其中該人腸病毒C型係選自人脊髓灰白質炎病毒1型(PV-1)、人脊髓灰白質炎病毒2型(PV-2)或人脊髓灰白質炎病毒3型(PV-3)。
如上述表現卡匣，其中該IRES係源自腦心肌炎病毒(EMCV)。
如上述表現卡匣，其中該源自腦心肌炎病毒(EMCV)之IRES係經基因改質以減少IRES活性。
如上述表現卡匣，其中該源自EMCV之IRES已藉由添加一個核苷酸(A7)至JK區段之A6雙岐圈環經基因改 質。
如上述表現卡匣，其中該IRES係源自人腸病毒。
如上述表現卡匣，其中該啟動子係真核細胞啟動子。
如上述表現卡匣，其中該真核細胞啟動子係多角體蛋白啟動子。
如上述表現卡匣，其中該啟動子係與編碼人腸病毒A型P1多肽、EMCV IRES及人腸病毒A型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接。
如上述表現卡匣，其中該EMCV IRES係經突變以減少IRES活性。
如上述表現卡匣，其中該啟動子係與編碼人腸病毒A型P1多肽、HEV71 IRES及人腸病毒A型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接。
如上述表現卡匣，其中該啟動子係與編碼人腸病毒A型P1多肽、人腸病毒C型IRES及人腸病毒A型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接。
如上述表現卡匣，其中該啟動子係與編碼人腸病毒C型P1多肽、人腸病毒C型IRES及人腸病毒C型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接。
如上述表現卡匣，其中該啟動子係與編碼人腸病毒C型P1多肽、HEV71 IRES及人腸病毒C型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接。
如上述表現卡匣，其中該啟動子係與編碼人腸病毒C型P1多肽、EMCV IRES及人腸病毒C型3CD蛋白酶之 核酸可操作性連接。
一種製備疫苗之方法，該方法包含導入VLP表現卡匣至宿主細胞，培養該宿主細胞經一段足以產製該表現卡匣之多肽之時間，及自該宿主細胞及/或培養上清液回收該人腸病毒多肽。
如上述方法，其中該宿主細胞係真核細胞。
如上述方法，其中該真核細胞係選自昆蟲細胞、哺乳動物細胞系或酵母菌細胞。
如上述方法，其中該昆蟲細胞係選自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、果蠅(drosophila)或源自白線斑蚊(Aedes albopictus)之蚊子細胞。
如上述方法，其中該哺乳動物細胞系係選自CHO、HEK 293、COS-1、HeLa、Vero或NIH3T3。
本發明之詳細說明
本發明提供源自小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)之病毒的抗原之病毒樣顆粒(VLP)、病毒次蛋白衣、聚集體及複合體，以作為預防及/或治療小核糖核酸病毒感染之免疫原性組成物及/或疫苗。代表性實例可包括腸病毒、柯沙奇病毒及脊髓灰白質炎病毒。
本發明之另一態樣提供病毒蛋白，例如P1蛋白或小核糖核酸病毒VP0蛋白、VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白及/或VP4蛋白或彼等之免疫或生物活性片段之組合，其 誘發中和性抗體。本發明包括融合蛋白，其包含前述之病毒蛋白及/或彼之片段，該融合蛋白具免疫活性或生物活性以誘發具保護性之中和性抗體之產製。
在一實施態樣中，腸病毒抗原可為腸病毒外套/殼體蛋白或彼等之免疫活性片段之組合。該病毒外套/殼體蛋白可為VP0、VP1、VP2、VP3及/或VP4蛋白之任何組合，可能呈現病毒樣顆粒(VLP)、次蛋白衣、複合體及/或聚集體之形式。該組合可能呈融合蛋白之形式。
本發明之其他態樣包括製備小核糖核酸病毒科病毒樣顆粒(VLP)、次蛋白衣、複合體及/或聚集體之方法，該方法包含下列步驟：(i)建構與啟動子可操作性連接之表現卡匣，該表現卡匣包含一或多種各自編碼小核糖核酸病毒蛋白之核酸，例如P1蛋白或小核糖核酸病毒VP0蛋白、VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白及/或VP4蛋白之組合，該一或多種核酸係與內部核糖體進入位點(IRES)可操作性相連，該IRES係與3C或3CD蛋白酶可操作性連接；(ii)以該表現卡匣轉染或轉型適當之宿主細胞；(iii)在該宿主細胞表現該卡匣內所包含之核酸後可產製病毒樣顆粒(VLP)及/或次蛋白衣及/或抗原之條件下培養該細胞。
核酸或重組DNA分子可能獲得，其中編碼柯沙奇病毒A16、HEV71、人腸病毒C型(人脊髓灰白質炎病毒PV1、PV2及/或PV3)、EV68或任何其他小核糖核酸病毒蛋白及蛋白酶之開放閱讀框可藉由PCR擴增放大，其利用經適當設計之與柯沙奇病毒A16、HEV71或人腸病毒C 型或任何其他小核糖核酸病毒之核酸序列互補之引子。適當引子可根據標準技術自公眾可用之腸病毒核酸序列設計，包括柯沙奇病毒A16、HEV71及人腸病毒C型或任何其他小核糖核酸病毒。完整基因組序列可得自GenBank，可於美國國家生物技術資料中心(National Center for Bitechnology Information)(NCBI)取得。
在一實施態樣中，小核糖核酸病毒P1蛋白或任何腸病毒P1蛋白係以多肽表現，其接著被3C或3CD蛋白酶切割成VP0、VP1及VP3病毒蛋白或彼之免疫或生物活性片段，該等腸病毒蛋白誘發針對腸病毒之中和性抗體。VP0蛋白可進一步被切割成VP2及VP4蛋白，或彼等之誘發針對腸病毒之中和性抗體之免疫或生物活性片段。該等病毒蛋白可能自行組裝成VLP、次蛋白衣及/或腸病毒蛋白之聚集體。另外將了解的是，該蛋白酶基因可能被包含在VLP表現卡匣之相同DNA重組分子或不同DNA重組分子內，及/或自不同的啟動子或轉譯元件表現。
該VLP表現卡匣之重組DNA分子及核酸可能經設計，藉以利用經適當設計之與人小核糖核酸病毒之核酸序列互補之引子進行PCR擴增以獲得編碼小核糖核酸病毒之結構蛋白或蛋白酶之開放閱讀框。
在其他實施態樣中，該重組DNA分子可能編碼具有至少二種腸病毒結構蛋白或彼等之部分之融合蛋白，該融合蛋白係以單一多肽抗原表現。
本發明包含VLP表現卡匣，其具有腸病毒結構蛋白 之基因序列(P1區)，與處理P1蛋白成為病毒殼體之蛋白質所需之蛋白酶(3CD)，因此允許腸病毒VLP之自行組裝。該表現卡匣係雙順反子載體，其使用在腸病毒P1蛋白之核酸編碼序列上游之啟動子。在編碼該P1蛋白之順反子下游係內部核糖體進入位點(IRES)序列，然後是含有編碼該3CD蛋白酶之核苷酸序列的順反子。
P1區及3CD蛋白酶之表現係自單一雙順反子信號開始，其中該3CD蛋白酶基因係於IRES之控制下經帽蓋非依賴性方式轉譯。我們觀察到蛋白酶3CD之表現可能具有會導致宿主細胞提前死亡之毒性，因此降低腸病毒殼體蛋白及VLP之產率。蛋白酶之活性可被減少但仍維持該卡匣P1蛋白1之高量表現。不同的IRES及含突變之IRES序列被***該表現卡匣以控制該3CD蛋白酶之表現/活性及識別有效IRES以適當處理P1而不對細胞產生毒性。為了有效產製VLP，測試數種重組桿狀病毒以求有效之VLP產製，其中該重組桿狀病毒具有完整P1編碼序列及完整3CD蛋白酶編碼序列，其表現係由源自不同病毒物種或血清型之IRES控制。
舉例來說，本發明之表現卡匣可能包含與編碼人腸病毒A型P1多肽、EMCV IRES及人腸病毒A型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接之啟動子。
本發明之表現卡匣可能包含與編碼人腸病毒A型P1多肽、人腸病毒C型IRES及人腸病毒A型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接之啟動子。
本發明之表現卡匣可能包含與編碼人腸病毒C型P1多肽、HEV71 IRES及人腸病毒C型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接之啟動子。
另外，本發明之表現卡匣可能包含與編碼人腸病毒C型P1多肽、EMCV IRES及人腸病毒C型3CD蛋白酶之核酸可操作性連接之啟動子。
另外，在包含有效IRES之表現卡匣內製備3CD蛋白酶之截短及突變可能達成最大VLP產率。例如，HEV71 3C蛋白酶之甘胺酸(GenBank編號DQ341362.1之胺基酸1671)利用點突變形成被改變成丙胺酸以表現突變之HEV71 3C及後續處理HEV71 P1多肽。
與該領域一般欲達成表現卡匣之蛋白質的高表現及高活性之目標的習知智慧不同的是，在一實施態樣中，本發明實際上尋求減少蛋白質之活性以達到最大蛋白質產率。該減少活性之IRES或3C蛋白酶核酸之突變非預期地導致腸病毒殼體蛋白及VLP之產量增加。
該表現卡匣可被選殖至適當載體，並經轉形/轉染至適當宿主細胞以表現及純化作為疫苗之抗原以防範小核糖核酸病毒包括腸病毒之感染。
該編碼小核糖核酸病毒抗原類之表現卡匣可能被包含於質體內，該質體可能經轉染至真核宿主細胞並於適當生長條件下表現。適當之真核表現系統係該領域之技藝人士所知，包括可誘導之表現系統及適當之真核宿主細胞。
包含本發明之表現卡匣之哺乳動物細胞表現載體包括 該些可被過渡性轉染至宿主細胞及細胞系者。另外，哺乳動物細胞表現載體可為在轉染後穩定維持在宿主細胞內之載體。
另外，哺乳動物細胞表現載體可能包括經穩定或過渡性轉染至哺乳動物宿主細胞或細胞系中之載體，其中感興趣之蛋白質之表現係藉由添加誘導劑至培養基中誘導。哺乳動物宿主細胞及細胞系包括例如CHO、HEK 293、COS-1、HeLa、Vero及NIH3T3細胞。亦將了解的是，其他真核宿主細胞可能包括酵母菌細胞或其他哺乳動物細胞系。
表現卡匣可能包含於會轉染宿主細胞之重組病毒中。可能用於此目的之適當病毒包括桿狀病毒、牛痘病毒、辛德比斯(sindbis)病毒、SV40、仙台(Sendai)病毒、反轉錄病毒及腺病毒。適當之宿主細胞可能包括相容於上述病毒之宿主細胞，包括昆蟲細胞像是草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞(例如Sf9細胞)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞、CHO細胞、雞胚胎纖維母細胞、BHK細胞、人SW13細胞、果蠅細胞、源自白線斑蚊(Aedes albopictus)之蚊子細胞。
包含腸病毒核酸之表現卡匣可能藉由該領域之技藝人士已知之手段被導入適當之宿主細胞中。該等宿主細胞在允許腸病毒基因及蛋白質表現之條件下增殖及培養。
編碼腸病毒VP2蛋白質或彼之誘發針對腸病毒之中和性抗體之免疫或生物活性片段之基因可能被***含有適當啟動子之質體中並於宿主細胞中表現。該經產製之腸病 毒VP2蛋白質將被分離並用來作為疫苗或診斷性用途之免疫原性組成物之基礎。
編碼腸病毒VP4蛋白質或彼之誘發針對腸病毒之中和性抗體之免疫或生物活性片段之基因可能被***含有適當啟動子之質體中並於宿主細胞中表現。該經產製之腸病毒VP4蛋白質將被分離並用來作為疫苗或診斷性用途之免疫原性組成物之基礎。
編碼腸病毒VP0蛋白質或彼之誘發針對腸病毒之中和性抗體之免疫或生物活性片段之基因可能被***含有適當啟動子之質體中並於宿主細胞中表現。該經產製之腸病毒VP0蛋白質將被分離並用來作為疫苗或診斷性用途之免疫原性組成物之基礎。
編碼腸病毒VP0蛋白之基因可能與適當之啟動子可操作性相連並***質體中，該質體展現與適當啟動子相連之腸病毒蛋白酶以提供雙重組質體，該雙重組質體最終可能於真核或原核細胞表現系統中表現。
用於選殖基因及表現腸病毒多肽抗原類之適當載體包括黏質體或質體。適當表現系統包括該領域之技藝人士已知之原核細胞表現系統及原核宿主細胞，包括經黏質體或質體轉形以於原核細胞中表現蛋白質之大腸桿菌(E.coli)。
適當表現系統包括該領域之技藝人士已知之真核表現系統及經質體轉形以於各種真核宿主細胞及細胞系中表現蛋白質之真核宿主細胞。
另外，腸病毒多肽抗原類可能藉由該領域之技藝人士已知之手段得自宿主細胞或培養上清液。
腸病毒VLP、次蛋白衣、抗原類、彼等之免疫活性成份及/或彼等之聚集體可能藉由該領域之技藝人士所知之任何適當純化手段得自經轉染及/或轉形之宿主細胞或宿主細胞之培養基、上清液及溶解物。分離經釋放至培養基中之蛋白質係獲得腸病毒VLP、次蛋白衣、抗原類及/或聚集體之輕便方法。腸病毒VLP、次蛋白衣、抗原類、彼等之免疫活性成份及/或彼等之聚集體可能藉由該領域之技藝人士已知之方法進一步濃縮及純化。
本發明之另一態樣包括疫苗，該疫苗包含小核糖核酸病毒抗原類諸如腸病毒抗原類、VLP及/或次蛋白衣與適當佐劑之組合。該等小核糖核酸病毒抗原類、彼等之免疫活性片段、VLP及/或次蛋白衣可能與任何適當之佐劑組合，諸如經修飾之牛痘病毒、ISCOMS、明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、弗氏(Freund’s)不完全或完全佐劑、Quil A及其他皂素或任何其他例如於Vanselow(1987)S.Vet.Bull.57 881-896中所述之佐劑。
此處使用之用語「磷酸鋁」及「氫氧化鋁」的意義包括所有形式之適合用來佐劑化疫苗之氫氧化鋁或磷酸鋁。
另外，小核糖核酸病毒抗原類可藉由化學合成根據公眾可得之人小核糖核酸病毒之核酸或蛋白質序列之多肽或藉由化學合成製備。
在一態樣中，本發明提供包含一或多種人腸病毒C型 抗原類之疫苗。此處所使用之「脊髓灰白質炎病毒抗原」或「人腸病毒C型抗原」係指能刺激針對人腸病毒C型之中和性抗體的任何抗原。該病毒抗原可能包含外套/殼體蛋白或彼之片段、抗原性決定簇及/或其他人腸病毒C型蛋白。
本發明之一態樣包括人腸病毒C型病毒次單位疫苗，其包含作為抗原之單一人腸病毒C型病毒外套/殼體蛋白。更特別地，本發明關於包含人腸病毒C型VP2外套/殼體蛋白或彼之免疫原性片段作為抗原之疫苗類。
本發明之另一態樣包括含有人腸病毒C型病毒樣顆粒(VLP)、次蛋白衣、複合體及/或聚集體之疫苗，其包含人腸病毒C型VP1、VP2、VP3及/或VP4或VP0蛋白。
重組DNA分子可能獲得，其中包含編碼人腸病毒C型結構蛋白及蛋白酶之開放閱讀框之核酸可藉由PCR擴增獲得，其利用經適當設計之與人腸病毒C型之核酸序列互補之引子。適當引子可根據標準技術自公眾可用之人腸病毒C型核酸序列設計，諸如該些GenBank之完整基因組序列且可由美國國家生物技術資料中心(NCBI)取得。人腸病毒C型脊髓灰白質炎病毒第一型基因組之完整基因組標號包括V01149及V01150。
本發明之表現卡匣可能包含編碼人腸病毒C型P1多肽之核酸。該P1多肽係由在該表現卡匣之IRES的控制下所轉譯之3CD蛋白酶處理(切割)以產生VP1、VP3及/或VP0多肽。VP0、VP1及VP3之組合可能自行相連成病 毒樣顆粒。
人腸病毒C型多肽抗原可能包含人腸病毒C型外套/殼體VP2蛋白、VP0進一步處理之產物及與另一脊髓灰白質炎病毒VP0、VP1、VP3及/或VP4外套/殼體蛋白之組合。人腸病毒C型外套/殼體蛋白之組合可能採取病毒樣顆粒(VLP)、次蛋白衣、複合體及/或聚集體之形式。
編碼人腸病毒C型外套/殼體VP2蛋白之基因可能被***含有適當啟動子之質體並於宿主細胞中表現，該蛋白質可能經分離及使用為免疫原性組成物之基礎以作為疫苗。另外，編碼人脊髓灰白質炎病毒VP2蛋白之基因可能被***含有適當啟動子之質體並於宿主細胞中表現，該蛋白質可能經分離及使用為免疫原性組成物之基礎以作為疫苗。
編碼人腸病毒C型外套/殼體VP4蛋白之基因可能被***含有適當啟動子之質體並於宿主細胞中表現，該蛋白質可能經分離及使用為免疫原性組成物之基礎以作為疫苗。另外，編碼人脊髓灰白質炎病毒VP4蛋白之基因可能被***含有適當啟動子之質體並於宿主細胞中表現，該蛋白質可能經分離及使用為免疫原性組成物之基礎以作為疫苗。
編碼人腸病毒C型外套/殼體VP0蛋白之基因可能被***含有適當啟動子之質體並於宿主細胞中表現，該蛋白質可能經分離及使用為免疫原性組成物之基礎以作為疫苗。另外，編碼人脊髓灰白質炎病毒VP0蛋白之基因可 能被***含有適當啟動子之質體並於宿主細胞中表現，該蛋白質可能經分離及使用為免疫原性組成物之基礎以作為疫苗。
本發明包含疫苗，該疫苗包含一或多種免疫活性抗原，該等免疫活性抗原包含一或多種人腸病毒C型VP0、VP1、VP2、VP3、VP4多肽或彼等之免疫活性片段，該疫苗誘發針對人腸病毒之保護性及/或中和性免疫反應。
在一實施態樣中，該表現卡匣實質上係由編碼人腸病毒C型P1多聚蛋白之核酸、IRES及在該IRES之轉譯控制下之腸病毒3CD蛋白酶組成，該蛋白酶處理該人腸病毒C型P1多聚蛋白成為結構殼體蛋白。
在另一態樣中，本發明提供包含源自P1多聚蛋白之人腸病毒A型抗原類之疫苗，該P1多肽包括VP2、VP4及/或VP0蛋白及/或彼等之生物或免疫活性片段。該等人腸病毒A型抗原類可能源自HEV71及/或柯沙奇病毒A16。該HEV71抗原可能為單一人腸病毒外套/殼體蛋白。特別是，該HEV71抗原可能為HEV71 P1多聚蛋白、VP4、VP2或VP0多肽或彼等之片段，其在投予至人時誘發免疫反應。
在一實施態樣中，該人腸病毒A型抗原可為人腸病毒A型外套/殼體蛋白之組合或彼等之免疫活性片段。舉例來說，該人腸病毒A型抗原可能包含脊髓灰白質炎病毒VP2蛋白與選自VP1、VP3及/或VP4多聚蛋白之另一脊髓灰白質炎病毒外套/殼體蛋白之組合。VP2多肽與另 一脊髓灰白質炎病毒外套/殼體蛋白之組合可能採取病毒樣顆粒(VLP)、次蛋白衣、複合體及/或聚集體之形式。該組合可能呈融合蛋白之形式。
更特別地，本發明關於包含人腸病毒A型VP2外套/殼體蛋白或彼之免疫原性片段作為抗原之疫苗類。
本發明之另一態樣包括含有人腸病毒A型病毒樣顆粒(VLP)及/或次蛋白衣之疫苗，其包含VP1、VP2、VP3及/或VP4或VP0人腸病毒A型蛋白。
重組DNA分子可能獲得，其中編碼人腸病毒A型結構蛋白及/或蛋白酶之開放閱讀框可藉由PCR擴增獲得，其利用經適當設計之與人腸病毒A型之核酸序列互補之引子。經適當設計之引子可根據標準技術自公眾可得之HEV71核酸序列設計。HEV71之完整基因組的編號包括DQ341362、AB204852、AF302996及AY465356。
重組DNA分子可能獲得，其中編碼人腸病毒A型P1、VP1、VP2、VP3及/或VP4或VP0蛋白及彼等之免疫活性片段及蛋白酶之開放閱讀框可藉由PCR擴增獲得，其利用經適當設計之與人腸病毒A型之核酸序列互補之引子。
在本發明之一態樣中，人腸病毒A型P1蛋白係經表現以形成多聚蛋白或多肽，該多聚蛋白或多肽接著被3C或3CD蛋白酶分解成VP0、VP1及VP3蛋白。VP0蛋白可被進一步分解成VP2及VP4蛋白。該等腸病毒蛋白可能自組成VLP、次蛋白衣、複合體及/或腸病毒蛋白之聚 集體。另外將了解的是，該非結構基因及蛋白酶基因可能被包含在相同之DNA重組分子或不同之DNA重組分子內，及/或自不同的啟動子或轉譯元件表現。
本發明之表現卡匣可能包含編碼人腸病毒A型P1多肽之核酸。該P1多肽係由在該表現卡匣之IRES的控制下所轉譯之3CD蛋白酶處理(切割)以產生VP1、VP3及VP0多肽及彼等之免疫活性片段。VP0、VP1及VP3多肽之組合可能自行相連成病毒樣顆粒。
編碼人腸病毒A型VP2蛋白質或彼之免疫活性片段之基因可能被***含有適當啟動子之質體中並於宿主細胞中表現。該經分離之人腸病毒A型抗原例如HEV71 VP2蛋白質可被分離並作為免疫原性組成物之基礎以用於疫苗或診斷性用途。
編碼人腸病毒A型VP4蛋白質或彼之免疫活性片段之基因可能被***含有適當啟動子之質體中並於宿主細胞中表現。該經分離之VP4蛋白質可被分離並用來作為免疫原性組成物之基礎以用於疫苗或診斷性用途。
編碼人腸病毒A型VP0蛋白質或彼之免疫活性片段之基因可能被***含有適當啟動子之質體中並於宿主細胞中表現。該經分離之VP0蛋白質可被分離並用來作為免疫原性組成物之基礎以用於疫苗或診斷性用途。
編碼人腸病毒A型VP0蛋白或彼之免疫活性片段之基因可能與適當之啟動子可操作性相連並***質體中，該質體展現與適當啟動子相連之人腸病毒A型蛋白酶以提 供雙重組質體，該雙重組質體最終可能於真核或原核細胞表現系統中表現。
包含人腸病毒A型基因及核酸之表現卡匣可能藉由該領域之技藝人士已知之手段被導入適當之宿主細胞中。該等宿主細胞在允許人腸病毒A型基因及蛋白質表現之條件下增殖及培養。
本發明包含疫苗，該疫苗包含一或多種免疫活性抗原，該等免疫活性抗原包含一或多種人腸病毒A型VP0、VP1、VP2、VP3、VP4多肽或彼等之免疫活性片段，該疫苗誘發針對人腸病毒之保護性及/或中和性免疫反應。
在一實施態樣中，該表現卡匣實質上係由編碼人腸病毒A型P1多聚蛋白之核酸、IRES及在該IRES之轉譯控制下之腸病毒3CD蛋白酶組成，該蛋白酶處理該人腸病毒P1多聚蛋白成為腸病毒結構殼體蛋白。該等結構蛋白可採取VLP、次蛋白衣、複合體及/或聚集體之形式。
事實上，如此處所述之一或多種腸病毒蛋白之表現提供誘發抗體類之抗原類，該等抗體類具功能性且能以高力價中和選自HEV71、柯沙奇病毒A16、人腸病毒C型或任何其他小核糖核酸病毒之腸病毒。
該一或多種腸病毒蛋白之表現顯示VP2及/或VP0多肽包含被中和性抗血清辨識之表位。
這些功能性抗體意外地與腸病毒VP2及VP0多肽較強結合相較於VP1多肽，該VP1多肽係該領域已知之產製中和性抗體所需之主要殼體蛋白。我們並未預期到VP2 多肽事實上在產製針對HEV71感染之中和性抗體上係為重要。
因此，令人意外的是腸病毒VP2多肽係產製針對腸病毒感染之中和性抗體的殼體蛋白之顯性表位或抗原性決定簇。單獨之HEV71 VP2多肽或與其他HEV71殼體蛋白例如VP0多肽之組合係顯性抗原，其誘發針對HEV71之中和性抗體。
在本發明之態樣中，用於預防腸病毒感染之預防性疫苗係經考慮，該等疫苗納入人腸病毒之VP0及/或VP2結構蛋白至免疫原性組成物中。該免疫原性組成物或疫苗可能包含源自人腸病毒A型包括HEV71及柯沙奇病毒A16之VP0或VP2結構蛋白或彼等之組合。該免疫原性組成物可能被投予至個體以誘發針對人腸病毒之中和性抗體。該免疫原性組成物可能被包含於經投予至個體之疫苗中，以預防由人腸病毒A型諸如HEV71及/或柯沙奇病毒A16造成之手足口症感染。
在本發明之另一態樣中，治療性疫苗係經提供以預防及/或緩解HEV71及/或柯沙奇病毒A16感染之併發症，例如以症候群表現之神經系統及心血管系統併發症，諸如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性痲痺、肺水腫及心衰竭。
在本發明之態樣中，用於預防腸病毒感染之預防性疫苗係經考慮，該疫苗納入源自人腸病毒C型之VP0或VP2結構蛋白，例如PV1、PV2、PV3結構蛋白或彼等之組合或彼等之生物或免疫活性片段。該免疫原性組成物可 能被包含於經投予至個體之疫苗中，以預防由人腸病毒C型包括PV1、PV2及PV3造成之小兒麻痺感染。
另外，該免疫原性組成物或疫苗可能包含源自人腸病毒C型及人腸病毒A型兩種抗原類之組合。
以下可參照本發明隨附圖式中說明之各種實施態樣。在這些實施態樣中，應注意的是腸病毒VLP、次蛋白衣、抗原類及聚集體及DNA重組分子之特定建構體係僅供示範。
可能得到的結論是腸病毒VP2多肽在達成中和性抗體上係為重要。VP2多肽可能足以被調製成針對小核糖核酸病毒感染之疫苗，諸如人腸病毒A型HEV71及柯沙奇病毒A16、人腸病毒C型第1、2及3型及人腸病毒D型EV68。
在本發明之態樣中，用於預防腸病毒感染之預防性疫苗係經考慮，該等疫苗納入該病毒之至少VP0及/或VP2及VP4結構蛋白至免疫原性組成物中。該免疫原性組成物可能被投予至個體以誘發針對小核糖核酸病毒之中和性抗體。該免疫原性組成物可能被包含於疫苗中，該疫苗係經投予至個體以預防小核糖核酸病毒感染。
在本發明之另一態樣中，治療性疫苗係經提供以預防及/或緩解小核糖核酸病毒感染之併發症，例如以症候群表現之神經系統及心血管系統併發症，諸如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性痲痺、肺水腫及心衰竭。
在本發明之其他態樣中，本發明之疫苗組成物係經提 供以用於醫藥。
在另一態樣中，本發明提供雙價或多價疫苗，其包含腸病毒VP0及/或VP2及/或VP4抗原類。舉例來說，人腸病毒A型VP0及/或VP2及/或VP4抗原類可能經組合。另外，源自人腸病毒A型之不同血清型的前述抗原類諸如柯沙奇病毒A16及HEV71之抗原類可能被組合於例如針對人手足口症之疫苗中。
該等雙價或多價疫苗之腸病毒抗原類可能自此處描述之表現卡匣產製。該等腸病毒抗原類可採取病毒樣顆粒、次蛋白衣、複合體及/或聚集體之形式。
在另一態樣中，本發明提供包含腸病毒抗原類及提供針對下列一或多種病原體之免疫性之抗原之雙價或多價疫苗：白喉(D)、破傷風(T)、百日咳(P)、B型流感嗜血桿菌(Hib)、A型肝炎(HA)、B型肝炎(HB)及人腸病毒71型。
在小兒疫苗中，其他相容抗原類亦可被包含，例如已知能有效對抗B型腦膜炎、A型腦膜炎、C型腦膜炎及中耳炎之抗原類。
在每疫苗劑量內小核糖核酸病毒抗原之量係經選擇為於典型接種過疫苗者體內能引起免疫保護反應且無顯著不利之副作用的量。該量將隨所採用之特定免疫原種類而定。特定疫苗之理想量可由觀察受試者之抗體力價及其他反應之標準試驗確定。初次疫苗接種療程可能包括間隔投予2或3劑疫苗，該間隔能提供理想之免疫保護反應。
因此本發明提供一種預防人之小核糖核酸病毒感染之 方法，該方法包含以免疫有效劑量之本發明任何上述態樣之疫苗治療需要治療之人個體。
如此處及申請專利範圍中所使用，下列用語及用詞具有以下意義。
「抗體」係指由B淋巴樣細胞產製之免疫球蛋白分子，其具有由抗原(免疫原)在人或其他動物中引起之特定胺基酸序列。這些分子具有與該抗原專一性反應之特徵。
「抗體反應」或「體液反應」係指一種免疫反應，其中抗體因應抗原性刺激而由B淋巴樣細胞產製及分泌至血液及/或淋巴液。在功能適當之免疫反應中，該抗體與細胞(例如病原體)表面之抗原專一性結合，使該細胞成為吞噬細胞及/或補體媒介性機轉摧毀之標靶。
「抗原」係指任何物質，當其與適當細胞接觸導致誘導敏感及/或免疫反應性之狀態，且在體內或試管內與該經致敏之個體的抗體及/或免疫細胞以可顯現之方式反應。
「表位」係指在複合抗原分子上最簡單形式之抗原性決定簇。此為免疫球蛋白或T細胞受體所辨識之抗原的特定部分。
「融合蛋白」係指藉由表現組合二或多種源自不同腸病毒結構蛋白之基因序列所製備之多肽而形成之蛋白抗原。
「免疫活性片段」或「生物活性片段」係指腸病毒結構蛋白之片段，其誘發針對腸病毒之中和性抗體類。因此，在本發明之上下文中，該等免疫活性片段係經呈現給有機體之免疫系統以影響或更佳地誘導特定免疫反應，藉以免疫 或預防性保護該有機體以防範腸病毒之感染。
中和性抗體免疫反應係指免疫系統之特化細胞辨識該等異源性蛋白、肽或表位之存在並發動特定免疫反應。
在一實施態樣中，本發明之疫苗抗原可誘導保護性免疫反應。此處使用之用語「保護性免疫反應」及/或「中和性免疫反應」係意圖表示該經免疫之個體本身可能不受該疫苗免疫所防範之致病性劑之感染。
「細胞性反應」或「細胞性宿主反應」係指一種由能直接清除病毒感染或癌細胞之特定助手及殺手T細胞所媒介之免疫反應。
「抗原呈現細胞」係指抗原誘導事件之附屬細胞，其主要功能為處理及呈現抗原給淋巴細胞。抗原呈現細胞(APC)與抗原之交互作用係免疫誘導中之關鍵步驟，因為其使淋巴細胞能面對及辨識抗原性分子並變得活化。示範性APC包括巨噬細胞、蘭氏(Langerhans)樹突細胞、濾泡樹突細胞及B細胞。
「B細胞」係指一種產製與抗原交互反應之免疫球蛋白或抗體之淋巴細胞。
「細胞毒性T淋巴細胞」係一種特化之淋巴細胞，其能摧毀外來細胞及受到感染劑感染之宿主細胞，該等細胞產製病毒性抗原。
用語「實質上由...組成」係指除了該些必備成份以外，其他成份亦可能存在於組成物中，惟其該等組成物之實質、基本及/或新穎特徵不受彼等存在之實質影響。
用語「可操作性連接」係指該等所述成份之間的關係允許它們以它們應該進行之方式作用。因此舉例來說，與核酸「可操作性連接」之啟動子表示該啟動子與順反子或超過一個順反子之核酸係以可產製單一順反子、單一雙順反子或單一多順反子信使RNA(mRNA)之方式組合。信使RNA之蛋白質表現可能根據該核酸序列之轉錄/轉譯元件調節。以順反子上游(5')之方向將IRES序列***表現卡匣中係指該IRES序列與該順反子之核酸之連結方式使得該順反子mRNA之轉譯受到IRES控制之調節。
以下可參照本發明隨附圖式中說明之各種實施態樣。在這些實施態樣中，應注意的是小核糖核酸病毒VLP、次蛋白衣、抗原類及聚集體及DNA重組分子之特定建構體係僅供示範。
實施例1：HEV71 VLP表現卡匣及載體之說明
表現卡匣可經由該領域已知之方法建構。
1.1 HEV71 VLP表現卡匣[P1+IRES+3CD] 特徵：
卡匣大小：5172 bp
prPs：痘病毒強早/晚合成性啟動子，43 bp
P1：源自EV71-SB12736-SAR-03(GenBank編號：DQ341362)之P1蛋白編碼序列，添加終止密碼子， 2588 bp
IRES：內部核糖體結合位點，585 bp
3CD：源自EV71-SB12736-SAR-03(GenBank編號：DQ341362)之P3的C及D蛋白編碼序列，添加ATG起始密碼子及終止密碼子，1940 bp
Pac I：罕見切割者，使卡匣能被選殖至pSNX01中(MVA del 3整合載體)
該卡匣係經選殖至pDONR221 Gateway進入載體(Invitrogen)以產製pSN01。
見圖1之表現卡匣及pSN01質體。
1.2 HEV71 VLP表現卡匣[P1+IRES+3C] 特徵：
卡匣大小：3773 bp
prPS：痘病毒強早/晚合成性啟動子，43 bp
P1：源自EV71-SB12736-SAR-03(GenBank編號：DQ341362)之P1蛋白編碼序列，添加終止密碼子，2588 bp
IRES：內部核糖體結合位點，585 bp
3CD：源自EV71-SB12736-SAR-03(GenBank編號：DQ341362)之P3的C蛋白編碼序列，添加ATG起始密碼子及終止密碼子，551 bp
Pac I：罕見切割者，使卡匣能被選殖至pSNX01中(MVA del 3整合載體)
該卡匣係經選殖至pDONR221 Gateway進入載體(Invitrogen)以產製pSN03。
見圖2之表現卡匣及pSN03質體。
1.3獲得包含該***物HEV71[P1+IRES+3CD]或[P1+IRES+3C]之重組桿狀病毒之方法
HEV71 P1加3CD之來源材料係pSN01，P1加3C之來源材料係pSN03。目標係將源自pSN01及pSN03(進入載體)之HEV71-VLP卡匣藉由利用LR CLONASE®之attL/aaR試管內重組導入桿狀病毒表現質體pDEST8(目的載體)中，遵照Invitrogen BAC-TO-BAC®手冊(2009)中之說明進行。
建立二種重組酶反應：1. pSN01(EV71-P1+3CD)x pDEST8以產製pSN07；2. pSN03(EV71-P1+3C)x pDEST8以產製pSN08
pSN07及pSN08被用於藉由轉形DH10bac以產製重組桿狀病毒質體(bacmid)bacSN07及bacSN08，根據Invitrogen BAC-TO-BAC®手冊所述進行。該重組桿狀病毒質體係經轉染至Sf9細胞以救援重組桿狀病毒SN07及SN08。
該重組桿狀病毒SN07及SN08被用於另行感染6孔盤中之Sf9細胞以評估經處理之殼體蛋白之表現。對VP1具專一性之多株兔抗血清被用於西方墨點法中以識別自重組桿狀病毒感染之Sf9細胞的溶解物及上清液中之VP1蛋 白。
1.4 VP1於經SN07感染之Sf9細胞之上清液中之表現
在感染後第3至7天每天收集經感染之Sf9細胞的上清液，蛋白質係於12% SDS-PAGE上分離並轉移至硝化纖維素膜上，接著利用多株兔抗VP1抗血清(1：4000稀釋)隔夜偵測，然後以經HRP共軛之抗兔血清(1：1000稀釋)於室溫中作用1小時。西方墨點接著利用TMB呈色。結果顯示於圖3。觀察到HEV71 VP1係經處理，該蛋白之表現在感染後第3及4天之上清液中被觀察到，且該VP1之表現量在之後減少。重組桿狀病毒SN07感染Sf9細胞產生抗原，該抗原係於上清液發現。
實施例2：上清液及溶解物中經處理之VP1
Sf9細胞係經不同之重組桿狀病毒分離株以10之感染複數(MOI)感染，包括SN07、SN08、對照桿狀病毒bacGUS及空白感染。上清液及溶解物係於感染後第3及4天收集，並利用兔抗VP1抗血清(1：4000稀釋)進行西方墨點分析以評估蛋白質之表現，藉以比較由SN07及SN08所產製之蛋白質的產率。如圖4所示，表現建構體SN07相較於表現建構體SN08在感染後第3及4天之上清液及溶解物中皆產製較多經切割之VP1。
實施例3：VP1及VP0在經100kD分子量截留(MWCO)膜 超過濾後出現於滯留物中
使感染後第3天收集之經SN07感染之Sf9細胞的上清液變澄清並通過AMICON®過濾器(Millipore Corp.)之100 kDa MWCO。測試該滯留物有無經處理之VP1及VP0存在。由於VP1之分子量大約為33 kDa，VP0之分子量為36 KDa，因此不預期這些蛋白質會留在滯留物中除非它們呈現寡聚體之形式。如圖5所示，這些抗原在上清液通過100kDa MWCO超過濾膜後維持在滯留物中。這顯示該等抗原係相連成寡聚體形式。因此，可以得到VP1及VP0係經處理且與其他殼體蛋白相連成寡聚體之結論。
實施例4：該滯留物用於免疫小鼠時誘發強烈之針對HEV71之中和性抗體
二組遠交系白色小鼠係以實施例3所製備之經SN07感染之Sf9上清液濃縮物免疫。該使用之免疫計劃係如圖6所示。
所有免疫組之小鼠產生中和HEV71之抗體，如表1所示。該滯留物用於免疫小鼠時誘發強烈之針對HEV71之中和性抗體。
因此，結論是寡聚體蛋白能在小鼠誘發中和性抗體。
該等寡聚體蛋白可能被用於免疫原性組成物中及/或包含於疫苗內以用於預防腸病毒感染。
實施例5：VP0係於經SN07感染之Sf9細胞的溶解物中表現
Sf9細胞係經SN07感染，且該溶解物係於72、96及120小時收集。利用針對EV71 VP0之兔多株抗血清檢測免疫轉漬，結果顯示VP0係於感染後72小時表現。如圖7所示，自感染後96小時開始，VP0被部分切割成VP2。因此VP0及VP2皆存在於SN07感染細胞之溶解物中。
實施例6：以經SN07感染之Sf9細胞的上清液中之寡聚體抗原免疫之小鼠的集合中和血清在ELISA中對重組VP2具有高力價
ELISA孔盤係以等量之重組VP1及VP2包覆，並用於檢測集合中和性小鼠抗血清。圖8顯示接受該上清液滯留物抗原製劑之小鼠與VP2之結合優於VP1。因此，結論是該等抗體具有功能性且能以高力價中和HEV71。
實施例7：以經SN07感染之Sf9細胞的上清液中之寡聚體抗原免疫之小鼠的集合中和血清與VP2及VP0之結合強過與VP1之結合
圖9之西方墨點分析顯示中和性集合小鼠抗血清與VP2及VP0之結合強過與VP1之結合，即使添加至各孔槽之總蛋白之量相同。這顯示VP2及VP0包含中和性抗血清所識別之表位。
這些功能性抗體意外地與VP2及VP0較強地結合，相較於被認為是產製中和性抗體所需之主要殼體蛋白VP1。因此可以推斷VP2事實上在產製中和性抗體上具有重要性。
可以結論認為在疫苗調製劑中VP2之存在對於產生中和性抗體具有重要性。VP2可能足以被調製成針對HEV71及其他腸病毒A型、B型或C型物種之疫苗，包括人柯沙奇病毒A16、伊科病毒30型及脊髓灰白質炎病毒1型、2型或3型。
進一步將了解的是，本發明之範圍包括一種產生針對脊髓灰白質炎病毒之免疫反應之方法，該方法包括投予有效量之包含脊髓灰白質炎病毒抗原之疫苗之步驟。
實施例8：比較中和性抗體之量
包含HEV71 VP1之免疫原性組成物係用於免疫小鼠。類似地，包含HEV71 VP2及/或VP0之免疫原性組成物係用於免疫小鼠。經HEV71 VP2及/或VP0免疫之小鼠的中和性抗體量係與經HEV71 VP1免疫之小鼠的中和性抗體量比較。該經HEV71 VP2及/或VP0免疫之小鼠的中和性抗體量係顯著高於經HEV71 VP1免疫之小鼠的中和性抗體量。
實施例9：建構重組桿狀病毒載體以自單一雙順反子信息表現人腸病毒C型P1區及蛋白酶3CD
此實施例提供一種藉由減少蛋白酶3CD媒介之殺滅桿狀病毒感染細胞，而導致有效產製人腸病毒C型(脊髓灰白質炎病毒)之VLP之方法。
建構自單一雙順反子信息表現P1區及蛋白酶3CD之重組桿狀病毒載體係於例如圖1所示。該3CD蛋白酶基因係於EMCV IRES之控制下以帽蓋非依賴性方式轉譯。此系統提供調節蛋白酶3CD表現之工具，即評估該突變IRES序列以找出最弱之IRES，以使得相較於P1蛋白較少量之蛋白酶係經產製。
雙順反子載體係經建構，其中該質體在P1編碼序列之上游包含多角體蛋白啟動子。編碼P1之順反子下游係腦心肌炎病毒(EMCV)內部核糖體進入位點(IRES)序列 (GenBank編號AF113968.2；核苷酸1666至2251)，然後是包含編碼蛋白酶3CD之核苷酸序列的順反子。人腸病毒C型P1與3CD之來源物質可自美國菌種保存中心(ATCC)取得，並自已知之人腸病毒C型序列合成(GenBank可自美國國家生物技術資料中心(NCBI)獲得)。
重組桿狀病毒係利用BAC-TO-BAC®系統根據廠商說明(Invitrogen)製備。簡言之，LR CLONASE®係用於將人腸病毒C型VLP卡匣藉由attL/aaR試管內重組導入桿狀病毒表現質體pDEST8(目的載體)。該LR CLONASE®反應係於25℃進行1小時，然後與蛋白酶K一起培養。該LR CLONASE®反應混合物係經轉形至Library Efficiency DH5 α勝任細胞以獲得表現株。DNA係自該形成之表現株分離，並藉由限制酶分析證實人腸病毒C型卡匣之存在。重組桿狀病毒質體係藉由導入該表現卡匣至藉由T7轉位重組酶於DH10bac細胞所獲取之桿狀病毒基因組中建構。該重組桿狀病毒質體係藉由彼等在添加50 μg/ml卡那黴素(kanamycin)、7 μg/ml健他黴素(gentamicin)、10 μg/ml四環素、100 μg/ml X-gal及40 μg/ml IPTG之LB洋菜膠板上的白色表型確認。PureLink HiPure質體DNA微量製備套組(Invitrogen)係用於自DH10Bac E.coli純化高品質之桿狀病毒質體DNA。源自該***物之M13前置引子、M13反置引子及內部引子被用於證實人腸病毒C型卡匣之存在。EFFECTENE®轉染試劑(Qiagen)被用於藉由轉染DNA至Sf9昆蟲細胞以救援重組桿狀病毒。簡言 之，Sf9細胞係以每個T25角瓶2百萬個細胞接種，並於28℃培養6小時以黏附。一微克之重組桿狀病毒質體DNA係經重懸於150 μl之DNA凝聚緩衝液，8μl之增強溶液係經混合並於室溫中培養5分鐘。接著將25μl之EFFECTENE®試劑添加至該DNA混合物，於室溫中培養10分鐘。一毫升之培養基被添加於含有該轉染複合物之試管中，然後轉移並均勻散佈至細胞培養角瓶中。在第3天，以500g離心5分鐘以收集上清液。在轉染後製備高力價之病毒保存液。一旦獲得高力價病毒保存液，使用該保存液以測定標靶蛋白表現之理想時間。
實施例10：藉由減少蛋白酶3CD媒介之殺滅經桿狀病毒感染之細胞製備HEV71及人腸病毒C型之VLP
此實驗描述建構重組桿狀病毒載體以自單一雙順反子信息表現P1區及蛋白酶3CD。該蛋白酶基因3CD係於EMCV IRES之控制下以帽蓋非依賴性方式轉譯，如圖10所示。此系統提供調節蛋白酶3CD表現之工具，即評估該突變IRES序列以找出最弱之IRES，以使得相較於P1蛋白較少量之蛋白酶係經產製。
雙順反子載體係經建構，其中質體在P1編碼序列之上游包含多角體蛋白啟動子。編碼P1之順反子下游係腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)(EMCV)內部核糖體進入位點(IRES)序列及包含編碼該蛋白酶3CD之核苷酸序列的順反子，見圖1。實施例1所使用之IRES包 含天然之EMCV IRES序列，另外有經改變之序列形式。圖10所示之天然EMCV IRES序列顯示在JK區段之A6雙岐圈環。添加一個核苷酸例如腺嘌呤(A7)減少其表現。同樣地，在實施例1所使用之建構體中，該3CD蛋白酶之胺基端係與腦心肌炎病毒IRES融合。重要地以3CD蛋白酶編碼序列改變EMCV起始密碼子之讀框應顯著減少下游基因之表現，見圖11。兩種修飾皆被納入pSN01之EMCV IRES序列中，其命名為pSN01-M1且由DNA2.0合成，如圖12所示。
設計實驗以了解自pSN01-M1之突變EMCV IRES所表現之VLP之特徵。重組桿狀病毒係利用BAC-TO-BAC®系統根據廠商說明(Invitrogen)製備。簡言之，LR CLONASE®係用於將HEV71 VLP卡匣藉由attL/aaR試管內重組導入桿狀病毒表現質體pDEST8(目的載體)。該LR CLONASE®反應係於25℃進行1小時，然後與蛋白酶K一起培養。該LR CLONASE®反應混合物係經轉形至Library Efficiency DH5 α勝任細胞以獲得表現株。DNA係自該形成之表現株分離，並藉由限制酶分析證實HEV71/脊髓灰白質炎病毒卡匣之存在。重組桿狀病毒質體係藉由導入pSN07-M1之表現卡匣至藉由T7轉位重組酶於DH10bac細胞所獲取之桿狀病毒基因組中建構以得到bacSN07-M1。該重組桿狀病毒質體係藉由彼等在添加50 μg/ml卡那黴素(kanamycin)、7 μg/ml健他黴素(gentamicin)、10 μg/ml四環素、100 μg/ml X-gal及40 μg/ml IPTG之LB洋菜膠板上的白色表型確認。PureLink HiPure質體DNA微量製備套組(Invitrogen)係用於自DH10Bac E.coli純化高品質之桿狀病毒質體DNA。源自該***物之M13前置引子、M13反置引子及內部引子被用於證實HEV71/脊髓灰白質炎病毒卡匣之存在。EFFECTENE®轉染試劑(Qiagen)被用於藉由轉染DNA至Sf9昆蟲細胞以救援重組桿狀病毒。簡言之，Sf9細胞係以每個T25角瓶2百萬個細胞接種，並於28℃培養6小時以黏附。一微克之重組桿狀病毒質體DNA係經重懸於150 μl之DNA凝聚緩衝液，8μl之增強溶液係經混合並於室溫中培養5分鐘。接著將25μl之EFFECTENE®試劑添加至該DNA混合物，於室溫中培養10分鐘。一毫升之培養基被添加於含有該轉染複合物之試管中，然後轉移並均勻散佈至細胞培養角瓶中。在第3天，以500g離心5分鐘以收集上清液。在轉染後製備高力價之病毒保存液。一旦獲得高力價病毒保存液，使用該保存液以測定標靶蛋白表現之理想時間。要分析感興趣之蛋白質，生長於10% Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen)中之Sf9細胞係經重懸於1% FBS Sf900-II SFM培養基(Invitrogen)以得到單一細胞，以每毫升一百萬之密度接種於角瓶並於28℃培養4小時。病毒保存液係以10之MOI被添加至PBS清洗細胞，輕搖1小時。用PBS清洗該經感染之細胞三次，使細胞生長於Sf900II-SFM不同時間期間。細胞以低張勻漿緩衝液/1%TRITON® X-100(TX-100)(1.5mM MgCl2， 50mM KCl，20mM HEPES，1% TX-100)溶解，於室溫中搖晃角瓶30分鐘，藉由自該角瓶收集經溶解之細胞並於4℃以7000 rpm離心30分鐘以製備細胞溶解物。該細胞溶解物及上清液之成份係藉由免疫轉漬及ELISA利用特定抗體分析。
實施例11：藉由減少蛋白酶3CD媒介之殺滅經桿狀病毒感染之細胞有效製備HEV71及人腸病毒C型(脊髓灰白質炎病毒)之VLP
建構自單一雙順反子信息表現P1區及蛋白酶3CD之重組桿狀病毒載體係如圖1所示。該3CD蛋白酶基因係於EMCV IRES之控制下以帽蓋非依賴性方式轉譯，如圖10所示。此系統提供調節3CD蛋白酶表現之工具，即評估該突變IRES序列以找出最弱之IRES，以使得相較於P1蛋白較少量之蛋白酶係經產製。
雙順反子載體係經建構，該質體在P1編碼序列之上游包含多角體蛋白啟動子。編碼P1之順反子下游係腦心肌炎病毒(EMCV)內部核糖體進入位點(IRES)序列及包含編碼該3CD蛋白酶之核苷酸序列的順反子，見圖1。實施例1所使用之IRES包含天然之EMCV IRES序列，另外有經改變之序列形式。該天然EMCV IRES序列具有在JK區段之A6雙岐圈環，藉由添加一個核苷酸(A7)已知能減少其表現，見圖10。該pSN01之EMCV IRES序列中之A6雙岐圈環係經基因改質為A7並命名為pSN01-M2，見 圖13，其係藉由DNA2.0合成。
由pSN01-M2之突變EMCV IRES所表現之VLP係經特徵化。重組桿狀病毒係利用BAC-TO-BAC®系統根據廠商說明(Invitrogen)製備。簡言之，LR CLONASE®係用於將HEV71 VLP卡匣藉由attL/aaR試管內重組導入桿狀病毒表現質體pDEST8(目的載體)。該LR CLONASE®反應係於25℃進行1小時，然後與蛋白酶K一起培養。該LR CLONASE®反應混合物係經轉形至Library Efficiency DH5 α勝任細胞以獲得表現株。DNA係自該形成之表現株分離，並藉由限制酶分析證實HEV71/脊髓灰白質炎病毒卡匣之存在。重組桿狀病毒質體係藉由導入pSN07-M2之表現卡匣至藉由T7轉位重組酶於DH10bac細胞所獲取之桿狀病毒基因組中建構以得到bacSN07-M2。該重組桿狀病毒質體係藉由彼等在添加50 μg/ml卡那黴素(kanamycin)、7 μg/ml健他黴素(gentamicin)、10 μg/ml四環素、100 μg/ml X-gal及40 μg/ml IPTG之LB洋菜膠板上的白色表型確認。PureLink HiPure質體DNA微量製備套組(Invitrogen)係用於自DH10Bac E.coli純化高品質之桿狀病毒質體DNA。源自該***物之M13前置引子、M13反置引子及內部引子被用於證實HEV71/脊髓灰白質炎病毒卡匣之存在。EFFECTENE®轉染試劑(Qiagen)被用於藉由轉染DNA至Sf9昆蟲細胞以救援重組桿狀病毒。簡言之，Sf9細胞係以每個T25角瓶2百萬個細胞接種，並於28℃培養6小時以黏附。一微克之重組桿狀病毒質 體DNA係經重懸於150 μl之DNA凝聚緩衝液，8μl之增強溶液係經混合並於室溫中培養5分鐘。接著將25μl之EFFECTENE®試劑添加至該DNA混合物，於室溫中培養10分鐘。一毫升之培養基被添加於含有該轉染複合物之試管中，然後轉移並均勻散佈至細胞培養角瓶中。在第3天，以500g離心5分鐘以收集上清液。在轉染後製備高力價之病毒保存液。一旦獲得高力價病毒保存液，使用該保存液以測定標靶蛋白表現之理想時間。要分析感興趣之蛋白質，生長於10% Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen)中之Sf9細胞係經重懸於1% FBS Sf900-II SFM培養基(Invitrogen)以得到單一細胞，以每毫升一百萬之密度接種於角瓶並於28℃培養4小時。病毒保存液係以10之MOI被添加至PBS清洗細胞，輕搖1小時。用PBS清洗該經感染之細胞三次，使細胞生長於Sf900II-SFM不同時間期間。細胞以低張勻漿緩衝液/1%TX-100(1.5mM MgCl2，50mM KCl，20mM HEPES，1% TX-100)溶解，於室溫中搖晃角瓶30分鐘，藉由自該角瓶收集經溶解之細胞並於4℃以7000 rpm離心30分鐘以製備細胞溶解物。該細胞溶解物及上清液之成份係藉由免疫轉漬及ELISA利用特定抗體分析。
實施例12：藉由減少蛋白酶3CD媒介之殺滅經桿狀病毒感染之細胞有效製備HEV71及人腸病毒C型(脊髓灰白質炎病毒)之VLP
建構自單一雙順反子信息表現P1區及蛋白酶3CD之重組桿狀病毒載體係如圖1所示。該3CD蛋白酶基因係於EMCV IRES之控制下以帽蓋非依賴性方式轉譯，如圖10所示。此系統提供調節蛋白酶3CD表現之工具，即評估該突變IRES序列以找出最弱之IRES，以使得相較於P1蛋白較少量之蛋白酶係經產製。
雙順反子載體係經建構，其中質體在P1編碼序列之上游包含多角體蛋白啟動子。編碼P1之順反子下游係腦心肌炎病毒(EMCV)內部核糖體進入位點(IRES)序列及包含編碼該蛋白酶3CD之核苷酸序列的順反子(圖1)。實施例1所使用之IRES包含天然之EMCV IRES序列，另外有經改變之序列形式。在pSN01建構體中，該3CD蛋白酶之胺基端係與腦心肌炎病毒多聚蛋白融合。以3CD蛋白酶編碼序列改變EMCV起始密碼子之讀框應顯著減少下游基因之表現，見圖11。此改質被納入pSN01之EMCV IRES序列並命名為pSN01-M3，見圖14，其係由DNA2.0合成。
由pSN01-M3之突變EMCV IRES所表現之VLP係經分析。重組桿狀病毒係利用BAC-TO-BAC®系統根據廠商說明(Invitrogen)製備。簡言之，LR CLONASE®係用於將HEV71 VLP卡匣藉由attL/aaR試管內重組導入桿狀病毒表現質體pDEST8(目的載體)。該LR CLONASE®反應係於25℃進行1小時，然後與蛋白酶K一起培養。該LR CLONASE®反應混合物係經轉形至Library Efficiency DH5 α勝任細胞以獲得表現株。DNA係自該形成之表現株分離，並藉由限制酶分析證實HEV71/脊髓灰白質炎病毒卡匣之存在。重組桿狀病毒質體係藉由導入pSN07-M3之表現卡匣至藉由T7轉位重組酶於DH10bac細胞所獲取之桿狀病毒基因組中建構以得到bacSN07-M3。該重組桿狀病毒質體係藉由彼等在添加50 μg/ml卡那黴素(kanamycin)、7 μg/ml健他黴素(gentamicin)、10 μg/ml四環素、100 μg/ml X-gal及40 μg/ml IPTG之LB洋菜膠板上的白色表型確認。PureLink HiPure質體DNA微量製備套組(Invitrogen)係用於自DH10Bac E.coli純化高品質之桿狀病毒質體DNA。源自該***物之M13前置引子、M13反置引子及內部引子被用於證實HEV71/脊髓灰白質炎病毒卡匣之存在。EFFECTENE®轉染試劑(Qiagen)被用於藉由轉染DNA至Sf9昆蟲細胞以救援重組桿狀病毒。簡言之，Sf9細胞係以每個T25角瓶2百萬個細胞接種，並於28℃培養6小時以黏附。一微克之重組桿狀病毒質體DNA係經重懸於150 μl之DNA凝聚緩衝液，8μl之增強溶液係經混合並於室溫中培養5分鐘。接著將25μl之EFFECTENE®試劑添加至該DNA混合物，於室溫中培養10分鐘。一毫升之培養基被添加於含有該轉染複合物之試管中，然後轉移並均勻散佈至細胞培養角瓶中。第3天後，以500g離心5分鐘以收集上清液。在轉染後製備高力價之病毒保存液。一旦獲得高力價病毒保存液，使用該保存液以測定標靶蛋白表現之理想時間。
要分析感興趣之蛋白質，生長於10% Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen)中之Sf9細胞係經重懸於1% FBS Sf900-II SFM培養基(Invitrogen)以得到單一細胞，以每毫升一百萬之密度接種於角瓶並於28℃培養4小時。病毒保存液係以10之MOI被添加至PBS清洗細胞，輕搖1小時。用PBS清洗該經感染之細胞三次，使細胞生長於Sf900II-SFM不同時間期間。細胞以低張勻漿緩衝液/1% TX-100(1.5mM MgCl2，50mM KCl，20mM HEPES，1% TX-100)溶解，於室溫中搖晃角瓶30分鐘，藉由自該角瓶收集經溶解之細胞並於4℃以7000 rpm離心30分鐘以製備細胞溶解物。該細胞溶解物及上清液之成份係藉由免疫轉漬及ELISA利用特定抗體分析。
實施例13：突變IRES建構體M2在上清液中表現較高量之VP1
在野生型或突變EMCV IRES之控制下所表現之重組桿狀病毒表現HEV71殼體蛋白係就自該ECMV IRES之HEV71殼體蛋白的表現量方面經過評估。桿狀病毒在實施例1之SN07的野生型EMCV IRES及分別在實施例10、11及12之3個突變IRES M1、M2及M3之控制下所表現的VLP係就該桿狀病毒表現HEV71殼體蛋白之量方面經過分析。不同啟動子(F)及對照重組桿狀病毒表現bacGUS(G)下之重組桿狀病毒表現P1及3CD亦包含於本實驗中。Sf9細胞係以MOI 5感染，溶解物及上清液皆如 上實施例10至12所述於第3天收集。該溶解物及上清液係利用抗VP1抗體偵測以檢測HEV71殼體蛋白之表現。
圖15之免疫轉漬顯示當溶解物係以抗VP1之抗體偵測時，該突變物M1及M2相較於突變物M3或由2個啟動子啟動之建構體表現較高量之VP1。然而，突變物M2在上清液中產生較多VP1。這些資料係顯示於上方之圖。
圖15下方之圖顯示利用抗gp64抗體偵測之免疫轉漬，抗gp64抗體係針對桿狀病毒之外套蛋白。該免疫轉漬顯示每個樣本皆產製等量之桿狀病毒。
實施例14：利用桿狀病毒表現系統選殖、表現及純化次單位疫苗
本發明意圖產製及使用融合成單一免疫原之重組HEV71及脊髓灰白質炎病毒結構蛋白以於經免疫之個體中誘發保護性免疫反應。本發明大致關於製備重組HEV71及/或脊髓灰白質炎病毒融合蛋白疫苗組成物，其包含HEV71及/或脊髓灰白質炎病毒次單位蛋白或彼等之免疫原性片段及與該重組HEV71及/或脊髓灰白質炎病毒次單位融合蛋白組合之佐劑。HEV71及脊髓灰白質炎病毒次單位融合蛋白可能包含選自VP1、VP2、VP3、VP4、彼等之組合或彼等之免疫原性片段之組合之殼體蛋白。在本實施態樣之一態樣中，該重組HEV71及/或脊髓灰白質炎病毒融合蛋白包含HEV71或脊髓灰白質炎病毒次單位蛋白及與該HEV71或脊髓灰白質炎病毒次單位蛋白基因 相連之融合伴蛋白。本發明考慮產製建構體藉以在大腸桿菌及桿狀病毒中表現下列次單位疫苗之方法：VP0、VP4-VP2-VP3融合、VP2-VP3-VP1融合。
為了自HEV71及/或脊髓灰白質炎病毒製備編碼VP0、VP4-VP2-VP3融合或VP2-VP3-VP1之cDNA，利用經純化之基因組病毒RNA進行逆轉錄/聚合酶連鎖反應(High Pure核酸套組；Roche)。前置因子及反置引子係自該等基因之5’及3’端製備，且該等引子納入起始及終止密碼子。該經擴增之PCR產物係以EcoRI及NotI限制酶消化，並經選殖至如圖16所示之pFastBac HT載體(Invitrogen)。Invitrogen之BAC-TO-BAC®表現系統係供商用，使用根據廠商說明。該等融合基因被選殖至pFastBac HT捐贈質體，重組蛋白質之產製係根據BAC-TO-BAC®桿狀病毒表現系統(Invitrogen)。攜帶該等融合基因之pFastBac HT捐贈質體係藉由T7轉位重組酶之定點重組經轉移至桿狀病毒穿梭載體(桿狀病毒質體)。此係於大腸桿菌株DH10Bac中完成。該等DH10Bac細胞包含授予卡那黴素(kanamycin)抗藥性之桿狀病毒質體，及編碼轉位酶和授予四環素抗藥性之輔助質體。該含有感興趣基因之重組pFastBac HT質體係經轉形至DH10Bac細胞以轉位產製重組桿狀病毒質體。該經轉形之細胞係經連續稀釋，各稀釋液被接種於添加50μg/ml卡那黴素、7μg/ml健他黴素、10μg/ml四環素、100 μg/ml X-gal及40 μg/ml IPTG之LB洋菜板上，於37℃培養至少48小時。 挑選白色菌株並再劃線以確認白色表型。重組桿狀病毒質體係藉由PureLink HiPure質體DNA微量製備套組(Invitrogen)分離，DNA樣本被溶解於40μl之TE(10 mM Tris-HCl pH 8，1 mM EDTA)並用於轉染。
該經分離之桿狀病毒質體DNA係經PCR篩選以找出感興趣之***基因。EFFECTENE®轉染試劑(Qiagen)被用於藉由轉染DNA至Sf9昆蟲細胞以救援重組桿狀病毒。簡言之，Sf9細胞係以每個T25角瓶2百萬個細胞接種，並於28℃培養6小時以黏附。一微克之重組桿狀病毒質體DNA係經重懸於150 μl之DNA凝聚緩衝液，8μl之增強溶液係經混合並於室溫中培養5分鐘。接著將25μl之EFFECTENE®試劑添加至該DNA混合物，於室溫中培養10分鐘。一毫升之培養基被添加於含有該轉染複合物之試管中，然後轉移並均勻散佈至細胞培養角瓶中。在第3天，以500g離心5分鐘以收集上清液。在轉染後製備高力價之病毒保存液。一旦獲得高力價病毒保存液，使用該保存液以測定標靶蛋白表現之理想時間。要分析感興趣之蛋白質，生長於10% Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen)中之Sf9細胞係經重懸於1% FBS Sf900-II SFM培養基(Invitrogen)以得到單一細胞，以每毫升一百萬之密度接種於角瓶並於28℃培養4小時。病毒保存液係以10之MOI被添加至PBS清洗細胞，輕搖1小時。用PBS清洗該經感染之細胞三次，使細胞生長於Sf900II-SFM不同時間期間。細胞以低張勻漿緩衝液/1%TX-100(1.5mM MgCl2，50mM KCl，20mM HEPES，1% TX-100)溶解，於室溫中搖晃角瓶30分鐘，藉由自該角瓶收集經溶解之細胞並於4℃以7000 rpm離心30分鐘以製備細胞溶解物。該等異源性蛋白於細胞中之表現係藉由SDS聚丙醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)及西方墨漬確認，西方墨漬使用His探針-HRP抗體(Thermo Scientific)作為探針。一旦桿狀病毒之產製及蛋白質之表現經過確認，該病毒保存液係經擴增以產製攜帶該感興趣基因之桿狀病毒的濃縮保存液。同時建立最適當之感染昆蟲細胞之病毒濃度及產製該所欲蛋白之理想時間點。要在變性條件下純化，將細胞溶於含有6 M胍基-HCl於100 mM NaH2PO4中、10 mM Tris、300mM NaCl、10 mM咪唑pH 8.0(溶胞緩衝液)之溶胞緩衝液中。將該懸浮液置於冰上超音波震盪5次脈衝，每次脈衝1分鐘功率設定60瓦，於室溫中混合1小時。該溶解物以27K g離心30分鐘以去除細胞殘渣。該上清液被加入預先經溶胞緩衝液平衡之HisTrap(GE healthcare life sciences)管柱。在加入上清液後，用20倍管柱體積之6 M胍基-HCl於100 mM NaH2PO4中、10 mM Tris、300 mM NaCl、40 mM咪唑pH 8.0(清洗緩衝液1)清洗該管柱，然後用20倍管柱體積之8 M尿素於100 mM NaH2PO4中、10 mM Tris、300 mM NaCl、40 mM咪唑pH 8.0(清洗緩衝液2)清洗該管柱。經結合之蛋白質係以含有8M尿素、100 mM NaH2PO4、10 mM Tris、300 mM NaCl、250 mM咪唑pH 8之緩衝液(洗脫液)洗脫。集合含 有蛋白質之組分，並以PBS於4℃隔夜透析。TEV蛋白酶被用於在蛋白質純化後移除組胺酸標籤，根據廠商說明使用。
實施例15：於大腸桿菌表現及純化人腸病毒A型及人腸病毒C型(脊髓灰白質炎病毒)次單位疫苗
ChampionTM pET SUMO表現系統(Invitrogen)在大腸桿菌(E.coli)能產製最高量之可溶性蛋白。其利用小泛素相關修飾因子(SUMO)融合以增進經表現之融合蛋白之可溶性。在表現後，該11 kD SUMO基團可藉由具高度特異性及活性之SUMO(ULP-1)蛋白酶切割其羧基端，以產生原本蛋白質。其亦包含N端6xHis標籤以用於蛋白檢測及純化。
用於表現HEV71及脊髓灰白質炎病毒之抗原性融合蛋白之pET SUMO-VP0、pET SUMO-VP4-VP2-VP3及pET SUMO-VP2-VP3-VP1表現載體(如圖17)的建構係於下說明。VP0、VP4-VP2-VP3融合及VP2-VP3-VP1融合之片段被用來作為HEV71及脊髓灰白質炎病毒次單位疫苗之抗原。SUMO模體及6XHistag係與融合蛋白之N端共軛以分別協助該蛋白質之溶解及該蛋白質之純化。該等抗原性融合蛋白係藉由基因選殖技術產製，包含選殖編碼個別蛋白質之cDNA序列至表現載體以形成pET SUMO-VP0、pET SUMO-VP0、pET SUMO-VP4-VP2-VP3及pET SUMO-VP2-VP3-VP1之表現載體。編碼融合伴之DNA片 段係利用分別由位於前置引子及反置引子之起始密碼子及終止密碼子組成之特定引子經PCR擴增。PCR產物之接合係如下進行：新鮮PCR產物、10X接合緩衝液、pET SUMO載體(25 ng/μl)2 μl、無菌水加至總體積9 μl及加入1 μl T4 DNA接合酶(4.0 Weiss單位)，該接合反應係於15℃隔夜培養，然後用於轉形One Shot® MachlTM-T1R(Invitrogen)勝任細胞。挑選十株(10)細胞，利用PureLinkTM HQ Mini質體純化套組(Invitrogen)自該等細胞株分離質體DNA。該等質體係藉由限制酶分析確認存在正確方向性之***物。質體DNA係如稍早所述自重組細胞分離，且該等質體被轉形至BL21(DE3)One Shot®細胞(Invitrogen)。該等轉形細胞係經生長，並於數個時間點利用IPTG誘導表現以決定最佳表現時間。在每個時間點，自該經誘導及未經誘導之培養液中取出500 μl，所得到之各細胞團塊以80 μl之SDS-PAGE樣本緩衝液重懸。在離心該經煮沸之樣本後，取各樣本10 μl加至SDS-PAGE膠體並加以電泳。
為了大量純化重組融合蛋白使用HisTrap鎳管柱(GE Healthcare Life Sciences)，採用下列步驟。隔夜細胞培養液(5%)被接種於添加50μg/ml卡那黴素之100至300 ml LB中，並在2小時後以1mM IPTG誘導。經2小時後，以3000g離心10分鐘以收集細胞。該細胞團塊被重懸於10%(該培養之總體積)結合緩衝液中(20mM磷酸鈉、0.5M NaCl及20mM咪唑pH7.4)。細胞係經Misonic UltraSonicate液體處理器超音波震盪5次每次1分鐘，間隔時置於冰桶中1分鐘。該經超音波震盪之樣本藉由在4℃以4000 rpm離心1小時分成可溶及不可溶形式。不可溶組分係以含有6M尿素之結合緩衝液重懸。可溶及不可溶組分皆於4℃以4000 rpm離心1小時，然後經0.22μm過濾單位過濾。HisTrap管柱係以結合緩衝液平衡，然後加入過濾樣本置該管柱。接著，以含有40mM咪唑之結合緩衝液清洗管柱，以含有0.5M咪唑(6M尿素用於不可溶組分)之結合緩衝液洗脫該重組蛋白質。所有收集樣本係利用考馬斯藍蛋白質染色法測試。含有純的重組蛋白之經洗脫組分係利用於Tris-HCl中之Merck透析管透析。在透析後，蛋白質濃度係利用布拉德福德(Bradford)試劑預測。根據廠商說明，使用SUMO蛋白酶切割含有6xHis標籤及SUMO之N端肽以產製該天然蛋白。
實施例16：源自經SN07滯留物免疫之小鼠的集合中和血清之抗體與EV71VLP之所有成份結合
VP1、VP2及VP0係如實施例15所述被分開選殖至pET SUMO載體。各殼體蛋白係如實施例15所述於大腸桿菌中表現及純化。該經純化之蛋白質VP0、VP1、VP2及VP3係進行西方墨點分析，並利用實施例4所使用之集合中和血清稀釋1000倍後偵測。實施例4所使用之對照小鼠血清亦包括於本試驗中。
圖18之西方墨點試驗結果顯示，以經SN07感染之 Sf9細胞的上清液中之寡聚體抗原免疫小鼠所得到之集合中和血清能與所有VLP成份VP0、VP1、VP2及VP3結合。
實施例17：HEV71 VLP之特徵，下拉展開源自培養上清液之HEV71 VLP
20ml之源自經重組桿狀病毒SN07感染之細胞的上清液係與10ml之中和性單株抗體(EV18/4/D6-1/F1/G9)混合，靜置於室溫中1小時。該混合物被緩慢添加經過1ml之MabSelect SuReTM(GE Health Care)重組蛋白A、85um洋菜糖珠大小管柱，該管柱係經PBS預平衡，然後以20ml PBS清洗，再以0.5 ml之0.1M甘胺酸-HCl，pH3.0洗脫。組分係30μl之Tris-HCl，pH8.8中和。洗脫液組分進行SDS-PAGE分析，然後進行考馬斯藍染色及脫色。
圖19顯示所有VLP成份(VP0、VP1及VP3)皆可於經考馬斯藍染色之SDS-PAGE膠體中看見。
實施例18：經親和性管柱(AFC)純化之HEV71 VLP之分析
親和性管柱(AFC)係利用中和性單株抗體(EV18/4/D6-1/F1/G9)製備，該單株抗體係利用桿狀病毒SN07上清液滯留物發展。該經洗脫之組分係藉由西方墨點法分析，結果顯示於圖20。在第1及2行經洗脫之組分係利用抗VP1抗體偵測，顯示VP1存在於經AFC純化之VLP中。 在第3及4行經洗脫之組分係利用抗VP2抗體偵測，顯示VP2亦存在於經AFC純化之VLP中。在第5及6行經洗脫之組分係利用抗VP2單株抗體偵測，顯示VP2存在於經AFC純化之VLP中。
實施例19：經AFC純化之HEV71 VLP之電子顯微圖
自實施例18之親和性管柱(AFC)洗脫之組分係藉由電子顯微鏡評估。經AFC純化之VLP的電子顯微鏡圖係顯示於圖21。該電子顯微鏡之結果證實HEV71結構蛋白係組裝成VLP。
實施例20：利用滯留物之小鼠保護試驗
使用之抗原係經20倍濃縮之如上述製備之重組桿狀病毒SN07之粗製滯留物。在交配隔天早上藉由***栓塞判斷是否懷孕，定該天為胚胎日E0.5。二劑100 μL之滯留物係與IMJECT®(明礬)混合，第一劑於E3.5經i.p.注射至懷孕母鼠，在測量體重證實懷孕後，於E17.5給予第二劑。在投予第一劑疫苗之前自各鼠收集初期血液樣本，之後每周收集一次樣本直到以病毒攻毒幼鼠後14天。共三組Balb/c小鼠，20隻小鼠係經免疫然後攻毒(20隻小鼠)，20隻小鼠係經空白免疫然後攻毒(20隻小鼠)，5隻小鼠未經免疫、未經攻毒。五日齡之幼鼠係以50 μl之MP-26M病毒(含有100 x HD50之MP-26M)感染。每天觀察所有經感染之動物是否出現疾病臨床症狀二次，直到感 染後14天。異常徵兆包括生長遲緩、體重減輕、體型瘦小、胃中無乳、疲倦、歪頭、弓背、翹毛、脫水、低體溫、肢體麻痺。麻痺係根據下列分級系統評分：
0-正常
1-肢體無力但仍可移動肢體
2-無法移動受影響之肢體
3-四肢癱瘓即無法移動之四肢
被評分為第3級癱瘓之動物在麻醉(HD50)下施以頸椎脫臼予以安樂死。對多種目標器官之切片進行組織病理學研究。
該保護性試驗之結果係顯示於下表2。
經VLP免疫之母鼠產下兩胎幼鼠。一隻母鼠產下5隻幼鼠，並且會照顧幼鼠。第二隻母鼠產下1隻非常虛弱之幼鼠，該母鼠不照顧幼鼠。
我們的結論是經免疫之母鼠產下之幼鼠中83%在病毒 攻毒中受到保護。
組織病理學觀察之概要係於表3顯示。
五隻產下幼鼠之母鼠被納入疫苗保護試驗中(11%懷孕率)。人道終點之量(HD50)係依據Reed and Muench,1938之方法計算為2.0 x 102 TCID50之MP-26M。經免疫之母鼠所產下之小鼠中83%在攻毒中受到保護。
組織病理學結果顯示，經HEV71-VLP免疫之母鼠所產下之3隻幼鼠在以HEV71病毒攻毒後顯示無感染之臨床症狀。
然而，經空白免疫(明礬/PBS)之母鼠所產下之3隻幼 鼠在以HEV71病毒攻毒後受到感染。未經免疫母鼠、未攻毒組之2隻小鼠無顯示感染之臨床症狀。
VLP疫苗保護一胎幼鼠(5/6經免疫母鼠產下之幼鼠，相較於0/12經空白免疫母鼠產下之幼鼠)免於受到HEV71之B3基因型小鼠適應株之致死性攻毒。
實施例21：人腸病毒C型(脊髓灰白質炎病毒-PV)VLP表現
不同的脊髓灰白質炎病毒表現卡匣係經建構以產製脊髓灰白質炎病毒VLP。所有表現卡匣皆包含脊髓灰白質炎病毒P1多肽及不同的IRES，該等IRES引導脊髓灰白質炎病毒3CD蛋白酶之表現：(PV-P1+HEV71-IRES+PV-3CD)、(PV-P1+EMCV-IRES+PV-3CD)、(PV-P1+PV-IRES+PV-3CD)。獲得該脊髓灰白質炎病毒VLP表現卡匣之重組桿狀病毒係經測試。以該桿狀病毒感染細胞後3天收集該經感染細胞之溶解物，利用兔抗PVP3抗體(1：2000)評估脊髓灰白質炎病毒VP3之表現。
只有含PV-IRES之建構體產製預期大小之VP-3蛋白。和PV-IRES建構體不同的是，當3CD蛋白酶處於HEV71-IRES或EMCV-RES之控制下時，該脊髓灰白質炎病毒VP3蛋白未經適當處理，因此不良地影響該脊髓灰白質炎病毒VLP之產製。因此，獲得PV-IRES之脊髓灰白質炎病毒PV-VLP表現卡匣能非常有效地產製脊髓灰白質炎病毒VLP。
實施例22：ELISA證實脊髓灰白質炎病毒PV-VLP組裝
為了證實脊髓灰白質炎病毒VLP係自該PV-VLP表現卡匣產製，利用攜帶PV-VLP表現卡匣之重組桿狀病毒的溶解物及上清液進行二位點ELISA，其中該PV-3CD蛋白酶係位於脊髓灰白質炎病毒IRES之控制下。Sf9細胞係經攜帶PV-VLP表現卡匣(包括PV-IRES)之重組桿狀病毒感染。在感染後第3天收集溶解物及上清液。脊髓灰白質炎病毒VLP之形成係利用二位點ELISA評估。
二位點ELISA之進行係藉由製備經蛋白A純化之兔抗脊髓灰白質炎病毒VP3抗體作為捕捉抗體，將其稀釋於包覆緩衝液(0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液，pH 9.6)至50μg/mL。100 μl/孔之抗體係分配於NUNC免疫孔盤，於4℃儲存隔夜。在PBST(0.05%)清洗後，該免疫孔盤以200 μl/孔之封閉液(1%酪蛋白於PBS中)於室溫中封閉2小時。源自攜帶PV-VLP表現卡匣之重組桿狀病毒(其中該PV-3CD蛋白酶係位於脊髓灰白質炎病毒IRES之控制下)的溶解物及上清液之樣本係經稀釋劑(0.2%酪蛋白於PBS中)稀釋，以100μl/孔分配，並於室溫中培養1小時然後用PBST(0.05%)清洗。
為了檢測VLP，小鼠單株抗體抗VP1(5-D8/1株；Dako)係以0.2%酪蛋白於PBS中稀釋為1：250。該經稀釋之檢測單株抗體係以100μl/孔分配，並於室溫中培養1小時。抗小鼠HRP共軛之二級抗體係以0.2%酪蛋白於PBS 中稀釋為1：1000。在以PBST(0.05%)清洗孔盤後，100μl/孔之經稀釋之二級抗體係經分配，該孔盤於室溫中培養1小時。該孔盤以清洗緩衝液PBST(0.05%)清洗。SureBlueTM TMB1(KPL)成份微孔過氧化酶受質係以100μl/孔分配，於室溫中培養10分鐘以發色。加入100μl/孔之停止溶液(5mM NaOH)以停止反應。各孔之吸光度係於OD 650nm下讀取。
圖23之二位點ELISA之結果證實VP1及VP3蛋白係彼此相連，顯示VLP確實係自該PV-VLP表現卡匣形成。
實施例23：建構具有HEV71 IRES之HEV71 VLP表現卡匣(P1+HEV71 IRES+3CD)
圖24顯示具有HEV71-IRES之HEV71 VLP表現卡匣的結構。該表現卡匣類似實施例1之建構體(pSN01)，不同的是該3CD蛋白酶之表現係由HEV71 IRES驅動而非EMCV IRES。HEV71 IRES序列可見於GenBank編號DQ341362.1，核苷酸1至747。含有HEV71表現卡匣之載體係藉由利用LR CLONASE®之attL/aaR試管內重組導入桿狀病毒表現質體pDEST8(目的載體)中，遵照Invitrogen BAC-TO-BAC®手冊(2009)中之說明。進入載體與pDEST8之間的重組產生表現株。如Invitrogen BAC-TO-BAC®手冊所述，表現株藉由轉形DH10bac以得到重組桿狀病毒質體。使該重組桿狀病毒質體轉染至Sf9細胞救援該攜帶具有P1、HEV71 IRES及3CD之表現卡匣的 重組桿狀病毒。
進一步感染Sf9細胞可被用於評估救援重組桿狀病毒於6孔盤中表現經處理之殼體蛋白。對VP1、VP0及VP3具專一性之多株兔抗血清將被用於西方墨點法中以識別自重組桿狀病毒感染之Sf9細胞的溶解物及上清液中之組裝VLP。
實施例24：建構具有PV-IRES(P1+PV-IRES+3CD)之HEV71 VLP表現卡匣
該表現卡匣類似實施例24之表現卡匣，不同的是該3CD蛋白酶之表現係由脊髓灰白質炎病毒IRES(PV-IRES)驅動而非HEV71-IRES。該脊髓灰白質炎病毒IRES序列可見於GenBank編號V01150.12，核苷酸1至628。
含有HEV71表現卡匣之載體係藉由利用LR CLONASE®之attL/aaR試管內重組導入桿狀病毒表現質體pDEST8(目的載體)中，遵照Invitrogen BAC-TO-BAC®手冊(2009)中之說明進行。進入載體與pDEST8之間的重組反應係經建立以產製表現株。如Invitrogen BAC-TO-BAC®手冊所述，表現株藉由轉形DH10bac以得到重組桿狀病毒質體。使該重組桿狀病毒質體轉染至Sf9細胞救援該攜帶具有P1、PV IRES及3CD之表現卡匣的重組桿狀病毒。
進一步感染Sf9細胞可被用於評估救援重組桿狀病毒於6孔盤中表現經處理之殼體蛋白。對VP1、VP0及VP3 具專一性之多株兔抗血清將被用於西方墨點法中以識別自重組桿狀病毒感染之Sf9細胞的溶解物及上清液中之組裝VLP。
圖1：HEV71 VLP表現卡匣[P1+IRES+3CD]及pSN01質體。
圖2：HEV71 VLP表現卡匣[P1+IRES+3C]及pSN03質體。
圖3：VP1於經SN07感染之Sf9細胞之上清液中之表現。
圖4：上清液及溶解物中經處理之VP1。
圖5：VP1及VP0在經100kDa分子量截留(MWCO)膜超過濾後出現於滯留物中。
圖6：產製中和性抗體之免疫計劃。
圖7：在3次不同收集時間，以抗VP0(箭頭)之兔多株抗血清偵測之免疫轉漬。
圖8：以經SN07感染之Sf9細胞的上清液中之寡聚體抗原免疫之小鼠的集合中和血清在ELISA中顯示對重組VP2具有高力價。
圖9：以經SN07感染之Sf9細胞的上清液中之寡聚體抗原免疫之小鼠的集合中和血清與VP2及VP0之結合強過與VP1之結合。
圖10：EMCV基因組之EMCV IRES(SEQ ID NO：1) 區。
圖11：以3CD蛋白酶編碼序列改變EMCV起始密碼子之讀框；天然IRES序列(SEQ ID NO：2)與突變IRES序列(SEQ ID NO：3)。
圖12：質體pSN01-M1。
圖13：質體pSN01-M2。
圖14：質體pSN01-M3。
圖15：用於表現HEV71 VLP之不同重組桿狀病毒設計的表現比較。
圖16：質體pFastBacTM HT。
圖17：人腸病毒A型及人腸病毒C型之抗原性融合蛋白之原核細胞表現建構體。
圖18：源自經SN07滯留物免疫之小鼠的集合中和血清之抗體與HEV71 VLP之所有成份結合。
圖19：HEV71 VLP之特徵，下拉展開源自培養上清液之HEV71 VLP。
圖20：經親和性管柱(AFC)純化之HEV71 VLP之分析。
圖21：經AFC純化之HEV71 VLP之電子顯微圖。
圖22：人腸病毒C型(脊髓灰白質炎病毒-PV)VLP表現。
圖23：脊髓灰白質炎病毒-VLP VP3-VP1 ELISA。
圖24：具有HEV71-IRES及HEV71 3CD蛋白酶之HEV71 VLP表現卡匣。
圖25：具有PV-IRES及HEV71 3CD蛋白酶之HEV71 VLP表現卡匣。
<110> 瑪莉珍卡杜莎 穆哈莫德 賈米路德 沙利方賓丁哈米德
<120> 抗原類及針對人腸病毒之疫苗類
<130> SENTINEXT 1 PCT
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>586
<212> RNA
<213> 腦心肌炎病毒
<220>
<221> misc_feature
<223> 內部核糖體進入位點
<400> 1
<210> 2
<211> 38
<212> RNA
<213> 腦心肌炎病毒
<400> 2
<210> 3
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性突變
<400> 3

Claims (8)

  1. 一種疫苗，其包含人腸病毒(Enterovirus)A型病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒包含人腸病毒A型VP0多肽、VP1多肽、VP2多肽、VP3多肽及VP4多肽，其中該疫苗誘發針對人腸病毒A型之保護性及/或中和性免疫反應。
  2. 如申請專利範圍第1項之疫苗，其中該人腸病毒A型係人腸病毒71型(HEV71)或柯沙奇病毒A16型。
  3. 如申請專利範圍第1至2項中任一項之疫苗，其中該病毒樣顆粒係呈聚集體之型式。
  4. 一種表現卡匣，其包含與編碼人腸病毒A型P1多肽之核酸序列可操作性連接之啟動子，其中該編碼人腸病毒A型P1多肽之核酸序列與編碼腦心肌炎病毒(EMCV)內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列可操作性連接，其中該編碼IRES之核酸序列與編碼人腸病毒A型3CD蛋白酶之核酸序列可操作性連接，其中該人腸病毒A型3CD蛋白酶係於該IRES之轉譯控制下。
  5. 一種製備疫苗之方法，該方法包含培養包含如申請專利範圍第4項之表現卡匣的真核宿主細胞達一段足以產製該人腸病毒A型P1多肽和人腸病毒A型3CD蛋白酶且形成病毒樣顆粒及/或該病毒樣顆粒的聚集體之時間的步驟。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其另包含自該真核宿主細胞及/或培養上清液回收該病毒樣顆粒及/或該病毒樣顆粒的聚集體之步驟。
  7. 一種依據如申請專利範圍第5至6項中任一項之方法所產製之疫苗，該疫苗包含人腸病毒A型病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒包含人腸病毒A型VP0多肽、VP1多肽、VP2多肽、VP3多肽及VP4多肽。
  8. 一種如申請專利範圍第1至3及7項中任一項之疫苗於製備藥物之用途，該藥物係用於接種個體以對抗人腸病毒A型感染。
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