TWI700295B - 對會感染人類之腸病毒具有專一性之抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供可專一性地結合至腸病毒71(EV71)之至少一構象表位之抗體或其片段，其中該抗體個別地包含至少一可變異輕鏈與至少一可變異重鏈。亦提供一種製造可專一性地結合至腸病毒71(EV71)之至少一構象表位之抗體之方法。

Description

對會感染人類之腸病毒具有專一性之抗體 發明領域
本發明係關於對會感染人類之腸病毒具有專一性之抗體、其製造方法，及其用於治療人類腸病毒感染之用途，以及作為疫苗製程控制，以決定專一性與效力標準。
發明背景
小核糖核酸病毒(Picornaviridae)為一廣大病毒家族，會引起多種常見疾病。在小核糖核酸病毒家族中，腸病毒屬的病毒會引起數種顯著疾病，每年會影響全世界數百萬人。非專一性發熱性疾病是腸病毒感染最常見的代表之一。由腸病毒感染引發之其他著名的疾病包括脊髓灰質炎、胸膜痛、心包炎、心肌炎、心律失常、心肌梗塞與急性出血性結膜炎。
腸病毒屬的病毒通常在呼吸道分泌物中(如唾液，痰，或鼻粘液)和被感染者的糞便中發現。從歷史上看，脊髓灰質炎，由3種脊髓灰質炎病毒引起，是腸病毒引起的最顯著疾病。然而，現在有將近一百種非脊髓灰質炎腸病毒可導致人類疾病；其中包括柯薩奇病毒A、柯薩奇病毒B、 埃可病毒，和許多其他腸病毒。不包括鼻病毒，引起人類疾病之腸病毒最近被重新劃分為4個不同物種。脊髓灰質炎病毒和腸病毒71(EV71)，像許多其他腸病毒，是經由糞-口途徑傳播。感染可導致多種症狀，範圍從溫和的呼吸道疾病(一般感冒)、手足口病、急性出血性結膜炎、無菌性腦膜炎、心肌炎、嚴重新生兒敗血症樣疾病，至急性弛緩性麻痺。
腸病毒感染是兒童無菌性腦膜炎的最常見原因。在美國，腸病毒引起30,000至50,000例腦膜炎。此外，2007年的研究顯示，與腸病毒有關的急性呼吸道或消化道感染，可能是慢性疲勞症候群的因素之一。
人類腸病毒71和柯薩奇病毒A16(CA16)，為腸病毒血清型種A，其因為是手足口病(HFMD)的主要病因而引起注意。該病毒會隨著糞便被排出，且亦見於咽分泌物和水泡。傳播與兒童間的密切接觸有關，並經由環境污染傳播。本病特徵為急發熱，並且在手掌、腳掌、臀部和膝蓋出現疹子，以及在頰膜出現水疱，其通常會在7-10天內結束。只有一小部分HFMD患病兒童發展為嚴重的疾病。
有些感染EV71的兒童會發展為腦炎，此為腸病毒感染的一種罕見表現。腦炎可能導致永久性腦損傷，且可能致命。主要涉及神經系統和心血管系統表現為症候群的嚴重疾病，如腦膜炎、腦炎、腦幹腦炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫和心臟衰竭，一般僅發生於EV71感染。在亞太地區最具破壞性的神經系統症候群為腦幹腦炎，其死亡率 為40-80%。患有重症HFMD的兒童可能需要幾個月的時間才能恢復，而且在某些情況下，神經損害可能是永久性的。目前尚無HFMD之專一性抗病毒治療，且無疫苗可預防脊髓灰質炎以外的腸病毒感染。
EV71有時額外地與嚴重中樞神經系統疾病有關。其於1969年首度由在加州的神經系統疾病的案例分離出及被鑑定。至今，對於EV71感染之宿主反應的分子機制知之甚少，但已發現編碼趨化因子之mRNA、涉及蛋白質降解之蛋白質、補體蛋白，以及促凋亡蛋白之含量會增加。
雖然之後該病毒已於全球檢測到，但最近HFMD在亞洲的區域流行病中已升高警戒，EV71更具致病性的形式可能會出現於該地區。第一個造成大量死亡的HFMD爆發疫情是在1997年的馬來西亞沙撈越出現。與該爆發疫情有關的病毒為EV71。台灣於1998年的流行期間，報導129,106件HFMD病例，其中405例為嚴重疾病，且78例死亡。新加坡在2000-2001年期間，報導9000件案例，其中有7例死亡，從那以後，每兩到三年反覆流行一次。在2008年的前8個月，新加坡報導19,530件HFMD病例，以及1人死亡。之後，EV71疫情在新加坡、泰國、馬來西亞、台灣、日本、韓國、越南、中國、澳大利亞和菲律賓定期有報導。
中國在2007年報導83,344件案例，其中有17例死亡，並在2008年的安徽省阜陽市經歷了一次大爆發，，且蔓延至中國許多地方。這些大爆發經由媒體廣泛地報導，引發家長對於孩童健康的關注，且公共衛生部門試圖藉由 關閉學校和日托中心打斷傳播鏈而引起了社會混亂。從那時起，中國每年都會有大爆發的報告。
對抗由EV71殼體蛋白之胜肽而產生的單株抗體，通常沒有或具有低度中和活性。Zhang等人(2012)產生對抗胺基酸殘基94至97的單株抗體，其在西方墨漬法、免疫螢光法與ELISA中具反應性，但無法中和EV71病毒。Kiener等人(2012)描述對抗VP2胜肽(胺基酸142-146)之單株抗體，其專一性地與EV71反應，但無法中和病毒。市售之單株抗體MAB979(Merk Millipore)，其對VP2殼體胜肽(胺基酸141至150)具反應性(Liu等人，2011)，可在力價為<1：14中和原型EV71(BrCr)。胜肽SP55(胺基酸163-177)，其位於VP1殼體和胜肽SP70(胺基酸208-222)中，亦位於VP1中，可產生單株抗體，其無法中和EV71，或僅以低力價(titre)，如最佳1：4或1：16，進行中和(Li等，2009)。Lim等人(2012)描述2單株抗體，係針對位於SP70胜肽內的一胜肽產生(Li等人，2009)，其共享一共同的表位KQEKD。其中一種單株抗體可中和EV71，而另一種則不能。作者認為中和作用是取決於抗體的同種型，在這種情況下，具IgM同種型的抗體可以中和，而IgG抗體則無法。IgM具10個結合位置，而IgG只有2個，這表明該中和活性是取決於抗體的阻斷作用。
由於上述抗體缺乏效力，因此需要提供更有效的具EV71專一性之單株抗體，以及製造可對抗EV71與其他小核糖核酸病毒之中和抗體的方法。另外，EV71抗體為EV71疫苗發展中，製程控制與決定效力所必需的，且亦可用於 幫助定義EV71抗體效力標準。
發明概要
本發明係尋求可解決上述問題，並提供具腸病毒71(EV71)專一性之抗體。依據本發明之一較佳觀點，係提供至少一經分離之抗體或其片段，其可專一性地結合至EV71之至少一構象(非線性)表位。
在一較佳實施例中，其抗體或片段可包含至少一可變異輕鏈胺基酸序列，包含SEQ ID NO：1、其變異體、突變物或片段，以及至少一可變異重鏈胺基酸序列，包含SEQ ID NO：2、其變異體、突變物或其片段。
在一較佳實施例中，該抗體包含一可變異輕鏈，其包含具有與SEQ ID NO：1至少90%序列等同度之序列，以及一可變異重鏈，其包含具有與SEQ ID NO：2至少90%序列等同度之序列。
在一較佳實施例中，該可變異輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO：15、其變異體、突變物或片段。
依據另一較佳實施例，該抗體包含至少一可變異輕鏈與至少一可變異重鏈，其中該可變異輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO：3、其變異體、突變物或片段，以及該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NOs：4與5之至少一者、其變異體、突變物或片段。
在一較佳實施例中，該抗體包含一可變異輕鏈，其包含具有與SEQ ID NO：3至少90%序列等同度之序列，以 及一可變異重鏈，其包含具有與SEQ ID NOs：4或5至少90%序列等同度之序列。
在一較佳實施例中，該可變異輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NOs：16、17與18之至少一者、其變異體、突變物或片段，以及該重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NOs：19、20、21、22之至少一者，以及其變異體、突變物或片段。
依據又一較佳實施例，該抗體包含至少一可變異輕鏈與至少一可變異重鏈，其中該可變異輕鏈包含如SEQ ID NO：6之胺基酸序列、其變異體、突變物或片段，以及該重鏈包含如SEQ ID NO：7之胺基酸序列、其變異體、突變物或片段。
在一較佳實例中，該抗體包含一可變異輕鏈，其包含具有與SEQ ID NO：6至少90%序列等同度之序列，以及一可變異重鏈，其包含具有與SEQ ID NO：7至少90%序列等同度之序列。
在一較佳實例中，本發明之抗體或片段為一中和抗體或其片段。
在一較佳實施例中，本發明之抗體或其片段為單株小鼠、人類、人源化或嵌合性抗體。
依據本發明之另一較佳觀點，係提供一種製造具小核糖核酸病毒專一性之抗體之方法，該方法包含：以至少一未成熟小核糖核酸病毒顆粒，使至少一非人類哺乳動物產生免疫反應，以形成至少一具小核糖核酸病毒專一性之B細胞； 篩選出至少一具小核糖核酸病毒專一性之B細胞；融合該篩選出之B細胞與至少一不朽化(immortalized)細胞，以產生至少一融合瘤，其中該融合瘤可製造具小核糖核酸病毒專一性之至少一抗體或其片段；以及任擇地自該融合瘤中分離出該抗體，並定序該可變異重鏈與輕鏈。
依據本發明之另一較佳觀點，係提供一種經分離之核酸分子，編碼(a)如前述定義之抗體之至少一可變異輕鏈或一片段，其中該可變異輕鏈包含至少一胺基酸序列，其選自於由SEQ ID NOs：3與16-18，其變異體、突變物或片段組成之族群；及/或(b)如前述定義之抗體之至少一可變異重鏈或一片段，其中該可變異重鏈包含至少一胺基酸序列，其選自於由SEQ ID NOs：4、5與19-22，其變異體、突變物或片段組成之族群。
在一較佳實施例中，該(a)之至少一核酸序列具有與SEQ ID NOs：10及/或24及/或25及/或26至少90%之序列等同度；及/或該(b)之至少一核酸序列具有與SEQ ID NOs：11及/或12及/或27，及/或28，及/或29，及/或30至少90%之序列等同度。
更佳地，上述經分離核酸分子包含：(a)至少一核酸序列，選自於由SEQ ID NOs：10與24-26、 其突變物、變異體或片段組成之族群；及/或(b)至少一核酸序列，選自於由SEQ ID NOs：11、12與27-30、其突變物、變異體或片段組成之族群。
依據本發明之另一實施例，係提供一種經分離之核酸分子，編碼(a)該抗體之至少一可變異輕鏈或其片段，其中該可變異輕鏈包含至少一胺基酸序列，其選自於由SEQ ID NOs：1與15，其變異體、突變物或片段組成之族群；及/或(b)該抗體之至少一可變異重鏈或其片段，其中該可變異重鏈包含至少一胺基酸序列，如SEQ ID NO：2，其變異體、突變物或片段。
在該經分離之核酸分子之一實施例中，該(a)之至少一核酸序列具有與SEQ ID NOs：8及/或23至少90%之序列等同度；及/或該(b)之至少一核酸序列具有與SEQ ID NO：9至少90%之序列等同度。
更佳地，該經分離之核酸分子包含：(a)至少一核酸序列，如SEQ ID NOs：8及/或23，其變異體、突變物或片段；及/或(b)至少一核酸序列，如SEQ ID NO：9，其變異體、突變物或片段。
依據本發明之另一實施例，係提供一種經分離之核酸分子，編碼 (a)該抗體之至少一可變異輕鏈或其片段，其中該可變異輕鏈包含至少一胺基酸序列，如SEQ ID NO：6，其變異體、突變物或片段；及/或(b)該抗體之至少一可變異重鏈或其片段，其中該可變異重鏈包含至少一胺基酸序列，如SEQ ID NO：7，其變異體、突變物或片段。
在該經分離之核酸分子之一實施例中，該(a)之至少一核酸序列具有與SEQ ID NO：13至少90%之序列等同度；及/或該(b)之至少一核酸序列具有與SEQ ID NO：14至少90%之序列等同度。
更佳地，該經分離之核酸分子包含：(a)至少一核酸序列，如SEQ ID NO：13，其變異體、突變物或片段；及/或(b)至少一核酸序列，如SEQ ID NO：14，其變異體、突變物或片段。
依據本發明之另一較佳觀點，係提供EV71之至少一構象表位，其中該構象表位可經本發明任一觀點中之至少一抗體辨識。
依據其他較佳觀點，本發明提供一種用於鑑定一潛在腸病毒疫苗候選物上之至少一構象中和表位之方法，以及用於純化一含有至少一構象表位之潛在腸病毒疫苗候選物之方法。
此外，本發明之一較佳實施例提供一種定義 EV71與EV71疫苗之中和抗體效力之方法。本發明之抗體亦可用於EV71疫苗製程控制。
依據其他較佳觀點，本發明提供一種治療EV71及/或至少一EV71-相關疾病之方法；使用本發明之抗體或其片段作為藥物之用途；使用本發明之抗體或其片段用於製備藥物之用途；包含本發明之抗體或其片段之套組，核酸及其用途；包含本發明之至少一經分離核酸之表現載體；一包含本發明之表現載體，以及一可由本發明之任一觀點之至少一抗體辨識之構象表位之宿主細胞。
如下列描述清楚可知，本發明之較佳實施例可允許該經分離抗體之最佳化用途，優勢為其對於EV71之至少一表位具準確性與專一性。此領域技術人員可由下列描述清楚得知此與其他相關優點。
圖1為24-孔盤之影像，顯示抗體E18(A)、E19(B)與E20(C)之噬斑減少中和試驗(PRNT)之結果。
圖2A顯示EV71被E18中和之圖像。
圖2B顯示EV71被E19中和之圖像。
圖3A為西方墨漬法影像，顯示E18與E19並未結合以使EV71病毒蛋白變性。R525為對抗VP1之兔子多株抗體；M=模擬感染細胞裂解物；V=經EV71感染細胞裂解物。
圖3B為結合圖，顯示E18與E19結合至重組與熱失活之EV71殼體蛋白上。
圖4A與B顯示EV71與熱失活(HI)-EV71與(A)E18 及(B)E19之結合。
圖5A為點狀圖，顯示經類病毒顆粒(VLP)免疫化之小鼠，其血清中之抗體結合至EV71。DPBS為Dulbecco’s磷酸緩衝生理食鹽水。
圖5B為條狀圖，顯示E18結合至EV71之抑制，在經VLP免疫化之小鼠的血清存在下。
圖6A為考馬斯(Coomassie)-染色(“C”)膠之圖像，顯示抗體E18可有效地用於鑑定潛在EV71疫苗候選物。圖6A亦以西方墨漬法呈現，EV71病毒類似顆粒可使用抗體E18親和管柱純化。此外，以E18與E19製備之親和管柱亦可純化感染性病毒顆粒(圖6A)。
圖6B為抗體E18親和管柱捕捉到的EV71病毒類似顆粒之圖像。
圖7包括二圖，顯示EV71經重組性嵌合E18、E19與E20抗體中和。
圖8顯示親代小鼠E18與使用Vero細胞之細胞培養物中之嵌合性E18抗體之EV71中和活性。Y-軸=噬斑減少百分比；X-軸=抗體濃度之log10標度。植物與非-植物-製造之嵌合性E18抗體具類似活性。
圖9包括三圖，顯示EV71經重組性人源化E19-衍生抗體中和。
較佳實施例之詳細說明
為了方便起見，本案說明書中提及之參考文獻係 以列表形式列出，並附於範例之後。這些參考文獻在此完整併入本案以作為參考資料。
定義
為了方便說明，在本案說明書、範例與後附之申請專利範圍中使用之某些術語，係收錄於此。
使用於此，術語"抗體"係指任一可結合至一專一性表位之免疫球蛋白或完整分子及其片段。此類抗體包括但不侷限於，完整抗體之多株、單株、嵌合性、人源化、單鏈、可變異單鏈片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab)’片段及/或F(v)部分。術語“單株抗體”可稱之為“Mab”。該抗體包括抗體E18、E19與E20，分別由融合瘤細胞株EV18/4、EV19/5，以及EV20/5製造。抗體E18、E19與E20可為單株抗體、多株抗體、單鏈抗體，及維持原抗體之抗原結合功能之片段。抗體E18、E19與E20可專一性地結合至EV71，包括但不侷限於構象表位，其包含EV71之至少一殼體蛋白，並包括單株抗體、多株抗體、單鏈抗體，及維持原抗體之抗原結合功能之片段。
術語“抗體片段”使用於此係指該抗體之完整序列的不完整或分離部分，其維持原抗體之抗原結合功能。抗體片段之範例包括scFv、Fab、Fab'、F(ab')2與Fv片段；雙體(diabodies)；線性抗體；單鏈抗體分子；以及形成自抗體片段之多重-專一性抗體。E18、E19與E20抗體之片段可包含於本發明中，只要其維持完整長度抗體希望之親和性。尤其是，其可短少至少一個胺基酸。例如，一單鏈抗體可 具有包含SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2且在該二者間具有一連結基之構型。另一組合可為SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：2於單鏈構形中。
術語"抗原"使用於此係指可促進抗體產生，並可導致免疫反應之物質。於本發明中，其可與術語“免疫原”交換使用。在嚴格意義上，免疫原為可引發免疫系統產生反應之物質，而抗原係定義為結合至特定抗體之物質。一抗原或其片段可為一與一特定抗體接觸之分子(即一表位)。當一蛋白或一蛋白之一片段係用於使一宿主動物產生免疫反應時，該蛋白質之數個區域可誘發抗體產生(即引發免疫反應)，其可專一性地結合至抗原(提供在該蛋白質上之區域或三維結構)。抗原之非限制性範例為EV71之VP0蛋白，以及未成熟小核糖核酸病毒顆粒。該抗原可包括但不侷限於殼體蛋白，及/或EV71之非結構性蛋白。尤其是，術語“表位”係指形成一抗體結合位置之約5個至13個胺基酸之連續序列。結合至抗體或結合蛋白之表位可為一變性蛋白，其實質上缺乏四級結構。該表位可為一構象表位，其包含自非連續性序列之非連續性因子(element)。該表位亦可為一四級表位，其包含來自一種以上之蛋白或多胜肽，其組成為顆粒如VLP、病毒顆粒或其他種類之組裝物，之非連續因子。
一“構象表位’，於此係定義為次單元之序列(通常為胺基酸)，其包含一與一抗體之可變異輕鏈與重鏈直接接觸之抗原。當一抗體與一未經切割之抗原進行交互作用時， 若該蛋白為展開的，則接觸之表面胺基酸並非互相連續的。此在立體構形上聚在一起，並與該抗體之互補位交互作用之不連續胺基酸稱之為構象表位。相對的，若該抗原經切割，會形成稱之為胜肽之小片段，其與主要組織相容性複合體分子結合，之後經由連續排成一直線之胺基酸與T細胞受體結合。這些已知為線性表位。
術語"包含"於此係定義為各元件、成分或步驟，可結合使用以實施本發明。因此，術語"包含"係涵蓋更具限制性之術語"基本上由...組成"以及"由...組成"。
術語"嵌合性抗體"使用於此，係指至少一抗體分子，其中該恆定區域中之胺基酸序列已被改變，使得該抗體更接近人類抗體，並仍維持其原始結合能力。
術語"人源化抗體"使用於此係指至少一抗體分子，其中該位於可變異與恆定區域內之胺基酸序列已被改變，使得該抗體更接近人類抗體，並仍維持其原始結合能力。使用於此，術語"融合瘤"係指該細胞已被改造以大量製造希望之抗體。例如，欲製造至少一融合瘤，係將取自經相關抗原刺激之動物脾臟之B細胞，與至少一不朽化細胞融合而成。此融合係以使細胞膜更具通透性而進行。該經融合之雜合細胞(稱之為融合瘤)，會快速且無限制地倍增，並可製造至少一抗體。融合瘤之範例為細胞株EV18/4、EV19/5與EV20/5。
“不朽化細胞”使用於此係已知為轉型細胞-即生長特性已被改變之細胞。此並不一定指"癌細胞"或"腫瘤 細胞"，即若引入至實驗動物中，不一定會形成腫瘤，儘管在某些情況下會。不朽化細胞株包括但不侷限於NS1、Jurkat、HeLa、HepG2、SP2/0、Hep-3b及類似細胞株。
術語一抗體或相關結合蛋白之"免疫結合特性"，在所有語法形式中，係指該抗體或其抗原之結合蛋白之專一性、親和性與交叉反應性。
術語"經分離"於此係定義為一種生物成分(如核酸、胜肽或蛋白)，已實質上被分離自、排除，或純化遠離細胞或生物體中之其他生物成分，其中該成份係天然產生，即其它染色體和染色體外之DNA與RNA，與蛋白。已被分離之核酸、胜肽和蛋白因此包括經標準純化方法純化之核酸和蛋白。此術語也包括由在宿主細胞中重組表現所製備之核酸、胜肽和蛋白，以及化學合成之核酸。
術語“中和抗體”於此係定義為一能夠中和病原啟動及/或永久感染宿主之能力之抗體。本發明提供至少一中和人類單株抗體，其中該抗體可辨識來自EV71的一抗原。
術語“框架”於此係定義為提供結構支持功能，但不直接結合至表位的抗體區域。
術語“突變物”於此係定義為一具有至少一個核苷酸序列與參考序列不同者，其係經由取代、刪去或加入至少一個核酸而變化，但編碼相同胺基酸序列，其保留辨識與結合至EV71上同樣的構象表位之能力，如同未突變序列所編碼者。術語“突變物”也適用於與至少一參考序 列不同之胺基酸序列，其係經由取代、刪去或加入至少一個胺基酸而變化，但保留辨識與結合至EV71上同樣的構象表位之能力，如同未突變序列。尤其是，該等突變物可以是天然存在的，或可以經由重組或合成產生。更特別的是，該突變物可具有與參考序列至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度。例如，SEQ ID NO：15所示之E18可變異輕鏈胺基酸序列是短於SEQ ID NO：1所示之序列，並可視為SEQ ID NO：1之突變物，因為其維持辨識與結合至EV71上同樣的構象表位之能力。類似地，SEQ ID NO：16所示之人源化E19可變異輕鏈胺基酸序列，係由取代SEQ ID NO：3之E19可變異輕鏈胺基酸序列中的胺基酸，於較佳之人類框架中，而製備，並可視為SEQ ID NO：3之突變物。
術語“變異體”使用於此係指一種胺基酸序列，其一或多個胺基酸經改變，但保留辨識與結合至EV71上同樣的構象表位之能力，如同未變異的參考序列。該變異體可具有“保守性”改變，其中經取代之胺基酸具有相似的結構或化學性質(例如，白胺酸置換異白胺酸)。更罕見的，一個變異體可能有“非保守”改變(如將甘胺酸更換為色胺酸)。類似次要變化亦可包括胺基酸刪去或***，或兩者皆有。決定哪些胺基酸殘基可以被取代、***或刪去，而不消除其生物性或免疫性活性之指引，可使用本領域中已知之電腦程式，如DNASTAR®軟體(DNASTAR,Inc.麥迪遜，威斯康辛，美國)。例如，SEQ ID NO：15之E18可變異輕 鏈胺基酸序列是短於SEQ ID NO：1之序列，可視為SEQ ID NO：1之變異體，因為其維持辨識與結合至EV71上同樣的構象表位之能力。類似地，SEQ ID NO：16所示之人源化E19可變異輕鏈胺基酸序列，係由將SEQ ID NO：3之E19可變異輕鏈胺基酸序列中的胺基酸取代為較佳之人類框架，可視為SEQ ID NO：3之變異體。
術語“樣本”使用於此，係指其最廣泛的含義。一生物樣本可為含有編碼至少一EV71衍生胜肽或其片段之核酸，或EV71本身可包含體液、從細胞之萃取物、從細胞分離的染色體、胞器或膜；基因組DNA、RNA或cDNA(在溶液中或結合於固體支持物上)、組織、組織印痕，以及類似物。
使用於此，術語"專一性結合"或"專一性地結合"係指一或多個蛋白或胜肽與一促效劑、一抗體，或者一拮抗劑間的交互作用。尤其是，該結合係介於一抗原與一抗體之間。該相互作用取決於一或多個蛋白的特定結構之存在，經由結合分子(例如，該抗原或表位)辨識出。如前所述，該抗原或表位可包含一種以上之單胜肽序列，其來自相同蛋白或不同蛋白，在同一空間形成一個構象抗原或表位。例如，若一抗體具表位“A”專一性，則含有該表位A之多肽的存在，或游離未經標記A的存在，在含有游離經標記A與該抗體之反應中，結合至該抗體之經標記A的量會降低。
術語“未成熟小核糖核酸病毒顆粒”係指一個空的病毒顆粒，其缺乏基因組材料並包括殼體蛋白VP0、 VP1與VP3。殼體蛋白V0為殼體蛋白V2與V4的前驅物。
術語“治療”，如在本發明的上下文中使用時，是指預防性、改善性，治療性或治癒性治療。
術語“個體”於此定義為脊椎動物，特別是哺乳動物，更特別是人。就研究目的而言，個體可特別為至少一動物模型，例如，小鼠、大鼠及類似動物。特別是，用於治療EV-71感染及/或EV71相關疾病，該個體可為經EV71感染之人類。
本領域技術人員應理解到，本發明可在沒有過度實驗情況下，根據本文所給之方法來實施。該方法、技術和化學品，如參考文獻或標準生物技術和分子生物學教科書中所描述之流程。
依據一較佳觀點，本發明提供經分離之單株抗體及相關之結合蛋白，其專一性地結合至EV71。該等依據本發明之任一觀點之抗體，可為單株抗體(Mab)，其可為衍生自單一抗體-製造細胞之抗體之實質上均一族群。因此，在該族群中之所有抗體可相等，或可對一特定表位具有相同的專一性。Mab反應之專一性，提供EV71感染及/或至少一EV71-相關疾病有效治療之一基礎。單株抗體與其衍生之結合蛋白亦具有作為治療試劑之產業利用性。
該等依據本發明之任一觀點之抗體提供至少一抗-EV71抗體，其可中和EV71感染，並抑制細胞對細胞傳播。這些依據本發明之任一觀點之抗體可使用作為預防性及/或治療性試劑，用於治療EV71與EV71-相關疾病。
依據本發明之一較佳實施例，係提供一種經分離之抗體或其片段，其可專一性地結合至腸病毒71(EV71)之至少一構象表位。
尤其是，該經分離之抗體可選自於由下列所組成之群組：(a)一由融合瘤細胞株EV18/4製造之抗體；(b)一具有該由融合瘤細胞株EV18/4製造之抗體之結合特性之抗體；(c)一結合至一可與該由融合瘤細胞株EV18/4製造之抗體結合之抗原之抗體；(d)一包含至少一可變異輕鏈與至少一可變異重鏈之抗體，其中該可變異輕鏈包含SEQ ID NO：1、其變異體、突變物或片段，以及可變異重鏈包含SEQ ID NO：2、其變異體、突變物或片段。
該經分離之單株抗體或其片段可為中和單株抗體或其片段，其可專一性地結合至EV71之至少一表位。該表位可為線性或可為構象表位。該構象表位可在一完整的病毒殼體上。更特別的是，該表位可包含殼體蛋白VP1、VP2、VP3、VP4及/或VP0前驅物之一或多者。腸病毒屬之所有成員，包括EV71、脊髓灰質炎病毒與柯薩奇病毒A16，皆具有單股正向RNA基因體，其具有單一開放式框架，編碼一多蛋白P1，其係由殼體蛋白VP4、VP2、VP3與VP1與數種包括病毒蛋白酶3C與3CD之非結構性蛋白所組成，該等病毒蛋白酶3C與3CD負責切割該多蛋白P1成個別的殼 體蛋白VP1、VP3與VP0。VP0為VP2與VP4之前驅物。該等殼體蛋白可組合成為病毒類似顆粒(VLPs)。
本申請案之發明人提出可中和EV71之抗體，其可使用一作為抗原之未成熟EV71病毒顆粒而產生。尤其是，該未成熟EV71病毒顆粒可為一空病毒顆粒，其並未含有基因體材料。更特別的是，該未成熟EV71病毒顆粒可包含該殼體蛋白VP0。
如同所有的腸病毒，四種不同之殼體多胜肽已被辨識出，並命名為VP1、VP2、VP3與VP4，其結合以形成二十面體病毒殼體。通常，接種脊髓灰質炎病毒之個別的多胜肽，已顯示出該經分離之多胜肽或胜肽無法提高人類或動物中之有效中和抗體。本發明之經分離之單株抗體或其片段，不僅可中和，亦可誘發早期基因體釋放，其為一種抗體中和病毒的新機制。此外，本申請案提出的方法可用於製備具有對抗相關病毒，包括顯著人類病原體之類似性質之抗體。
依據本發明之一較佳實施例之抗體可由融合瘤細胞株EV18/4，或標準重組方法製造，並可包含至少一可變異輕鏈(VL)，其包含如表1所示之SEQ ID NO：1，或其變異體、突變物或片段，及/或至少一可變異重鏈(VH)，其包含表1所示之SEQ ID NO：2，或其變異體、突變物或片段。尤其是，該經分離之抗體可包含至少一可變異輕鏈，其包含一序列，具有與SEQ ID NO：1至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度，及/或至少一可變異重鏈，其包含至少一序列，其具有與SEQ ID NO：2至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度。
Figure 103143473-A0202-12-0021-1
依據本發明之另一較佳實施例，係提供一種經分離之抗體或其片段，其可專一性地結合至腸病毒71(EV71)之至少一表位，其中該抗體係選自於由下列所組成之群組：(a)一由融合瘤細胞株EV19/5製造之抗體；(b)一具有該由融合瘤細胞株EV19/5製造之抗體之結合特性之抗體；(c)一結合至一可與該由融合瘤細胞株EV19/5製造之 抗體結合之抗原之抗體；(d)一包含至少一可變異輕鏈與至少一可變異重鏈之抗體，其中該可變異輕鏈包含表1所列之SEQ ID NO：3、其變異體、突變物或片段，以及該可變異重鏈包含表1所列之SEQ ID NOs：4與5之至少一者、其變異體、突變物或片段。
尤其是，該經分離之抗體可包含一可變異輕鏈，其包含一具有與SEQ ID NO：3至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度的序列，及/或至少一可變異重鏈，其包含至少一具有與SEQ ID NO：4或5至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度的序列。
依據本發明之另一較佳實施例，係提供一種經分離之抗體或其片段，其可專一性地結合至腸病毒71(EV71)之至少一構象表位，其中該抗體係選自於由下列所組成之群組：(a)一由融合瘤細胞株EV20/5製造之抗體；(b)一具有該由融合瘤細胞株EV20/5製造之抗體之結合特性之抗體；(c)一結合至一可與該由融合瘤細胞株EV20/5製造之抗體結合之抗原之抗體；(d)一包含至少一可變異輕鏈與至少一可變異重鏈之抗體，其中該可變異輕鏈包含SEQ ID NO：6、其變異體、突變物或片段，以及該可變異重鏈包含SEQ ID NO：7、其變異體、突變物或片段。
尤其是，該經分離之抗體可包含一可變異輕鏈，其包含一具有與SEQ ID NO：6至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度的序列，及/或至少一可變異重鏈，其包含至少一具有與SEQ ID NO：7至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度的序列。
抗體E18、E19與E20可阻斷病毒在宿主中傳播之機制。其可有效地中和無細胞之病毒顆粒，並抑制病毒之細胞對細胞直接傳播。
該等依據本發明之任一實施例之抗體結合至EV71之至少一構象表位。此係有利的因表位通常自然存在有三維構形，因此該等抗體可更足夠且更有效地偵測EV71之存在，及/或隨後中和EV71之作用。該構象表位可包含至少一殼體蛋白及/或至少一非結構性蛋白。該殼體蛋白可為一完整病毒殼體蛋白。該殼體蛋白可包含一或多個蛋白，其係選自於由VP1、VP2、VP3、VP4與VP0前驅物組成之族群。該等依據本發明之任一觀點之抗體可辨識EV71病毒之完整光譜。這些抗體可具高度專一性與敏感性。該等依據本發明之抗體提供數種優點，包括可使用作為HFMD之藥物或疫苗。
尤其是，依據本發明之任一觀點中之抗體可大量在融合瘤上清液、腹水或重組細菌或植物及/或動物細胞中製備。亦可使用依據本發明之任一觀點之任一融合瘤細胞株，由恆定與可再生來源獲得單株抗體。這些抗體亦可經由親和層析法輕易地進行純化，使用本領域中已知的任何 方法。由依據本發明之任一觀點之抗體辨識之經定義表位，亦使抗體的病毒中和能力之機制研究可容易進行。
在一實施例中，依據本發明之任一觀點之中和抗體可於體內有效保護對抗EV71感染。這些抗體之效力與專一性如範例中所示。
尤其是，依據本發明之任一觀點之抗體可包含單株抗體E18、E19或E20之免疫結合特性。E18之免疫結合特性係由融合瘤EV18/4產生。E19之免疫結合特性係由融合瘤EV 19/5產生。E20之免疫結合特性係由融合瘤EV20/5產生。融合瘤提供本發明之抗體與結合蛋白之連續來源。該等序列提供一重組性再創造每一抗體之方法。
依據本發明之另一觀點，係提供一種製造具小核糖核酸病毒專一性之抗體之方法，該方法包含以至少一未成熟小核糖核酸病毒顆粒使至少一非人類哺乳動物產生免疫反應，以形成至少一具小核糖核酸病毒專一性之B細胞，並篩選出至少一具小核糖核酸病毒專一性之B細胞。尤其是，該非人類動物可為小鼠。更特別的是，該非人類哺乳動物可為Balb/c小鼠。
尤其是，一未成熟小核糖核酸病毒顆粒可為空的小核糖核酸病毒顆粒，其並未含有基因體材料。該未成熟小核糖核酸病毒顆粒可含有殼體蛋白VP1、VP3、VP0，及/或VP2與VP4。更特別的是，該未成熟小核糖核酸病毒顆粒可含有殼體蛋白VP2及/或VP4或VP0，其為殼體蛋白V2與V4之前驅物。該空的顆粒假設為成熟感染性病毒顆粒之前 驅物。
抗體可藉由融合來自非人類哺乳動物脾臟之B細胞及一不朽化細胞株以產生一融合瘤細胞株而製備。該融合瘤細胞株可分泌單一種類之單株抗體，其具有小核糖核酸病毒之準確專一性，且通常具有高親和性。尤其是，該不朽化細胞株可為"癌"或"腫瘤"細胞。更特別的是，該不朽化細胞株可包括但不侷限於NS1、Jurkat、HeLa、HepG2、SP2/0、Hep-3b及類似細胞。該抗體可分離自該融合瘤，且該可變異重鏈與輕鏈可定序。
小核糖核酸病毒家族包含下列各種：***病毒、水棲哺乳動物病毒(Aquamavirus)、禽肝炎病毒(Avihepatovirus)、心病毒(Cardiovirus)、寇沙病毒(Cosavirus)、地西皮病毒(Dicipivirus)、腸病毒、馬鼻炎病毒(Erbovirus)、肝病毒(Hepatovirus)、嵴病毒(Kobuvirus)、美格瑞病毒(Megrivirus)、腹腸孤病毒(Parechovirus)、薩力病毒(Salivirus)、薩佩洛病毒(Sapelovirus)、塞尼卡病毒(Senecavirus)、鐵士古病毒(Teschovirus)，以及震顫病毒(Tremovirus)。尤其是，該小核糖核酸病毒可來自腸病毒屬。更特別的是，該小核糖核酸病毒可為腸病毒71(EV71)。
腸病毒代表一個龐大與分歧的小型RNA病毒屬，其特徵在於單一正向股基因組RNA。所有腸病毒包含一個約7500個鹼基之基因組，已知具有高突變率因為低保真度複製和頻繁重組。感染宿主細胞後，該基因組會以不需加蓋(cap)方式轉譯為單一多蛋白，其隨後由病毒編碼之蛋白 酶處理成結構性殼體蛋白與非結構蛋白，其主要涉及病毒之複製。
血清學研究已辨識出約一百種人類腸病毒血清型，以抗體中和測試與基因組資訊為基礎。額外的抗原變異體已於數種血清型中定義出，以各變異株之間的降低或不可逆交叉中和為基礎。以其在人類和動物中之發病機制的基礎上，腸病毒最初分為四組，脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒A(CA)、柯薩奇病毒B(CB)，以及迴聲病毒。然而，很快瞭解到這些導致人類疾病的病毒在生物特性上有顯著重疊，且它們現在已被重新分類為4個基因族群，不包括鼻病毒。表2列出了由腸病毒屬涵蓋的種類和血清型。
Figure 103143473-A0202-12-0026-2
Figure 103143473-A0202-12-0027-3
本發明之抗體可由培養連續細胞株生產抗體分子之任何技術來生產。此種方法包括，但不限於，最初由 Kohler和Milstein於1975年開發之融合瘤技術，以及三體瘤技術、人類B細胞融合瘤技術，以及EBV-融合瘤技術，以生產人類單株抗體(Cole等人，1985)。可以使用人類抗體，並且可以使用人類融合瘤獲得(Cote等人，1983)。此外，一旦抗體序列已知，便可使用此領域已知之標準重組技術生產。
依據本發明之一觀點，係提供一種經分離之核酸分子，其編碼依據本發明之任一觀點之抗體之至少一可變異輕鏈、其變異體、突變物或片段，及依據本發明之任一觀點之抗體之至少一可變異重鏈、其變異體、突變物或片段。尤其是，該經分離之核酸分子可編碼SEQ ID NOs：1、3與6之至少一者、其變異體、突變物或片段，以及SEQ ID NOs：2、4、5與7之至少一者、其變異體、突變物或片段。尤其是，該經分離之核酸分子可包含SEQ ID NOs：8、10與13之至少一者、其變異體、突變物或片段，以及SEQ ID NOs：9、11、12與14之至少一者、其變異體、突變物或片段，如表3所列。
Figure 103143473-A0202-12-0028-4
Figure 103143473-A0202-12-0029-5
Figure 103143473-A0202-12-0030-6
尤其是，該經分離之核酸分子可包含至少一核酸序列，其具有與SEQ ID NOs：8、10或13至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度，及/或至少一核酸序列，其具有與表3中所列之SEQ ID NOs：9、11、12或14至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度。
依據本發明之經分離之核酸分子可選殖至一表現載體上，其之後可轉型至宿主細胞中以製造依據本發明之任一觀點之抗體。尤其是，該宿主細胞可為293細胞、CHO細胞或重組性植物細胞。
可使用發展用於製造"嵌合性抗體"(Morrison等人，1984，在此併入本案以作為參考資料)之技術，藉由切割具適當抗原專一性之小鼠抗體分子之基因，連同具適當生物活性之人類抗體分子之基因。例如，來自小鼠抗體分子如E18、E19與E20之基因連同具適當生物活性之人類抗體分子之基因可被切割。一嵌合性抗體為一分子，其中不同部分係衍生自不同動物物種，如具衍生自鼠類抗體之可變異區域與人類免疫球蛋白之恆定區域。嵌合性抗體亦可 為含有人類Fc部分與鼠類(或其他非人類)Fv部分者。
目前已發展出製造人源化抗體之技術(如US 5,585,089及/或US 5,225,539，在此併入本案以作為參考資料)。一免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變異區域係由一"框架"區域組成，其介入三個高度可變異區域，稱之為互補決定區域(CDRs)。簡言之，人源化抗體為來自非-人類物種之抗體分子，其具一或多個來自非人類物種之CDRs，以及來自人類免疫球蛋白分子之框架區域。嵌合性與人源化抗體二者皆可為單株。此人類或人源化嵌合性抗體較佳可用於人類疾病或病症之體內診斷或治療。
產生重組性嵌合性E18(VL+VH；SEQ ID NOs：1與2)、重組性嵌合性E19(VL+VH & VL+VH2；SEQ ID NOs：3、4與5)，與重組性嵌合性E20(VL+VH；SEQ ID NOs：6與7)抗體。就E18而言，第二重組性嵌合性抗體可藉由改變表4所列之E18 VL(SEQ ID NO：1)與新的VL序列(SEQ ID NO：15,VL2)而達成。此外，產生七種重組性人源化E19 VL與VH序列，衍生自E19 VL與VH2(SEQ ID NOs：3與5)。該七種新穎之重組性人源化E19 VL與VH胺基酸序列係顯示於表4中，為hVL或hVH鏈(分別為SEQ ID NOs：16、17、18、19、20、21與22；hVL1、hVL2、hVL3、hVH1、hVH2、hVH3、hVH4)。
Figure 103143473-A0202-12-0032-7
依據本發明之另一較佳觀點，係提供一種經分離之核酸分子，其編碼依據本發明之任一觀點之抗體之至少一可變異輕鏈、其變異體、突變物或片段，以及依據本發明之任一觀點之抗體之至少一可變異重鏈、其變異體、突變物或片段。尤其是，該經分離之核酸分子可編碼SEQ ID NOs：15、16、17與18之至少一者、其變異體、突變物或片段，以及SEQ ID NOs：19、20、21與22之至少一者、其變異體、突變物或片段。編碼嵌合性與人源化重組性E18與E19抗體之各可變異輕鏈或可變異重鏈之核酸序列係列於表5。
Figure 103143473-A0202-12-0033-8
Figure 103143473-A0202-12-0034-9
Figure 103143473-A0202-12-0035-10
尤其是，該經分離之核酸分子可包含至少一序列，其具有與SEQ ID NOs：23、24、25或26至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度，以及至少一序列，其具有與表5所列之SEQ ID NOs：27、28、29或30至少80%、至少90%或至少95%之序列等同度。
依據本發明之一較佳觀點之經分離核酸分子，可選殖至一表現載體上，其之後可轉型至宿主細胞中以製造依據本發明之任一觀點之抗體。尤其是，該宿主細胞可為293細胞、CHO細胞或重組性植物細胞。該重組性嵌合性與人源化E18、E19與E20抗體提供本發明之抗體與結合蛋白之額外極穩定之連續來源。
含有該抗體分子之個體遺傳型之抗體片段可由已知技術產生。例如，其可由胃蛋白酶切割該抗體分子而製備；該等Fab片段可由還原F(ab)2片段之雙硫鍵而產生，而該等Fab片段可以木瓜酶與還原劑處理該抗體分子而製備。此抗體片段可由本發明之任一抗體而產生。
在製造抗體時，篩選希望之抗體可由此領域已知之技術達成。例如，這些技術可包括但不侷限於放射免疫試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、“夾心”免疫試驗、免疫放射試驗、凝膠擴散沉澱素反應、免疫擴散試驗、原位免疫試驗(使用膠體金、酵素、放射性同位素標記或類似物)、 西方墨漬法、沉澱反應、凝集試驗(凝膠凝集試驗、血凝試驗或類似試驗)、免疫螢光試驗、免疫電泳試驗，以及類似試驗。例如，抗體結合可藉由偵測一級抗體上之標記來檢測。在另一範例中，一級抗體可藉由與二級抗體或其它試劑結合來檢測。該二級抗體可經標記。
依據本發明之其他較佳觀點，係提供一種用於鑑定一潛在腸病毒疫苗候選物上之至少一構象中和表位之方法，以及純化含有至少一構象表位之一潛在腸病毒疫苗候選物之方法。此外，本發明提供一種定義EV71中和抗體效價之方法。
依據本發明之一觀點，係提供一種依據本發明之任一觀點之經分離抗體或其片段之用途，使用作為藥物。尤其是，該用途涉及治療EV71-感染及/或至少一EV71-相關疾病。
依據另一觀點，本發明提供一種醫藥組成物，其包含依據本發明之任一觀點之經分離抗體或其片段。
又依據本發明之另一觀點，係提供至少一種治療EV71-感染及/或至少一EV71-相關疾病之方法，該方法包含投予依據本發明之任一觀點之經分離抗體至一個體。在一較佳實施例中，本發明之抗體的組合或混合物可投至個體中。例如，該組合物或混合物可包含前述之人源化或嵌合性E19，以及至少一額外選自於如前述之人源化或嵌合性E18或人源化或嵌合性E20之抗體。較佳地，該組合物或混合物包含前述之人源化E19與人源化或嵌合性E18。尤其是， 該EV71-相關疾病可選自於由無菌性腦膜炎、腦炎、顱神經麻痺、格林巴利症候群(Guillain-Barre syndrom)、腦幹腦炎、脊髓灰質炎樣症候群、皰疹性咽峽炎，以及手足口病組成之族群。
又依據本發明之另一觀點，係提供依據本發明之任一觀點之至少一抗體之用途，其用於製造治療EV71-感染及/或至少一EV71-相關疾病之藥物。在一較佳實施例中，該藥物可包含前述之人源化或嵌合性E19，以及至少一額外選自於如前述之人源化或嵌合性E18或人源化或嵌合性E20之抗體。較佳地，該藥物包含前述之人源化E19與人源化或嵌合性E18。尤其是，該EV71-相關疾病可選自於由無菌性腦膜炎、腦炎、顱神經麻痺、格林巴利症候群(Guillain-Barre syndrom)、脊髓灰質炎樣症候群、腦幹腦炎、皰疹性咽峽炎，以及手足口病組成之族群。
現一般性地描述本發明，可更容易地經由參考下列範例而理解，其僅用於示範，而非限制本發明。
本領域技術人員應理解到，本發明可在沒有過度實驗下，根據本文所提供的方法來實施。該方法，技術和化學品，係如參考文獻中所述，或由標準生物技術和分子生物學教科書之流程中提供。
範例
技術上已知之標準分子生物技術且非專一性描述，請見於Sambrook and Russel,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(2001)。
範例1 製造對抗EV71之融合瘤細胞株
10隻8週大Balb/c小鼠係以經SUMO融合蛋白裂解之重組性EV71-VP0蛋白進行免疫反應。第一次免疫是以弗氏完全佐劑(聖克魯斯，加州，美國)完成，並進行皮下注射(SC)。第二、第三及融合前加強劑量均使用弗氏不完全佐劑(聖克魯斯，加州，美國)，並分別進行2-3週間隔之腹腔注射(IP)。
融合前致敏(priming)注射後三天，小鼠脾臟分別準備用於細胞融合(附錄B：脾-骨髓瘤細胞融合之流程)。在細胞融合前，夥伴SP2/0骨髓瘤細胞株擴展至每個脾臟的T75燒瓶。在細胞融合當天，將小鼠由心臟放血以收集血清，脾臟以無菌方式收集。脾細胞和SP2/0細胞二者經洗滌，並以一個小鼠脾臟對一個T75燒瓶的SP2/0細胞之比例混合。依據免疫原將小鼠脾臟分為四個細胞融合組，並加入適當數目的SP2/0細胞。細胞融合係經由緩慢加入聚乙二醇(PEG1500)(Sigma公司，密蘇里州，美國)至細胞混合物中而進行，將所得細胞沉澱物進行洗滌，然後種入四個24孔組織培養盤每個脾臟(主盤)。培養整夜後，10%RPMI 2XHAT培養液(次黃嘌呤、胺基喋呤與胸腺嘧啶)加入至每孔中，培養盤培養數天，之後進行10%RPMI 1XHAT的隨後培養。
融合後一周至10天，由主盤中挑出可見之融合瘤殖株，植入24孔挑選殖株盤。當這些挑出之殖株為40-70% 匯合度，細胞上清液以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行篩選，以塗覆有EV71 VLP裂解液(抗原)與Sf9裂解液(對照組)之平板篩選。第二次篩選是以塗有重組性EV71病毒蛋白(rVP0、rVP1、rVP2、rVP3、rVP4)綜合液之平板進行ELISA。任何提供陽性讀數(SN07>0.1OD，SF9<0.1)的樣本係於T25瓶中倍增並冷凍保存。任何潛在的陽性殖株之後進行小鼠免疫球蛋白捕獲ELISA(MICE)，以確保該殖株有分泌抗體。自樣本中收集抗體-產生細胞上清液，並用於測試對EV71病毒的中和作用。
之後挑選出最強陽性反應之融合瘤，以有限稀釋法再次選殖，以獲得單一殖株在96孔盤之孔中(附錄E：再選殖單株抗體細胞株之流程)。再選殖是必需的，因為原始培養物可能起源於一個以上的融合瘤細胞。經由再選殖，來自此陽性抗體培養物之單一細胞可被分離出並傳代培養。該再選殖細胞首先進行MICE篩選，以篩選出分泌高力價抗體之細胞(以OD測量確定)。具有高OD讀數之4-8個單一殖株擴展到24孔盤之孔中，並經由間接ELISA測試專一性反應，使用塗覆有EV71 VLP裂解物/滯留物之平板。具有強專一性反應之殖株擴展到T25瓶中，並冷凍保存。選出一良好殖株進行下一輪之再選殖。經過兩輪再選殖，最終殖株經擴充，以收集細胞上清液，直接使用作為試劑或用於純化單株抗體。最終殖株亦經由預塗覆有不同的抗小鼠-Ig類型(抗-IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、κ和λ輕鏈)之ELISA盤進行分型(附錄C-III：Pierce快速ELISA小鼠單株 分型套組之使用流程)。此外，RNA由每一融合瘤分離出，並用於產生cDNA，以定序每一可變異輕鏈與可變異重鏈。
製備單株抗體之Fab片段
抗體之Fab片段是使用Pierce Fab製備套組，根據製造商的說明(http：//www.piercenet.com/product/fab-preparation-kits)而製備。動物照護與使用是依照2006年動物法中馬來西亞之國家動物福利標準而進行。
免疫墨漬分析
等體積之模擬-和EV-71感染的細胞裂解物，係於12%SDS-PAGE上分離，轉移至硝酸纖維素膜，並使用R525(針對EV71 VP1之多株抗體)、E18或E19偵測。以結合有二級抗體之辣根過氧化酶(Dako公司，丹麥)，隨後以TMB膜過氧化物酶受質(KPL，馬里蘭州，美國)偵測結合抗體。
ELISA分析
間接ELISA係於塗覆有重組性病毒蛋白或熱失活EV71感染RD細胞裂解液作為陽性對照組之Nunc免疫平板進行。非專一性結合係使用5%脫脂乳阻斷，抗體以各種濃度雙倍加入，結合的抗體係使用辣根過氧化酶聯結(HRP)聯結抗小鼠IgG(Dako公司)偵測。加入SureBlue Reserve TMB微孔過氧化物酶受質(KPL)5分鐘，加入0.5M HCl溶液以停止酵素反應，且各孔於450nm讀取。
進行夾心ELISA法，其中各孔塗覆有對抗VP1之R525抗體，以及PEG沉澱之EV71，此為未處理或在56℃進行熱失活30分鐘，以允許其結合至VP1抗體。結合的顆粒係以單株抗體E18或E19偵測，之後以上述HRP IgG(Dako公司)偵測。
進行競爭性ELISA，以檢測小鼠血清中是否存在含E18表位之抗體。匯集由4隻經高PRNT50力價之VLP免疫化之小鼠採集之血清，以及由4隻經PBS免疫化之小鼠採集之血清，以進行競爭性ELISA試驗。各孔以R525塗覆，之後以相等蛋白質濃度之模擬與EV71感染的RD細胞裂解物塗覆。加入由小鼠匯集(在1/250稀釋度)之血清至各孔中，之後隨即加入HRP聯結之E18。加入Reserve TMB微孔過氧化酶受質(KPL)5分鐘，加入0.5MHCl溶液以停止酵素反應，且各孔於450nm讀取。調整後的OD值係由OD(EV71感染RD細胞)減去OD(模擬RD細胞裂解液)獲得。E18結合的相對百分比是以樣品調整後的OD除以僅含HRP-E18之孔之經調整OD，再乘以100而得。
噬斑減少中和試驗
不同濃度的抗體、Fab片段或熱失活小鼠血清，係與EV71感染株MY104(300 PFU/毫升)，以1：1體積比，在37℃下靜置1小時。該病毒-抗體(或Fab)混合物雙倍地接種於24孔盤中的Vero細胞單層上(Nunc公司，熱費舍爾，美國)。該等單層係以每孔0.5毫升Vero細胞在DMEM中3×105每毫升補充有5%FBS和抗生素(均來自Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國)製備，且在接種前附著整夜。 在以200μl抗體(或Fab)-病毒混合物接種之前吸出培養液，並培養於CO2培養箱中，於37℃培養2小時，之後加入1毫升含有DMEM之覆蓋溶液，DMEM補充有2%FBS，抗生素和1.5%羧甲基纖維素(CMC)。培養盤於37℃以5%CO2培養4天，並以萘黑色染色。噬斑以人工計數。抑制百分比係以相對於對照組之各孔中之噬斑平均數目而決定，其中對照組之病毒僅與培養液共同培養。
病毒製造與純化
EV71病毒顆粒係如先前之描述(Plevka et al.,2012)所製造與純化。
VLP之製造與純化
簡言之，EV71空的未成熟殼體使用桿狀病毒表現系統製造，其中該完整P1編碼序列與EV71之蛋白酶3CD係重組性地***多角體蛋白啟動子下游，且該重組性桿狀病毒係用於感染Sf9細胞，於moi為0.1時。於第4天收穫之上清液經澄清化，並使用切向流過濾濃縮(GE Healthcare公司Lifesciences公司)，殘留物通過一將E18耦合至HiTrap NHS-活化HP管柱之親和性管柱(GE Healthcare Lifesciences公司)。結合之顆粒使用甘胺酸緩衝液在pH 3.0下沖提出，並立即以1M Tris-HCl中和至pH 7.2。該等顆粒轉移到Dulbecco磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)緩衝液(Invitrogen)中。
以拉下(pull-down)試驗鑑定EV71 VLP
20ml得自以表現有EV71 VLPs之重組性桿狀病毒感染之細胞之上清液，係與10ml中和單株抗體E18混合， 並置於室溫下1小時。該混合物緩慢地載入通過1ml MabSelect SuReTM(GE Healthcare)重組性蛋白A管柱，瓊膠小珠尺寸85um，其預先平衡於PBS中，之後以20ml PBS清洗，之後以0.5ml之0.1M且pH為3.0之甘胺酸-HCl，沖提。分液以30μl之pH為8.8之Tris-HCl中和。沖提出之分液係於SDS-PAGE上分離，之後以考馬斯藍(Coomassie blue)染色與去染。
經親和性管柱(AFC)純化之EV71 VLP之分析
親和性管柱(AFC)係以中和單株抗體E18製備。沖提出之分液係經西方墨漬法分析。沖提出之分液使用抗-VP1抗體、抗-VP2抗體或抗-VP0單株抗體偵測。
經E18-純化之VLPs係使用電子顯微鏡(EM)分析。
小鼠免疫化
小鼠(n=每組10隻)係以二劑量之DPBS或10μg之VLP，在Inject Alum(Thermo Scientific)存在下隔3週進行免疫化。血清係藉由在56℃下培養30分鐘而失活，並儲存於-20℃，以進行進一步分析。
於植物細胞中表現重組性嵌合性E18與人源化E19單株抗體
VL與VH DNA序列(SEQ ID NOs：23、9、25與30)係經密碼子最佳化，以於本氏菸草(Nicotiana benthamiana)中表現，並基因性地融合至人類IgG骨架上，其亦經密碼子 最佳化，以於本氏菸草(Nicotiana benthamiana)中表現。嵌合性E18與完整人源化E19抗體構築物之後轉移至農桿菌中，並用於滲入野生型本氏菸草(Nicotiana benthamiana)，以產生重組性植物。重組性嵌合性E18或完整人源化E19抗體係由植物材料中收穫，並使用蛋白A-基礎管柱層析法純化。所有使用之方法皆與先前用於人類治療用抗體之方法相同(Qiu et al.,2014)。
結果
抗體E18、E19與E20係以含VP0之空的未成熟EV71顆粒使小鼠免疫化。由噬斑減少中和試驗結果顯示所有三種抗體，E18、E19與E20，皆可中和EV71(圖1A-C)。列於表6中之每一抗體之PRNT50值，其相較於無融合瘤-病毒，代表著降低50%噬斑數目所需之融合瘤培養流體之濃度。
Figure 103143473-A0202-12-0044-11
此外，E18與E19二者皆可以作為完整抗體或Fab片段中和病毒(圖2)。在圖2中，單株抗體E18(a圖)與E19(a 圖)之完整IgG與Fab片段係於不同濃度下(X軸)使用噬斑減少中和試驗用於抑制EV71。圓形代表完整抗體，方塊代表Fab片段。病毒之抑制係以相對於對照組孔噬斑之噬斑百分比表示。
間接ELISA之結果亦顯示出E18與E19 MAbs二者可辨識熱失活EV71顆粒表面之構象表位(圖3)。在圖3A中，模擬-(M)與EV71-感染(V)細胞裂解液，係經SDS-PAGE分離並轉移至薄膜上。薄膜以R525、E18或E19偵測。E18與E19並未結合至變性之病毒蛋白。參照圖3B，間接ELISA係於塗覆有重組性病毒蛋白或熱失活EV71-感染細胞裂解液之各孔進行。各濃度之MAb係以雙倍加入。MAbs以辣根過氧化酶(HRP)試驗偵測。結合之MAbs量係以平均OD450±標準差表示。ELISA試驗進一步顯示E18與熱失活EV71 A顆粒之結合，較成熟病毒顆粒佳(圖4)。
於此顯示可中和EV71之抗體，可以含VP0之未成熟小核糖核酸病毒顆粒免疫化而產生。此策略之一範例，空的未成熟病毒類顆粒(VLPs)係於E18親和性管柱純化，並用於使小鼠免疫化。分析所得血清以決定該中和抗體力價(圖5)。相較於對照組小鼠(幾何平均力價=55)，以VLPs免疫化之小鼠具有較高之對抗EV71之中和抗體力價(幾何平均力價=153)。由VLP-免疫化小鼠匯集之血清，可抑制60%之E18結合，表示這些小鼠的血清含有可辨識E18表位之抗體(圖5)。因此，篩選出之具有E18表位之VLPs，可誘發小鼠中之中和抗體。因此，其他小核糖核酸病毒亦可使用此 述之方法獲得治療用抗體。
此外，由於E18可純化維持構象表位之致免疫性EV71 VLPs，因此具有作為EV71疫苗發展製程控制試劑之利用性。此製程之一範例示於圖6。於此，EV71 VLPs可結合至E18。如圖6A所示，當以SDS PAGE分析，並以考馬斯藍(Coomassie blue)染色(標記C)時，沈澱之VLPs含有所有VLP組成(VP0、VP1與VP3)。之後EV71 VLP之純化係使用E18親和性管柱進行，沖提出之分液係使用西方墨漬法分析。如圖6A所示，經純化之VLPs中明顯存在VP1與VP0(下2行，標記為EV71 VLPs)。重要的是，以E18與E19二者製備之親和性管柱，可用於純化來自原始EV71感染培養物之感染性病毒顆粒，吾人可顯示VP1與VP0之存在，如圖6A所示(最後4行，標記為EV71病毒)。最後，經E18、E19與E20-純化之VLPs係使用電子顯微鏡(EM)分析。在代表性範例中，與EV71病毒顆粒大小差不多之VLPs示於圖6B。此說明抗體E18、E19與E20可辨識高度原始組裝之EV71 VLP，以及原始感染性EV71病毒顆粒。任一EV71疫苗候選物可以類似方法鑑定，以決定是否所有組成皆存在、高度原始構象表位存在，及/或是否結構組裝EV71病毒顆粒是明顯的。此外，由於E18、E19與E20為高度中和抗體(圖2，表6)，此三個抗體可使用作為標準物，以決定各接受候選物EV71疫苗之相對中和力價，提供評估EV71疫苗-誘發抗體反應之一致標準。
重要的是，E18、E19與E20的高度中和活性也表 明這些抗體可發展為有效的治療抗體以治療人類疾病。如上所述，這兩種抗體原先由小鼠融合瘤中純化。作為E18、E19與E20發展為用於人類治療的第一步，係生產重組性嵌合性E18、E19與E20抗體。E18、E19與E20之可變異重鏈與輕鏈(SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6與7)係選殖至人類IgG骨架上，以誘發重組性小鼠-人類嵌合性單株抗體。測試該等嵌合性抗體之體外中和EV71之能力，如圖7所示，四個重組性嵌合性抗體之三個可中和病毒。包含E19VL+VH(SEQ ID NO：3和4)之E 19嵌合性抗體不具活性。值得注意的是，嵌合性E20也顯示出弱的中和能力，僅在一個細胞株(ATCC)中具有限的活性。嵌合性E18顯示明顯的中和活性；然而，在這兩種細胞株(NIBSC和ATCC)中，嵌合性E18活性略小於親代小鼠抗體(EV18/4/D6-1)。對於含有VL+VH2(SEQ ID NO：3和5)之嵌合性E19，在兩種細胞株中，其中和活性大於或等於親代小鼠抗體(EV19/5/1-6)。重組性嵌合性抗體濃度需要抑制50%EV71生長，推算每一抗體之抑制濃度50(IC50)，結果列於表7。
Figure 103143473-A0202-12-0047-12
Figure 103143473-A0202-12-0048-13
含有E19 VL+VH(SEQ ID NO：4)之嵌合性E19抗體於任何經測試的濃度下皆無法中和EV71，且嵌合性E20具最少之中和活性，因具有最高之IC50。重組性嵌合性E18於NIBSC細胞中相較於親代小鼠抗體具明顯較高之IC50(~5-倍差異)，並於ATCC細胞中有明顯較低的中和作用，其中嵌合性E18之IC50高出親代抗體2倍。含有VL+VH2(SEQ ID NOs：3與5)之重組性嵌合性E19具有最佳活性，反映於其在二細胞株中皆具有低IC50。
由於嵌合性E18之中和活性係低於親代小鼠抗體，一第二重組性嵌合性E18係藉由縮短VL序列產生。新的E18-衍生VL序列，亦即VL2，係提供於表4(SEQ ID NO：15)。新的重組性嵌合性E18抗體之表現係於植物細胞中完成。該親代小鼠E18與二嵌合性E18抗體係於細胞培養物中使用Vero細胞測試中和EV71之能力(圖8)。抗體(Ab)係經稀釋，並測試各種濃度，如x軸所示。每一抗體濃度之病毒噬斑減少百分比(y-軸)被測定。該親代小鼠E18顯示於最低濃度有最佳之中和活性。二嵌合性E18抗體以類似的程度中和EV71，如同幾近重疊之曲線。
由於重組性嵌合性E19為最有效的重組性中和抗體，可於VL與VH2(SEQ ID NOs：3與5)之可變異框架區域內 進行進一步的基因操作，以產生重組性完全人源化E19單株抗體。VL之三種版本與VH 2之三種版本，一開始係由模擬人類抗體框架，並引入特定胺基酸取代至小鼠E19 VL與VH2框架區域而創造出。六個新的完全人源化E19 VL-與VH2-衍生序列係提供於表4中(SEQ ID NOs：16、17、18、19、20與21)，並標記為hVL1、hVL2、hVL3、hVH1、hVH2與hVH3，以分辨其與親代小鼠之VL與VH2序列(SEQ ID NOs：3與5)。E19-衍生之hVL與hVH之九種不同組合，係表現為完整人類IgG抗體，且測試每一者之EV71中和活性。如圖9所示，所有九種重組性完全人源化E19單株抗體皆可中和EV71。
Figure 103143473-A0202-12-0049-14
Figure 103143473-A0202-12-0050-15
此外，當每一抗體之IC50被推算出，具最佳中和特性之三個重組性完全人類抗體為hVL2+hVH2、hVL3+hVH3與hVL3+hVH2(SEQ ID NOs：17、18、20與21)。重要的是，三個最佳之重組性完全人類E19抗體之IC50係類似於所觀察到之嵌合性E19 VL+VH2抗體之IC50(表7與8)，並優於該親代小鼠E19抗體(表7)。由於hVL2+hVH2一貫呈現最低之IC50，其代表一治療性抗體之最佳候選物，因其為完全人源化並高度中和。有趣的是，進一步檢驗hVH2序列，發現框架3區域缺乏一存在於許多人類VH框架3區域中的精胺酸殘基。為了進一步將hVL2+hVH2 E19抗體之治療效果最佳化，因而產生衍生自hVH2之第七個序列，但包括額外之精胺酸殘基於正確位置上。此新的序列提供於表4(SEQ ID NO：22)，並標記為hVH4。已完成新的hVL2+hVH4 E19抗體之表現，且正在評估抗體的功能。
為了降低治療用抗體之製造成本，重組性抗體之表現係於本氏菸草(Nicotiana benthamiana)植物細胞中測試。具體地，嵌合性VL2+VH E18抗體(SEQ ID NOs：15與2)與重組性完全人源化hVL2+hVH4 E19抗體(SEQ ID NOs：17與22)被選用於測試植物細胞之表現。植物之轉型與表現係如方法中所述進行，且目前每一重組性抗體已純化出超過300毫克。目前已完成第二E18嵌合性(圖8)之評估中和活性之功能性試驗，且正在進行人源化E19之評估。以第二嵌合性E18植物細胞之結果為基礎，代表本申請案為可行之重組性抗體之製造平台。
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Figure 103143473-A0202-12-0058-27
<210> 10
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體E19 VL鏈
<400> 10
Figure 103143473-A0202-12-0059-30
<210> 11
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體E19 VH1鏈
<400> 11
Figure 103143473-A0202-12-0059-28
<210> 12
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體E19 VH2鏈
<400> 12
Figure 103143473-A0202-12-0060-32
<210> 13
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體E20 VL鏈
<400> 13
Figure 103143473-A0202-12-0060-33
<210> 14
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體E20 VH鏈
<400> 14
Figure 103143473-A0202-12-0061-35
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：1之抗體E18 VL2鏈
<400> 15
Figure 103143473-A0202-12-0061-34
Figure 103143473-A0202-12-0062-36
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：3之抗體E19人源化VL1鏈
<400> 16
Figure 103143473-A0202-12-0062-37
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：3之抗體E19人源化VL2鏈
<400> 17
Figure 103143473-A0202-12-0062-38
Figure 103143473-A0202-12-0063-39
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：3之抗體E19人源化VL3鏈
<400> 18
Figure 103143473-A0202-12-0063-40
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：5之抗體E19人源化VH1鏈
<400> 19
Figure 103143473-A0202-12-0064-41
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：5之抗體E19人源化VH2鏈
<400> 20
Figure 103143473-A0202-12-0064-42
Figure 103143473-A0202-12-0065-44
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：5之抗體E19人源化VH3鏈
<400> 21
Figure 103143473-A0202-12-0065-43
Figure 103143473-A0202-12-0066-45
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：20之抗體E19人源化VH4鏈
<400> 22
Figure 103143473-A0202-12-0066-46
<210> 23
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：1之抗體E18 VL2鏈
<400> 23
Figure 103143473-A0202-12-0067-47
<210> 24
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：3之抗體E19人源化VL1鏈
<400> 24
Figure 103143473-A0202-12-0067-48
<210> 25
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：3之抗體E19人源化VL2鏈
<400> 25
Figure 103143473-A0202-12-0067-50
Figure 103143473-A0202-12-0068-51
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：3之抗體E19人源化VL3鏈
<400> 26
Figure 103143473-A0202-12-0068-53
<210> 27
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：5之抗體E19人源化VH1鏈
<400> 27
Figure 103143473-A0202-12-0068-54
Figure 103143473-A0202-12-0069-57
<210> 28
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：5之抗體E19人源化VH2鏈
<400> 28
Figure 103143473-A0202-12-0069-56
<210> 29
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：5之抗體E19人源化VH3鏈
<400> 29
Figure 103143473-A0202-12-0069-55
Figure 103143473-A0202-12-0070-58
<210> 30
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自SEQ ID NO：20之抗體E19人源化VH4鏈
<400> 30
Figure 103143473-A0202-12-0070-60

Claims (11)

  1. 一種經分離之抗體或其片段，其專一性地結合至腸病毒71(EV71)之至少一構象(非線性)表位，其中該抗體包含至少一可變異輕鏈與至少一可變異重鏈，其中該可變異輕鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO：1或15，以及該可變異重鏈胺基酸序列包含SEQ ID NO：2，其中該抗體為中和抗體。
  2. 如請求項1之經分離之抗體或其片段，其中該抗體為單株小鼠、人源化或嵌合性抗體。
  3. 一種如請求項1或2之經分離之抗體或其片段，其係供用於EV71疫苗製程控制、候選EV71疫苗純化，或決定EV71抗體效力標準。
  4. 一種醫藥組成物，其包含至少一於請求項1至3中任一項定義之抗體或其片段。
  5. 一種請求項1或2所定義之至少一抗體或其片段於製備一藥物之用途，該藥物係用於治療EV71感染及/或至少一EV71-相關疾病，該至少一EV71-相關疾病是選自於由無菌性腦膜炎、腦炎、顱神經麻痺、格林巴利症候群、脊髓灰質炎樣症候群、腦幹腦炎、皰疹性咽峽炎以及手足口病組成之族群。
  6. 一種經分離之核酸分子，其編碼(a)於請求項1或2定義之抗體之至少一可變異輕鏈，其中該可變異輕鏈包含選自於由SEQ ID NOs：1與15 所組成之族群的至少一胺基酸序列；以及(b)於請求項1或2定義之抗體之至少一可變異重鏈，其中該可變異重鏈包含至少一SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
  7. 如請求項6之經分離之核酸分子，其中(a)中之至少一核酸序列具有與SEQ ID NOs：8及/或23至少90%之序列等同度；及(b)中之至少一核酸序列具有與SEQ ID NO：9至少90%之序列等同度。
  8. 如請求項7之經分離之核酸分子，其包含：(a)至少一核酸序列，其係SEQ ID NOs：8及/或23；及(b)至少一核酸序列，其係SEQ ID NO：9。
  9. 一種表現載體，其包含至少一於請求項6至8中任一項定義之經分離之核酸分子。
  10. 一種宿主細胞，其包含於請求項9定義之表現載體。
  11. 一種套組，其包含至少一於請求項1或2定義之抗體或其片段。
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