TWI551687B - 胜肽片段的調製方法、使用於該方法的胜肽片段調製用套件以及分析方法 - Google Patents

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Description

胜肽片段的調製方法、使用於該方法的胜肽片段調製用套件以及分析方法
本發明是有關於一種使用蛋白酶(protease)對抗體等蛋白質進行位置選擇性切割，而調製胜肽片段的方法、及使用於該方法的胜肽片段調製用套件。而且，本發明是有關於一種藉由質譜法(mass spectrometry)等對藉由該方法而調製的胜肽片段進行分析，而進行蛋白質的檢測或定量的分析方法。
抗體醫藥的需求急速地擴大，在臨床現場，將血液中的抗體濃度進行簡便地定量的重要性提高。先前，並未重視準確地測定投予抗體醫藥後的血液中濃度，但在隨著曲妥珠單抗(trastuzumab)(商品名：Herceptin(賀癌平))於胃癌應用中擴大的臨床試驗中，在其血液中濃度與生命期發現顯著差異以後，在抗體醫藥的臨床試驗等中，需要測定抗體的血中濃度。例如在藥物動態確認等品質管理、或通用名藥(generic drug)的臨床試驗等與新藥的同一性確認等中，亦正在要求抗體醫藥的鑑定、或其血液中濃度的定量。
使用抗原抗體反應的酵素連結免疫吸附分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法由於特異性及定量性優異，因此在臨床試驗等中，廣泛用於血液中的抗原或抗體的檢測、定量等。但是，ELISA法是以單一蛋白質(抗原或抗體)的檢測為目的者，無法同時檢測多種不同的蛋白質。為了藉由ELISA法檢測多種蛋白質，而需要對各檢測對象製作特異抗體而設定濃度測定條件，並需要莫大的勞力與時間及費用。另外，ELISA法由於利用抗原抗體反應，因此已知與併用藥或代謝物的交叉反應可對測定結果造成影響，或一部分抗體醫藥難以應用於保存檢體等問題點。
因此，期望開發出可通用地應用於各種抗體的分析方 法。隨著蛋白質體學(Proteomics)的發展，開發出了可藉由質譜法對蛋白質進行籠統地檢測、定量的技術，近年來，亦可實現抗體等巨大有機體分子的解析。在質譜中，需要將測定對象分子進行離子化，多數情況下難以直接藉由質譜對抗體等巨大有機體分子進行分析。因此採用：藉由蛋白酶消化將蛋白質切割(片段化)，自經片段化的胜肽中，選擇對分析對象的蛋白質具有特異性胺基酸序列的胜肽片段，並藉由質譜裝置進行檢測、定量的方法。通常，為了提高藉由蛋白酶的消化效率，而在高濃度的脲或胍(guanidine)溶液中使基質蛋白質變性後，進行蛋白酶消化。
在藉由蛋白酶消化將抗體等蛋白質片段化而進行質譜時，重要的是選擇性地檢測成為檢測對象的胜肽片段。但自包含 多種多樣的夾雜物的有機體試樣中，檢測源自分析對象的蛋白質的特定胜肽片段，有時伴有困難。即，血液等有機體試樣由於含有多種多樣的夾雜物，因此若在有機體試樣中添加蛋白酶，則源自夾雜物的蛋白質亦會進行蛋白酶消化，而生成龐大數量的胜肽片段。為了自其中將源自檢測對象(例如特定抗體)的目標胜肽片段進行選擇性地檢測、定量，而在供於質譜前，需要胜肽片段的分離或濃縮等操作。另外，若自檢測對象以外的蛋白質產生與檢測對象的蛋白質的胜肽片段共通並具有胺基酸序列的胜肽片段，則可成為錯誤檢測或定量性降低的原因。因此，有隨著由有機體試樣產生的胜肽片段數的增加，而作為檢測對象的胜肽片段的選擇變得更困難的傾向。
鑒於此種有機體試樣的複雜性，而開發出：藉由液相層 析法(Liquid Chromatography，LC)將試樣純化後，供於質譜裝置的方法；或利用藉由碰撞誘導解離(Collision-Induced Dissociation，CID)等而產生離子開裂(ionic cleavage)的多階段質譜、或該些的組合(多重反應監測(Multiple Reaction Monitoring，MRM))，而將有機體試樣等複雜試樣中的特定蛋白質定量的方法。但是，試樣變得越複雜，則越會存在以下問題：需要組合各種分離模式，需要高精度的實驗裝置，或分析條件的設定需要大量的時間等。
另外，抗體等巨大蛋白質在使用經純化的試樣時，亦會 因蛋白酶消化而產生大量的胜肽片段，因此有難以自其中將對檢 測對象具有特有的胺基酸序列的胜肽片段進行選擇性地檢測、定量的傾向。鑒於此種問題，開發出：將分析對象的蛋白質進行位置選擇性地蛋白酶消化，減少試樣中的胜肽片段的數量(種類)，提高分析精度，並且將分析進行簡化的方法。例如，專利文獻1中提出以下方法：在藉由抗體的胃蛋白酶(pepsin)消化而產生F(ab')2片段後，將F(ab')2片段進一步藉由胰蛋白酶等蛋白酶進行消化，而產生包含抗體的互補性決定區域(complementarity-determining region，CDR)的胜肽片段，藉由質譜將包含CDR的胜肽片段進行檢測、定量。
此處，對抗體的結構進行說明。所有的抗體具有2條重 鏈(H鏈)與2條輕鏈(L鏈)。1條輕鏈與1條重鏈藉由雙硫鍵連結而形成異二聚物(heterodimer)，繼而2個異二聚物藉由2個雙硫(S-S)鍵連結而形成“Y”字型異四聚體(heterotetramer)(參照圖2)。抗體具有包含重鏈的1個Fc(片段、可結晶(Fragment、crystallizable))區域與包含重鏈及輕鏈的2個Fab(片段、抗原結合(Fragment、antigen binding))區域，Fc區域與Fab區域經由鉸鏈(hinge)部而連接。
抗體的Fc區域主要擔負起引起抗體與抗原結合後的反 應的功能(效應(effector)功能)，源自同一種的抗體的絕大部分與Fc區域的胺基酸序列共通。另一方面，Fab區域具有將前端部分(N末端側)與抗原結合的功能。在Fab區域中，N末端側的部分以可與多種抗原結合的方式，在胺基酸序列中見到多彩的變 化。該區域被稱為可變區域(V區域)，輕鏈的可變區域被稱為VL區域，重鏈的可變區域被稱為VH區域。V區域以外的Fab區域與Fc區域是胺基酸序列的變化少的區域，被稱為恆定區域(C區域)。輕鏈的恆定區域被稱為CL區域，重鏈的恆定區域被稱為CH區域。CH區域進一步分為CH1區域、CH2區域、及CH3區域這3個。重鏈的Fab區域包含VH區域與CH1區域，重鏈的Fc區域包含CH2與CH3。鉸鏈部位於CH1與CH2之間。
抗體的特異性(即與抗原的特異性結合性)由V區域的 胺基酸序列的組合決定。輕鏈及重鏈的各鏈在Fab區域的V區域內具有3個互補性決定區域(CDR)。CDR亦被稱為超可變區域，在抗體的各種類中胺基酸序列不同。抗體在輕鏈與重鏈的各鏈中具有3個CDR(合計6種CDR)，因此產生可與各種抗原結合的多樣性。換言之，CDR是對抗體賦予特徵的區域，藉由確定抗體的CDR的胺基酸序列，而可鑑定抗體。
如上述般，抗體的Fab區域與Fc區域經由鉸鏈部而連 接。作為蛋白酶的一種的木瓜酶(papain)會切割該鉸鏈部，因此藉由抗體的木瓜酶消化而產生2個Fab區域與1個Fc區域。另外，作為蛋白酶的一種的胃蛋白酶會切割鉸鏈部的2條雙硫鍵的Fc區域側(C末端側)，因此藉由胃蛋白酶消化，而產生2個Fab區域結合的F(ab')2區域、及大量的Fc區域片段。
在上述專利文獻1的方法中，藉由胃蛋白酶消化或木瓜酶消化而產生Fab區域或F(ab')2區域，並將Fab區域或F(ab')2區 域進行位置選擇性地蛋白酶消化。藉由該方法，由於會降低藉由蛋白酶消化而產生的胜肽的數量，並可有效地產生包含CDR的胜肽，因此可簡化藉由質譜法的抗體的檢測、定量。另外，在專利文獻2中報告，藉由併用胃蛋白酶或木瓜酶以及特定離子，而提高藉由該些蛋白酶的消化效率。
亦市售有以抗體的Fab區域的純化為目的、而使蛋白酶 最佳化的純化用套件等。但是，上述專利文獻1的方法中，在將Fab區域或F(ab')2區域純化後，進而需要進行蛋白酶處理，因此供於質譜的試樣的調製需要大量的時間與成本，說不上是簡便的方法。另外，蛋白酶消化(片段化)根據成為消化對象的基質蛋白的種類，而其消化效率不同，因此為了將用以供於質譜的胜肽片段試樣的調製簡化，而重要的是提高消化效率。
近年來，作為蛋白酶消化的高效率化方法，受到關注的 是在奈米粒子等微小環境(微反應器(micro reactor))中進行蛋白酶消化的方法。例如，在非專利文獻1中報告以下的例子，藉由在尼龍的多孔膜的細孔內將胰蛋白酶固定，使白蛋白(albumin)溶液通過該多孔膜，而使白蛋白的胰蛋白酶消化達到高效率化。 在非專利文獻2中報告，藉由使用在細孔內將胰蛋白酶固定的介孔二氧化矽(mesoporous silica)，而可將分子量小的蛋白質進行選擇性地胰蛋白酶消化。該些方法均是在多孔體的細孔內將蛋白酶固定，使固相表面的蛋白酶與液相內的基質蛋白質反應的方法。如此，藉由在微小環境中將蛋白酶固定為固相，而提高消化 效率的原因認為：在固相與液相的界面的局部、微細的環境中，蛋白質容易引起變性；或者藉由溶解度或立體結構的晃蕩幅度等受到干擾，而基質蛋白質與蛋白酶的接觸機會增大，而提高反應機率。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1：WO2008/079914號國際公開小冊子
專利文獻2：日本專利特開2011-130749號公報
非專利文獻
非專利文獻1：許飛等，「分析化學」(Fei Xu et. al., Anal. Chem.), 2010, 82, 10045-10051.
非專利文獻2：民錢浩等，「化學通訊」(Qianhao Min et. al., Chem. Commun.), 2010, 46(33), 6144-6146.
上述非專利文獻2的方法可將分子量小的蛋白質進行選擇性地蛋白酶消化，但無法應用於如抗體般的巨大蛋白質的選擇性消化。另外，藉由如非專利文獻1及非專利文獻2所揭示的微反應器，位置選擇性地進行蛋白酶消化的方法並未揭示。
如上述般，為了藉由質譜法對蛋白質進行簡便地檢測、定量，而要求將分析對象的蛋白質進行位置選擇性地切割，而有效地產生對檢測對象的蛋白質為特異性的胜肽片段，並減小其以外的胜肽片段的產生量。例如，為了對抗體進行檢測及定量分析，而需要對Fab區域、特別是Fab區域的V區域進行位置選擇性地 蛋白酶消化，而抑制Fc區域的蛋白酶消化。
本發明者等人銳意研究的結果發現，藉由將抗體等基質蛋白質與蛋白酶這兩者固定為固相，而可實現基質蛋白質的位置選擇性的蛋白酶消化，從而完成了本發明。
本發明是有關於一種藉由蛋白酶將蛋白質消化的胜肽片段的調製方法。本發明的方法包括：使將切割對象的基質蛋白質固定於細孔內的多孔體與將蛋白酶固定於表面的微粒子在液體中接觸的步驟(消化步驟)。將基質蛋白質固定於細孔內的多孔體是藉由將切割對象的基質蛋白質固定於多孔體的細孔內的步驟(基質固定步驟)而得。本發明中，較佳為微粒子的粒徑大於多孔體的平均細孔徑。
在微粒子的粒徑大於多孔體的平均細孔徑時，固定於微粒子表面的蛋白酶可進入多孔體的細孔的表層附近(多孔體與液相的界面附近)，但無法進入細孔的深部位置。如此，物理性(空間性)地限制蛋白酶的可進入的區域，因此蛋白酶選擇性地進入至固定於多孔體的細孔內的基質蛋白質的特定部位。因此，可實現基質蛋白質的位置選擇性的蛋白酶消化(片段化)。
在本發明中，較佳為基質蛋白質的特定區域固定於多孔體。在該形態中，固定於多孔體的區域位於細孔的深部，與所固定的區域不同的區域位於細孔的表層附近。若與基質蛋白質的選擇性切割部位不同的區域、即較佳為不進行蛋白酶消化的區域固 定於多孔體，則在位於細孔的表層附近的基質蛋白質的選擇性切割部位，固定於微粒子表面的蛋白酶進入，而進行蛋白酶消化。因此，可將基質蛋白質的所期望的部位進行位置選擇性地蛋白酶消化。
較佳為在多孔體的細孔內固定與基質蛋白質發生部位特異性相互作用的連接子(linker)分子。另外較佳為，基質蛋白質經由連接子分子而固定於多孔體的細孔內。作為在基質蛋白質為抗體時的連接子分子，例如可列舉：蛋白G(protein G)或蛋白A(protein A)等。該些連接子分子與抗體的Fc區域發生部位特異性結合，因此將抗體的Fc區域固定於多孔體，Fab區域位於細孔的表層附近。根據該形態，可將抗體的Fab區域進行選擇性地蛋白酶消化。
在多孔體的細孔內固定有連接子分子時，連接子分子與基質蛋白質結合的狀態的分子尺寸，較佳為多孔體的平均細孔徑的0.5倍~1.5倍左右。如此，藉由調整分子尺寸，而可提高固定於微粒子表面的蛋白酶與基質蛋白質的選擇性切割部位的進入機率，並提高蛋白酶消化的位置選擇性。
另外較佳為，微粒子的表面由可與蛋白酶結合的間隔體(spacer)分子修飾，蛋白酶經由該間隔體分子而固定於微粒子的表面。藉由經由間隔體分子而將蛋白酶固定，而抑制蛋白酶自微粒子表面脫離，並提高蛋白酶消化的位置選擇性。另外，藉由調整間隔體的分子尺寸，而亦可使蛋白酶選擇性地進入至基質蛋白 質的所期望的位置，並提高位置選擇性。
在本發明中，作為固定於微粒子表面的蛋白酶，較佳為 胰蛋白酶、或胰蛋白酶與其他蛋白酶的併用體系。在基質蛋白質為抗體時，較佳為單獨使用胰蛋白酶，或者在蛋白酶為併用體系時，較佳為全部蛋白酶中的胰蛋白酶的量為90%以上。特別是在基質蛋白質為抗體時，有藉由使用胰蛋白酶，而將Fab區域進行選擇性地蛋白酶消化，並抑制Fc區域的蛋白酶消化的傾向。
多孔體的平均細孔徑較佳為30nm~150nm左右，微粒 子的平均粒徑較佳為100nm以上。特別是在基質蛋白質為抗體時，若平均細孔徑及平均粒徑為上述範圍，則可更可靠地對Fab區域進行位置選擇性地切割。
而且，本發明是有關於一種可用於上述方法的胜肽片段 調製用套件。本發明的胜肽片段調製用套件包含：具有可固定蛋白質的細孔的多孔體、以及可將蛋白酶固定於表面的微粒子。微粒子能以在表面固定蛋白酶的狀態提供。藉由使該套件的多孔體與試樣(例如血液等檢體)接觸，而可將試樣中的目標物質(抗體等基質蛋白質)固定於多孔體的細孔內。藉由使固定基質蛋白質後的多孔體與將蛋白酶固定於表面的微粒子在液體中接觸，而可將基質蛋白質進行位置選擇性地蛋白酶消化。
藉由利用質譜等對藉由上述方法而得的胜肽片段進行分析，而可進行基質蛋白質的檢測(鑑定)或定量。在本發明中，由於將基質蛋白質進行位置選擇性地蛋白酶消化，因此可大幅度 減少測定試樣中所含的胜肽片段的種類。因此，可將質譜的條件設定進行簡化，並亦可期待分析精度的提高。
例如，在基質蛋白質為抗體時，根據本發明的方法，可 實現包含互補決定區域的Fab區域的位置選擇性的蛋白酶消化，因此可將抗體的包含互補性決定區域的至少一部分的序列的胜肽片段作為檢測對象。互補性決定區域具有對各抗體為特異性的胺基酸序列，因此可藉由包含互補決定區域的序列的胜肽片段的分析，而進行抗體的檢測或定量。
根據本發明，可藉由簡便的方法將抗體等蛋白質進行位 置選擇性地蛋白酶消化，而獲得胜肽片段。在將本發明的方法應用於抗體時，可抑制抗體的Fc區域的消化，並將包含CDR的Fab區域進行選擇性地蛋白酶消化，而提高對抗體的鑑定較為重要的且包含CDR的胺基酸序列的胜肽片段在試樣中的濃度。
根據本發明的方法，可大幅度減少測定試樣中所含的胜 肽的種類，因此可將質譜的條件設定進行簡化，並亦可期待分析精度的提高。藉由對所得的胜肽片段進行分析，而亦可實現血液中的抗體醫藥濃度的定量。因此，本發明的方法亦可用作非臨床或臨床試驗中的抗體醫藥的濃度測定系統的預處理方法。
另外，本發明的方法並不限定於抗體醫藥，可應用於大量的蛋白質，除了醫藥產業的應用擴大外，亦可期待應用於以有機體分子的相互作用解析為代表的基礎研究領域等。
10‧‧‧微粒子
11‧‧‧間隔體
15‧‧‧蛋白酶
20‧‧‧多孔體
21‧‧‧連接子分子
25‧‧‧基質蛋白質
29‧‧‧細孔
110‧‧‧微粒子
120‧‧‧多孔膜
131‧‧‧微粒子懸浮液
132‧‧‧旋轉管柱
135‧‧‧內容器
136‧‧‧外容器
D1‧‧‧平均粒徑
D2‧‧‧平均細孔徑
圖1是用以說明本發明的位置選擇性切割的原理的概念圖。
圖2是用以說明抗體的結構的示意圖。
圖3是表示胜肽片段調製用套件的一個形態的示意圖。
圖4是蛋白酶的量比研究實驗的電泳圖像。
圖5是蛋白酶的量比研究實驗的質譜(基質輔助雷射脫附游離-飛行時間質譜(MALDI-TOFMS，Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry))光譜。
圖6是消化時間研究實驗的質譜(MALDI-TOFMS)光譜。
圖7是基於曲妥珠單抗的胰蛋白酶消化片段的質譜結果的資料庫(database)解析結果。
圖8是曲妥珠單抗的胰蛋白酶消化片段的質譜(MALDI-TOFMS)光譜。
圖9是曲妥珠單抗的胰蛋白酶消化片段的LC-MS測定的層析圖。
圖10是曲妥珠單抗的胰蛋白酶消化片段的質譜(LC-MS)光譜。
圖11(A)及圖11(B)是表示曲妥珠單抗的重鏈(A)及輕鏈(B)的胺基酸序列的圖。圖中的下劃線表示藉由本實驗的質譜而鑑定的胜肽片段。
圖12是混合蛋白酶消化研究實驗的電泳圖像。
圖13是混合蛋白酶消化研究實驗的質譜(MALDI-TOFMS) 光譜。
在本發明的胜肽片段的調製方法中，將切割對象的基質蛋白質固定於多孔體的細孔內，使固定有基質蛋白質的多孔體與將蛋白酶固定於表面的微粒子在液體中接觸。圖1是用以說明本發明的蛋白酶消化的原理的概念圖。
在微粒子10(平均粒徑D1)的表面固定有蛋白酶15。多孔體20具有大量的細孔29(平均細孔徑D2)，並在細孔內固定有基質蛋白質25。如此，在本發明的方法中，蛋白酶15及基質蛋白質25這兩者在微小區域固定為固相，藉由固相彼此的接觸，而進行蛋白酶消化。
微粒子10的平均粒徑D1大於多孔體20的平均細孔徑D2。因此，微粒子10可進入至細孔29的表層附近，但無法進入至細孔29的深部。伴隨於此，固定於微粒子10表面的蛋白酶15亦無法進入至細孔29的深部。在圖1中，細孔29附近的虛線表示蛋白酶15可進入的區域的邊界。
如此，將蛋白酶15進入細孔29內的基質蛋白質25的情況進行位置特異性限制，並提高在基質蛋白質的液相側(圖1中為“Y”字的部分)的相對的進入機率。藉此，可將基質蛋白質25進行位置選擇性地蛋白酶消化，而獲得胜肽片段。
[基質蛋白質]
基質蛋白質25是成為分析對象的蛋白質。基質蛋白質的種類 並無特別限定，就進行位置選擇性切割的觀點而言，較佳為分子直徑大於蛋白酶15者。另外，基質蛋白質亦可為蛋白質的複合物。分子直徑可自各種文獻或資料庫等獲得根據藉由X射線或核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)等的結構解析而確定的數值。例如抗體的分子直徑為約15nm。另外，亦可藉由X射線小角散射等而求出分子直徑，並且亦可由分子量藉由估計而求出。作為參考例，將在調查超濾膜的分離特性時用作標記分子的蛋白質的分子量與分子直徑表示於表1。
基質蛋白質25較佳為在多孔體20的細孔29內進行部位特異性地結合者。藉由基質蛋白質25進行部位特異性地結合，而可將該結合部位以外的部位進行選擇性地蛋白酶消化。例如在C末端或N末端等附有組胺酸(His)標籤(包含6個左右連續的組 胺酸(histidine)殘基的標籤胜肽)或生物素化胜肽等標籤序列的蛋白質、或與特定基質進行特異性結合的酶等，亦可用作進行部位特異性地結合的蛋白質。
在本發明中，作為在多孔體的細孔內可進行部位特異性 地結合的基質蛋白質，特佳為使用抗體。若將抗體的Fc區域固定於多孔體20，則可將Fab區域進行選擇性地蛋白酶消化。抗體的種類並無特別限制，較佳為單株抗體。作為單株抗體，例如可列舉：帕尼單抗(Panitumumab)(Vectibix)、奧法木單抗(Ofatumumab)(Arzerra)、戈利木單抗(Golimumab)(Simponi)、易普利單抗(Ipilimumab)(Yervoy)等人類抗體；托珠單抗(Tocilizumab)(Actemra)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)(Herceptin)、貝伐單抗(Bevacizumab)(Avastin)、奧馬珠單抗(Omalizumab)(Xolair)、美泊利單抗(Mepolizumab)(Bosatria)、吉妥單抗(Gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg)、帕利珠單抗(Palivizumab)(Synagis)、蘭尼單抗(Ranibizumab)(Lucentis)、賽妥珠單抗(Certolizumab)(Cimzia)、奧瑞珠單抗(Ocrelizumab)、莫加木珠單抗(Mogamulizumab)(Poteligeo)、依庫麗單抗(Eculizumab)(Soliris)等人類化抗體；利妥昔單抗(Rituximab)(Rituxan)、西妥昔單抗(Cetuximab)(Erbitux)、英夫利昔單抗(Infliximab)(Remicade)、巴利昔單抗(Basiliximab)(Simulect)等嵌合抗體等。該些可用作抗體醫藥(分子靶向治療藥(molecular target drug))，在臨床試驗等中，需要血液中的抗體濃度的定量。
如下文藉由實施例進行說明般，根據本發明的方法，可 將單株抗體的Fab區域進行位置選擇性地蛋白酶消化，藉由所得的胜肽片段的質譜，可進行抗體的鑑定或定量。本發明的分析方法是藉由檢測源自抗體的可變區域的胜肽片段，而進行抗體的鑑定(檢測)或定量，且直接測定源自抗體的胜肽片段的方法。因此，本發明的分析方法不需要抗原等特異性結合物質，不論抗體的種類為何均可應用。因此，本發明的方法並不限定於上述例示的抗體，亦可應用於新穎開發的單株抗體等。
[多孔體]
多孔體20若為具有大量細孔29者，則其材料並無特別限定。在圖1中，圖示半球形狀的細孔，但細孔的形狀並無特別限定。另外，亦可使用如多孔膜般形成有貫通多孔體的細孔者。
作為多孔體20，可使用活性碳、多孔膜、多孔質樹脂顆粒、金屬粒子等。該些中，較佳為可選擇性結合上述基質蛋白質者，特佳為將基質蛋白質進行部位特異性結合者。例如，用於特定蛋白質等的純化的親和管柱(affinity column)載體顆粒，可滿足此種要件。
在本發明中，較佳為使用在多孔體20的細孔29內固定有與基質蛋白質25發生部位特異性相互作用的連接子分子21者。作為基質蛋白質與連接子分子的相互作用，可列舉：化學鍵、氫鍵、離子鍵、形成錯合物、疏水性相互作用、凡得瓦(van der Waals)相互作用、靜電相互作用、立體選擇性相互作用等。
連接子分子可根據基質蛋白質的種類或結合部位，自胺 基、羧基、環氧基等官能基；生物素、地高辛(digoxigenin)等標記化合物；抗生素蛋白(avidin)、鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白等蛋白質；各種配位子(ligand)；酶的基質化合物；二氧化矽；金屬螯合物等適當選擇最佳者。
在基質蛋白質25為抗體時，作為連接子分子21，較佳 為使用蛋白G或蛋白A等。蛋白A或蛋白G與抗體的Fc區域進行部位特異性結合。藉由使用在細孔29內固定蛋白A或蛋白G等的連接子分子21的多孔體20，而在細孔內將抗體(基質蛋白質25)的Fc區域進行部位特異性固定，並且Fab區域位於液相側(細孔的表層附近)。如此，藉由在細孔內將抗體固定為一定方向，而可控制細孔內的抗體的配向，並實現藉由蛋白酶的Fab區域的位置選擇性消化。
另外，藉由在細孔內固定基質蛋白質，並存在於固相與 液相的界面的微細環境，而基質蛋白質容易引起變性，分子的晃蕩受到干擾，並且受到蛋白酶的攻擊(attack)的機率提高。另外，在本發明中，藉由將蛋白酶固定於粒子上，而成為立體性穩定、且難以產生自體分解(autodigestion)的環境，因此認為蛋白酶的穩定性增加。因此，根據本發明的方法，除了可進行位置選擇性蛋白酶消化外，還可維持蛋白酶的高活性。
多孔體20的細孔29的大小並無特別限定。細孔的大小 較佳為在固定基質蛋白質25時，以基質蛋白質的前端部分、即應被選擇性消化的部位位於細孔29的表層附近的方式，考慮基質蛋白質的分子直徑等而確定。多孔體20的平均細孔徑D2例如在10nm~500nm左右的範圍，且小於微粒子10的平均粒徑D1的範圍內適當設定。多孔體20的平均細孔徑D2例如較佳為20nm~200nm左右，更佳為30nm~150nm左右。特別是在基質蛋白質25為抗體時，為了將Fc區域固定於細孔內，並將Fab區域進行位置選擇性地蛋白酶消化，而多孔體的細孔徑較佳為30nm~150nm，更佳為40nm~120nm，尤佳為50nm~100nm。
考慮到細孔或基質蛋白質的大小，連接子分子的大小以 基質蛋白質的選擇性切割部位位於細孔的表層附近的方式進行選擇。連接子分子與基質蛋白質結合的狀態的分子尺寸，較佳為多孔體的細孔徑的0.5倍~1.5倍左右，更佳為0.6倍~1.2倍左右，尤佳為0.7倍~1.1倍左右，特佳為0.8倍~1倍左右。另外，於不在多孔體20上固定連接子分子，而在多孔體的細孔內直接結合基質蛋白質時，基質蛋白質的分子直徑與多孔體的細孔徑較佳為滿足上述關係。
[基質蛋白質的固定化]
將基質蛋白質25固定於多孔體20的細孔29內的方法並無特別限定，根據基質蛋白質與多孔體(或固定於多孔體的連接子分子)的特性等，可採用適當的方法。例如於在細孔內固定有蛋白A或蛋白G的多孔體上固定抗體時，藉由將多孔體的懸浮液與包含 抗體的溶液混合，而可在細孔內容易地將抗體固定。
多孔體與基質蛋白質的量比可根據目的進行適當地設 定。例如，在進行基質蛋白質的定量分析時，期望試樣中的基質蛋白質的幾乎全部的量固定於多孔體。因此，相對於試樣中的基質蛋白質的推測含量，較佳為以多孔體的量為過量的方式設定量比。
[蛋白酶]
蛋白酶15識別基質蛋白質的胺基酸序列，並選擇性地切割特定序列的特定結合。在本發明中，蛋白酶15在特定胺基酸序列部位切割固定於多孔體20的細孔29內的基質蛋白質25，而獲得胜肽片段。
作為蛋白酶，可列舉：胰蛋白酶(在鹼性胺基酸殘基(Arg 及Lys)的C末端側切割胜肽)、賴胺醯肽鏈內切酶(Lysyl Endopeptidase)(在Lys殘基的C末端側切割胜肽)、精胺酸肽鏈內切酶(在Arg殘基的C末端側切割胜肽)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)(在芳香族胺基酸殘基(Phe、Tyr及Trp)的C末端側切割胜肽)、V8蛋白酶(在Glu殘基的C末端側切割胜肽)、胃蛋白酶、木瓜酶等。另外，蛋白酶亦可組合2種以上而使用。
在將蛋白酶消化後的基質蛋白質的胜肽片段作為測定 資料而供於質譜時，較佳為使用自體分解少、切割序列的選擇性高的蛋白酶。在使用市售的蛋白酶時，較佳為使用質譜等級或序列測定(sequence determination)(序列(sequence))等級的蛋白 酶。例如已知，源自有機體的天然胰蛋白酶藉由自體分解而生成表現出類胰凝乳蛋白酶的活性的假胰蛋白酶，因此切割部位的特異性低。因此，作為質譜等級，市售有將胰蛋白酶的離胺酸殘基進行還原甲基化而提高對自體分解的抵抗性者。
為了提高基質蛋白質的蛋白酶消化的位置選擇性，重要 的是限定蛋白酶可進入至基質蛋白質的區域。因此，較佳為蛋白酶的分子直徑小於基質蛋白質的分子直徑。更具體而言，蛋白酶的分子直徑較佳為10nm以下，更佳為8nm以下，尤佳為6nm以下，特佳為5nm以下。另外，胰蛋白酶或賴胺醯肽鏈內切酶等分子量為30kDa左右的蛋白質的分子直徑為4nm左右(參照上述的表1)。
在上述蛋白酶中，在本發明中，特佳為使用胰蛋白酶。 如上述般，胰蛋白酶的分子直徑小、且活性部位存在於分子的內部。因此，限制活性部位可進入至基質蛋白質的區域，而可提高蛋白酶消化的位置選擇性。特別是在基質蛋白質為抗體時，較佳為使用胰蛋白酶作為蛋白酶。
在蛋白質組(Proteome)解析研究中，作為提高胜肽片 段的回收率的技術，近年來著眼於藉由胰蛋白酶與賴胺醯肽鏈內切酶的混合消化(「蛋白質組研究(J.Proteome Res.)」,2012,11(11),5145-5156)。其原因認為，相對於胰蛋白酶具有自立體結構的外側分階段地進行分解反應的特徵，而賴胺醯肽鏈內切酶主要最先切割抗體的鉸鏈區域。相對於此，為了抑制抗體的鉸鏈區域的切 割，並選擇性地切割Fab區域(更佳為Fab區域的V區域)，在本發明中，在單獨使用胰蛋白酶，或併用賴胺醯肽鏈內切酶等時，亦較佳為將全部蛋白酶中的胰蛋白酶的量設為90%以上。
[微粒子]
微粒子10是為了在其表面固定蛋白酶15，控制蛋白酶進入至固定於多孔體20的細孔29內的基質蛋白質25而使用。因此，為了不進入至多孔體20的細孔29的深部，微粒子10較佳為其平均粒徑D1大於多孔體20的平均細孔徑D2。微粒子10的平均粒徑D1更佳為多孔體20的平均細孔徑D2的1.2倍以上，尤佳為1.5倍以上，特佳為1.8倍以上。
微粒子10的形狀並無特別限定，就使蛋白酶均勻地進 入至多孔體20的細孔29的觀點而言，較佳為球狀微粒子。另外，微粒子10較佳為平均粒徑均勻。
在多孔體20的平均細孔徑為30nm~150nm左右時， 微粒子10的平均粒徑D1較佳為100nm以上，更佳為150nm以上。在基質蛋白質25為抗體、且多孔體20的平均細孔徑為50nm~100nm左右時，微粒子10的平均粒徑較佳為120nm以上，更佳為150nm以上，特佳為170nm以上。微粒子10的平均粒徑D1的上限並無特別限定，就提高藉由蛋白酶的消化效率的觀點而言，較佳為1μm以下，更佳為500nm以下，尤佳為300nm以下。
微粒子10若為可將上述蛋白酶固定於表面者，則其材 質並無特別限定，可適當使用金屬或樹脂等。另外，亦可使用： 藉由樹脂被覆金屬表面者、或藉由金屬被覆樹脂表面者等。
微粒子10較佳為抑制非特異性的蛋白質吸附於表面、 且可將蛋白酶選擇性地固定者，例如如圖1所示般，可較佳地使用：微粒子的表面藉由與蛋白酶特異性地結合的間隔體11修飾的微粒子。間隔體較佳為可與蛋白酶結合，且不會使蛋白酶失活者。
另外，就控制固定於微粒子10表面的蛋白酶15的進入 範圍的觀點而言，間隔體11較佳為分子直徑小者。間隔體的分子直徑較佳為5nm以下，更佳為3nm以下，尤佳為2nm以下。另外，間隔體的分子量較佳為2000以下，更佳為1500以下，尤佳為1000以下，特佳為800以下。能以上述分子直徑將蛋白酶固定的間隔體分子，較佳為非蛋白質，且較佳為具有胺基、醯胺基、酯基、環氧基、羧基、生物素、抗生素蛋白、螯合物等官能基的分子。例如，胰蛋白酶的固定較佳為使用具有酯基的間隔體。另外，為了提高蛋白酶的固定化效率，將酯基活化的分子亦可較佳地用作間隔體。
在本發明中，亦可使用藉由間隔體分子修飾的微粒子的 市售品。例如，作為親和純化用微粒子，作為商品名「FG beads NHS」市售有藉由利用N-羥基琥珀醯亞胺將酯基活化的間隔體分子修飾的微粒子。
[蛋白酶固定化微粒子的調製]
將蛋白酶15固定於微粒子10的表面的方法並無特別限定，可根據蛋白酶與微粒子(或修飾微粒子表面的間隔體分子)的特 性等而採用適當的方法。例如在將胰蛋白酶固定於經間隔體修飾的微粒子表面時，藉由將微粒子的懸浮液與包含胰蛋白酶的溶液混合，而可在微粒子表面固定蛋白酶。
在微粒子表面固定蛋白酶後，較佳為使微粒子表面的未 與蛋白酶結合的活性部分滅活。例如，若在微粒子表面存在未固定蛋白酶的間隔體分子，則有產生以下問題的情況：未結合的間隔體分子與試樣中的夾雜物等結合，而對蛋白酶消化造成不良影響，或者藉由蛋白酶消化而產生的胜肽片段固定於微粒子等。在固定蛋白酶後，藉由將未結合的間隔體封端，而抑制此種問題。 作為使未與蛋白酶結合的活性部分滅活的方法，較佳為化學修飾。例如活化酯基藉由與胺的反應而形成醯胺鍵而滅活。
[蛋白酶消化]
藉由使固定有基質蛋白質25的多孔體20與將蛋白酶15固定於表面的微粒子10在液體中接觸，而將基質蛋白質進行蛋白酶消化，並產生胜肽片段。
本發明中的蛋白酶消化的條件並無特別限定，可適當採 用與通常的蛋白酶消化相同的條件。例如，較佳為在調整至蛋白酶的最適pH值附近的緩衝溶液中，通常在37℃左右的溫度下，進行4小時~20小時左右的培養(incubate)。
固定有基質蛋白質的多孔體與將蛋白酶固定於表面的 微粒子的混合量比亦並無特別限制，只要以成為與基質蛋白質的量對應的蛋白酶量的方式進行設定即可。另外，通常的蛋白酶消 化條件是基質：蛋白酶=100：1~20：1(重量比)左右。相對於此，在本發明中，藉由多孔體與微粒子的組合，而物理性地限制基質蛋白質與蛋白酶的進入，因此與通常的蛋白酶消化相比，較佳為增加蛋白酶量。例如，較佳為基質蛋白質：蛋白酶=30：1~3：1左右，更佳為15：1~4：1左右，尤佳為10：1~5：1左右。
通常，在將血液等有機體試樣中的抗體進行選擇性地蛋 白酶消化時，首先需要將固定有蛋白G等的粒子與試樣混合，而在粒子上固定抗體，將夾雜物除去後，使抗體自粒子溶出，藉由脲或胍使溶出後的抗體變性，而進行蛋白酶消化。相對於此，在本發明的方法中，在將抗體固定於多孔體的狀態下進行蛋白酶消化。另外，由於藉由蛋白酶消化而產生的胜肽片段存在於液相內，因此不進行抗體的溶出或變性操作而可位置選擇性地獲得Fab區域的胜肽片段。如此，根據本發明的方法，可藉由比先前方法簡便的操作、且位置選擇性進行胜肽片段的回收。
[胜肽片段調製用套件]
亦可使用預先準備的胜肽片段調製用套件，進行本發明的胜肽片段的調製。本發明的胜肽片段調製用套件包含：具有可將基質蛋白質固定的細孔的多孔體、及可將蛋白酶固定於表面的微粒子。套件可進一步包含蛋白酶。另外，可提供將蛋白酶固定於表面的狀態的微粒子。
圖3是表示本發明的胜肽片段調製套件的一個實施形態的圖。在圖3中，可將蛋白酶固定於表面的微粒子110作為懸浮 液131而提供。套件可進一步包含蛋白酶。另外，微粒子110能以將蛋白酶固定於表面的狀態提供。旋轉管柱132包含內容器135與外容器136，該些形成為可裝卸的形狀。在內容器135的底部，配置具有可將基質蛋白質固定的細孔的多孔膜120。多孔膜120具有在常壓下不透過液體的程度的細孔徑。
在使用該旋轉管柱進行胜肽片段的調製時，首先，將包 含基質蛋白質的試樣(例如血液等檢體)加入至旋轉管柱的內容器135內，使試樣與多孔膜接觸。為了使試樣與多孔膜均勻地接觸，可根據需要將容器振盪。藉由該操作，而在多孔膜120的細孔內，將抗體等基質蛋白質固定。
將基質蛋白質固定於多孔膜後的試樣液體，較佳為自內 容器135排出。藉由移液(pipetting)等操作，而可自內容器的開口部排出液體，亦可藉由離心分離等而經由多孔膜自內容器的底部將液體排出。然後，根據需要藉由適當的溶液進行清洗。
在將基質蛋白質固定於多孔膜120的內容器135內，添 加將蛋白酶固定於表面的微粒子110。如上述般，蛋白酶能以預先固定於微粒子的狀態提供，亦可在將要使用前在微粒子表面固定蛋白酶而使用。
為了使蛋白酶消化條件最佳化等，可根據需要進一步添 加緩衝液等溶液。內容器內的固定於多孔膜120的基質蛋白質，藉由固定於微粒子110表面的蛋白酶進行消化。蛋白酶消化的條件如上述般可適當設定。藉由蛋白酶消化而產生的胜肽片段移動 至液相內。
藉由回收蛋白酶消化後的液相，而可獲得將基質蛋白質 進行位置選擇性地切割的胜肽片段。液相的回收方法並無特別限定，藉由離心分離經由多孔膜自內容器135的底部回收至外容器136內的方法簡便。然後，為了使保持於多孔膜的細孔內的胜肽片段溶出等，可進行清洗或溶出等操作等。
如此，藉由使用套件，可更簡便地進行本發明的胜肽片 段調製的操作，藉由裝置的自動化亦可容易地進行。特別是胰蛋白酶等在固定於微粒子表面的狀態下亦可保持活性，因此若在將蛋白酶固定於微粒子表面的狀態下作為套件的構成要素而提供，則可進一步簡化胜肽片段調製的操作。
[分析]
藉由層析法或質譜對上述所得的包含胜肽片段的試樣進行分析，而可進行基質蛋白質的鑑定或定量。在本發明中，為了將基質蛋白質進行位置選擇性地蛋白酶處理，而減少試樣中所含的胜肽片段的種類。因此，可容易進行藉由質譜等的分析條件的設定。在分析時，可根據需要在進行脫鹽、可溶化、萃取、濃縮、乾燥等處理後，將試樣用於分析。
由藉由蛋白酶消化而產生的胜肽片段進行基質蛋白質的鑑定或定量時，適合的是質譜。由於質譜可確定胺基酸序列，因此可判別胜肽片段是否為源自抗體等特定蛋白質的胜肽片段。另外，可根據峰值強度確定試樣中的胜肽片段的濃度。
質譜中的離子化法並無特別限定，可採用：電子遊離 (Electron Ionization，EI)法、化學離子化(Chemical Ionization，CI)法、電場解吸(Field Desorption，FD)法、快速原子轟擊(Fast Atom Bombardment，FAB)法、基質輔助雷射脫附遊離(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)法、電噴霧離子化(Electrospray Ionization，ESI)法等。經離子化的試樣的分析方法亦無特別限定，可根據離子化法適當確定磁場偏向型、四極(Q)型、離子阱(Ion Trap，IT)型、飛行時間(Time Of Flight，TOF)型、傅里葉變換離子迴旋共振(Fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance，FT-ICR)型等。另外，亦可使用三聯四極型(Triple-quadrupole)質譜裝置等，進行MS/MS分析、或MS3以上的多階段質譜。
為了更確實地使胜肽片段分離，而提高分析精度等，可 藉由液相層析法(Liquid Chromatography，LC)、或固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)等，將供於質譜之前的上述試樣進行分離、濃縮。在藉由LC進行試樣的分離時，可使用具備LC的LC/MS作為質譜的前一階段，將來自LC的溶出液直接離子化而供於質譜。亦可藉由將LC與串聯式質譜組合的LC/MS/MS或LC/MSn而進行分析。另外，亦可將來自LC的溶出液一次性分取後，供於質譜。LC的管柱或SPE的載體並無特別限定，可適當選擇使用：在胜肽的分析中通常所使用的C30、C18、C8、C4等疏水管柱，或親水性親和層析法用載體等。
為了根據質譜結果，鑑定抗體等蛋白質，亦可使用已有 的資料庫。在本發明中，由於使用將抗體等基質蛋白質進行位置特異性地蛋白酶消化的胜肽片段，因此可提高藉由資料庫檢索的命中率(hit ratio)或資料的可靠度。另外，藉由利用多階段的質譜等，確定胜肽片段的胺基酸序列，而亦可鑑定基質蛋白質。例如，在基質蛋白質為抗體時，若確定包含對抗體具有特異性的胺基酸序列的互補性決定區域(CDR)的至少一部分的胺基酸序列的胜肽片段的酸序列，則可鑑定抗體。
另外，在根據包含CDR的序列的特定胜肽片段的檢測 結果，進行抗體的檢測或定量時，檢測對象的胜肽的胺基酸殘基數較佳為5~30左右，更佳為7~25左右。若胺基酸殘基數過小，則難以與源自夾雜物或同一蛋白質的另外部位的胜肽片段相區別，可成為錯誤檢測(misdetection)等的原因。另外，若胺基酸殘基數過大，則由於難以離子化等的理由，而有難以檢測、或定量性降低的情況。
在將基質蛋白質的濃度進行定量時，可根據所檢測的胜 肽片段離子(在為多階段MS時，藉由胜肽片段離子的開裂而得的開裂離子)的峰值面積或峰值強度，算出基質蛋白質的量。例如，根據預先求出的校準曲線(校正曲線)與峰值面積的關聯(association)、或源自添加於試樣中的內部標準的峰值面積與源自試樣的峰值面積的關聯等，算出試樣中的胜肽片段的濃度，並根據胜肽片段濃度，算出基質蛋白質的量或濃度。
如以上所說明般，根據本發明，藉由將基質蛋白質與蛋 白酶這兩者固定為固相，並物理性地控制兩者的進入，而可將基質蛋白質的特定部位進行位置選擇性地蛋白酶消化。所得的胜肽片段可藉由質譜法等已知的方法進行分析，可不經過複雜的步驟而進行試樣中的蛋白質的鑑定或定量。
本發明的方法特別適合於抗體的檢測或定量，藉由將 Fab區域進行選擇性地蛋白酶消化而得的胜肽片段試樣的質譜，而可確定包含互補性決定區域的胺基酸序列的胜肽片段的序列或量。另外，本發明的方法操作簡便、且可確保再現性或定量性，並且可進行自動化，因此亦可應用於藥物動態的解析、使用抗原抗體反應的相互作用的解析、各種相互作用組(interactome)解析、免疫沈澱蛋白質的鑑定等基礎研究。此外，亦可期待應用於抗體醫藥等有機體分子醫藥的序列解析、品質保證、通用名藥的同一性確認等。
實施例
以下，表示藉由本發明的方法，將人類免疫球蛋白G(IgG)及曲妥珠單抗(商品名：Herceptin)進行蛋白酶消化，將所得的胜肽片段試樣供於質譜的實驗例。另外，本發明並不限定於以下的例子。
以下，%的記載只要無特別說明，則表示重量%。本實驗例中所使用的試劑等如下所述。
胰蛋白酶(測序級(sequencing grade)、普洛麥格 (promega))
賴胺醯肽鏈內切酶(質譜等級、和光純藥工業)
2-嗎啉基乙磺酸(MES、同人化學)
2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES、同人化學)
三(羥基甲基)胺基甲烷(Tris、和光純藥工業)
上述以外的有機溶劑等並未特別記載者，自和光純藥工業獲得。
另外，各緩衝液是使用利用精密pH計調整了pH值的以下緩衝液。
MES緩衝液：25mM MES-NaOH、pH值5.5
HEPES緩衝液：25mM HEPES-NaOH、pH值7.0
乙醇胺緩衝液：1M乙醇胺-HCl、pH值8.0
Tris緩衝液：25mM Tris-HCl、pH值8.0
<抗體固定化多孔體的製作>
在MES緩衝液200μL中，添加在多孔質顆粒的表面結合蛋白G的樹脂顆粒的懸浮液(皮斯生物技術(Pierce Biotechnology)、蛋白G UltraLink樹脂、平均粒徑：100μm、細孔徑：50nm~100nm)5μL，於其中添加抗體溶液後，在室溫下緩慢攪拌約1小時，使抗體結合於樹脂顆粒表面的蛋白G上並固定。然後，在4℃下進行離心(15000rpm、1分鐘)使樹脂顆粒沈澱，去除上清液後，重複2次的藉由Tris緩衝液的清洗與離心，使多孔質顆粒懸浮在Tris緩衝液(200μL)中。另外，作為上述抗體溶液，是使用人類 免疫球蛋白(IgG)溶液(10mg/mL、西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich))、及曲妥珠單抗(Herceptin、20mg/mL、中外製藥)溶液。
<固定蛋白酶的微粒子的調製>
使用平均粒徑為190nm的微粒子的表面由藉由N-羥基琥珀醯亞胺將羧基活化的間隔體(參照下述化學式(L為在微粒子表面的結合部位)、間隔體長度為1nm)修飾的蛋白酶固定化用奈米微粒子(多摩川精機、FG beads NHS)。
將FG beads的異丙醇懸浮液50μL在4℃下進行離心(15000rpm、5分鐘)使微粒子沈澱，去除上清液後，藉由甲醇清洗。將包含50μg的蛋白酶的溶液溶解於200μL的HEPES緩衝液中，將所得的溶液添加至上述微粒子使微粒子懸浮。另外，在懸浮時，以懸浮液的溫度不上升的方式，進行數秒鐘的超音波處理。
將該微粒子的懸浮液在4℃下攪拌30分鐘，並在4℃下進行離心(15000rpm、5分鐘)使微粒子沈澱，去除上清液後， 添加乙醇胺緩衝液200μL使顆粒懸浮，在4℃下攪拌30分鐘，藉由乙醇胺將微粒子表面的多餘的N-羥基琥珀醯亞胺基封端。然後，在4℃下進行離心(15000rpm、5分鐘)使微粒子沈澱，去除上清液後，重複2次的藉由Tris緩衝液的清洗與離心，並懸浮於Tris緩衝液(100μL)中。該懸浮液中的蛋白酶濃度為0.5μg/μL。
[實驗1：在多孔體上的抗體固定化量的確認]
在抗體固定化多孔體的製作中，在0μL~20μL的範圍內改變相對於100μg的IgG的蛋白G結合樹脂顆粒懸浮液的量，藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)電泳對上清液進行分析，根據電泳圖像帶狀畫素(band pixel)數量，求出上清液中所殘留的未結合IgG的估計量(抗體殘留量)。隨著蛋白G結合樹脂顆粒量的增加，而見到抗體殘留量降低的傾向，蛋白G結合樹脂顆粒量為10μL時的抗體殘留量為約3%，可確認大致再現了蛋白G結合樹脂顆粒的目錄規格(資料未圖示)。
[實驗2：抗體與蛋白酶的量比的研究]
將IgG固定化多孔體懸浮液(蛋白G-IgG)與蛋白酶固定化微粒子(FG beads-胰蛋白酶)混合，一邊在37℃下緩慢攪拌15小時，一邊進行蛋白酶消化。然後，在4℃下進行離心(15000rpm、5分鐘)使樹脂沈澱，並回收液相(上清液)。以蛋白酶的量為5μg(水準1)、10μg(水準2)、25μg(水準3)的方式，改變蛋白酶固定化微粒子的量進行上述實驗。在水準4~水準6中，代替 IgG固定化多孔體懸浮液，而直接使用未固定IgG的多孔體(蛋白G UltraLink樹脂)進行同樣的實驗。另外，在水準7、水準8中，不使用多孔體，而僅將蛋白酶固定化微粒子(FG beads-胰蛋白酶)在37℃下培養15小時。
將上述各實驗的水準表示於表2。表2中的重量(μg)是試樣中的蛋白質(IgG或胰蛋白酶)的量。將所得的上清液的SDS-PAGE電泳圖像表示於圖4。圖4中，左端的條帶(lane)是分子量標記。
(質譜)
藉由MALDI-TOFMS(島津製作所、AXIMA Resonance MALDI-QIT TOF MS)，對上述水準1~水準6的上清液進行分析。首先，在上清液20μL中以最終濃度為0.5%的方式添加三氟乙酸，使用疏水性樹脂填充晶片(密理博(Millipore)、ZipTip uC18)進行純化後，藉由1μL進行2次溶出。溶出液直接應用(apply)於 MALDI不鏽鋼靶上，在潔淨台(clean bench)內風乾。風乾後，將10mg/mL的2,5-二羥基苯甲酸溶液(DHBA、島津GLC、水/乙腈=50/50)重層1μL並進行質譜。另外，裝置的m/z是使用血管緊張素(angiotensin)II胜肽(m/z=1046.54、西格瑪奧德里奇)與ACTH片段胜肽(m/z=2465.20、西格瑪奧德里奇)進行。將MS光譜表示於圖5。
圖4的水準4~水準6的帶均與水準7、水準8的帶相 同。另外，圖5的水準4~水準6中所檢測到的m/z=842、1045、2211、2283的峰值均為胰蛋白酶的自體分解片段。根據該些結果可知，即便使蛋白酶固定化微粒子與蛋白G多孔體接觸，蛋白G亦不會被消化。其原因認為，由於多孔體的細孔徑小於蛋白酶固定化微粒子的粒徑，因此固定於微粒子表面的胰蛋白酶無法進入至細孔內的蛋白G。
圖5的水準1~水準3中，除了胰蛋白酶的自體分解片 段以外，檢測到m/z=835、913、1187、1287、1510、1678、1946的峰值，並確認到該些均為IgG的胰蛋白酶消化胜肽片段。根據該結果，表示藉由使固定了IgG的多孔體與固定了胰蛋白酶的微粒子接觸，可選擇性地消化IgG而不消化多孔體的蛋白G。
若將圖4的水準1~水準3進行對比，則可知，隨著胰蛋白酶量的增加，高分子側的帶減少，抗體的消化反應較佳地進行。另一方面，隨著胰蛋白酶量的增加而自體分解亦變得顯著。根據該些結果，將水準2(基質：酶比率=10：1)設定為標準條件， 進行以下的條件研究。
另外，通常的蛋白酶消化條件是基質蛋白質：蛋白酶 =100：1~20：1。在本方法中，藉由多孔體與微粒子的組合，而物理性限制基質蛋白質與蛋白酶的進入，因此與通常的蛋白酶消化相比，蛋白酶量變多，最佳的基質酶比率推測為10：1~5：1左右。
[實驗3：相對於消化時間的回收胜肽的評價]
在上述實驗2的水準2的條件、即將IgG固定化多孔體懸浮液(IgG固相量為100μg)與蛋白酶固定化微粒子(胰蛋白酶固相量為10μg)混合，將在37℃下的消化時間設為(1)15分鐘、(2)45分鐘、(3)90分鐘、(4)180分鐘、(5)360分鐘、(6)15小時(整夜、0/N)。除此以外，以與上述實驗2相同的方式，進行胰蛋白酶消化，並進行所得的試樣的質譜。將MS光譜表示於圖6。
如圖6所示般可知，隨著消化時間的增加，胜肽片段的 峰值增大，並且胜肽片段的回收量增加。若將(5)360分鐘與(6)整夜進行比較，則整夜的回收率高，特別是可見m/z=1187、1510、1678等容易受到蛋白酶消化的片段的聚集變得更顯著的傾向。但是，該些片段是源自抗體的C區域的片段，無助於包含CDR的胜肽片段的分析。因此，將蛋白酶消化時間設定為6小時而進行以下的研究。
[實驗4：曲妥珠單抗的胰蛋白酶消化及質譜]
使用Herceptin代替IgG作為抗體而製作抗體固定化多孔體，在上述實驗2、實驗3中所選擇的條件、即相對於抗體固相量100μg的蛋白酶固定微粒子量：10μg、消化時間：6小時的條件下，進行胰蛋白酶消化並進行質譜，根據質譜結果，進行資料庫(Mascot server)解析。如圖7所示般可知，以極高的評分鑑定Herceptin(鏈B、源自三個人類抗-P185-Her2抗體4d5的變種的抗原結合區域的X射線結構及分子模型對比)。
在本實驗中，為了確認藉由質譜檢測Herceptin的胜肽 片段，而進行更詳細的分析。圖8表示質譜(MALDI-TOFMS)光譜。
另外，藉由LC-MS(島津製作所、LCMS-8080三聯四 極型超高效液相層析質譜儀)，進行消化後的上清液的分析。將LC-MS的層析圖表示於圖9，將MS光譜表示於圖10。另外，在LC-MS的測定時，以最終濃度為0.5%的方式，在上清液中添加甲酸，使用所得的溶液作為試樣，LC條件設為如以下所述。
<HPLC溶液>
溶液A：0.1%甲酸、1%乙腈/水溶液
溶液B：0.1%甲酸、乙腈溶液
<管柱>
ShimPack ODS XR-ODS II(內徑為2mm、管柱長度為50mm)
管柱溫度：40℃
流速：0.4mL/分鐘
注入(injection)量：20μL
<梯度程式>(gradient program)
0分-2分：%B=0
2分-10分：%B=0-40梯度
10分-11分：%B=40-98梯度
11分-13分：%B=98
13分-13.5分：%B=98-0梯度
13.5分-15分：%B=0
在曲妥珠單抗的重鏈(圖11(A)、序列表的序列編號1)及輕鏈(圖11(B)、序列表的序列編號2)中，藉由下劃線表示藉由上述質譜檢測、鑑定的胜肽序列部分。如圖11(A)所示般可知，檢測到重鏈的CDR1(序列表的序列編號3)、CDR2(序列表的序列編號4)、CDR3(序列表的序列編號5)的全部。另外，如圖11(B)所示般，在輕鏈中，檢測到CDR1(序列表的序列編號6)及CDR2(序列表的序列編號7)。輕鏈的CDR3(序列表的序列編號8)是包含該序列的胰蛋白酶消化片段的長度為4個胺基酸殘基或37個胺基酸殘基，無法獲得適於質譜的片段，因此無法鑑定，但若變更蛋白酶的種類，則認為可調製可藉由質譜檢測輕鏈的CDR3的胜肽片段。另外，在本實驗中，雖然無法檢測到輕鏈的CDR3，但檢測到重鏈與輕鏈的合計為6個的CDR中的5個，因此如圖7所示般，藉由資料庫解析而鑑定曲妥珠單抗。
如以上所述可知，藉由本發明的方法而調製的胜肽片 段，是將抗體進行位置特異性地蛋白酶消化者，因此藉由無須複雜的測定條件的設定的質譜測定，可鑑定抗體。
[實驗5：混合蛋白酶消化的研究]
以下，為了研究本發明的體系中的混合蛋白酶消化的可應用性，而藉由胰蛋白酶與賴胺醯肽鏈內切酶(Lys-C)的併用體系，進行蛋白酶消化實驗。
以與上述各實驗例相同的方式，將使抗體(IgG或 Herceptin)100μg固定於多孔體的蛋白G的抗體固定化多孔體與固定了10μg蛋白酶的微粒子在37℃下攪拌6小時，進行抗體的蛋白酶消化。對於使用IgG作為抗體的情形及使用Herceptin作為抗體的情形的各情形，將胰蛋白酶與賴胺醯肽鏈內切酶的比(重量比)設為(1)10：0、(2)9：1、(3)8：2、(4)0：10而進行實驗，藉由SDS-PAGE電泳對消化後的上清液液及多孔體表面的固定化成分分別進行分析。將電泳圖像表示於圖12。圖12中，左端的條帶是分子量標記。
以與上述實驗2相同的方式，對在使用Herceptin作為 抗體時的上述水準1~水準4的消化後的上清液進行質譜。將MS光譜表示於圖13。另外，根據質譜結果，以與實驗4相同的方式進行藉由Mascot server的資料庫解析。另外，水準1(胰蛋白酶為100%)與上述實驗4(圖7及圖8)相同。水準2~水準4的資料庫解析結果如以下所述(資料未圖示)
<水準2：胰蛋白酶：賴胺醯肽鏈內切酶=90：10>
混合物
gi|442924質量(mass)：23708評分(score)：117期望(expect)：4.9e-007匹配(matches)：13
鏈B、源自三個人類抗-P185-Her2抗體4d5的變種的抗原結合區域的X射線結構及分子模型對比
gi|184747質量：36012評分：64期望：0.11匹配：10
免疫球蛋白γ-1重鏈連續區域[智人]
<水準3：胰蛋白酶：賴胺醯肽鏈內切酶=80：20>
混合物
gi|442924質量：23708評分：115期望：7.8e-007匹配：13
鏈B、源自三個人類抗-P185-Her2抗體4d5的變種的抗原結合區域的X射線結構及分子模型對比
gi|184747質量：36012評分：54期望：1.1匹配：9
免疫球蛋白γ-1重鏈連續區域[智人]
<水準4：賴胺醯肽鏈內切酶100%>
gi|184747質量：36012評分：71期望：0.021匹配：8
免疫球蛋白γ-1重鏈連續區域[智人]
在併用胰蛋白酶與賴胺醯肽鏈內切酶的水準2、水準3中，作為解析結果，除了Herceptin的抗原結合區域外，表示源自人類的抗體的恆定區域。另外，在僅使用賴胺醯肽鏈內切酶的水準4中，表示不包含Herceptin，而僅優異地檢測到抗體的恆定區 域的解析結果。
在圖12的電泳圖像中可知，隨著賴胺醯肽鏈內切酶比 率的上升，而有上清液的胜肽片段的數量增加，帶面積亦增加的傾向，並且消化效率及胜肽回收率增大。另外，在圖13中，隨著賴胺醯肽鏈內切酶的比率的上升，而所檢測的胜肽片段的種類或量增加。但可知，在水準2~水準4中新檢測到的胜肽片段大多是源自Herceptin的Fc區域者，蛋白酶消化的位置選擇性(將Fab區域進行選擇性地消化的特性)降低。
根據該些結果可以看出如下傾向：隨著賴胺醯肽鏈內切 酶的使用量增大，而抗體的消化效率提高，蛋白酶消化的位置選擇性降低，隨著恆定區域的胜肽片段的產生量增大，而V區域的胜肽片段的相對的產生量減少，因此抗體的檢測、鑑定精度降低。 因此，藉由本發明的方法，就進行抗體的Fab區域的位置選擇性切割，並進行CDR的特異性檢測的觀點而言，較佳為單獨使用胰蛋白酶，在併用胰蛋白酶與賴胺醯肽鏈內切酶時，可以說較佳為將賴胺醯肽鏈內切酶的混合量設為10%以下。
另外可知，在僅使用賴胺醯肽鏈內切酶的水準4中，未 進行部位特異性消化，相對於此，在僅使用胰蛋白酶的水準1(實驗4)中，藉由資料庫解析而有效地檢測CDR，因此將Fab區域的V區域進行選擇性地蛋白酶消化。根據以上結果可以說表示出，在基質蛋白質為抗體時，若使用胰蛋白酶而應用本發明，則可恰當地控制蛋白酶對於抗體的立體性的進入，而可進行位置選 擇性的蛋白酶消化。
另外，根據本實驗而表示出，在併用胰蛋白酶與賴胺醯 肽鏈內切酶時，各蛋白酶不會喪失其功能，而可將固定於細孔內的基質蛋白質進行切割。抗體由於V區域存在於分子的前端，因此有若賴胺醯肽鏈內切酶的使用量增加，則位置特異性降低的傾向，但暗示如下的可能性：在使用其他蛋白質作為基質時，藉由蛋白酶的併用體系，而可謀求位置選擇性或消化效率的提高。
以上，如藉由各實驗例進一步所示般可知，根據本發 明，可藉由簡便的方法將抗體等蛋白質進行位置選擇性地蛋白酶消化而獲得胜肽片段試樣，所得的胜肽片段試樣適合於藉由質譜的蛋白質的鑑定或檢測。
<110> 島津製作所股份有限公司
<120> 胜肽片段的調製方法、使用於該方法的胜肽片段調製用套件以及分析方法
<140> 103119967
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<160> 8
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗的重鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗的輕鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗的重鏈的CDR1
<400> 3
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗的重鏈的CDR2
<400> 4
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗的重鏈的CDR3
<400> 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗的輕鏈的CDR1
<400> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗的輕鏈的CDR2
<400> 7
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗的輕鏈的CDR3
<400> 8
10‧‧‧微粒子
11‧‧‧間隔體
15‧‧‧蛋白酶
20‧‧‧多孔體
21‧‧‧連接子分子
25‧‧‧基質蛋白質
29‧‧‧細孔
D1‧‧‧平均粒徑
D2‧‧‧平均細孔徑

Claims (13)

  1. 一種胜肽片段的調製方法，其特徵在於包括：基質固定步驟，將切割對象的基質蛋白質固定於多孔體的細孔內；以及消化步驟，使固定有上述基質蛋白質的上述多孔體與蛋白酶固定於表面的微粒子在液體中接觸，而進行上述基質蛋白質的蛋白酶消化，上述微粒子的平均粒徑大於上述多孔體的平均細孔徑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽片段的調製方法，其中在上述基質固定步驟中，上述基質蛋白質的特定區域固定於上述多孔體，並位置選擇性地將與上述特定區域不同的區域進行蛋白酶消化。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之胜肽片段的調製方法，其中在上述多孔體的細孔內，固定與上述基質蛋白質發生部位特異性相互作用的連接子分子，在上述基質固定步驟中，上述基質蛋白質經由上述連接子分子而固定於上述多孔體的細孔內。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之胜肽片段的調製方法，其中上述微粒子的表面由可與上述蛋白酶結合的間隔體分子修飾，上述蛋白酶經由上述間隔體分子而固定於上述微粒子的表面。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之胜肽片段的調製方 法，其中上述基質蛋白質為抗體。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之胜肽片段的調製方法，其中上述抗體為單株抗體。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之胜肽片段的調製方法，其中在上述基質固定步驟中，上述抗體的Fc區域固定於上述多孔體，在上述消化步驟中，上述抗體的Fab區域藉由上述蛋白酶而位置選擇性地切割。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之胜肽片段的調製方法，其中上述蛋白酶為胰蛋白酶。
  9. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之胜肽片段的調製方法，其中上述多孔體的平均細孔徑為30nm~150nm，上述微粒子的平均粒徑為100nm以上。
  10. 一種胜肽片段調製用套件，其用於如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之胜肽片段的調製方法，且其特徵在於包含具有可將基質蛋白質固定的細孔的多孔體、以及可將蛋白酶固定於表面的微粒子，上述微粒子的平均粒徑大於上述多孔體的細孔徑。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之胜肽片段調製用套件，其中上述微粒子以在表面固定上述蛋白酶的狀態提供。
  12. 一種分析方法，其藉由質譜法對藉由如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之胜肽片段的調製方法而調製的胜肽片段進行分析。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之分析方法，其中分析對象的胜肽片段是包含抗體的互補性決定區域的至少一部分的胺基酸序列的胜肽片段。
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