JP6680357B2 - 容器セットおよびそれを用いた試料調製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、容器セットおよびそれを用いた分析用試料の調製方法に関する。
遠心濾過は、液体が濾過フィルターを透過することにより、固体と液体とを分離可能であるため、固液分離性に優れる。遠心濾過には、試料を装填するためのフィルターユニットと、フィルターユニットの濾過フィルターを透過した液体（濾液）を回収するための回収容器とを組み合わせた容器セット（遠心濾過キット）が用いられる。回収容器は、遠心分離機に装填可能な外形状を有しており、フィルターユニットと回収容器とを組み合わせた状態で遠心分離を行うことにより、試料中の液体成分を回収容器内に回収できる。
例えば、液体クロマトグラフィー用試料の前処理において、試料から粒子や沈殿物等の固体成分を除去するために、シリンジ濾過や遠心濾過が用いられている。濾過後の濾液は、そのまま試料として用いられる。
固体表面に結合した成分（Ｂｏｎｄ）と固体表面に結合していない成分（Ｆｒｅｅ）との分離（Ｂ／Ｆ分離）にも遠心濾過を適用できる。例えば、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）等の免疫測定法では、抗体と結合している抗原（Ｂｏｎｄ）と、抗体に結合していない抗原およびその他の夾雑成分（Ｆｒｅｅ）とを分離するために、Ｂ／Ｆ分離が行われる。対象試料が固体表面に固定されている場合は、遠心濾過後にフィルター上に残存した固体が回収される。これにより、対象試料が選択的に固体表面に固定され、固体に固定されていない夾雑成分は濾液として除去される。フィルターユニット内に残存した、対象物質が固定された固体成分は、適宜の方法により回収される。例えば、フィルターユニットに液体を加えて固体成分を懸濁させ、この懸濁液をピペットにより回収すればよい。
Ｂ／Ｆ分離を利用する試料の調製方法の例として、上述の免疫測定法の他に、ナノ粒子表面に固定されたプロテアーゼとの反応により、タンパク質を位置選択的に切断してペプチド断片を生成させる手法（nano-Surface and Molecular-Orientation Limited proteolysis; nSMOL法）が挙げられる（例えば、特許文献１、非特許文献１および非特許文献２）。
図８は、nSMOL法による試料調製および分析のフローチャートである。まず、抗体等の分析対象物質を選択的に固定可能な多孔質体を準備する（Ｓ１０）。例えば、プロテインＡやプロテインＧ等で被覆された多孔質体は、抗体のＦｃドメインと選択的に結合する。多孔質体の懸濁液に血液等の検体を添加すると、多孔質体の細孔内に抗体等の分析対象物質が選択的に固定される（Ｓ１１）。
多孔質体の表面には、膜タンパク質等の多種多様な夾雑物が付着している。これらの夾雑物を溶解除去するために、界面活性剤を含む溶液による洗浄が行われる（Ｓ２１）。遠心濾過により、洗浄後の固体（多孔質体）と界面活性剤を含む溶液とが分離される（Ｓ２２）。その後、界面活性剤を除去するためにＰＢＳ等の洗浄液による洗浄が行われる（Ｓ２３）。遠心濾過により、洗浄後の固体と洗浄液との分離が行われる（Ｓ２４）。
ナノサイズの微粒子の表面にトリプシン等のプロテアーゼが固定されたプロテアーゼ固定微粒子を準備し、液体中で、上記の固体と接触させる（Ｓ３１）。表面に抗体等の対象物質が固定された多孔質体とプロテアーゼ固定微粒子とが液体中に共存する状態で、例えば、温度３５〜６０℃で、３〜３０時間程度インキュベーションすることにより、プロテアーゼ消化が進行する（Ｓ３２）。プロテアーゼにより位置選択的に切断されたペプチド断片は、液体中に遊離する。
微粒子の粒子径が多孔質体の細孔径よりも大きい場合、微粒子表面に固定されたプロテアーゼは、多孔質体の細孔の表層付近（多孔質体と液相の界面付近）にはアクセスできるが、細孔の奥深い位置にはアクセスできない。そのため、プロテアーゼは、多孔質体の細孔内に固定化されたタンパク質の特定の部位に選択的にアクセスし、位置選択的な切断が行われる。
インキュベーション後に、プロテアーゼ消化により産生したペプチド断片が遊離した液体を回収し（Ｓ４１）、ＬＣ−ＭＳ等の分析により、タンパク質の同定および定量が行われる（Ｓ５１）。
この方法では、分析対象のタンパク質が位置選択的にプロテアーゼ消化されるため、液体試料中に含まれるペプチドの種類が少ない。例えば、多孔質体に抗体が結合している場合は、多孔質体との結合部位である抗体Ｆｃドメインへのプロテアーゼのアクセスが制限されているため、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＦａｂドメインが選択的にプロテアーゼにより切断される。そのため、分析用試料中には、抗体の構造同定に重要な相補性決定領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片が、生成ペプチド断片の全量に対して相対的に高濃度で含まれており、高精度の分析が可能である。
WO2015/033479号パンフレット
Iwamoto et. al, Anal. Methods, 2015, 21, 9177-9183. Iwamoto et. al, Bioanalysis, 2016, 8(10), 1009-1020.
上記の試料調製方法では、遠心濾過によりＢ／Ｆ分離を行った後、プロテアーゼ処理を実施して分析対象物質を液相中に遊離させ、分析用試料としての液体を回収する。前述のように、Ｂ／Ｆ分離による洗浄後の固体の回収は、一般にはピペット操作により実施される。ピペット操作では、フィルターユニットやピペットのチップ内に付着した固体が回収されずに残存する場合がある。そのため、操作者の熟練度等に起因して試料の回収率が異なり、定量分析の精度を低下させる要因となる。
特に、臨床現場等で同時に多数の検体を扱う場合は、作業にムラが生じ易く、操作が煩雑になるほど、ピペット操作等の作業者が介在する操作に起因する精度低下の影響が大きくなる。また、試料を別の容器に移動させる作業の回数が増加すると、回収ロスによる精度低下に加えて、試料の取り違え等のヒューマンエラーを生じるリスクが増大する。そのため、臨床試験等の分析用試料の調製においては、容器の移し替えの回数を可能な限り低減させることが好ましい。
遠心濾過により濾液を排出し、フィルターユニット内に固体を残存させ（図８のＳ２４）、フィルターユニット内にプロテアーゼ固定微粒子の懸濁液を添加すれば（図８のＳ３１）、ピペット操作等により固体を移動させることなく、フィルターユニット内でプロテアーゼ消化（図８のＳ３２）を実施できる。しかし、フィルターユニットの濾過フィルターには、０．１μｍ〜５μｍ程度の細孔が設けられているため、濾過フィルター上に貯留されている液体が、毛細管現象により、フィルターの細孔を介してリークする。通常の遠心濾過のような短時間の作業であれば、フィルターユニット内の液体がリークすることはないが、プロテアーゼ消化のように長時間の反応が行われる場合は、毛細管現象によるリーク量が大きく、試料のロスに伴い分析精度が低下する。
上記のように、遠心濾過によりＢ／Ｆ分離を実施後に、固体をフィルターユニットから他の容器に移動する操作を行うと、分析精度の低下を生じる場合がある。一方で、フィルターユニット内で固体と液体とを共存させた状態が長時間継続すると、液体のリークが生じる。かかる課題に鑑み、本発明は、固体をフィルターユニットから他の容器に移動せずに、固体と液体との混合物をフィルターユニット内で長時間保持した場合でも、液体のリークが生じ難い容器の提供、および試料調製方法の提供を目的とする。
本発明の容器セットは、フィルターユニット、およびフィルターユニットに着脱可能な閉鎖ユニットを含み、フィルターユニットと閉鎖ユニットとが接合した状態において、フィルターユニットの試料収容空間が陰圧となるように構成されている。
フィルターユニットは、筐体、および筐体内に固定された濾過フィルターを備え、筐体および濾過フィルターに囲まれた試料収容空間に、試料（液体および固体）を収容可能である。筐体の一端には、試料収容空間に固体および液体を導入するための試料導入開口が設けられている。試料導入開口は閉鎖可能でもよく、例えば、試料収容空間に試料を導入する際には試料導入開口を開放状態とし、それ以外の時は試料導入開口を閉鎖してもよい。筐体の他端には、濾過フィルターを透過して試料収容空間の外に移動した液体（濾液）を排出するための液体排出開口が設けられている。
フィルターユニットの筐体は、閉鎖ユニットと接合可能な第一接合部を有する。閉鎖ユニットは、フィルターユニットの第一接合部と接合可能に構成された第二接合部を有する。フィルターユニットの第一接合部と閉鎖ユニットの第二接合部は、両者が接合して気密状態となり、フィルターユニットの液体排出開口が閉鎖ユニットにより空間的に閉鎖されるように構成されている。また、第一接合部および第二接合部は、気密状態を維持したまま、濾過フィルターと閉鎖ユニットとの距離が短縮するようにさらに押し込み可能に構成されている。第一接合部と第二接合部とが接合した状態で、フィルターユニットと閉鎖ユニットとを両者の距離が近付くように押し込むことにより、閉鎖ユニットと濾過フィルターとの間の空間が、試料収容空間に対して陽圧となる。
容器セットは、フィルターユニットおよび閉鎖ユニットに加えて、フィルターユニットと着脱可能な液体回収容器を含んでいてもよい。液体回収容器は、遠心分離機に装填可能な外形状を有することが好ましい。閉鎖ユニットとの組み合わせ前、または閉鎖ユニットを脱離後のフィルターユニットを液体回収容器と組み合わせた状態で遠心濾過を行うことにより、フィルターユニットの濾過フィルターを透過した濾液を貯留できる。
本発明は、上記の容器セットを用いた分析用試料の調製方法を提供する。試料の調製は、検体中の特定の物質を固体表面に固定するステップ；遠心濾過により、固体表面に固定されていない夾雑成分を除去（Ｂ／Ｆ分離）するステップ；固体表面に固定された特定の物質から、回収対象物質を液体中に遊離させるステップ；および液体中に遊離した回収対象物質を回収するステップ、を順に有する。
回収対象物質は、固体表面に固定された特定の物質と同一でもよく、固体表面に固定された物質の反応物や分解物等でもよい。例えば、固体表面に抗体等のタンパク質が固定されている場合、溶液環境の変化により、固体表面からタンパク質を液体中に遊離させることができる。固体表面にタンパク質が固定された状態でプロテアーゼ消化を行うと、ペプチド断片が液体中に遊離する。
本発明の方法では、上記のフィルターを用いて遠心濾過を実施することにより、固体表面に固定されていない夾雑成分の除去が行われる。その後、フィルターユニットの試料収容空間に固体を保持した状態で、反応液等の液体を添加することにより、回収対象物質を液体中に遊離させる。すなわち、遠心濾過と、回収対象物質の液体中への遊離とが、同一のフィルターユニットを用いて実施される。
遠心濾過後に、フィルターユニットを閉鎖ユニットと接合することにより、フィルターユニットの液体排出開口が空間的に閉鎖された状態で、回収対象物質の液体中への遊離が行われる。
本発明の容器セットは、フィルターユニットと閉鎖ユニットとを組み合わせた状態では、閉鎖ユニットと濾過フィルターとの間の密閉空間が陽圧、フィルターユニットの試料収容空間が陰圧となるように構成されている。そのため、試料収容空間に液体を含む試料が装填されている場合でも、濾過フィルターを介した液体のリークを防止できる。
また、フィルターユニットから閉鎖ユニットを分離した状態では、フィルターユニットは遠心濾過フィルターとして使用可能である。そのため、試料を長時間保持する操作（例えば反応）と、洗浄や濾液回収等のための遠心濾過とを、同一のフィルターユニットを用いて実施可能である。このように、種々の操作を１つの容器内で実施可能であり、試料を別の容器に移動させる作業の回数を低減できるため、試料調製の作業を簡素化できることに加えて、定量分析等の分析精度を向上できる。
容器セットのフィルターユニットおよび閉鎖ユニットの概略斜視図である。 フィルターユニットの断面図である。 閉鎖ユニットの断面図である。 フィルターユニットと閉鎖ユニットとを組み合わせる途中の状態の断面図である。 フィルターユニットと閉鎖ユニットとを組み合わせた状態の断面図である。 容器セットのフィルターユニット、およびフィルターユニットに組み合わせ可能な液体回収容器の概略斜視図である。 容器セットのフィルターユニットおよび閉鎖ユニットの断面図である。 容器セットのフィルターユニットおよび閉鎖ユニットの断面図である。 容器セットのフィルターユニットおよび閉鎖ユニットの概略斜視図である。 ｎＳＭＯＬ法による試料調製および分析の概要を示すフローチャートである。
［容器セットの構成］
本発明の容器セットは、フィルターユニットおよび閉鎖ユニットを含む。閉鎖ユニットはフィルターユニットと着脱可能である。容器セットは、フィルターユニットと着脱可能な液体回収容器をさらに含んでいてもよい。
図１は、フィルターユニット１０および閉鎖ユニット３０からなる容器セットの一実施形態の概略斜視図であり、図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ、フィルターユニット１０および閉鎖ユニット３０の断面図である。
フィルターユニット１０は、一般的なスピンカラムのフィルターカップと同一または類似の構成であり、内壁面が円筒形状の筐体１１に、濾過フィルター２１が固定されている。筐体１１の一端には試料導入開口１８が設けられており、他端には液体排出開口１９が設けられている。濾過フィルター２１は、筐体１１の液体排出開口１９近傍に固定されており、筐体１１の内壁１２および濾過フィルター２１により囲まれた空間が試料収容空間１５を構成している。試料収容空間１５は、試料導入開口１８から導入された固体および液体を収容可能である。
フィルターユニット１０の試料導入開口１８は、試料導入時以外は閉鎖可能でもよい。例えば、図１に示す容器セットでは、閉鎖ユニット３０の本体部３１に、ヒンジ３４を介して蓋３８が結合されており、フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０とを組み合わせた状態において、蓋３８により試料導入開口１８を閉鎖可能である。フィルターユニットの筐体に、試料導入開口を閉鎖するための蓋が接続されていてもよく、フィルターユニットおよび閉鎖ユニットとは独立した蓋により試料導入開口を閉鎖してもよい。
濾過フィルター２１としては、例えば、ポリスルホン、アセチルセルロース、ニトロセルロース、ポリビニルピロリドン、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン等のポリマーからなる多孔質膜が用いられる。濾過フィルター２１は、試料収容空間１５内の液体を透過可能なフィルター孔を有する。フィルター孔の孔径は、試料収容空間１５内の固体が透過しないように、例えば０．１〜５μｍ程度に設定される。濾過フィルター２１は、接着剤による接着、熱融着、超音波融着等の接合や、Ｏリング等の固定リングを用いて、筐体１１内に固定されている。試料収容空間１５に固体と液体との混合物が含まれた状態で遠心濾過を行うと、濾過フィルター２１を透過した液体が、液体排出開口１９から、フィルターユニットの外部に排出される。
フィルターユニット１０の筐体１１は、外壁面１３がテーパ形状であり、閉鎖ユニット３０との接合側（図の下側）に向けて縮径している。このテーパ形状の外壁面１３が、フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０とを組み合わせる際の接合部となる。
閉鎖ユニット３０は、底部が閉じた筒状の本体部３１を有し、本体部３１の上面には、フィルターユニット１０を挿入するための接合用開口３６が設けられている。閉鎖ユニットの内壁面３２はテーパ形状であり、接合用開口３６側から底部に向けて縮径している。この内壁面３２は、フィルターユニット１０の筐体１１の外壁面１３と同一のテーパ角を有し、フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０とを組み合わせる際の接合部となる。すなわち、フィルターユニット１０の外面テーパと閉鎖ユニット３０の内面テーパとが、一対の接合部を構成し、両者は気密状態で接合可能である。
閉鎖ユニット３０の接合用開口３６から、本体部３１に囲まれた空間３５にフィルターユニット１０を挿入することにより、フィルターユニットの筐体の外壁面１３と閉鎖ユニット本体の内壁面とが嵌合する。閉鎖ユニット３０は、内テーパの縮径側に閉鎖端を有するため、フィルターユニットと閉鎖ユニットとが嵌合した状態では、フィルターユニットの液体排出開口は空間的に閉鎖され、気密状態となる。
図３Ａは、フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０とを組み合わせる途中の状態における断面図であり、図３Ｂは、フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０との組み合わせ状態における断面図である。フィルターユニット１０の外壁面１３と閉鎖ユニット３０の内壁面３２とが同一のテーパ角を有するため、閉鎖ユニット３０の空間３５に、フィルターユニット１０を挿入すると、図３Ａに示すように、両者が嵌合して気密状態となる。
閉鎖ユニット本体部３１の底部が閉じているため、フィルターユニット１０の外壁面１３と閉鎖ユニット３０の内壁面３２とが接すると、フィルターユニット１０の液体排出開口１９は、閉鎖ユニット３０により空間的に閉鎖される。この状態では、フィルターユニット１０の濾過フィルター２１と閉鎖ユニット３０の本体部３１とが気密状態となり、両者の間に、密閉空間３９が形成されている。
フィルターユニット１０の接合部（外壁面）と閉鎖ユニット３０の接合部（内壁面）とが接合して密閉空間３９が形成された状態から、気密状態を維持したまま、フィルターユニット１０を閉鎖ユニット３０にさらに押し込む（図３Ｂ）。
フィルターユニットの筐体および閉鎖ユニットがポリプロピレン樹脂等の弾性材料からなる場合、フィルターユニット１０の濾過フィルター２１と閉鎖ユニット３０との距離が短縮するように、閉鎖ユニットにフィルターユニットを押し込み可能である。閉鎖ユニットにフィルターユニットを押し込むと、フィルターユニットの筐体１１および閉鎖ユニットの本体部３１が弾性圧縮変形し、その反発力により、第一接合部としての筐体１１の外壁面１３と第二接合部としての本体部３１の内壁面３２との接合状態が保持される。閉鎖ユニットにフィルターユニットを押し込むことにより、密閉空間３９内の気体（空気）が、濾過フィルター２１と閉鎖ユニットの本体部３１との間で圧縮される。そのため、閉鎖ユニットの本体部３１と濾過フィルター２１との間の密閉空間が陽圧となる。
上記のように、フィルターユニット１０の接合部１３は、閉鎖ユニット３０に対してフィルターユニット１０を押し込む際の押し込み方向に向けて縮径する外面テーパ形状である。閉鎖ユニット３０の接合部３２は、フィルターユニット１０の接合部１３と嵌合することにより気密状態を構成可能な内面テーパ形状である。
フィルターユニットおよび閉鎖ユニットの接合部のテーパ角は特に限定されない。接合部での気密性を保持したまま両者を押し込み可能とするためには、テーパ角は０．１〜１０°程度が好ましく、０．２〜５°程度がより好ましい。接合部のテーパ形状は、各種の規格にあわせて設計してもよい。例えば、テーパ角を３°とすれば、医療用品や実験用器具で広く用いられているルアーロック方式の接合部（ルアーテーパ）を構成できる。
フィルターユニットの筐体１１の上部に、外部に突出した係止部１７が設けられている場合は、係止部１７が閉鎖ユニットの接合用開口の外縁部３７と当接するまでフィルターユニットを押し込むことにより、濾過フィルターと閉鎖ユニットの間の空間を確実に陽圧状態にできる。フィルターユニットの底部と閉鎖ユニットの底部とが当接するまで、フィルターユニットを押し込んでもよい。
濾過フィルター２１と閉鎖ユニット３０との間の空間が陽圧となることにより、フィルターユニット１０の試料収容空間１５は、濾過フィルター２１を境界として相対的に陰圧となっている。試料収容空間内に液体が存在すると、毛細管現象により、液体が濾過フィルターのフィルター孔を介して試料収容空間外に漏出する作用が生じる。濾過フィルターと閉鎖ユニットの間の空間が陽圧であれば、陰圧となっている試料収容空間に、フィルター孔を介して気体が流入しようとする作用が働く。そのため、試料収容空間に液体が収容された場合でも、毛細管現象による濾過フィルターを介した液体のリークを防止できる。
フィルターユニット１０を用いて、遠心濾過により固体と液体とを分離した後、フィルターユニット１０に閉鎖ユニット３０を組み合わせれば、フィルターユニットの試料収容空間１５内に液体を加えて長時間保持した場合でも、濾過フィルター２１を介した液体のリークを抑制できる。そのため、遠心濾過後に、フィルターユニット内に残存した固体を別の容器に移動させることなく、フィルターユニットに液体を加えて反応等を実施しても、試料の定量性を確保できる。また、ピペット操作等により固体を別の容器に移動させる必要がないため、試料調製の操作を簡素化できることに加えて、固体の回収ロス等に起因する定量性の低下を防止できる。
フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０とを分離すれば、フィルターユニット１０は、再度遠心濾過フィルターとして使用可能である。例えば、固体と液体との共存状態で反応を実施した後、遠心濾過を実施すれば、反応後の液体を濾液として回収可能である。遠心濾過後に、濾過フィルター上に残存した固体を試料として回収してもよい。
容器セットは、フィルターユニットおよび閉鎖ユニットに加えて、フィルターユニットと着脱可能な液体回収容器をさらに含んでいてもよい。図４は、フィルターユニット１０と組み合わせ可能な液体回収容器５０の概略斜視図である。
液体回収容器５０は、本体部５１が遠心分離機に装填可能な外形状を有し、かつフィルターユニット１０の濾過フィルター２１を透過した濾液を貯留可能に構成されていればよい。遠心分離機に装填可能な外形状は、遠心分離機のローターの形状等に応じて適宜設計すればよい。例えば、１ｍＬ以下の少量の試料に対しては、液体回収容器として、マイクロチューブ、あるいはこれと類似の形状の容器を使用できる。フィルターユニット１０と液体回収容器５０とは組み合わせ状態において気密性を有している必要はない。
図４に示す形態では、液体回収容器５０の本体部５１に、ヒンジ５４を介して蓋５８が結合されており、フィルターユニット１０と液体回収容器５０とを組み合わせた状態において、蓋５８により試料導入開口１８を閉鎖可能である。
上述のように、フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０とを組み合わせる前に、フィルターユニット１０を用いて、遠心濾過により固体と液体との分離が行われる。フィルターユニット１０と液体回収容器５０とを組み合わせた状態で遠心濾過を行えば、液体回収容器５０内に濾液を回収できる。また、フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０とを組み合わせた状態で長時間液体を保持して反応等を行った後にも、フィルターユニット１０を用いて遠心濾過が行われる。この際にも、フィルターユニット１０に液体回収容器５０を組み合わせて遠心濾過を実施すれば、液体回収容器内に濾液を回収できる。
フィルターユニット１０と閉鎖ユニット３０とを組み合わせた状態では、フィルターユニット１０と液体回収容器５０とを組み合わせた状態に比べて、容器の高さが小さい。閉鎖ユニット３０の底部にアダプタを取り付けて容器高さを調整すれば、チューブスタンドの利用が容易となる。また、接合部よりも下側に、容器高さを嵩上げするための空間を有するように、閉鎖ユニットを成形してもよい。
図１〜３に示す形態では、試料収容空間１５の側壁の外壁面１３がテーパ形状であり、閉鎖ユニットと接合するための接合部を構成している。フィルターユニットの接合部は、試料収容空間から離れた位置に設けられていてもよい。
例えば、図５の断面図に示すフィルターユニット１１０は、濾過フィルター１２１と液体排出開口１１９との間の筐体外壁面１２３が、液体排出開口１１９側に向けて縮径する外面テーパ形状である。このフィルターユニット１１０と組み合わせて用いられる閉鎖ユニット１３０は、内壁面１３２が、底部から接合用開口１３６に向けて縮径する内面テーパ形状である。
この実施形態では、フィルターユニット１１０の外面テーパ１２３と、閉鎖ユニット１３０の内面テーパ１３２とが一対の接合部を構成している。フィルターユニット１１０の筐体１１１が、閉鎖ユニット１３０の接合用開口１３６を貫通して、閉鎖ユニット内の空間１３５に挿入されると、フィルターユニット１１０の接合部（外面テーパ）１２３と閉鎖ユニット１３０の接合部（内面テーパ）１３２とが互いに嵌合し、気密状態となる。
両者の嵌合による気密状態を維持したまま、閉鎖ユニット１３０内にさらにフィルターユニット１１０を押し込むと、濾過フィルター１２１と閉鎖ユニット１３０の底部との間に形成された空間内の空気が圧縮される。そのため、閉鎖ユニットと濾過フィルターとの間の密閉空間が陽圧となる。
本発明の容器セットは、フィルターユニット内に閉鎖ユニットを挿入することにより、閉鎖ユニットと濾過フィルターとの間の空間が陽圧となるように構成されていてもよい。例えば、図６の断面図に示すフィルターユニット２１０は、濾過フィルター２２１と液体排出開口２１９との間の筐体内壁面２２２が、液体排出開口１１９側から濾過フィルター２２１側に向けて縮径する内面テーパ形状である。このフィルターユニット２１０と組み合わせて用いられる閉鎖ユニット２３０は、側面２３３が、底部から上部平面２３５側に向けて縮径する外面テーパ形状である。
この実施形態では、フィルターユニット２１０の内面テーパ２２２と、閉鎖ユニット２３０の外面テーパ２３３とが一対の接合部を構成している。フィルターユニット２１０の液体排出開口２１９を塞ぐように、閉鎖ユニット２３０を挿入することにより、フィルターユニット２１０の接合部（内面テーパ）２２２と閉鎖ユニット２３０の接合部（外面テーパ）２３３とが互いに嵌合し、気密状態となる。
気密状態を維持したまま、フィルターユニット２１０内にさらに閉鎖ユニット２３０を押し込むと、濾過フィルター２２１と閉鎖ユニット２３０の上部平面２３５との間に形成された空間内の空気が圧縮される。そのため、閉鎖ユニットと濾過フィルターとの間の密閉空間が陽圧となる。
フィルターユニットの接合部と閉鎖ユニットの接合部の形状は、テーパ形状に限定されず、両者が接合した気密状態を維持して、濾過フィルターと閉鎖ユニットとの距離を短縮するように押し込み可能であればよい。
例えば、フィルターユニットおよび閉鎖ユニットの接合部は、互いに噛み合うスクリュー形状でもよい。スクリューが噛み合うように接合した状態で、フィルターユニットに対して閉鎖ユニットを相対的に回転させることにより、濾過フィルターと閉鎖ユニットとの距離が短縮し、両者の間の空間が圧縮されて陽圧状態となる。接合部がテーパスクリュー形状であれば、より確実に気密状態を形成できる。また、スクリューの係止作用により、濾過フィルターと閉鎖ユニットとの間の空間の圧力が高くなった場合でも、接合状態を維持できる。
フィルターユニットおよび閉鎖ユニットの少なくとも一方の接合部に、パッキン等の封止部材を設けて、濾過フィルターと閉鎖ユニットとを気密状態としてもよい。封止部材を介して濾過フィルターの接合部と閉鎖ユニットの接合部とが気密性を有する状態で、濾過フィルターと閉鎖ユニットとの距離が短縮するように、一方に対して他方を相対的に押し込めば、両者の間の密閉空間が圧縮されて陽圧状態となる。
上記の形態では、いずれもフィルターユニットの接合部と閉鎖ユニットの接合部とが互いに嵌合する形状を有するため、気密状態を形成可能である。フィルターユニットと閉鎖ユニットとを気密状態とする他の手段として、気密密着性および延伸性を有するフィルム部材を用いる方法が挙げられる。
図７の斜視図に示す容器セットは、フィルターユニット５１０および閉鎖ユニット５３０を含む。フィルターユニット５１０の構成は、上述の各実施形態と同様であり、筐体５１１の一端に試料導入開口５１８が設けられ、他端に液体排出開口５１９が設けられている。筐体５１１の外壁面および内壁面は、テーパ形状でも直管形状でもよい。筐体５１１の液体排出開口５１９の近傍に、濾過フィルター５２１が固定され、濾過フィルター５２１および筐体５１１に囲まれた空間が、試料収容空間５１５を構成している。
閉鎖ユニット５３０は、フィルターユニットの液体排出開口を通過させることが可能な接合用開口を有し、接合用開口を塞ぐようにフィルム部材５３６が固定されている。フィルム部材５３６は、例えば接着剤、熱融着、超音波融着等により、閉鎖ユニット本体部５３１に固定されている。
フィルム部材５３６は、気密密着性および延伸性を有するフィルムである。フィルム部材６５は、透明でも不透明でもよい。フィルム部材６５としては、配管の接合部に用いられるシールテープ（シール用四フッ化エチレン樹脂未焼成テープ）や、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、ポリエチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニル等の主に食品用ラップフィルムに用いられるフィルム材料、Bemis Flexible Packaging製の「パラフィルム」や、Diversified Biotech製の「デュラシール」等が用いられる。フィルム部材は、フィルターユニット内に液体および固体を共存させて長時間保持する際に、その使用環境における耐熱性および耐溶剤性を有することが好ましい。例えば、軟化点７０℃以上のポリエチレン系フィルムが好ましく用いられる。
フィルターユニット５１０の筐体５１１の端部の液体排出開口５１９を、閉鎖ユニットの接続用開口に設けられたフィルム部材５３６に当接させることにより、気密状態が形成され、濾過フィルター５２１とフィルム部材５３６との間が密閉空間となる。すなわち、本実施形態では、液体排出開口５１９の外周の筐体５１１がフィルターユニット５１０の接合部であり、フィルム部材５３６が閉鎖ユニット５３０の接合部に相当する。
フィルターユニット５１０の液体排出開口５１９をフィルム部材５３６により閉鎖した状態で、フィルターユニット５１０を閉鎖ユニット５３０の空間５３５に挿入するように押し込むと、フィルム部材５３６が筐体５１１と密着し、液体排出開口５１９の気密状態を保ったまま延伸される。この際の圧縮力により、濾過フィルター５２１とフィルム部材５３６との間の空間が、試料収容空間５１５に対して陽圧となる。
図７に示す閉鎖ユニット５３０では、マイクロチューブ５３１の開口を覆うようにフィルム部材５３６が設けられているが、閉鎖ユニットは容器形状である必要はない。閉鎖ユニットは、フィルターユニットが通過可能な開口を覆うようにフィルム部材が固定されていればよく、環状の成型体にフィルム部材を固定した構成でもよい。また、マイクロチューブスタンドの表面にフィルム部材を貼り合わせ、スタンド用の孔をフィルム部材で覆ったシンプルな構成でもよい。
上記の容器セットの各実施形態は、１つのフィルターユニットに１つの閉鎖ユニットを組み合わせるように構成されているが、容器セットは、複数のフィルターユニットを１つの閉鎖ユニットに組み合わせるように構成されていてもよい。例えば、複数のマイクロチューブを並べて収容可能なマイクロチューブスタンドの表面全体を覆うようにフィルム部材を貼り合わせれば、それぞれのスタンド孔に設けられたフィルム部材が接合部として機能するため、１つの閉鎖ユニットに、複数のフィルターユニットを組み合わせて収容できる。
また、板状部材の表面に、図２Ｂの内壁面３２や図５の内壁面１３２のような内テーパ形状の孔が複数設けられたものを閉鎖ユニットとして用いてもよい。板状部材の表面に、図６の側面２３３のような外テーパ形状の凸部が複数設けられたものを閉鎖ユニットとして用いてもよい。このように、複数の接合部を有し、それぞれの接合部がフィルターユニットと接合可能に構成された閉鎖ユニットを用いれば、多数の検体を同時に処理する場合の作業効率を向上できる。
［試料調製方法］
本発明の容器セットは、例えば、遠心濾過により固体と液体とを分離する操作、および容器内で長時間の液体の保持を要する操作（例えば化学反応）を含む試料調製に使用できる。遠心濾過を行う際は、フィルターユニットの液体排出開口を開放状態として、液体排出口からフィルターユニット外に濾液を排出する。この際、フィルターユニットに液体回収容器を装着すれば、液体排出口から排出された濾液を液体回収容器内に回収できる。
遠心濾過により濾液を排出後の試料収容空間では、濾過フィルター上に固体が残存している。この状態で、フィルターユニットの接合部と閉鎖ユニットの接合部とを接合してフィルターユニットの液体排出開口を閉鎖する。フィルターユニットを閉鎖ユニットに押し込むことにより、閉鎖ユニットと濾過フィルターとの間に密閉された気体が圧縮され、試料収容空間に対して陽圧となる。
フィルターユニットと閉鎖ユニットとを組み合わせた状態で、フィルターユニットの試料導入開口から試料収容空間内に液体を含む試料を導入する。フィルターユニットの試料収容空間は、閉鎖ユニットと濾過フィルターとの間の空間に対して陰圧となっているため、毛細管現象による濾過フィルターを介した液体のリークを防止できる。
なお、フィルターユニットの試料収容空間に液体を導入後も、数分程度の短時間であれば、毛細管現象による液体のリークはほとんど生じない。そのため、試料収容空間に液体を導入後にフィルターユニットと閉鎖ユニットとを組み合わせてもよい。
試料収容空間内に液体を保持した状態で、所定時間経過後（例えば反応終了後）に、試料の回収が行われる。フィルターユニットと閉鎖ユニットとを分離し、液体排出開口を開放することにより、試料収容空間内の液体と固体とを遠心濾過により濾別できる。この際、フィルターユニットに液体回収容器を装着すれば、液体排出口から排出された濾液を液体回収容器内に回収できる。
本発明の容器セットを用いた試料調製方法の一形態では、図８のフローチャートに示すように、血液等の検体から分析用試料の調製が行われる。
まず、検体中の特定の物質を表面に固定可能な固体を準備する（Ｓ１０）。特定の物質としては、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド等の生体由来物質や細胞等が挙げられる。目的物質が生体由来物質である場合は、分子認識等により、固体表面に目的物質が固定されてもよい。例えば、目的物質が核酸である場合は、シリカコーティングされた粒子を用いることにより、粒子表面に核酸を特異的に吸着させることができる。また、目的物質が、抗体(例えば、標識抗体)、受容体、抗原およびリガンド等である場合、粒子表面のアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アピジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、プロテインＡ、プロテインＧ等により、固体表面に選択的に固定できる。
固体として多数の細孔を有する多孔質ビーズを用いれば、比表面積が大きいため、目的物質を効率的に固体表面に固定できる。また、nSMOL法では、多孔質体を用いることにより空間的なアクセス制限を設け、目的物質を位置選択的にプロテアーゼ消化できる。
上記の固体に検体を添加し、両者を混合することにより、検体中の特定の物質が固体表面に固定される（Ｓ１１）。固体と検体との混合は、フィルターユニット内で実施してもよく、別の容器内で実施してもよい。
検体中の特定の物質が固体表面に固定された状態で洗浄を行うことにより、固体表面に付着した夾雑成分を除去する。夾雑成分が凝集しやすく強固に付着している場合は、界面活性剤やカオトロピック剤等を用いて、夾雑成分を変性させ、液体中に溶解させることが好ましい（Ｓ２１）。界面活性剤等を含む液体による処理を行った後、遠心濾過を行い、夾雑物を含む濾液を除去する（Ｓ２２）。界面活性剤等による処理と遠心濾過とを複数回繰り返して実施してもよい。
界面活性剤による処理後、界面活性剤を含まない液体を用いて洗浄を行い、固体表面に付着した界面活性剤を洗浄する（Ｓ２３）。その後、遠心濾過により洗浄液を除去する（Ｓ２４）。洗浄と遠心濾過とを複数回繰り返して実施してもよい。
遠心濾過により、固体表面に固定されていない夾雑成分を除去した後、フィルターユニットと閉鎖ユニットとを組み合わせて、濾過フィルター上に固体が残存している試料収容空間を相対的に陰圧として、毛細管現象による液体のリークを防止する。試料収容空間に液体を添加して、所定温度で所定時間保持することにより、固体表面に固定された特定の物質から、回収対象物質を液体中に遊離させる。
固体表面に固定された特定の物質と回収対象物質は同一でも異なっていてもよい。例えば、シリカ被覆粒子の表面に核酸が結合している場合は、水または低濃度の塩を含む緩衝液を添加することにより、シリカと核酸との間の相互作用が小さくなるため、シリカ表面から核酸が遊離する。この場合、固体表面に固定された特定の物質と回収対象物質は同一である。
固体表面に固定された特定の物質を、液体中で化学反応に関与させれば、固体表面に固定された特定の物質とは異なる回収対象物質が液体中に遊離する。例えば、固体表面にタンパク質が固定されている場合、プロテアーゼによるタンパク質の消化を実施すれば、ペプチド断片が液体中に遊離する。多孔質体の細孔内に検体中のタンパク質が固定されている場合、多孔質体の細孔径よりも大きな粒子径を有する微粒子の表面に固定されたプロテアーゼと、細孔内に固定されたタンパク質とを接触させれば、プロテアーゼがアクセス可能な空間が制限されているため、タンパク質を位置選択的にプロテアーゼ消化できる。表面にプロテアーゼが固定された微粒子は、例えば懸濁液として、試料導入用開口からフィルターユニットの試料収容空間内に添加すればよい（Ｓ３２）。
タンパク質を位置選択的にプロテアーゼ消化する場合は、固体表面とタンパク質との結合が位置選択的（部位選択的）であることが好ましい。例えば、プロテインＡやプロテインＧは、抗体のＦｃドメインと選択的に結合する。そのため、プロテインＡやプロテインＧで被覆された多孔質体を用いれば、細孔内の表面に抗体のＦｃドメインが固定され、抗体のＦａｂドメインが細孔の外側を向くように配向性を制御できる。特に、プロテインＡは、Ｆｃドメインとの結合の位置選択性が高いため、プロテアーゼ消化の位置選択性を高めるためには、プロテインＡで被覆された多孔質体を用いることが好ましい。
上記の様に多孔質体の細孔内で抗体の配向が制御されている場合、多孔質体との結合部位である抗体Ｆｃドメインへのプロテアーゼのアクセスが制限されているため、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＦａｂドメインが、プロテアーゼにより位置選択的に切断される。そのため、液体中に遊離するペプチド断片は、抗体の同定に重要な相補性決定領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片を高濃度で含んでいる。
上記の様なプロテアーゼによるタンパク質の消化は、通常、温度３５〜６０℃で、３〜３０時間程度インキュベーションが必要である（Ｓ３２）。フィルターユニットの試料収容空間内に液体を含む試料を収容した状態で長時間保持した場合でも、濾過フィルターを境界として、試料収容空間が陰圧であれば、濾過フィルターのフィルター孔を介した液体のリークを防止できる。そのため、試料のロスがなく定量性を維持できる。
回収対象物質を液体中へ遊離後に、フィルターユニットと閉鎖ユニットと脱離する。遠心濾過により、フィルターユニット内の回収対象物質が遊離した液体を、濾液として試料回収容器内に回収する（Ｓ４１）。
上記の方法により得られた試料は、必要に応じて希釈、脱塩、精製等を行った後、分析が行われる（Ｓ５１）。例えば、nSMOL法により調製されたペプチド断片は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた多重反応モニタリング（Multiple Reaction Monitoring; MRM）により、定量分析を実施できる。
以下では、本発明の容器セットを用いて、前述の非特許文献２（Iwamoto et. al, Bioanalysis, 2016, 8(10), 1009-1020.）に記載のプロトコールに基づいて、nSMOL法により試料調製を実施する方法の一例を示す。なお、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。
表面がプロテインＡで被覆された多孔質体の懸濁液（トヨパール AF-rProtein A HC-650F；東ソー製、粒子径３０〜６０μｍ、空孔率８６％、樹脂濃度５０重量％、IgG静的吸着量８０ｇ／Ｌ）２５μＬを、２ｍＬのマイクロチューブに分取する。ここに、界面活性剤として０．１％のオクチル β‐Ｄ‐グルコピラノシドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）９０μＬ、および検体としての血漿試料１０μＬを加える。１５分間、穏やかに撹拌を行う。これらの操作により、血漿中の抗体がプロテインＡ被覆樹脂の表面に固定される。
試料を固定後のプロテインＡ被覆樹脂懸濁液をフィルターユニットに移し、１００００ｇで１分間遠心濾過を行う。フィルターユニットに、０．１％のオクチル β‐Ｄ‐グルコピラノシドを含むＰＢＳを１５０μＬ加え、１００００ｇで１分間遠心濾過を行う。これを計３回繰り返し、界面活性剤による夾雑物（プロテインＡ被覆樹脂の表面に付着した膜タンパク質等）の除去を行う。その後、フィルターユニットにＰＢＳを１５０μＬ加え、１００００ｇで１分間遠心濾過を行う。これを計３回繰り返し、界面活性剤を洗浄除去する。
フィルターユニットを閉鎖ユニットに挿入して両者を組み合わせ、フィルターユニットの液体排出開口を塞いで密閉状態とする。さらに、フィルターユニットの係止部が閉鎖ユニットに当接するまで、フィルターユニットを押し込む。これにより、フィルターユニットと閉鎖ユニットの間の空気が圧縮されて陽圧となり、プロテインＡ被覆樹脂が収容されたフィルターユニット内の試料収容空間は相対的に陰圧となる。
フィルターユニットに、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）７５μＬ、および表面にトリプシンを固定したポリグリシジルメタクリレート被覆フェライトナノ粒子（FG beads；多摩川精機製、粒子径約２００ｎｍ）の懸濁液（２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加える。トリプシンを固定したナノ粒子、および検体中の抗体が固定された多孔質樹脂との懸濁液が収容されたフィルターユニットと、閉鎖ユニットとの組み合わせ体を、５０℃の飽和蒸気圧下で、６時間、穏やかに撹拌する。
プロテインＡは、抗体のＦｃドメインに選択的に結合するため、プロテインＡ被覆樹脂の細孔内では、抗体のＦａｂドメインが外側を向くように固定されている。ナノ粒子の粒子径が、プロテインＡ被覆樹脂の細孔径よりも大きいため、ナノ粒子の表面に固定されたトリプシンは、細孔内のプロテインＡと抗体のＦｃドメインとの結合部位付近にはアクセスできない。そのため、抗体のＦａｂドメインが選択的にトリプシンにより切断され、液相に遊離する。
トリプシンによるタンパク質の切断を完結させ、定量性を確保するためには、容器内で長時間（例えば、上記のように６時間）液体を保持する必要がある。本実施例では、フィルターユニットと閉鎖ユニットとが組み合わせられているため、フィルターユニットの試料収容空間側が陰圧となっている。そのため、試料収容空間内で長時間液体を保持する場合でも、濾過フィルターを介した液体のリークを防止し、定量性を確保できる。
５０℃で６時間保持後の試料に、１０％のギ酸を５μＬ加えて希釈した後、閉鎖ユニットをフィルターユニットから分離し、フィルターユニットに新しい回収容器を組み合わせる。１００００ｇで１分間遠心濾過を行い、回収容器内の濾液を回収する。この濾液のＬＣ−ＭＳ分析により、検体に含まれる抗体の同定および定量分析が行われる。
本実施例では、途中で固体を他の容器に移動させることなく、１つのフィルターユニットを用いて、抗体が固定された固体の洗浄、トリプシンによる酵素反応、および酵素反応後の液相の回収が行われる。そのため、試料の調製作業が簡素化されることに加えて、人為的操作のバラツキ等に起因する固体の回収ロスを防止できる。また、上記のようにフィルターユニット内でのプロテアーゼとの反応時には、フィルターユニットと閉鎖ユニットとを組み合わせることにより、液体のリークが抑制される。そのため、定量性の高い分析用試料の調製が可能となる。
１０ フィルターユニット
１１ 筐体
１５ 試料収容空間
１８ 試料導入開口
１９ 液体排出開口
２１ 濾過フィルター
１３ テーパ状外壁面（第一接合部）
３０ 閉鎖ユニット
３６ 接合用開口
３２ テーパ状内壁面（第二接合部）

Claims (14)

  1. フィルターユニット、および前記フィルターユニットに着脱可能な閉鎖ユニットを含む容器セットであって、
    前記フィルターユニットは、閉鎖可能であってもよい試料導入開口が一端に設けられ液体排出開口が他端に設けられた筐体、および前記筐体に固定された濾過フィルター、を備え、
    前記試料導入開口は、前記筐体および前記濾過フィルターにより囲まれた試料収容空間に、固体および液体を導入可能であり、
    前記液体排出開口は、前記濾過フィルターを透過した濾液を排出可能であり、
    前記フィルターユニットの筐体は第一接合部を有し、
    前記閉鎖ユニットは、前記第一接合部と接合可能に構成された第二接合部を有し、
    前記フィルターユニットの第一接合部および前記閉鎖ユニットの第二接合部は、両者が接合して気密状態となり前記液体排出開口が前記閉鎖ユニットにより空間的に閉鎖されるように構成され、かつ気密状態を維持したまま、濾過フィルターと閉鎖ユニットとの距離が短縮するようにさらに押し込み可能に構成されており、
    前記フィルターユニットと前記閉鎖ユニットとの押し込みにより、前記閉鎖ユニットと前記濾過フィルターとの間の空間が、前記試料収容空間に対して陽圧となるように構成されており、
    前記閉鎖ユニットは、前記試料導入開口を閉鎖するための蓋を有する、容器セット。
  2. 前記フィルターユニットの第一接合部と前記閉鎖ユニットの第二接合部とが、互いに嵌合可能な形状を有する、請求項１に記載の容器セット。
  3. 前記フィルターユニットの第一接合部と前記閉鎖ユニットの第二接合部とが、いずれもテーパ形状である、請求項２に記載の容器セット。
  4. 前記フィルターユニットの第一接合部は、前記閉鎖ユニットに対して前記フィルターユニットを押し込む際の押し込み方向に向けて縮径する外面テーパ形状であり、
    前記閉鎖ユニットの第二接合部は、前記第一接合部に嵌合可能な内面テーパ形状である、請求項３に記載の容器セット。
  5. 前記閉鎖ユニットは、前記筐体の液体排出開口側の端部を通過させることが可能な接合用開口を有し、
    前記筐体が前記接合用開口を貫通して、前記閉鎖ユニットに挿入されることにより、前記フィルターユニットの筐体の外壁面の第一接合部と前記閉鎖ユニットの内壁面の第二接合部とが互いに嵌合するように構成されている、請求項１に記載の容器セット。
  6. 前記フィルターユニットは、前記液体排出開口の外周の筐体が第一接合部を構成し、
    前記閉鎖ユニットは、前記第一接合部を通過させることが可能な接合用開口を有し、前記接合用開口を塞ぐように、第二接合部としてのフィルム部材が固定されており、
    前記フィルム部材は、気密密着性および延伸性を有し、
    前記筐体が前記接合用開口を貫通して前記閉鎖ユニットに挿入されることにより、前記フィルム部材が前記液体排出開口を閉鎖した状態を維持したままさらに押し込まれ、前記フィルム部材が延伸されることにより、前記フィルム部材と前記濾過フィルターとの間の空間が、前記試料収容空間に対して陽圧となるように構成されている、請求項１に記載の容器セット。
  7. 前記閉鎖ユニットは、複数の第二接合部を有し、複数のフィルターユニットと接合可能に構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の容器セット。
  8. さらに、前記フィルターユニットと着脱可能な液体回収容器を含み、
    前記液体回収容器は、遠心分離機に装填可能な外形状を有し、かつ前記濾過フィルターを透過した濾液を貯留可能に構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の容器セット。
  9. 前記第一接合部と前記第二接合部は、ルアーロック方式の接合部を構成する、請求項４に記載の容器セット。
  10. 検体から分析用試料を調製する方法であって、
    検体中の特定の物質を固体表面に固定するステップ；
    遠心濾過により、固体表面に固定されていない夾雑成分を除去するステップ；
    固体表面に固定された特定の物質から、回収対象物質を液体中に遊離させるステップ；および
    液体中に遊離した回収対象物質を回収するステップ、を順に有し、
    遠心濾過と、回収対象物質の液体中への遊離とが、同一のフィルターユニットを用いて実施され、
    前記フィルターユニットは、閉鎖可能であってもよい試料導入開口が一端に設けられ液体排出開口が他端に設けられた筐体、および前記筐体に固定された濾過フィルター、を備え、
    前記試料導入開口は、前記筐体および前記濾過フィルターにより囲まれた試料収容空間に、固体および液体を導入可能であり、
    前記液体排出開口は、前記濾過フィルターを透過した濾液を排出可能であり、
    遠心濾過後に、前記フィルターユニットを閉鎖ユニットと接合することにより、前記液体排出開口が空間的に閉鎖された状態で、回収対象物質の液体中への遊離が行われ、
    前記フィルターユニットの筐体は第一接合部を有し、
    前記閉鎖ユニットは、前記第一接合部と接合可能に構成された第二接合部を有し、
    前記フィルターユニットの第一接合部および前記閉鎖ユニットの第二接合部は、両者が接合した状態において前記液体排出開口が前記閉鎖ユニットにより空間的に閉鎖されるように構成されており、
    両者の接合状態を維持したまま、前記濾過フィルターと前記閉鎖ユニットとの距離が短縮するようにさらに押し込むことにより、前記閉鎖ユニットと前記濾過フィルターとの間の空間を前記試料収容空間に対して陽圧とした状態で、回収対象物質の液体中への遊離が実施される、分析用試料の調製方法。
  11. 回収対象物質の液体中への遊離後に、前記フィルターユニットと前記閉鎖ユニットとを分離し、
    遠心濾過により、回収対象物質が遊離した液体の回収が行われる、請求項１０に記載の分析用試料の調製方法。
  12. 前記固体表面に固定される特定の物質がタンパク質であり、
    プロテアーゼによるタンパク質の消化により、前記回収対象物質としてペプチド断片を液体中に遊離させる、請求項１０または１１に記載の分析用試料の調製方法。
  13. 前記固体が多孔質体であり、多孔質体の細孔内に検体中のタンパク質が固定され、
    微粒子の表面に固定されたプロテアーゼと多孔質体の細孔内に固定されたタンパク質とが接触することにより、前記タンパク質が位置選択的に切断され、ペプチド断片が液体中に遊離する、請求項１２に記載の分析用試料の調製方法。
  14. 検体から分析用試料を調製する方法であって、
    検体中の特定の物質を固体表面に固定するステップ；
    遠心濾過により、固体表面に固定されていない夾雑成分を除去するステップ；
    固体表面に固定された特定の物質から、回収対象物質を液体中に遊離させるステップ；および
    液体中に遊離した回収対象物質を回収するステップ、を順に有し、
    遠心濾過と、回収対象物質の液体中への遊離とが、濾過フィルターを備える同一のフィルターユニットを用いて実施され、
    遠心濾過後に、前記濾過フィルターと閉鎖ユニットとの距離が短縮するように前記フィルターユニットを閉鎖ユニットに対して押し込み、前記閉鎖ユニットと前記濾過フィルターとの間の空間を前記試料収容空間に対して陽圧とした状態で、回収対象物質の液体中への遊離が実施される、分析用試料の調製方法。
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