JP7165210B2 - タンパク質の定量分析 - Google Patents
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Description
本開示の一の態様は、複雑な生体試料中の標的タンパク質を検出および/または定量するための方法を含む。方法は、捕捉工程から始まり、その工程中で、標的タンパク質を含む生体試料を、固定化捕捉部分(entities)と接触させて、生体試料からの標的タンパク質と結合して捕捉し、これにより固定化標的タンパク質を形成する。方法の次の工程は、タンパク質変性工程であって、その工程中で、固定化標的タンパク質を、有機溶媒を含む変性溶液と接触させて、変性固定化標的タンパク質を形成する。方法の3番目の工程は、タンパク質分解消化工程であって、その行程中で、変性固定化標的タンパク質を、プロテアーゼを含む消化溶液と接触させて、タンパク質分解ペプチドを含む溶液を形成する。方法の最後の工程は、タンパク質分解ペプチドを含む溶液を、質量分析ベースの技術により分析して、生体試料中の標的タンパク質を検出および/または定量することを含み、ここで、該分析は、該方法の1つの工程中に加えられる、少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドを利用する工程を含む。以下に記載の方法は、1つの標的タンパク質の検出および/または定量について詳述するが、該方法を、複数の標的タンパク質の多重検出および/または定量のために容易に改変し得る。
本明細書に記載の方法の第1工程は、生体試料からの標的タンパク質の捕捉および濃縮を含む。この工程は、標的タンパク質を含む生体試料を、固定化捕捉部分へ加え、該固定化捕捉部分が、標的タンパク質を認識して結合し、これにより標的タンパク質を捕捉および固定することを含むことを含む。
様々な標的タンパク質を、本明細書に記載の方法を用いて検出および/または定量し得る。適切な標的タンパク質は、抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、IgG分子、IgA分子、IgD分子、IgE分子、IgM分子、組み換え抗体、操作抗体、キメラ抗体など)、抗体断片(例えば、重鎖、軽鎖、Fab断片、F(ab)2断片、Fc断片、Fab'断片、一本鎖可変断片、および上記いずれかの融合、例えば、Fc融合タンパク質)、抗体模倣物、増殖因子、インターフェロン、インターロイキン、他のサイトカイン、タンパク質またはペプチドホルモン、血液凝固因子、抗凝血剤、骨形成タンパク質、血栓溶解剤、ワクチン、酵素、操作タンパク質足場、融合タンパク質、治療用タンパク質、診断用タンパク質、上記いずれかの断片、または上記いずれかの誘導体を含むが、これらに限定されない。特定の実施態様において、標的タンパク質は、モノクローナル抗体、その断片、または抗体断片を含む融合タンパク質であり得る。
標的タンパク質を、様々な生体試料中で検出および/または定量し得る。一般的に、生体試料は、標的タンパク質、他のタンパク質、および/または他の生物学的部分(例えば脂質、核酸など)の混合物を含む。適切な生体試料の非限定的な例として、血液、血清、血漿、羊膜液、腹水液、生検抽出物、生検液、骨抽出物、骨髄吸引物、***分泌物、気管支分泌物、細胞培養液、細胞抽出物、細胞ホモジネート、脳脊髄液、子宮頸部分泌物、子宮内膜分泌物、糞便、消化管分泌物、血液ろ液(hemofiltrate)、涙液(lacrimal fluid)、リンパ液、卵巣嚢腫分泌物、胸膜液、尿道球腺液(カウパー液)、前立腺液、唾液、***(semen)、***(seminal fluid)、精漿、痰、汗、滑液、組織抽出物、組織液、組織ホモジネート、涙液(tear)、腫瘍吸引物、腫瘍抽出物、尿および膣分泌物が挙げられる。特定の実施態様において、生体試料は、血清または血漿であり得る。
固定化捕捉部分は、捕捉部分が標的タンパク質を結合することができる、抗体またはその断片、タンパク質またはその断片、リガンドまたはアプタマーであり得る。いくつかの実施態様において、捕捉部分は、標的タンパク質を認識して結合する、抗体またはその断片であり得る。例えば、捕捉部分は、ヒトIgGと結合する抗ヒトIgG抗体であり得る。他の実施態様において、捕捉部分は、標的タンパク質と結合する、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、レクチン、シグナル伝達タンパク質などのタンパク質であり得る。例えば、捕捉部分は、アダリムマブまたはインフリキシマブと結合する腫瘍壊死因子αであり得る。更なる捕捉部分の例としては、タンパク質相互作用ドメイン、例えばSH2、SH3、PTB、14-3-3、FHA、WW、SAM、LIMドメイン、タンパク質結合ドメイン、ペプチドリガンド、小分子リガンド、炭水化物リガンド、脂質リガンド、核酸リガンド(すなわちアプタマー)が挙げられるが、これらに限定されない。
標的タンパク質を含む生体試料を、固定化捕捉部分に加えて、一定時間インキュベートし、その間に、固定化捕捉部分は、生体試料からの標的タンパク質を捕捉して、固定化標的タンパク質を形成する。一般に、インキュベート時間は、約30分~約18時間の範囲である。いくつかの実施態様において、インキュベート時間は、約0.5時間~約8時間、約1時間~4時間または約1.5時間~約2.5時間の範囲であり得る。他の実施態様において、インキュベート時間は、約8時間~約18時間の範囲であり得る。インキュベート温度は、約4℃~約40℃、約10℃~約35℃、約20℃~約30℃またはおよそ室温(すなわち22~25℃)の範囲であり得る。特定の実施態様において、インキュベートを室温にて約2時間実施し得る。固定化捕捉部分と、標的タンパク質を含む生体試料は、インキュベート時間中に振とう、回転および/または渦巻により混合され得る。
一般に、捕捉工程の後に、1回以上の洗浄工程が続く。このため、未結合タンパク質を含む生体試料を、固定標的タンパク質から(デカンテーションまたは反転により)取り除き、一定量の洗浄溶液を固定化標的タンパク質に加える。固定化標的タンパク質および洗浄溶液を混合し、その後洗浄溶液を取り除く。洗浄工程は、1回以上繰り返され得る。洗浄溶液は、上記ワーキング溶液と同一であってもよく、所望により非イオン性界面活性剤をさらに含んでもよい。適切な非イオン性界面活性剤の非限定的な例として、ポリソルベート20およびポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルが挙げられる。
方法の次の工程は、有機溶媒を含む変性溶液を、固定化標的タンパク質へ加えて、変性固定化標的タンパク質を形成することを含む。
方法の次の工程は、プロテアーゼを含む消化溶液を、変性固定化標的タンパク質へ加えて、タンパク質分解ペプチドを含む溶液を形成することを含む。
本明細書に記載の方法は、プロセスの1つの工程中に少なくとも1つの内部標準が加えられるため、定量的である。本明細書で用いる内部標準は、標的タンパク質に固有である少なくとも1つのペプチド配列を含む、安定な同位体標識タンパク質またはペプチドである。このような固有の配列は、「サロゲート」または「レポーター」ペプチドと呼ばれ、質量分析ベースの分析中の定量およびモニタリングのために用いられる。
方法の最後の工程は、タンパク質分解ペプチドを、質量分析ベースの技術により分析して、生体試料中の標的タンパク質を検出および/または定量することを含む。このような分析は、定量およびモニタリングのために1つ以上の適切なサロゲートペプチドの同定に依存する。サロゲートペプチドは、標的タンパク質に固有であり、質量分析(例えば良好なイオン化など)によく応答する。定量は、従来の安定な同位体希釈法を用いて方法中で加えられる1つ以上の安定な同位体標識内部標準と比較して、1つ以上のサロゲートペプチドを測定することにより実施される。
本開示の別の態様は、生体試料中の標的タンパク質を検出および/または定量するためのキットを提供する。一般に、キットは、セクション(1)(b)で上述した変性溶液または変性溶液を調製する構成成分、およびセクション(1)(c)で上述した消化溶液または消化溶液を調製する構成成分を含み得る。キットは、対象とする標的タンパク質に対する捕捉部分(セクション(1)(a)(iii)で上述したとおり)をさらに含み得る。捕捉部分は、固体支持体と結合でき、キットにそのように提供される。あるいは、捕捉部分は、捕捉部分を固体支持体へ結合するための手段と一緒に、遊離型で提供され得る。例えば、捕捉部分は、ビオチニル化抗体であり得て、これは、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体(例えば96ウェルプレート)または固体支持体をコーティングするためのストレプトアビジンと一緒に提供され得る。キットはまた、セクション(1)(d)で上述した、少なくとも1つの安定な同位体標識内部標準タンパク質も含み得る。更なる実施態様において、キットは、方法の標的タンパク質捕捉工程中で用いるためのワーキング溶液および洗浄溶液(それぞれセクション(1)(a)(ii)および(1)(a)(v)参照)をさらに含み得る。
本明細書で提供する方法およびキットは、様々な用途および適用を有する。適切な適用の非限定的な例として、バイオマーカーの前臨床検証、生物治療アッセイ、臨床アッセイ、診断アッセイ、治療モニタリングアッセイ、薬物動態試験、非臨床試験などが挙げられる。方法は、診断、治療、臨床、産業および/または研究の用途のためであり得る。
他に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。下記参照文献は、本発明で用いられる多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988);The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いる以下の用語は、他に断らない限り、それらに帰する意味を有する。
本発明は、以下の態様および実施態様を含む。
[1] 生体試料中の標的タンパク質を検出および/または定量するための方法であって、
a)標的タンパク質を含む生体試料を、固定化捕捉部分(entities)へ加えて、標的タンパク質を捕捉し、これにより固定化標的タンパク質を形成する工程;
b)有機溶媒を含む変性溶液を、固定化標的タンパク質へ加えて、変性固定化標的タンパク質を形成する工程;
c)プロテアーゼを含む消化溶液を、変性固定化標的タンパク質へ加えて、タンパク質分解ペプチドを含む溶液を形成する工程;および
d)タンパク質分解ペプチドを含む溶液を、質量分析ベースの技術により分析して、生体試料中の標的タンパク質を検出および/または定量する工程であって、該分析が、該方法の1つの工程中に加えられる、少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドを利用する工程
を含む、方法。
[2] 固定化捕捉部分が、抗体、抗体断片、タンパク質、タンパク質断片、リガンドまたはアプタマーである、[1]に記載の方法。
[3] 固定化捕捉部分が、直接結合、リンカーまたは親和性相互作用により固体支持体と結合している、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 親和性相互作用が、ストレプトアビジン-ビオチン、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、プロテインL、アプタマーまたはリガンドを含む、[3]に記載の方法。
[5] 固体支持体が、ウェルプレート、マイクロプレート、ビーズ、レジン、チップ、ファイバーまたは反応チューブである、[3]または[4]に記載の方法。
[6] 固定化捕捉部分が、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に付着したビオチニル化抗体である、[3]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 標的タンパク質が、抗体、抗体断片、または抗体断片を含む融合タンパク質である、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8] 生体試料が、血清または血漿である、[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9] 工程(a)を室温にて約1時間~約4時間実施する、[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 工程(a)の後に、少なくとも1回の洗浄工程が続く、[1]~[9]のいずれかに記載の方法。
[11] 工程(b)における変性溶液中の有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノール、アセトニトリル、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、またはその組合せであり、約30体積%~約100体積%で存在する、[1]~[10]のいずれかに記載の方法。
[12] 有機溶媒が、メタノールまたはエタノールであり、約40体積%~約60体積%で存在する、[11]に記載の方法。
[13] 工程(b)を室温にて約5分間~約60分間実施する、[1]~[12]のいずれかに記載の方法。
[14] 工程(c)における消化溶液中のプロテアーゼが、トリプシンである、[1]~[13]のいずれかに記載の方法。
[15] トリプシンが、哺乳類のトリプシンである、[14]に記載の方法。
[16] 工程(d)を約50℃~約70℃にて約1時間~約4時間実施する、[1]~[15]のいずれかに記載の方法。
[17] 工程(b)と(c)の間に洗浄工程および/またはデカント工程がない、[1]~[16]のいずれかに記載の方法。
[18] 工程(c)の前に、還元工程および/またはアルキル化工程がない、[1]~[17]のいずれかに記載の方法。
[19] 工程(b)と(c)を、有機溶媒を含む変性溶液およびプロテアーゼを含む消化溶液を固定化標的タンパク質へ同時に加えることにより組み合わせる、[1]~[18]のいずれかに記載の方法。
[20] 約50℃~約70℃にて約1時間~約4時間インキュベートする工程をさらに含む、[19]に記載の方法。
[21] 少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドが、工程(a)中に加えられ、そして、安定な同位体標識型の標的タンパク質、または標的タンパク質に存在するユニバーサルペプチド配列を含む安定な同位体標識タンパク質である、[1]~[20]のいずれかに記載の方法。
[22] 少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドが、工程(c)の前に加えられ、そして、安定な同位体標識された切断可能な型のサロゲートペプチドである、[1]~[20]のいずれかに記載の方法。
[23] 少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドが、工程(c)の前および後に加えられ、そして、安定な同位体標識型のサロゲートペプチドである、[1]~[20]のいずれかに記載の方法。
[24] 工程(d)における質量分析ベースの技術が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)である、[1]~[23]のいずれかに記載の方法。
[25] 定量下限が、約50 ng/ml未満である、[1]~[24]のいずれかに記載の方法。
[26] 定量下限が、約10 ng/ml未満である、[25]に記載の方法。
いくつかの異なる消化プロトコールの効率を評価するために、最初に、サル血清中で100μLの0.64μg/ml未標識アデュリムマブ(Adulimumab)抗体の免疫親和性濃縮を実施した。その後、抗体を、3つの異なる消化プロトコールを用いて消化した。
#1 変性プロトコール無しの急速高温消化。ウェル1に、190μLの50mM炭酸水素アンモニウム消化緩衝液および10μgのトリプシンを加えた。試料を70℃にて2時間インキュベートした(変性は実施しなかった)。
#2 従来の還元、アルキル化および消化プロトコール。ウェル2に、100μLの10 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を加え、37℃にて30分間インキュベートした。還元後、試料を、20μLの100mM IAAおよびを加え、室温にて30分間インキュベートすることによりアルキル化した。その後、70μLの50 mM炭酸水素アンモニウム消化緩衝液および10μgのトリプシンを加え、37℃にて16時間インキュベートした。
#3 変性プロトコール有りの急速高温消化(すなわち最適化プロトコール)。ウェル3に、50μLの50%MeOHを加え、15分間インキュベートした。その後、136μLの50 mM炭酸水素アンモニウム消化緩衝液、4μLの1M CaCl2および10μgのトリプシンを加え、60℃で1時間インキュベートした。
最適化消化プロトコールを、サル血清中で5μLの1.25μg/ml未標識アデュリムマブ抗体の免疫親和性濃縮後に、様々な有機溶媒の存在下で実施した。50μLの50%有機溶媒(すなわち、メタノール、エタノール、トリフルオロエタノール(TFE)またはアセトニトリル(ACN))、150μLの炭酸水素アンモニウム消化緩衝液、5μgのトリプシンを加えた。消化を60℃にて2時間実施した。予め消化されているSIL-アデュリムマブ内部標準(25 ng)を、トリプシン消化後、各ウェルに加えた。試料を繰り返し2回調製した。2回繰り返した試料の%CVは、<5%であった。図3に示すように、結果は、試験した有機溶媒が、最適化消化プロトコールにおいて変性溶液(50%MeOH)と同じ挙動をすることを示す。実験を50mMトリスおよび50mM炭酸水素アンモニウムの両方で実施し、結果は同様であった。
Claims (25)
- 生体試料中の標的タンパク質を検出および/または定量するための方法であって、
a)標的タンパク質を含む生体試料を、固定化捕捉部分(entities)へ加えて、標的タンパク質を捕捉し、これにより固定化標的タンパク質を形成する工程;
b)有機溶媒を含む変性溶液を、固定化標的タンパク質へ加えて、変性固定化標的タンパク質を形成する工程;
c)プロテアーゼを含む消化溶液を、変性固定化標的タンパク質へ加えて、タンパク質分解ペプチドを含む溶液を形成する工程;および
d)タンパク質分解ペプチドを含む溶液を、質量分析ベースの技術により分析して、生体試料中の標的タンパク質を検出および/または定量する工程であって、該分析が、該方法の1つの工程中に加えられる、少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドを利用する工程
を含み、工程(c)の前に、還元工程および/またはアルキル化工程がない、方法。 - 固定化捕捉部分が、抗体、抗体断片、タンパク質、タンパク質断片、リガンドまたはアプタマーである、請求項1に記載の方法。
- 固定化捕捉部分が、直接結合、リンカーまたは親和性相互作用により固体支持体と結合している、請求項1または2に記載の方法。
- 親和性相互作用が、ストレプトアビジン-ビオチン、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、プロテインL、アプタマーまたはリガンドを含む、請求項3に記載の方法。
- 固体支持体が、ウェルプレート、マイクロプレート、ビーズ、レジン、チップ、ファイバーまたは反応チューブである、請求項3または4に記載の方法。
- 固定化捕捉部分が、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に付着したビオチニル化抗体である、請求項3~5のいずれか一項に記載の方法。
- 標的タンパク質が、抗体、抗体断片、または抗体断片を含む融合タンパク質である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 生体試料が、血清または血漿である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)を室温にて約1時間~約4時間実施する、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)の後に、少なくとも1回の洗浄工程が続く、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)における変性溶液中の有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノール、アセトニトリル、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、またはその組合せであり、約30体積%~約100体積%で存在する、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 有機溶媒が、メタノールまたはエタノールであり、約40体積%~約60体積%で存在する、請求項11に記載の方法。
- 工程(b)を室温にて約5分間~約60分間実施する、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)における消化溶液中のプロテアーゼが、トリプシンである、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- トリプシンが、哺乳類のトリプシンである、請求項14に記載の方法。
- 工程(c)を約50℃~約70℃にて約1時間~約4時間実施する、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)と(c)の間に洗浄工程および/またはデカント工程がない、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)と(c)を、有機溶媒を含む変性溶液およびプロテアーゼを含む消化溶液を固定化標的タンパク質へ同時に加えることにより組み合わせる、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 組み合わせた変性溶液と消化溶液を約50℃~約70℃にて約1時間~約4時間インキュベートする工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドが、工程(a)中に加えられ、そして、安定な同位体標識型の標的タンパク質、または標的タンパク質に存在するユニバーサルペプチド配列を含む安定な同位体標識タンパク質である、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドが、工程(c)の前に加えられ、そして、安定な同位体標識された切断可能な型のサロゲートペプチドである、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドが、工程(c)の前および後に加えられ、そして、安定な同位体標識型のサロゲートペプチドである、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)における質量分析ベースの技術が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)である、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。
- 定量下限が、約50 ng/ml未満である、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- 定量下限が、約10 ng/ml未満である、請求項24に記載の方法。
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