JP2002521060A - 生体高分子生成のための酵素 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
正常な細胞代謝からの炭素中間体のＰＨＡへの流動または流れを至適化するために、ＰＨＡ生合成経路の酵素の発現を至適化することが所望される。遺伝子融合物は遺伝子構築物であり、ここでは、２つのオープンリーディングフレームが１つに融合されており、そしてハイブリッドタンパク質およびいくつかの場合ではハイブリッド酵素をコードする。リンカーは、空間的に別々の二機能性ハイブリッドタンパク質の２つのドメインに付加され得る。経路における連続的反応を触媒する酵素の場合では、２つの遺伝子の融合は、２つの酵素活性を互いに近接にする。第１の反応の産物が第２の反応のための基質である場合、活性部位のこの新たな配置は、この経路を通じての流動を増加するための可能性を有する第２の活性部位への、第１の反応の産物のより早い転移を生じ得る。
Description
【０００１】 （関連出願の引用） １９９８年７月３０日に出願した米国特許仮出願番号第６０／０９４，６７４
号に対する優先権を主張する。
号に対する優先権を主張する。
【０００２】 （発明の背景） 本発明は、一般的には、微生物によるポリヒドロキシアルカノエートの産生の
ための遺伝子操作した細菌および植物系ならびに遺伝子操作した植物の分野にあ
り、ここで、このポリマーの生成に必須の酵素は、ポリマー合成についての増強
された特性を有する融合タンパク質として発現される。
ための遺伝子操作した細菌および植物系ならびに遺伝子操作した植物の分野にあ
り、ここで、このポリマーの生成に必須の酵素は、ポリマー合成についての増強
された特性を有する融合タンパク質として発現される。
【０００３】 多数の微生物は、ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］ポリマーす
なわちＰＨＡの細胞内貯蔵物を蓄積する能力を有する。ＰＨＡは、広範な範囲の
工業的適用および生物医学的適用を有する、生分解性かつ生体適合性の熱可塑性
材料である（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、ＣＨＥＭＴＥ
ＣＨ ２６，３８−４４）。近年では、ＰＨＡ生体高分子は、単一のホモポリマ
ーであるポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）であると元来みなされたも
のから、異なるモノマー組成および広範な範囲の物理的特徴を有する広範なクラ
スのポリエステルが出現している。１００を超える異なるモノマーが、ＰＨＡポ
リマーに取り込まれている（ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ
，１９９５，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２２
８）。ＰＨＡを、その側鎖の長さおよびその生合成経路に従って、２つの群に分
けることが有用であった。短い側鎖を有するもの（例えば、ポリヒドロキシブチ
レート（ＰＨＢ）（Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位のホモポリマー））は、半結晶
性熱可塑性材であるのに対し、長い側鎖を有するＰＨＡは、よりエラストマー性
である。
なわちＰＨＡの細胞内貯蔵物を蓄積する能力を有する。ＰＨＡは、広範な範囲の
工業的適用および生物医学的適用を有する、生分解性かつ生体適合性の熱可塑性
材料である（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、ＣＨＥＭＴＥ
ＣＨ ２６，３８−４４）。近年では、ＰＨＡ生体高分子は、単一のホモポリマ
ーであるポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）であると元来みなされたも
のから、異なるモノマー組成および広範な範囲の物理的特徴を有する広範なクラ
スのポリエステルが出現している。１００を超える異なるモノマーが、ＰＨＡポ
リマーに取り込まれている（ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ
，１９９５，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２２
８）。ＰＨＡを、その側鎖の長さおよびその生合成経路に従って、２つの群に分
けることが有用であった。短い側鎖を有するもの（例えば、ポリヒドロキシブチ
レート（ＰＨＢ）（Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位のホモポリマー））は、半結晶
性熱可塑性材であるのに対し、長い側鎖を有するＰＨＡは、よりエラストマー性
である。
【０００４】 短い側鎖のＰＨＡ（例えば、ＰＨＢおよびＰＨＢＶ）の生合成は、中心代謝物
であるアセチル−ＣｏＡからの３つの酵素で触媒される一連の反応を通じて進行
する。この経路の第１の工程では、２つのアセチル−ＣｏＡ分子は、３−ケトア
シル−ＣｏＡチオラーゼによってアセトアセチル−ＣｏＡに縮合される。アセト
アセチル−ＣｏＡは続いて、ＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼによって、ＰＨＢ前
駆体である３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに還元される。次いで、３−ヒドロ
キシブチリル−ＣｏＡは、ＰＨＢへと重合され、これは、細菌によって、「細胞
内封入体」または顆粒として隔離される。ＰＨＢの分子量は、ほぼ１０4〜１０7 Ｄａのオーダーである。Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍのようないくつ
かの細菌では、レダクターゼ酵素は、主に補因子としてＮＡＤＨを伴って活性で
ある。ＰＨＢＶコポリマーの合成は、同じ経路を通じて進行し、その差異は、ア
セチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡが、β−ケトチオラーゼによって３
−ケトバレリル−ＣｏＡに変換されることである。次いで、２−ケトバレリル−
ＣｏＡは、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡに変換され、これは重合される。
であるアセチル−ＣｏＡからの３つの酵素で触媒される一連の反応を通じて進行
する。この経路の第１の工程では、２つのアセチル−ＣｏＡ分子は、３−ケトア
シル−ＣｏＡチオラーゼによってアセトアセチル−ＣｏＡに縮合される。アセト
アセチル−ＣｏＡは続いて、ＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼによって、ＰＨＢ前
駆体である３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに還元される。次いで、３−ヒドロ
キシブチリル−ＣｏＡは、ＰＨＢへと重合され、これは、細菌によって、「細胞
内封入体」または顆粒として隔離される。ＰＨＢの分子量は、ほぼ１０4〜１０7 Ｄａのオーダーである。Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍのようないくつ
かの細菌では、レダクターゼ酵素は、主に補因子としてＮＡＤＨを伴って活性で
ある。ＰＨＢＶコポリマーの合成は、同じ経路を通じて進行し、その差異は、ア
セチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡが、β−ケトチオラーゼによって３
−ケトバレリル−ＣｏＡに変換されることである。次いで、２−ケトバレリル−
ＣｏＡは、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡに変換され、これは重合される。
【０００５】 長い側鎖のＰＨＡは、脂肪酸β酸化または脂肪酸生合経路の中間体から生成さ
れる。β酸化の場合、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡのＬ型異性体は、ｆａｏＡ
Ｂ遺伝子によってコードされる多酵素複合体に存在するエピメラーゼ活性によっ
てＤ型異性体に変換される。脂肪酸生合成経路を通じてのアセチル−ＣｏＡから
の生合成は、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰのＬ型異性体を生成する。ＡＣＰの
ＣｏＡ誘導体への変換は、ｐｈａＧ遺伝子の産物によって触媒される（Ｋｒｕｇ
ｅｒおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ １９９８、米国特許第５，７５０，８４８
号）。
れる。β酸化の場合、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡのＬ型異性体は、ｆａｏＡ
Ｂ遺伝子によってコードされる多酵素複合体に存在するエピメラーゼ活性によっ
てＤ型異性体に変換される。脂肪酸生合成経路を通じてのアセチル−ＣｏＡから
の生合成は、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰのＬ型異性体を生成する。ＡＣＰの
ＣｏＡ誘導体への変換は、ｐｈａＧ遺伝子の産物によって触媒される（Ｋｒｕｇ
ｅｒおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ １９９８、米国特許第５，７５０，８４８
号）。
【０００６】 エノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、微生物（例えば、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌ
ｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍおよびＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）におけるＰＨ
Ａ生合成に関与している。Ｒ．ｒｕｂｒｕｍにおけるＰＨＢの生合成は、３−ヒ
ドロキシブチリル−ＣｏＡのＬ型異性体に特異的なアセトアセチル−ＣｏＡレダ
クターゼ酵素を通じて進行すると考えられる。次いで、Ｌ型からＤ型への変換は
、２つのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性の作用によって触媒される。ＰＨＢ
−ｃｏ−ＨＸ（ここで、ＸはＣ６−Ｃ１６ヒドロキシ酸である）（通常、脂肪酸
で増殖した細胞から生成されるコポリマーである）の場合では、これらの経路の
組み合わせは、異なるモノマー単位の形成を担い得る。実際は、Ａｅｒｏｍｏｎ
ａｓ ｃａｖｉａｅにおけるＰＨＡシンターゼ遺伝子（これは、コポリマーであ
るＰＨＢ−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエートを生成する）をコードするＤＮ
Ａ遺伝子座の分析は、Ｄ−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよびＤ−β−ヒド
ロキシヘキサノイル−ＣｏＡ単位の生成を担うＤ型特異的エノイル−ＣｏＡヒド
ラターゼをコードする遺伝子を同定した（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ，１９９７、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０；Ｆｕｋｕｉら、１９９
８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６６７−６７３）。
ｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍおよびＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）におけるＰＨ
Ａ生合成に関与している。Ｒ．ｒｕｂｒｕｍにおけるＰＨＢの生合成は、３−ヒ
ドロキシブチリル−ＣｏＡのＬ型異性体に特異的なアセトアセチル−ＣｏＡレダ
クターゼ酵素を通じて進行すると考えられる。次いで、Ｌ型からＤ型への変換は
、２つのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性の作用によって触媒される。ＰＨＢ
−ｃｏ−ＨＸ（ここで、ＸはＣ６−Ｃ１６ヒドロキシ酸である）（通常、脂肪酸
で増殖した細胞から生成されるコポリマーである）の場合では、これらの経路の
組み合わせは、異なるモノマー単位の形成を担い得る。実際は、Ａｅｒｏｍｏｎ
ａｓ ｃａｖｉａｅにおけるＰＨＡシンターゼ遺伝子（これは、コポリマーであ
るＰＨＢ−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエートを生成する）をコードするＤＮ
Ａ遺伝子座の分析は、Ｄ−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよびＤ−β−ヒド
ロキシヘキサノイル−ＣｏＡ単位の生成を担うＤ型特異的エノイル−ＣｏＡヒド
ラターゼをコードする遺伝子を同定した（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ，１９９７、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０；Ｆｕｋｕｉら、１９９
８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６６７−６７３）。
【０００７】 経済的理由のために、トランスジェニック作物種においてこれらのポリマーを
産生し得ることが所望される。これを達成するための方法は公知である。例えば
、米国特許第５，２４５，０２３号および米国特許第５，２５０，４３０号；米
国特許第５，５０２，２７３号；米国特許第５，５３４，４３２号；米国特許第
５，６０２，３２１号；米国特許第５，６１０，０４１号；米国特許第５，６５
０，５５５号；米国特許第５，６６３；０６３号；ＷＯ９１００９１７、ＷＯ９
２１９７４７、ＷＯ９３０２１８７、ＷＯ９３０２１９４、およびＷＯ９４１２
０１４、Ｐｏｉｒｉｅｒら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６；５２０−５２３
、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、Ｃｈｅｍｔｅｃｈ２６，
３８−４４を参照のこと。この目的を達成するために、ＰＨＡシンターゼをコー
ドする１つの遺伝子（または、１つより多いサブユニットを有するＰＨＡシンタ
ーゼの場合は複数の遺伝子）を、微生物から植物細胞に移入し、そしてＰＨＡシ
ンターゼ酵素の適切なレベルの産生を得ることが必要である。さらに、さらなる
ＰＨＡ生合成遺伝子（例えば、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル
−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラ
ーゼ遺伝子またはＰＨＡシンターゼ酵素のための基質を合成するのに必要な酵素
をコードする他の遺伝子を提供することが必要であり得る。
産生し得ることが所望される。これを達成するための方法は公知である。例えば
、米国特許第５，２４５，０２３号および米国特許第５，２５０，４３０号；米
国特許第５，５０２，２７３号；米国特許第５，５３４，４３２号；米国特許第
５，６０２，３２１号；米国特許第５，６１０，０４１号；米国特許第５，６５
０，５５５号；米国特許第５，６６３；０６３号；ＷＯ９１００９１７、ＷＯ９
２１９７４７、ＷＯ９３０２１８７、ＷＯ９３０２１９４、およびＷＯ９４１２
０１４、Ｐｏｉｒｉｅｒら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６；５２０−５２３
、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、Ｃｈｅｍｔｅｃｈ２６，
３８−４４を参照のこと。この目的を達成するために、ＰＨＡシンターゼをコー
ドする１つの遺伝子（または、１つより多いサブユニットを有するＰＨＡシンタ
ーゼの場合は複数の遺伝子）を、微生物から植物細胞に移入し、そしてＰＨＡシ
ンターゼ酵素の適切なレベルの産生を得ることが必要である。さらに、さらなる
ＰＨＡ生合成遺伝子（例えば、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル
−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラ
ーゼ遺伝子またはＰＨＡシンターゼ酵素のための基質を合成するのに必要な酵素
をコードする他の遺伝子を提供することが必要であり得る。
【０００８】 多くの場合において、異なる植物組織または小器官における発現を制御するこ
とが特に所望される。発現を制御するための方法は、当業者に公知である（Ｇａ
ｓｓｅｒおよびＦｒａｌｃｙ，１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４；１２９３−１
２９９；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ，１９９５、Ｐｏｔ
ｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、および
「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、１９９６、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．
編、Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ）。米国特許第
５，６１０，０４１号は、リーダーペプチドを付加して核遺伝子から発現された
タンパク質をプラスミドに指向させる以前に公知の技術によるプラスチド発現の
経路を記載する。より最近の技術は、組換えによる、外来遺伝子の直接的なプラ
スチド染色体への直接挿入を可能にする。（Ｓｖａｂら、１９９０、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：８５２６−８５３０；ＭｃＢｒｉ
ｄｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：７
３０１−７３０５）。プラスチドＲＮＡの原核生物の性質およびタンパク質合成
機構はまた、例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｐｈｂＣ、ｐｈｂＡおよびｐｈｂ
Ｂ遺伝子のような微生物遺伝子の発現を可能にする。
とが特に所望される。発現を制御するための方法は、当業者に公知である（Ｇａ
ｓｓｅｒおよびＦｒａｌｃｙ，１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４；１２９３−１
２９９；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ，１９９５、Ｐｏｔ
ｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、および
「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、１９９６、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．
編、Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ）。米国特許第
５，６１０，０４１号は、リーダーペプチドを付加して核遺伝子から発現された
タンパク質をプラスミドに指向させる以前に公知の技術によるプラスチド発現の
経路を記載する。より最近の技術は、組換えによる、外来遺伝子の直接的なプラ
スチド染色体への直接挿入を可能にする。（Ｓｖａｂら、１９９０、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：８５２６−８５３０；ＭｃＢｒｉ
ｄｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：７
３０１−７３０５）。プラスチドＲＮＡの原核生物の性質およびタンパク質合成
機構はまた、例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｐｈｂＣ、ｐｈｂＡおよびｐｈｂ
Ｂ遺伝子のような微生物遺伝子の発現を可能にする。
【０００９】 細菌および植物を遺伝子操作してポリマーのような産物（異なる基質に対して
連続して複数の酵素の協調発現および作用を必要とする）を作製することは、低
収率、または乏しい効率、または最終産物における変動もしくは偏差を生じ得る
。
連続して複数の酵素の協調発現および作用を必要とする）を作製することは、低
収率、または乏しい効率、または最終産物における変動もしくは偏差を生じ得る
。
【００１０】 それゆえ、本発明の目的は、細菌または植物において、複数の酵素の産物（例
えば、ポリマー、および特に、ポリヒドロキシアルカノエート）の産生を増強す
るための方法および材料を提供することである。
えば、ポリマー、および特に、ポリヒドロキシアルカノエート）の産生を増強す
るための方法および材料を提供することである。
【００１１】 （発明の要旨） 正常な細胞代謝からの炭素中間体のＰＨＡへの流動または流れを至適化するた
めに、ＰＨＡ生合成経路の酵素の発現を至適化することが所望される。遺伝子融
合物は遺伝子構築物であり、ここでは、２つのオープンリーディングフレームが
１つに融合されている。第１のオープンリーディングフレームの上流の転写配列
および翻訳配列は、両方の本来のオープンリーディングフレームを含む一次構造
を有する単一のタンパク質の合成を指向する。結果として、遺伝子融合物はハイ
ブリッドタンパク質およびいくつかの場合では二機能性ハイブリッド酵素をコー
ドする。個々の遺伝子は、例えば、ＰＣＲによって単離され、その結果、得られ
たＤＮＡフラグメントは、目的の完全コード領域またはコード領域の一部を含む
。ハイブリッドタンパク質のアミノ末端ドメインをコードするＤＮＡフラグメン
トは、翻訳開始部位および転写制御配列を含み得る。アミノ末端ドメインをコー
ドする遺伝子における停止コドンは、このＤＮＡフラグメントから取り出される
必要がある。カルボキシ末端ドメインをコードする遺伝子における停止コドンは
、このＤＮＡフラグメントにおいて保持される必要がある。制限酵素によって認
識されるＤＮＡ配列が、ＤＮＡクローニング目的のために新たな遺伝子に導入さ
れ得る。リンカーが、ハイブリッドタンパク質の２つのドメインを空間的に別々
にするように付加され得る。
めに、ＰＨＡ生合成経路の酵素の発現を至適化することが所望される。遺伝子融
合物は遺伝子構築物であり、ここでは、２つのオープンリーディングフレームが
１つに融合されている。第１のオープンリーディングフレームの上流の転写配列
および翻訳配列は、両方の本来のオープンリーディングフレームを含む一次構造
を有する単一のタンパク質の合成を指向する。結果として、遺伝子融合物はハイ
ブリッドタンパク質およびいくつかの場合では二機能性ハイブリッド酵素をコー
ドする。個々の遺伝子は、例えば、ＰＣＲによって単離され、その結果、得られ
たＤＮＡフラグメントは、目的の完全コード領域またはコード領域の一部を含む
。ハイブリッドタンパク質のアミノ末端ドメインをコードするＤＮＡフラグメン
トは、翻訳開始部位および転写制御配列を含み得る。アミノ末端ドメインをコー
ドする遺伝子における停止コドンは、このＤＮＡフラグメントから取り出される
必要がある。カルボキシ末端ドメインをコードする遺伝子における停止コドンは
、このＤＮＡフラグメントにおいて保持される必要がある。制限酵素によって認
識されるＤＮＡ配列が、ＤＮＡクローニング目的のために新たな遺伝子に導入さ
れ得る。リンカーが、ハイブリッドタンパク質の２つのドメインを空間的に別々
にするように付加され得る。
【００１２】 経路における連続的反応を触媒する酵素の場合では、２つの遺伝子の融合は、
２つの酵素活性を互いに近接にする。第１の反応の産物が第２の反応のための基
質である場合、活性部位のこの新たな配置は、経路を通じての流動を増加するた
めの可能性を有する第２の活性部位への、第１の反応の産物のより早い転移を生
じ得る。ハイブリッドにおける互いに関連する２つの触媒ドメインの配置は、そ
れらの間にリンカー配列を提供することによって変更され得る。このリンカーは
、２０の天然のアミノ酸のいずれかから構成され得、そして可変長であり得る。
長さおよび組成における変動は、ハイブリッドの個々のドメインの相対的配置お
よびその酵素活性を変化させるための重要なパラメーターである。
２つの酵素活性を互いに近接にする。第１の反応の産物が第２の反応のための基
質である場合、活性部位のこの新たな配置は、経路を通じての流動を増加するた
めの可能性を有する第２の活性部位への、第１の反応の産物のより早い転移を生
じ得る。ハイブリッドにおける互いに関連する２つの触媒ドメインの配置は、そ
れらの間にリンカー配列を提供することによって変更され得る。このリンカーは
、２０の天然のアミノ酸のいずれかから構成され得、そして可変長であり得る。
長さおよび組成における変動は、ハイブリッドの個々のドメインの相対的配置お
よびその酵素活性を変化させるための重要なパラメーターである。
【００１３】 この技術は、多酵素経路をコードする一連の遺伝子の、細菌または植物または
植物小器官（例えば、プラスチドゲノム）への直接取り込みを可能にする。いく
つかの場合では、この技術は、プラスチド遺伝子の５’未翻訳領域（これはｍＲ
ＮＡの安定性および翻訳のために重要である（Ｈａｕｓｅｒら、１９９６、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４８６−１４９７））を再操作するため、二次
構造エレメントを取り除くため、または高度に発現されるプラスチド遺伝子由来
のエレメントを付加してオペロンによってコードされる導入遺伝子の発現を最大
化するために有用であり得る。
植物小器官（例えば、プラスチドゲノム）への直接取り込みを可能にする。いく
つかの場合では、この技術は、プラスチド遺伝子の５’未翻訳領域（これはｍＲ
ＮＡの安定性および翻訳のために重要である（Ｈａｕｓｅｒら、１９９６、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４８６−１４９７））を再操作するため、二次
構造エレメントを取り除くため、または高度に発現されるプラスチド遺伝子由来
のエレメントを付加してオペロンによってコードされる導入遺伝子の発現を最大
化するために有用であり得る。
【００１４】 実施例は、複数の酵素活性をコードする活性なポリペプチドの発現を実証する
。補因子の使用を必要とし、かつ相互作用してポリマーを合成するホモ四量体酵
素が存在し、これは以前には、融合タンパク質として発現可能であることが実証
されていなかった。
。補因子の使用を必要とし、かつ相互作用してポリマーを合成するホモ四量体酵
素が存在し、これは以前には、融合タンパク質として発現可能であることが実証
されていなかった。
【００１５】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．遺伝子融合物） 正常な細胞代謝からの炭素中間体のＰＨＡへの流動または流れを至適化するた
めに、ＰＨＡ生合成経路の酵素の発現を至適化することが所望される。遺伝子融
合物は遺伝子構築物であり、ここででは、２つのオープンリーディングフレーム
が１つに融合されている。第１のオープンリーディングフレームの上流の転写配
列および翻訳配列は、両方の本来のオープンリーディングフレームを含む一次構
造を有する単一のタンパク質の合成を指向する。結果として、遺伝子融合物はハ
イブリッドタンパク質およびいくつかの場合では二機能性ハイブリッド酵素をコ
ードする。ハイブリッドタンパク質は、以下のような適用のために開発されてき
た：タンパク質精製（Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１
９８７）１６３：４４３−４４８；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｓｙｍｐ．（１９９０）５７：１２３−１３３；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｔｉ
ｂｔｅｃｈ．（１９９１）９：２２６−２３１）、生化学分析（Ｌｊｕｎｇｅｒ
ａｎｔｚら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（１９９０）２７４：９１−９４；Ｌｊｕｎ
ｇｅｒａｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）２８：８７８６−８
７９２；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．（１９９０
）５７：１２３−１３３；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｔｉｂｔｅｃｈ．（１９９１）
９：２２６−２３１）、および代謝操作（米国特許第５，４２０，０２７号；Ｃ
ａｒｌｓｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．（１９９２）１４：４３９−４４
４；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．（１９９０）５
７：１２３−１３３；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｔｉｂｔｅｃｈ．（１９９１）９：
２２６−２３１；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：１０８１７−１０８２１）。
めに、ＰＨＡ生合成経路の酵素の発現を至適化することが所望される。遺伝子融
合物は遺伝子構築物であり、ここででは、２つのオープンリーディングフレーム
が１つに融合されている。第１のオープンリーディングフレームの上流の転写配
列および翻訳配列は、両方の本来のオープンリーディングフレームを含む一次構
造を有する単一のタンパク質の合成を指向する。結果として、遺伝子融合物はハ
イブリッドタンパク質およびいくつかの場合では二機能性ハイブリッド酵素をコ
ードする。ハイブリッドタンパク質は、以下のような適用のために開発されてき
た：タンパク質精製（Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１
９８７）１６３：４４３−４４８；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｓｙｍｐ．（１９９０）５７：１２３−１３３；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｔｉ
ｂｔｅｃｈ．（１９９１）９：２２６−２３１）、生化学分析（Ｌｊｕｎｇｅｒ
ａｎｔｚら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（１９９０）２７４：９１−９４；Ｌｊｕｎ
ｇｅｒａｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）２８：８７８６−８
７９２；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．（１９９０
）５７：１２３−１３３；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｔｉｂｔｅｃｈ．（１９９１）
９：２２６−２３１）、および代謝操作（米国特許第５，４２０，０２７号；Ｃ
ａｒｌｓｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．（１９９２）１４：４３９−４４
４；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．（１９９０）５
７：１２３−１３３；Ｂｕｅｌｏｗ，Ｌ．，Ｔｉｂｔｅｃｈ．（１９９１）９：
２２６−２３１；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：１０８１７−１０８２１）。
【００１６】 個々の遺伝子は、例えば、ＰＣＲによって単離され、その結果、得られたＤＮ
Ａフラグメントは、目的の完全コード領域またはコード領域の一部を含む。ハイ
ブリッドタンパク質のアミノ末端ドメインをコードするＤＮＡフラグメントは、
翻訳開始部位および転写制御配列を含み得る。アミノ末端ドメインをコードする
遺伝子における停止コドンは、このＤＮＡフラグメントから取り出される必要が
ある。カルボキシ末端ドメインをコードする遺伝子における停止コドンは、この
ＤＮＡフラグメントにおいて保持される必要がある。制限酵素によって認識され
るＤＮＡ配列が、ＤＮＡクローニング目的のための新たな遺伝子に導入され得る
。リンカーが、ハイブリッドタンパク質の２つのドメインを空間的に別々にする
ように付加され得る。
Ａフラグメントは、目的の完全コード領域またはコード領域の一部を含む。ハイ
ブリッドタンパク質のアミノ末端ドメインをコードするＤＮＡフラグメントは、
翻訳開始部位および転写制御配列を含み得る。アミノ末端ドメインをコードする
遺伝子における停止コドンは、このＤＮＡフラグメントから取り出される必要が
ある。カルボキシ末端ドメインをコードする遺伝子における停止コドンは、この
ＤＮＡフラグメントにおいて保持される必要がある。制限酵素によって認識され
るＤＮＡ配列が、ＤＮＡクローニング目的のための新たな遺伝子に導入され得る
。リンカーが、ハイブリッドタンパク質の２つのドメインを空間的に別々にする
ように付加され得る。
【００１７】 経路における連続的反応を触媒する酵素の場合では、２つの遺伝子の融合は、
２つの酵素活性を互いに近接にする。第１の反応の産物が第２の反応のための基
質である場合、活性部位のこの新たな配置は、この経路を通じての流動を増加す
るための可能性を有する第２の活性部位に対しての、第１の反応の産物のより早
い転移を生じ得る。このハイブリッドにおける互いに関連する２つの触媒ドメイ
ンの配置は、それらの間にリンカー配列を提供することによって変更され得る。
このリンカーは、２０の天然のアミノ酸のいずれかから構成され得、そして可変
長であり得る。長さおよび組成における変動は、ハイブリッドの個々のドメイン
の相対的配置およびその酵素活性を変化させるための重要なパラメーターである
。
２つの酵素活性を互いに近接にする。第１の反応の産物が第２の反応のための基
質である場合、活性部位のこの新たな配置は、この経路を通じての流動を増加す
るための可能性を有する第２の活性部位に対しての、第１の反応の産物のより早
い転移を生じ得る。このハイブリッドにおける互いに関連する２つの触媒ドメイ
ンの配置は、それらの間にリンカー配列を提供することによって変更され得る。
このリンカーは、２０の天然のアミノ酸のいずれかから構成され得、そして可変
長であり得る。長さおよび組成における変動は、ハイブリッドの個々のドメイン
の相対的配置およびその酵素活性を変化させるための重要なパラメーターである
。
【００１８】 ＰＨＡ生合成融合酵素の有用性を、分子進化、すなわち「遺伝子シャッフリン
グ」技術を用いて改良するための方法が存在する（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｍ．Ｐ．Ｃ
．１９９４、Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｍ．Ｐ
．Ｃ．１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４，９１：
１０７４７−１０７５１）。このアプローチ作用を作用させる要件は、変異誘発
技術（この技術は、通常、ＰＣＲに基づく）、および所望の改良された特徴を有
する変異酵素を同定するためのスクリーニング技術を含む。
グ」技術を用いて改良するための方法が存在する（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｍ．Ｐ．Ｃ
．１９９４、Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｍ．Ｐ
．Ｃ．１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４，９１：
１０７４７−１０７５１）。このアプローチ作用を作用させる要件は、変異誘発
技術（この技術は、通常、ＰＣＲに基づく）、および所望の改良された特徴を有
する変異酵素を同定するためのスクリーニング技術を含む。
【００１９】 （Ａ．遺伝子） 適切な遺伝子としては、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、β−ケトチオ
ラーゼ、アシルＣｏＡレダクターゼ、ファシン（ｐｈａｓｉｎ）、エノイル−Ｃ
ｏＡヒドラターゼ、およびβ−ヒドロキシアシルＡＣＰ：：コエンザイムＡトラ
ンスフェラーゼが挙げられる。構築され得る融合物の例を、図１Ａ〜１Ｈに例示
する。
ラーゼ、アシルＣｏＡレダクターゼ、ファシン（ｐｈａｓｉｎ）、エノイル−Ｃ
ｏＡヒドラターゼ、およびβ−ヒドロキシアシルＡＣＰ：：コエンザイムＡトラ
ンスフェラーゼが挙げられる。構築され得る融合物の例を、図１Ａ〜１Ｈに例示
する。
【００２０】 β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子は、以下から単離されている：Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ（ＭＢＸ非公開；Ｃｈｏｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．６４（１２）、４８９７−４９０３（１９９８）
）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｔｏｐｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．およ
びＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−
１５３０３（１９８９）；Ｓｌａｔｅｒら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．１８０：１９７９−１９８７）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（Ｓｃ
ｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏ
ｓｕｍ（Ｌｉｂｅｒｇｅｓｅｌｌ，Ｍ．およびＳｔｅｒｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）、１３５−１５０（１９９２））、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ（Ｕｍｅｄａら、Ａｐｐｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７０−７２：３４１−３５２（１９９８））、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｙａｂｕｔａｎｉら、
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３（１−２、８５−９０（１９
９５））、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１、２５５３−２５５９（１９９５））、Ｔｈｉ
ｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌら、Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（４）、４９３−５０１（１
９９３））、およびＺｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏｐｌｅｓら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１），９７−１０２（１９８７））。
ａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ（ＭＢＸ非公開；Ｃｈｏｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．６４（１２）、４８９７−４９０３（１９９８）
）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｔｏｐｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．およ
びＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−
１５３０３（１９８９）；Ｓｌａｔｅｒら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．１８０：１９７９−１９８７）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（Ｓｃ
ｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏ
ｓｕｍ（Ｌｉｂｅｒｇｅｓｅｌｌ，Ｍ．およびＳｔｅｒｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）、１３５−１５０（１９９２））、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ（Ｕｍｅｄａら、Ａｐｐｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７０−７２：３４１−３５２（１９９８））、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｙａｂｕｔａｎｉら、
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３（１−２、８５−９０（１９
９５））、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１、２５５３−２５５９（１９９５））、Ｔｈｉ
ｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌら、Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（４）、４９３−５０１（１
９９３））、およびＺｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏｐｌｅｓら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１），９７−１０２（１９８７））。
【００２１】 レダクターゼをコードする遺伝子は、以下から単離されている：Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｓ ｌａｔｕｓ（Ｃｈｏｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．６４（１２）、４８９７−４９０３（１９９８））、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐ
ｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−１５３０３（１９８９））；Ａｃ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ）、Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ（Ｌｉｂｅｒｇｅｓｅｌｌ、Ｍ．およびＳｔｅｉｎｂ
ｕｃｈｅｌ、Ａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）、１３５−１５０
（１９９２））；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ（Ｕｍｅｄａ
ら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７０−７２：３４１−３５２
（１９９８））、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３（１−２）、８５−９０（１９９
５））、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ １４１（Ｐｔ１０）、２５５３−２５５９（１９９５））、およびＺ．ｒ
ａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ、Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．、
１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：３４９−３５
７））。
ｇｅｎｓ ｌａｔｕｓ（Ｃｈｏｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．６４（１２）、４８９７−４９０３（１９９８））、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐ
ｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−１５３０３（１９８９））；Ａｃ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ）、Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ（Ｌｉｂｅｒｇｅｓｅｌｌ、Ｍ．およびＳｔｅｉｎｂ
ｕｃｈｅｌ、Ａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）、１３５−１５０
（１９９２））；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ（Ｕｍｅｄａ
ら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７０−７２：３４１−３５２
（１９９８））、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３（１−２）、８５−９０（１９９
５））、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ １４１（Ｐｔ１０）、２５５３−２５５９（１９９５））、およびＺ．ｒ
ａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ、Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．、
１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：３４９−３５
７））。
【００２２】 ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子は、以下から単離されている：Ａｅｒｏ
ｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（Ｆｕｋｕｉ、Ｔ．およびＤｏｉ，Ｙ．Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１７９（１５）、４８２１−４８３０（１９９７））、Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｓ ｌａｔｕｓ（Ｃｈｏｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．６４（１２）、４８９７−４９０３（１９９８））、Ｒ．ｅｕｔｒｏ
ｐｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−１５３０３（１９８９））；Ｌ
ｅｅら、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ）、Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ（Ｌｉｂｅｒｇｅｓｅｌｌ、Ｍ．およびＳｔｅｉ
ｎｂｕｃｈｅｌ、Ａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）、１３５−１
５０（１９９２））；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎ
ｓ（ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９（３）、３０９−３１７（１９９３））、
Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０１９９
６４）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｃｉｄｐｐｈｉｌａ（Ｕｍｅｄａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．７０−７２：３４１−３５２（１９９８））、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉ
ｆｉｃａｎｓ（Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（３）、７７４−
７７９（１９９６））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｔｉ
ｍｍおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１
）、１５−３０（１９９２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎ
ｓ（Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）、２１９１−２
１９８（１９９１））、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ（Ｃｅｖａｌｌｏｓら、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（６）、１６４６−１６５４（１９９６））、
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １
４１（Ｐｔ１０）、２５５３−２５５９（１９９５））、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｒｕｂｅｒ（Ｐｉｅｐｅｒ、Ｕ．およびＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ、Ａ．、
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９６（１）、７３−８０（１９９２
））、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｒｔｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９３、２８５−２９０（１９９２））、
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ
ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９（２−４）、２１７−２３０（
１９９２）；Ｈｕｓｔｅｄｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５，７０
９−７１４（１９９３））、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｋａｎｅｔ
ｏ、Ｔ．ＤＮＡ Ｒｅｓ．３（３）、１０９−１３６（１９９６））、Ｔ．ｖｉ
ｏｌａｃｅａｅ（Ｌｉｂｅｒｇｅｓｅｌｌら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（４）、４９３−５０１（１９９３））、およびＺ
．ｒａｍｉｇｅｒａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６６２４２）。
ｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（Ｆｕｋｕｉ、Ｔ．およびＤｏｉ，Ｙ．Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１７９（１５）、４８２１−４８３０（１９９７））、Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｓ ｌａｔｕｓ（Ｃｈｏｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．６４（１２）、４８９７−４９０３（１９９８））、Ｒ．ｅｕｔｒｏ
ｐｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−１５３０３（１９８９））；Ｌ
ｅｅら、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ）、Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ（Ｌｉｂｅｒｇｅｓｅｌｌ、Ｍ．およびＳｔｅｉ
ｎｂｕｃｈｅｌ、Ａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）、１３５−１
５０（１９９２））；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎ
ｓ（ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９（３）、３０９−３１７（１９９３））、
Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０１９９
６４）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｃｉｄｐｐｈｉｌａ（Ｕｍｅｄａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．７０−７２：３４１−３５２（１９９８））、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉ
ｆｉｃａｎｓ（Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（３）、７７４−
７７９（１９９６））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｔｉ
ｍｍおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１
）、１５−３０（１９９２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎ
ｓ（Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）、２１９１−２
１９８（１９９１））、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ（Ｃｅｖａｌｌｏｓら、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（６）、１６４６−１６５４（１９９６））、
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １
４１（Ｐｔ１０）、２５５３−２５５９（１９９５））、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｒｕｂｅｒ（Ｐｉｅｐｅｒ、Ｕ．およびＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ、Ａ．、
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９６（１）、７３−８０（１９９２
））、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｒｔｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９３、２８５−２９０（１９９２））、
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ
ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９（２−４）、２１７−２３０（
１９９２）；Ｈｕｓｔｅｄｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５，７０
９−７１４（１９９３））、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｋａｎｅｔ
ｏ、Ｔ．ＤＮＡ Ｒｅｓ．３（３）、１０９−１３６（１９９６））、Ｔ．ｖｉ
ｏｌａｃｅａｅ（Ｌｉｂｅｒｇｅｓｅｌｌら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（４）、４９３−５０１（１９９３））、およびＺ
．ｒａｍｉｇｅｒａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６６２４２）。
【００２３】 ｐｈｂ遺伝子と優位に相同性を共有するがＰＨＡ形成と関与付けられていない
他の遺伝子および／またはその対応する遺伝子産物もまた、使用され得る。チオ
ラーゼおよびレダクターゼ様の酵素をコードする遺伝子は、広汎な非ＰＨＢ産生
細菌において同定されている。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｕ２９５８１，Ｄ９０８５１、Ｄ
９０７７７）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｕ３２７６１
）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（Ｄ１０３９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｕ８８６５３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａ
ｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｕ０８４６５）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｅｐｒａｅ（Ｕ０００１４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ（Ｚ７３９０２）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ＡＥ
０００５８２）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｚ９２９７４）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕ
ｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＡＥ００１０２１）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎ
ｕｃｌｅａｔｕｍ（Ｕ３７７２３）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓ（Ｌ０５７７０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｄ
８４４３２、Ｚ９９１２０，Ｕ２９０８４）およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ
ｓｐ．（Ｄ９０９１０）は、すべて、その染色体由来の１つ以上のチオラーゼ
をコードする。真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ（Ｌ２０４２８）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍ
ｂｅ（Ｄ８９１８４）、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（Ｄ１３４７０
）、Ｃａｅｎｏｒｈａｄｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（Ｕ４１１０５）、ヒト
（Ｓ７０５１４）、ラット（Ｄ１３９２１）、マウス（Ｍ３５７９７）、ラディ
ッシュ（Ｘ７８１１６）、カボチャ（Ｄ７０８９５）およびキュウリ（Ｘ６７６
９６）もまた、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の３−ケトチオラーゼと有意な相同性
を有するタンパク質を発現する。
他の遺伝子および／またはその対応する遺伝子産物もまた、使用され得る。チオ
ラーゼおよびレダクターゼ様の酵素をコードする遺伝子は、広汎な非ＰＨＢ産生
細菌において同定されている。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｕ２９５８１，Ｄ９０８５１、Ｄ
９０７７７）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｕ３２７６１
）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（Ｄ１０３９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｕ８８６５３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａ
ｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｕ０８４６５）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｅｐｒａｅ（Ｕ０００１４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ（Ｚ７３９０２）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ＡＥ
０００５８２）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｚ９２９７４）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕ
ｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＡＥ００１０２１）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎ
ｕｃｌｅａｔｕｍ（Ｕ３７７２３）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓ（Ｌ０５７７０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｄ
８４４３２、Ｚ９９１２０，Ｕ２９０８４）およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ
ｓｐ．（Ｄ９０９１０）は、すべて、その染色体由来の１つ以上のチオラーゼ
をコードする。真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ（Ｌ２０４２８）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍ
ｂｅ（Ｄ８９１８４）、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（Ｄ１３４７０
）、Ｃａｅｎｏｒｈａｄｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（Ｕ４１１０５）、ヒト
（Ｓ７０５１４）、ラット（Ｄ１３９２１）、マウス（Ｍ３５７９７）、ラディ
ッシュ（Ｘ７８１１６）、カボチャ（Ｄ７０８９５）およびキュウリ（Ｘ６７６
９６）もまた、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の３−ケトチオラーゼと有意な相同性
を有するタンパク質を発現する。
【００２４】 アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードするｐｈｂＢ遺伝子と有意な相同
性を有する遺伝子は、いくつかの生物から単離されている：Ａｚｏｓｐｉｒｉｌ
ｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（Ｘ６４７７２，Ｘ５２９１３）およびＲｈｉ
ｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（Ｕ５３３２７，Ｙ００６０４），Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｄ９０
７４５），Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ（Ｕ３９４４１），Ｈ．ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ（Ｕ３２７０１），Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｕ５９４３３），Ｐ．ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｕ９１６３１），Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｄ
９０９０７），Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（ＡＥ０００５７０），Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｘ６４４６４），Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ
（Ｘ５４５６６）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｕ
６６８００）。
性を有する遺伝子は、いくつかの生物から単離されている：Ａｚｏｓｐｉｒｉｌ
ｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（Ｘ６４７７２，Ｘ５２９１３）およびＲｈｉ
ｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（Ｕ５３３２７，Ｙ００６０４），Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｄ９０
７４５），Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ（Ｕ３９４４１），Ｈ．ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ（Ｕ３２７０１），Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｕ５９４３３），Ｐ．ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｕ９１６３１），Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（Ｄ
９０９０７），Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（ＡＥ０００５７０），Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｘ６４４６４），Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ
（Ｘ５４５６６）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｕ
６６８００）。
【００２５】 ＰＨＡ顆粒に結合する多数のタンパク質が同定され、そしてその遺伝子がクロ
ーニングされている（Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌら、１９９５、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ（補遺１）４１：９４−１０５）。現在の仮説は、これらのタ
ンパク質が、アブラナにおいてオレオシン油貯蔵タンパク質に類似する役割を果
たしていることであり（Ｈｕａｎｇ，Ａ．Ｈ．Ｃ．１９９２、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ
．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：１７７
−２００）、そしてファシン（ｐｈａｓｉｎ）と命名されている。例えば、タン
パク質ＧＡ２４は、Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＡ産
生細胞において見出された２４キロダルトンのタンパク質である（Ｗｉｅｃｚｏ
ｒｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５、１７７、２４２５−２４３５）
。ＧＡ２４をコードする遺伝子であるｐｈａＰは、細菌のＰＨＡがもれやすい変
異体の補完によって単離された。Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋらは、そのＧＡ２４の研究
において、そのタンパク質がＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＡ産生細胞において
ＰＨＡ顆粒を被覆し、そしてＧＡ２４において欠損する細胞が非常に大きな顆粒
を形成したのに対し、野生型細胞は遥かに小さな顆粒を有していたことを観察し
た（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５、１７７、２４
２５−２４３５）。この観察に基づいて、その著者らは、ＧＡ２４は、ＰＨＡ顆
粒の大きさを制御することを担うファシンと命名された多数のそのようなタンパ
ク質のうちの一つであると提唱した。多数の異なる細菌由来の他のＰＨＡ顆粒の
免疫学的分析がこのタンパク質の保存を示し（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら、１９９６
、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １３５：２３−３０
）、そしてその著者らは、ＧＡ２４のホモログが広汎に存在し、そしてその遺伝
子が容易に単離され得ると結論付けた。１３Ｋｄファシンは、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐ．において同定されている（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、１９９５、
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．１３３：２７７−２８３）。
ーニングされている（Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌら、１９９５、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ（補遺１）４１：９４−１０５）。現在の仮説は、これらのタ
ンパク質が、アブラナにおいてオレオシン油貯蔵タンパク質に類似する役割を果
たしていることであり（Ｈｕａｎｇ，Ａ．Ｈ．Ｃ．１９９２、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ
．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：１７７
−２００）、そしてファシン（ｐｈａｓｉｎ）と命名されている。例えば、タン
パク質ＧＡ２４は、Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＡ産
生細胞において見出された２４キロダルトンのタンパク質である（Ｗｉｅｃｚｏ
ｒｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５、１７７、２４２５−２４３５）
。ＧＡ２４をコードする遺伝子であるｐｈａＰは、細菌のＰＨＡがもれやすい変
異体の補完によって単離された。Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋらは、そのＧＡ２４の研究
において、そのタンパク質がＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＡ産生細胞において
ＰＨＡ顆粒を被覆し、そしてＧＡ２４において欠損する細胞が非常に大きな顆粒
を形成したのに対し、野生型細胞は遥かに小さな顆粒を有していたことを観察し
た（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５、１７７、２４
２５−２４３５）。この観察に基づいて、その著者らは、ＧＡ２４は、ＰＨＡ顆
粒の大きさを制御することを担うファシンと命名された多数のそのようなタンパ
ク質のうちの一つであると提唱した。多数の異なる細菌由来の他のＰＨＡ顆粒の
免疫学的分析がこのタンパク質の保存を示し（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら、１９９６
、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ １３５：２３−３０
）、そしてその著者らは、ＧＡ２４のホモログが広汎に存在し、そしてその遺伝
子が容易に単離され得ると結論付けた。１３Ｋｄファシンは、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐ．において同定されている（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、１９９５、
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．１３３：２７７−２８３）。
【００２６】 （Ｂ．形質転換ベクター） ＤＮＡ構築物は、植物へ導入遺伝子を導入し得る形質転換ベクターを含む。利
用可能な多くの植物形質転換ベクターの選択肢が存在する。Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｉ．およびＳ
ｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｇ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａ
ｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９６
）、Ｏｗｅｎ、Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．ＥｎｇｌａｎｄならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕ
ｒｓｅ ｍａｎｕａｌ（１９９５）、Ｍａｌｉｇａ、Ｐ．、Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ
．Ｆ．、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ａ．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．およびＶａｍｅ
ｒ、Ｊ．Ｅ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
用可能な多くの植物形質転換ベクターの選択肢が存在する。Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｉ．およびＳ
ｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｇ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａ
ｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９６
）、Ｏｗｅｎ、Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．ＥｎｇｌａｎｄならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕ
ｒｓｅ ｍａｎｕａｌ（１９９５）、Ｍａｌｉｇａ、Ｐ．、Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ
．Ｆ．、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ａ．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．およびＶａｍｅ
ｒ、Ｊ．Ｅ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００２７】 （Ｃ．調節配列） 一般に、植物形質転換ベクターは、５’調節配列および３’調節配列（プロモ
ーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナル）の転写制御
下の目的の１つ以上のコード配列、ならびに選択もしくはスクリーニング可能な
マーカー遺伝子を含む。５’調節配列のための通常の要件は、プロモーター、転
写開始部位、およびｍＲＮＡプロセシングシグナルを含む。３’調節配列として
は、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルが挙げられる。さ
らなるＲＮＡプロセシングシグナルおよびリボゾーム配列は、単一の転写物から
２つ以上のポリペプチドの発現のための構築物へと操作され得る（米国特許第５
，５１９，１６４号）。このアプローチは、単一の遺伝子座において複数の導入
遺伝子を配置する利点を有し、これは、続く植物の交配の試みにおいて有利であ
る。さらなるアプローチは、相同組換えによる植物プラスチド染色体を特異的に
形質転換するベクターを使用することである（米国特許第５，５４５，８１８号
）。この場合、プラスチドゲノムの原核生物的性質の利点を利用し、そして多数
の導入遺伝子をオペロンとして挿入することが可能である。
ーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナル）の転写制御
下の目的の１つ以上のコード配列、ならびに選択もしくはスクリーニング可能な
マーカー遺伝子を含む。５’調節配列のための通常の要件は、プロモーター、転
写開始部位、およびｍＲＮＡプロセシングシグナルを含む。３’調節配列として
は、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルが挙げられる。さ
らなるＲＮＡプロセシングシグナルおよびリボゾーム配列は、単一の転写物から
２つ以上のポリペプチドの発現のための構築物へと操作され得る（米国特許第５
，５１９，１６４号）。このアプローチは、単一の遺伝子座において複数の導入
遺伝子を配置する利点を有し、これは、続く植物の交配の試みにおいて有利であ
る。さらなるアプローチは、相同組換えによる植物プラスチド染色体を特異的に
形質転換するベクターを使用することである（米国特許第５，５４５，８１８号
）。この場合、プラスチドゲノムの原核生物的性質の利点を利用し、そして多数
の導入遺伝子をオペロンとして挿入することが可能である。
【００２８】 多数の植物プロモーターが公知であり、そして目的の遺伝子の構成的であるか
、または環境もしくは発生上で調節されるかのいずれかの発現を生じる。植物プ
ロモーターは、ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２９３−１２９９によって記載されるように、異なる植物組織または
小器官において導入遺伝子の発現を制御するように選択され得る。導入遺伝子の
５’側末端を操作して、プラスチドまたは他の細胞成分オルガネラ標的化ペプチ
ドをコードする配列を、その導入遺伝子とインフレームに連結させて含ませ得る
。適切な構成的植物プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓプロモーター（ＣａＭＶ）および増強されたＣａＭＶプロモーター（Ｏｄｅｌ
ｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０），アクチンプロモーター（Ｍ
ｃＥｌｒｏｙら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１）、Ａ
ｄｈＩプロモーター（Ｆｒｏｍｍら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
８：８３３−８３９；Ｋｙｏｚｕｋａら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．２２８：４０−４８）、ユビキチンプロモーター、ゴマノハグサモザイク
ウイルスプロモーター、マンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモー
ター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモータ
ーが挙げられる。有用な調節可能なプロモーター系としては、ホウレンソウニト
レート誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、リブロース二リン酸カル
ボキシラーゼプロモーターの小サブユニット、および化学的誘導性プロモーター
芽挙げられる（米国特許第５，３６４，７８０号および同第５，３６４，７８０
号）。
、または環境もしくは発生上で調節されるかのいずれかの発現を生じる。植物プ
ロモーターは、ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２９３−１２９９によって記載されるように、異なる植物組織または
小器官において導入遺伝子の発現を制御するように選択され得る。導入遺伝子の
５’側末端を操作して、プラスチドまたは他の細胞成分オルガネラ標的化ペプチ
ドをコードする配列を、その導入遺伝子とインフレームに連結させて含ませ得る
。適切な構成的植物プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓプロモーター（ＣａＭＶ）および増強されたＣａＭＶプロモーター（Ｏｄｅｌ
ｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０），アクチンプロモーター（Ｍ
ｃＥｌｒｏｙら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１）、Ａ
ｄｈＩプロモーター（Ｆｒｏｍｍら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
８：８３３−８３９；Ｋｙｏｚｕｋａら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．２２８：４０−４８）、ユビキチンプロモーター、ゴマノハグサモザイク
ウイルスプロモーター、マンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモー
ター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモータ
ーが挙げられる。有用な調節可能なプロモーター系としては、ホウレンソウニト
レート誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、リブロース二リン酸カル
ボキシラーゼプロモーターの小サブユニット、および化学的誘導性プロモーター
芽挙げられる（米国特許第５，３６４，７８０号および同第５，３６４，７８０
号）。
【００２９】 発生中の種子においてのみその導入遺伝子を発現することが好ましくあり得る
。この目的に適切なプロモーターとしては、ナピン遺伝子プロモーター（米国特
許第５，４２０，０３４号；同第５，６０８，１５２号）、アセチルＣｏＡカル
ボキシラーゼプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号、同第５，６０８
，１５２号）、２Ｓアルブミンプロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター
、ファセオリンプロモーター（Ｓｌｉｇｈｔｏｒｎら、１９８３Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１８９７−１９０１）、オレオシンプ
ロモーター（ｐｌａｎｔら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：
１９３−２０５；Ｒｏｗｌｅｙら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ａｃｔａ．１３４５：１−４；米国特許第５，６５０，５５４号；ＰＣＴ Ｗ
Ｏ９３／２０２１６）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプ
ンシンターゼプロモーター、およびデンプン分岐酵素プロモーターが挙げられる
。
。この目的に適切なプロモーターとしては、ナピン遺伝子プロモーター（米国特
許第５，４２０，０３４号；同第５，６０８，１５２号）、アセチルＣｏＡカル
ボキシラーゼプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号、同第５，６０８
，１５２号）、２Ｓアルブミンプロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター
、ファセオリンプロモーター（Ｓｌｉｇｈｔｏｒｎら、１９８３Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１８９７−１９０１）、オレオシンプ
ロモーター（ｐｌａｎｔら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：
１９３−２０５；Ｒｏｗｌｅｙら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ａｃｔａ．１３４５：１−４；米国特許第５，６５０，５５４号；ＰＣＴ Ｗ
Ｏ９３／２０２１６）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプ
ンシンターゼプロモーター、およびデンプン分岐酵素プロモーターが挙げられる
。
【００３０】 上記の特徴の多くを含む多数の有用な植物ベクターは文献に記載されている。
これらの中で特に有用なものは、Ｉｓｈｉｄａら、（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ
ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０）に記載された「スーパー
バイナリー」ベクターおよびＣａｍｂｉａ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌ
ｉａから利用可能な広汎なベクター（１９９７年９月１５〜１８日、Ｍａｌａｃ
ｃａ，Ｍａｌａｙｓｉａの、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏ
ｎ Ｒｉｃｅ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｆｏｕ
ｎｄａｔｉｏｎ Ｍｅｅｔｉｎｇにおいて提示されたＲｏｂｅｒｔｓら、「Ａ
ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｅｔ ｏｆ ｍｏｄｕｌａｒ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ」に記載され
ている。）である。
これらの中で特に有用なものは、Ｉｓｈｉｄａら、（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ
ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０）に記載された「スーパー
バイナリー」ベクターおよびＣａｍｂｉａ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌ
ｉａから利用可能な広汎なベクター（１９９７年９月１５〜１８日、Ｍａｌａｃ
ｃａ，Ｍａｌａｙｓｉａの、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏ
ｎ Ｒｉｃｅ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｆｏｕ
ｎｄａｔｉｏｎ Ｍｅｅｔｉｎｇにおいて提示されたＲｏｂｅｒｔｓら、「Ａ
ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｅｔ ｏｆ ｍｏｄｕｌａｒ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ」に記載され
ている。）である。
【００３１】 （ＩＩ．植物の形質転換およびその選択のための方法） 植物において１を超える遺伝子産物を発現させることが好ましい。多数の方法
を使用して、これを達成し得る。これには以下が挙げられる：コードＤＮＡを、
すべての必要なＤＮＡが単一のベクターに存在する単一の形質転換事象において
導入する工程；すべての必要なＤＮＡが別個のベクターに存在するが、植物細胞
に同時に導入される同時係質転換事象において（導入する工程）；独立した形質
転換事象によるコードＤＮＡの首尾よい植物細胞への導入（すなわち、１つ以上
のそのコードＤＮＡをさらなるＤＮＡ構築物とともに発現するトランスジェニッ
ク植物細胞の形質転換）；別個の形質転換事象による必要なＤＮＡ構築物の各々
の形質転換、その個々のタンパク質を発現するトランスジェニック植物を得る工
程および伝統的な植物交配方法を用いて単一の植物にその経路全体を組み込む工
程。
を使用して、これを達成し得る。これには以下が挙げられる：コードＤＮＡを、
すべての必要なＤＮＡが単一のベクターに存在する単一の形質転換事象において
導入する工程；すべての必要なＤＮＡが別個のベクターに存在するが、植物細胞
に同時に導入される同時係質転換事象において（導入する工程）；独立した形質
転換事象によるコードＤＮＡの首尾よい植物細胞への導入（すなわち、１つ以上
のそのコードＤＮＡをさらなるＤＮＡ構築物とともに発現するトランスジェニッ
ク植物細胞の形質転換）；別個の形質転換事象による必要なＤＮＡ構築物の各々
の形質転換、その個々のタンパク質を発現するトランスジェニック植物を得る工
程および伝統的な植物交配方法を用いて単一の植物にその経路全体を組み込む工
程。
【００３２】 これらのベクターを用いた適切な作物植物宿主の形質転換は、ある範囲の方法
および植物組織によって達成され得る。適切な植物としては以下が挙げられる：
Ｂｒａｓｓｉｃａ科（ｎａｐｕｓ、ｒａｐｐａ、ｓｐ．ｃａｒｉｎａｔａおよび
ｊｕｎｃｅａを含む）、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、パーム、ココ
ナツ、ベニバナ、ピーナツ、カラシナ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａを含む）およ
びアマ。これらのベクターを用いた形質転換のための適切な組織としては以下が
挙げられる：プロトプラスト、細胞、カルス組織、葉ディスク、花粉、***組織
など。適切な形質転換手順としては、以下が挙げられる：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ媒介性形質転換、遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｃｓ）、微量注入、エレクト
ロポレーション、ポリエチレングリコール媒介性プロトプラスト形質転換、リポ
ソーム媒介性形質転換、シリコンファイバー媒介性形質転換（米国特許第５，４
６４，７６５号）など。（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（
１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｇ．編、
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９６）、Ｏｗｅｎ、Ｍ．Ｒ．Ｌ．お
よびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌ
ａｎｄならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ−ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ（１９９
５）、Ｍａｌｉｇａ、Ｐ．、Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ａ
．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．およびＶａｍｅｒ、Ｊ．Ｅ．編、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
および植物組織によって達成され得る。適切な植物としては以下が挙げられる：
Ｂｒａｓｓｉｃａ科（ｎａｐｕｓ、ｒａｐｐａ、ｓｐ．ｃａｒｉｎａｔａおよび
ｊｕｎｃｅａを含む）、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、パーム、ココ
ナツ、ベニバナ、ピーナツ、カラシナ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａを含む）およ
びアマ。これらのベクターを用いた形質転換のための適切な組織としては以下が
挙げられる：プロトプラスト、細胞、カルス組織、葉ディスク、花粉、***組織
など。適切な形質転換手順としては、以下が挙げられる：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ媒介性形質転換、遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｃｓ）、微量注入、エレクト
ロポレーション、ポリエチレングリコール媒介性プロトプラスト形質転換、リポ
ソーム媒介性形質転換、シリコンファイバー媒介性形質転換（米国特許第５，４
６４，７６５号）など。（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（
１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｇ．編、
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９６）、Ｏｗｅｎ、Ｍ．Ｒ．Ｌ．お
よびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌ
ａｎｄならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ−ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ（１９９
５）、Ｍａｌｉｇａ、Ｐ．、Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ａ
．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．およびＶａｍｅｒ、Ｊ．Ｅ．編、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００３３】 これらの特異的な作物について形質転換手順が確立されている（Ｇｅｎｅ Ｔ
ｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｉ．お
よびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｇ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅ
ｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（
１９９６）、Ｏｗｅｎ、Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．ＥｎｇｌａｎｄならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ（１９９５）、Ｍａｌｉｇａ、Ｐ．、Ｋｌｅｓｓ
ｉｇ，Ｄ．Ｆ．、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ａ．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．および
Ｖａｍｅｒ、Ｊ．Ｅ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
ｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｉ．お
よびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｇ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅ
ｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（
１９９６）、Ｏｗｅｎ、Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．ＥｎｇｌａｎｄならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ（１９９５）、Ｍａｌｉｇａ、Ｐ．、Ｋｌｅｓｓ
ｉｇ，Ｄ．Ｆ．、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ａ．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．および
Ｖａｍｅｒ、Ｊ．Ｅ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００３４】 Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓは、例えば、米国特許第５，１８８，９５８号
および同第５，４６３，１７４号に記載されるように形質転換され得る。他のＢ
ｒａｓｓｉｃａ（例えば、ｒａｐｐａ，ｃａｒｉｎａｔａおよびｊｕｎｃｅａ）
ならびにＳｉｎａｐｉｓ ａｌｂａは、Ｍｏｌｏｎｅｙら（１９８９、Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２３８−２４２））に記載されるように形
質転換され得る。ダイズは、多数の報告された手順によって形質転換され得る。
米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，０１５，９４４号、同第５，０２４
，９４４号、同第５，３２２，７８３号、同第５，４１６，０１１号、同第５，
１６９，７７０号を参照のこと。多数の形質転換手順が、トランスジェニックト
ウモロコシ植物の産生のために報告されている。これには、以下が挙げられる：
花粉形質転換（米国特許第５，６２９，１８３号）、シリコンファイバー媒介性
形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号）、プロトプラストのエレクトロポ
レーション（米国特許第５，２３１，０１９号；同第５，４７２，８６９号；同
第５，３８４，２５３号）遺伝子銃（米国特許第５，５３８，８７７号；同第５
，５３８，８８０号）およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換（ＥＰ
０ ６０４ ６６２ Ａ１；ＷＯ９４／００９７７）。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ媒介性手順は、特に好ましい。なぜなら、この手順を用いて導入遺伝子構
築物の単一の組換え事象がより容易に達成され、これが引き続く植物交配を大い
に容易にするからである。ワタは、粒子ボンバードメント（米国特許第５，００
４，８６３号；同第５，１５９，１３５号）によって形質転換され得る。ヒマワ
リは、粒子ボンバードメントおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の組合せを
用いて形質転換され得る（ＥＰ０４８６２３３Ａ２；米国特許第５，０３０，５
７２号）。アマは、粒子ボンバードメントまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒
介性の形質転換のいずれかによって形質転換され得る。本発明を実施するにおい
て有用であるレコンビナーゼ技術としては以下が挙げられる：ｃｒｅ−ｌｏｘ、
ＦＬＰ／ＦＲＴおよびＧｉｎ系。本明細書に記載した目的のためにこれらの技術
が使用され得る方法は、例えば、米国特許第５，５２７，６９５号；Ｄａｌｅお
よびＯｗ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：
１０５５８−１０５６２；Ｓａｕｅｒ、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ２２５：８９０−９００；Ｍｅｄｂｅｒｒｙら、１９９５、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４８５−４９０に記載されている
。ＵＳ５，７２３，７６４号は、ｃｒｅ／ｌｏｘを用いた植物遺伝子発現を制御
するための方法を記載する。
および同第５，４６３，１７４号に記載されるように形質転換され得る。他のＢ
ｒａｓｓｉｃａ（例えば、ｒａｐｐａ，ｃａｒｉｎａｔａおよびｊｕｎｃｅａ）
ならびにＳｉｎａｐｉｓ ａｌｂａは、Ｍｏｌｏｎｅｙら（１９８９、Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２３８−２４２））に記載されるように形
質転換され得る。ダイズは、多数の報告された手順によって形質転換され得る。
米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，０１５，９４４号、同第５，０２４
，９４４号、同第５，３２２，７８３号、同第５，４１６，０１１号、同第５，
１６９，７７０号を参照のこと。多数の形質転換手順が、トランスジェニックト
ウモロコシ植物の産生のために報告されている。これには、以下が挙げられる：
花粉形質転換（米国特許第５，６２９，１８３号）、シリコンファイバー媒介性
形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号）、プロトプラストのエレクトロポ
レーション（米国特許第５，２３１，０１９号；同第５，４７２，８６９号；同
第５，３８４，２５３号）遺伝子銃（米国特許第５，５３８，８７７号；同第５
，５３８，８８０号）およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換（ＥＰ
０ ６０４ ６６２ Ａ１；ＷＯ９４／００９７７）。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ媒介性手順は、特に好ましい。なぜなら、この手順を用いて導入遺伝子構
築物の単一の組換え事象がより容易に達成され、これが引き続く植物交配を大い
に容易にするからである。ワタは、粒子ボンバードメント（米国特許第５，００
４，８６３号；同第５，１５９，１３５号）によって形質転換され得る。ヒマワ
リは、粒子ボンバードメントおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の組合せを
用いて形質転換され得る（ＥＰ０４８６２３３Ａ２；米国特許第５，０３０，５
７２号）。アマは、粒子ボンバードメントまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒
介性の形質転換のいずれかによって形質転換され得る。本発明を実施するにおい
て有用であるレコンビナーゼ技術としては以下が挙げられる：ｃｒｅ−ｌｏｘ、
ＦＬＰ／ＦＲＴおよびＧｉｎ系。本明細書に記載した目的のためにこれらの技術
が使用され得る方法は、例えば、米国特許第５，５２７，６９５号；Ｄａｌｅお
よびＯｗ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：
１０５５８−１０５６２；Ｓａｕｅｒ、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ２２５：８９０−９００；Ｍｅｄｂｅｒｒｙら、１９９５、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４８５−４９０に記載されている
。ＵＳ５，７２３，７６４号は、ｃｒｅ／ｌｏｘを用いた植物遺伝子発現を制御
するための方法を記載する。
【００３５】 選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子
ｎｐｔＩＩ（米国特許第５，０３４，３２２号；同第５，５３０，１９６号）、
ハイグロマイシン耐性遺伝子（米国特許第５，６６８，２９８号）、ホスフィノ
トリシン耐性をコードするｂａｒ遺伝子（米国特許第５，２７６，２６８号）が
挙げられる。ＥＰ ０ ５３０ １２９ Ａ１は、形質転換された植物が形質転
換されていない系統にまで成長することを可能にする陽性選択系を記載する。こ
の系は、増殖培地に添加された不活性な化合物を活性化する酵素をコードする導
入遺伝子を発現させることによる。有用なスクリーニング可能なマーカー遺伝子
としては、βグルクロニダ−ゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７、ＥＭ
ＢＯ Ｊ．６：３９０１−３９０７；米国特許第５，２６８，４６３号）および
ネイティブのまたは改変されたグリーン蛍光タンパク質遺伝子（Ｃｕｂｉｔｔら
、１９９５、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０：４４８−４５５；
Ｐａｎｇら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８９３−９００
）が挙げられる。これらのマーカーのうちいくつかは、除草剤耐性のような形質
を目的の植物に導入するというさらなる利点を有し、入力された側においてさら
なる作物上の価値を提供する。
ｎｐｔＩＩ（米国特許第５，０３４，３２２号；同第５，５３０，１９６号）、
ハイグロマイシン耐性遺伝子（米国特許第５，６６８，２９８号）、ホスフィノ
トリシン耐性をコードするｂａｒ遺伝子（米国特許第５，２７６，２６８号）が
挙げられる。ＥＰ ０ ５３０ １２９ Ａ１は、形質転換された植物が形質転
換されていない系統にまで成長することを可能にする陽性選択系を記載する。こ
の系は、増殖培地に添加された不活性な化合物を活性化する酵素をコードする導
入遺伝子を発現させることによる。有用なスクリーニング可能なマーカー遺伝子
としては、βグルクロニダ−ゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７、ＥＭ
ＢＯ Ｊ．６：３９０１−３９０７；米国特許第５，２６８，４６３号）および
ネイティブのまたは改変されたグリーン蛍光タンパク質遺伝子（Ｃｕｂｉｔｔら
、１９９５、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０：４４８−４５５；
Ｐａｎｇら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８９３−９００
）が挙げられる。これらのマーカーのうちいくつかは、除草剤耐性のような形質
を目的の植物に導入するというさらなる利点を有し、入力された側においてさら
なる作物上の価値を提供する。
【００３６】 上記の方法のいずれか１つによる形質転換の後、以下の手順を用いて本発明の
導入遺伝子を発現する形質転換された植物を入手する：選択培地において形質転
換された植物細胞を選択し；形質転換された植物細胞を再生して分化された植物
を生産し；そしてその導入遺伝子を発現する形質転換された植物を選択し、その
結果、所望のポリペプチドレベルを所望の組織および細胞位置において入手する
。
導入遺伝子を発現する形質転換された植物を入手する：選択培地において形質転
換された植物細胞を選択し；形質転換された植物細胞を再生して分化された植物
を生産し；そしてその導入遺伝子を発現する形質転換された植物を選択し、その
結果、所望のポリペプチドレベルを所望の組織および細胞位置において入手する
。
【００３７】 実施例は、トランスジェニック生物においてポリヒドロキシアルカノエートバ
イオポリマーの効率よい産生のための新たな遺伝子操作された酵素の合成を実証
する。１つの実施例において、ｐｈｂＡおよびｐｈｂＢの遺伝子によってコード
されるチオラーゼおよびレダクターゼの活性を遺伝子融合物の構築を通じて合わ
せて単一の酵素とした。そのようなハイブリッド酵素およびその対応する遺伝子
の使用は、有利である：単一の転写単位において２つの酵素活性を合わせること
は、トランスジェニック生物において発現されることが必要な遺伝子の数、およ
び代謝経路において連続的な工程を触媒する２つの酵素の活性の緊密な密接度を
減少させる。融合物において酵素は、第一の触媒ドメインから第二のドメインへ
の反応産物の直接移動を可能にする。これらの遺伝子融合物は、トランスジェニ
ック微生物または植物作物のＰＨＡ生成物系において適用され得る。この融合物
は、高等植物の細胞質ゾルまたは細胞成分オルガネラ（例えば、油作物（Ｂｒａ
ｓｓｉｃａ、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、ベニバナ、アマ、パームまたは
ココナツ）の種子）、デンプン蓄積植物（ポテト、タピオカ、キャッサバ）、繊
維植物（ワタ、アサ）、またはタバコ、アルファルファ、スイッチグラスまたは
他の飼料用草の緑色組織）において発現され得る。
イオポリマーの効率よい産生のための新たな遺伝子操作された酵素の合成を実証
する。１つの実施例において、ｐｈｂＡおよびｐｈｂＢの遺伝子によってコード
されるチオラーゼおよびレダクターゼの活性を遺伝子融合物の構築を通じて合わ
せて単一の酵素とした。そのようなハイブリッド酵素およびその対応する遺伝子
の使用は、有利である：単一の転写単位において２つの酵素活性を合わせること
は、トランスジェニック生物において発現されることが必要な遺伝子の数、およ
び代謝経路において連続的な工程を触媒する２つの酵素の活性の緊密な密接度を
減少させる。融合物において酵素は、第一の触媒ドメインから第二のドメインへ
の反応産物の直接移動を可能にする。これらの遺伝子融合物は、トランスジェニ
ック微生物または植物作物のＰＨＡ生成物系において適用され得る。この融合物
は、高等植物の細胞質ゾルまたは細胞成分オルガネラ（例えば、油作物（Ｂｒａ
ｓｓｉｃａ、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、ベニバナ、アマ、パームまたは
ココナツ）の種子）、デンプン蓄積植物（ポテト、タピオカ、キャッサバ）、繊
維植物（ワタ、アサ）、またはタバコ、アルファルファ、スイッチグラスまたは
他の飼料用草の緑色組織）において発現され得る。
【００３８】 （実施例） 本発明は、以下の実施例を参照することでさらに理解される。この実施例は、
以下のこれらの一般的方法および材料を使用する。
以下のこれらの一般的方法および材料を使用する。
【００３９】 ＤＮＡ操作を、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットまたはＱｉａｇｅｎ染色体
ＤＮＡ調製キットを製造業者の推奨に従って用いて精製したプラスミドおよび染
色体のＤＮＡ上で実施した。ＤＮＡを、制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を製造業者の推奨に従って用いて消化し
た。ＤＮＡフラグメントを、０．７％アガロース−Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡゲ
ルから、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて単離した。オリゴヌクレオチドを、Ｂｉｏ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはＧｅｎｅｓｙｓから購入した。ＤＮＡ配列を、Ｐｅｒ
ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３７３Ａ配列決定機を用いて自動配列決定するこ
とによって決定した。ＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、Ｍｄ）からのＰＣＲミックスおよびＥｒｉｃｏｍｐ ＤＮＡ増幅機を用いた
５０μｌの容量中でポリメラーゼ連鎖反応を用いて、増幅した。
ＤＮＡ調製キットを製造業者の推奨に従って用いて精製したプラスミドおよび染
色体のＤＮＡ上で実施した。ＤＮＡを、制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を製造業者の推奨に従って用いて消化し
た。ＤＮＡフラグメントを、０．７％アガロース−Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡゲ
ルから、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて単離した。オリゴヌクレオチドを、Ｂｉｏ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはＧｅｎｅｓｙｓから購入した。ＤＮＡ配列を、Ｐｅｒ
ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３７３Ａ配列決定機を用いて自動配列決定するこ
とによって決定した。ＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、Ｍｄ）からのＰＣＲミックスおよびＥｒｉｃｏｍｐ ＤＮＡ増幅機を用いた
５０μｌの容量中でポリメラーゼ連鎖反応を用いて、増幅した。
【００４０】 Ｅ．ｃｏｌｉ株を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地または２×ＹＴ培地（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ）中で３７℃、３０℃または１６℃で増殖させた。
ａｍｂｒｏｏｋら、１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ）中で３７℃、３０℃または１６℃で増殖させた。
【００４１】 蓄積したＰＨＢを、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって決定し、凍
結乾燥した細胞塊において行った。約２０ｍｇの凍結乾燥した細胞塊を、同時の
抽出および２ｍＬ中の混合物（（容量で）９０％の１−ブタノールおよび１０％
濃塩酸（２ｍｇ／ｍＬの安息香酸を内部標準として加えた）を含む）中での１１
０℃でのブタノール溶解に３時間供した。得られた混合物の水溶性成分を、３ｍ
Ｌの水での抽出によって除去した。有機層（１μＬ、２ｍＬ／分の全体の流速で
１；５０の分割比）を、ＳＰＢ−１縮合したシリカキャピラリーＧＣカラム（３
０ｍ；０．３２ｍｍ ＩＤ（内径）；０．２５μｍのフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ
；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ．）を用いて、ＦＩＤ検出器を備えたＨＰ５８９
０ＧＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ
）において分析した。この際以下の温度プロファイルを使用した：８０℃、２分
；２５０℃まで１分あたり１０℃；２５０℃、２分。ブチル安息香酸を内部標準
として用いた。単離されたポリマーの分子量を、狭いポリ多様性のポリスチレン
サンプルに対して較正したＷａｔｅｒｓ Ｓｔｙｒａｇｅｌ ＨＴ６Ｅカラム（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈｙ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてＧＰＣによって決定した
。サンプルを、クロロホルム中に、１ｍｇ／ｍＬで溶解し、５０μＬのサンプル
を注入し、そして１ｍＬ／分で溶出した。検出を、示差屈折計を用いて実施した
。
結乾燥した細胞塊において行った。約２０ｍｇの凍結乾燥した細胞塊を、同時の
抽出および２ｍＬ中の混合物（（容量で）９０％の１−ブタノールおよび１０％
濃塩酸（２ｍｇ／ｍＬの安息香酸を内部標準として加えた）を含む）中での１１
０℃でのブタノール溶解に３時間供した。得られた混合物の水溶性成分を、３ｍ
Ｌの水での抽出によって除去した。有機層（１μＬ、２ｍＬ／分の全体の流速で
１；５０の分割比）を、ＳＰＢ−１縮合したシリカキャピラリーＧＣカラム（３
０ｍ；０．３２ｍｍ ＩＤ（内径）；０．２５μｍのフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ
；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ．）を用いて、ＦＩＤ検出器を備えたＨＰ５８９
０ＧＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ
）において分析した。この際以下の温度プロファイルを使用した：８０℃、２分
；２５０℃まで１分あたり１０℃；２５０℃、２分。ブチル安息香酸を内部標準
として用いた。単離されたポリマーの分子量を、狭いポリ多様性のポリスチレン
サンプルに対して較正したＷａｔｅｒｓ Ｓｔｙｒａｇｅｌ ＨＴ６Ｅカラム（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈｙ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてＧＰＣによって決定した
。サンプルを、クロロホルム中に、１ｍｇ／ｍＬで溶解し、５０μＬのサンプル
を注入し、そして１ｍＬ／分で溶出した。検出を、示差屈折計を用いて実施した
。
【００４２】 タンパク質サンプルを、沸騰水浴中で２−メルカプトエタノールおよびドデシ
ル硫酸ナトリウムの存在下でインキュベートすること（３分間）によって変性さ
せ、次いで、１０％、１５％、または１０〜２０％のドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分離した。タンパク質の支持
ニトロセルロースメンブレン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
，ＭＤ）への転写後、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−Ｃ
ｏＡレダクターゼおよびＰＨＢポリメラーゼを、ウサギにおいてこれらの酵素に
対して惹起されたポリクローナル抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼで標識
した二次抗体、次いで化学発光検出（ＵＳＢ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出
した。
ル硫酸ナトリウムの存在下でインキュベートすること（３分間）によって変性さ
せ、次いで、１０％、１５％、または１０〜２０％のドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分離した。タンパク質の支持
ニトロセルロースメンブレン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
，ＭＤ）への転写後、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−Ｃ
ｏＡレダクターゼおよびＰＨＢポリメラーゼを、ウサギにおいてこれらの酵素に
対して惹起されたポリクローナル抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼで標識
した二次抗体、次いで化学発光検出（ＵＳＢ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出
した。
【００４３】 β−ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ特異的なアセトアセチルＣｏＡレダクター
ゼの活性を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９７８、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．１１６：２２１−２４）およびＳａｉｔｏら（１９７７、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．１１４：２１１−２１７）にそれぞれ記載されるように測定した。
アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄの分
光計を用いて無細胞抽出物の添加の後の３０４ｎｍでの吸光度における減少をモ
ニターすることによって、Ｍｇ2+−アセトアセチルＣｏＡ複合体の分解として測
定する。アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ活性を、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰへ
の変換を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ分光計を３４０ｎｍで用いてモニタ
ーすることによって測定する。
ゼの活性を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９７８、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．１１６：２２１−２４）およびＳａｉｔｏら（１９７７、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．１１４：２１１−２１７）にそれぞれ記載されるように測定した。
アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄの分
光計を用いて無細胞抽出物の添加の後の３０４ｎｍでの吸光度における減少をモ
ニターすることによって、Ｍｇ2+−アセトアセチルＣｏＡ複合体の分解として測
定する。アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ活性を、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰへ
の変換を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ分光計を３４０ｎｍで用いてモニタ
ーすることによって測定する。
【００４４】 （実施例１：チオラーゼ−レダクターゼ融合タンパク質（チレダーゼ（Ｔｈｒ
ｅｄａｓｅ））の構築） プラスミドｐＴｒｃＡＢ１１を、本質的に図２に例示されるような以下の技術
を使用して構築した。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のｐｈｂＡ遺伝子を、以下の
プライマーを用いる温度サイクリング（９４℃で４０秒、６５℃で４０秒、およ
び７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で７分の最終の伸長工程によって
、プラスミドｐＡｅＴ４１３（プラスミトｐＡｅＴ４１の誘導体）（Ｐｅｏｐｌ
ｅｓ，Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６４：１５２９８〜１５３０３）から増幅した。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕ
ｓ由来のｐｈｂＡのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：（
配列番号）１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
ｅｄａｓｅ））の構築） プラスミドｐＴｒｃＡＢ１１を、本質的に図２に例示されるような以下の技術
を使用して構築した。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のｐｈｂＡ遺伝子を、以下の
プライマーを用いる温度サイクリング（９４℃で４０秒、６５℃で４０秒、およ
び７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で７分の最終の伸長工程によって
、プラスミドｐＡｅＴ４１３（プラスミトｐＡｅＴ４１の誘導体）（Ｐｅｏｐｌ
ｅｓ，Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６４：１５２９８〜１５３０３）から増幅した。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕ
ｓ由来のｐｈｂＡのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：（
配列番号）１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
【００４５】
【化１】 Ａ１Ｆ−Ｋｐｎは、リボソーム結合部位および翻訳開始部位を含む；Ａ１Ｆ−
Ｂａｍは、翻訳停止コドンを含まない。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ｐｈｂＢ遺伝
子を、以下のプライマーを用いて温度サイクリング（９４℃で４０秒、４５℃で
４０秒、および７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で７分の最終の伸長
工程）によってプラスミドｐＡｅＴ４１の誘導体（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．お
よびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１
５２９８〜１５３０３）から増幅した。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のｐｈｂＢ
のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：６に示す。
Ｂａｍは、翻訳停止コドンを含まない。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ｐｈｂＢ遺伝
子を、以下のプライマーを用いて温度サイクリング（９４℃で４０秒、４５℃で
４０秒、および７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で７分の最終の伸長
工程）によってプラスミドｐＡｅＴ４１の誘導体（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．お
よびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１
５２９８〜１５３０３）から増幅した。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のｐｈｂＢ
のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：６に示す。
【００４６】
【化２】 Ｂ１Ｌ−Ｂａｍは、ＢａｍＨＩに隣接するＡＴＧコドンを含むが、翻訳開始シ
グナルを含まない；Ｂ１Ｌ−Ｘｂａは、翻訳停止コドンＴＧＡを含む。次いで、
増幅されたｐｈｂＡ遺伝子を、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、そし
て増幅されたｐｈｂＢ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化した。
消化後、ｐｈｂＡ遺伝子を、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＴｒｃＮ中
にクローニングしてｐＴｒｃＡＦを作製し、そしてｐｈｂＢ遺伝子を、ＢａｍＨ
Ｉ／ＸｂａＩで消化したｐＴｒｃＮ中にクローニングしてｐＴｒｃＢＬを作製し
た。
グナルを含まない；Ｂ１Ｌ−Ｘｂａは、翻訳停止コドンＴＧＡを含む。次いで、
増幅されたｐｈｂＡ遺伝子を、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、そし
て増幅されたｐｈｂＢ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化した。
消化後、ｐｈｂＡ遺伝子を、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＴｒｃＮ中
にクローニングしてｐＴｒｃＡＦを作製し、そしてｐｈｂＢ遺伝子を、ＢａｍＨ
Ｉ／ＸｂａＩで消化したｐＴｒｃＮ中にクローニングしてｐＴｒｃＢＬを作製し
た。
【００４７】 インサートのＤＮＡ配列の確認後、ｐｈｂＢを、ｐＴｒｃＢＬからのＢａｍＨ
Ｉ／ＸｂａＩフラグメントとして、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＴｒｃＡ
Ｆ中にクローニングして、これにより、プラスミドｐＴｒｃＡＢ１１を得た。得
られたハイブリッド遺伝子は、チオラーゼ−グリシン−セリン−レダクターゼ融
合物をコードする。ＡＢ１１融合物のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す。
Ｉ／ＸｂａＩフラグメントとして、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＴｒｃＡ
Ｆ中にクローニングして、これにより、プラスミドｐＴｒｃＡＢ１１を得た。得
られたハイブリッド遺伝子は、チオラーゼ−グリシン−セリン−レダクターゼ融
合物をコードする。ＡＢ１１融合物のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す。
【００４８】 ｐｈｂＡとｐｈｂＢとの間のＢａｍＨＩの挿入は、チオラーゼおよびレダクタ
ーゼ酵素を接続し、かつ引き続いて、リンカー領域の長さおよび／または配列を
変更するために改変され得るグリシン−セリンリンカーを生じる。ｐＴｒｃＡＢ
１１のいくつかのこのような誘導体を、以下の通りに構築した：ｐＴｒｃＡＢ１
１を、ＢａｍＨＩを用いて消化し、そして線状化したフラグメントを精製し、そ
してエビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した。
ーゼ酵素を接続し、かつ引き続いて、リンカー領域の長さおよび／または配列を
変更するために改変され得るグリシン−セリンリンカーを生じる。ｐＴｒｃＡＢ
１１のいくつかのこのような誘導体を、以下の通りに構築した：ｐＴｒｃＡＢ１
１を、ＢａｍＨＩを用いて消化し、そして線状化したフラグメントを精製し、そ
してエビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した。
【００４９】 オリゴヌクレオチドを、ＢａｍＨＩ部位中に以下のＤＮＡフラグメントを挿入
するために設計した。コードされたアミノ酸配列を以下に示す：
するために設計した。コードされたアミノ酸配列を以下に示す：
【００５０】
【化３】 オリゴヌクレオチドＬ５ＡおよびＬ５Ｂ（５００ｐｍｏｌ）を、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼを使用してリン酸化し、そしてアニールさせ（１３３ｍｏｌの
各プライマー）、そして線状化したｐＴｒｃＡＢ１１中に連結した。ライゲーシ
ョン混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４０中にエレクトロポレーションし、そ
してチオラーゼ遺伝子とレダクターゼ遺伝子との間に挿入されたリンカーを有す
るプラスミドを、ＢｓａＷＩを用いる制限酵素消化により同定した。
レオチドキナーゼを使用してリン酸化し、そしてアニールさせ（１３３ｍｏｌの
各プライマー）、そして線状化したｐＴｒｃＡＢ１１中に連結した。ライゲーシ
ョン混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４０中にエレクトロポレーションし、そ
してチオラーゼ遺伝子とレダクターゼ遺伝子との間に挿入されたリンカーを有す
るプラスミドを、ＢｓａＷＩを用いる制限酵素消化により同定した。
【００５１】 融合構築物の有用性を、それらをＥ．Ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４０中に形質転換し
、そして酵素アッセイによっておよびＰＨＢの産生についてタンパク質レベルで
イムノブロッティングをすることによってポリペプチドレベルで融合物の組み込
みを試験することによって調査された。ＭＢＸ２４０は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕ
ｓ ｐｈａＣ遺伝子の組み込みによるＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ ｂｌｕｅに由来
する（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．１９８９、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８〜１５３０３）。組み込まれた株に
対する別のアプローチは、適合性プラスミドからＰＨＢシンターゼを発現させる
ことである。
、そして酵素アッセイによっておよびＰＨＢの産生についてタンパク質レベルで
イムノブロッティングをすることによってポリペプチドレベルで融合物の組み込
みを試験することによって調査された。ＭＢＸ２４０は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕ
ｓ ｐｈａＣ遺伝子の組み込みによるＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ ｂｌｕｅに由来
する（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．１９８９、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８〜１５３０３）。組み込まれた株に
対する別のアプローチは、適合性プラスミドからＰＨＢシンターゼを発現させる
ことである。
【００５２】 適切な融合プラスミドを含む組換え株を、２×ＹＴ／１％グルコース／１００
μｇ／ｍｌアンピシリン中で、３０℃で一晩増殖させた。増殖された培養物を、
５０ｍｌの新鮮な２×ＹＴ／１％グルコース／１００μｇ／ｍｌアンビシリン中
に１：１００で希釈し、そして３０℃でインキュベートした。培養物の２つの同
一のセットを接種し、一方をＩＰＴＧを用いて誘導し、そして一方を誘導しなか
った。一旦、この培養物が、０．６のＯＤ６００に達すると、サンプルを、１ｍ
Ｍ ＩＰＴＧの最終濃度を用いて誘導した。細胞を、誘導の２４時間後に２つの
５０ｍｌサンプル中へと分割することによって回収し、そして３０００×ｇで１
０分間遠心分離した。細胞全体のサンプルを、ＰＨＢ含量の分析のために保持し
た。ペレットの第２のセットを、０．７５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、ｐＨ８．２）中に再懸濁し、そし
て超音波破砕（出力５０％、５０％で２分）した。次いで、粗抽出物を遠心分離
し（３０００×ｇで１０分、４℃）、そして上清およびペレットを１０％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そしてクマーシー染色によってならびにイムノブロ
ッティングによって分析した。イムノブロットを、ウサギ抗Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈ
ｕｓチオラーゼ抗体およびウサギ抗Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓレダクターゼ抗体を
用いてプローブした。両方の抗体が、Ｍｒ＝６２ｋＤのタンパク質と反応し、こ
のタンパク質は、コントロール株（ベクターｐＴｒｃＮのみを含むＭＢＸ２４０
）では存在しなかった。Ｍｒ４２ｋＤポリペプチドとの抗チオラーゼ抗体または
Ｍｒ２６ｋＤａポリペプチドとのレダクターゼ抗体の交叉反応性は存在しなかっ
た。次いで、可溶性タンパク質を、チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性につ
いて分析した。
μｇ／ｍｌアンピシリン中で、３０℃で一晩増殖させた。増殖された培養物を、
５０ｍｌの新鮮な２×ＹＴ／１％グルコース／１００μｇ／ｍｌアンビシリン中
に１：１００で希釈し、そして３０℃でインキュベートした。培養物の２つの同
一のセットを接種し、一方をＩＰＴＧを用いて誘導し、そして一方を誘導しなか
った。一旦、この培養物が、０．６のＯＤ６００に達すると、サンプルを、１ｍ
Ｍ ＩＰＴＧの最終濃度を用いて誘導した。細胞を、誘導の２４時間後に２つの
５０ｍｌサンプル中へと分割することによって回収し、そして３０００×ｇで１
０分間遠心分離した。細胞全体のサンプルを、ＰＨＢ含量の分析のために保持し
た。ペレットの第２のセットを、０．７５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、ｐＨ８．２）中に再懸濁し、そし
て超音波破砕（出力５０％、５０％で２分）した。次いで、粗抽出物を遠心分離
し（３０００×ｇで１０分、４℃）、そして上清およびペレットを１０％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そしてクマーシー染色によってならびにイムノブロ
ッティングによって分析した。イムノブロットを、ウサギ抗Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈ
ｕｓチオラーゼ抗体およびウサギ抗Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓレダクターゼ抗体を
用いてプローブした。両方の抗体が、Ｍｒ＝６２ｋＤのタンパク質と反応し、こ
のタンパク質は、コントロール株（ベクターｐＴｒｃＮのみを含むＭＢＸ２４０
）では存在しなかった。Ｍｒ４２ｋＤポリペプチドとの抗チオラーゼ抗体または
Ｍｒ２６ｋＤａポリペプチドとのレダクターゼ抗体の交叉反応性は存在しなかっ
た。次いで、可溶性タンパク質を、チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性につ
いて分析した。
【００５３】 これらの分析の結果を、ｐＴｒｃＡＢ１１および改変されたリンカーを有する
５つの誘導体について、表１に示す。 表１：融合物の酵素活性
５つの誘導体について、表１に示す。 表１：融合物の酵素活性
【００５４】
【表１】 aｐＴｒｃＮ中に挿入された構築物、Ｌ５−ｎは、Ｌ５オリゴヌクレオチドのセ
ットに由来するリンカーを有するＡＢ１１融合物を示す；b培養物を、１ｍＭ
ＩＰＴＧで２４時間ＯＤ６００にて誘導したか（＋）、または誘導しなかった（
−）；c粗タンパク質抽出物のＵ／ｍｇにおけるチオラーゼおよびレダクターゼ
活性；d細胞乾燥重量の百分率としての蓄積されたＰＨＢ。
ットに由来するリンカーを有するＡＢ１１融合物を示す；b培養物を、１ｍＭ
ＩＰＴＧで２４時間ＯＤ６００にて誘導したか（＋）、または誘導しなかった（
−）；c粗タンパク質抽出物のＵ／ｍｇにおけるチオラーゼおよびレダクターゼ
活性；d細胞乾燥重量の百分率としての蓄積されたＰＨＢ。
【００５５】 表１に示された結果は、これらのチオラーゼ−レダクターゼ融合物が両方の酵
素活性を有し、そして高レベルのＰＨＢの産生を生じることを示す。
素活性を有し、そして高レベルのＰＨＢの産生を生じることを示す。
【００５６】 ｐＴｒｃＡＢ１１によりコードされる融合物を、部分的に精製した。１６℃で
３３時間増殖されたＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４０（ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ：：ｐｈ
ｂＣ１５０）［ｐＴｒｃＡＢ１１］細胞の培養物（５．５ｇ）を、１１ｍｌの溶
解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｈｅ
ｃａｍｅｇ、２０％グリセロール、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、そして超音波破
砕（出力５０％、５０％で２分）した。次いで、粗抽出物を、遠心分離し（３０
００×ｇで１０分、４℃）、そしてこの上清を、５０ｍＭＮａＣｌに予め平衡化
したＴｏｙｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ、ＰＡ）
カラム（１６．５×３．０ｃｍ）にアプライした。非結合タンパク質を、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ（３００ｍｌ）を用いて洗浄して除き、その後、結合タンパク質を
、５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配（４００ｍｌの総容量）を用いて溶出した。
チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する画分（２５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌで溶出）を、プールし、そして５０，０００ＭＷスピンカラム（Ａｍｉｃｏ
ｎ）で濃縮／脱塩した。活性タンパク質のサンプルを、ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲ
ＯＳＥTMＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ
）カラム（１０．５ｃｍ×２．６ｃｍ）に対して、ＤＥＡＥについてと同じだが
異なるＮａＣｌ濃度を含む緩衝液を使用して、さらに精製した。非結合タンパク
質を、２５０ｍＭ ＮａＣｌ（２００ｍＭ）を用いてカラムから洗浄して除き、
そして残っているタンパク質を、７５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２Ｍ ＮａＣｌを
使用する２工程において溶出した。チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性の２
／３を、７５０ｍＭ ＮａＣｌ工程において回収し、ここで残りは、２Ｍ Ｎａ
Ｃｌ工程に溶出した。再度、チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を含
む画分をプールし、そして５０，０００ＭＷスピンカラムで濃縮／脱塩した。融
合タンパク質の調製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、タンパク質を、クマ
ーシーブルー染色または抗βケトチオラーゼ抗体および抗アセトアセチルＣｏＡ
レダクターゼ抗体を使用するウエスタンブロット分析のいずれかによって検出し
た。βケトチオラーゼ活性およびアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ活性の両方
を含む画分は、両方の抗体と反応した、６０ｋＤａの見かけの分子量を有する単
一のタンパク質のバンドを示した。これにより、両方の酵素活性が、単一の遺伝
子によりコードされる単一のポリペプチド鎖に存在したことが確認される。
３３時間増殖されたＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４０（ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ：：ｐｈ
ｂＣ１５０）［ｐＴｒｃＡＢ１１］細胞の培養物（５．５ｇ）を、１１ｍｌの溶
解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｈｅ
ｃａｍｅｇ、２０％グリセロール、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、そして超音波破
砕（出力５０％、５０％で２分）した。次いで、粗抽出物を、遠心分離し（３０
００×ｇで１０分、４℃）、そしてこの上清を、５０ｍＭＮａＣｌに予め平衡化
したＴｏｙｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ、ＰＡ）
カラム（１６．５×３．０ｃｍ）にアプライした。非結合タンパク質を、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ（３００ｍｌ）を用いて洗浄して除き、その後、結合タンパク質を
、５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配（４００ｍｌの総容量）を用いて溶出した。
チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する画分（２５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌで溶出）を、プールし、そして５０，０００ＭＷスピンカラム（Ａｍｉｃｏ
ｎ）で濃縮／脱塩した。活性タンパク質のサンプルを、ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲ
ＯＳＥTMＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ
）カラム（１０．５ｃｍ×２．６ｃｍ）に対して、ＤＥＡＥについてと同じだが
異なるＮａＣｌ濃度を含む緩衝液を使用して、さらに精製した。非結合タンパク
質を、２５０ｍＭ ＮａＣｌ（２００ｍＭ）を用いてカラムから洗浄して除き、
そして残っているタンパク質を、７５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２Ｍ ＮａＣｌを
使用する２工程において溶出した。チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性の２
／３を、７５０ｍＭ ＮａＣｌ工程において回収し、ここで残りは、２Ｍ Ｎａ
Ｃｌ工程に溶出した。再度、チオラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を含
む画分をプールし、そして５０，０００ＭＷスピンカラムで濃縮／脱塩した。融
合タンパク質の調製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、タンパク質を、クマ
ーシーブルー染色または抗βケトチオラーゼ抗体および抗アセトアセチルＣｏＡ
レダクターゼ抗体を使用するウエスタンブロット分析のいずれかによって検出し
た。βケトチオラーゼ活性およびアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ活性の両方
を含む画分は、両方の抗体と反応した、６０ｋＤａの見かけの分子量を有する単
一のタンパク質のバンドを示した。これにより、両方の酵素活性が、単一の遺伝
子によりコードされる単一のポリペプチド鎖に存在したことが確認される。
【００５７】 （実施例２：レダクターゼ−チオラーゼ融合タンパク質の構築） レダクターゼ−グリシン−セリン−チオラーゼ酵素を発現するハイブリッド遺
伝子を、レダクターゼ遺伝子およびチオラーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物から構築
した。 以下のプライマー：
伝子を、レダクターゼ遺伝子およびチオラーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物から構築
した。 以下のプライマー：
【００５８】
【化４】 を使用して、これらの遺伝子を増幅し（９４℃で４０秒、６５℃で４０秒、７２
℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で７分の最終の伸長工程）、その結果、
レダクターゼ遺伝子は、リボソーム結合部位に続き、そして停止コドンを含まな
い。この融合物の停止コドンは、チオラーゼ遺伝子により提供される。
℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で７分の最終の伸長工程）、その結果、
レダクターゼ遺伝子は、リボソーム結合部位に続き、そして停止コドンを含まな
い。この融合物の停止コドンは、チオラーゼ遺伝子により提供される。
【００５９】 増幅したｐｈｂＢ遺伝子を、ｋｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、次い
で、ｐＴｒｃＮのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位中にクローニングしてｐＴｒｃＢＦ
を作製した。増幅されたｐｈｂＡ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて
消化し、そしてｐＴｒｃＮのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位中にクローニングしてプ
ラスミドｐＴｒｃＡＬを得た。ｐＴｒｃＢＦからのｐｈｂＢ遺伝子を、ＢａｍＨ
Ｉ−ＫｐｎＩを用いて消化し、そしてこのフラグメントを、ｐＴｒｃＡＬのＢａ
ｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位中に挿入してプラスミドｐＴｒｃＢＡを得た。これにより
１つのポリペプチド中にレダクターゼ−グリシン−セリン−チオラーゼをコード
する融合遺伝子を得た。Ｂ１Ａ１融合物のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示す。
で、ｐＴｒｃＮのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位中にクローニングしてｐＴｒｃＢＦ
を作製した。増幅されたｐｈｂＡ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて
消化し、そしてｐＴｒｃＮのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位中にクローニングしてプ
ラスミドｐＴｒｃＡＬを得た。ｐＴｒｃＢＦからのｐｈｂＢ遺伝子を、ＢａｍＨ
Ｉ−ＫｐｎＩを用いて消化し、そしてこのフラグメントを、ｐＴｒｃＡＬのＢａ
ｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位中に挿入してプラスミドｐＴｒｃＢＡを得た。これにより
１つのポリペプチド中にレダクターゼ−グリシン−セリン−チオラーゼをコード
する融合遺伝子を得た。Ｂ１Ａ１融合物のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示す。
【００６０】 （実施例３：ＰＨＡシンターゼ−ＡＣＰ：：ＣｏＡトランスフェラーゼ融合物
の設計） Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのＰＨＡシンターゼ１をコードするｐｈａＣ１遺伝
子（Ｈｕｉｓｍａｎら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１
〜２１９８）（Ｃ３）は、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応に
よって増幅され得る。Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのｐｈｂＣ１遺伝子のＤＮＡ配
列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２１に示す。
の設計） Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのＰＨＡシンターゼ１をコードするｐｈａＣ１遺伝
子（Ｈｕｉｓｍａｎら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１
〜２１９８）（Ｃ３）は、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応に
よって増幅され得る。Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのｐｈｂＣ１遺伝子のＤＮＡ配
列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２１に示す。
【００６１】
【化５】 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ由来のアシル−ＡＣＰ：：ＣｏＡトランスフェラーゼをコー
ドするｐｈａＧ（Ｇ３）は、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応
によって増幅され得る。Ｐ．ｐｕｔｉｄａのｐｈａＧ遺伝子のＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に
示す。
ドするｐｈａＧ（Ｇ３）は、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応
によって増幅され得る。Ｐ．ｐｕｔｉｄａのｐｈａＧ遺伝子のＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に
示す。
【００６２】
【化６】 引き続いて、Ｃ３およびＧ３の融合物を、ｐＴｒｃＮ中へのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩおよびＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、Ｃ３ ｕｐおよ
びＧ３ ｄｗ ＰＣＲ産物、またはＧ３ ｕｐおよびＣ３ ｄｗ ＰＣＲ産物の
のいずれかのクローニングにより作製した。得られたプラスミドは、シンターゼ
−トランスフェラーゼ融合物（Ｃ３Ｇ３）またはトランスフェラーゼ−シンター
ゼ（Ｇ３Ｃ３）の融合タンパク質のいずれかをコードする。Ｃ３Ｇ３のＤＮＡ配
列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３３に示す。Ｇ３Ｃ３のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示す。
ｍＨＩおよびＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、Ｃ３ ｕｐおよ
びＧ３ ｄｗ ＰＣＲ産物、またはＧ３ ｕｐおよびＣ３ ｄｗ ＰＣＲ産物の
のいずれかのクローニングにより作製した。得られたプラスミドは、シンターゼ
−トランスフェラーゼ融合物（Ｃ３Ｇ３）またはトランスフェラーゼ−シンター
ゼ（Ｇ３Ｃ３）の融合タンパク質のいずれかをコードする。Ｃ３Ｇ３のＤＮＡ配
列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３３に示す。Ｇ３Ｃ３のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示す。
【００６３】 （実施例４：ＰＨＡシンターゼ−ヒドラターゼ融合物の設計） Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＢシンターゼ融合物をコードするｐｈａＣ遺
伝子（Ｃ５）を、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増
幅した。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのｐｈｂＣ遺伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配
列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示す。
伝子（Ｃ５）を、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増
幅した。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのｐｈｂＣ遺伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配
列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示す。
【００６４】
【化７】 Ａ．ｃａｖｉａｅ由来の（Ｒ）−特異的エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ
をコードするｐｈａＪ遺伝子（Ｊ１２）は、以下のプライマーを使用するポリメ
ラーゼ連鎖反応によって増幅され得る。Ａ．ｃａｖｉａｅのｐｈｂＪ遺伝子のＤ
ＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２およびＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４３に示す。
をコードするｐｈａＪ遺伝子（Ｊ１２）は、以下のプライマーを使用するポリメ
ラーゼ連鎖反応によって増幅され得る。Ａ．ｃａｖｉａｅのｐｈｂＪ遺伝子のＤ
ＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２およびＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４３に示す。
【００６５】
【化８】 引き続いて、Ｃ５およびＪ１２の融合物を、ｐＴｒｃＮ中へのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩおよびＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、Ｃ５ ｕｐおよ
びＪ１２ ｄｗ ＰＣＲ産物、またはＪ１２ ｕｐおよびＣ５ ｄｗ ＰＣＲ産
物のいずれかのクローニングによって作製した。得られたプラスミドは、シンタ
ーゼ−ヒドラターゼ（Ｃ５Ｊ１２）またはヒドラターゼ−シンターゼ（Ｊ１２Ｃ
５）融合酵素のいずれかをコードする。Ｃ５Ｊ１２ ＲＥのＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示
し、そしてＪ１２Ｃ５遺伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示す。
ｍＨＩおよびＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、Ｃ５ ｕｐおよ
びＪ１２ ｄｗ ＰＣＲ産物、またはＪ１２ ｕｐおよびＣ５ ｄｗ ＰＣＲ産
物のいずれかのクローニングによって作製した。得られたプラスミドは、シンタ
ーゼ−ヒドラターゼ（Ｃ５Ｊ１２）またはヒドラターゼ−シンターゼ（Ｊ１２Ｃ
５）融合酵素のいずれかをコードする。Ｃ５Ｊ１２ ＲＥのＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示
し、そしてＪ１２Ｃ５遺伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示す。
【００６６】 （実施例５：広汎な基質範囲のチオラーゼ−レダクターゼ融合物の設計） Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのチオラーゼＩＩをコードするｂｋｔＢ遺伝子（Ｓｌａ
ｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）１８０、１９７９〜１９８７
）（Ａ１〜ＩＩ）は、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によっ
て増幅され得る。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｂｋｔＢ遺伝子のＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示
す。
ｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）１８０、１９７９〜１９８７
）（Ａ１〜ＩＩ）は、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によっ
て増幅され得る。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのｂｋｔＢ遺伝子のＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示
す。
【００６７】
【化９】 Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードするｐｈａ
Ｂ遺伝子（Ｂ１）を、実施例１に記載されるプライマーを使用するポリメラーゼ
連鎖反応によって増幅する。引き続いて、Ａ１−ＩＩおよびＢ１の融合物を、ｐ
ＴｒｃＮ中へのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩおよびＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントとして、Ａ１−ＩＩ ｕｐおよびＢ１ ｄｗ ＰＣＲ産物、またはＢ１
ｕｐおよびＡ１−ＩＩ ｄｗ ＰＣＲ産物のいずれかのクローニングによって
作製する。得られたプラスミドは、チオラーゼ−レダクターゼ（Ａ１−ＩＩＢ１
）またはレダクターゼ−チオラーゼ（Ｂ１Ａ１−ＩＩ）融合酵素のいずれかをコ
ードする。Ａ１−ＩＩＢ１のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示し、そしてＢ１Ａ１−ＩＩ遺伝
子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６１に示す。
Ｂ遺伝子（Ｂ１）を、実施例１に記載されるプライマーを使用するポリメラーゼ
連鎖反応によって増幅する。引き続いて、Ａ１−ＩＩおよびＢ１の融合物を、ｐ
ＴｒｃＮ中へのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩおよびＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントとして、Ａ１−ＩＩ ｕｐおよびＢ１ ｄｗ ＰＣＲ産物、またはＢ１
ｕｐおよびＡ１−ＩＩ ｄｗ ＰＣＲ産物のいずれかのクローニングによって
作製する。得られたプラスミドは、チオラーゼ−レダクターゼ（Ａ１−ＩＩＢ１
）またはレダクターゼ−チオラーゼ（Ｂ１Ａ１−ＩＩ）融合酵素のいずれかをコ
ードする。Ａ１−ＩＩＢ１のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示し、そしてＢ１Ａ１−ＩＩ遺伝
子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６１に示す。
【００６８】 本発明の改変および変更は、前述の詳細な説明から当業者に自明である。この
ような改変および変更は、上記の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図され
る。
ような改変および変更は、上記の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図され
る。
【図１】 図１Ａ〜１Ｈは、複数の酵素タンパク質をコードする遺伝子融合物の概略図で
ある：ｐＴｒｃＡＢは、β−ケトチオラーゼ（ｐｈｂＡ）およびアシル−ＣｏＡ
レダクターゼ（ｐｈｂＢ）を含む（１Ａ）；ｐＴｒｃＢＡは、ｐｈｂＢおよびｐ
ｈｂＡを含む（１Ｂ）；ｐＴｒｃＣＰは、ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）および
ファシン（ｐｈａＰ）を含む（１Ｃ）；ｐＴｒｃＰＣは、ｐｈａＰおよびｐｈａ
Ｃを含む（１Ｄ）；ｐＴｒｃＣＧは、ｐｈａＣおよびβ−ヒドロキシアシル−Ａ
ＣＰ：：コエンザイムＡトランスフェラーゼ（ｐｈｂＧ）を含む（１Ｅ）；ｐＴ
ｒｃＧＣは、ｐｈｂＧおよびｐｈａＣを含む（１Ｆ）；ｐＴｒｃＣＪは、ｐｈａ
Ｃおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ｐｈａＪ）を含む（１Ｇ）；ならびに
ｐＴｒｃＪＣは、ｐｈａＪおよびｐｈａＣを含む（１Ｈ）。
ある：ｐＴｒｃＡＢは、β−ケトチオラーゼ（ｐｈｂＡ）およびアシル−ＣｏＡ
レダクターゼ（ｐｈｂＢ）を含む（１Ａ）；ｐＴｒｃＢＡは、ｐｈｂＢおよびｐ
ｈｂＡを含む（１Ｂ）；ｐＴｒｃＣＰは、ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）および
ファシン（ｐｈａＰ）を含む（１Ｃ）；ｐＴｒｃＰＣは、ｐｈａＰおよびｐｈａ
Ｃを含む（１Ｄ）；ｐＴｒｃＣＧは、ｐｈａＣおよびβ−ヒドロキシアシル−Ａ
ＣＰ：：コエンザイムＡトランスフェラーゼ（ｐｈｂＧ）を含む（１Ｅ）；ｐＴ
ｒｃＧＣは、ｐｈｂＧおよびｐｈａＣを含む（１Ｆ）；ｐＴｒｃＣＪは、ｐｈａ
Ｃおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ｐｈａＪ）を含む（１Ｇ）；ならびに
ｐＴｒｃＪＣは、ｐｈａＪおよびｐｈａＣを含む（１Ｈ）。
【図２】 図２は、チオラーゼおよびレダクターゼの両方の活性を有する単一のポリペプ
チドにおけるｐＴｒｃＡＢ１１（ｐｈｂＡおよびｐｈｂＢを含む）の構築の概略
図である。
チドにおけるｐＴｒｃＡＢ１１（ｐｈｂＡおよびｐｈｂＢを含む）の構築の概略
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 9/14 9/14 9/98 9/98 Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ｃ (72)発明者 フイスマン， ジャルト ダブリュー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94070 −3419， サン カルロス， ブリッタン アベニュー ナンバー18 3370 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA08 AA17 BA08 BA10 BA11 BA80 CA04 DA01 DA06 EA04 GA11 GA17 GA19 HA01 4B050 CC03 CC08 DD02 GG06 LL05 LL10 4B065 AA09Y AA12Y AA26X AA88X AB01 AC14 BA02 CA12 CA28 CA29 CA53 4H045 AA10 BA11 BA40 CA11 DA89 EA05 FA74
Claims (14)
- 【請求項１】 Ｅ１−Ｌn−Ｅ２およびＥ２−Ｌn−Ｅ１からなる群より選択
される式を有するタンパク質融合物であって、 ここで、Ｅ１およびＥ２は、ＰＨＡ生合成経路における連続的反応を触媒し、
そして各々が、β−ケトチオラーゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＡシン
ターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ファシン、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、および
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ：：コエンザイムＡトランスフェラーゼからなる
群より選択され、ここでリンカーＬnが、Ｅ１とＥ２またはＥ２とＥ１を連結す
るｎアミノ酸のペプチドである、タンパク質融合物。 - 【請求項２】 前記Ｅ１およびＥ２が、β−ケトチオラーゼ（ｐｈｂＡ）お
よびアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）；ｐｈｂＢおよびｐｈｂＡ；ＰＨ
Ａシンターゼ（ｐｈａＣ）およびファシン（ｐｈａＰ）；ｐｈａＰおよびｐｈａ
Ｃ（１Ｄ）；ｐｈａＣおよびβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ：：コエンザイムＡ
トランスフェラーゼ（ｐｈｂＧ）；ｐｈｂＧおよびｐｈａＣ；ｐｈａＣおよびエ
ノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ｐｈａＪ）；ならびにｐｈａＪおよびｐｈａＣか
らなる群より選択される、請求項１に記載の融合物。 - 【請求項３】 前記リンカーにおけるｎが、０アミノ酸と５０アミノ酸との
間である、請求項１に記載の融合物。 - 【請求項４】 前記リンカーが、グリシン−セリンである、請求項１に記載
の融合物。 - 【請求項５】 植物において発現される、請求項１に記載の融合物。
- 【請求項６】 細菌において発現される、請求項１に記載の融合物。
- 【請求項７】 Ｅ１−Ｌn−Ｅ２およびＥ２−Ｌn−Ｅ１からなる群より選択
される式を有するタンパク質融合物コードする遺伝子であって、 ここで、Ｅ１およびＥ２は、各々が、β−ケトチオラーゼ、アシル−ＣｏＡレ
ダクターゼ、ＰＨＡシンターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ファシン、エノイル−Ｃｏ
Ａヒドラターゼ、およびβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ：：コエンザイムＡトラ
ンスフェラーゼからなる群より選択され、ここでリンカーＬｎが、Ｅ１とＥ２ま
たはＥ２とＥ１を連結するｎアミノ酸のペプチドである、遺伝子。 - 【請求項８】 前記Ｅ１およびＥ２が、β−ケトチオラーゼ（ｐｈｂＡ）お
よびアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）；ｐｈｂＢおよびｐｈｂＡ；ＰＨ
Ａシンターゼ（ｐｈａＣ）およびファシン（ｐｈａＰ）；ｐｈａＰおよびｐｈａ
Ｃ（１Ｄ）；ｐｈａＣおよびβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ：：コエンザイムＡ
トランスフェラーゼ（ｐｈｂＧ）；ｐｈｂＧおよびｐｈａＣ；ｐｈａＣおよびエ
ノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ｐｈａＪ）；ならびにｐｈａＪおよびｐｈａＣか
らなる群より選択される融合タンパク質をコードする、請求項７に記載の遺伝子
。 - 【請求項９】 前記リンカーにおけるｎが、０アミノ酸と５０アミノ酸との
間である、請求項７に記載の遺伝子。 - 【請求項１０】 前記リンカーが、グリシン−セリンである、請求項７に記
載の遺伝子。 - 【請求項１１】 植物における発現のためのプロモーターを含む、請求項７
に記載の遺伝子。 - 【請求項１２】 組織、プラスチド、または他の器官における発現に特異的
なプロモーターを含む、請求項１１に記載の遺伝子。 - 【請求項１３】 調節可能なプロモーターを含む、請求項１１に記載の遺伝
子。 - 【請求項１４】 ＲＮＡプロセシングシグナルまたはリボザイム配列をさら
に含む、請求項７に記載の遺伝子。
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