TWI530505B - 輕鏈橋接型雙特異性抗體 - Google Patents

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TWI530505B TW101150846A TW101150846A TWI530505B TW I530505 B TWI530505 B TW I530505B TW 101150846 A TW101150846 A TW 101150846A TW 101150846 A TW101150846 A TW 101150846A TW I530505 B TWI530505 B TW I530505B
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Description

輕鏈橋接型雙特異性抗體
本發明係關於用於製備雙特異性或多特異性生物分子(諸如雙特異性抗體)之方法，及其產品。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2011年12月27日申請之臨時申請案第61/580,491號的權益，該申請案之揭示內容以全文引用的方式併入。
將具有不同功能之生物分子組合後可產生具有所要或改良特性之新分子。舉例而言，多特異性抗體(包括雙特異性抗體及雙特異性腫瘤靶向性T淋巴細胞嚙合體)的最新進展已顯示，與單株抗腫瘤療法相比，具有免疫活化特性之多特異性分子在腫瘤療法中通常會產生增強之功效。
舉例而言，雙特異性抗體(BsAb)可由不同抗體之兩種不同結合域(亦即可變區)之片段構成。該兩種不同結合域可與兩種不同類型之抗原結合。此等分子可應用於臨床療法，諸如癌症免疫療法。對於該等應用，BsAb可經設計來同時結合細胞毒性細胞(使用如CD3之受體(Kurby immunology.San Francisco：W.H.Freeman.ISBN 1-492-0211-4))及諸如癌細胞之標靶(例如癌細胞上之抗原)。
雙特異性或多特異性蛋白質之構築涉及多種蛋白質域之融合。然而，由於融合搭配物之不同生物化學及/或生理特性，該等融合可 能造成融合搭配物之間出現不相容性。另外，包括腎過濾或循環路徑之滲透性在內的生理侷限性亦會挑戰醫學上可用之多特異性腫瘤靶向性分子的設計。
本發明之實施例係關於用於諸如臨床療法之生物醫學應用之具有免疫活化特性的新穎形式的雙特異性或多特異性融合蛋白質。此等蛋白質包括由橋接域連接之兩種特異性結合域(靶向域)，該橋接域可包括一個或兩個視情況存在之連接子。該等橋接域可衍生自抗體之免疫球蛋白域，以致在融合蛋白質中之不同搭配物可相容且可保留所要的生物特性。可用作橋接子之免疫球蛋白域可包括輕鏈恆定區或重鏈恆定區。該等融合蛋白質可稱作輕鏈橋接型抗體或重鏈橋接型抗體。
舉例而言，根據本發明實施例之雙特異性融合蛋白質可包含抗腫瘤生物標記，諸如CD20(Hybridoma.1983 2；17)、Her2/neu(Am J Clin Pathol 2003 120(增刊1)；S53)或EpCAM(J.Immunol.1992 148(2)；590)；單鏈連接之Fv片段(ScFv)，作為細胞靶向域或生物分子靶向域；作為橋接子的輕鏈恆定域；視情況存在之連接子(其可忽略)；及作為T淋巴細胞活化域之抗CD3 ScFv。此類輕鏈橋接型雙特異性免疫活化劑顯示針對表現腫瘤之細胞標靶及T淋巴細胞之結合特異性。與兩種標靶之結合會特異性地誘導T淋巴細胞介導之對腫瘤標靶的細胞毒性。
除上述抗腫瘤ScFv實例之外，亦可使用其他的細胞靶向域。該等其他分子可具有與其他細胞標靶特異性結合之能力。除T淋巴細胞活化域之外的其他細胞靶向域之實例可包括具有所要特異性之毒素多肽、酶、激素、細胞因子、信號傳導分子或ScFv。此外，可在原核或真核細胞中表現根據本發明實施例之融合蛋白質。另外，ScFv之方向可為重鏈可變區連接至輕鏈可變區，或與其相反之方向。該等雙特異 性分子之應用包括醫藥應用，諸如攜帶特異性生物標記之細胞消除療法，諸如癌症療法。另外，該等分子可用於診斷應用。
本發明之一個態樣係關於雙特異性融合蛋白質。根據本發明一個實施例之雙特異性融合蛋白質可包括對所關注之第一標靶具有特異性之第一靶向域；衍生自免疫球蛋白之輕鏈或重鏈之恆定區的橋接域，該免疫球蛋白可為人類免疫球蛋白；及對所關注之第二標靶具有特異性之第二靶向域。靶向域可對標靶生物分子或細胞具有特異性。
根據本發明之一些實施例，雙特異性融合蛋白質可進一步包括與橋接域之N端或C端融合之連接子。第一靶向域與橋接域或連接子融合且第二靶向域與橋接域或連接子融合。連接子可包括GGGGS序列。所關注之第一標靶可為CD20、Her2/neu、EpCAM或其類似物，且第二靶向域可為T淋巴細胞活化域，諸如抗CD3。
根據本發明之一些實施例，雙特異性融合蛋白質可省略上述連接子域，亦即，其中對所關注之第一標靶具有特異性的第一靶向域及對所關注之第二標靶具有特異性的第二靶向域兩者與橋接域之兩個末端直接融合。
根據本發明之一些實施例，雙特異性融合蛋白質可包含介於第一靶向域與橋接域之間以及橋接域與第二靶向域之間的上述一或多個連接子。亦即，第一靶向域及第二靶向域兩者分別與連接子融合，該等連接子與橋接域之兩個末端融合。
在以上實施例中之任一者中，第一靶向域可包含對所關注之第一標靶具有特異性的第一ScFv，且第二靶向域可包含對所關注之第二標靶具有特異性的第二ScFv。
在以上實施例中之任一者中，第一ScFv及第二ScFv各可包含人類免疫球蛋白序列。在以上實施例中，第一ScFv可包含對第一抗原具有結合特異性之VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，且第二ScFv可包含 對第二抗原具有結合特異性之VH-連接子-VL或VL-連接子-VH。
在以上實施例中之任一者中，連接子可包含一或多個GGGGS(G4S)序列。舉例而言，連接子可包含一個G4S序列、兩個G4S序列(重複)、三個G4S序列等。另外，連接子可包含其他與G4S序列組合的胺基酸序列。舉例而言，該等其他胺基酸序列可包括鉸鏈序列(例如CPPCP)。
將由以下描述及所附申請專利範圍顯而易知本發明之其他態樣及優點。
圖1A及圖1B顯示根據本發明實施例，說明各種雙特異性T淋巴細胞活化劑之構築體的示意圖。
圖2A及圖2B顯示根據本發明實施例，來自真核及原核表現系統之輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑的表現及純化之結果。圖2B顯示針對His標記之LCBTA對由BL-21(DE3)pLysS表現之可溶性蛋白質進行的庫馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)染色(圖A)及西方墨點法(Western blotting)(圖B)。兩個圖之色帶1及3為在IPTG誘導前之萃取物。兩個圖之色帶2及4為經IPTG誘導之萃取物。色帶1及2代表靶向EpCAM之Ka LCBTA-1。色帶3及4代表靶向Her2/neu之Ka LCBTA-1。
圖3A顯示所選腫瘤靶向性單株抗體及輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑之尺寸排阻-高效液相層析(SEC-HPLC)分析。圖3B顯示輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑之均質性的SEC-HPLC分析以及該等活化劑之抗原結合活性及產率之改良。
圖4A及4B顯示根據本發明之實施例，靶向不同腫瘤之輕鏈橋接型雙特異性抗體與CD20+ Raji淋巴瘤細胞、Her2/neu+ BT474乳癌細胞、EpCAM+ HT29結腸直腸癌細胞(圖4A)及Jurkat淋巴瘤細胞之CD3(圖4B)之結合的實例。
圖5顯示根據本發明之實施例，若干雙特異性抗體之Ig輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑的短暫表現之比較。
圖6展示La LCBTA及Ka LCBTA之活體外血清穩定性分析。
圖7顯示根據本發明之實施例，周邊血液單核細胞(PBMC)在單株抗體及腫瘤靶向性雙特異性抗體(靶向EpCAM及Her2)刺激之後的細胞因子分泌概況之實例。
圖8A顯示根據本發明之實施例，Ig輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑對CD20+ B淋巴瘤(Raji)之細胞毒性。圖8B顯示根據本發明之實施例，Ig輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑對Her2/neu +/EpCAM+結腸直腸癌(HT29)之細胞毒性。圖8C顯示根據本發明之實施例，Ig輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑對Her2/neu +/EpCAM+胰臟癌(Capan-1)之細胞毒性。
圖9A顯示根據本發明之實施例，利用靶向CD20之Ig輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑根除腫瘤的異種移植研究。圖9B顯示根據本發明之實施例，利用靶向Her2/neu之Ig輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑根除腫瘤的異種移植研究。圖9C顯示根據本發明之實施例，利用靶向EpCAM之Ig輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑根除腫瘤的異種移植研究。
本發明之實施例係關新穎形式之具有免疫活化特性的雙特異性或多特異性融合蛋白質於諸如臨床療法之生物醫學應用。根據本發明實施例之單體雙特異性或多特異性免疫活化分子，可稱作輕鏈橋接型雙特異性免疫活化劑(LCBTA)，或更一般地稱作免疫球蛋白橋接型雙特異性或多特異性生物分子。根據本發明實施例之生物分子可為雙特異性或多特異性。然而，為了清楚起見，以下描述將提及此等分子為「雙特異性」分子。應瞭解，該提及之「雙特異性」意欲包括「雙特 異性」及「多特異性」。
根據本發明實施例之雙特異性分子可包含連接兩個靶向域之橋接域。根據本發明實施例之橋接域可包含蛋白質或肽，且兩個靶向域可分別連接至橋接域之N端及C端。根據本發明實施例之兩個靶向域可衍生自抗體之特異性結合域(亦即可變區)。兩個靶向域中之一者可為T淋巴細胞活化域，而另一靶向域可對標靶分子或細胞，諸如腫瘤細胞、腫瘤抗原、病毒、細菌等具有特異性。
本發明之雙特異性分子之實例可包括在以下式(I)及(VI)所示之分子，其中TgD為靶向域，BD為橋接域，TAD為T淋巴細胞活化域，且LNK為連接子：TgD-BD-TAD 式(I)
TAD-BD-TgD 式(II)
TgD-LNK-BD-TAD 式(III)
TAD-BD-LNK-TgD 式(IV)
TgD-LNK-BD-LNK-TAD 式(V)
TAD-LNK-BD-LNK-TgD 式(VI)
一些實例可包括在靶向域與橋接域之間的連接子。一些實例可包括在T淋巴細胞活化域與橋接域之間的連接子。一些實例可包括在靶向域與橋接域之間的連接子及在T淋巴細胞活化域與橋接域之間的另一連接子。
根據本發明之實施例，靶向域(TD)(例如腫瘤靶向域、抗原靶向域、生物分子靶向域等)可衍生自抗體之可變區。衍生自抗體之靶向域可包含輕鏈可變區及重鏈可變區之兩者，該等可變區可以兩種組態(定向)存在：(1)輕鏈可變區在N端且重鏈可變區在C端，或(2)重鏈可變區在N端且輕鏈可變區在C端。
在靶向域(例如腫瘤靶向域)中，重鏈可變區及輕鏈可變區可用連接子連接，該連接子可包含任何合適的連接子，諸如短肽片段。舉例而言，根據本發明實施例之連接子可包含短肽，該短肽典型地包含小胺基酸殘基或親水性胺基酸殘基(例如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、脯胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺等)。此類肽之一個實例為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)。其他實例可包括該序列中胺基酸之置換，諸如GGGSG、GGSGG、GSGGG或SGGGG。其他實例可包括含有除G或S以外之胺基酸殘基的肽，諸如GGTGS、GTSPGG、GNGGGS等。熟習此項技術者應瞭解，許多常用肽連接子可用於本發明之實施例中。
根據本發明之一些實施例，該等短肽連接子可包含重複單元以增加連接子長度。舉例而言，一些連接子可包含兩個G4S重複連接子、三個G4S重複連接子或四個G4S重複連接子。此外，一些「重複狀」連接子可包含不同肽序列之混合，諸如G4S-GGSGG-G4S-SGGGG。
根據本發明之實施例，橋接域可包含肽片段，較佳為衍生自抗體之片段。在較佳實施例中，橋接域可衍生自重鏈、輕鏈，尤其重鏈或輕鏈中之恆定區。舉例而言，根據本發明實施例之橋接子可衍生自輕鏈，諸如κ鏈、λ-2鏈或λ-5鏈(或代用輕鏈)。在一些實施例中，橋接子可包含衍生自輕鏈之區或域，諸如κ鏈、λ-2鏈或λ-5鏈之恆定區。類似地，橋接域可衍生自重鏈或重鏈之區(例如恆定區)。如本文所用，術語「衍生自」係指如下事實：橋接域與輕鏈或重鏈之域(例如恆定區)的全長序列共享實質同源性(例如50%，較佳70%，更佳80%，最佳90%)。
另外，根據本發明之實施例，橋接域可為模擬輕鏈恆定區之κ鏈、λ鏈或λ-5(或代用輕鏈)之突變體，或κ鏈、λ鏈或λ-5代用輕鏈之衍生物。如本文所用之「突變體」係指保守突變體或非保守突變體。 根據本發明實施例之突變體保留充當如本文所述之橋接域之功能。熟習此項技術者應瞭解，保守突變體包含用類似胺基酸取代胺基酸，且典型地應保存生物活性或結構。保守突變體可包括1-50個胺基酸取代，較佳1-30個胺基酸，更佳1-20個胺基酸，且最佳1-10個胺基酸。非保守突變體可缺失、取代或***一或多個胺基酸殘基，例如1-50個胺基酸，較佳1-30個胺基酸，更佳1-20個胺基酸，且最佳1-10個胺基酸。
根據本發明之一些實施例，橋接子(或橋接域)可與靶向域及T淋巴細胞活化域直接連接。根據本發明之其他實施例，可在橋接子與靶向域或T淋巴細胞活化域之間提供連接子。根據本發明之其他實施例，可在橋接子與靶向域之間提供連接子，且在橋接子與T淋巴細胞活化域之間提供第二連接子。
橋接域與靶向域或T淋巴細胞活化域之間的連接子可類似於上文關於該等域內之連接子所描述之連接子。舉例而言，橋接域與靶向域或T淋巴細胞活化域之間的連接子可包含G4S連接子或G4S重複連接子(其可為雙重重複、三重重複或其類似重複)。另外，如上文所指出，連接子可包含其他胺基酸序列。
根據本發明之實施例，T淋巴細胞活化域可在介入連接子存在或不存在之情況下連接至用於T淋巴細胞活化之橋接域的一個末端。此項技術中已知各種T淋巴細胞活化分子，包括抗CD3抗體(單株或多株)或該等抗體之CD3結合片段或4-1BB分子之配位體或抗體。舉例而言，根據本發明之實施例，T淋巴細胞活化域可包含針對CD3之單株抗體的可變區。在該等實施例中，可以兩種定向使用可變區之重鏈及輕鏈：(1)輕鏈可變區在N端且重鏈可變區在C端，或(2)重鏈可變區在N端且輕鏈可變區在C端。
類似於關於靶向域所描述之連接子，連接子可連接T淋巴細胞結 合域之重鏈可變區與輕鏈可變區。舉例而言，此類連接子可包含任何合適的胺基酸序列，諸如G4S或雙重、三重或四重G4S重複連接子。另外，連接子可包括其他胺基酸序列。
本發明之雙特異性分子可用於靶向細胞或分子，與此同時活化T淋巴細胞反應。將用以下工作實例說明此等分子之一些生物效用。
免疫球蛋白輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑之產生
在第一組實例中，使用抗CD20、抗Her2/neu或抗EpCAM ScFv(可變區之單鏈片段)作為細胞靶向域(CtD)，且選擇抗CD3 ScFv作為T淋巴細胞活化域(TAD)。將所選的CtD及TAD以橋接子連接，該橋接子例如可包含衍生自抗體輕鏈或重鏈之免疫球蛋白域。該等橋接子之實例可包括選自人類免疫球蛋白恆定區之橋接子。選自人類免疫球蛋白恆定區之該等免疫球蛋白鏈橋接子的特定實例可包括(但不限於)如下所顯示之SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3及SEQ ID No.4：
‧序列ID No.1： - 人類免疫球蛋白κ恆定
‧序列ID No.2： - 人類免疫球蛋白λ2恆定
‧序列ID No.3： - 人類免疫球蛋白λ5恆定
‧序列ID No.4： - 人類免疫球蛋白重鏈恆定1(CH1)
根據本發明之一些實施例，CtD之C端可融合至所選橋接子(例如衍生自人類免疫球蛋白恆定區之橋接子)之N端。根據本發明之其他實施例，CtD之C端可融合至連接子序列之N端，且該連接子隨後融合至 所選橋接子(例如衍生自人類免疫球蛋白恆定區之橋接子)之N端。
在輕鏈橋接子之C端，連接子可視情況與橋接子之C端融合。根據本發明之實施例，連接子可包含上文所描述之任何合適的肽序列。舉例而言，在存在或不存在其他序列(例如鉸鏈序列CPPCP)之情況下，連接子可包含一或多個GGGGS序列(G4S)。此構築體可隨後連接至TAD以形成圖1所顯示之雙特異性分子。
如上文所指出，本發明之一些實施例可在介入連接子存在或不存在之情況下使TAD在橋接子之N端，且在介入連接子存在或不存在之情況下使CtD在橋接子之C端。此外，熟習此項技術者應瞭解，可用針對其他標靶分子的其他特異性結合域來替換CtD。
圖1所顯示之LCBTA為二價(雙特異性)分子，其中一個效價對細胞標靶具有特異性且另一效價對T淋巴細胞上之CD3分子具有特異性。此LCBTA可表現於哺乳動物、真核或原核細胞中，且例如經輕鏈特異性親和管柱純化至均質性(圖2)。SEC-HPLC(尺寸排阻HPLC)分析顯示，大多數經純化之雙特異性分子為單體形式(圖3)。儘管如此，ScFv之定向、域間連接子之長度、ScFv域至橋接域之相容性及/或轉譯效率可影響雙特異性分子之轉譯及轉譯後處理，由此可導致多聚體形成之增加及/或生物功能性之變化(I及J，圖3，表1)。
除定向、域間連接子、各域之間的相容性及轉譯及轉譯後修飾會對單體及多聚體之形成造成影響外，域內連接子亦可影響雙特異性分子之生物特性。如圖3B所顯示，舉例而言，靶向Her2/neu之Ka LCBTA-1包含G4SG4SG4S域內連接子，其經工程改造以包含域內連接子G4SG4S(Ka LCBTA-1-A)及G4SG4SG4SG4S(Ka LCBTA-1-B)。雖然關於三種形式之SEC-HPLC及標靶結合分析顯示類似結果，但在最終蛋白質產率中發現顯著變化。
參考雙特異性抗體之構築
構築IgG-FL(免疫球蛋白G全長)雙特異性抗體(BsAb)作為參考物(參見圖1)。此BsAb包含在N端之全長抗CD20單株抗體作為細胞靶向域(CtD)及在C端之兩個抗CD3 ScFv作為T淋巴細胞活化域(TAD)。可將包含GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS肽之連接子/鉸鏈域***此參考IgG-FL BsAb之CtD與TAD之間，該GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS肽包括兩個連接子(GGGGS或G4S)序列及一鉸鏈(CPPCP)序列(圖1)。此IgG-FL BsAb為四價分子，其中兩個結合位點對細胞標靶具有特異性，且其他兩個結合位點對CD3分子具有特異性。
除上文所描述之IgG-FL BsAb以外，亦構築兩個串聯重複BsAb作為參考物。如圖1所顯示，串聯重複-1具有在N端之抗CD20 ScFv作為CtD，緊接CtD之C端後之GGGGS連接子，及抗CD3 ScFv作為與該連接子之C端融合之TAD。串聯重複-2具有與串聯重複-1呈反向順序之CtD及TAD，亦即，TAD在連接子之N端且CtD在連接子之C端。
結合分析
對細胞標靶及T淋巴細胞之結合特異性為針對雙特異性分子之治療指示劑的重要部分。以上雙特異性抗體之結果顯示，具有單價抗CD20、抗Her2/neu或抗EpCAM ScFv(作為CtD)之LCBTA確實可分別結合表現Raji之CD20、表現BT474之Her2/neu(ErbB2)或表現HT29之EpCAM。該結合接近於單株抗CD20、抗Her2/neu或抗EpCAM抗體(圖4A)。與二價單株抗CD3抗體相比，單價TAD(抗CD3 ScFv)與LCBTA之C端之融合降低了與表現Jurkat之CD3分子的結合親和力(圖4B)。該降低與二價參考形式(IgG-FL BsAb)相當(圖4B)。參考IgG-FL BsAb為類似於全抗體之雙特異性抗體，其例外之處在於抗CD3 ScFv共價融合至各重鏈之C端(圖1)。
免疫球蛋白輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑之表現
圖2、3及5顯示經短暫轉染之LCBTA在哺乳動物細胞株中之表現。參考形式(IgG-FL BsAb)顯示表現速率不小於1 μg/ml，其類似於λ或κ橋接型LCBTA形式及其衍生物。橋接型域之生理特性對雙特異性T細胞活化劑之表現及穩定性較為重要。舉例而言，λ 5(亦稱為代用輕鏈)為由不成熟B淋巴細胞表現之免疫球蛋白輕鏈狀蛋白質。與λ或κ橋接型LCBTA相比，哺乳動物細胞之λ 5橋接型LCBTA短暫表現減少。另外，與該等參考物(亦即λ或κ橋接型LCBTA)相比，作為λ或κ橋接子的替換物之IgG1之恆定重鏈域的CH1亦得到不良表現速率。
橋接型LCBTA由4個主要域構成：腫瘤靶向域、輕鏈橋接子、連接子及T細胞活化域。與全分子相比，此等域中之任一者變化均可誘導域間干擾且導致功能降低或損失。如表1所顯示，使腫瘤靶向性ScFv的定向/組態自輕鏈-重鏈(Ka LCBTA-1)改變至重鏈-輕鏈會導致與T細胞活化域之結合降低，且反之亦然。基於SEC-HPLC分析，該 等定向操作亦改變單體產品之形成(圖3A)。此等實例中之連接子域包含四個重複甘胺酸及一個絲胺酸的短延伸。結果顯示，域間連接子之長度或尺寸可劇烈影響橋接型LCBTA分子之生物特徵(表2)。
亦藉由SEC-HPLC檢測所表現之橋接型LCBTA以評估多聚LCBTA之污染。當使用ScFv作為其他顯影劑之組分時，不欲的多聚雙特異性分子之污染的增加會造成問題。如圖3所顯示，不考慮靶向分子下，大多數經純化之橋接型LCBTA呈單體形式。另外，κ或λ作為橋接型均不影響LCBTA之單體的均質性。
串聯重複BsAb之表現呈高度ScFv依賴性，因為將ScFv抗體自N端反接至C端或自C端反接至N端會導致蛋白質表現速率的劇烈變化。因此，LCBTA展現之表現速率比串聯重複BsAb形式之表現速率更優良(參見例如色帶1及2，圖5)，且當將TAD置放在分子之C端時，該差異會進一步放大。
對生物醫藥協會(Biopharmaceutical society)而言，ScFv或成片段之Ig分子的短暫血清穩定性係為常識(Cancer Res 2000年8月8日，60；433)。在輕鏈作為橋接子之情況下，含有ScFv之雙特異性分子的穩定性顯示在圖6中。結果顯示，即使在血清中且在37℃下培育一週之後，LBCTA之兩種形式仍可穩定化超過50%之ScFv。
Ka LCBTA及經單株抗體處理之PBMC的發炎性細胞因子分泌概況
已知經抗CD3單株抗體處理可誘導T淋巴細胞活化及發炎性細胞因子分泌之增強(圖7)。如圖7所顯示，除IL-8以外，橋接型LCBTA並 不誘導發炎性細胞因子之分泌。橋接型LCBTA並不包含任何重鏈恆定序列，因此，FcR介導之活化不對IL8之提高負責。低發炎性細胞因子分泌概況表示T淋巴細胞依賴性療法之副作用的風險會降低。
免疫球蛋白輕鏈橋接型雙特異性T淋巴細胞活化劑之細胞毒性
為展示本發明實施例之生物功能性，測試靶向CD20之κ橋接型LCBTA、抗CD20 mAb及IgG-FL BsAb之抗腫瘤能力(圖1及8)。如圖8所顯示，與抗CD20 mAb之EC50值22 pM或IgG-FL BsAb之EC50單一數位pM相比，κ橋接型LCBTA在次pM範圍內之EC50值顯示其對腫瘤之根除高度有效。κ橋接型LCBTA亦顯示最大腫瘤根除速率高達90%，而抗CD20 mAb僅35%，且IgG-FL BsAb為75%。
為展示本發明實施例之生物功能性，將靶向Her2/neu或EpCAM之κ橋接型LCBTA對Her2/neu +及EpCAM+ HT29結腸直腸癌細胞進行測試，以評估其之腫瘤根除能力(圖8B)。如圖8B所顯示，與抗Her2/neu及抗EpCAM mAb分別為28%至51%之腫瘤殺死速率相比，靶向Her2/neu及EpCAM之κ橋接型LCBTA之腫瘤根除效果均高度有效，其中最大細胞毒性速率高達100%。
為展示本發明實施例之生物功能性，將靶向Her2/neu或EpCAM之κ橋接型LCBTA對Her2/neu +及EpCAM+ Capan-1胰臟癌細胞進行測試，以評估其之腫瘤根除能力(圖8C)。如圖8C所顯示，與抗Her2/neu及抗EpCAM mAb分別為39%至34%腫瘤殺死速率相比，靶向Her2/neu及EpCAM之κ橋接型LCBTA之腫瘤根除效果均高度有效，其中靶向Her2/neu及EpCAM之κ橋接型LCBTA的最大細胞毒性速率分別為超過75%及100%。
攜帶腫瘤之動物的異種移植分析
為展示本發明實施例之治療潛力，將靶向CD20之κ橋接型LCBTA 及抗CD20 mAb對攜帶有CD20+人類淋巴瘤(Raji細胞)之SCID小鼠進行測試，以評估其之抗腫瘤能力(圖1及8)。在治療之前，對SCID小鼠皮下接種Raji細胞及PBMC。如圖9A所顯示，用Ka LCBTA作為治療劑處理之動物發展的腫瘤遠少於用抗CD20 mAb作為治療劑處理之動物。
為展示本發明實施例之治療潛力，將靶向Her2/neu之κ橋接型LCBTA及抗Her2/neu mAb對攜帶有Her2/neu +人類結腸直腸癌(HT29細胞)之SCID小鼠進行測試，以評估其之抗腫瘤能力(圖1及8)。在治療之前，對SCID小鼠皮下接種HT29細胞(與預活化或未處理之PBMC預混合)。如圖9B所顯示，用靶向Her2/neu之Ka LCBTA作為治療劑處理之動物發展的腫瘤顯著少於用抗Her2/neu mAb作為治療劑處理之動物。
為展示本發明實施例之治療潛力，將靶向EpCAM之κ橋接型LCBTA及抗EpCAM mAb對攜帶有EpCAM+人類結腸直腸癌(HT29細胞)之SCID小鼠進行測試，以評估其之抗腫瘤能力(圖1及8)。在治療之前，對SCID小鼠皮下接種HT29細胞(與預活化PBMC預混合)。如圖9B所顯示，靶向EpCAM之Ka LCBTA有效抑制腫瘤進程。
構築雙特異性抗體
自各個供應商購買限制酶。DNA聚合酶、T4 DNA連接酶克列諾(Klenow)酶及T4 DNA聚合酶來自Invitrogen(Grand Island,NY)。如製造商所推薦使用所有酶。
自供應商購買用於PCR擴增之所有引子。DNA擴增執行如下：在PCR機器中，在94℃下使用2分鐘之預變性步驟，繼之以35個循環，該等循環含有變性步驟(94℃)、退火步驟(50℃)及延長步驟(72℃)，各50秒。
所有表現模組示意性地呈現在圖1中。
將抗CD20、抗Her2/neu及抗EpCAM輕鏈及截短之重鏈分別選殖至載體載體pGEM中。將抗CD20、抗Her2/neu及抗EpCAM VH及VL之單鏈片段選殖至載體TCAE8中且用於後續抗腫瘤ScFv。
細胞株製備
本發明所用之Raji、BT474、Capan-1及HT29細胞分別為B淋巴瘤腫瘤細胞株、乳癌細胞株、胰臟細胞株及結腸直腸癌細胞株，其獲自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)，該中心為中華民國之食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)之一個部門。Jurkat細胞為來自ATCC之T淋巴瘤細胞株。Raji及Jurkat細胞均在補充有10%胎牛血清(Hyclone)、0.03% L-麩醯胺酸及0.4 mM丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基(GibcoBRL Life Technologies,Paisly,UK)中培養。在37℃下含有5% CO2之含濕氣培育箱中培育之後，細胞經繼代培養或在滅菌緩衝液中洗滌以用於測試。根據ATCC之準則培養BT474、Capan-1及HT29。
周邊血液單核細胞(PBMC)之製備
用Ficoll-Paque PLUS藉由密度離心自正常健康成人供體之全血分離周邊血液單核細胞(PBMC)。在分離之後，PBMC在補充有10 ng/ml抗CD3 mAb、75 IU/ml介白素-2(IL-2)及10% FBS之RPMI-1640培養基中培養及預活化5-10天。
細胞毒性分析(鈣黃綠素AM細胞毒性)
在37℃下，在補充有5% FBS之不含酚紅之RPMI 1640培養基中，用10 μM鈣黃綠素標記標靶細胞(Raji)30分鐘。在鈣黃綠素培育結束時，用含有5% FBS之不含酚紅之RPMI 1640培養基洗滌細胞兩次，且 用含有5% FBS之不含酚紅之RPMI 1640調整細胞密度至3×105個細胞/毫升。對於反應混合物，將培養基之100 μl等分試樣(各含有3 ×104個細胞)置放在96孔培養板之各孔中。計算效應細胞(PBMC)培養物之細胞密度且用含有5% FBS之不含酚紅之RPMI 1640培養基調整至3×106個細胞/毫升。對於細胞毒性分析，將不同數量之不同BsAb及100 μl(3×105個細胞)效應細胞添加至預負載有Raji之96孔培養板中且在37℃下富集有5% CO2之培育箱中培育4小時。在培育結束時，在700 g下使培養板離心5分鐘。隨後，將來自各反應孔之130 μl上清液單獨轉移至新板且在融合α微板讀取器(Fusion alpha micro-plate reader)中定量經剝離之染料。根據下式計算細胞毒性之百分比：[螢光(樣品)-螢光(對照組)]/[螢光(總溶解)-螢光(對照組)]*100。
總溶解係定義為用0.9% Triton處理10分鐘之標靶細胞。
流動式細胞測量術分析 對腫瘤標靶(B淋巴瘤)之結合親和力
在室溫下用不同濃度之不同BsAb處理包括Raji、BT474及HT29細胞在內之標靶細胞(1×106個細胞/反應物)30分鐘。在培育結束時，用補充有2% FBS之PBS洗滌所有反應物兩次。洗滌之後，在室溫下，用1 μl之FITC共軛之親和純化F(ab')2片段(山羊抗人類IgG(Fab')2片段)特異性抗體再培育細胞30分鐘。在培育之後，用冰冷的補充有2% FBS之PBS洗滌細胞兩次且藉由FACS裝置監測細胞。
在室溫下用不同濃度之不同BsAb處理Jurkat細胞(1×106個細胞/反應物)30分鐘。在培育結束時，用補充有2% FBS之PBS洗滌所有反應物兩次。洗滌之後，在室溫下，用1 μl之FITC共軛之親和純化F(ab')2片段(山羊抗人類IgG(Fab')2片段)特異性抗體再培育細胞30分鐘。在培育之後，用冰冷的補充有2% FBS之PBS洗滌細胞兩次且藉由 FACS裝置監測細胞。
免疫球蛋白輕鏈橋接型雙特異性抗體之原核選殖及表現
使用Nco I及xhoI限制位點，將與所需腫瘤靶向性輕鏈橋接型雙特異性抗體相對應之合成基因選殖至pET20b載體中。將約20 ng各重組構築體轉化成Novagen® BL21(DE3)pLysS(EMD Millipore)，且在補充有安比西林(100 μg/ml)之LB瓊脂板上選擇轉化體。
含有該等重組構築體之BL21(DE3)pLysS之單群落在37℃下於5 mL補充有安比西林之LB中生長隔夜。在37℃下在震盪條件下培育培養物。當群體達到0.6-0.7之OD600時接著添加誘導物(IPTG)。在誘導0小時及隔夜之後，藉由離心(4000×g持續15分鐘)收穫等分試樣。為驗證標靶特異性輕鏈橋接型雙特異性抗體之表現，藉由SDS-PAGE(4~12%丙烯醯胺)分析可溶性部分之總蛋白質提取物。藉由添加樣品緩衝液及沸騰5分鐘製備樣品。分離之後，用0.1%庫馬斯亮藍R-250對凝膠染色。使用抗His mAb分析西方墨點法。
以上實例展示了本發明實施例之效用，該等實施例為雙特異性或多特異性分子。以上實例亦說明了各種靶向域可用於靶向不同的分子或細胞。因此，熟習此項技術者應瞭解，可在本文所述之雙特異性分子之相同構架中使用針對不同標靶之其他靶向域。因此，本發明之範疇不限於實例中所顯示之特定較佳實施例。
雖然已關於有限數目之實施例描述本發明，但具有本發明權益之熟習此項技術者應瞭解，可設計不脫離如本文所揭示之本發明範疇的其他實施例。因此，本發明之範疇應僅受所附申請專利範圍限制。
<110> 財團法人生物技術開發中心
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<211> 101
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<213> 智人
<400> 4

Claims (10)

  1. 一種單鏈雙特異性融合蛋白質，其包含：對所關注之第一標靶具有特異性之第一靶向域；衍生自免疫球蛋白之輕鏈或重鏈之恆定區的橋接域；及對所關注之第二標靶具有特異性之第二靶向域，其中該橋接域為κ鏈、λ鏈、λ-5代用輕鏈，或模擬該輕鏈恆定區之該κ鏈、該λ鏈或該λ-5代用輕鏈之突變體，或該κ鏈、該λ鏈或該λ-5代用輕鏈之衍生物；且其中該第一靶向域包含對所關注之該第一標靶具有特異性之第一ScFv，且該第二靶向域包含對所關注之該第二標靶具有特異性之第二ScFv。
  2. 如請求項1之單鏈雙特異性融合蛋白質，其進一步包含與該橋接域之N端或C端融合之連接子。
  3. 如請求項1或2之單鏈雙特異性融合蛋白質，其中該第一靶向域與該橋接域或該連接子融合且該第二靶向域與該橋接域或該連接子融合。
  4. 如請求項1或2之單鏈雙特異性融合蛋白質，其中該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。
  5. 如請求項2之單鏈雙特異性融合蛋白質，其中該連接子包含GGGGS序列。
  6. 如請求項1或2之單鏈雙特異性融合蛋白質，其中該第二靶向域為T淋巴細胞活化域。
  7. 如請求項1或2之單鏈雙特異性融合蛋白質，其中該所關注之該第一標靶為CD20、Her2/neu或EpCAM。
  8. 如請求項1之單鏈雙特異性融合蛋白質，其中該第一ScFv及該第 二ScFv各自包含人類序列。
  9. 如請求項1之單鏈雙特異性融合蛋白質，其中該第一ScFv包含對第一抗原具有結合特異性之VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，且該第二ScFv包含對第二抗原具有結合特異性之VH-連接子-VL或VL-連接子-VH。
  10. 如請求項9之單鏈雙特異性融合蛋白質，其中該連接子包含GGGGS序列。
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