JP2017048196A

JP2017048196A - 軽鎖架橋二重特異性抗体

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Publication number: JP2017048196A
Application number: JP2016198979A
Authority: JP
Inventors: ユーシェンスー，; Yu-Shen Hsu; ショウ−シャンシェウ，; Show-Shan Sheu; ミン−アイチャン，; Ming-I Chang; チェン−カイロー，; Cheng-Kai Lo
Original assignee: Development Center for Biotechnology; DCB USA LLC
Current assignee: Development Center for Biotechnology; DCB USA LLC
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2017-03-09
Also published as: TW201336866A; KR20160145847A; EP2797958A4; CA2861816A1; EP2797958A1; AU2012362378A1; US20130165638A1; KR101814370B1; TWI530505B; JP6114902B2; WO2013101909A1; EP2797958B1; CN104185642A; HK1202560A1; AU2012362378B2; JP2015508400A; CA2861816C; KR20140112515A

Abstract

【課題】臨床治療のための免疫活性化特性を有する単量体の二重特異性融合タンパク質の新規なフォーマットの提供。【解決手段】目的の第一の標的に対する特異性を有する第一の標的指向化ドメイン；ヒト免疫グロブリンであってもよい免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の定常部に由来する架橋ドメイン；及び目的の第二の標的に対する特異性を有する第二の標的指向化ドメインを含む、二重特異性融合タンパク質。二重特異性融合タンパク質は、架橋ドメインのＮ末端又はＣ末端に融合されたリンカーをさらに含むことができる。第一の標的指向化ドメインは、架橋ドメインに融合され、第二の標的指向化ドメインは、架橋ドメイン又はリンカーに融合される。リンカーは、ＧＧＧＧＳ配列を含んでいてもよい。目的の第一の標的は、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、又はＥｐＣＡＭであることができ、第二の標的指向化ドメインは、Ｔリンパ球活性化ドメインである。【選択図】図１Ｂ

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年１２月２７日に出願された仮出願第６１/５８０，４９１号の利益を請求するものであり、同出願の開示はその全体が参照によりここに包含される。

（発明の分野）
本発明は、二重特異性抗体のような二重特異性又は多重特異性生体分子を製造する方法、及びその生成物に関する。

（発明の背景）
異なる機能を有する生物学的分子を一緒にすることは、所望の特性又は改良された特性を有する新規な分子をもたらし得る。たとえば、二重特異性抗体及び二重特異性腫瘍標的指向化Ｔリンパ球エンゲージャー（engagers）を含む多重特異性抗体における最近の進歩により、免疫学的活性化特性を有する多重特異性分子はモノクローナル抗腫瘍治療と比較して強化された腫瘍治療効率をしばしばもたらすことが明らかにされている。

たとえば、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、異なる抗体由来の二つの異なる結合ドメイン（すなわち可変領域）のフラグメントから構成されていてもよい。その二つの異なる結合ドメインは、二つの異なるタイプの抗原に結合することができる。これらの分子は、がんの免疫治療のような臨床治療において適用を見出す可能性がある。このような適用のために、ＢｓＡｂｓは、細胞傷害性細胞（レセプター様ＣＤ３（Kurby immunology. San Francisco:W.H. Freeman. ISBN 1−492−0211−4）を用いて）及びがん細胞のような標的（たとえば、がん細胞上の抗原）に同時に結合するように設計することができる。

二重特異性又は多重特異性タンパク質の構築は、複数のタンパク質ドメインの融合を含む。しかし、このような融合は、融合パートナー間で異なる生化学的及び／又は生理学的特性のために融合パートナー間の不適合性を引き起こし得る。さらに、腎臓のろ過又は循環経路の透過性を含む生理学的限界もまた、医学的に利用可能な多重特異性腫瘍標的指向化分子の設計に挑戦するものとなり得る。

（発明の概要）
本発明の実施態様は、臨床治療のような生物医学的適用のための免疫活性化特性を有する二重特異性又は多重特異性融合タンパク質の新規なフォーマットに関する。これらのタンパク質は、架橋ドメインによって連結された二つの特異的結合ドメイン（標的指向化ドメイン）を含み、一つ又は二つの任意のリンカーを含んでいてもよい。架橋ドメインは、融合タンパク質中の異なるパートナーが適合性であり、所望の生物学的特性を保持することができるように、抗体の免疫グロブリンドメイン由来でもよい。架橋として有用であり得る免疫グロブリンドメインは、軽鎖定常部又は重鎖定常部を含むことができる。このような融合タンパク質は、軽鎖架橋抗体又は重鎖架橋抗体と呼ばれることができる。

たとえば、本発明の実施態様に従った二重特異性融合タンパク質は、ＣＤ２０（Hybridoma. 1983 2;17）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Am J Clin Pathol 2003 120 （suppl 1）; S53）又はＥｐＣＡＭ（J. Immunol. 1992 148 （2）; 590）のような抗腫瘍バイオマーカー、細胞標的指向化又は生体分子標的指向化ドメインとしての単鎖連結（linked）Ｆｖフラグメント（ＳｃＦｖ）、架橋としての軽鎖定常部ドメイン、任意のリンカー（これは省略してもよい）、及びＴリンパ球活性化ドメインとしての抗ＣＤ３ＳｃＦｖを含むことができる。このような軽鎖架橋二重特異性免疫活性化因子は、腫瘍発現細胞標的及びＴリンパ球の両方に対して結合特異性を示す。両方の標的に対する結合は、腫瘍標的に対して特異的にＴリンパ球媒介性細胞傷害性を誘導する。

上記の抗腫瘍ＳｃＦｖの例に加えて、他の細胞標的指向化ドメインも用いることができる。このような他の分子は、他の細胞標的に対する特異的結合能を有し得る。Ｔ細胞活性化ドメイン以外の他の細胞標的指向化ドメインの例としては、毒素ポリペプチド、酵素、ホルモン、サイトカイン、シグナル伝達分子又は所望の特異性のＳｃＦｖが挙げられる。さらに、本発明の実施態様に従った融合タンパク質は、原核細胞又は真核細胞において発現させてもよい。それに加えて、ＳｃＦｖの配向は、重鎖可変領域に連結された軽鎖可変領であってもよく、あるいはその逆であってもよい。このような二重特異性分子の適用は、医薬品の適用、たとえば特異的バイオマーカー担持細胞枯渇治療（specific biomarker−bearing cell depletion therapies）、たとえばがん治療を含む。さらに、このような分子は、診断の適用において使用してもよい。

本発明の一つの側面は、二重特異性融合タンパク質に関する。本発明の一つの実施態様に従った二重特異性融合タンパク質は、目的の第一の標的に対する特異性を有する第一の標的指向化ドメイン；ヒト免疫グロブリンであってもよい免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の定常部に由来する架橋ドメイン；及び目的の第二の標的に対する特異性を有する第二の標的指向化ドメインを含むことができる。標的指向化ドメインは、標的生体分子又は細胞に対して特異的であることができる。

本発明のいくつかの実施態様に従えば、二重特異性融合タンパク質は、架橋ドメインのＮ末端又はＣ末端に融合したリンカーをさらに含むことができる。第一の標的指向化ドメインは、架橋ドメイン又はリンカーに融合され、第二の標的指向化ドメインは、架橋ドメイン又はリンカーに融合される。リンカーは、ＧＧＧＧＳ配列を含んでいてもよい。目的の第一の標的は、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｐＣＡＭ又は同様のものであってもよく、第二の標的指向化ドメインは、Ｔリンパ球活性化ドメイン、たとえば抗ＣＤ３であってもよい。

本発明のいくつかの実施態様に従えば、二重特異性融合タンパク質は、上記のリンカードメインを欠いていてもよく、すなわち、その場合においては、目的の第一の標的に対して特異性を有する第一の標的指向化ドメイン及び目的の第二の標的に対して特異性を有する第二の標的指向化ドメインは、架橋ドメインの二つの末端に直接融合される。

本発明のいくつかの実施態様に従えば、二重特異性融合タンパク質は、第一の標的指向化ドメインと架橋ドメインとの間ならびに架橋ドメインと第二の標的指向化ドメインとの間に介在する上記の一又はそれ以上のリンカーを含んでいてもよい。言い換えれば、第一の標的指向化ドメイン及び第二の標的指向化ドメインの両方は、リンカーと個別に融合され、それらは架橋ドメインの二つの末端と融合される。

上記の実施態様のいずれにおいても、第一の標的指向化ドメインは、目的の第一の標的に対する特異性を有する第一のＳｃＦｖを含んでいてもよく、第二の標的指向化ドメインは、目的の第二の標的に対する特異性を有する第二のＳｃＦｖを含んでいてもよい。

上記の実施態様のいずれにおいても、第一のＳｃＦｖ及び第二のＳｃＦｖの各々は、ヒト免疫グロブリン配列を含んでいてもよい。上記の実施態様においては、第一のＳｃＦｖは、第一の抗原に対して結合特異性を有するＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでいてもよく、第二のＳｃＦｖは、第二の抗原に対して結合特異性を有するＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでいてもよい。

上記の実施態様のいずれにおいても、リンカーは、一つ又はそれ以上のＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）配列を含んでいてもよい。たとえば、リンカーは、一つのＧ４Ｓ配列、二つのＧ４Ｓ配列（反復）、三つのＧ４Ｓ配列、などを含んでいてもよい。さらに、リンカーは、Ｇ４Ｓ配列と組み合わせて他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。このような他のアミノ酸配列としては、たとえば、ヒンジ配列を含んでいてもよい（たとえばＣＰＰＣＰ）。

本発明の他の側面及び利点は、以下の記載及び添付の特許請求の範囲から明らかであろう。

図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の実施態様に従った種々の二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の構築物の模式図を示す。

図２Ａ及び図２Ｂは、本発明の実施態様に従った原核及び真核発現系からの軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の発現及び精製の結果を示す。図２Ｂは、クマシーブリリアントブルー染色（パネルＡ）及びＢＬ−２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳによって発現された可溶性タンパク質上のＨｉｓ−タグ化ＬＣＢＴＡｓに対するウェスタンブロッティング（パネルＢ）を示す。両パネルのレーン１及び３は、ＩＰＴＧ誘導前の抽出物である。両パネルのレーン２及び４は、ＩＰＴＧ誘導された抽出物である。レーン１及び２は、ＥｐＣＡＭ標的指向化ＫａＬＣＢＴＡ−１を表す。レーン３及び４は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ標的指向化ＫａＬＣＢＴＡ−１を表す。

図３Ａは、選択された腫瘍標的指向化モノクローナル抗体及び軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の分子ふるい−高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）解析を示す。図３Ｂは、軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の均一性のＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析ならびにその抗原結合活性及び収量の改良を示す。

図４Ａ及び図４Ｂは、本発明の実施態様に従ったＣＤ２０⁺Ｒａｊｉリンパ腫細胞、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ⁺ ＢＴ４７４乳がん細胞、ＥｐＣＡＭ⁺ ＨＴ２９大腸がん細胞（図４Ａ）、及びＪｕｒｋａｔリンパ腫細胞のＣＤ３（図４Ｂ）に結合する異なる腫瘍標的指向化軽鎖架橋二重特異性抗体の例を示す。

図５は、本発明の実施態様に従ったいくつかの二重特異性抗体のＩｇ軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の一過性発現の比較を示す。

図６は、ＬａＬＣＢＴＡ及びＫａＬＣＢＴＡのインビトロ血清安定性解析を明らかにする。

図７は、本発明の実施態様に従ったモノクローナル抗体及び腫瘍標的指向化二重特異性抗体（ＥｐＣＡＭ及びＨｅｒ２標的指向化の両方）の刺激後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）によるサイトカイン分泌プロフィールの例を示す。

図８Ａは、本発明の実施態様に従ったＣＤ２０⁺ Ｂ−リンパ腫（Ｒａｊｉ）に対するＩｇ軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の細胞傷害性を示す。図８Ｂは、本発明の実施態様に従ったＨｅｒ２／ｎｅｕ⁺／ＥｐＣＡＭ⁺大腸がん（ＨＴ２９）に対するＩｇ軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の細胞傷害性を示す。図８Ｃは、本発明の実施態様に従ったＨｅｒ２／ｎｅｕ⁺／ＥｐＣＡＭ⁺膵臓がん（Ｃａｐａｎ−１）に対するＩｇ軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の細胞傷害性を示す。

図９Ａは、本発明の実施態様に従ったＣＤ２０標的指向化Ｉｇ軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子による腫瘍根絶の異種移植実験を示す。図９Ｂは、本発明の実施態様に従ったＨｅｒ２／ｎｅｕ標的指向化Ｉｇ軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子による腫瘍根絶の異種移植実験を示す。図９Ｃは、本発明の実施態様に従ったＥｐＣＡＭ標的指向化Ｉｇ軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子による腫瘍根絶の異種移植実験を示す。

（詳細な説明）
本発明の実施態様は、臨床治療のような生物医学的適用のための免疫活性化特性を有する二重特異性又は多重特異性融合タンパク質の新規なフォーマットに関する。本発明の実施態様に従った単量体の二重特異性又は多重特異性免疫活性化分子は、軽鎖架橋二重特異性免疫活性化因子（ＬＣＢＴＡ）と、又はより一般的には免疫グロブリン架橋二重特異性又は多重特異性生体分子と、呼ばれることができる。本発明の実施態様に従った生体分子は、二重特異性又は多重特異性であることができる。しかし、明確さのために、以下の説明においては、これらの分子を「二重特異性」分子と呼ぶことになる。このような「二重特異性」に対する言及は、「二重特異性」及び「多重特異性」の両方を含むことを意図することは理解されるべきである。

本発明の実施態様に従った二重特異性分子は、二つの標的指向化ドメインを連結する架橋ドメインを含んでいてもよい。本発明の実施態様に従った架橋ドメインは、タンパク質又はペプチドを含んでいてもよく、二つの標的指向化ドメインは、それぞれ、架橋ドメインのＮ末端及びＣ末端に連結されていてもよい。本発明の実施態様に従った二つの標的指向化ドメインは、抗体の特異的結合ドメイン（すなわち、可変領域）に由来してもよい。二つの標的指向化ドメインの一方は、Ｔリンパ球活性化ドメインであってもよく、他方の標的指向化ドメインは、腫瘍細胞、腫瘍抗原、ウイルス、細菌、などのような標的分子又は細胞に対して特異的であってもよい。

本発明の二重特異性分子の例としては、以下の式（Ｉ）及び（ＶＩ）で示されるものを挙げることができ、それらにおいて、ＴｇＤは標的指向化ドメイン、ＢＤは架橋ドメイン、ＴＡＤはＴリンパ球活性化ドメイン、及びＬＮＫはリンカーである：
ＴｇＤ−ＢＤ−ＴＡＤ式（Ｉ）
ＴＡＤ−ＢＤ−ＴｇＤ式（II）
ＴｇＤ−ＬＮＫ−ＢＤ−ＴＡＤ式（III）
ＴＡＤ−ＢＤ−ＬＮＫ−ＴｇＤ式（IV）
ＴｇＤ−ＬＮＫ−ＢＤ−ＬＮＫ−ＴＡＤ式（Ｖ）
ＴＡＤ−ＬＮＫ−ＢＤ−ＬＮＫ−ＴｇＤ式（VI）

いくつかの例は、標的指向化ドメイン及び架橋ドメインの間のリンカーを含んでいてもよい。いくつかの例は、Ｔリンパ球活性化ドメイン及び架橋ドメインの間のリンカーを含んでいてもよい。いくつかの例は、標的指向化ドメイン及び架橋ドメインの間のリンカー、及びＴリンパ球活性化ドメイン及び架橋ドメインの間の別のリンカーを含んでいてもよい。

本発明の実施態様に従えば、標的指向化ドメイン（ＴＤ）（たとえば、腫瘍標的指向化ドメイン、抗原標的指向化ドメイン、生体分子標的指向化ドメイン、など）は、抗体の可変領域に由来していてもよい。抗体由来の標的指向化ドメインは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方を含んでいてもよく、それは二つの立体配置（配向）で存在してもよい：（１）軽鎖可変領域はＮ末端に、かつ重鎖可変領域はＣ末端にある、又は（２）重鎖可変領域はＮ末端に、かつ軽鎖可変領域はＣ末端にある。

標的指向化ドメイン（たとえば腫瘍標的指向化ドメイン）においては、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、リンカーで連結されていてもよく、リンカーは短いペプチドフラグメントのような任意の好適なリンカーを含んでいてもよい。たとえば、本発明の実施態様に従ったリンカーは、短いペプチドを含んでいてもよく、それは典型的には小さいアミノ酸残基又は親水性アミノ酸残基（たとえば、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、など）を含む。このようなペプチドの一例は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）である。他の例としては、配列中でのこれらのアミノ酸の並べ替え、たとえばＧＧＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＧ、又はＳＧＧＧＧを挙げることができる。さらなる例としては、Ｇ又はＳ以外のアミノ酸残基を含むペプチド、たとえばＧＧＴＧＳ、ＧＴＳＰＧＧ、ＧＮＧＧＧＳ、などを挙げることができる。当業者は、多数の通常使用されるペプチドリンカーを本発明の実施態様において用いてもよいことを認めるであろう。

本発明のいくつかの実施態様に従えば、このような短いペプチドリンカーは、リンカー長を増大させるために反復単位を含んでいてもよい。たとえば、いくつかのリンカーは、二回反復Ｇ４Ｓリンカー、三回反復Ｇ４Ｓリンカー、又は四回反復Ｇ４Ｓリンカーを含んでいてもよい。さらに、いくつかの「反復様」リンカーは、異なるペプチド配列の混合、たとえばＧ４Ｓ−ＧＧＳＧＧ−Ｇ４Ｓ−ＳＧＧＧＧを含んでいてもよい。

本発明の実施態様に従えば、架橋ドメインは、ペプチドフラグメント、好ましくは抗体由来のフラグメントを含んでいてもよい。好ましい実施態様においては、架橋ドメインは、重鎖、軽鎖、特に重鎖又は軽鎖の定常部から由来していてもよい。たとえば、本発明の実施態様に従った架橋は、カッパ（κ）鎖、ラムダ−２（λ−２）鎖、又はラムダ−５（λ−５）鎖（もしくは代替軽鎖）のような、軽鎖から由来していてもよい。いくつかの実施態様においては、架橋は、カッパ（κ）鎖、ラムダ−２（λ−２）鎖、又はラムダ−５（λ−５）鎖の定常部のような、軽鎖に由来する領域又はドメインを含んでいてもよい。同様に、架橋ドメインは、重鎖又は重鎖の領域（たとえば定常部）から由来していてもよい。本明細書において使用する場合、「〜から由来する」という用語は、架橋ドメインが軽鎖又は重鎖のドメイン（たとえば定常部）の全長配列と、実質的な相同性（たとえば、(５０％、好ましくは(７０％、より好ましくは(８０％、最も好ましくは(９０％）を共有するという事実を指す。

さらに、本発明の実施態様に従えば、架橋ドメインは、軽鎖定常部を模倣したカッパ鎖、ラムダ鎖又はラムダ−５（もしくは代替軽鎖）の変異体、あるいはカッパ鎖、ラムダ鎖又はラムダ−５代替軽鎖の誘導体であってもよい。本明細書で使用される場合、「変異体」は、保存変異体又は非保存変異体を指す。本発明の実施態様に従った変異体は、本明細書において記載されているように、架橋ドメインとして役立つ機能を保持する。当業者は、保存変異体は類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含み、典型的には保存された生物学的活性又は構造を有するであろうことを認めるであろう。保存変異体は、１〜５０個のアミノ酸の置換、好ましくは１〜３０個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、そして最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸を含むことができる。非保存変異体は、１又はそれ以上のアミノ酸残基、たとえば、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜３０個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、そして最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含むことができる。

本発明のいくつかの実施態様に従えば、架橋（もしくは架橋ドメイン）は、標的指向化ドメイン及びＴリンパ球活性化ドメインに直接連結されていてもよい。本発明の他の実施態様に従えば、リンカーは、標的指向化ドメイン又はＴリンパ球活性化ドメインと架橋との間に提供されていてもよい。本発明のさらに別の実施態様に従えば、リンカーは、架橋及び標的指向化ドメインの間に提供されていてもよく、そして第二のリンカーは架橋及びＴリンパ球活性化ドメインの間に提供される。

架橋ドメインと標的指向化又はＴリンパ球活性化ドメインとの間のリンカーは、ドメイン内のリンカーについて上記したものと同様であってもよい。たとえば、架橋ドメインと標的指向化又はＴリンパ球活性化ドメインとの間のリンカーは、Ｇ４Ｓリンカー又はＧ４Ｓ反復リンカー（それは二回反復、三回反復、などであることができる）を含んでいてもよい。さらに、上記のとおり、リンカーは、他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。

本発明の実施態様に従えば、Ｔリンパ球活性化ドメインは、介在性リンカーのある又はない状態で、Ｔリンパ球活性化のために架橋ドメインの一端に連結されていてもよい。種々のＴリンパ球活性化分子が当該技術分野において知られており、それらには抗ＣＤ３抗体（モノクローナル又はポリクローナル）、又はそのような抗体のＣＤ３結合フラグメント又は４−１ＢＢ分子に対するリガンド又は抗体が含まれる。たとえば、本発明の実施態様に従えば、Ｔリンパ球活性化ドメインは、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体の可変領域を含んでいてもよい。このような実施態様においては、可変領域の重鎖及び軽鎖は、二つの配向で用いることができる：（１）軽鎖可変領域がＮ末端にあり、かつ重鎖可変領域がＣ末端にある、又は（２）重鎖可変領域がＮ末端にあり、かつ軽鎖可変領域がＣ末端にある。

標的指向化ドメインについて記載したのと同様に、リンカーは、Ｔリンパ球結合ドメインの軽鎖可変領域と重鎖可変領域を連結してもよい。たとえば、このようなリンカーは、任意の好適なアミノ酸配列、たとえばＧ４Ｓ、又は二回、三回、もしくは四回（quadruple）Ｇ４Ｓ反復リンカーを含んでいてもよい。さらに、リンカーは、他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。

本発明の二重特異性分子は、細胞又は分子を標的化するために、一方で同時にＴリンパ球応答を活性化するために、使用することができる。これらの分子のいくつかの生物学的利用性は、以下の実施例によって説明されるであろう。

免疫グロブリン軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の生成
第一のセットの例においては、抗ＣＤ２０、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、又は抗ＥｐＣＡＭＳｃＦｖ（可変領域の単鎖フラグメント）を、細胞標的指向化ドメイン（ＣｔＤ）として用い、抗ＣＤ３ＳｃＦｖをＴリンパ球活性化ドメイン（ＴＡＤ）として選択する。選択されたＣｔＤ及びＴＡＤは、架橋を介して連結されるが、この架橋は、たとえば、抗体軽鎖又は重鎖から由来する免疫グロブリンドメインを含んでいてもよい。このような架橋の例としては、ヒト免疫グロブリン定常部から選択されたものを挙げることができる。ヒト免疫グロブリン定常部から選択されるこのような免疫グロブリン鎖架橋の具体的な例としては、以下に示す配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４を挙げることができるが、これらに限らない：

本発明のいくつかの実施態様に従えば、ＣｔＤのＣ末端は、選択された架橋（たとえば、ヒト免疫グロブリン定常部に由来する架橋）のＮ末端に融合されてもよい。本発明の他の実施態様に従えば、ＣｔＤのＣ末端は、リンカー配列のＮ末端に融合されてもよく、このリンカーは、続いて、選択された架橋（たとえば、ヒト免疫グロブリン定常部に由来する架橋）のＮ末端に融合される。

軽鎖架橋のＣ末端で、リンカーは、場合によっては架橋のＣ末端と融合されていてもよい。本発明の実施態様に従えば、リンカーは、上記の任意の好適なペプチド配列を含んでいてもよい。たとえば、リンカーは、一つ又はそれ以上のＧＧＧＧＳ配列（Ｇ４Ｓ）を、他の配列（たとえば、ヒンジ配列、ＣＰＰＣＰ）と共に又は他の配列なしで、含んでいてもよい。この構築物は、その後ＴＡＤと連結されて図１に示す二重特異性分子を形成することができる。

上記のように、本発明のいくつかの実施態様は、架橋のＮ末端にＴＡＤを、介在性リンカーと共に又はリンカーなしで、有していてもよく、そして、架橋のＣ末端にＣｔＤを、介在性リンカーと共に又はリンカーなしで、有していてもよい。さらに、当業者は、ＣｔＤは他の標的分子に対する他の特異的結合ドメインで置き換えてもよいことを認めるであろう。

図１に示すＬＣＢＴＡは、二価（二重特異性）分子であり、細胞の標的に対して特異的な一価及びＴリンパ球上のＣＤ３分子に対して特異的なもう一価を有する。このＬＣＢＴＡは、哺乳類、真核細胞又は原核細胞において発現させることができ、たとえば、軽鎖特異的アフィニティカラムを介して、均一性になるまで精製することができる（図２）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（分子ふるいＨＰＬＣ）解析により、精製された二重特異性分子のほとんどの部分が単量体形態であることが示された（図３）。それにもかかわらず、ＳｃＦｖの配向、ドメイン間リンカーの長さ、架橋ドメインに対するＳｃＦｖドメインの適合性、及び／又は翻訳の効率は、二重特異性分子の翻訳及び翻訳後プロセッシングに影響を与えることができ、それは、上昇した多量体形成及び／又は変更された生物学的機能性をもたらし得る（Ｉ及びＪ、図３、表１）。

単量体及び多量体形成に対する、配向、ドメイン間リンカー、ドメイン間の適合性ならびに翻訳及び翻訳後修飾の効果に加えて、ドメイン内リンカーもまた、二重特異性分子の生物学的特性に影響し得る。図３Ｂに示すように、たとえば、ＫａＨｅｒ２／ｎｅｕ標的指向化ＬＣＢＴＡ−１はＧ４ＳＧ４ＳＧ４Ｓドメイン内リンカーを含み、これは、ドメイン内リンカーＧ４ＳＧ４Ｓ（ＫａＬＣＢＴＡ−１−Ａ）及びＧ４ＳＧ４ＳＧ４ＳＧ４Ｓ（ＫａＬＣＢＴＡ−１−Ｂ）を含むように設計された。三種のフォーマットについてのＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び標的結合解析は同様の結果を示したものの、最終的なタンパク質収量において有意な変動が見い出された。

標準試料二重特異性抗体の構築
ＩｇＧ−ＦＬ（免疫グロブリンＧ全長）二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を、標準試料として構築した（図１を参照されたい）。このＢｓＡｂは、Ｎ末端に細胞標的指向化ドメイン（ＣｔＤ）として全長抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を、及びＣ末端にＴリンパ球活性化ドメイン（ＴＡＤ）として二つの抗ＣＤ３ＳｃＦｖを含む。ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＰＣＰＧＧＧＧＳペプチドを含むリンカー／ヒンジドメイン（これは二つのリンカー（ＧＧＧＧＳ又はＧ４Ｓ）配列及びヒンジ（ＣＰＰＣＰ）配列を含む）は、この標準試料ＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂのＣｔＤ及びＴＡＤの間におそらく挿入されている（図１）。このＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂは、細胞の標的に対して特異的な二つの結合部位及びＣＤ３分子に対して特異的な他の二つを有する四価の分子である。

上記のＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂに加えて、二つのタンデム反復ＢｓＡｂもまた、標準試料として構築された。図１に示すように、タンデム反復−１は、Ｎ末端にＣｔＤとして抗ＣＤ２０ＳｃＦｖ、ＣｔＤのＣ末端にすぐに続いてＧＧＧＧＳリンカー、及びこのリンカーのＣ末端と融合されたＴＡＤとして抗ＣＤ３ＳｃＦｖを有する。タンデム反復−２は、タンデム反復−１の逆の順番で、すなわちリンカーのＮ末端にＴＡＤ及びリンカーのＣ末端にＣｔＤの順番で、ＣｔＤ及びＴＡＤを有する。

結合アッセイ
細胞の標的及びＴリンパ球に対する結合特異性は、二重特異性分子のための治療上の指標の重要な部分である。上記の二重特異性抗体についての結果は、ＣｔＤとして一価の抗ＣＤ２０、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、又は抗ＥｐＣＡＭＳｃＦｖを有するＬＣＢＴＡはそれぞれ実際にＲａｊｉ発現ＣＤ２０、ＢＴ４７４発現Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）、又はＨＴ２９発現ＥｐＣＡＭに結合できたことを示した。この結合は、モノクローナル抗ＣＤ２０抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体又は抗ＥｐＣＡＭ抗体と近い（図４Ａ）。ＬＣＢＴＡのＣ末端に対する一価のＴＡＤ（抗ＣＤ３ＳｃＦｖ）の融合は、二価モノクローナル抗ＣＤ３抗体と比較して、Ｊｕｒｋａｔ発現ＣＤ３分子に対する結合アフィニティを低減した（図４Ｂ）。このような低減は、二価標準試料フォーマット（ＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂ）に匹敵する（図４Ｂ）。標準試料ＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂは、抗ＣＤ３ＳｃＦｖが共有結合的に各重鎖のＣ末端に融合していることを除き、全長抗体に似ている二重特異性抗体である（図1）。

免疫グロブリン軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の発現
哺乳類細胞株における一過性遺伝子導入されたＬＣＢＴＡの発現は、図２、３、及び５において説明されている。標準試料フォーマット（ＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂ）は、１μg/mlを下回らない発現率を示したが、これは、ラムダ又はカッパ架橋ＬＣＢＴＡフォーマット及びそれらの誘導体と同様である。架橋ドメインの生理学的特性は、二重特異性Ｔ細胞活性化因子の発現及び安定性のために重要である。たとえば、ラムダ５は、代替軽鎖としても知られており、未成熟Ｂリンパ球によって発現される免疫グロブリン軽鎖様タンパク質である。哺乳類細胞によるラムダ５架橋ＬＣＢＴＡの一過性発現は、ラムダ又はカッパ架橋ＬＣＢＴＡと比較して低減される。さらに、ラムダ又はカッパ架橋の置換物としてのＩｇＧ１由来定常部重鎖ドメインのＣＨ１もまた、標準試料、すなわちラムダ又はカッパ架橋ＬＣＢＴＡと比較して劣った発現率をもたらした。

架橋ＬＣＢＴＡは、４つの主要なドメインを構成する；腫瘍標的指向化ドメイン、軽鎖架橋、リンカー、及びＴ細胞活性化ドメイン。これらのドメインの任意のものに対する変更は、ドメイン間干渉を誘導して全長分子と比較して低減した又は失われた機能をもたらし得る。表１に示すように、軽鎖−重鎖（ＫａＬＣＢＴＡ−１）から重鎖−軽鎖への腫瘍標的指向化ＳｃＦｖの配向／立体配置の変化は、Ｔ細胞活性化ドメインへの低減した結合、又はその逆をもたらし得る。このような配向の操作はまた、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析に基づく単量体生成の形成をも変更する（図３Ａ）。これらの例におけるリンカードメインは、反復性の４つのグリシン及び１つのセリンの短いストレッチを含む。それらの結果は、ドメイン間リンカーの長さ又はサイズは架橋ＬＣＢＴＡ分子の生物学的特徴に強烈な影響を与えることを示した（表２）。

発現された架橋ＬＣＢＴＡは、多量体のＬＣＢＴＡの混入を評価するためにＳＥＣ−ＨＰＬＣによっても試験された。望ましくない多量体の二重特異性分子の上昇した混入は、成分としてＳｃＦｖを用いる他のデベロッパー（developers）に問題を起こした。図３に示すように、標的指向化分子に関わらず、精製された架橋ＬＣＢＴＡのほとんどの部分が単量体形態である。さらに、架橋されたとおりのカッパ又はラムダは、ＬＣＢＴＡの単量体の均一性に影響しない。

ＳｃＦｖ抗体をＮ末端からＣ末端へ又はその逆へ反転させることはタンパク質発現率に劇的な変化をもたらし得るので、タンデム反復ＢｓＡｂの発現は、高度にＳｃＦｖ依存性である。結果として、ＬＣＢＴＡは、タンデム反復ＢｓＡｂフォーマットについての発現率よりも優れた発現率を呈し（たとえば、図５のレーン１及び２を参照されたい）、このような差異は、ＴＡＤが分子のＣ末端に置かれた場合にさらに増幅された。

ＳｃＦｖ又はフラグメント化Ｉｇ分子の短い血清安定性は、生物製剤の社会においては共通の知見である（Cancer Res August 8、2000 60; 433）。架橋として軽鎖を用いて、ＳｃＦｖを含有する二重特異性分子の安定性を図６に示す。これらの結果は、ＬＢＣＴＡの両方のフォーマットが、血清中で３７℃で一週間のインキュベーション後でさえも、５０％を超えるＳｃＦｖを安定化し得たことを示唆する。

ＫａＬＣＢＴＡ及びモノクローナル抗体処理ＰＢＭＣによる炎症性サイトカイン分泌プロフィール
抗ＣＤ３モノクローナル抗体処理は、Ｔリンパ球の活性化及び炎症性サイトカインの増強された分泌を誘導することが知られている（図７）。図７に示すように、ＩＬ−８を除き、架橋ＬＣＢＴＡは炎症性サイトカインの分泌を誘導しない。架橋ＬＣＢＴＡは、いかなる重鎖定常部配列も含まず、したがって、ＦｃＲ媒介性活性化は、ＩＬ８の上昇について責任がない。低い炎症性サイトカイン分泌プロフィールは、Ｔリンパ球依存性治療についての副作用の低減されたリスクを示唆する。

免疫グロブリン軽鎖架橋二重特異性Ｔリンパ球活性化因子の細胞傷害性
本発明の実施態様の生物学的機能性を明らかにするために、ＣＤ２０標的化カッパ架橋ＬＣＢＴＡ、抗ＣＤ２０ｍＡｂ及びＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂを、その抗腫瘍能について試験した（図１及び８）。図８に示すように、カッパ架橋ＬＣＢＴＡは、腫瘍根絶において大変有効であり、抗ＣＤ２０ｍＡｂについては２２pM、又はＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂについては一桁のpMであったのに対して、pM領域より低いＥＣ５０値を有していた。カッパ架橋ＬＣＢＴＡは、９０％に上る最大腫瘍根絶率を示したが、一方、抗ＣＤ２０ｍＡｂについてはわずか３５％及びＩｇＧ−ＦＬＢｓＡｂについては７５％であった。

本発明の実施態様の生物学的機能性を明らかにするために、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＥｐＣＡＭ標的化カッパ架橋ＬＣＢＴＡを、その腫瘍根絶能を評価するために、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ⁺及びＥｐＣＡＭ⁺ＨＴ２９大腸がん細胞上で試験した（図８Ｂ）。図８Ｂに示すように、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及びＥｐＣＡＭ標的指向化カッパ架橋ＬＣＢＴＡの両方が、腫瘍根絶において大変有効であり、最大細胞傷害性率は１００％に上ったが、それに対し、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＥｐＣＡＭｍＡｂｓについての腫瘍殺傷率はそれぞれ２８％から５１％であった。

本発明の実施態様の生物学的機能性を明らかにするために、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＥｐＣＡＭ標的化カッパ架橋ＬＣＢＴＡを、その腫瘍根絶能を評価するためにＨｅｒ２／ｎｅｕ⁺及びＥｐＣＡＭ⁺ Ｃａｐａｎ−１膵臓がん細胞上で試験した（図８Ｃ）。図８Ｃに示すように、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及びＥｐＣＡＭ標的指向化カッパ架橋ＬＣＢＴＡの両方が、腫瘍根絶において大変有効であり、最大細胞傷害性率はＨｅｒ２／ｎｅｕ及びＥｐＣＡＭ標的指向化カッパ架橋ＬＣＢＴＡについて、それぞれ、７５％超及び１００％であったが、それに対し、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＥｐＣＡＭｍＡｂについては、それぞれ３９％から３４％の腫瘍殺傷率であった。

腫瘍担持動物での異種移植片解析
本発明の実施態様の治療ポテンシャルを明らかにするために、ＣＤ２０標的化カッパ架橋ＬＣＢＴＡ及び抗ＣＤ２０ｍＡｂを、抗腫瘍能についてＣＤ２０⁺ヒトリンパ腫（Ｒａｊｉ細胞）を担持するＳＣＩＤマウス上で試験した（図１及び８）。治療の前に、ＳＣＩＤマウスにＲａｊｉ細胞及びＰＢＭＣを皮下接種した。図９Ａに示すように、治療剤としてＫａＬＣＢＴＡで処理された動物は、治療剤として抗ＣＤ２０ｍＡｂで処理された動物よりもはるかに小さい腫瘍を生じた。

本発明の実施態様の治療ポテンシャルを明らかにするために、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ標的化カッパ架橋ＬＣＢＴＡ及び抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕｍＡｂを、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ⁺ヒト大腸がん（ＨＴ２９細胞）を担持するＳＣＩＤマウス上で、抗腫瘍能について試験した（図１及び８）。治療の前に、ＳＣＩＤマウスに、予備活性化されたＰＢＭＣ又はナイーブのＰＢＭＣのいずれかと予め混合されたＨＴ２９細胞を皮下接種した。図９Ｂに示すように、治療剤としてＨｅｒ２／ｎｅｕ標的指向化ＫａＬＣＢＴＡで処理された動物は、治療剤として抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕｍＡｂで処理された動物よりも有意に小さい腫瘍を生じた。

本発明の実施態様の治療ポテンシャルを明らかにするために、ＥｐＣＡＭ標的化カッパ架橋ＬＣＢＴＡ及び抗ＥｐＣＡＭｍＡｂを、ＥｐＣＡＭ⁺ヒト大腸がん（ＨＴ２９細胞）を担持するＳＣＩＤマウス上で、抗腫瘍能について試験した（図１及び８）。治療の前に、ＳＣＩＤマウスに、予備活性化されたＰＢＭＣsと予め混合されたＨＴ２９細胞を皮下接種した。図９Ｂに示すように、ＥｐＣＡＭ標的指向化ＫａＬＣＢＴＡは、効果的に腫瘍の進行を阻害した。

二重特異性抗体の構築
制限酵素は種々の売主から購入した。ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼクレノウ（Klenow）酵素及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼは、インビトロジェン（Invitrogen（Grand Island、NY））から購入した。すべての酵素は、製造業者により推奨されているとおりに使用した。

ＰＣＲ増幅のためのすべてのプライマーは、売主から購入した。ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲ機において、９４℃で２分間の予備変性工程と、それに続いて３５サイクルの、それぞれ５０秒間の変性工程（９４℃）、アニーリング工程（５０℃）及び伸長工程（７２℃）を実施した。

すべての発現モジュールを、模式的に図１に表す。

抗ＣＤ２０、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＥｐＣＡＭ軽鎖及び切断型重鎖を、ベクターｐＧＥＭに、それぞれクローニングした。抗ＣＤ２０、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＥｐＣＡＭＶＨ及びＶＬの単鎖フラグメントは、ベクターＴＣＡＥ８にクローニングし、後続する抗腫瘍ＳｃＦｖのために使用した。

細胞株の調製
本発明において使用されるＲａｊｉ、ＢＴ４７４、Ｃａｐａｎ−１及びＨＴ２９細胞は、それぞれ、Ｂリンパ腫腫瘍細胞株、乳がん細胞株、膵臓細胞株、及び大腸がん細胞株であり、台湾中華民国（Ｒ.Ｏ.Ｃ.）のFood Industry Research and Development Institute（ＦＩＲＤＩ）の一部門であるBioresource Collection and Research Center（ＢＣＲＣ）から入手した。Ｊｕｒｋａｔ細胞はＡＴＣＣからのＴリンパ腫細胞株である。Ｒａｊｉ及びＪｕｒｋａｔ細胞の両方は、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、０．０３％Ｌ−グルタミン及び０．４mMピルビン酸ナトリウムを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（GibcoBRL Life Technologies、Paisly、UK）中で培養した。５％のＣＯ₂を含む加湿されたインキュベーター中で３７℃で培養した後、細胞は、継代培養されるか、又は滅菌された緩衝液で試験のために洗浄された。ＢＴ４７４、Ｃａｐａｎ−１及びＨＴ２９は、ＡＴＣＣのガイドラインに従って培養した。

末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の調製
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ficoll−Paque PLUSを用いて密度遠心によって正常な健常成人ドナーの全血から単離した。単離の後、ＰＢＭＣは、１０ng/mlの抗ＣＤ３ｍＡｂ、７５IU/mlのインターロイキン−２（ＩＬ−２）、及び１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で５〜１０日間培養し、予備活性化した。

細胞傷害性アッセイ（カルセインＡＭ細胞傷害性）
標的細胞（Ｒａｊｉ）は、５％ＦＢＳを添加したフェノールレッド無含有ＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃で３０分間、１０μMのカルセインで標識した。カルセインインキュベーションの最後に、５％ＦＢＳを含有するフェノールレッド無含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて細胞を２回洗浄し、５％ＦＢＳを含有するフェノールレッド無含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて細胞密度を３×１０⁵細胞/mlに調整した。反応混合物のために、３×１０⁴個の細胞を含む各培地の１００μlのアリコートを、９６ウェル培養プレートの各ウェルに入れた。エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）培養物の細胞密度を算出し、５％ＦＢＳを含有するフェノールレッド無含有ＲＰＭＩ１６４０によって３×１０⁶細胞/mlに調整した。細胞傷害性アッセイのために、異なる量の異なるＢｓＡｂ及び１００μl（３×１０⁵細胞）のエフェクター細胞を、予めＲａｊｉを入れた９６ウェル培養プレートに添加し、３７℃の５％ＣＯ₂濃縮インキュベーター中で４時間培養した。インキュベーションの最後に、培養プレートを７００ｇで５分間遠心分離した。次に、各反応ウェルからの１３０μlの上清を、個別に、新たなプレートに移し、放出された色素を、Fusion αマイクロプレートリーダーで定量した。細胞傷害性のパーセンテージを、以下の式に従って算出した：
[蛍光（サンプル）−蛍光（コントロール）]／[蛍光（総量−溶解）−蛍光（コントロール）]＊１００。

この総量−溶解は、０．９％のＴｒｉｔｏｎで１０分間処理された標的細胞として定義された。

フローサイトメトリーアッセイ
腫瘍標的（Ｂリンパ腫）に対する結合アフィニティ
Ｒａｊｉ、ＢＴ４７４及びＨＴ２９細胞（１×１０⁶細胞／反応）を含む標的細胞を、異なる濃度の異なるＢｓＡｂを用いて室温で３０分間処理した。インキュベーションの最後に、すべての反応を、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、細胞を、室温で３０分間、１μlのＦＩＴＣ複合化アフィニティ精製Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）２フラグメント特異的抗体と再インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を、２％ＦＢＳを添加した氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ装置でモニタリングした。

Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０⁶細胞／反応）を、異なる濃度の異なるＢｓＡｂを用いて室温で３０分間処理した。インキュベーションの最後に、すべての反応を、２％ＦＢＳを添加したＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、細胞を、室温で３０分間、１μlのＦＩＴＣ複合化アフィニティ精製Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）２フラグメント特異的抗体と再インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を、２％ＦＢＳを添加した氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ装置でモニタリングした。

免疫グロブリン軽鎖架橋二重特異性抗体の原核細胞へのクローニング及び発現
所望の腫瘍標的指向化軽鎖架橋二重特異性抗体に相当する合成遺伝子を、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を用いてｐＥＴ２０ｂベクターにクローニングした。約２０ngの各組換え構築物をＮｏｖａｇｅｎ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（EMD Millipore）に形質転換し、形質転換体を、アンピシリン（１００μg/ml）を添加したＬＢ寒天プレート上で選択した。

組換え構築物を含む単一コロニーのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、アンピシリンを添加した５mlのＬＢ中で、３７℃で一晩生育させた。培養物は、振とう条件下で、３７℃でインキュベートした。誘発剤（ＩＰＴＧ）は、その後集団がＯＤ₆₀₀値０．６〜０．７に達した時に添加した。アリコートは、０時間及び一晩の誘導の後、遠心分離（４０００×ｇ、１５分間）によって回収した。標的特異的軽鎖架橋二重特異性抗体の発現を確認するために、可溶性画分の総タンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％アクリルアミド）によって解析した。サンプルは、サンプル緩衝液を添加することによって調製し、５分間沸騰させた。分離の後、０．１％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いてゲルを染色した。ウェスタンブロットは、抗ＨｉｓｍＡｂを用いて解析した。

上記の例は、二重特異性又は多重特異性分子である本発明の実施態様の利用性を明らかにする。上記の例は、種々の標的指向化ドメインを、異なる分子又は細胞を標的化するために用いることができることをも説明する。したがって、当業者は、異なる標的に対する他の標的指向化ドメインを、本明細書において記載されている二重特異性分子と同じ枠組みにおいて使用することができることを認めるであろう。したがって、本発明の範囲は、実施例において示されている具体的な好ましい実施態様に限られない。

本発明は、限られた数の実施態様に関して記載されているが、当業者は、本開示の利益をもって、本明細書において開示された発明の範囲を逸脱しない他の実施態様を考案することができることを認めるであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。

Claims

目的の第一の標的に対する特異性を有する第一の標的指向化ドメイン；
免疫グロブリンの全長軽鎖定常部を含む架橋ドメイン；及び
目的の第二の標的に対する特異性を有する第二の標的指向化ドメイン
を含む単一のポリペプチドからなる、二重特異性融合タンパク質であって、前記第一の標的指向化ドメイン又は前記第二の標的指向化ドメインは、前記架橋ドメインに直接連結されている、二重特異性融合タンパク質。