KR20160145847A - 경쇄-가교된 이중특이성 항체 - Google Patents

경쇄-가교된 이중특이성 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 임상적 치료를 위한 면역 활성화 특성을 가지는 단량체 이중특이성 융합 단백질의 신규한 구성방식을 설명한다. 이중특이성 융합 단백질은 관심의 첫 번재 표적에 대한 특이성을 가지는 첫 번째 표적화 도메인; 사람 면역글로불린일 수 있는, 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 불변 영역으로부터 유도된 교량 도메인; 및 관심의 두 번째 표적에 대한 특이성을 가지는 두 번째 표적화 도메인을 포함한다. 이중특이성 융합 단백질은 추가로 교량 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 링커를 포함할 수 있다. 첫 번째 표적화 도메인은 교량 도메인에 융합되고 두 번째 표적화 도메인은 교량 도메인 또는 링커에 융합된다. 링커는 GGGGS 서열을 포함할 수 있다. 관심의 첫 번째 표적은 CD20, Her2/neu 또는 EpCAM이고, 두 번째 표적화 도메인은 T-림프구 활성화 도메인이다.

Description

경쇄-가교된 이중특이성 항체{LIGHT CHAIN-BRIDGED BISPECIFIC ANTIBODY}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2011년 12월 27일에 출원된 미국 임시 출원 일련번호 61/580,491호의 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 전체가 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 이중특이성 또는 다중-특이성 생물분자, 예컨대 이중특이성 항체의 제조 방법, 및 그것의 생성물에 관한 것이다.
상이한 기능을 나타내는 생물학적 분자들을 조합하는 것은 원하거나 개선된 특성을 가지는 새로운 분자를 유도할 수 있다. 예를 들어 다중특이성 항체, 이를테면 이중특이성 항체 및 이중특이성 종양 표적화 T-림프구 참여자(engagers)에서 이루어진 최근의 진전은, 면역학적 활성화 특성을 가지는 다중특이성 분자가, 단클론성 항종양 치료법과 비교하여 종양 치료법에서 자주 증대된 효능을 전달한다는 것을 증명하였다.
예를 들어, 이중특이성 항체(BsAb)는 상이한 항체로부터의 두 개의 상이한 결합 도메인(즉 가변 영역)의 단편으로 구성될 수 있다. 두 개의 상이한 결합 도메인은 두 개의 상이한 유형의 항원에 결합할 수 있다. 이들 분자는 임상 치료법, 예컨대 암 면역치료법에서 사용될 수 있다. 그런 용도에 대해 BsAb는 세포독성 세포(CD3(Kurby immunology. San Francisco: W. H. Freeman. ISBN 1-492-0211-4)와 같은 수용체를 사용함)와 암세포와 같은 표적(예컨대 암세포 상의 항원)에 동시에 결합하도록 디자인될 수 있다.
이중특이성 또는 다중특이성 단백질의 구성은 다수의 단백질 도메인의 융합을 포함한다. 그러나 그런 융합은 그것들의 상이한 생화학적 및/또는 생리적 특성으로 인해 융합 파트너들 사이에서 부적합성을 유발할 수 있다. 또한 신장 여과 또는 순환경로의 투과성을 포함하여 생리적인 한계는 또한 의학적으로 사용할 수 있는 다중특이성 종양 표적화 분자의 디자인에 도전이 될 수 있다.
본 발명의 구체예는 생체의학적 용도, 예를 들면 임상적 치료법에 대해 면역 활성화 특성을 가지는 이중특이성 또는 다중특이성 융합 단백질의 신규한 구성방식에 관한 것이다. 이들 단백질은 교량 도메인(bridging domain)에 의해 연결된 두 개의 특이한 결합 도메인(표적화 도메인)을 포함하며, 그것은 하나 또는 두 개의 임의의 링커를 포함할 수 있다. 교량 도메인은 항체의 면역글로불린 도메인으로부터 유도될 수 있어서 융합 단백질의 상이한 파트너들이 양립하고 원하는 생물학적 특성들을 보유할 수 있게 된다. 가교로서 유용할 수 있는 면역글로불린 도메인은 경쇄 불변 영역 또는 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 그런 융합 단백질은 경쇄-가교된 항체 또는 중쇄-가교된 항체로 언급될 수 있다.
예를 들어 본 발명의 구체예에 따르는 이중특이성 융합 단백질은 항-종양 생체지표, 예컨대 CD20(Hybridoma. 1983 2;17), Her2/neu(Am J Clin Pathol 2003 120 (suppl 1); S53) 또는 EpCAM(J. Immunol. 1992 148 (2); 590), 세포-표적화 또는 생체 분자-표적화 도메인으로서의 단일 사슬 연결된 Fv 단편(ScFv), 가교로서의 경쇄 불변 도메인, 선택적인 링커(이것은 생략될 수 있다), 및 T-림프구 활성화 도메인으로서의 항-CD3 ScFv를 포함할 수 있다. 그런 경쇄-가교된 이중특이성 면역 활성화제는 종양-발현된 세포 표적 및 T-림프구 둘 다에 대해 결합 특이성을 나타낸다. 두 가지 표적에 대한 결합은 종양 표적에 대한 T-림프구-중재된 세포독성을 특이하게 유도한다.
상기에서 설명된 항-종양 ScFv 보기들 외에, 다른 세포-표적화 도메인이 또한 사용될 수 있다. 그런 다른 분자들은 다른 세포 표적에 대해 특이한 결합 능력을 가질 수 있다. 다른 세포-표적화 도메인의 실례로는, T-림프구 활성화 도메인 외에 독소 폴리펩티드, 효소, 호르몬, 사이토킨, 신호화 분자 또는 원하는 특이성을 가진 ScFv를 들 수 있다. 더욱이 본 발명의 구체예에 따르는 융합 단백질은 원핵 또는 진핵 세포에서 발현될 수 있다. 또한, ScFv의 방향은 중쇄 가변 영역에 연결된 경쇄 가변 영역이거나, 그 역일 수 있다. 그런 이중특이성 분자의 적용은 약제학적 적용, 예컨대 특이한 생체표지-내포 세포 고갈 치료법, 예컨대 암 치료법을 포함한다. 또한 그런 분자는 진단 적용에도 사용될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 이중특이성 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 한 구체예에 따르는 이중특이성 융합 단백질은 관심의 첫 번째 표적에 대한 특이성을 가지고 있는 첫 번째 표적화 도메인; 사람 면역글로불린일 수 있는 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 불변 영역으로부터 유도된 교량 도메인; 및 관심의 두 번째 표적에 대한 특이성을 가지고 있는 두 번째 표적화 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 어떤 측면에 따르면, 이중특이성 융합 단백질은 교량 도메인의 N-말단 또는 C--말단에 융합된 링커를 추가로 포함할 수 있다. 첫 번째 표적화 도메인은 교량 도메인 또는 링커에 융합되고 두 번째 표적화 도메인은 교량 도메인 또는 링커에 융합된다. 링커는 GGGGS 서열을 포함할 수 있다. 관심의 첫 번째 표적은 CD20, Her2/neu, EpCAM 등일 수 있고, 두 번째 표적화 도메인은 T-림프구 활성화 도메인, 예컨대 항-CD3일 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에 따르면, 이중특이성 융합 단백질은 상기에서 설명된 링커 도메인을 생략할 수 있다. 즉 관심의 첫 번째 표적에 대한 특이성을 가지는 첫 번째 표적화 도메인과 관심의 두 번째 표적에 대한 특이성을 가지는 두 번째 표적화 도메인 두 가지는 모두 교량 도메인의 두 단부에 직접 융합된다.
본 발명의 어떤 구체예에 따르면, 이중특이성 융합 단백질은 첫 번째 표적화 도메인과 교량 도메인 사이뿐 아니라 교량 도메인과 두 번째 표적화 도메인 사이에 끼어 있는 상기에서 설명된 하나 또는 그 이상의 링커를 포함할 수 있다. 즉 첫 번째 표적화 도메인과 두 번째 표적화 도메인은 둘 다 별도로 링커와 융합되고, 그것은 교량 도메인의 두 단부와 융합된다.
상기 구체예 중 어느 것에서든지, 첫 번째 표적화 도메인은 관심의 첫 번째 표적에 대한 특이성을 가지는 첫 번째 ScFv를 포함할 수 있고, 두 번째 표적화 도메인은 관심의 두 번째 표적에 대한 특이성을 가지는 두 번째 ScFv를 포함할 수 있다.
상기 구체예 중 어느 것에서든지, 첫 번째 ScFv와 두 번째 ScFv는 각각 사람 면역글로불린 서열을 포함할 수 있다. 상기 구체예에서, 첫 번째 ScFv는 첫 번째 항원에 대한 결합 특이성을 가지는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함할 수 있고, 두 번째 ScFv는 두 번째 항원에 대한 결합 특이성을 가지는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함할 수 있다.
상기 구체예 중 어느 것에서든지, 링커는 하나 또는 그 이상의 GGGGS(G4S) 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 링커는 하나의 G4S 서열, 두 개의 G4S 서열(반복), 세 개의 G4S 서열 등을 포함할 수 있다. 또한 링커는 G4S 서열과 조합하여 다른 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그런 다른 아미노산은, 예를 들면 힌지 서열(예컨대 CPPCP)을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면 및 장점들은 다음의 설명 및 첨부되는 특허청구의 범위로부터 드러날 것이다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 구체예에 따르는 다양한 이중특이성 T-림프구 활성화제의 구성을 예시하는 개략도를 도시한다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 구체예에 따르는 원핵 및 진핵 발현 시스템으로부터의 경쇄 가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 발현 및 정제의 결과를 도시한다. 도 2b는 BL-21(DE3)pLysS에 의해 발현된 가용성 단백질 상에서의 His-태그된(tagged) LCBTA에 대한 쿠마찌 형광 블루 염색(패널 A) 및 웨스턴 블롯팅(패널 B)을 도시한다. 두 패널의 레인 1과 3은 IPTG 유도 전 추출물이다. 두 패널의 레인 2와 4는 IPTG로 유도된 추출물이다. 레인 1과 2는 EpCAM 표적화 Ka LCBTA-1을 나타낸다. 레인 3과 4는 Her2/neu 표적화 Ka LCBTA-1을 나타낸다.
도 3a는 선택된 종양 표적화 단클론성 항체 및 경쇄 가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 크기 축출-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 분석 결과를 도시한다. 도 3b는 경쇄 가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 균일성 및 그것들의 항원 결합 활성 및 수율 개선에 대한 SEC-HPLC 분석결과를 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 구체예에 따르는 CD20+ Raji 림프종 세포, Her2/neu+ BT474 유방암 세포, EpCAM+ HT29 결장암 세포(도 4a) 및 Jurkat 림프종 세포의 CD3(도 4b)에 대한 상이한 종양 표적화 경쇄 가교된 이중특이성 항체 결합의 실례를 도시한다.
도 5는 본 발명의 구체예에 따라 여러 가지 이중특이성 항체의 Ig 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 일시적인 발현을 비교한 것을 도시한다.
도 6은 La LCBTA 및 Ka LCBTA의 시험관 내 혈청 안정성 분석을 증명한다.
도 7은 본 발명의 구체예에 따르는 단클론성 항체 및 종양 표적화 이중특이성 항체(EpCAM 및 Her2 표적화 둘 다)의 자극 후 말초혈 단핵세포(PBMC)에 의한 사이토킨 분비 프로필의 실례를 도시한다.
도 8a는 본 발명의 구체예에 따르는 CD20+ B-림프종(Raji)에 대한 Ig 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 세포독성을 도시한다. 도 8b는 본 발명의 구체예에 따르는 Her2/neu +/EpCAM+ 결장암(HT29)에 대한 Ig 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 세포독성을 도시한다. 도 8c는 본 발명의 구체예에 따르는 Her2/neu +/EpCAM+에 대한 Ig 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 세포독성을 도시한다.
도 9a는 본 발명의 구체예에 따르는 CD20 표적화 Ig 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제에 의한 종양 퇴치의 이종이식 연구 결과를 도시한다. 도 9b는 본 발명의 구체예에 따르는 Her2/neu 표적화 Ig 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 이종이식 연구 결과를 도시한다. 도 9c는 본 발명의 구체예에 따르는 EpCAM 표적화 Ig 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제에 의한 종양 퇴치의 이종이식 연구 결과를 도시한다.
본 발명의 구체예는 생의학적 용도 예를 들면 임상 치료법을 위한 면역-활성화 특성을 가지는 이중특이성 또는 다중특이성 융합 단백질의 신규한 구성방식에 관한 것이다. 본 발명의 구체예에 따르는 단량체 이중특이성 또는 다중-특이성 면역-활성화 분자는 경쇄-가교된 이중특이성 면역 활성화제(LCBTA), 또는 보다 일반적으로는 면역글로불린-가교된 이중특이성 또는 다중 특이성 생체분자로서 언급될 수 있다. 본 발명에 따르는 생체분자는 이중특이성이거나 다중특이성일 수 있다. 그러나 명료화를 위해, 다음의 설명은 "이중특이성" 분자로서 이들 분자를 언급하게 될 것이다. "이중특이성"에 대한 그런 언급은 "이중특이성"과 "다중특이성"을 둘 다 포함하는 것으로 의도된다는 것이 인지되어야 한다.
본 발명의 구체예에 따르는 이중특이성 분자는 두 개의 표적화 도메인을 연결기키는 교량 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에 따르는 교량 도메인은 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있고, 두 개의 표적화 도메인은 각각 교량 도메인의 N-말단과 C-말단에 연결될 수 있다. 본 발명의 구체예에 따르는 두 개의 표적화 도메인은 항체의 특이한 결합 도메인(즉 가변 영역)으로부터 유도될 수 있다. 두 개의 표적화 도메인 중 하나는 T-림프구-활성화 도메인일 수 있는 반면, 다른 하나의 표적화 도메인은 표적 분자 또는 세포, 예컨대 종양 세포, 종양 항원, 바이러스, 박테리아 등에 대해 특이적일 수 있다.
본 발명의 이중특이성 분자의 실례로는 다음의 식 (I) 및 (VI)에 예시된 것들을 포함할 수 있고, 이때 TgD는 표적화 도메인, BD는 교량 도메인, TAD는 T-림프구 활성화 도메인, 그리고 LNK는 링커이다:
TgD - BO - TAD 식 (I)
TAD - BD - TgD 식 (II)
TgD - LNK - BD - TAD 식 (III)
TAD - BD - LNK - TgD 식 (IV)
TgD - LNK - BD - LNK - TAD 식 (V)
TAD - LNK - BD - LNK - TgD 식 (VI)
어떤 실례는 표적화 도메인과 교량 도메인 사이에 링커를 포함할 수 있다. 어떤 실례는 T-림프구-활성화 도메인과 교량 도메인 사이에 링커를 포함할 수 있다. 어떤 실례는 표적화 도메인과 교량 도메인 사이에 링커를, T-림프구-활성화 도메인과 교량 도메인 사이에 다른 링커를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적화 도메인(TD)(예컨대 종양-표적화 도메인, 항원-표적화 도메인, 생체분자-표적화 도메인 등)은 항체의 가변 영역으로부터 유도될 수 있다. 항체-유도된 표적화 도메인은 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 그것들은 두 개의 형태(방향)으로 존재할 수 있다: (1) 경쇄 가변 영역은 N-말단에 있고, 중쇄 가변 영역은 C-말단에 있거나, 또는 (2) 중쇄 가변 영역은 N-말단에 있고, 경쇄 가변 영역은 C-말단에 있다.
표적화 도메인(예컨대 종양-표적화 도메인)에서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 링커로 연결될 수 있고, 링커는 어떠한 적당한 링커, 예를 들면 짧은 펩티드 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 구체예에 따르는 링커는 짧은 펩티드를 포함할 수 있는데, 그것은 전형적으로 작은 아미노산 잔기 또는 친수성 아미노산 잔기(예컨대 글리신, 세린, 트레오닌, 프롤린, 아스파트산, 아스파라긴 등)를 포함할 수 있다. 그런 펩티드의 한 실례는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(4GS)이다. 다른 실례는 이들 아미노산의 서열의 순열을 포함할 수 있다 - 예컨대 GGGSG, GGSGG, GSGGG 또는 SGGGG. 추가의 실례는 G 또는 S 이외의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드, 예컨대 GGTGS, GTSPGG, GNGGGS 등을 포함할 수 있다. 당업계의 숙련자는 공통적으로 사용되는 많은 펩티드 링커가 본 발명의 구체예에 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 어떤 구체예에 따르면, 그런 짧은 펩티드 링커는 링커의 길이를 증가시키기 위하여 반복 유닛을 포함할 수 있다. 예를 들어 어떤 링커는 두 개의 G4S-반복 링커, 세 개의 G4S-반복 링커, 또는 네 개의 G4S-반복 링커를 포함할 수 있다. 나아가 어떤 "반복-유사" 링커는 상이한 펩티드 서열의 혼합물 - 예컨대 -G4S-GGSGG-G4S-SGGGG를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 교량 도메인은 펩티드 단편, 바람직하게는 항체로부터 유도된 단편을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 교량 도메인은 중쇄, 경쇄, 특히 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 구체예에 따르는 가교는 경쇄, 예컨대 카파(κ) 사슬, 람다-2(λ-2) 사슬, 또는 람다-5(λ-5) 사슬(또는 대용 경쇄)로부터 유도될 수 있다. 어떤 구체예에서, 가교는 경쇄, 예컨대 카파(κ) 사슬, 람다-2(λ-2) 사슬, 또는 람다-5(λ-5) 사슬의 불변 영역으로부터 유도된 영역 또는 도메인을 포함할 수 있다. 유사하게, 교량 도메인은 중쇄 또는 중쇄의 영역(예컨대 불변 영역)으로부터 유도될 수 있다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "로부터 유도된"은 교량 도메인이 경쇄 또는 중쇄의 도메인(예컨대 불변 영역)의 전길이 서열과 실질적인 동일성(예컨대 ≥50%, 바람직하게는 ≥70%, 보다 바람직하게는 ≥80%, 가장 바람직하게는 ≥90%)을 공유하는 사실을 말한다.
또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 교량 도메인은 경쇄 불변 영역을 모방하는 카파 사슬, 람다 사슬, 또는 람다-5(또는 대용 경쇄)의 돌연변이, 또는 카파 사슬, 람다 사슬, 또는 람다-5 대용 경쇄의 유도체일 수 있다. 본원에서 사용되는 것과 같은 "돌연변이"는 보존된 돌연변이 또는 비-보존 돌연변이를 말한다. 본 발명의 구체예에 따르는 돌연변이는 본원에 기술된 것과 같이, 교량 도메인으로서 작용하는 기능을 보유한다. 당업계의 숙련자는 보존된 돌연변이가 아미노산의 유사한 아미노산으로의 치환을 포함한다는 것과, 전형적으로 보존된 생물학적 활성 또는 구조는 가질 것이라는 것을 인지할 것이다. 보존된 돌연변이는 1 내지 50의 아미노산 치환, 바람직하게는 1 내지 30 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 20 아미노산, 가장 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비-보존 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기, 예를 들면 1 내지 50개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 30개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 20개의 아미노산, 가장 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입을 가질 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에 따르면, 가교(또는 교량 도메인)는 직접 표적화 도메인 및 T-림프구 활성화 도메인과 연결될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 링커는 가교와 표적화 도메인 또는 T-림프구 활성화 도메인 사이에 제공될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 링커는 가교와 표적화 도메인 사이에 제공될 수 있고, 두 번째 링커는 가교와 T-림프구 활성화 도메인 사이에 제공된다.
교량 도메인과 표적화 또는 T-림프구 활성화 도메인 사이의 링커는 도메인 내 링커에 대해 상기에서 설명된 것들과 유사할 수 있다. 예를 들어 교량 도메인과 표적화 또는 T-림프구 활성화 도메인 사이의 링커는 G4S 링커 또는 G4S-반복 링커(이중 반복, 삼중 반복 등일 수 있다)를 포함할 수 있다. 또한 상기에서 주지된 바와 같이, 링커는 다른 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, T-림프구 활성화 도메인은 개입된 링커가 있거나 또는 없이 T-림프구 활성화를 위해 교량 도메인의 한 단부에 연결될 수 있다. 다양한 T-림프구 활성화 분자가 해당 기술분야에 공지되어 있고, 이를테면 항-CD3 항체(단클론성 또는 다클론성), 또는 그러한 항체 또는 리간드의 CD3-결합 단편 또는 4-1BB 분자에 대한 항체를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 구체예에 따르면, T-림프구 활성화 도메인은 CD3에 대한 단클론성 항체의 가변 영역을 포함할 수 있다. 그런 구체예에서, 가변 영역의 중쇄 및 경쇄는 두 가지 방향으로 사용될 수 있다: (1) 경쇄 가변 영역은 N-말단에 있고 중쇄 가변 영역은 C-말단에 있거나, 또는 (2) 중쇄 가변 영역은 N-말단에 있고 경쇄 가변 영역은 C-말단에 있다.
표적화 도메인에 대해 설명된 것과 유사하게, 링커는 T-림프구 결합 도메인의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 연결시킬 수 있다. 예를 들어 그런 링커는 어떠한 적당한 아미노산 서열, 예컨대 G4S 또는 이중, 삼중 또는 사중 G4S-반복 링커를 포함할 수 있다. 또한 링커는 다른 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 이중특이성 분자는 세포 또는 분자를 표적화하기 위해 사용될 수 있는 한편, 동시에 T-림프구 반응을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 이들 분자들의 어떤 생물학적 활용성은 다음의 작업 실시예로 예시될 것이다.
면역글로불린 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 제조
첫 번째 세트의 실시예에서, 항-CD20, 항-Her2/neu 또는 항-EpCAM ScFv(가변 영역의 단일-사슬 단편)를 세포-표적화 도메인(CtD)으로서 사용하고, 항-CD3 ScFv를 T-림프구 활성화 도메인(TAD)으로서 선택한다. 선택한 CtD와 TAD를 가교를 통하여 연결하는데, 그것은 예를 들면 항체 경쇄 또는 중쇄로부터 유도된 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 그런 가교의 실례로는 사람 면역글로불린 불변 영역으로부터 선택된 것들을 포함한다. 사람 면역글로불린 불변 영역으로부터 선택된 그런 면역글로불린 사슬 가교의 구체적인 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 아래에 제시된 SEQ ID No. 1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3 및 SEQ ID No.4를 포함한다:
Figure pat00001
본 발명의 어떤 구체예에 따르면, CtD의 C-말단은 선택된 가교(예컨대 사람 면역글로불린 불변 영역으로부터 유도된 가교)의 N-말단에 융합될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, CtD의 C-말단은 링커 서열의 N-말단에 융합될 수 있고, 그 링커는 계속해서 선택된 가교(예컨대 사람 면역글로불린 불변 영역으로부터 유도된 가교)의 N-말단에 융합된다.
경쇄 가교의 C-말단에서, 링커는 임의로 가교의 C-말단과 융합될 수 있다. 본 발명의 구체예에 따르면, 링커는 상기에서 설명된 어떠한 적당한 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 링커는 다른 서열(예컨대 힌지 서열, CPPCP)이 있거나 없이 하나 또는 그 이상의 GGGGS 서열(4GS)을 포함할 수 있다. 이 구성물은 그런 다음 도 1에 도시된 이중특이성 분자를 형성하기 위하여 TAD에 연결될 수 있다.
상기에서 주지된 것과 같이, 본 발명의 어떤 구체예는 개입하는 링커가 있거나 없이 가교의 N-말단에서 TAD를 가질 수 있고, 개입하는 링커가 있거나 없이 가교의 C-말단에서 CtD를 가질 수 있다. 나아가 당업계의 숙련자는 CtD가 다른 표적 분자에 대한 다른 특이성 결합 도메인으로 대체될 수 있다는 것을 인지하게 될 것이다.
도 1에 도시된 LCBTA는 이가(이중특이성)의 분자로, 그 중 하나는 세포 표적에 특이적인 것이고, 다른 하나는 T-림프구 상의 CD3 분자에 대해 특이적이다. 이 LCBTA는 포유류, 진핵세포 또는 원핵세포에서 발현될 수 있고, 예를 들어 경쇄 특이적 친화성 칼럼을 통해 균일성으로 정제될 수 있다(도 2). SEC-HPLC(크기-축출 HPLC) 분석결과, 거의 대부분의 정제된 이중특이성 분자는 단량체 형태인 것으로 나타났다(도 3). 그럼에도 불구하고, ScFv의 방향, 도메인 내 링커의 길이, ScFv 도메인의 교량 도메인에 대한 적합성 및/또는 번역 효율은 이중특이성 분자의 번역 및 번역-후 프로세싱에 영향을 줄 수 있고, 그것은 다량체의 형성 증가 및/또는 변경된 생물학적 기능성을 초래할 수 있다(도 3, I 및 J, 표 1).
종양 표적
 가교
구성방식		 ScFv의
방향		 링커
구성방식		 FACS 분석 균일성
CD3 결합%(10㎍/ml)
CD20 카파 HL HL 3*G4S 91.98 단량체, 이량체
CD20 카파 HL LH 3*G4S 23.1 단량체
CD20 람다 2 HL HL 1×G4S 88.8 단량체, 이량체
CD20 람다 2 LH LH 1×G4S 12.2 단량체
CD20 카파 HL LH 3*G4S 68.7 단량체,
가벼운 이량체
EpCAM 카파 HL LH 3*G4S 5.73 단량체
Her2/neu 카파 LH HL 3*G4S 81.44 단량체, 이량체
Her2/neu 카파 HL LH 3*G4S 35.61 단량체, 이량체
EpCAM 람다 2 HL LH G4S 3.8 단량체, 이량체
EpCAM 람다 2 LH HL G4S 74.46 단량체, 이량체




EpCAM 결합%
10㎍/ml 1㎍/ml
EpCAM 카파 HL LH 3*G4S 96.58 58.1 단량체,
가벼운 이량체
EpCAM 람다 2 HL LH 3*G4S 86.7 7.37 단량체
단량체 및 다량체 형성에 미치는 방향, 도메인 내 링커, 도메인과 번역 및 번역 후 변형 사이의 적합성의 효과에 더불어, 도메인 내 링커는 또한 이중특이성 분자의 생물학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어 도 3b에 도시된 것과 같이, G4SG4SG4S 도메인 내 링커를 포함하는 Ka Her2/neu 표적화 LCBTA-1은 도메인 내 링커 G4SG4S(Ka LCBTA-1-A) 및 G4SG4SG4SG4S(Ka LCBTA-1-B)를 포함하도록 공학처리되었다. 비록 세 가지 구성방식에 대한 SEC-HPLC와 표적 결합 분석이 유사한 결과를 보여주긴 했지만, 최종 단백질 수율에서 상당한 변화가 발견되었다.
참조 이중특이성 항체의 제조
IgG-FL(면역글로불린 G 전 길이) 이중특이성 항체(BsAb)를 참조로서 제조하였다(도 1 참조). 이 BsAb는 N-말단에 세포-표적화 도메인(CtD)으로서 전길이의 항-CD20 단클론성 항체 및 C-말단에 T-림프구-활성화 도메인(TAD)으로서 두 개의 항-CD3 ScFv를 포함한다. 두 개의 링커(GGGGS 또는 G4S) 서열 및 힌지(CPPCP) 서열을 포함하는, GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS 펩티드를 포함하는 링커/힌지 도메인을, 이 참조 IgG-FL BsAb의 CtD와 TAD 사이에 삽입할 수 있었다(도 1). 이 IgG-FL BsAb는 세포 표적에 특이한 두 개의 결합 부위와 CD3 분자에 대해 특이한 다른 두 개의 결합 부위를 가지는 4가의 분자이다.
상기에서 설명된 IgG-FL BsAb 외에, 두 개의 탠덤-반복 BsAb를 또한 참조로서 제조하였다. 도 1에서 알 수 있는 것과 같이, 탠덤-반복-1은 N-말단에 CtD로서 항-CD20 ScFv, CtD의 C-말단 바로 뒤에 GGGGS의 링커 및 링커의 C-말단과 융합된 TAD로서 항-CD3 ScFv를 가진다. 탠덤-반복-2는 탠덤-반복-1의 반대 순서로 CtD와 TAD를 가진다. 즉 링커의 N-말단에 TAD가 있고, 링커의 C-말단에 CtD를 가진다.
결합 분석
세포 표적 및 T-림프구에 대한 결합 특이성은 이중특이성 분자에 대한 치료적 지표의 중요한 부분이다. 상기 이중특이성 항체에 대한 결과는 CtD로서 일가의 항-CD20, 항-Her2/neu 또는 항-EpCAM ScFv를 가지는 LCBTA가 실제로 Raji 발현된 CD20, BT474 발현된 Her2/neu(ErbB2) 또는 HT29 발현된 EpCAM에 각각 결합할 수 있었음을 나타냈다. 결합은 단클론성 항-CD20, 항-Her2/neu 또는 항-EpCAM 항체에 대해 중요하다(도 4a). LCBTA의 C-말단에 대한 일가 TAD(항-CD3 ScFv)의 융합은 이가의 단클론성 항체 항-CD3 항체에 비교하여 Jurkat 발현된 CD3 분자에 대한 결합 친화성을 감소시켰다(도 4b). 그러한 감소는 이가의 참조 구성방식(IgG-FL BsAb)에 비교할만한다(도 4b). 참조 IgG-FL BsAb는 전체 항체를 닮은 이중특이성 항체이되, 단 항-CD3 ScFv는 각각의 중쇄의 C-말단에 공유적으로 융합된다(도 1).
면역글로불린 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 발현
포유류 셀라인에서 일시적으로 형질전환된 LCBTA의 발현을 도 2, 도 3 및 도 5에 예시한다. 참조 구성방식(IgG-FL BsAb)은 1㎍/ml보다 적지 않은 발현 비율을 나타냈는데, 그것은 람다 또는 카파 가교된 LCBTA 구성방식 및 그것의 유도체와 유사하다. 가교된 도메인의 생리적 특성은 이중특이성 T-세포 활성화제의 발현 및 안정성에 중요하다. 예를 들어 또한 대용 경쇄로서 알려져 있는 람다 5는 미성숙한 B-림프구에 의해 발현된 면역글로불린 경쇄-유사 단백질이다. 포유류 세포에 의한 람다 5-가교된 LCBTA의 일시적인 발현은 람다 또는 카파 가교된 LCBTA와 비교하여 감소된다. 또한 람다 또는 카파 가교에 대한 대체물로서 IgG1으로부터의 불변 중쇄 도메인의 CH1은 또한 참조, 즉 람다 또는 카파 가교된 LCBTA와 비교하여, 빈약한 발현 비율을 나타냈다.
가교된-LCBTA는 4개의 주요 도메인; 종양 표적화 도메인, 경쇄 가교, 링커 및 T-세포 활성화 도메인을 포함한다. 이들 도메인 중 어느 것이든지에 대한 변경은 도메인 내 간섭을 유도할 수 있고, 그 결과 전체 분자와 비교하여 기능의 감소 또는 손실을 유발할 수 있다. 표 1에서 알 수 있는 것과 같이, 종양 표적화 ScFv의 경쇄-중쇄(Ka LCBTA-1)로부터 중쇄-경쇄로의 방향/형태의 변화는 T-세포 활성화 도메인에 대한 결합 감소를 초래할 수 있고, 그 역도 마찬가지이다. 그런 방향 조작은 또한 SEC-HPLC 분석을 토대로 한 단량체 생성의 형성을 바꾼다(도 3a). 이들 실시예 중의 링커 도메인은 반복적인 4개의 글리신과 하나의 세린의 짧은 스트레치를 포함한다. 그 결과는 도메인 내 링커의 길이 또는 크기는 가교된-LCBTA 분자의 생물학적 특징에 극적으로 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다(표 2).
종양 표적 가교
구성방식		 ScFv의
방향		 링커
구성방식		 세포독성
EC50 pM		 수율(일시적인 mg/L) 균일성
CD20 카파 LH HL 3*G4S 0.1 0.9 단량체
CD20 카파 LH HL 1*G4S 10 0.4 단량체,이량체
발현된 가교된-LCBTA를 또한 SEC-HPLC에 의해 조사하여 다량체 LCBTA의 오염을 평가하였다. 원하지 않는 다량체 이중특이성 분자의 증가된 오염은 성분으로서 ScFv를 사용하는 다른 개발자들에게 문제점을 유발하였다. 도 3에서 알 수 있는 것과 같이, 표적화 분자에도 불구하고, 거의 대부분의 정제된 가교된-LCBTA가 단량체 형태이다. 또한 가교된 대로의 카파 또는 람다는 어느 것이든지 LCBTA의 단량체의 균일성에 영향을 미치지 않는다.
탠덤 반복 BsAb의 발현은 ScFv에 매우 의존적인데, 왜냐하면 N으로부터 C 말단으로 ScFv 항체를 반전시키는 것, 또는 그 역은 단백질 발현 비율의 극적인 변화를 유발할 수 있었다. 그 결과로서, LCBTA는 탠덤 반복 BsAb 구성방식에 대한 발현 비율보다 월등한 발현 비율을 나타내고(예컨대 도 5의 레인 1 및 레인 2 참조), 그러한 차이는 TAD가 분자의 C-말단에 위치할 때 추가로 증폭되었다.
ScFv 또는 단편화된 Ig 분자의 짧은 혈청 안정성은 생물약제학 협회에는 흔히 알려져 있던 것이다(Cancer Res August 8, 2000 60;433). 가교로서 경쇄를 사용할 때 ScFv-함유 이중특이성 분자의 안정성은 도 6에 제시된다. 그 결과는 LCBTA의 두 가지 구성방식이 모두 혈청 중에서 37℃ 인큐베이션되면서 일주일이 지난 후에도 ScFv의 50% 이상이 안정될 수 있었음을 시사한다.
Ka LCBTA에 의한 염증성 사이토킨 분비 프로필 및 단클론성 항체 치료된 PBMC
항-CD3 단클론성 항체 치료는 T-림프구의 활성화 및 염증성 사이토킨의 증가된 분비를 유도하는 것으로 알려져 있다(도 7). 도 7에서 알 수 있는 것과 같이, IL-8 외에, 가교된 LCBTA는 염증성 사이토킨의 분비를 유도하지 않는다. 가교된 LCBTA는 어떠한 중쇄 불변 서열을 포함하지 않고, 따라서 FcR 중재된 활성화는 IL8의 증가에 대해서는 설명할 수 없다. 낮은 염증성 사이토킨 분비 프로필은 T-림프구 의존성 치료법에 대한 부작용의 감소된 위험을 시사한다.
면역글로불린 경쇄-가교된 이중특이성 T-림프구 활성화제의 세포독성
본 발명의 구체예의 생물학적 기능성을 증명하기 위하여, CD20 표적화된 카파-가교된 LCBTA, 항-CD20 mAb 및 IgG-FL BsAb를 그것들의 항-종양 능력에 대해 시험하였다(도 1 및 도 8). 도 8에 도시된 것과 같이, 카파-가교된 LCBTA는 항-CD20 mAb에 대한 22pM 또는 IgG-FL BsAb에 대한 한 자리 숫자의 pM에 비교하여 종양 퇴치에서 매우 효과적이었고, 그것의 EC50 값은 서브(sub) pM 범위였다. 카파-가교된 LCBTA는 또한 90%까지의 최대 종양 퇴치율을 나타낸 반면, 항-CD20 mAb에 대해서는 단지 35%, 그리고 IgG-FL BsAb에 대해서는 75%를 나타냈다.
본 발명의 구체예의 생물학적 기능성을 증명하기 위하여, Her2/neu 또는 EpCAM 표적화된 카파-가교된 LCBTA를 Her2/neu + 및 EpCAM+ HT29 결장암종 세포 상에서 시험하여 그것들의 종양 퇴치 능력을 평가하였다(도 8b). 도 8b에서 알 수 있는 것과 같이, Her2/neu와 EpCAM 표적화 카파-가교된 LCBTA는 둘 다 종양 퇴치에 있어서, 항-Her2/neu 및 항-EpCAM mAb에 대한 각각 28% 내지 51% 종양 사멸률과 비교하여 매우 효과적이었는데, 최대 100%까지의 세포독성율을 나타냈다.
본 발명의 구체예의 생물학적 기능성을 증명하기 위하여, Her2/neu 또는 EpCAM 표적화된 카파-가교된 LCBTA를 Her2/neu + 및 EpCAM+ Capan-1 췌장암 세포 상에서 시험하여 그것들의 종양 퇴치 능력을 평가하였다(도 8c). 도 8c에서 알 수 있는 것과 같이, Her2/neu와 EpCAM 표적화 카파-가교된 LCBTA는 둘 다 종양 퇴치에 있어서, 항-Her2/neu 및 항-EpCAM mAb에 대한 각각 39% 내지 34% 종양 사멸률과 비교하여 매우 효과적이었는데, Her2/neu와 EpCAM 표적화 카파-가교된 LCBTA에 대해 각각 최대 75% 이상 및 100%의 세포독성율을 나타냈다.
종양 내포 동물에 대한 이종이식 분석
본 발명의 구체예의 치료적 잠재력을 증명하기 위하여, CD20 표적화된 카파-가교된 LCBTA와 항-CD20 mAb를 CD20+ 사람 림프종(Raji 세포)-내포 SCID 마우스 상에서 항-종양 능력에 대해 시험하였다(도 1 및 도 8). 치료 전에 SCID 마우스를 Raji 세포와 PBMC로 피하 접종하였다. 도 9a에 도시된 것과 같이, 치료제로서 Ka LCBTA로 치료된 동물들이, 치료제로서 항-CD20 mAb로 치료된 동물들보다 훨씬 더 작은 종양을 전개했다.
본 발명의 구체예의 치료적 잠재력을 증명하기 위하여, Her2/neu 표적화된 카파-가교된 LCBTA 및 항-Her2/neu mAb를 Her2/neu + 사람 결장암종(HT29 세포)-내포 SCID 마우스 상에서 항-종양 능력에 대해 시험하였다(도 1 및 도 8). 치료 전에 SCID 마우스를 사전활성화된 또는 원래의 PBMC 중 하나와 사전 혼합된 HT29 세포로 피하 접종하였다. 도 9b에서 알 수 있는 것과 같이, 치료제로서 Her2/neu 표적화 Ka LCBTA로 치료된 동물들이, 치료제로서 항-Her2/neu mAb로 치료된 동물들보다 상당히 더 작은 종양을 전개했다.
본 발명의 구체예의 치료적 잠재력을 증명하기 위하여, EpCAM 표적화된 카파-가교된 LCBTA 및 항-EpCAM mAb를 EpCAM+ 사람 결장암종(HT29 세포)-내포 SCID 마우스 상에서 항-종양 능력에 대해 시험하였다(도 1 및 도 8). 치료 전에 SCID 마우스를 사전활성화된 PBMC와 사전 혼합된 HT29 세포로 피하 접종하였다. 도 9b에서 알 수 있는 것과 같이, EpCAM 표적화 Ka LCBTA는 효과적으로 종양 진전을 억제하였다.
이중특이성 항체의 구성
제한 효소를 다양한 판매자들로부터 구매하였다. DNA 중합효소, T4 DNA 리가제 클레노우 효소 및 T4 DNA 중합효소는 Invitrogen(Grand Island, NY)으로부터 구하였다. 모든 효소를 제조업체에 의해 권고받은 대로 사용하였다.
PCR 증폭을 위한 모든 프라이머를 판매자들로부터 구매하였다. DNA 증폭을 94℃에서 2분의 사전-변성 단계, 그런 다음 변성 단계(94℃), 아닐링 단계(50℃) 및 연장 단계(72℃)를 각각 50초씩 35주기를 포함하는 단계를 사용하여 PCR기에서 수행하였다.
모든 발현 분자를 도 1에 개략적으로 도시한다.
항-CD20, 항-Her2/neu 및 항-EpCAM 경쇄 및 절단된 중쇄를 벡터 pGEM에 별도로 클론하였다. 항-CD20, 항-Her2/neu 및 항-EpCAM VH 및 VL의 단일 사슬 단편을 벡터 TCAE8에 클론하여 계속해서 항-종양 ScFv에 대해 사용하였다.
셀라인 제조
본 발명에서 사용한 Raji, BT474, Capan-1 및 HT29 세포는 각각 B-림프종 종양 셀라인, 유방암 셀라인, 췌장 셀라인 및 결장암 셀라인이고, 대만 식품 산업 연구 및 개발 연구소(FIRDI)의 한 부서인 Bioresource Collection and Research Center(BCRC)로부터 얻었다. Jurkat 세포는 ATCC로부터의 T-림프종 셀라인이다. Raji 및 Jurkat 세포 두 가지를 모두 10%의 우태아 혈청(Hyclone), 0.03%의 L-글루타민 및 0.4mM의 피루브산 나트륨이 첨가된 RPMI 1640 배지(GibcoBRL Life Technologies, Paisly, UK)에서 배양한다. 세포를 5%의 CO2를 함유하고 있는 37℃의 가습 인큐베이터에서 인큐베이션한 후에, 하위배양하거나 시험을 위해 멸균된 완충액으로 세척한다. BT474, Capan-1 및 HT29를 ATCC로부터의 지침에 따라 배양하였다.
말초혈 단핵세포(PBMC)의 제조
말초혈 단핵세포(PBMC)를 건강한 성인 공여자의 전혈로부터, 피콜-파크 PLUS를 사용하여 밀도 구배에 의해 분리하였다. 분리한 후, PBMC를 10ng/ml의 항-CD3 mAb, 75 IU/ml의 인터류킨-2(IL-2) 및 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 5 내지 10일 동안 배양하여 사전-활성화시켰다.
세포독성 분석(칼세인 AM 세포독성)
표적 세포(Raji)를 10μM의 칼세인으로 30분 동안 37℃에서 5% FBS가 첨가된 페놀 레드-유리 RPMI 1640 배지 중에서 표지하였다. 칼세인 인큐베이션이 끝났을 때, 세포를 5% FBS를 함유하는 페놀 레드-유리 RPMI 1640 배지로 2회 세척하고, 세포 밀도를 5% FBS를 함유하는 페놀 레드-유리 RPMI 1640을 3×105 세포/ml로 조정하였다. 반응 혼합물에 대해, 각각 3×104 세포를 함유하고 있는 100㎕의 배지 분취액을 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 넣었다. 이펙터 세포(PBMC) 배양물의 세포 밀도를 계산하고, 5% FBS를 함유하는 페놀 레드-유리 RPMI 1640 배지에 의해 3×106 세포/ml로 조정하였다. 세포독성 분석을 위해, 상이한 양의 상이한 BsAb 및 100㎕(3×105 세포)의 이펙터 세포를 Raji 세포가 사전에 부하되어 있는 96 웰 배양 플레이트에 첨가하고, 37℃에서, 5% CO2가 풍부한 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 인큐베이션이 끝날 때, 배양 플레이트를 700g에서 5분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 각 반응 웰로부터 130㎕의 상층액을 개별적으로 새로운 플레이트에 옮기고, 방출된 염료를 융합 알파 마이크로-플레이트 판독기로 정량하였다. 세포독성의 %는 다음 식을 따라 계산하였다:
[형광(샘플) - 형광(대조표준)]/[형광(총-용해) - 형광(대조표준)]*100
총-용해는 0.9% 트리톤으로 10분 동안 처리된 표적 세포로서 정의하였다.
유동 세포 분석
종양 표적(B-림프종)에 대한 결합 친화성
Raji, BT474 및 HT29 세포(1×106 세포/반응)를 포함하여 표적 세포를 상이한 농도의 상이한 BsAb로 실온에서 30분 동안 처리하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 모든 반응물을 2%의 FBS가 첨가된 PBS로 2회 세척하였다. 세척한 후에 세포를 1㎕의 FITC 포합된, 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소 항-사람 IgG (Fab')2 단편-특이적 항체와 함께 30분 동안 실온에서 재-인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 2%의 FBS가 첨가된 빙냉 PBS로 2회 세척하고 FACS 장치에 의해 모니터하였다.
Jurkat 세포(1×106 세포/반응)를 상이한 농도의 상이한 BsAb로 실온에서 30분 동안 처리하였다. 인큐베인션이 끝났을 때, 모든 반응물을 2%의 FBS가 첨가된 PBS로 2회 세척하였다. 세척한 후에 세포를 1㎕의 FITC 포합된, 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소 항-사람 IgG (Fab')2 단편-특이적 항체와 함께 30분 동안 실온에서 재-인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 2%의 FBS가 첨가된 빙냉 PBS로 2회 세척하고 FACS 장치에 의해 모니터하였다.
면역글로불린 경쇄 가교된 이중특이성 항체의 원핵 클로닝 및 발현
원하는 종양 표적화 경쇄 가교된 이중특이성 항체에 해당하는 합성 유전자를 NcoI과 XhoI 제한 부위를 사용하여 pET20b 벡터에 클론하였다. 약 20ng의 각각의 재조합 구성물을 Novagen® BL21(DE3)pLysS(EMD Millipore)안에 형질전환하고, 형질전환체를 암피실린(100㎍/ml)이 첨가된 LB 아가 플레이트 상에서 선택하였다.
재조합 구성물을 함유하고 있는 BL21(DE3)pLysS의 단일 콜로니를 암피실린이 첨가된 5ml의 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 진동 조건 하에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 집단의 OD600이 0.6 내지 0.7에 도달했을 때 인듀서(IPTG)를 첨가하였다. 0시간 동안 및 밤새 인큐베이션한 후에 원심분리에 의해(4000×g, 15분 동안) 분취액을 수득하였다. 표적-특이적 경쇄 가교된 이중특이성 항체의 발현을 증명하기 위하여, 가용성 분획의 총 단백질 추출물을 SDS-PAFE(4 내지 12% 아크릴아마이드)에 의해 분석하였다. 샘플을 완충액에 첨가하고 5분 동안 끓임으로써 샘플을 준비하였다. 분리 후에 겔을 0.1%의 쿠마찌 형광 블루 R-250으로 염색하였다. 웨스턴 블롯은 항-His mAb를 사용하여 분석하였다.
상기 실시예들은 이중특이성 또는 다중 특이성 분자인 본 발명의 구체예의 유용성을 입증한다. 상기 실시예들은 또한 다양한 표적화 도메인이 상이한 분자 또는 세포를 표적화하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 그러므로 당업계의 숙련자는 상이한 표적에 대한 다른 표적화 도메인이 본원에서 설명된 이중특이성 분자의 동일한 프레임워크에서 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는 실시예에서 제시한 구체적이고 바람직한 구체예들에 제한되지 않는다.
본 발명이 본 개시 내용의 유익함을 나타내는 제한된 수의 구체예와 관련하여 기술되었지만, 당업계의 숙련자들은 본원에 개시된 것과 같은 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않는 다른 구체예들이 고안될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Development Center for Biotechnology DCB-USA LLC <120> Light Chain Bridged Bispecific Antibody <130> 17787/005WO1 <150> US 61/580,491 <151> 2011-12-27 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 20 25 30 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 65 70 75 80 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Thr His Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gln 1 5 10 15 Pro Lys Ala Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 20 25 30 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Met Asn Asp Phe Tyr 35 40 45 Pro Gly Ile Leu Thr Val Thr Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro Ile Thr 50 55 60 Gln Gly Val Glu Met Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Arg Ser Arg 85 90 95 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Met His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 100 105 110 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 115 120 <210> 4 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 1 5 10 15 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 20 25 30 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 35 40 45 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 50 55 60 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 65 70 75 80 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala 85 90 95 Glu Pro Lys Ser Cys 100

Claims (12)

  1. 단일 폴리펩티드로 이루어진 이중특이성 융합 단백질로서, 상기 이중특이성 융합 단백질은
    관심의 첫 번째 표적에 대해 특이성을 가지고 있는 첫 번째 표적화 도메인;
    면역글로불린의 전길이(full-length) 경쇄 불변 영역으로 이루어진 교량 도메인 또는 이의 동족체(homolog), 여기서 상기 동족체는 상기 전길이 경쇄 불변 영역과 80% 이상의 서열 동일성을 가진다; 및
    관심의 두 번째 표적에 대해 특이성을 가지는 두 번째 표적화 도메인
    을 포함하고,
    상기 첫 번째 표적화 도메인 또는 상기 두 번째 표적화 도메인은 상기 교량 도메인과 직접적으로 연결되어 있는, 이중특이성 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 교량 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 링커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 첫 번째 표적화 도메인은 상기 교량 도메인 또는 링커에 융합되고, 상기 두 번째 표적화 도메인은 상기 교량 도메인 또는 링커에 융합되는 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린은 사람 면역글로불린인 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 교량 도메인은 카파 사슬, 람다 사슬, 람다-5 대용 경쇄, 또는 상기 경쇄 불변 영역을 모방하는 상기 카파 사슬, 상기 람다 사슬, 또는 상기 람다-5 대용 경쇄의 돌연변이, 또는 상기 카파 사슬, 상기 람다 사슬, 또는 상기 람다-5 대용 경쇄의 유도체인 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  6. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 링커는 GGGGS 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 두 번째 표적화 도메인은 T-림프구 활성화 도메인인 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심의 첫 번째 표적은 CD20, Her2/neu, 또는 EpCAM인 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 표적화 도메인은 상기 관심의 첫 번째 표적에 대한 특이성을 가지고 있는 첫 번째 ScFv를 포함하고, 상기 두 번째 표적화 도메인은 상기 관심의 두 번째 표적에 대한 특이성을 가지고 있는 두 번째 ScFv를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 첫 번째 ScFv와 상기 두 번째 ScFv는 각각 사람 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 첫 번째 ScFv는 첫 번째 항원에 대한 결합 특이성을 가지는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함하고, 상기 두 번째 ScFv는 두 번째 항원에 대한 결합 특이성을 가지는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 링커는 GGGGS 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 융합 단백질.
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