TWI510249B - 涉及突變之ｋｒａｓ或ｂｒａｆ基因之癌症的治療 - Google Patents

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Description

涉及突變之KRAS或BRAF基因之癌症的治療
申請資料
本申請案與2009年11月5日申請之美國專利申請案第61/258518號及2010年9月13日申請之澳大利亞專利申請案第2010904107號有關且主張該等專利申請案之優先權，該等申請案各自的全部內容以引用的方式併入本文中。
本發明係關於治療個體之癌症的方法，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因。方法涉及投予至個體抗體或其抗原結合片段。本發明亦關於癌症治療方法，其涉及測定患者之KRAS或BRAF狀態。
碳水化合物結構可能為腫瘤特異性或腫瘤相關性抗原且因此成為許多產生抗體之免疫策略的焦點。然而，由於抗碳水化合物特異性抗體可能缺乏特異性、親和力或僅為IgM類型，故產生該等抗體為一項具有挑戰性之任務(Christensen等人,2009)。此外，產生具有殺滅癌細胞能力之人類化抗碳水化合物抗體為一項具有挑戰性之任務，所反映出之事實在於關於該等抗體之報道極少。抗糖脂抗體中僅有一個實例已被成功人類化；該抗體識別神經節苷脂GM2且可於試管內及活體內殺滅人類腫瘤細胞(美國專利6,423,511及6,872,392)。儘管未經人類化，但碳水化合物結合抗體中有兩個其他實例已經工程改造而用於人類投予。第一，抗碳水化合物抗體RAV-12為嵌合小鼠-人類IgG1 ，其顯示試管內及活體內對抗人類結腸癌細胞之功效(Loo等人,2007)。第二，抗碳水化合物抗體HMMC-1已顯示試管內對抗人類卵巢癌之功效。HMMC-I為由轉染色體KM小鼠產生之全人抗體(Nozawa等人,2004)。
國際專利申請案第WO 2005/108430號揭示抗癌小鼠單株抗體，其被命名為SC104。該抗體之CDR序列陳列於表1中。此申請案之揭示內容係以引用的方式併入本文中。SC104所結合之抗原的確切性質尚不明確，但WO2005/108430表明該抗原為唾液酸四糖基碳水化合物(sialyltetraosyl carbohydrate)。其亦揭示SC104能夠直接誘發細胞死亡，而無需免疫效應細胞。如同在申請中之國際專利申請案第WO 2010/105290號中所述，已開發出SC104之許多人類化形式。此申請案之揭示內容亦以引用的方式併入本文中。
人類癌症之治療性治療具有挑戰性且可在一些情況下藉由使分子生物標記物與治療結果相關聯來增強。舉例而言，基因KRAS(或稱為ki-ras或k-ras)或BRAF之突變使腫瘤細胞中之蛋白質的信號傳導特性有改變。已知該等生物標記物之突變與使用靶向表皮生長因子受體之治療抗體(例如西妥昔單抗(cetuximab)或帕尼單抗(panitumumab))之癌症治療的失敗結果有關(Amado,Wolf等人,2008；Karapetis,Khambata-Ford等人,2008；Di Nicolantonio,Martini等人,2008；Loupakis,Ruzzo等人,2009；Lievre,Bachet等人,2006)。KRAS突變由於在35%-45%之結腸直腸癌患者中出現而具有特別的醫學重要性；BRAF突變在小於15%之結腸直腸癌患者中出現(Siena,Sartore-Bianchi等人,2009)。此外，KRAS突變見於70%-95%之胰臟癌組織中(Saif等人,2007)。
在第一態樣中，本發明提供治療個體之癌症的方法，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因，方法包含投予至個體有效量之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205。
在第二態樣中，本發明提供治療個體之癌症的方法，該方法包含檢驗癌症中突變之KRAS或BRAF基因的存在且向所患之癌症包含突變之KRAS或BRAF基因的個體投予有效量之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205。
在第三態樣中，本發明提供可與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205之抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製備用以治療個體之癌症的醫藥品，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因。
在第四態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其在個體癌症治療中與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因。
本發明係關於治療癌症之方法，其中該癌症包含KRAS或BRAF基因之突變。該方法涉及使用可與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205之抗體或其抗原結合片段。在各個具體實例中，本發明涉及在癌症治療中使用SC104、SC104嵌合體、人類化SC104、去免疫化之SC104或其抗原結合片段，其中該癌症包含KRAS或BRAF基因之突變。該抗體較佳不為SC104。
在第一態樣中，本發明提供治療個體之癌症的方法，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因，方法包含投予至個體有效量之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205。
在第二態樣中，本發明提供治療個體之癌症的方法，該方法包含檢驗癌症中突變之KRAS或BRAF基因的存在且向所患之癌症包含突變之KRAS或BRAF基因的個體投予有效量之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205。
在第三態樣中，本發明提供可與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205之抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製備用以治療個體之癌症的醫藥品，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因。
在第四態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其在個體癌症治療中與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因。
如本文所用之「競爭」意指抗體或其抗原結合片段在以與SC104相同之濃度使用時使SC104與人類結腸癌細胞系Colo205之結合減少至少10%。SC104與Colo205之結合程度可在熟習此項技術者已知之基於流動式細胞測量術之結合檢定中評估。在該種檢定中，在各種競爭抗體稀釋液存在下量測經螢光染料標記之SC104抗體與Colo205之結合信號。SC104之螢光染料標記可藉由直接結合或藉由間接偵測方法來實現，諸如偵測SC104而非競爭抗體之SC104生物素/抗生蛋白鏈菌素-螢光染料或螢光染料結合之二次抗體。
應瞭解，癌症之KRAS及/或BRAF狀態較佳在治療前測定。測定細胞是否包含突變之KRAS或BRAF基因之方法在此項技術中為熟知的。該等方法包括(Lievre,Bachet等人,2006)及(Seth,Crook等人,2009)中所述之方法。
在本發明之各種形式中，抗體為小鼠SC104(可變區列於SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:1中)或SC104嵌合體。應瞭解，嵌合體為鼠類恆定區已置換為人類或靈長類恆定區之抗體。該種嵌合體之實例展示於SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2中。如上所述，抗體較佳不為SC104，以免在人類體內產生人類抗小鼠抗體(HAMA)反應。
在本發明之其他形式中，抗體為去免疫化型SC104或其抗原結合片段。抗體之去免疫化為此項技術中已被完全瞭解之一種方法。舉例而言，藉由去免疫化降低諸如鼠類抗體之抗體的免疫原性已描述於WO 00/34317、WO 98/52976、WO 02/079415、WO 02/012899及WO 02/069232中(其揭示內容係以交叉引用之方式併入本文中)。去免疫化一般需要在潛在T細胞抗原決定基內進行胺基酸取代。以此方式，使特定序列將在胞內蛋白質加工後產生T細胞抗原決定基之可能性減小。此外，WO 92/10755描述一種工程改造蛋白質上之抗原決定子的方法。特定言之，對蛋白質進行抗原決定基定位且經由遺傳工程改造改變其胺基酸序列。
在其他具體實例中，抗體為人類化型式之SC104。人類化一般需要用相應人類序列取代非人類抗體序列，諸如CDR移植之情況。該方法之實例描述於WO 91/09968及美國專利第6,407,213號中。如上所述，已開發出許多可與SC104競爭以結合於人類結腸癌細胞系Colo205的人類化型式之SC104。該等人類化抗體描述於同在申請中之國際專利申請案第WO 2010/105290號中。
就此而言，在本發明之一個具體實例中，抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群之至少一個序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91及SEQ ID NO:94。
在另一個較佳具體實例中，抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群之輕鏈及重鏈組合：SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:38。
應瞭解，本發明中所述之序列可使用此項技術中熟知之方法來修飾，以便藉由例如親和力成熟來增加結合，或藉由移除預測之MHC II類結合基元來降低免疫原性。已經開發及本文所述之序列的治療效用可藉由調節其功能特徵來進一步增強，其功能特徵諸如有抗體依賴性細胞介導型細胞毒性(ADCC)、補體依賴型細胞毒性(CDC)、血清半衰期、生物分佈及與Fc受體之結合、或任何該等功能特徵之組合。該調節可藉由蛋白質工程改造、糖基化工程改造或化學方法來實現。視所需治療應用而定，增大或減小任何該等活性可為有利的。
如Shinkawa T.等人,2003(J Biol Chem 278: 3466-73)中所述，糖基化工程改造之一個實例使用Potelligent方法。人類化抗體變異體之可變輕鏈及重鏈區經表現為標準恆定區主鏈上之IgG1。恆定重鏈序列為GenBank寄存編號P01857.1且恆定輕鏈序列為NCBI寄存編號P01834。
許多抗體親和力成熟方法在此項技術中為已知的。該等方法中有許多係基於藉由突變誘發接著選擇及/或篩檢出改良之親和力來產生變異蛋白質組或文庫的一般策略。突變誘發常常在DNA層面上，例如藉由易錯PCR(Thie,Voedisch等人,2009)、藉由基因改組(Kolkman及Stemmer 2001)、藉由使用突變化學劑或輻射、藉由使用『突變體』品系利用易錯複製機制(Greener 1996)或藉由利用天然親和力成熟機制之體細胞超突變法(Peled,Kuang等人,2008)來進行。突變誘發亦可在RNA層面上，例如藉由使用Qβ複製酶(Kopsidas,Roberts等人,2006)來進行。允許篩檢出經改良之變異蛋白質的基於文庫之方法可基於各種顯示技術，諸如噬菌體、酵母、核糖體、細菌或哺乳動物細胞，且在此項技術中為熟知的(Benhar 2007)。親和力成熟可藉由較多定向性/預測性方法，例如藉由由3D蛋白質模型化結果所引導之定點突變誘發或基因合成來實現(參見例如Queen,Schneider等人,1989或美國專利6,180,370或美國專利5,225,539)。
增加ADCC之方法已由以下文獻所述：Ferrara,Brunker等人,2006；Li,Sethuraman等人,2006；Stavenhagen,Gorlatov等人,2007；Shields,Namenuk等人,2001；Shinkawa,Nakamura等人,2003及WO 2008/006554。
增加CDC之方法已由以下文獻所述：Idusogie,Wong等人,2001；Dall'Acqua,Cook等人,2006；Michaelsen,Aase等人,1990；Brekke,Bremnes等人,1993；Tan,Shopes等人,1990；及Norderhaug,Brekke等人,1991。
描述增加ADCC及CDC之方法的參考文獻包括Natsume,In等人,2008。該等參考文獻各自的揭示內容係以交叉引用的方式包括於本文中。
調節抗體血清半衰期及生物分佈之許多方法係基於改進抗體與新生兒Fc受體(FcRn)(即在保護IgG免於分解代謝方面具有關鍵作用之受體)之間的相互作用及維持高血清抗體濃度。Dall’Acqua等人描述：IgG1之Fc區中之取代增加對FcRn之結合親和力，從而增加血清半衰期(Dall'Acqua,Woods等人,2002)，且進一步證明M252Y/S254T/T256E之三元取代增強生體可用性及調節ADCC活性(Dall'Acqua,Kiener等人,2006)。亦參見美國專利第6,277,375號、第6,821,505號及第7,083,784號。Hinton等人已描述位置250及428處之恆定域胺基酸取代增加活體內半衰期(Hinton,Johlfs等人,2004)。(Hinton,Xiong等人,2006)。亦參見美國專利第7,217,797號。Petkova等人已描述位置307、380及434處之恆定域胺基酸取代增加活體內半衰期(Petkova,Akilesh等人,2006)。亦參見Shields等人,2001及WO 2000/42072。可調節與Fc受體之結合及由該等受體所介導之後續功能(包括FcRn結合及血清半衰期)之恆定域胺基酸取代的其他實例描述於美國專利申請案第20090142340號、第20090068175號及第20090092599號中。
已知連接於抗體分子之聚糖影響抗體與Fc受體及聚糖受體之相互作用且從而影響抗體活性，包括血清半衰期(Kaneko,Nimmerjahn等人,2006；Jones,Papac等人,2007；及Kanda,Yamada等人,2007)。因此，可調節所需抗體活性之某些糖型可賦予治療性益處。產生經工程改造之糖型的方法在此項技術中為已知的且包括(但不限於)美國專利第6,602,684號、第7,326,681號、第7,388,081號及WO 2008/006554中所述之方法。
如例如由Fishburn 2008所綜述，藉由添加聚乙二醇(PEG)來延長半衰期已被廣泛用於延長蛋白質之血清半衰期。
應認識到，有可能在本發明之序列內進行保守胺基酸取代。「保守取代」意謂胺基酸具有類似特性。如本說明書中所用，以下各組胺基酸將視為保守取代：
H、R及K；
D、E、N及Q；
V、I及L；
C及M；
S、T、P、A及G；以及
F、Y及W。
貫穿本說明書，用詞「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化形式應理解為意指包括所陳述之要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群，但不排除任何其他要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群。
本說明書中提及之所有公開案係以引用的方式併入本文中。對已包括於本說明書中之文件、舉措、物質、裝置、製品或其類似者的任何討論僅用於提供本發明之背景的目的。其不應被理解為承認任何或所有此等內容構成先前技術基礎之一部分或為本發明相關領域內之一般常識，因為其已在本申請案之申請專利範圍各項之優先日期之前存在於澳大利亞或其他地方。
為了可更好地理解本發明之性質，現將參考以下實施例來描述其較佳形式。
實施例1
免疫組織化學方案
使用免疫組織化學篩檢含有一系列來自不同供體之腫瘤類型之樣品的多腫瘤人類組織微陣列與經生物素標記之人類化SC104抗體變異體的結合。經生物素標記之人類IgG1 同型用於陰性對照染色。藉由目視檢查以四階標度基於陽性細胞之染色強度及百分比對抗體免疫反應性評分。
人類化SC104抗體變異體結合於各種人類癌症類型
分析不同人類患者之許多不同癌症類型與人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)之結合。人類化SC104抗體而非人類同型對照物結合於人類結腸癌組織，此證明所用結合條件之特異性(資料未展示)。表2概括在多達75%之結腸癌中發現陽性膜染色。令人驚奇的是，在多達95%之胰臟癌中發現高頻率陽性染色，而在其他實體腫瘤中程度則較低。相比之下，對胃腸基質腫瘤未觀察到染色。該等結果表明人類化SC104抗體適用於結腸直腸、胰臟、卵巢及肺臟惡性病之適應症的腫瘤診斷。另外，吾人可設想人類化SC104抗體適用於治療性治療人類之結腸直腸癌、胰臟癌、卵巢癌及肺癌。可在小鼠腫瘤異種移植模型中評估該活體內抗腫瘤功效。
另一組織微陣列由已在裸鼠中作為異種移植物繼代之原發性人類結腸腫瘤及胃腫瘤構建。使用抗體預複合方法及HRP顯示(visualisation)篩檢腫瘤樣品與人類化SC104抗體之結合。使人類化SC104抗體與抗人類Fab-FITC預複合，用過量人類IgG阻斷，且隨後將該複合物用作一級抗體試劑，其於組織微陣列上加以培育。在陰性對照染色中，用人類IgG1同型對照物交換人類化SC104抗體。藉由目視檢查以四階標度對抗體免疫反應性評分：0=無染色，1=很少的染色點，2=成團塊狀的陽性染色，3=>50%陽性染色，4=飽和染色。染色資料以三個區域之平均值表示且展示於圖1中。
KRAS基因狀態分析
分析已作為小鼠異種移植物繼代之原發性人類腫瘤之基因體DNA中的KRAS基因之外顯子1及外顯子2。核苷酸定序分析顯示外顯子是否編碼KRAS蛋白質之正常或活化突變。大部分突變之KRAS樣品為異型接合。
使用免疫組織化學分析得知，人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)結合於具有突變及正常KRAS基因狀態之人類胃腸癌組織(圖1)。
經人類化及Potelligent-經工程改造之SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:94)亦藉由組織化學顯示結合具有突變或野生型KRAS基因之人類結腸癌細胞(圖2)。
實施例2
基於流動式細胞測量術之結合檢定
在冰上，於黑暗中，將活腫瘤細胞及對照細胞(2×105 個，藉由錐蟲藍排除法(trypan blue exclusion)測定)以一式三份與於100 μL緩衝液(PBS加上1% FCS)中各種濃度之小鼠SC104、嵌合SC104或人類化變異體、及人類IgG1 同型(Sigma-Aldrich)一起於96 V孔板(Eppendorf)中培育20分鐘。用緩衝液洗滌細胞兩次，隨後分別在含有山羊抗人類IgG(Fc特異性，Sigma-Aldrich，與FITC結合)或山羊抗小鼠IgG(Fc特異性，Sigma-Aldrich，與FITC結合)之100 μL緩衝液中培育20分鐘，以偵測嵌合抗體或小鼠抗體。在洗滌後，使細胞再懸浮於緩衝液中且藉由流動式細胞測量術在Cell Lab QuantaTM SC MPL(Beckman Coulter)上使用電子容量(EV)、側向散射及FL-1門控來分析抗體結合；在獲取資料期間，藉由下置冷卻填料(Eppendorf)來冷卻96孔板中之細胞。結果以平均螢光強度(MFI)表示；藉由GraphPad Prism軟體使用非線性回歸分析計算曲線斜率值。
抗體依賴性細胞介導型細胞毒性(ADCC)檢定
根據製造商方案(Axis-Shield PoC AS)使用LymphoprepTM 自正常人類供體(由澳大利亞紅十字會血液服務機構(Australian Red Cross Blood Services)提供)之白血球層製劑純化出效應(周邊血液單核)細胞。在37℃及10% CO2 下，將活效應細胞(5×106 個/ml)於RPMI 1640(Gibco)加上10% FCS中培育隔夜。在PBS中隨後在培養基(RPMI 1640 w/o酚紅,Gibco,加上0.5% FCS)中洗滌腫瘤標靶細胞及效應細胞，使其再懸浮於培養基中且以一式三份與各種濃度之抗體(嵌合SC104、人類化SC104或人類IgG1 同型，Sigma-Aldrich,# I5154)一起於96孔U孔板(Corning)中在由以下最終濃度組成之200 μL檢定液中培育：標靶細胞，1×105 個細胞/毫升；效應細胞，2.5×106 個細胞/毫升；抗體範圍為10至0.001 μg/mL。在對照組中，在不存在(最小標靶)或存在(最大標靶)1% Triton-X(Sigma-Aldrich)的情況下僅培育標靶細胞，且在不存在抗體的情況下培育標靶細胞及效應細胞(背景)。以160×g離心孔板2分鐘且在37℃之濕潤CO2 氛圍中培育4小時。使用乳酸去氫酶釋放檢定量測細胞死亡。簡言之，以250×g離心孔板5分鐘且使用細胞毒性偵測套組(Roche)根據製造商指南檢定100 μL細胞上清液之乳酸去氫酶釋放情況。為使污染細胞殘留減至最少，經96孔0.2微米AcroPrepTM 板(Pall)過濾上清液。藉由在492 nm下讀取吸光度來定量LDH釋放且使用下式計算細胞毒性百分比：100×[樣品-平均(背景)]/平均(最大標靶-最小標靶)；藉由GraphPad Prism軟體使用非線性回歸分析計算EC50 值。
補體依賴型細胞毒性(CDC)檢定
將活腫瘤標靶細胞以一式三份於96孔扁平孔板(Corning)中與人類補體血清(Sigma-Aldrich#S1764)及各種濃度之抗體(嵌合SC104、人類化SC104或人類IgG1 同型，Sigma-Aldrich,#I5154)一起，在培養基(RPMI 1640 w/o酚紅,Gibco,加上0.5% FCS)中，在由以下最終濃度組成之150 μL檢定液中培育：標靶細胞，13.3×104 個細胞/毫升；補體，15%；抗體範圍為10至0.01 μg/mL。在對照組中，在不存在(標靶背景)或存在(標靶&補體背景)補體的情況下僅培育標靶細胞，且僅於培養基中培育補體(補體背景)。以160×g離心孔板2分鐘且在37℃之濕潤CO2 氛圍中培育2-3小時。使用CellTiter 96套組(Promega)根據製造商指南(包括額外3-4小時之培育期)量測細胞死亡。藉由在492 nm下讀取吸光度來定量死亡標靶細胞且使用下式計算細胞毒性百分比：100×[樣品-平均(標靶&補體背景)]/[平均(補體背景)-平均(標靶&補體背景)]；藉由GraphPad Prism軟體使用非線性回歸分析計算EC50 值。
新穎人類化SC104抗體變異體具有明類的針對人類結腸腫瘤細胞之細胞毒性
在抗體依賴性細胞介導型細胞毒性及補體依賴型細胞毒性檢定中檢驗人類化SC104變異體針對結腸腫瘤細胞之細胞毒性。使用正常人類供體之周邊血液單核細胞得知，人類化SC104抗體變異體及嵌合SC104抗體具有明顯的針對C170腫瘤細胞之抗體依賴性細胞介導型細胞毒性，但人類同型對照物沒有(圖3)。使用來自其他人類供體之周邊血液單核細胞獲得類似結果(資料未展示)。圖4顯示使用人類補體得知，同組之人類化SC104抗體變異體及嵌合SC104抗體具有明顯的針對Colo205腫瘤細胞之補體依賴型細胞毒性，但人類同型對照物沒有。人類化SC104抗體變異體之結合及殺滅活性概括於表3中。
實施例3
基於流動式細胞測量術之直接殺滅檢定
在室溫下，於黑暗中，將活腫瘤細胞(2×105 個，藉由錐蟲藍排除法判斷)以一式三份與於80 μL緩衝液(PBS加上1% FCS)中各種濃度之小鼠SC104、嵌合SC104或人類化變異體、及人類IgG1 同型(Sigma-Aldrich)一起於96 V孔板(Eppendorf)中培育2.5至3小時。向各孔添加0.15 g於20 μL緩衝液中之7AAD(BDBiosciences)，再培育細胞20分鐘，隨後藉由流動式細胞測量術在Cell Lab QuantaTM SC MPL(Beckman Coulter)上使用電子容量(EV)、側向散射及FL-3門控來檢定細胞存活力；在獲取資料期間，藉由下置冷卻填料(Eppendorf)來冷卻96孔板中之細胞。結果以7AAD+細胞之百分比表示；藉由GraphPad Prism軟體使用非線性回歸分析計算曲線斜率值。
針對人類胰腺細胞系之結合及殺滅活性
如流動式細胞測量術檢定中所量測，人類化及Potelligent-經工程改造之SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:94)結合於且直接殺滅具有或不具有KRAS突變之人類胰腺腫瘤細胞系。
實施例4
用於檢定之人類結腸癌細胞系
DLD-1(ATCC寄存編號CCL-221；KRAS突變體；BRAF野生型)、Colo201(ATCC寄存編號CCL-224；KRAS野生型；BRAF突變體)、Colo205(ATCC寄存編號CCL-222；KRAS野生型；BRAF突變體)、WiDr(ATCC寄存編號CCL-218；KRAS野生型；BRAF突變體)、及HT-29(ATCC寄存編號HTB-38；KRAS野生型；BRAF突變體)。已知該等細胞系在其KRAS或BRAF基因中攜帶突變((Seth,Crook等人,2009)；(Davies,Logie等人,2007))。
人類化SC104抗體針對在KRAS或BRAF基因中攜帶突變之人類結腸腫瘤細胞具有明顯的殺滅活性
使用正常人類供體之周邊血液單核細胞得知，人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)針對一組攜帶KRAS或BRAF突變之人類結腸癌細胞系具有明顯的抗體依賴性細胞介導型細胞毒性，但人類同型對照物沒有。圖5展示已知除野生型BRAF基因以外攜帶突變之KRAS基因之細胞系DLD-1的殺滅情況。圖6展示已知除野生型KRAS基因以外攜帶突變之BRAF基因之細胞系Colo201、Colo205、WiDr及HT-29的殺滅情況。使用該等細胞系及來源於其他人類供體之周邊血液單核細胞獲得類似結果。如實施例2中所述量測ADCC功能。
實施例5
SC104抗體之效應功能增強
可藉由增加抗體依賴性細胞介導型細胞毒性或補體依賴型細胞毒性或藉由組合抗體依賴性細胞介導型細胞毒性及補體依賴型細胞毒性來增強抗體之效應功能。
ADCC增強
對抗體Fc區使用標準修飾來工程改造SC104抗體變異體及嵌合SC104，以增強抗體依賴性細胞介導型細胞毒性(ADCC)活性。標準方法包括例如抗體Fc區之蛋白質工程改造或糖基化工程改造。
作為糖基化工程改造之一個實例，根據Zhou等人(Zhou,Shankara等人,2008)將產生人類化SC104抗體變異體或嵌合SC104抗體之CHO細胞與幾夫辛(0.25 μg/ml)一起培育8至10天。隨後純化抗體，且如實施例2中所述量測ADCC功能。
作為蛋白質工程改造之一個實例，如Lazar等人,2006(Lazar,Dang等人,2006)所述產生恆定重鏈序列中之突變。特定言之，將S122D、S181A、I215E突變引入Fc序列SEQ ID NO:52中而形成SEQ ID NOL53。在CHO細胞中表現且藉由蛋白質A層析純化後，在ADCC檢定中檢驗具有增強型Fc區SEQ ID NO:53之許多人類化抗體以及嵌合抗體。如實施例2中所述量測ADCC功能。
如Shinkawa T.等人,2003(J Biol Chem 278: 3466-73)中所述，糖基化工程改造之另一實例使用Potelligent方法。人類化抗體變異體之可變輕鏈及重鏈區經表現為標準恆定區主鏈上之IgG1。恆定重鏈序列為GenBank P01857.1且恆定輕鏈序列為NCBI寄存編號P01834。如實例2中所述量測ADCC功能。
效應增強型SC104人類化抗體變異體及嵌合SC104抗體具有增加之抗體依賴性細胞介導型細胞毒性
在一系列實驗中，蛋白質工程改造或糖基化工程改造被應用於增加嵌合SC104抗體及SC104人類化抗體變異體之抗體依賴性細胞介導型細胞毒性。與未修飾之抗體相比，經Fc工程改造(SEQ ID NO:53)或經幾夫辛處理之SC104人類化抗體變異體及嵌合SC104抗體顯示出針對Colo205腫瘤細胞之抗體依賴性細胞介導型細胞毒性增加。圖7顯示經幾夫辛處理之人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)明顯增加對人類結腸癌細胞WiDr(ATCC寄存編號CCL-218)之殺滅的實施例。
實施例6
小鼠異種移植腫瘤模型
對雌性BALB/c裸鼠皮下接種2×106 個人類結腸癌HT-29細胞(ATCC寄存編號HTB-38)。在與腫瘤細胞接種相同之日(第0日)，基於體重將小鼠隨機分為兩個處理組(每組n=10)。用媒劑對照物(PBS,10 ml/kg)或人類化SC104抗體(10 mg/kg)經腹膜內處理各組。每週兩次投予媒劑對照物及人類化SC104抗體，持續四週。使用下式每週三次計算腫瘤體積：體積(mm3 )=長度×直徑2 ×π/6。
在研究期間，一些小鼠由於體重過度減輕而必須被淘汰，從而使得媒劑對照物處理組(n=6)及抗體處理組(n=9)之小鼠數目減少。在研究結束(第27日)時，在所有小鼠死後切下腫瘤，去除表皮且稱重。
人類化SC104抗體在活體內明顯的抗腫瘤功效
與媒劑對照物處理相比，用人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)處理攜帶腫瘤之小鼠使得腫瘤體積及腫瘤重量顯著減小(圖8)。吾人可設想人類化SC104抗體變異體適用於以單一療法或與其他治療性抗腫瘤劑(化學治療劑、小分子或生物製劑)組合之形式治療人類之結腸直腸癌。可在小鼠腫瘤異種移植模型中評估該等組合療法之活體內功效。
實施例7
競爭檢定
將SC104抗原陽性結腸癌細胞(Colo205；經甲醛固定之細胞)在各種濃度下與競爭抗體(人類化SC104變異體SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50或對照人類IgG1同型)一起培育，隨後與固定濃度(1 μg/ml，上圖；10 μg/ml，下圖)的FITC結合之小鼠SC104抗體一起培育；隨後藉由流動式細胞測量術分析進行信號分析。
如圖9中所示，與競爭抗體一起培育以劑量依賴性方式(相對於與對照同型抗體一起培育)特異性降低小鼠SC104之結合；在相等濃度水準之小鼠及競爭抗體下，與同型對照抗體相比，使小鼠SC104之結合減少約23%(上圖)或約32%(下圖)。各點表示三個重複樣品之平均值±SD。
以相對於嵌合SC104之活性百分比表示；nd，未測定；在其他實驗中檢驗時獲得類似資料。
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序列表概要
SEQ ID NO:1：鼠類SC104重鏈可變區之胺基酸序列。
SEQ ID NO:2：具有小鼠可變區及人類IgG1 主鏈(人類IgG1重鏈CH1、鉸鏈區、CH2及CH3域)之嵌合SC104重鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:3：鼠類SC104輕鏈可變區之胺基酸序列。
SEQ ID NO:4：具有小鼠可變區及人類輕鏈恆定區之嵌合SC104輕鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:5：重鏈信號序列。
SEQ ID NO:6：輕鏈信號序列。
SEQ ID NO:7：合併有取代A15P之基於1U6A之SC104輕鏈多肽序列。
SEQ ID NO:8：基於1QLR之SC104輕鏈。
SEQ ID NO:9：Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:10：Kabat移植之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:11：基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:12：基於1QLR之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:13：合併有六個取代之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:14：合併有八個取代之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:15：合併有六個取代的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:16：合併有三個取代之基於1U6A之SC104輕鏈多肽序列。
SEQ ID NO:17：合併有四個取代的Kabat移植之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:18：合併有三個取代之基於1QLR之SC104輕鏈多肽序列。
SEQ ID NO:19：合併有取代Q1E及Q46E之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:20：合併有取代Q1E及I48M之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:21：合併有取代Q1E及V67I之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:22：合併有取代Q1E及T68S之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:23：合併有取代Q1E及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:24：合併有取代Q1E及E72D之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:25：合併有取代V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:26：合併有取代V71R之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:27：合併有取代V71R的Kabat移植之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:28：合併有取代V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:29：合併有取代G27Y及V71R的Kabat移植之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:30：具有小鼠可變區及人類IgG1 主鏈(人類IgG1 重鏈CH1、鉸鏈區、CH2及CH3域)且合併有CDR-H2取代F53W之嵌合SC104重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:31：具有小鼠可變區及人類IgG1 主鏈(人類IgG1 重鏈CH1、鉸鏈區、CH2及CH3域)且合併有CDR-H2取代F53Y之嵌合SC104重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:32：具有小鼠可變區及人類IgG1 主鏈(人類IgG1 重鏈CH1、鉸鏈區、CH2及CH3域)且合併有CDR-H2取代F53P之嵌合SC104重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:33：合併有取代S64K及V71R之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:34：合併有取代S64L及V71R之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:35：合併有取代S64H及V71R之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:36：合併有取代S64F及V71R之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:37：合併有取代S64R及V71R之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:38：合併有取代G27Y、F291、T30S、S64K及V71R的Kabat移植之基於1QLR之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:39：合併有取代S64K及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:40：合併有取代S64L及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:41：合併有取代S64H及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:42：合併有取代S64F及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:43：合併有取代S64R及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:44：合併有取代S40P及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:45：合併有取代S40P、S64K及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:46：合併有取代S40P、S64L及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:47：合併有取代S40P、S64H及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:48：合併有取代S40P、S64F及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:49：合併有取代S40P、S64F及V71R之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列的AbM移植之CDR-H1、Kabat界定之CDR-H2及CDR-H3。
SEQ ID NO:50：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:51：具有小鼠可變區及人類IgG1 主鏈(人類IgG1重鏈CH1、鉸鏈區、CH2及CH3域)且合併有取代N60D之嵌合SC104重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:52：合併有鉸鏈區、CH1、CH2及CH3域之重鏈恆定區。
SEQ ID NO:53：合併有鉸鏈區、CH1、CH2及CH3域且合併有胺基酸取代S122D、S181A、I215E之重鏈恆定區。
SEQ ID NO:54：合併有取代G27Y、I29A、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:55：合併有取代G27Y、I29C、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:56：合併有取代G27Y、I29D、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:57：合併有取代G27Y、I29E、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:58：合併有取代G27Y、I29F、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:59:合併有取代G27Y、I29G、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:60:合併有取代G27Y、I29H、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:61:合併有取代G27Y、I29K、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:62:合併有取代G27Y、I29L、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:63：合併有取代G27Y、I29M、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:64：合併有取代G27Y、I29N、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:65：合併有取代G27Y、I29P、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:66：合併有取代G27Y、I29Q、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:67：合併有取代G27Y、I29R、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:68：合併有取代G27Y、I29S、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:69：合併有取代G27Y、I29T、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:70：合併有取代G27Y、I29V、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:71：合併有取代G27Y、I29W、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:72:合併有取代G27Y、I29Y、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
SEQ ID NO:73：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71A的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:74：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71C的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:75：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71D的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:76：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71E的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:77：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71F的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:78：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71G的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:79：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71H的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:80：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71I的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:81：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71K的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:82：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71L的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:83：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71M的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:84：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71N的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:85：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71P的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:86：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71Q的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:87：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71S的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:88：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71T的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:89：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71V的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:90：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71W的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:91：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71Y的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。SEQ ID NO:92：合併有鉸鏈區、CH1、CH2及CH3域之重鏈恆定區。
SEQ ID NO:93：輕鏈恆定區SEQ ID NO:94：合併有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat移植之基於1U6A之SC104重鏈多肽序列。
<210>　82
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　82
<210>　83
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　83
<210>　84
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　84
<210>　85
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　85
<210>　86
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　86
<210>　87
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　87
<210>　88
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　88
<210>　89
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　89
<210>　90
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　90
<210>　91
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　91
<210>　92
<211>　330
<212>　PRT
<213>　智人
<400>　92
<210>　93
<211>　106
<212>　PRT
<213>　智人
<400>　93
<210>　94
<211>　450
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗體
<400>　94
圖1-人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)結合於具有突變KRAS基因及野生型KRAS基因之人類胃腸癌。圖1中展示對於一組供體腫瘤樣品(n=供體數目)之個別及平均免疫組織化學結合強度；如藉由曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)所測定，各腫瘤類型之野生型組或突變組之間的染色強度不存在統計顯著差異。
圖2-如藉由免疫組織化學所測定，人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:94)結合於具有突變KRAS基因及野生型KRAS基因之人類結腸癌細胞。
圖3-如藉由LDH釋放檢定使用SC104抗原陽性人類結腸癌細胞系C170所測定，合併有1U6A構架之人類化SC104抗體變異體(VL/VH SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25)及合併有1QLR構架之人類化SC104抗體變異體(VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:26)具有有效力的抗體依賴性細胞介導型細胞毒性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2)經顯示為比較者且人類IgG1同型用作陰性對照。各點表示三個重複樣品之平均值±SD。
圖4-如藉由細胞存活力檢定使用SC104抗原陽性人類結腸癌細胞系Colo205所測定，合併有1U6A構架之人類化SC104抗體變異體(VL/VH SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:25)及合併有1QLR構架之人類化SC104抗體變異體(VL/VH SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:26)具有有效力的補體依賴型細胞毒性。嵌合SC104抗體(SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:2)經顯示為比較者連同人類IgG1 同型經顯示為陰性對照。各點表示三個重複樣品之平均值±SD。
圖5-如藉由LDH釋放檢定所評估，人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)具有有效力的針對人類結腸癌細胞系DLD-1(KRAS突變型)之抗體依賴性細胞介導型細胞毒性。人類IgG1 同型用作陰性對照。各點表示三個重複樣品之平均值±SD。
圖6-如藉由LDH釋放檢定所評估，人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)具有有效力的針對人類結腸癌細胞系Colo201(A)、Colo205(B)、WiDr(C)及HT-29(BRAF突變型)(D)之抗體依賴性細胞介導型細胞毒性。人類IgG1 同型用作Colo201之陰性對照。各點表示三個重複樣品之平均值±SD。
圖7-如藉由LDH釋放檢定使用SC104抗原陽性WiDr人類結腸癌細胞系所評估，經幾夫辛(Kifunensin)處理之人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)具有高於未經處理之抗體的抗體依賴性細胞介導型細胞毒性。各點表示三個重複樣品之平均值±SD。
圖8-用人類化SC104抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50)處理攜帶HT29異種移植腫瘤之小鼠與媒劑對照物處理相比引起腫瘤負荷顯著減小。A：各組(每組6-10只小鼠)之平均值±SEM腫瘤體積。星號指示治療組之間的顯著差異，p<0.05曼-惠特尼檢驗。B：研究結束時之平均及個別腫瘤重量。P值係藉由曼-惠特尼檢驗來測定。
圖9-如藉由流動式細胞測量術使用抗原陽性細胞系Colo205所評估，競爭抗體(SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:50(-▲-))而非人類同型對照抗體(-○-)明顯減少經螢光標記之小鼠SC104抗體之結合(A -1 μg/ml；B -10 μg/ml)。

Claims (6)

  1. 一種與SC104競爭結合於人類結腸癌細胞系Colo205之人類化抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製備用以治療個體之癌症的醫藥品，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因，其中該人類化抗體或抗原結合片段包含選自由以下組成之群的輕鏈及重鏈組合：SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：38。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該癌症已經檢驗過突變之KRAS或BRAF基因的存在。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該癌症係選自由結腸癌、胰臟癌及胃癌組成之群。
  4. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該癌症係選自由結腸癌、胰臟癌及胃癌組成之群。
  5. 一種人類化抗體或其抗原結合片段，其在個體癌症治療中與SC104競爭結合於人類結腸癌細胞系Colo205，其中該癌症包含突變之KRAS或BRAF基因，其中該人類化抗體或抗原結合片段包含選自由以下組成之群的輕鏈及重鏈組合：SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：38。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗體或其抗原結合片段，其中該癌症已經檢驗過突變之KRAS或BRAF基因的存在。
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