TWI439279B - 治療過敏疾病之方法 - Google Patents

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Description

治療過敏疾病之方法
本發明係有關於藻膽蛋白(phycobiliprotein)應用於調節免疫反應，尤指取自於頭髮菜的藻藍素(phycocyanin fromBangia atropupurea ,Ba-PC)於過敏疾病的治療上的應用。
藻膽蛋白是一種水溶性蛋白質，可以在藍綠藻(cyanobacteria)以及某些藻類(algae)，例如：紅藻(rhodophytes)、隱藻(cryptomonads)或灰綠藻(glaucocystophytes)中發現。藻膽蛋白是由蛋白質共價地與藻膽色素(phycobilins)(例如：藻藍色素、藻紅素或藻尿後膽色素)等結合而成的複合物所構成，其作用如一發色團(chromophore)。各種藻膽蛋白於可見光波長下具有一特定的吸收與螢光放射最大值，藉此細胞可善加利用可用波長之光(波長介於500-650nm)。
藻藍素(phycocyanin,PC)具有三個α次單元(18,800 Da)以及三個β次單元(20,000 Da)，而以一三聚體聚集(trimeric aggregation)(αβ)3 之形式存在。藻藍素通常可以由諸如藻類之植物中取得，其應用於食物、飲品與化妝品中作為著色劑是具安全性的。易養殖的藍綠藻[諸如，螺旋藻(Spirulina )以及微囊藻(Microcystis )]是藻藍素的主要原料。其它同樣富含藻藍素的自然海洋資源是紅藻，諸如紫菜(Porphyra )與仙菜(Ceramium )。
純藻藍素可以應用在很多領域中，主因是由於當受到適合的波長或是光線照射時，分子所產生的已知光化學作用，例如：藻藍素可被使用於抗體的螢光標記，以於免疫學、臨床上、細胞生物學或是生物化學研究中作為一種診斷試劑。藻類的培養方法與從藍綠藻中製備藻藍素的方法已經被完整的建構，因此藻藍素與其他合成藥物相比被認為是相當有潛力的治療試劑候選物。
過敏性疾病的誘發原因是對於存在於環境中一些無害的物質的過敏原所引發的免疫反應，其中這些反應是後天的、可預測的以及快速的。以氣喘為例，其為一種熟知的過敏性疾病，氣喘病理生理學的特點是呼吸道的嗜伊紅性發炎作用(eosinopilic inflammation)、支氣管痙攣以及非特異性吸入性刺激物的過度反應(hyperreactivity)。氣喘經分析具有Th1淋巴細胞與Th2淋巴細胞間的失調以及具優勢的Th2型免疫反應之特性。Th2型細胞激素，例如：介白素-4(interleukin-4)、介白素-5以及介白素-10，可能會引發嗜伊紅性粒細胞與肥大細胞趨化性(chemotaxis)與活化作用，B細胞的免疫球蛋白E(IgE)生成作用同樣也會受到影響。一些研究已證明Th2型細胞激素的誘發以及Th2淋巴細胞的增殖作用可以藉由Th1淋巴細胞激素，尤指干擾素-γ(interferon-γ)以及介白素-12，予以阻斷。
然而，沒有文獻或是發表刊物已探討或揭露有關包括藻藍素之藻膽蛋白於參與調控免疫反應，尤指Th1細胞激素的促進反應與Th2的抑制反應，上的功效。
為了滿足對於發展新的用於治療過敏性疾病之組成物與方法的迫切的需求，藻膽蛋白應用於治療過敏性疾病的有效性於是被探討，特別是取自於頭髮菜的藻藍素(phycocyanin fromBangia atropurpurea ,Ba-PC)。因此，申請人致力於發展一種使用藻膽蛋白以治療過敏性疾病的方法，特別是指取自頭髮菜的藻藍素，申請人建立了一個篩選化合物的平台，以篩選到具有增強免疫力的化合物，並且作為治療過敏性疾病之有效標的物。取自於頭髮菜的藻藍素(Ba-PC)具有調節哺乳動物的免疫反應之功效，經由活體內與活體外的實驗證實藻膽蛋白，尤其是藻藍素，具有治療過敏性疾病的能力。
因此，在一方面，本發明係提供一種治療或減緩哺乳動物的過敏性疾病的方法，其包括：對一哺乳動物投藥以一治療有效劑量的藥學組成物(therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition)，該藥學組成物係包含藻藍素。
較佳的，其中過敏性疾病係選自於下列者所構成的群組：氣喘、過敏性鼻炎、濕疹、牛皮癬、過敏性皮膚炎、類風濕性關節炎、炎症性腸病、孔羅氏病、潰瘍性結腸炎、慢性阻塞性肺疾病、結膜炎、鼻塞以及蕁麻疹。
較佳的，其中於治療有效劑量係介於每日每公斤0.1毫克至每日每公斤50毫克之間。
較佳的，其中藻藍素係取自於由下列品系所構成的群組之藻類：屬於紫菜屬(Porphyra )、頭髮菜屬(Bangia )之物種或其等之組合。較佳的，藻藍素係取自於頭髮菜(Bangia atropurpurea )、紫菜(Porphyra angusta )、長紫菜(Porphyra dentata )。
較佳的，其中藻藍素係取自頭髮菜。
較佳的，其中過敏性疾病係指過敏性氣管疾病。
較佳的，其中該藥學組成物係以口服、***、外用、吸入或滴入鼻腔方式投藥。
較佳的，其中該藥學組成物係以靜脈內、皮下或肌肉內注射方式投藥。
另一方面，本發明應用了一種用以於活體外評估免疫調節功能的方法，其係利用骨髓衍生樹突狀細胞(Bone marrow derived dendritic cell,BMDC)培養系統，藉以因應需求監測新穎分子於哺乳動物中的免疫調節作用之功效。
因此，本發明亦提供了一種用於調節哺乳動物中Th1與Th2免疫反應之間平衡的方法，其中包含：對一哺乳動物投藥以一有效劑量的藻藍素，藉以令哺乳動物的免疫反應趨向發生Th1免疫反應。
較佳的，其中哺乳動物係患有過敏性疾病。
較佳的，其中哺乳動物係患有過敏性氣管疾病。
較佳的，其中過敏性氣管疾病係選自下列者所構成的群組：氣喘、過敏性鼻炎以及過敏性肺炎。
較佳的，其中藻藍素係取自藻類，該藻類係選自與紫菜同屬的藻類、與頭髮菜同屬的藻類以及紫菜與頭髮菜同屬的藻類所構成的群組。
較佳的，其中藻藍素係取自頭髮菜。
較佳的，其中有效劑量係介於每日每公斤0.1毫克至每日每公斤50毫克之間。
另一方面，本發明亦提供一種用於治療或減緩過敏性疾病的藥學組成物，其包含一治療有效劑量的藻藍素以及一藥學上可接受的載體或賦形劑。
較佳的，其中該治療有效劑量係介於每公斤0.1毫克至每公斤50毫克之間。
較佳的，其中藥學組成物係以採口服、外用、注射、肌肉內注射、滴入鼻腔、皮下或靜脈內注射方式投藥。
另一方面，本發明亦提供一種用於治療、預防或減緩或敏性疾病的補充性食品組成物，其包含一適當數量的藻藍素。
由於藻藍素製備成本低，作為飲品與食品也相當安全，且亦被證實具有治療過敏性疾病的療效，依據本發明的用於治療或減緩過敏性疾病的方法與組成物與其他習用用於治療或減緩過敏性疾病的方法或治療試劑相較，具有絕佳的優勢。
本發明的其他可達到的功效、優點以及新的特點會更清楚的闡明於下列實施方式與圖式內容中。
藻膽蛋白包括取自頭髮菜的藻藍素，而且經由活體內與活體外的實驗於本文中被鑑定出會調節哺乳動物的免疫反應。活體外的實驗分析係參照下列方法進行：雌性BALB/c小鼠之股骨與脛骨取得新鮮的骨髓細胞並且予以培養於RPMI 1640培養液中六天，該RPMI 1640培養液包含500 U/毫升的GM-CSF以及1000 U/毫升的介白素-4，接著在第六天的時候，將藻藍素予以添加予樹突狀細胞(dendritic cell,DC)中，在第七天或第八天時，收集上清液以供測量介白素-12p40，該介白素-12p40已知於Th1細胞分化過程扮演重要角色，於此處申請人建立了一種用以在活體外篩檢可增強免疫能力且具有潛力應用在治療過敏性疾病的的活性化合物，並且證明藻膽蛋白對於治療過敏性疾病(例如，但不限於：過敏性氣喘、過敏性鼻炎以及過敏性肺炎)是具有功效。
與調節Th1與Th2之間的免疫反應失調用以減緩過敏性疾病的方法相關的是，引起相關領域的研究學者之興趣的一種免疫細胞譜系(lineage)，其係樹突狀細胞。樹突狀細胞是一種專業的抗原呈現細胞(antigen-presenting cell)，也是能令休眠T細胞(resting T cell)活化之最有效的活化劑，同時也具有可活化未活化T細胞(nave T cell)的獨特能力。由於樹突狀細胞可調節T細胞發育並且促進針對特殊的抗原之Th1或Th2免疫反應的發展，樹突狀細胞藉由予以加入不同抗原已被應用作為舒緩呼吸道發炎之有效調節因子。
就藻藍素的來源而言，紅藻係於本發明中被用以萃取以取得所欲的藻藍素。如所知者，大部分的紅藻含膠量非常高，使得萃取藻藍素的過程變得相當困難，尤其是對經乾燥的紅藻進行萃取。申請人是利用從絲狀相(filamentous phase)(Conchocelis)的頭髮菜中製備藻藍素之方法從頭髮菜中萃取藻藍素。簡而言之，申請人從絲狀相的組織培養中取得一乾淨沒有汙染的藻類生質物(algal biomass)，該絲狀相的組織培養物係由將紅藻胞子(carpospore)於光與溫度的控制生長系統下使其發芽並發育而得。頭髮菜的膽蛋白質即是從藻類生質物中經由具成本效益的萃取法以及一系列的色層分析法分離而得。
在本說明書中，用語「過敏性疾病」意指對抗一過敏原的過敏反應，該過敏原可衍生自下列物質，例如，但不限於自身抗原：豚草(ragweed)、樺樹花粉(birch pollen)、花生、居家塵蟎、動物皮屑、黴菌以及原肌球蛋白(tropomyosin)。
根據本發明，過敏性疾病包括，但不限於：氣喘、鼻炎、濕疹、牛皮癬、過敏性皮膚炎、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、炎症性腸病、克隆氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、慢性阻塞性肺疾病、結膜炎、鼻塞以及蕁麻疹。
在本說明書中，用語「過敏性呼吸道疾病」意指呼吸道的過敏性疾病。舉例而言，過敏性呼吸道疾病包括，但不限於：氣喘、過敏性鼻炎以及過敏性肺炎。
根據本發明，藻藍素係取自於選自於由下列品系所構成的群組之藻類：屬於頭髮菜(Bangia atropurpurea )、紫菜(Porphyra angusta )、長紫菜(Porphyra dentata )之物種。較佳的是，藻藍素是取自頭髮菜(Ba-PC)。
在另一方面，本發明提供一種治療或減緩哺乳動物的過敏性疾病的方法，其包含：對一罹患過敏性疾病的哺乳動物投藥以一治療有效劑量的含有藻藍素的藥學組成物。
在本發明中較佳的實施例中，藥學組成物是以下列方式予以投藥：口服、吸入或是滴入鼻腔方式。
在本發明另一個較佳的實施例中，藥學組成物哺乳動物是以靜脈內注射、皮下注射或是肌肉內注射投藥。
依據本發明的方法，所述的治療有效劑量係介於每公斤每日0.1毫克至每公斤每日50毫克之間。
在另一方面，本發明提供了一種用於調節哺乳動物Th1與Th2免疫反應之間的平衡的方法，其包含：對於哺乳動物投藥以一有效劑量的藻藍素，藉以令哺乳動物的免疫反應趨向Th1免疫反應。
根據本發明，在本說明書中用語「免疫反應係趨向Th1免疫反應」係指於藻藍素存在下，Th2型細胞激素[例如：介白素-4、介白素-10、介白素-5、趨化因子(eotaxin)以及介白素-13]的生成會降低，而Th1型細胞激素(例如：干擾素-γ)的生成會增加。
根據本發明的方法，哺乳動物的免疫反應若是傾向Th2免疫反應會遭受到過敏性疾病之苦。根據本發明的方法，有效劑量是係介於每公斤每日0.1毫克至每公斤每日50毫克之間。
又再另一方面，本發明提供一種治療或減輕過敏性疾病的藥學組成物，其包含一治療有效劑量的藻藍素以及藥物上可接受的載體或賦形劑。
根據本發明的方法，該治療有效劑量是係介於每公斤每日0.1毫克至每公斤每日50毫克之間。
在本發明較佳的實施例中，藥學組成物的調劑或投藥的途徑為以下列方式：口服、外用、靜脈內、肌肉內注射、滴入鼻腔、皮下或是靜脈內。特定的，藥學組成物是粉狀、錠劑、丸劑、膠囊、扁型膠囊、栓劑、多樣化的分散粒劑、懸浮液、微型乳劑或是其他類似的劑型。
本發明的藥學組成物可調配成任何的劑型，例如：錠劑、膠囊、丸劑、菱形錠劑、粒劑、粉狀、團塊(pellet)、液體、乳劑、懸浮液、酏劑(elixir)或其他類似的劑型。藥學組成物可以與一經加壓的推進劑(propellant)之填裝入位於氣霧吸入器或是鼻腔噴霧器內之將加壓的氣溶膠容器中。
根據本發明，藥學上可接受的載體或賦形劑係為本技術領域中已知者，其係包括：磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳化劑，例如：油/水乳化劑、多種類型的潤濕劑以及無菌溶液等。賦形劑可以是任何藥學上的賦形劑作用為載劑材料、填充劑、黏結劑、潤滑劑、緩衝液、表面活性劑、稀釋劑、崩解劑、助流劑、著色劑或其他類似的劑型。
另一方面，本發明亦提供一種用於治療、預防或減緩過敏性疾病的補充性食物組成物，其包含一適當數量的藻藍素。
本發明中「有效劑量」的藻藍素將隨著個別病人跟疾病的嚴重程度變化。然而，一般而言有效劑量至少需要每公斤0.1毫克。較佳的，適當數量的藻藍素是介於每公斤0.1毫克至每公斤50毫克之間。
本發明更進一步地以下列實施例說明，但須理解的是本文所述的各實施例與具體實施例僅是作為例證，而不應用以將本發明限制於本文中具體實施例。
實施例
一般實驗材料與方法
1.　動物
六到八週大的雌性BAL/c小鼠，體重約20公克，予以飼養於國立臺灣大學醫學院動物中心(台北，台灣)。動物研究方案係經由國立臺灣大學醫學院動物研究委員會所認可。
2.　Ba-PC的製備
從海裡收集成熟的頭髮菜菌體，然後以無菌海水清洗。風乾一短暫時間後，將它們放置於培養液中(SWM-II培養液)。經過數小時，孢子便會從頭髮菜菌體中釋放出。在培養液中所釋放出的孢子從它們的菌體中被移出，然後放置於生長箱中，其中溫度、照度與光/暗的比例分別是25℃、500-1000照度(lux)以及14：10。
等到胞子發芽成分支的絲狀體(Conchocelis)，將該絲狀體轉移至含有SWM-III培養液的瓶中，接著培養在上述條件下直到它們形成絲狀群集(filament cluster)的菌落(colony)。將該絲狀群集以無菌磨床切成碎片增殖。切成小碎片的絲狀體的生長係藉由透過一系列的放大製程(scaling-up process)將之轉移至一位於更大體積的諸如玻璃纖維槽或是混凝土槽中之新的的SWM-III培養液中之方式予以提高。
放大的各個步驟中，絲狀體菌落就會再經裁切，使得該絲狀體菌落再進一步地生長到更大的體積一直到得到所欲的數量。要注意的是，當絲狀體菌落培養在大體積的瓶子或是槽體內時，一定要填充新鮮的空氣(300毫升/每分鐘)，其目的是為了要提供生長時所需的二氧化碳，同時也是為了達到震盪(agitation)的目的。接著絲狀體就會被收集起來，以100-400目的篩網過濾。培養基如果沒有受到其他藻類的污染的話，其含有豐富的基質成分可以回收再次使用。高密度的培養或是深度較深的培養容器會需要高強度的頂部照度，例如5000-10,000照度，直接照射在培養液表面或是至少需要500照度從培養容器的底部照射。室外的培養系統需要保持水溫低於30℃，其係藉由避免太陽直接照射或是在中午時分以地底下的海水降溫。培養基的鹽度的快速變化是必須要避免的，例如：被大量的雨水或是淡水稀釋。
被收集起來並且被過濾過的頭髮菜絲狀體接而以真空方式或是凍乾方式快速乾燥，接著磨成粉狀型態。將該乾燥後的藻類粉末加入pH值6.8、10 mM的磷酸溶液或是水(10倍體積)中，接著劇烈攪拌以獲得具有蛋白質的水性萃取物。利用離心去除殘餘物以獲得澄清的紅色素溶液，該紅色素溶液即是下列實施例中會使用的粗抽液(crude extract)。進行重複萃取以獲徹底的萃取作用。將後續萃取而得的上清液予以合併並且將(NH4 )2 SO4 結晶逐片加入上清液中同時攪拌至濃度為10%的飽和溶液。離心去除葉綠素結合的蛋白質(chlorophyll-bound protein)，所得上清液再逐片加入(NH4 )2 SO4 結晶同時攪拌至濃度為30%的飽和溶液，萃取液再次利用離心去除沉澱物中多數藻紅蛋白，所得的上清液再逐片加入(NH4 )2 SO4 結晶同時攪拌至濃度為50%的飽和溶液。結合有少量的藻紅蛋白之粗抽藻藍素係藉由離心作用以沉澱物形式取得。
粗抽的藻藍素沉澱再以微量的10 mM的磷酸鹽溶液重新懸浮，並且以透析管藉由前述磷酸鹽溶液進行透析，接著再以膠體過濾色層分析分離。膠體過濾色層分析係採用Sephadex G200管柱，且以對前述磷酸鹽溶液作為沖提液(eluent)，沖提後的溶液依據紫外光280 nm的吸收光的波峰予以收集成數個分份(fraction)，吸收光的波峰係利用光二偶極陣列偵測器(photodiode array detector,PDA detector)測量。將吸收光在618 nm與280 nm的吸光值比例大於2.5的分份予以合併作為粗抽藻藍素。吸收光在565 nm與280 nm的吸光值比例大於1.4的分份視為是粗抽藻紅蛋白。透過重複的Sephadex G200管柱的膠體過濾色層分析，藻紅蛋白於吸收光在565 nm與280 nm的吸光值比例會逐漸增加至大於5.1，同時藻藍素也進一步地被純化。由膠體過濾色層分析所得之經合併的粗抽藻藍素分份係於50%的(NH4 )2 SO4 溶液中進行沉澱。經透析的粗抽藻藍素溶液進一步地再以磷灰石色層分析法(hydroxyapatite chromatography)純化，其係使用自填充的Macro-Prep陶瓷磷灰石第一型膠體管柱(BIO-Rad)(圓直徑2.5公分、管柱長20公分)。以線性梯度的沖提液將該藻藍素沖提下來，該線性梯度沖提液係指配於0.1 M氯化鈉溶液中濃度10 mM至200 mM的磷酸鹽緩衝液。沖提所得的分份以紫外光-可見光分光光度計檢測。經純化的藻藍素是藉由將吸收光在618 nm與280 nm的的吸光值比例大於4的分份予以合併，並且藉由再加入(NH4 )2 SO4 結晶以溶解至濃度為60%的飽和溶液予以沉澱而得。
從頭髮菜中取得的藻藍素(Ba-PC)屬於第一型R-PC，第一型R-PC在波長618 nm與553 nm處有最大的吸光值λmax 以及放射螢光光波長為640 nm(請參見圖1以及圖2所示)。非變性與SDS-膠體電泳(native- and SDS-PAGE)的結果顯示，Ba-PC是一個(αβ)3 的共軛體，其係由三個α次單元(分子量17.06 kDa)以及三個β次單元(分子量26.69 kDa)所形成(請參見圖3所示)。Ba-PC係經由上述的方法分離得到，並且以下列小鼠呼吸道過度反應試驗和樹突狀細胞的生物性試驗(bioassay)而予以鑑定。
3.　來自骨髓培養的小鼠樹突狀細胞的分離與調節作用
骨髓衍生樹突狀細胞(Bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)以如先前所描述的方式製備(Richards DF.et al .,Eur. J. Immunol .,2000,30: 2344-54)。簡言之，股骨與脛骨的骨髓細胞是藉由使用ACK裂解緩衝液予以去除紅血球細胞並培養，1.5×106 個細胞放置於含有1毫升的培養液的24孔盤中，該培養液中添加有500單位/毫升的重組鼠類粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(mouse granulocyte macrophage-colony-stimulating factor,GM-CSF)以及1000單位/毫升的介白素-4(Pepro Tech Inc.,Rocky Hill,NJ)。該培養基係為RPMI-1640培養基，其包含5%的熱滅活胎牛血清、4 mM的左旋麩醯胺酸(L-glutamine)、25 mM的4-羥乙基乙磺酸(HEPES)(pH 7.5)、50 μM的2-硫氫乙醇(2-mercaptoethanol)、100單位/毫升的盤尼西林、100微克/毫升的鏈黴素以及0.25微克/毫升的兩性黴素。每隔一天將舊的培養液移除並添加新的培養液。小鼠的BMDC在第六天即可取得以供用於往後的實驗。培養到第六天，沒有黏附的細胞(BMDC)會被收集起來，施予或是不施予0.1微克/毫升的LPS或是75微克/毫升的Ba-PC之處理；培養到第八天，經培養的上清液、經LPS與Ba-PC處理的BMDC以及未施予LPS與Ba-PC處理的BMDC收集並準備進行分析。
4.　流式細胞分析方法
作為分析的細胞先以冷的磷酸鹽緩衝液清洗，該磷酸鹽緩衝液包含2%的胎牛血清以及0.1%的疊氮化鈉，接著予以培育於冷的緩衝液中。繼而將細胞以大鼠對抗小鼠抗體單株抗體染色作為同型抗體對照染色比對，IAd (MHC第二型)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、CD207或是CD11c(eBioscience，聖地牙哥，加州)置在冰上30分鐘。染色後的細胞清洗兩次然後重新懸浮於冷的緩衝液中，使用流式細胞儀(FACSCalibur)(Becton Dickson)進行分析流式細胞分析，且其資料係以CellQuestPro軟體(Becton Dickson)處理。
5.　細胞因子表現量的測定
關於BMDC的生物性功能分析，介白素-12p40、介白素-12p70、介白素-4、介白素-10以及干擾素-γ的表現位準(expressional level)是利用ELISA進行分析，其係依據廠商建議指引(R&D,Minneapolis,MN,USA)。
6.　樹突狀細胞的胞飲作用(endocytosis)的分析
評估經過Ba-PC處理過的樹突狀細胞的成熟狀態，樹突狀細胞的胞飲作用能力係藉由以異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的聚葡萄醣(dextran)的攝取量(uptake)來評估。取得經Ba-PC處理的小鼠骨髓衍生的樹突狀細胞清洗兩次接著以1毫升的RPMI 1640培養液再次懸浮，該RPMI 1640培養液添加有10%的胎牛血清、2 mM的左旋麩醯胺酸、100 U/毫升的盤尼西林、100 U/毫升的鏈黴素以及25 mM的4-羥乙基乙磺酸。前述細胞接著會與0.2毫克/毫升的異硫氰酸螢光素標記的聚葡萄醣在4℃或37℃下培育一小時。最終，前述細胞會以冷的緩衝液清洗三次，再以流式細胞儀以前述方式測量。
7.　異體混合淋巴細胞反應與細胞激素之生成分析
為了試驗經Ba-PC處理的樹突狀細胞的刺激能力，可經由混合淋巴細胞反應(mixed lymphocytes reaction,MLR)以及細胞激素分泌位準予以判定。CD4+ T細胞是從C57BL/6小鼠脾臟中以結合L3T4(抗CD4)的磁珠磁性分選純化取得，或是以MiniMACS管柱依照其操作手冊指示所取得。正性篩選所得的細胞包含95至99%的CD4+ T細胞，其被收集而用於細胞激素的生成與增殖作用試驗中。
就增殖作用試驗，經Ba-PC或是LPS處理過的骨髓衍生的樹突狀細胞經過3000 rads輻射量的照射並且被使用作為APC。新鮮地經純化的C57BL/6小鼠CD4+ T細胞(每一毫升有3×105 個細胞)，與經Ba-PC或是LPS處理過的骨髓衍生的樹突狀細胞依照指示的樹突狀細胞/T細胞的比例下共同培養。細胞係培養於96孔圓底組織培養盤中三天，其總體積為200微升。培養物以1 μCi[3 H]的胸腺核苷脈衝(pulse)繼續培養17個小時，並且以閃爍計數器量測[3 H]的胸腺核苷脫氧核醣併入的數量。就測量細胞激素分析，經Ba-PC處理過的骨髓衍生的樹突狀細胞，依照前述用於增殖作用的培養條件培養。於經過48、72以及96小時後，收集上清液，再以ELISA分析細胞激素的生成。
8.　細胞內的細胞激素的染色
細胞內的細胞激素以Andersson等人所發展的方法經過適度調整後以流式細胞儀測定(Andersson U.et al.,Eur. J. Immunol .,1990,20: 1591-6)。簡言之，3×105 個CD4+ T細胞與樹突狀細胞依照指示的DC/T細胞比例在37℃培養兩天。在最終培養的六小時時加入莫寧素(monensin)。接著取得106 個細胞，以藻紅蛋白標記的CD4抗體(BD PharMingen,San Diego,CA)染色。隨即清洗細胞，以eBioscience IC固定液、eBioscience通透性緩衝液固定及穿透(eBioscience，聖地牙哥，加州)，再以干擾素-γ或是介白素-4的異硫氰酸熒光素標記單株抗體(BD PharMingen)染色。在全部的實驗中皆以同型對照抗體(BD PharMingen,San Diego,CA)染色進行比對。104 個細胞以流式細胞儀分析，流式細胞儀分析結果是選定(gating)在CD4+ 淋巴細胞族群的方式呈現。
9.　以OVA誘發過敏性呼吸道發炎作用以及呼吸道過度反應(airway hyperresponsiveness,AHR)分析
取六到八週大的雌性BALB/c小鼠，在第零天、第五、十、十五、二十與二十五天，以腹腔注射配於總體積為200 μl的磷酸鹽緩衝液中之與50 μg或100 μg的Ba-PC混合的50 μg的OVA(Sigma,St Louis,MO,USA)使之敏感化(sensitized)(下文中簡稱為：「經OVA以及Ba-PC處理後的小鼠」)。靈芝多醣(polysaccharide fromG. lucidum ,PS-G)由國立陽明大學生物化學研究所的李旭生教授所提供，係作為正對照組(於活體外研究時，其劑量為10微克/毫升；於活體內研究時，其劑量為1毫克/小鼠)。申請人於先前研究(Lin,YL.et al.,Journal of Leukocyte Biology vol.78: 533-43,2005)中，已經證實靈芝多醣可促進活化成熟與未成熟的樹突狀細胞以及靈芝多醣可增加調節免疫反應的能力，因此，靈芝多醣可在本研究中作為正對照組。
疾病組的小鼠(圖式中標註為「OVA」)係使用OVA使之敏感化；未活化組的小鼠(圖式中標註為「未處理」)係注射磷酸鹽緩衝液。對於藉由OVA挑戰(challenge)所誘發的過敏性呼吸道發炎作用，所有的小鼠在第三十五、三十六、三十七、三十八天時，都以鼻腔內方式予以投用OVA(50微克配於總體積30微升的磷酸鹽緩衝液)。投用磷酸鹽緩衝液的未活化小鼠組作為負對照組。在免疫期間於不同時間以眼窩穿刺採集血液以進行分析免疫球蛋白E的滴定濃度(titer of IgE)。最後一次的OVA挑戰的二十四小時後，進行評估呼吸道過度反應(AHR)，採集血清、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BAL fluid)以及脾臟。
部分肺被裁切以及以10%的中性緩衝福馬林液固定，製備肺切片(厚度5 μm)以進行蘇木紫-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin staining,H&E staining)後，並且以光學顯微鏡觀察。脾臟細胞的單細胞懸浮液係藉由將將脾臟細胞壓制通過一篩孔為40 μm的篩網，並且以Hank’s平衡緩衝液清洗兩次所製成。所取得的細胞被使用於活體外使用OVA的刺激反應中，而細胞激素的生成是藉由ELISA進行分析。
10. OVA特異性抗體的檢測與測定
血清抗OVA免疫球蛋白E、IgG1以及IgG2抗體的滴定濃度是藉由ELISA測定。簡言之，於96孔微滴定濃度培養盤以各孔1微克的配於碳酸氫鈉緩衝液之OVA塗佈，於4℃培育過夜後，清洗該培養盤並且以3%配於磷酸鹽溶液中的牛血清蛋白在室溫下進行阻斷反應兩小時。血清樣本採集後、經稀釋後予以加入各孔中於4℃下培養過夜，接著清洗該培養盤。
生物素結合的抗小鼠IgG1(稀釋倍率1：5000，BD PharMingen，聖地牙哥，加州)、抗鼠免疫球蛋白E(稀釋倍率1：1000，BD PharMingen，聖地牙哥，加州)或者抗小鼠鼠IgG2a(稀釋倍率1：1000，BD PharMingen，聖地牙哥，加州)被稀釋於含有3%的牛血清蛋白的磷酸鹽溶液而後加入，接而在室溫下培育45分鐘。予以加入鏈黴素結合的辣根過氧化物酶(Streptavidin-conjugated horseradish peroxidase)(稀釋倍率1：5000，皮爾斯生物科技，羅克福德，伊利諾伊州，美國)並且於室溫下培育30分鐘。最終，反應以過氧化酶受質，也就是2,2’-聯氨-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽TMB[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt TMB](Clinical Science Products,MA,USA)，遵照下列步驟進行：加入硫酸停止溶液並於微孔洞盤判讀儀中以測定波長450 nm的吸收光值，抗體的位準用標準品血清來比對，計算並以ELISA單位(EU)表示。
EU=(Asample -Ablank )/(Apositive -Ablank );
Asample 表示樣品的吸光值；
Ablank 表示含有3%的牛血清蛋白的磷酸鹽溶液的吸光值；以及
Apositive 表示以患病嚴重的小鼠所製成的標準品血清的吸光值。
11.　呼吸道功能的測量
呼吸道功能係藉由以Glaab等人所描述的調整技術來麻醉小鼠(Glaab,T.et al. ,J. Appl. Physiol. ,2004,97: 1104-1111.)測量相對應於增加氣霧式甲基膽鹼(MCh)的劑量(3.125至25微克/微升)之RL的改變量進行。小鼠以胺酮氫氯酸鹽(ketamine hydrochloride)(90毫克/公斤；Phizer)麻醉後，在氣管上作一個開口，以電腦控制的小動物進氣器(Harvard Rodent Ventilator,model 683;Harvard Bio-Science,Southnatick,MA,USA)給予速率為每分鐘150次、潮氣體積為0.3毫升、呼氣末正壓3至4公分水柱的機械式進氣。將PE-50管子***食道進入胸腔丙且與壓力傳感器(LDS GOULD,Valley View,OH,USA)偶合。流量係藉由測量體積訊號的電性差異(electronic differentiation of volume signal)。壓力、流量以及體積的變化都會被紀錄下來。肺的阻力是利用軟體程式(Model PNM-PCT100W,LDS PONEMAH Physiology Platform;LDS GOULD)所計算出。該氣霧式甲基膽鹼係利用網式噴霧器(in-line nebulizer)直接經由進氣器投藥。所有呼吸道內阻力之量測要扣除氣切管(orotracheal tube)內的阻力(0.45公分水柱s/毫升)。數據資料會依據三次獨立的實驗以RL的比例表現，該RL係指磷酸鹽溶液經霧化後的RL。
12.支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)的製備以及其細胞組成與細胞激素位準之分析
支氣管肺泡灌洗液小鼠之氣管插管以及以1毫升的Hank’s平衡鹽溶液清洗所取得。該支氣管肺泡灌洗液以1500 rpm於4℃下離心十分鐘，將上清液保存於-20℃下，用以藉由ELISA測定介白素-4、介白素-10、介白素-5、介白素-13、趨化因子以及干擾素-γ的生成。細胞的團塊(pellet)則以二次收集的支氣管肺泡灌洗液再次懸浮，該二次收集的支氣管肺泡灌洗液係由以添加2%胎牛血清之Hank’s緩衝鹽溶液清洗氣管收集而得。支氣管肺泡灌洗液的適當細胞(大約2×104 個)經細胞離心抹片後(cytospined)以劉式染劑(Liu’s stain)染色。基於型態學，計數出至少要有200個細胞並且予以分類為巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞以分析支氣管肺泡灌洗液中的發炎性細胞族群。
13.　統計學分析
單因子變異數分析比較測試(One-way ANOVA comparison test)被用來評估各實驗組間統計上具有意義的差異。P值小於0.05的會被認為具有意義。所有的實驗結果以平均值正負標準誤差(means±SE)表示。
實施例1　經Ba-PC粗抽液脈衝的骨髓衍生的樹突狀細胞之細胞激素生成的初步分析
Ba-PC粗抽液如「2. Ba-PC的製備」中所述所取得。經Ba-PC粗抽液處理與未經Ba-PC粗抽液的骨髓衍生的樹突狀細胞(BMDC)是以如「3.來自骨髓培養的小鼠樹突狀細胞的分離與調節作用」中所述予以製備並培養而得。
BMDC使用或未使用18.8微克/毫升的Ba-PC粗抽液進行處理歷時48小時。為了比較的目的，BMDC以不含內毒素的12微克/毫升的Ba-PC粗抽液處理48小時。該不含內毒素的Ba-PC粗抽液(於此後稱作「無內毒素Ba-PC粗抽液(endotoxin-fee Ba-PC)」)係依據製造商手冊以將該Ba-PC粗抽液通過一個可移除內毒素的管柱「Detoxi-Gel內毒素移除膠體」所製備而得。經培養條件化的培養液於初始培養的48小時後被收集並進行ELISA分析。
請參見圖4A與圖4B所示，經Ba-PC粗抽液處理的樹突狀細胞會生成一相當量的介白素-12p70(5000 pg/毫升)(Th1細胞激素)、以及介白素-10(2000 pg/毫升)(Th2細胞激素)。相反的，請對照圖4C所示，經無內毒素Ba-PC粗抽液處理的樹突狀細胞，並沒有被觀察到有任何介白素-10的生成。這個實驗結果顯示，Ba-PC粗抽液具有調節BMDC的能力，可引發Th1免疫反應，其功效就如同純化後的Ba-PC。
實施例2　經Ba-PC處理的BMDC細胞標記表現與細胞激素生成之分析
LPS、靈芝多醣或者經過或未經過Ba-PC處理的BMDC是以如「3.來自骨髓培養的小鼠樹突狀細胞的分離與調節作用」所述予以製備並培養而得。經培養條件化的培養液於初始培養24與48小時後被收集並進行ELISA分析。樹突狀細胞的表面標記(CD11c、CD80、CD86、IAd 、CD40以及CD205)的表現則是使用流式細胞儀以如「4.流式細胞分析方法」中所述進行分析。使用LPS或是靈芝多醣培養的樹突狀細胞作為正對照組。
與經LPS處理的樹突狀細胞相比較，請參見圖5所示，與活化作用以及成熟作用相關的細胞表面標記的表現，顯示出經Ba-PC處理的樹突狀細胞是增加的。這些結果顯示Ba-PC具有顯著的可調節免疫反應的能力；與經LPS或PS-G處理的樹突狀細胞相比較，請參見圖6A以及6B所示，經Ba-PC處理的樹突狀細胞生成一相當量的介白素-12(Th1細胞激素)；與經LPS或PS-G處理的樹突狀細胞相比較，請參見圖7所示，經Ba-PC處理的樹突狀細胞幾乎沒有生成介白素-10(具有代表性的Th2細胞激素)。這表示了Ba-PC具有調節免疫反應的能力，很有可能是將免疫反應趨向Th1反應。
實施例3　藉由監測樹突狀細胞的胞飲作用對Ba-PC對樹突狀細胞的影響進行評估
經Ba-PC處理的樹突狀細胞的聚葡萄醣攝取量是如「6.樹突狀細胞的胞飲作用的分析」中所述進行監測，用以評估胞飲作用的能力。經LPS處理的樹突狀細胞作為正對照組，未經處理的樹突狀細胞作為負對照組。與未處理的樹突狀細胞相比較，請參見圖8所示，經Ba-PC處理的樹突狀細胞，其胞飲作用的能力降低，這指出了樹突狀細胞的成熟度會因為經過Ba-PC處理而增加。
實施例4 Ba-PC對於CD4 + T細胞的增殖作用與細胞激素生成影響的測定
為了測定經Ba-PC處理的樹突狀細胞對於T細胞的活化作用的影響，將經Ba-PC處理的樹突狀細胞與CD4+ T細胞共同培養，而CD4+ T細胞的增殖作用與細胞激素生成是如「7.異體混合淋巴細胞反應與細胞激素生成量分析」中所述進行測定。CD4+ T細胞的細胞激素生成的評估方法如「8.細胞內的細胞激素的染色」中所述。細胞激素位準則以ELISA測定，其方法如「5.細胞激素表現量的測定」所述。經LPS處理的樹突狀細胞作為正對照組，未經處理的樹突狀細胞作為負對照組。
與未經處理的樹突狀細胞相比較，請參見圖9所示，與經Ba-PC處理的樹突狀細胞共同培養的CD4+ T細胞，其增殖作用是增加的，特別是當樹突狀細胞/CD4+ T細胞的比例介於1/5至1/10之間時，這指出了Ba-PC可以增強CD4+ T細胞的活化。請參見圖10A至圖10C，經Ba-PC處理的樹突狀細胞可大幅地誘發CD4+ T細胞產生干擾素-γ。更進一步地，CD4+ T細胞所生成的干擾素-γ量會隨著與經Ba-PC處理的樹突狀細胞共同培養的時間增加而增加(48小時請參見圖10A；72小時請參見圖10B；96小時請參見圖10C)，其與圖6B所示之先前觀察結果相符合，經Ba-PC處理的樹突狀細胞的確是可有效地刺激Th1反應。
實 施例5　經經OVA結合Ba-PC處理的小鼠之免疫反應類型的測定
為了測定Ba-PC在動物中是否會對於調節免疫反應產生影響，經OVA結合Ba-PC處理的小鼠(被註記為「結合Ba-PC處理組」)是如「9.以OVA誘發過敏性呼吸道發炎作用以及呼吸道過度反應(AHR)分析」中所述製備並測定。血清抗OVA免疫球蛋白E、IgG1以及IgG2的是如「10. OVA特異性抗體的檢測與測量」中所述進行檢測，經OVA結合PS-G處理的小鼠(於此後稱作「結合PS-G處理組」)作為疾病控制組。僅注射磷酸鹽溶液的小鼠作為一般控制組。
請參見圖11A與圖11B所示，結合Ba-PC處理組的小鼠中，被觀察到具有高含量的血清IgG2以及低含量的血清IgG1或免疫球蛋白E，這與先前的實驗結果相符合，經Ba-PC處理的樹突狀細胞可有效地刺激Th1反應。
請參見圖12所示，僅以OVA免疫的小鼠與結合Ba-PC處理組的小鼠相比較，結合Ba-PC處理組的小鼠發生輕度支氣管發炎、產生較少浸潤性發炎細胞以及不甚明顯的支氣管上皮細胞增厚，這些結果指出Ba-PC有助於減緩支氣管發炎的嚴重性。
實施例6　取自結合Ba-PC處理組的小鼠的支氣管肺泡灌洗液內的細胞組成之檢測
為了更進一步地評估Ba-PC如何調控呼吸道內發炎細胞的甄補(recruitment)，取自結合Ba-PC處理組的小鼠的支氣管肺泡灌洗液的各種細胞是如「12.支氣管肺泡灌洗液的製備與細胞組成與細胞激素位準的分析」中所述進行評估，並且計算支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細胞佔所有細胞的百分比。經結合PS-G處理的小鼠作為正對照組，僅以OVA處理的小鼠作為疾病控制組，僅投用磷酸鹽溶液的小鼠作為一般控制組。
請參見圖13A與圖13B所示，結合Ba-PC處理組的小鼠或經結合PS-G處理的小鼠的嗜酸性粒細胞的在呼吸道的浸潤作用會被負調節。在結合Ba-PC處理組的小鼠或經結合PS-G處理的小鼠與僅以OVA處理的小鼠之間可以看到這個顯著的差異(***: p<0.0001)。相反的，僅以OVA處理的小鼠發生非常明顯的嗜酸性粒細胞的浸潤作用，這些結果都與先前的結論相同，顯示Ba-PC可減緩支氣管發炎的嚴重性。
實施例7　結合Ba-PC處理組的小鼠的呼吸道過度反應測量
為了進一步地探討Ba-PC於具有過敏性呼吸道疾病的小鼠模型中如何防止呼吸道過度活化，結合Ba-PC處理組的小鼠是如「9.以OVA誘發過敏性呼吸道發炎作用以及呼吸道過度反應(AHR)分析」以及「11.呼吸道功能的測量」中所述予以製備與分析，並藉由與僅以OVA處理的小鼠相比較以分析呼吸道過度反應(AHR)。經結合PS-G處理的小鼠作為正對照組，僅以OVA處理的小鼠作為疾病控制組，僅投用磷酸鹽溶液的小鼠作為一般控制組。
請參見圖14所示，由對於吸入的氣霧式甲基膽鹼的劑量增加的反應評估可見，僅以OVA處理的小鼠發生了嚴重的呼吸道過度反應，而結合Ba-PC處理組的小鼠的呼吸道過度反應顯著的下降，而經結合PS-G處理的小鼠也有降低呼吸道過度反應的現象，這些結果都顯示Ba-PC可減緩支氣管發炎的嚴重性。
實施例8　結合Ba-PC處理組的小鼠的支氣管肺泡灌洗液的細胞激素位準的檢測
經不同處理之組別的小鼠的支氣管肺泡灌洗液中的介白素-4、介白素-10、介白素-5、趨化因子以及介白素-13的表現是如「12.細胞內組成物與支氣管肺泡灌洗液的細胞激素位準的製備與分析」所述進行測量。經結合PS-G處理的小鼠作為正對照組，僅以OVA處理的小鼠作為疾病控制組，僅投用磷酸鹽溶液的小鼠作為一般控制組。
請參見圖15A至圖15E所示，與經OVA免疫的小鼠相比較，結合Ba-PC處理的小鼠的介白素-4、介白素-10、介白素-5、趨化因子以及介白素-13皆下降。這些結果顯示Ba-PC可經由支氣管肺泡灌洗液的細胞激素生成的改變影響免疫反應，以及Ba-PC可減緩支氣管發炎的嚴重性。
實施例9　取自結合Ba-PC處理組的小鼠的脾臟細胞的細胞激素位準的檢測
為了檢測Ba-PC在經OVA免疫的小鼠中對於調節抗原特異性免疫反應的效果，取自經OVA處理的小鼠的脾臟細胞在Ba-PC存在或未存在的條件下如同前述與OVA共同培養，藉以誘發OVA特異性的T細胞活化。在刺激後的第五天收集培養液的上清液，如「12.細胞內組成物與支氣管肺泡灌洗液的細胞激素位準的製備與分析」中所述藉由ELISA分析介白素-4、介白素-5、介白素-10、介白素-13以及干擾素-γ。
請參見圖16A至16E所示，在結合Ba-PC組的小鼠中，其抗原特異性T細胞的介白素-4、介白素-5、介白素-10以及介白素-13的細胞激素生成位準會傾向降低，而干擾素-γ的細胞激素生成位準會增加。這指示Ba-PC藉由促進細胞激素生成的Th1型環境(milieu)而建立了一個Th1型免疫反應。這些活體內的實驗結果顯示Ba-PC可有效地降低Th2型細胞激素的生成，並且減緩Th2型免疫反應。
實施例10　結合Ba-PC處理組的小鼠的OVA特異性T細胞增殖活性的檢測
取自經由結合Ba-PC或未結合Ba-PC處理的小鼠的CD4+ T細胞，於活體外以5微克/毫升的OVA刺激，接著以3 H-胸腺核苷併入如「7.異體混合淋巴細胞反應與細胞激素生成量分析」中所述分析其增殖作用。經結合PS-G處理的小鼠作為正對照組。
請參見圖17所示，取自結合Ba-PC處理的小鼠的OVA特異性CD4+ T細胞的增殖活性較僅以OVA免疫處理的小鼠的OVA特異性CD4+ T細胞為高。這些結果顯示Ba-PC可增強小鼠抗原特異性T細胞的增殖活性。
在說明書中提及的所有專利、專利申請案以及文獻，其全部的內容併入本案說明書中，如果有任何與先前技術不一致處，包含其定義，皆須以本說明書內容為基準。
以上所述僅是本發明之較佳實施例，並非對本發明作任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然而並非用以限定本發明，任何熟悉本專業之技術人員，在不脫離本發明之技術方案的範圍內，當可利用上述揭示的技術內容作些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明之技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。
圖1為由頭髮菜所純化的藻藍素(Ba-PC)之吸收光光譜圖。
圖2為Ba-PC的螢光光譜圖。
圖3為Ba-PC的非變性PAGE(6%)的分析結果(A區)；以及Ba-PC的SDS-PAGE的分析結果(B區)，其中左邊泳道表示分子量標記，其包含200、116.25、97.4、66.2、45.0、31.0、21.5、14.4以及6.5 kDa，而右邊泳道顯示α次單元與β次單元的分子量分別是17.06以及22.69 kDa。
圖4為經Ba-PC粗抽液處理或未經Ba-PC粗抽液處理的樹突狀細胞的介白素-12p70的生成(圖4A)；經純化後的Ba-PC處理的樹突狀細胞的介白素-12p70的生成(圖4B)；經無內毒素的Ba-PC粗抽液處理的樹突狀細胞的介白素-12p70的生成(圖4C)之分析結果。
圖5為經與Ba-PC(75微克/毫升)培育的樹突狀細胞的表面標記的表現位準的分析結果，其中以LPS(0.1微克/毫升)培養的樹突狀細胞作為正對照組。
圖6A以及圖6B為經所指示的分子(LPS、PS-G或Ba-PC)處理的樹突狀細胞的介白素-12p40的生成之柱狀分析圖，未經處理的樹突狀細胞為負對照組；經LPS或PS-G處理的樹突狀細胞為正對照組。
圖7為經所指示的分子(LPS、靈芝多醣或Ba-PC)處理的樹突狀細胞的介白素-10生成的分析結果。
圖8為藉由異硫氰酸螢光素標記的聚葡萄醣的攝取分析樹突狀細胞的胞飲作用之能力的結果(*: p<0.05)。經LPS處理的樹突狀細胞為正對照組；未經處理的樹突狀細胞為負對照組。
圖9為混合淋巴細胞反應(MLR)中經Ba-PC處理的樹突狀細胞對於刺激CD4+ T細胞增殖作用之效果的分析結果，與未處理組(mock)相比，經Ba-PC處理的樹突狀細胞可誘發較高位準的未活化的C57BL/6小鼠所衍生的CD4+ T細胞之增殖作用(*: p<0.05)。經LPS處理的樹突狀細胞為正對照組。
圖10A至圖10C為CD4+ T細胞於使用經Ba-PC處理的樹突狀細胞刺激後48小時(圖10A)、72小時(圖10B)、96小時(圖10C)的干擾素-γ與介白素-4的生成之分析結果，其中如實施例4中所述的進行混合淋巴細胞反應後的經LPS處理的樹突狀細胞為正對照組，而未處理的樹突狀細胞為負控制組。
圖11A至圖11B為同實施例5中所述不同實驗組中的血清OVA特異性抗體之位準的分析結果，圖11A為IgG1與IgG2a以及圖11B為免疫球蛋白E(*: p<0.05,**: p<0.001)，其中EU是以所指出的抗體之ELISA單位任意地表示。
圖12為如實施例5中所述不同實驗組的小鼠的呼吸道發炎作用之分析結果，小鼠是以OVA單獨或OVA結合Ba-PC或PS-G透過i.p注射於第零、五、十、十五、二十天以腹腔注射免疫，接著在最後一次免疫後第24、48、72小時以經由呼吸道吸入方式進行OVA處理。犧牲小鼠並取得小鼠肺臟組織，以石臘進行包埋接續以H & E染色，結合PS-G處理的小鼠為正對照組；與Ba-PC處理與未處理的小鼠相比較，圖12上部分顯示僅以OVA處理的肺臟組織呈現顯著的支氣管上皮組織增厚、介白素細胞浸潤以及支氣管發炎，而圖12下部分為圖12上部分的圖式放大。
圖13A至圖13B為如實施例6中所述取自經OVA結合不同處理的小鼠的支氣管肺泡灌洗液的細胞組成之分析結果；圖13A顯示支氣管肺泡灌洗液的嗜酸性粒細胞的細胞數；圖13B顯示支氣管肺泡灌洗液的嗜酸性粒細胞百分比。
圖14為如實施例7中所述取自經OVA結合不同處理的小鼠的呼吸道過度反應作用之分析結果。
圖15A至圖15E為如實施例8中所述取自經OVA結合不同處理的小鼠的支氣管肺泡灌洗液的Th2細胞激素位準之分析結果，諸如：介白素-4(A)、介白素-10(B)、介白素-5(C)、趨化因子(D)以及介白素-13(E)(*: p<0.05,**: p<0.001,***: p<0.0001)。
圖16A至圖16E為如實施例9中所述取自各實驗組的脾臟細胞的Th2細胞激素位準之分析結果，諸如:介白素-4(A)、介白素-5(B)、介白素-10(C)、趨化因子(D)以及干擾素-γ(E)(*: p<0.05,**: p<0.001,***: p<0.0001)。
圖17為如實施例10中所述取自經結合Ba-PC或PS-G處理的小鼠中抗原特異性T細胞的增殖作用活性之分析結果(*: p<0.05)。

Claims (10)

  1. 一種由紅藻屬取得的藻藍素用於製造治療或減緩過敏性疾病的醫藥品之用途，其中由紅藻屬取得的藻藍素係取自於由選自於由下列者所構成的群組之藻類：屬於紫菜、頭髮菜、長紫菜之藻類以及其組合。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該過敏性疾病係選自於下列者所構成的群組：氣喘、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺疾病、以及鼻塞。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該由紅藻屬取得的藻藍素之劑量係介於每公斤0.1毫克至每公斤50毫克之間。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中由紅藻屬取得的藻藍素係取自頭髮菜。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥品係以口服、外用、注射、肌肉內注射、滴入鼻腔、皮下或靜脈內注射之方式投藥。
  6. 一種由紅藻屬取得的藻藍素用於製造調節哺乳動物中Th1與Th2免疫反應之間平衡的醫藥品之用途，其中由紅藻屬取得的藻藍素係取自於由選自於由下列者所構成的群組之藻類：屬於紫菜、頭髮菜、長紫菜之藻類以及其組合。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中哺乳動物係患有過敏性呼吸道疾病。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中過敏性呼吸 道疾病係選自下列者所構成的群組：氣喘、過敏性鼻炎以及過敏性肺炎。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中由紅藻屬取得的藻藍素係取自頭髮菜。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中有效劑量係介於每日每公斤0.1毫克至每日每公斤50毫克之間。
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US10675233B2 (en) * 2015-11-18 2020-06-09 Seiberg Consulting, LLC Compositions containing natural extracts and use thereof for skin and hair
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