CN102168068A - 一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自体免疫细胞制品制备技术，公开了一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法。在α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)和细胞因子组合IL-2、IL-7、IL-15的刺激下，从外周血中扩增Vα24NKT细胞，该扩增方法中的细胞因子组合有协同作用。本方法具有扩增效率高、简单可行、重复性好、特异性强的特点，获得的Vα24NKT细胞可以作为***的自体免疫细胞制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于扩增人Vα24NKT细胞的方法，以及由本方法获得的Vα24NKT细胞制剂。
发明背景
自然杀伤T细胞(Natural killer T cells，NKT细胞)是一类天然存在的介导先天性免疫和获得性免疫的免疫细胞。其主要特征包括TCRVα链高度保守；能特异性识别抗原递呈细胞(APC)表面MHC I样分子CD1d递呈的糖脂类抗原；活化后的细胞调节分泌多种细胞因子，直接或间接参与机体的免疫应答。
小鼠NKT细胞TCR库的α链恒定表达Vα14Jα18，β链为Vβ8.2、Vβ2或Vβ7，称为Vα14NKT细胞。人的NKT细胞和小鼠高度同源，TCR库的α链为Vα24JαQ，与之配对的β链为Vβ11，称为Vα24NKT细胞。NKT细胞主要分布于胸腺和肝脏，脾脏和骨髓次之，外周血少见。
NKT细胞的天然配体尚不清楚，但能与CD1d分子提呈的海绵源性合成糖脂α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)结合并被激活，分泌诸如IL-4、IFN-γ等细胞因子，同时表达颗粒酶、穿孔素、FasL和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，在诱导和维持肿瘤免疫应答、病原微生物、自身免疫以及免疫耐受中起着关键作用。
CD1d依赖性NKT细胞是CD1反应性T细胞中的主要部分。CD1蛋白是第三类抗原递呈分子，与MHC分子不同，CD1为非多态性，在细胞表面表达时无需功能性抗原加工相关转运体(TAP)。人CD1基因家族有CD1a至CD1e五种基因，根据氨基酸序列同源性，将CD1a、b、c归为I类，CD1d归为II类。CD1分子抗原结合槽为疏水性，能提呈多种脂类抗原。
α-GalCer是半乳糖基与神经酰胺酯通过α-联接形成的糖脂的总称，是已知的最有效的NKT细胞选择性抗原。从肿瘤患者外周血中分离所得的Vα24NKT细胞，由α-GalCer激活后在体内外均显示穿孔素依赖的抗肿瘤细胞毒活性。该细胞毒活性并不依赖于靶细胞上MHC-I类分子的表达，表明Vα24NKT细胞与传统NK细胞的效应机制不同。α-GalCer活化的NKT细胞产生的IFN-γ，及其诱导DC产生的IL-12，能增强NK细胞的天然抗肿瘤活性，以及CD8+T细胞的特异性抗肿瘤反应，因此在临床肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。
NKT细胞在人体内的含量极少，仅占全血细胞的0.02％左右，很难用于临床治疗。目前多采用α-GalCer荷载DC的方法来实现NKT的扩增。但DC体外培养操作复杂且花费较大。研究发现CD1d不仅表达在DC上，在NKT细胞的某一亚型或在单个核细胞及B细胞上也有表达，所以在抗原呈递细胞不参与的情况下，脐血和外周血的NKT细胞(TCR Vα24+TCR Vβ11+)也有良好的扩增效率。本研究通过从外周血单个核细胞中直接扩增NKT细胞。
发明内容
本发明要解决的是外周血中Vα24NKT细胞含量极低，无法满足临床应用的技术问题，以及现有的制备方法复杂、效率低的技术难题。寻找一种简单高效的NKT细胞体外扩增方法。使用该方法可以产生足够数量的Vα24NKT细胞。该Vα24NKT细胞不仅分泌IFN-γ和IL-4，而且穿孔素、颗粒酶表达率高。
本发明采用如下技术方案：采集并分离患者外周血单个核细胞，用含10％自身血浆的培养基重悬单个核细胞沉淀；加入糖脂抗原α-GalCer及细胞因子组合IL-2、IL-7、IL-15刺激，置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育，4天后补充含有IL-2的培养基继续培养7-14天，即可得到高细胞毒活性的Vα24NKT细胞。
所述的培养基为GT-551人淋巴细胞培养基或RPMI1640，并添加了10％自身血浆。所述的单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水清洗，低速离心后获得。所述的α-GalCer的终浓度为100ng/ml，细胞因子IL-2的终浓度为100IU/ml，IL-7和IL-15的终浓度均为10ng/ml。依据单个核细胞的浓度不同细胞继续培养时间约7-14天收集细胞。
本发明所用的原料和试剂除特别说明外，均为市售可得。
获得的Vα24NKT细胞可以作为***的自体免疫细胞制剂；Vα24NKT细胞，能应用于治疗多种肿瘤的药物中，无论该肿瘤是否表达MHC，而且还适用于治疗病毒性疾病的药物中。
本发明的有益效果是：本方法具有扩增效率高、简单可行、重复性好、特异性强的特点，获得的Vα24NKT细胞可以作为***的自体免疫细胞制剂。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本发明的方法。但本发明并不受其限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
实施例1：
1)外周血单个核细胞(PBMC)的制备
用血细胞分离机无菌条件下采集患者抗凝血，1500rpm/min离心10分钟后吸取上层血浆，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释血细胞沉淀，比重为1.077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1∶1.5的比例加入离心管中，2000rpm/min离心15分钟，小心抽取白细胞层，用生理盐水清洗两次，低速离心后得到外周血单个核细胞。从外周血中获得的单个核细胞主要包含单核细胞和淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞)，并且去除了红细胞和血小板。
2)高效Vα24NKT细胞的诱导扩增
将上述获得的外周血单个核细胞置于含有100ng/ml α-GalCer的RPMI1640培养液中，放入225cm2的培养瓶中，同时加入细胞因子IL-2(终浓度为100IU/ml)及IL-7、IL-15(终浓度为10ng/ml)，置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育，每24小时观察细胞形态及生长情况，并计数细胞。每2-3天补充含有IL-2的培养基继续培养7-14天，即可得到高细胞毒活性的Vα24NKT细胞。
影响淋巴细胞增殖和分化的细胞因子组合的实例包括IL-2、IL-7、IL-15和IL-18，可以仅用一种细胞因子或者两种或多种联用，尽管传统的扩增方法仅用IL-2同样能得到Vα24NKT细胞，但是经过我们的反复试验证明联用IL-2、IL-7、IL-15和α-GalCer刺激扩增的Vα24NKT细胞不仅分泌IFN-γ和IL-4，而且穿孔素、颗粒酶表达率高，增强其抗肿瘤作用。
所述的培养基为GT-T551人淋巴细胞培养液或RPMI1640，并添加10％自身血浆，因自体免疫细胞制剂制备过程中应尽量避免使用异种血清，而且胎牛血清价格昂贵，对照试验表明使用自身血浆培养的细胞在形态和功能方面无明显差异。自体免疫细胞治疗要求效应细胞数量达到1010-11级，经该方法扩增收集的细胞在培养10天后就可以获得109-10个自体Vα24NKT细胞，其数量可以满足临床的需求。
通过本发明的制备方法获得的人Vα24NKT细胞不仅分泌IFN-γ和IL-4，而且穿孔素、颗粒酶表达率高，能引起强效的抗肿瘤免疫反应，能应用于多种肿瘤，以及病毒性疾病。因此作为一种免疫治疗制剂临床意义重大。
实施例2：
1)Vα24NKT细胞的表型分析
吸取100μl扩增的NKT细胞，各加入20μl PE标记的抗CD8、CD56、CD161、TCRVα24单抗，FITC标记的抗CD3、CD4、TCRVβ11单抗，避光孵育15min，加入500μl PBS进行流式细胞仪双荧光检测。
结果：与单独用α-GalCer或单用某种细胞因子相比，联用α-GalCer与细胞因子组合刺激培养的Vα24NKT细胞绝对数明显增多。
2)Vα24NKT的细胞因子及细胞坏死相关因子的流式检测
取Vα24NKT细胞1×106，加入佛波酯(20ng/ml)、离子霉素(1μg/ml)和莫能霉素(2μg/ml)，在37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下孵育4h后收获细胞。按照细胞破膜固定剂使用说明书处理细胞，用流式细胞仪单荧光检测法分别测定细胞内细胞因子IL-4、IFN-γ阳性细胞含量。对细胞坏死相关因子的检测则直接取Vα24NKT细胞1×106按照细胞破膜固定剂使用说明书处理细胞，用流式细胞仪单荧光检测法分别测定Perforin、Granzyme B阳性细胞含量。
结果：α-GalCer与IL-15联用可促进Vα24NKT细胞表达Granzyme B，而IL-2和IL-7在这方面无明显作用。这三种细胞因子分别与α-GalCer联用均能促进Vα24NKT细胞表达Perforin。
Claims (5)
1.一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法，其特征在于，该方法为：分离纯化外周血单个核细胞，用含10％自身血浆的培养基重悬后，加入糖脂类抗原α-GalCer及细胞因子组合IL-2、IL-7、IL-15刺激。
2.根据权利要求书1所述的一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法，其特征在于：所述的单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离，并用生理盐水清洗，低速离心后获得。
3.根据权利要求书1所述的一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法，其特征在于：所述的培养基是指GT-T551人淋巴细胞培养液或RPMI1640，α-GalCer的终浓度为100ng/ml，细胞因子IL-2的终浓度为100IU/ml，IL-7和IL-15的终浓度均为10ng/ml。
4.根据权利要求书1所述的一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法，其特征在于：细胞置于细胞培养袋或培养瓶中培养，培养环境为37℃，5％CO2。
5.权利要求书1所述的Vα24NKT细胞，能应用于治疗多种肿瘤的药物中，无论该肿瘤是否表达MHC，而且还适用于治疗病毒性疾病的药物中。
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