TWI438281B - 包含重組人類乳突病毒(hpv)蛋白之組合物之製造方法及其在子宮頸癌上的用途 - Google Patents
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Description
本發明大體上有關於用於偵測HPV感染與HPV相關上皮細胞異常,特別是惡性前期和惡性上皮細胞病變的方法、試劑和檢驗試劑組。
子宮頸癌是第二常見的婦女癌症。雖然經由篩檢發現早期病變的方式已經減低子宮頸癌引起的死亡率與發病率,但全球每年仍診斷出500,000個侵襲性子宮頸癌的新病例,並有230,000個婦女死於子宮頸癌。早期發現和診斷是子宮頸癌病患存活的關鍵。
因某些特定上皮細胞受到人類乳突病毒(HPV)感染而引起上皮組織增生,在子宮頸癌的致癌機轉上扮演了重要的角色。在已經被診斷確定為子宮頸癌的病例裡,約99%的病例發現同時伴隨有HPV感染,並且患有經組織切片確認的鱗狀表皮病變(SIL)或子宮頸上皮內贅瘤(CIN)。HPV感染的主要途徑為性行為接觸,並特別好發於年輕女性。目前全球約有2千萬性行為活躍的男性與女性受到感染。在所有受感染族群中,大約有1%的人有外生殖器病疣;以及4%的女性有子宮頸癌前期發展徵兆,例如從低度鱗狀表皮病變(LGSIL)到高度鱗狀表皮病變(HGSIL)不等。這些病變大多出現在年紀約35-40歲的女性,並且有極大的風險發展為侵襲性癌症。
在目前已經發現的超過上百種基因型人類乳突病毒中,只有少數種類的HPV,例如HPV-16、18、31、35、45、51、52及56等等會有將經HPV感染的生殖組織病變轉變成侵襲性子宮頸癌的高風險性。感染絕大多數種類的HPV,如HPV-6及11等等只會有短暫的症狀而並不會引起永久性的生殖組織變異,轉變成侵襲性子宮頸癌的風險極低。然而,子宮頸癌的發生是多步驟的過程,無法單就感染特別種類的HPV來解釋。高風險族群持續性的HPV感染是必要條件,但並不表示就不需要其他導致子宮頸癌發生的條件。研究發現年輕女性族群常有HPV感染;然而臨床研究發現,大多數潛在型或無症狀感染高風險型HPV以及早期子宮頸上皮內贄瘤病變(CIN1)通常是自限(self-limited)以及自動復原的。長時期持續性感染某些高風險型HPV與進階型子宮頸上皮內贄瘤病變(CIN2/CIN3)的發生,以及/或是侵襲性癌症的發生,彼此間有密切的關係。
另外一項導致腫瘤生成的重要因素是HPV將DNA基因體嵌入宿主的基因體中,這種情況經常導致一早期病毒基因E2的開放閱讀框架受到擾亂,進而引起過量表現兩種重要的致癌蛋白質E6和E7,並引起宿主細胞轉型。由於絕大多數子宮頸癌病例都含有高風險性HPV基因組,檢測HPV感染就變得很重要,特別是對那些長時期感染高風險型HPV的病例。其他因素以及遺傳上的變異或次要遺傳變化,也在侵襲性子宮頸癌的進程跟發展上也可能很重要。其中包括基因重組、病毒基因鑲嵌到宿主細胞染色體中、染色體重組、失去重要的常在型異合子(constitutional heterozygosity)以及初始致癌基因的活化等等。
在過去,對子宮頸癌的篩檢為使用傳統細胞學上的子宮頸抹片檢查(papanicolaou smear),如有異常抹片再接著進行***鏡和/或合併組織學上的切片做檢查。細胞學上的篩檢已大幅降低子宮頸癌的死亡率。然而,受限於主觀上的檢查標準判讀,子宮頸抹片檢查有著難以獲得檢體、不同檢查深度結果不一致、高比率的偽陰性(高達20%)和偽陽性、需要高度專業訓練的設備與人員以及無法檢測出眾多的HPV感染人口等缺點。我們需要更有再現性的檢驗方法來改善目前的篩檢方法,並避免將不需要的醫療介入與心理層面的壓力帶給那些受感染的女性病患。核酸檢查方法,例如「DNA雜交捕獲(DNA Hybrid Capture)」已經發展一段時間,但是由於價格昂貴、操作過程、所需設備、儀器以及高度訓練人員等因素而未臻理想。因此需要低價、簡單、敏感度及專一性高,可以在一般臨床檢測實驗室或醫師診間常規使用的檢測方法。
嘗試利用酵素結合免疫吸附法(ELISA)來偵測人體中出現的HPV抗體通常因為檢驗方法的敏感度太低而無法發展成具商業用途的診斷方法。這些ELISA檢驗方法都大多針對一種單一病毒蛋白質或是短肽鍊斷片,然這些蛋白質或短肽鍊斷片並無法跟人類的抗體做良好交互作用或緊密而專一的接合。ELISA檢驗的專一性以及敏感度過低,以致於即使使用已經證實患有HPV相關性侵襲性子宮頸癌病患的檢體做試驗,也只有53%的病患檢體被檢測出陽性結果。因此,目前並沒有可用於臨床檢測的成功ELISA檢驗方法。
因此,有必要發展一種可供早期偵測HPV感染以及幫助診斷子宮頸癌的檢驗方法和試劑。
本項發明的實施例主要有關於各種有效偵測一般型HPV感染以及高風險型HPV感染的方法、偵測試劑、試劑套組、多胜肽、重組蛋白質、抗體和核酸。在一實施例中,一種篩檢感染人類乳突病毒之人類受檢者的方法包括取得一人類受檢者的臨床檢體、取得由一乳突病毒初期基因所編碼的一第一重組蛋白質,以及取得由一乳突病毒晚期基因所編碼的一第二重組蛋白質。此方法進一步包含實行一種或多種免疫檢驗方法於該人類受測者的臨床檢體上,使用該第一重組蛋白質偵測出現在該人類受測者中的抗第一重組蛋白之抗體,以及使用該第二重組蛋白質偵測出現在人類受測者中抗第二重組蛋白的抗體。
在其他的實施例中,一種篩檢感染人類乳突病毒之人類受測者的方法,該方法包含取得該人類受測者之臨床人類檢體,使用核酸雜交檢驗方法偵測該人類受測者之臨床檢體中是否出現乳突病毒基因體,以及對該臨床檢體上使用一種或多種免疫檢驗法。可用同一檢體或來自於同一個受測者的不同檢體來獨立地或同時執行這些一種或多種免疫檢驗法或核酸雜交檢驗方法。這些一種或多種免疫檢驗方法可以使用初期乳突病毒蛋白的一第一重組蛋白質來偵測出現在臨床檢體中的抗初期乳突病毒蛋白抗體或該初期乳突病毒蛋白。此外,可在使用該第一重組蛋白執行的免疫試驗中,單獨或同時利用該晚期乳突病毒蛋白之第二重組蛋白質來檢驗出現在臨床檢體中的抗晚期蛋白質抗體。
在另一實施例中,提供一種篩檢感染高風險性人類乳突病毒之人類受測者的方法。此方法包括:取得該人類受測者之臨床檢體;從含有一第一表現載體的一第一蛋白表現系統中純化出一第一重組蛋白,其中該第一載體具有一部份對應於初期乳突病毒基因全長核酸序列的核酸序列乳突;以及從含有一第二表現載體的一第二蛋白表現系統中純化出一第二重組蛋白,其中該第二載體具有一部份對應於晚期乳突病毒基因全長核酸序列的核酸序列乳突。進一步,使用該第一重組蛋白執行一種或多種免疫檢驗方法來偵測臨床檢體中是否出現抗病毒致癌蛋白質抗體或病毒致癌蛋白質,以及利用該第二重組蛋白質偵測臨床檢體中是否出現抗病毒外殼蛋白質抗體或該病毒外殼蛋白質。
本項發明的實施例主要提供各種有效偵測一般型HPV感染以及高風險型HPV感染的方法、檢驗試劑、試劑套組、多肽鍊、重組蛋白質、抗體和核酸。例如,利用文中所提到的核酸雜交方法和免疫檢驗方法來偵測HPV DNAs、基因體、初期病毒蛋白質、晚期病毒蛋白質、致癌蛋白質和/或外殼蛋白質,可以作為早期臨床HPV感染的篩檢。另外也可以作為HPV相關的子宮頸癌腫瘤、因HPV感染引起的上皮細胞變異、癌變前和惡性的HPV相關上皮細胞病變以及富有發展成為HPV相關子宮頸腫瘤和子宮頸腺癌風險等病例的診斷。文中所描述的方法可以單獨使用或和傳統的細胞學子宮頸抹片檢驗或組織學檢驗合併使用。且其結果可以與病人的後續情況做追蹤比較。
第1圖顯示一種篩檢受乳突病毒感染之人類受測者的方法,即方法100。在步驟110,從一人類受測者採集一臨床檢體。這項臨床檢體可能包含,但不限於生殖道拭樣、一般體液(general fluid)、子宮頸的細胞、子宮頸部組織、子宮頸拭樣、體液(body fluid)、血清、血、尿液、病變部位以及腫瘤等等。臨床檢體可能藉由各種方法獲得。例如可由臨床醫院提供來自人類正常個體或病患的生殖道拭樣,且附帶抹片檢查與細胞學檢查結果與臨床檢體相關的人口統計資料等。
在步驟120,收集一種或多種由乳突病毒初期基因和/或晚期基因所編碼的重組蛋白質。這些人類乳突病毒可以是高風險型HPV,或低風險型HPV,如HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59和HPV-68、HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-53、HPV-54、HPV-55和HPV-56等。高風險性人類乳突病毒包括,但不限於HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59和HPV-68等。低風險性人類乳突病毒包括,但不限於HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-53、HPV-54、HPV-55和HPV-56等。
乳突病毒屬於擁有DNA基因體的DNA病毒,其是一種無包膜病毒(non-enveloped viron),擁有二十面體的外殼(icosahedral capsid)。雙股環狀HPV DNA基因體包含了一晚期基因編碼區、一初期基因編碼區以及一非編碼上游調控區,該非編碼上游調控區具有多個供各種轉錄因子控制初期與晚期基因表現的結合位置。位於晚期基因編碼區中的兩個分開的開放閱讀框架編碼著病毒外殼蛋白質L1和L2。外殼蛋白質L1是主要的外殼蛋白,其高度保留在各種不同的HPV型中。在初期基因編碼區中的八個開放閱讀框架編碼著八種病毒初期蛋白,分別命名為E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7和E8。初期蛋白E6和E7是使宿主細胞不會凋亡以及促使細胞轉型,可以長久為病毒複製和生存所用的關鍵性致癌蛋白質(oncoproteins)。
感染高風險型HPVs需要兩種初期病毒蛋白質E6和E7,此兩種蛋白質都為致癌蛋白,因為他們在試管試驗(in vitro)中會將細胞轉型以及為維持惡性細胞生存所需。抑制E6和E7蛋白在癌變前或子宮頸癌組織中的表現可以阻斷侵襲性癌症的發展。在宿主組織裡,E6和E7致癌蛋白分別不利地抑制住內生性的宿主細胞調控蛋白質「p53」與「視網膜胚胎母細胞瘤(Rb)抑制蛋白」的活性,而引起抑制細胞凋亡機制與細胞循環失調,導致產生子宮頸癌。E6致癌蛋白質會與p53結合,而引起p53蛋白質分解。p53為一種保護DNA不受損害以及調控細胞凋亡機制的細胞因子。,E6致癌蛋白質藉由減少p53蛋白質的數量使腫瘤細胞免於死亡。E7致癌蛋白質結合到Rb蛋白上而引起Rb蛋白的失調,進而干擾正常細胞循環,引起細胞的增生。E7致癌蛋白進一步藉由與週期素依賴性蛋白質激酶抑制蛋白質p21的作用使細胞控制不穩定。並發現在已轉型的生殖組織中會持續製造HPV E6和E7致癌蛋白。這些交互作用會將細胞設定在控制宿主細胞增生與分化的階段(即,轉型)。第一步是將正常細胞轉變為癌前細胞(pre-neoplastic cell),而最終成為惡性癌症的完全表現。
另外一項參與腫瘤發展進程的事件就是HPV DNA嵌入宿主基因體中,其經常會擾亂E2的開放閱讀框架,引起E6和E7致癌蛋白的過度表現以及可能造成宿主基因體的不穩定。其他的輔因素和突變事件也可能在侵襲性子宮頸癌病理機制上扮演重要角色,可能包含染色體重排(chromosomal rearrangements)、失去重要的異合性(constitutional heterozygosity)和原致癌基因(proto-oncogene)的活化等。
HPV-16和HPV-18都是最常見的高風險型HPV,其會導致侵襲性子宮頸癌,並可使細胞培養中的人類角質細胞不死。超過50%的子宮頸癌病例伴隨有HPV-16的感染,大部分導致鱗狀上皮細胞瘤。HPV-18的感染多導致腺癌。有些研究指出,相對於鱗狀上皮細胞癌所導致的癌症來說,發生在子宮頸組織的腺癌會產生更具侵襲性與較不好後果的癌症。此暗示著比起來說,感染HPV-18的個人的預後可能遠差於受其他HPV感染的人的預後。
為了證實E6和E7在維持細胞惡性表現型中扮演活躍角色且可能為理想的抗-基因治療的標的之假說;研究顯示在子宮頸癌細胞株與初代腫瘤培養組織中標靶目標為HPV-16 E6和E7基因之硫代磷酸酯寡聚去氧核苷酸(phosphorothioate oligodeoxynucleotides,oligos)的抗增生效應。這些獨特的抗增生效應說明HPV-16 E6和E7序列在惡性腫瘤生長特性中扮演了重要角色,並可能是理想的抗-基因治療標的。在上皮幹細胞中,E6和E7兩種病毒致癌基因的表現為起始以及維持子宮頸致癌機轉的必要因子,並會導致細胞內p16INK4a蛋白質的明顯過量表現。
亦發現不同型的HPV-16會產生不同侵襲力的子宮頸癌。例如,亞-美洲的HPV-16變異型比歐洲的HPV-16變異型更容易致癌。研究也顯示亞-美洲和非洲的HPV-16變異型比起歐洲的HPV-16變異型更會產生侵襲性子宮頸癌。這些較為侵略性的變異型可能與病毒所製造的致癌蛋白核酸序列變異有關。相對於歐洲HPV-16變異型的E6蛋白質而言,亞-美洲HPV-16變異型的E6蛋白顯示對於角質細胞有更強的轉型作用以及壓制p53表現作用。而這些E6蛋白質在序列上的差異不過幾個氨基酸而已。因此在診斷高風險性病患的侵襲性子宮頸癌進程時,重要的不僅是要分別出感染患者的特別HPV型,還要分辨出感染的是何種HPV變異型。
在一實施例中,可用於文中的初期基因包含乳突病毒E6基因與乳突病毒E7基因等。在另一實施例中,可用於文中的晚期基因可以包括乳突病毒L1基因與乳突病毒L2基因等。
本發明的其中一態樣提供數種重組蛋白質,例如一種包含HPV致癌蛋白質全長序列的雜交蛋白質(hybrid protein);例如含有全長的E6、E7和/或L1多肽鍊序列。這些蛋白質因為在蛋白質純化過程中發生不想要的結集情形、蛋白質不安定、低表現量、已純化蛋白的免疫反應低等因素而難以收集與純化。例如,很多初期E6致癌蛋白包含許多半胱胺酸(cysteine),因此要形成正確結構的初期E6致癌蛋白需要適當地形成很多雙硫鍵。此外,某些使用初期E6和E蛋白之短肽鍊的免疫方法其特異性以及敏感度都極低,不適合作為商業用途的診斷工具。
在此描述的一種或多種重組蛋白質可以在各種適合的系統中表現,例如細菌表現系統、病毒表現系統、酵母表現系統、哺乳動物細胞表現系統,例如該領域中所熟知的大腸桿菌、酵母、桿狀病毒和/或哺乳動物培養細胞株。雖然多肽鍊可以經由其他方法獲得,本發明實施例所提供一或多種重組蛋白質大多(或接近)為他們的自然型態,在免疫分析方法中,是與自HPV感染之人體組織中取得的抗體所欲結合的較好型態。
在步驟130,一項或多項的免疫檢驗方法被使用在人類臨床檢體上。文中發展的一種或多種免疫檢驗方法,能為這些方法本身提供高品質且適當純化的HPV初期和晚期基因編碼之重組蛋白質,因此這些免疫檢驗方法對於篩檢HPV感染擁有非常高的敏感度和特異性(specificity,或稱專一性)。
此一種或多種免疫檢驗方法包括,但不限於ELISA(酵素連結免疫吸附法)、乳突病毒蛋白質抗原檢驗法、抗乳突病毒蛋白質抗體之抗體檢驗法、乳突病毒免疫複合物檢驗法、蛋白質晶片分析法、放射性免疫沈澱法、快速通透膜免疫層析法、快速柱狀免疫層析法等等。這些一種或多種免疫檢驗方法可以是非侵入性的,並且需求最少或不需其他器具。執行免疫試劑法的基本技術可以在「抗體:實驗室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual)」(Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.1989)、「分子選殖(Molecular cloning)」(A Laboratory Manual,eds.Sambrook,Fritsch and Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)以及其他書籍和手冊中見到。
例如,這些一種或多種以免疫學為基礎的檢驗方法可能包含已純化的乳突病毒蛋白質塗覆在如微孔盤底部或膜和/或晶片上的抗體檢驗方法。沒有被蛋白質覆蓋的表面可以使用不與抗體結合的蛋白質加以覆蓋。然後欲進行測試的檢體,例如內含抗HPV病毒或HPV相關蛋白質之抗體的檢體(人類檢體),可藉著與塗覆於表面上的已純化乳突病毒蛋白結合而結合到該表面。這些結合了抗體-純化乳突病毒蛋白質的複合物可以藉由二級抗體以及許多商業上可購得的呈色、冷光或螢光物質等偵測系統偵測之。二級抗體的其一範例是結合有山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)的二級抗體,如抗人類免疫球蛋白的抗體(特別是igG、igA等)。最終的結果可以在微孔盤閱讀機下讀取,或如果使用呈色物質的話,則可以肉眼觀察。
另一例子為抗原檢驗法,係將一級抗體塗覆在一表面上,該一級抗體可為例如與目標抗原間有親合力的捕捉抗體;該表面可以是例如微孔盤底面、膜或晶片表面等。目標抗原可例如由HPV病毒基因,例如初期基因或晚期基因等所編碼的乳突病毒蛋白質、致癌蛋白質或外殼蛋白質。在覆蓋住未結合有抗體的表面部分後,將欲分析的臨床檢體施用並結合到捕捉抗體上形成免疫複合物,然後此複合物可以被其他一級抗體或偵測抗體藉由結合到目標抗原上的方式而測得。因此,此兩種一級抗體或捕捉抗體和偵測抗體的配對能與目標抗原交互作用,形似三明治。捕捉抗體可相同或不同於該偵測抗體,只要兩種抗體都可以特異性地結合到如HPV病毒蛋白、HPV致癌蛋白、外殼蛋白等目標抗原上即可。
隨後,三明治狀的抗體-抗原複合物可以被二級抗體偵測到。二級抗體對於偵測抗體具有親合力,且其有助於利用藉由標準免疫複合偵測系統並使用呈色、冷光、螢光和其他不同物質所進行的測量。最終的讀取或視覺結果可以經由附有適當光吸收閱讀器來讀取或直接以肉眼判讀,並將結果與對照組比較。陽性結果顯示目標抗原結合到一級抗體、捕捉抗體和偵測抗體上。因此目標抗原出現在檢體中。相反的,陰性結果顯示沒有目標抗原結合到一級抗體,因此檢體中沒有目標抗原。
這些一種或多種免疫檢驗方法可以用來偵測至少三種我們所感興趣的目標蛋白質;包括,但不限於抗原、抗體和抗原/抗體複合物(也就是分別為以下所稱的抗原測試、抗體測試和抗原/抗體免疫複合物測試等)。
這些一種或多種免疫檢驗法形式可以是微量盤形式(如32孔、48孔、96孔)、豎立式或橫向通透膜快速測試、多點或多重蛋白質晶片等。這些檢驗分析原理與之前所描述的相同,除了偵測系統會隨著為了分析不同結果讀值所選用的物質而有所改變,或是特別為該些試驗所設計的設備型式有所差別。此外,為某一種形式之其中一種免疫檢驗方法所發展的實驗步驟、實驗條件、結合特異性等也適用於其他不同形式的相同或不同免疫方法,和/或適用於一相同或不同形式的不同免疫方法中。
例如,在蛋白質晶片檢驗法中,將被蛋白質塗覆/結合的表面可以是,例如經過化學處理表面的玻璃或是膜,以使捕捉試劑或蛋白可共價或非共價地結合至該表面。通常使用具有微小點真的點印機器沾取溶於適當緩衝液中的捕捉試劑,如重組蛋白、抗原、抗體或其他蛋白質,以將此類蛋白或抗體結合至已經處理過的表面。如之前描述過的微孔盤表面般,這些點上的捕捉蛋白或抗體穩固地結合到蛋白質晶片的化學處理表面上並留在該處理過的表面上,並且和目標蛋白質、抗體或抗原做緊密結合,即使為了要移除非特異性結合的蛋白質而經過數次清洗亦然,隨後與偵測系統中和Cy3或Cy5連結的二級抗體來偵測之。可利用微陣列掃瞄儀來測量該些點/沾濕區塊的影像強度以獲取和測得該特異性結合的偵測結果。
不止一種蛋白質可以被固定在經過處理的表面,因此可以特異性地捕捉目標蛋白質、抗體或抗原。於是此方法可以捕捉單一檢體中的多種蛋白或標的,並將至少一種或多種蛋白質或標的捕捉到蛋白質晶片表面並偵測得到;展現出雖然只是執行一種檢驗方法,其卻是多樣檢驗方法的結合。因此,和其他試劑形式做比較,蛋白質晶片檢驗方法只需要少量檢體,如少至50 μl或甚至少於10μl便可提供高敏感度和多重樣式的優點。可以用最少量檢體做多樣結合活性偵測的此特點,能在檢體的量非常有限時,也可以對某些疾病組織做多種檢驗。
另外的例子,在快速免疫測試中,可以使用以薄膜作為用來固定抗體或是蛋白質的表面。視標的蛋白質、抗體或抗原以及在含有標的蛋白、抗體或抗原之檢體中的非特異性蛋白質的種類不同,免疫測試的結合力也有所不同。至少有兩種快速免疫測試的形式可以使用,直立式快速免疫檢驗和橫式快速免疫檢驗。
直立式快速免疫檢驗是在一種具有薄膜的裝置中執行,其中該薄膜係作為其上可塗覆或點漬一捕捉試劑的捕捉/結合表面。這項裝置更包含一位在薄膜下方的基座,可以讓檢體以及檢驗試劑流經該薄膜。檢體中任何會與捕捉試劑做專一***互作用的標的蛋白、抗體或抗原都會被捕捉並停留在薄膜表面,即使經過幾次用以移除非專一性結合物的沖洗也不受影響。與HRP結合的二級抗體可以應用在膜表面來偵測任何停留在膜表面的蛋白質-抗體複合物,以及可使用呈色物質做視覺呈現。
橫式快速免疫檢驗是一種單一步驟測試法,使用一種已於其表面上的特定位置施用/塗覆有捕抓蛋白或抗體的膜狀長條。此測試唯一步驟為將含有目標蛋白或抗體的檢體與一結合有黃金粒子的偵測抗體混合,直接將該結合的混合物施用至膜狀長條使檢體液橫向流經此膜狀長條,直到抵達該膜狀長條表面上的一指定位置為止。此步驟會形成該捕捉-目標-偵測蛋白質-抗體免疫複合物並滯留在塗覆有捕捉蛋白或抗體的指定位置上。可以在這些指定位置看見陽性結果,並且不需要沖洗或分離的動作,也就是所謂的單一步驟。此測試的整個過程只需要幾分鐘,如少於15分鐘,因此也叫做單步驟快速測試法。
在步驟140,可偵測人體中一種或多種抗重組蛋白抗體和/抗原的存在。生物檢體中的任何抗體結合到一種或多種重組蛋白,利用一種或多種重組蛋白使檢體中的任何HPV相關蛋白/抗體結合到本文中所獲得的抗體上,和/或檢體中任何HPV相關蛋白免疫複和物結合到一種或多種本文中所獲得的重組蛋白和抗體,都顯示HPV感染蛋白出現在檢體中。
此處所述一種或多種使用來自HPV初期和/或晚期基因的純化重組蛋白和本文中所獲得之抗體的免疫檢驗方法都可當成是一種顯示是否有HPV感染的可靠指標。此外,還可偵測出HPV相關惡性細胞或惡化前的細胞轉型。本發明其中一項最有用的態樣為用於診斷子宮頸癌,包括鱗狀細胞和腺癌,以及致癌性HPV感染所引致的上皮細胞變異,包括細胞質泡化(koilocytosis)、過度角質化(hyperkerotosis)、包括上皮細胞瘤形成或上皮細胞病變在內的多種癌前症狀、重度上皮增生不良和侵襲性或惡性癌症。
初期E6和E7基因所編碼的E6和E7致癌蛋白在腫瘤細胞中持續表現;如將這些基因表現關閉,會使惡性表現型反轉。因此,初期E6和E7基因產物似乎是腫瘤-特異性抗原,以及可作為免疫篩檢方法中用來篩檢這些蛋白質/抗原或其對應抗體的可能標靶或探針。這些致癌蛋白也可以是用來發展疫苗或免疫治療法的標的,進而控制因HPV所導致的腫瘤。
例如,已在與HPV相關的腫瘤中發現針對E6和/或E7致癌蛋白的抗體。由於E6和E7致癌蛋白在子宮頸癌細胞中持續表現的特性,E6和E7致癌蛋白似乎是抗體產物的天然目標。研究已經發現抗HPV-16 E6和E7致癌蛋白的IgG和IgA有高度的疾病相關性。與非癌症對照組相比下,抗E6和E7致癌蛋白抗體在子宮頸癌病患血清中濃度相當高。更甚者,即使在較低量時,這些抗體也可以被免疫檢驗方法偵測得到。
執行偵測抗初期基因(如E6和E7)和晚期基因(如L1)編碼蛋白之抗體的抗體測試和抗原測試。例如,為了偵測人體中的E6、E7或L1抗體,分別使微孔盤式免疫檢驗方法中用來偵測抗-E6抗體所需的多種濃度之E6、E7、L1重組蛋白最佳化。半量化E6、E7或L1抗體量所需的最佳反應時間、試驗敏感度和變化性以及條件控制都已找出,而且敏感度和特異性可以被計算出。在一實施例中,本文所述之一項或多項免疫抗體測試方法的敏感度落在微克範圍內,如落在毫微克或微微克的範圍內。本文中所述之一項或多項免疫抗體測試方法的特異性(specificity)都在約50%的範圍或更高,例如約70%或更高,約85%或更高,約90%或更高,約95%或更高,約99%或更高。
另一個範例中,為了偵測人體中出現的E6、E7或L1抗原,使用E6、E7或L1重組蛋白來製造出抗E6、E7或L1的多株抗體和單株抗體,並證實這些抗體與抗原之間會結合而形成免疫複和物。已找出半量化E6、E7或L1抗體濃度所需的最佳反應時間、試驗敏感度和變化性以及測試條件,而且敏感度和特異性可以被計算出。在一實施例中,本文中所述之一項或多項免疫抗體測試方法的敏感度落在微克範圍內,如落在毫微克或微微克的範圍內等。本文中所述之一項或多項免疫抗體測試方法的特異性都在約50%的範圍或更高,例如約70%或更高,約85%或更高,約90%或更高,約95%或更高,約99%或更高。
根據本發明的一項或多個態樣,用來偵測如E6、E7、L1等HPV蛋白或偵測由於HPV感染引起之免疫反應的免疫檢驗方法,可採用諸如快速ELISA篩檢方法、單步驟快速免疫篩檢方法和多蛋白質晶片檢驗方法等形式或這些形式的結合來執行之。本發明實施例提供一種或多種發展用來偵測HPV初期基因(如E6和E7)和晚期基因(如L1)所編碼之病毒蛋白的檢驗方法,包括抗體、抗原或免疫複和物檢驗方法。此外,針對E6、E7、L1蛋白或抗體所發展出來的抗體、抗原或免疫複和物檢驗方法,可以是如微孔盤的形式,也可以轉變成用來直接測量HPV感染所導致E6、E7、L1蛋白或抗體的單步驟免疫色層分析方法。
單步驟免疫色層分析法是一種簡單、快速和容易操作的檢驗方法,其係為了重點照護用途所發展出來的。一般來說,僅需簡單地混合一待測檢體和本文中所述之抗體,並將該混合物施用或已經被固定在表面(如玻璃表面),在最佳反應溫度下(如室溫)反應一段預定的反應時間(如數分鐘)。取決於偵測抗體的品量以及測試反應條件,來縮短反應過程以求方便。因此,具短暫等待時間的快速免疫測試可以被實行,而且這樣的試驗通常被設計成可用肉眼判斷結果,而不需要特別的偵測儀器。
在另外一範例中,用來偵測如E6、E7、L1等HPV蛋白質或其對應抗體的蛋白質晶片免疫檢驗方法也可以用來快速偵測HPV感染。此外,蛋白質晶片免疫檢驗方法也可以被設計成能快速且大量地偵測多種不同的蛋白質或抗體目標。如文中所提供的蛋白質晶片免疫檢驗方法可用來診斷HPV感染和迅速偵測某些子宮頸癌生物標記。一般來說,首先,藉由標準表面化學方法在晶片表面上共價鍵結抗體、蛋白質或抗原,這些抗體、蛋白質或抗原對於檢體中的目標蛋白質都具有結合親和性。
例如,本文所述的純化E6、E7、L1重組蛋白會接合到晶片表面,並能選擇性地偵測到該溶液中的E6、E7、L1抗血清。如此一來,蛋白質晶片免疫檢驗方法可用來快速判讀檢體中是否有因HPV感染所引發的抗體。同樣地,藉由在晶片上接合抗HPV初期基因及/或晚期基因(如L1、E6和E7)編碼之病毒蛋白的抗體或抗血清,蛋白質晶片免疫檢驗方法可用來快速判讀檢體中是否有因HPV感染所引發病毒蛋白。
另外一個例子,為了使用蛋白質晶片免疫檢驗方法診斷HPV感染,可將一捕捉試劑分別地黏接到一個或多個晶片表面上的各種位置。或是,捕捉試劑可以被黏接到不同位置而形成多重形式(multiplexed format),而可同步偵測在同一檢體中不同的HPV感染相關蛋白質。可製造由全部種類、品系或變異株HPV病毒得來的蛋白質或抗體所構成的蛋白質晶片陣列,來篩檢所感染之HPV的表現型。因此,蛋白質晶片檢驗方法可以是非常強大的篩檢工具,能設計出適合用於執行用來篩檢或診斷HPV感染的多種或所有免疫檢驗方法的蛋白質晶片或試驗/分析法。蛋白質晶片試驗法中的捕捉試劑包括,但不限於HPV初期基因和晚期基因編碼的E6、E7和L1等重組HPV病毒蛋白以及抗HPV初期和/或晚期基因(如E6、E7、和L1)編碼之HPV病毒蛋白的抗血清或抗體。一種或多種蛋白質晶片的檢驗條件已被最佳化/標準化,並已於臨床檢體上進行測試。來自ELISA免疫檢驗方法的結果也被拿來和蛋白質晶片免疫檢驗方法的結果作比較。由於蛋白質晶片免疫檢驗法使用雷射作為光源以及較好的器械設計和較佳的偵測範圍等原因,蛋白質晶片免疫檢驗方法可提供比微孔盤免疫檢驗方法更好的敏感度。較高的試劑敏感度和較好的偵測儀器將能偵測出該些處於HPV感染早期或是疾病發展早期之人體內的極低量抗原或抗體,以提供更好的預防和疾病管理。
免疫檢驗若得到陽性結果則證實臨床檢體中可能包含HPV相關蛋白或抗原,表示臨床檢體目前受到HPV感染。藉由偵測過去或目前HPV感染的免疫反應和/或由於目前或過去HPV感染所誘導出的抗體,而可偵測出仍然存在於該臨床檢體中過去的HPV感染。進一步,此處所提一種或多種免疫檢驗方法亦適合藉由使用從高風險型HPV之基因所得到的重組蛋白質來偵測一般型HPV感染以及高風險型HPV型感染。
根據執行偵測從HPV初期基因和晚期基因衍生出之抗體或病毒蛋白的免疫試驗方法的結果,從同一檢體中(也可使用多於一個檢體),一致的陽性結果可進一步確認HPV感染。針對人體的臨床狀況而言,亦發現本文中所述之一種或多種免疫檢驗方法的共同陽性結果與取得該些臨床檢體之人類受測者的臨床症狀非常相符。例如,在大量的臨床檢體上獲得和發現的一致陽性結果係與組織學上判斷的子宮頸上皮內贄瘤病變(CIN)階段、抹片確認的鱗狀表皮病變時期或程度/階段、演變為侵襲性癌症、腫瘤和/或腺瘤的進程跟階段、出現不明的非典型的腺體細胞(AGUS)以及出現不明鱗狀上皮細胞異常(ASCUS)等情況高度相符。
用來偵測HPV初期基因和晚期基因衍生蛋白的兩蛋白質檢驗方法出現不一致的陽性結果,可能表示是一般型HPV感染,例如感染了不同型HPV,以及在兩個針對初期或晚期病毒蛋白的試驗中所使用的其中一種蛋白質有交叉反應。例如,已經發現有因HPV初期基因之病毒蛋白間的交互反應所產生的陽性結果,但陰性結果則無,且對於來自HPV晚期基因的病毒蛋白間沒有交叉反應性,反之亦然。
在步驟150,可選擇性地對該臨床檢體執行額外的核酸檢驗方法、細胞學測試法和/或組織學測試法。可在臨床檢體上所使用,以偵測人類臨床檢體中是否存在乳突病毒基因體的核酸雜交檢驗方法包括聚合酶連鎖反應、核酸雜交方法、DNA晶片檢驗、放射線核酸雜交和偵測方法以及非放射線核酸雜交和偵測方法等。
本文中所描述的方法也可以包含對臨床檢體實行細胞抹片檢查,並且將細胞抹片檢查結果與一種或多種免疫檢驗方法的結果做比較。由於HPV無法有效地培養且血清學檢驗法的臨床效果不佳,因此HPV感染診斷幾乎完全仰賴分子工具。除了文中所述之一或多種免疫檢驗法以外,還可使用如PCR等核酸放大技術、以核酸序列為基礎的增幅法以及進階核酸技術,包括雜交捕捉技術(其一範例是Digene hybrid capture II test商品,購自Digene股份有限公司,Gaithersburg,MD)作為HPV感染的分子篩檢工具。
一般來說,雜交捕捉II HPV DNA測試法(Hybrid Capture II HPV DNA Test)是一種用來偵測高風險型HPV的試管內核酸雜交檢驗方法,其使用針對13種高風險型HPV的RNA探針。此種雜交捕捉II HPV DNA測試法係藉由將HPV特異性DNA探針塗覆到微孔盤上來放大RNA:DNA雜交複合物,並使用一偵測抗體(抗DNA/RNA雜交物的單株抗體)來偵測RNA:DNA雜交複合物,隨後使用化學發光物質來定量偵測出存在於檢體裡之13種高風險性HPV的DNA。
因此,它需要複雜的儀器設備和經訓練的人員來實行這種測試法,並使用特別的微孔盤閱讀器和此微孔盤閱讀器專用的軟體來分析資料。這種雜交捕捉技術(Digene tests)的實用性受限於複雜的執行技術,因其需要複雜的儀器設備和訓練人員,以及在一般群眾與早期HPV感染個體中,可能由於待測檢體中的DNA很容易在採樣與檢體處理過程中被降解或遺失而造成偽陽性和偽陰性的機率非常高。然而,雜交捕捉測試可以用來確認文中所述之一種或多種免疫檢驗方法的結果。該領域中已知的額外核酸檢驗、細胞學測試和/或組織學測試可以用在臨床檢體上,以進一步證實一種或多種免疫檢驗的結果。
文中所述之一種或多種免疫檢驗方法,目標在於提供使用者可在短時間內使用的方便程序以及簡單的儀器或完全不需其他的儀器。比較各種免疫檢驗方法的結果,核酸雜交試劑合併該人類受測者的細胞學和組織學結果以及人口統計學資料,可用來證實在診斷HPV感染和/或子宮頸癌方面的相關性以及準確度。
在目前,並沒有商業化的免疫檢驗試劑可用來臨床檢驗HPV相關蛋白質或抗體。本發明實施例因此提供一種有用的診斷工具可用來診斷HPV感染和HPV相關子宮頸癌。此外,此處所述之免疫檢驗的結果可用來和其他針對p53和RB所設計的市售免疫檢驗試劑做比較。感染如HPV-16和HPV-18等高風險型HPVs會因表現E6和E7病毒致癌蛋白而引起子宮頸細胞惡性化,並改變/減少宿主細胞的內生性p53和RB蛋白質,導致細胞失去功能最終產生腫瘤,而引起子宮頸癌。因此,可對同一個人類受測者之數種臨床檢體(如子宮頸組織、體液、血清)進行試驗分析並比較這些臨床檢體中所有因HPV感染而引起蛋白質在量上的改變。
在這些因為HPV感染而受影響的蛋白質(如E6、E7、p53、Rb、等)表現程度改變可當成一種可能罹患子宮頸癌的高風險指標。若HPV相關病毒蛋白或抗原的量升高以及p53和RB的量減少證實該人類受測者不僅得到HPV感染,並且有罹患子宮頸癌的高風險。相反的,在人體中p53和RB的量沒有改變,但HPV相關病毒蛋白或抗原的量升高,可能表示為一般型HPV感染但尚未發展成子宮頸癌。
因此,其中一種篩檢人類乳突病毒感染的方法可能包含:從一人類受測者身上取得一臨床檢體、取得乳突病毒初期基因編碼的第一重組蛋白質、取得乳突病毒晚期基因編碼的第二重組蛋白質、對該人類臨床檢體執行一種或多種免疫檢驗方法、利用該第一重組蛋白質偵測在人體中是否存有抗第一重組蛋白的抗體、利用該第二重組蛋白質偵測在人體中是否存有抗該第二重組蛋白的抗體。該第一重組蛋白可以是,例如重組HPV-16 E6蛋白、重組HPV-16 E7蛋白、重組HPV-18 E6蛋白、重組HPV-18 E7蛋白等。該第二重組蛋白可以是,例如重組HPV-16 L1蛋白、重組HPV-18 L1蛋白等。
用於篩檢人類乳突病毒感染的方法之另一範例可能包含:從一人類受測者取得一臨床檢體、對該臨床檢體執行核酸雜交檢驗法、偵測該人類臨床檢體中是否出現乳突病毒基因體、對該臨床檢體執行一種或多種免疫檢驗方法、利用初期乳突病毒蛋白的第一重組蛋白質來偵測在人體中是否出現抗初期乳突病毒蛋白的抗體或出現該初期乳突病毒蛋白,利用該晚期乳突病毒蛋白的第二重組蛋白質來偵測在人體中是否出現抗該晚期乳突病毒蛋白的抗體或出現該乳突病毒晚期病毒蛋白。
初期乳突病毒蛋白可能包含,但不限於HPV-16 E6蛋白、HPV-16 E7蛋白、HPV-18 E6蛋白、HPV-18 E7蛋白以及其他蛋白。晚期乳突病毒蛋白可能包含,但不限於HPV-16 L1蛋白、HPV-18 L1蛋白以及其他蛋白。乳突病毒基因體的存在可以藉由幾種方式偵測出,例如使用與乳突病毒基因之保守DNA序列同源的核酸探針,該些乳突病毒基因包括乳突病毒晚期基因的L1基因、L2基因,乳突病毒初期基因的E2基因、E6基因和E7基因等。
文中所描述一種或多種免疫檢驗方法可能包括:取得一種可能含有抗HPV相關蛋白質和/或HPV抗原之抗體的體液或組織檢體、使該檢體與文中所述一種或多種重組蛋白質作用以及使用適當的偵測系統來偵測是否出現抗體-抗原複合物。陽性結果證實臨床檢體包含抗體,顯示過去曾受HPV感染以及顯示目前臨床檢體中存在高抗體濃度。也可以用來偵測目前的HPV感染,顯示人體中強烈免疫反應。
文中所述的一種或多種免疫檢驗方法可以包括:取得對文中所述之一種或多種重組蛋白具有特異性的多株抗體、單株抗體和/或抗血清;取出一可能包含HPV相關蛋白和/或抗原的臨床檢體;使該檢體與所得到的多株抗體、單株抗體和/或抗血清作用;利用適當的偵測系統分析是否出現抗體-抗原複合物。適當的偵測系統可以針對各免疫檢驗中使用的二級抗體而使用呈色物質、化學發光物質和螢光物質等。
另外一個例子,用來篩檢人類感染高風險型人類乳突病毒的方法包括:取得人類受測者的一臨床檢體;從含有一第一表現載體的第一蛋白表現系統中取得一純化的第一重組蛋白,其中該第一表現載體含有對應於乳突病毒初期基因全長核酸序列的核酸序列斷片;從含有一第二表現載體的第二蛋白表現系統中取得一純化的第二重組蛋白,其中該第二表現載體含有對應於乳突病毒晚期基因全長核酸序列的核酸序列斷片。然後使用該第一重組蛋白質和第二重組蛋白質對該臨床檢體執行一種或多種免疫檢驗方法,以偵測檢體中是否出現抗病毒致癌蛋白的抗體或出現該致癌蛋白。該第一重組蛋白可以是,例如重組HPV-16 E6蛋白、重組HPV-16 E7蛋白、重組HPV-18 E6蛋白、重組HPV-18 E7蛋白等。晚期重組蛋白可為,例如重組HPV-16 L1蛋白與重組HPV-18 L1蛋白等。初期乳突病毒基因可為,例如乳突病毒E6基因和乳突病毒E7基因等。晚期乳突病毒基因可為,例如乳突病毒L1基因和乳突病毒L2基因等。初期和晚期基因可以從諸如HPV-16和HPV-18等高風險型人類乳突病毒中獲得。
臨床可用的子宮頸癌疫苗療程是已經是可行的,因此,用來篩檢HPV陽性和陰性感染病患的早期偵測,從中找出適合疫苗治療的候選病患比以往更為迫切。預防子宮頸癌的策略將因此要求改善HPV測試/篩檢,以除了密切追蹤這些過去或目前遭受HPV感染和/或有癌前病變的患者以外,更普及致全世界的人口。
篩檢/測試過去或目前的HPV感染合併抹片篩檢可能變成標準照護程序,這樣的需求已經列入包括美國婦產科學會(ACOG)、美國癌症協會(ACS)、生殖健康專業人員協會(ARHP)和美國***鏡和子宮頸病理協會(ASCCP)等主要醫療團體所編列的臨床指南中。因此,本文中所描述的發明可以商業化作為HPV一般感染檢驗方法和/或高風險型HPV感染檢驗方法,並在篩檢子宮頸癌上扮演重要角色。當伴隨細胞學檢查(抹片檢查結果)和高風險型HPV感染篩檢時,子宮頸癌篩檢會變得更有效率。除了子宮頸癌篩檢外,HPV感染篩檢會變成用來做早期快速和簡單的必要篩檢、作為假陰性抹片的品管控制、作為該些抹片檢查結果不明確的女性的判斷依據、用於那些接受CIN3或子宮頸癌治療的女性的追蹤檢查,也可用來偵測子宮頸腺癌。
早期診斷出感染高風險型HPV對於成功預防和治療致命性子宮頸癌是重要的。重要的是,已知女性受HPV感染12-15年是轉變為侵襲性癌症的必要條件。因此,可以使用檢驗方法偵測高風險型HPV感染生物標記對於女性的早期篩檢是很重要的。這樣一來就有可能早期治療HPV感染並防止子宮頸癌的發展,而不是依賴化學治療或放射線治療來治療惡性癌症。發展本文所說的免疫檢驗方法來偵測人口中一般型HPV感染和高風險型HPV感染的一系列生物標記,可以用於早期診斷並從而防止子宮頸癌發生。
本發明的其中一個目標為,發展出由各種HPV型和株的初期基因和/或晚期基因所衍生而來的免疫反應性或抗體反應性重組蛋白質。進一步目標為提供這些純化學形式的重組蛋白質。更進一步目標為提供簡單、迅速、較不昂貴和更高敏感度的檢驗分析/測試方法,其不僅可用於HPV感染上的診斷,更可用於診斷大部分至全部的HPV相關腫瘤。
取得初期HPV基因和晚期HPV基因所編碼的重組蛋白質。重組蛋白質可以重組蛋白本身或是轉錄或轉譯融合一部份HPV標的基因全長DNA斷片的雜合蛋白質(hybrid proteins)。標的HPV基因的DNA序列可以來自高風險型HPV、低風險型HPV、HPV型中的致癌HPV株等。致癌HPV株是一種由美國癌症協會(NCI、2001)證實會引起子宮頸癌的HPV株。致癌HPV蛋白是由致癌HPV型或株產生的初期病毒蛋白。各種HPV的病毒基因序列和蛋白質序列也可在NCBI的基因資料庫(NCBI's Gene Bank database)中找到,如下:HPV16-E6:GI:9627100、HPV18-E6:GI:9626069、HPV31-E6:GI:9627109、HPV35-E6:GI:9627127、HPV30-E6:GI:9627320、HPV39-E6:GI:9627165、HPV45-E6:GI:9627356、HPV51-E6:GI:9627155、HPV52-E6:GI:9627370、HPV56-E6:GI:9627383、HPV59-E6:GI:9627962、HPV58-E6:GI:9626489、HPV33-E6:GI:9627118、HPV66-E6:GI:9628582、HPV68b-E6:GI:184383、HPV69-E6:GI:9634605、HPV26-E6:GI:396956、HPV53-E6:GI:9627377、HPV73:GI:1491692、HPV82:GI:9634614、HPV34 GI:396989、HPV67 GI:3228267與HPV70 GI:1173493。
在這裡描述選殖一致癌型HPV的HPV-16 E6初期基因,作為示範。利用聚合酶連鎖反應(PCR)放大複製法來獲得HPV-16 E6基因的一個474鹼基對(b.p.)DNA斷片(序列編號:1),其中包含了157個氨基酸編碼區(序列編號:2)。用來進行選殖的引子係如一對前置和反置引子,分別為5’cgcGGATCCcaccaaaagagaactgcaatgtttc 3’(序列編號:3)和5’cccAAGCTTttacagctgggtttctctacgtg 3’(序列編號:4)。此分離出的DNA片段之DNA序列經過與基因銀行資料庫(Gene Bank database)中的序列比對而證實。所有的選殖步驟都依據「分子選殖(Molecular Cloning)」(Alaboratory Manual、eds.Sambrook、Fritsch and Maniatis、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)一書中所載的步驟。此外,亦可從不同臨床檢體或來源選殖出不同種系之HPV-16的E6 DNA斷片。
收集到的474鹼基對(b.p.)DNA斷片被次選殖(sub-cloned)到一組胺酸標記表現載體「pQE30」中,以用來表現帶有his-標記的重組HPV-16 E6蛋白質。產生的質體DNA標示為pQE30/HPV-16-E6,係用以表現his-標記-HPV-16-E6重組蛋白質。這些His-標記重組HPV-16 E6蛋白的DNA序列和氨基酸序列分別標示為序列編號:5(長度為510鹼基對的DNA斷片)和序列編號:6(長度為169氨基酸的融合蛋白)。
其他帶有組胺酸標記(如His6、His8等)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白、麥芽糖結合蛋白(MBP)等標記的其他表現載體也可使用作為重組蛋白過量表現系統。此外,所獲得的HPV-16 E6 DNA斷片可以選殖到其他表現系統中,包括麥芽糖-結合蛋白和麩胱甘肽-S-轉移酶-E6融合蛋白表現系統。各種表現系統也可用於表現各種型和各種系HPV的E6重組蛋白。例如,取得來自HPV-58的E6重組蛋白並標示為HPV-58-MBP-E6。
組胺酸標記的HPV-16-E6和MBP-HPV-E6重組蛋白都是在大腸桿菌BL21(DE3)中使用IPTG做誘導表現。在37’C下培養大腸桿菌BL21兩個小時以進行蛋白質表現,其後分別根據供應商Amersham與New England Biolabs所建議的標準程序來純化並獲得His-E6或MBP-E6重組蛋白且其最終濃度約1mg/L。我們發現較長的培養時間和重新回流到蛋白質純化管柱可以得到更高的蛋白質產率,產生高濃度的純化重組蛋白質,大約2-10mg/L。利用PAGE分析,His-E6重組蛋白質的純度估計約大於90%。重組E6融合蛋白係用來偵測臨床檢體中是否出現E6抗體,也可作為製造多株抗血清和單株抗體的免疫反應原。
第2A和2B圖顯示使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)和使用抗-E6單株抗體(MAb1-1)做西方墨點法來分析由IPTG誘導表現出全長之HPV-16 E6重組蛋白質的結果。His-標籤-HPV-16-E6重組蛋白的分子量約20.5KD。西方墨點法係執行於PVDF膜上,使用的是抗E6單株小鼠抗體;接著使用的二級抗體係一鹼性過氧化酶(AP)-羊-抗-小鼠IgG1,並在NBT和BCIP受質混合物的反應下顯像。結果顯示出一條單一主要蛋白質帶,可見重組E6蛋白質已純化出來。依據PAGE分析的結果,重組E6蛋白質估計約有90%或更高的純度。
顯示於第3A圖中的純化E6重組蛋白是用於一種或多種免疫檢驗方法中,例如,作為一種抗體檢驗中的偵測抗體等。純化的重組E6蛋白也作為免疫反應原用來生產抗HPV-16 E6蛋白的抗血清、多株抗體和單株抗體等。
第2C圖顯示純化重組E6蛋白的膠體過濾管柱層析結果,其顯示純化的重組蛋白HPV-16-E6是一種單體可溶性蛋白,分子量約20.5kDa。純化的重組E6蛋白比BSA還要晚被沖提出。
在這裡描述的是示範從HPV-16選殖出致癌E7初期基因。利用聚合酶連鎖反應(PCR)獲得長度為294鹼基對的HPV-16 E7基因DNA斷片(序列編號:7),該DNA斷片包含了99氨基酸編碼區(序列編號:8)。用來進行選殖的引子,例如,一對前置引子和反置引子,其分別為5’cgcGGATCCcatggagatacacctacattgc 3’(序列編號:9)和5’ccgGAATTCttatggtttctgagaacagatgg 3’(序列編號:10)。分離出之DNA斷片的DNA序列係與基因銀行資料庫做比較而確認。此外,亦可從不同的臨床檢體或來源中選殖出不同種系之HPV-16的E7 DNA斷片。
將所獲得之294鹼基對的DNA斷片選殖到一GST表現載體中以表現重組HPV-16 E7 GST融合蛋白。所產生之重組HPV-16 E7 GST蛋白的DNA序列和氨基酸序列分別顯示為序列編號:11(972鹼基對的DNA斷片)和序列編號:6(323個氨基酸的融合蛋白)。重組HPV-16 E7 GST蛋白的分子量約為37.2KD。獲取並純化該重組HPV-16 E7 GST蛋白質使其最後濃度約1mg/L。其他表現系統也可以用來表現各種HPV型和種系的E7重組蛋白。重組E7融合蛋白或重組E7桿狀病毒蛋白被用來偵測臨床檢體中的E7抗體,也被使用作為免疫反應原來生產多株抗血清和單株抗體。
第3圖是一SDS-PAGE膠體,顯示一個示範的純化重組HPV-16-E7蛋白。如第3圖所示,HPV-16-E7重組蛋白如如箭頭所示般已被純化成同質型態(homogeneity),顯示只有一條主要的單一條帶,分子量37.2KDa。
在此描述示範選殖HPV-16的晚期基因重組。利用聚合酶連鎖反應(PCR)擴增獲得一HPV-16 L1基因之長度為1596鹼基對的DNA斷片(序列編號:13),其包含531氨基酸的編碼區(序列編號:14)。用來進行PCR選殖的引子,例如,一對前置引子和反向引子,分別為5’ccgCTCGAGatgcaggtgacttttattacatcc 3’(序列編號:15)和5’cccAAGCTTttacagcttacgttttttgcgttta 3’(序列編號:16)。所分離出之DNA斷片的DNA序列係與基因銀行資料庫做比較而確認。此外,亦可從不同的臨床檢體或來源選殖出不同種系之HPV-16的L1 DNA斷片。
將所獲得1596鹼基對的DNA斷片選殖到一桿狀病毒表現載體中以表現重組HPV-16 L1蛋白。所產生之重組HPV-16 L1蛋白的DNA序列和氨基酸序列分別表示為序列編號:17(1716鹼基對的DNA斷片)和序列編號:18(571氨基酸的蛋白)。重組HPV-16 L1蛋白的分子量約為64.2KD。收集並純化該重組HPV-16 L1蛋白質使其最後濃度約1mg/L。其他表現系統也可以用來表現各種HPV型和種系的L1重組蛋白。
一般來說,可以利用一對前置和反置引子根據本文所述之步驟藉由聚合酶連鎖反應(PCR)選殖出初期基因和晚期基因並利用此處所述之各種表現系統而獲得來自各型或各種系之高風險HPV和低風險HPV的重組蛋白。例如,也可以透過His-標籤表現系統來表現出HPV-16 L1蛋白的重組N-端斷片。產生的重組HPV-16 L1-N-端重組蛋白的氨基酸序列係標示為序列編號:19且其分子量約34KD。亦可獲得C-端斷片,重組L1蛋白和/或重組L1部分蛋白係用來偵測臨床檢體中是否出現L1抗體,也可作為免疫反應原來製造多株抗血清和單株抗體。
第4圖依據一或多個本發明實施例,示範以考瑪斯藍染色三種純化HPV重組蛋白的SDS-PAGE分析結果。從不同型HPV,例如不同高風險型HPV、如HPV-16、HPV-18、HPV-58等取得重組融合蛋白。P1顯示已純化的重組HPV-58-E6-MBP融合蛋白,並與僅有MBP蛋白的P3做對照比較。P2顯示已純化的重組HPV-16-E7-His融合蛋白,CP顯示純化的重組HPV-16-E6-His融合蛋白。
欲使用本方法進行分析的生物檢體可以是取自任何哺乳類,如HPV之人類或非人類動物模型。在很多實施例中,生物檢體是從活體生物收集來的臨床檢體。在某些實施例中,用來獲取檢體的受測者本身顯然相當健康,然分析和/或檢驗仍然依照常規般的進行篩檢。在其他的實施例中,受測者本身易罹患HPV,例如可根據家庭史、暴露於某些特別的環境因素等來判斷。在其他實施例中,受測者有HPV的症狀,例如子宮頸病疣或類似的病變。在其他實施例中,受測者已經被暫時地診斷帶有HPV,例如經由抹片檢查、雜交捕捉法、PCR測試等測試方法加以確定。
生物檢體可能從受測者的任何細胞、組織、器官或細胞群得來。在某些實施例中,係從受測者身上取得子宮頸刮擦物、切片或灌洗物。在某些實施例,檢體是血液或尿液檢體。在某些實施例,生物檢體使用習知標準方法處理過,如移除某些可能干擾本發明檢驗或方法的成份。在某些實施例中,生物檢體經過例如鹽析(salt precipitation)或類似方法處理過以增加蛋白質含量。在某些實施例中,檢體經過蛋白酶抑制劑處理,以防止抗體、蛋白質或抗原等物質的降解。
本文中所述的檢體包括材料或材料的混合物,雖然非為必要,但通常這些材料或材料混合物為液態形式,也就是包含一種或多種感興趣的成分的水溶液,並且可能包含任何的生物檢體、臨床檢體等。檢體可來自許各種的生物檢體、液體或固體,例如從一個體分離出來的組織或液體,包括但不限於,例如血漿、血清、脊髓液、***、淋巴液、外部皮膚、呼吸道、腸道道和泌尿生殖器管道的切片、淚液、唾液、乳汁、血球、腫瘤、器官和體外細胞培養的檢體,包括但不限於來自細胞培養液中的調整培養液、病毒感染細胞、重組細胞和細胞組成)。
所有從女性病患來的檢體都是從他們到醫院做婦科檢查時取得。在窺視器置入人體內後,將一刷子或棉花棒伸入子宮頸內並旋轉以獲得子宮頸細胞。取出此刷子或棉花棒並塗抹在抹片上(子宮頸抹片)。隨後將此刷子或棉花棒置入約1ml的樣本稀釋緩衝液中(PBS+1% BSA)並劇烈搖晃來移除上面所沾附的材料(黏液和細胞)。此稀釋樣本被儲存在-20℃或-80℃的冷凍庫。
靜脈血係利用一般的刺絡法收集,利用21或22規格的雙點針置入含有瓊脂(agar)的試管,從每個受測者身上取得約7-9ml的血液。血液置於室溫約15分鐘使其凝結並離心15分鐘。使用拋棄式移液管將血清抽離血球,移液至微量試管(Eppendorf)中,並儲存在-20℃或-80℃的冷凍庫。至於不含HPV感染的陰性對照組,可以從處女女性收集血清。
除了本文中所提供的免疫檢驗方法以外,可額外使用核酸雜交檢驗法。
為了準備可供核酸檢驗方法使用的DNA,係劇烈搖晃細胞懸浮液檢體,並取120μl的細胞懸浮液檢體加入40μl溶在3%Triton X-100中的蛋白酶K(200μl/ml),於37℃下留置一小時。隨後在95℃下放置10分鐘將蛋白酶K去活化。接下來,在取10μl的溶液用於後續反應中。
設計用來偵測各型HPV初期基因和晚期基因的引子。例如,DNA前置和反置引子(序列編號:20和序列編號:21),其分別為5’-GCNCARGGHCAYAAYAATGG-3’和5’-GTDGTATCHACMHCAGTAACAAA-3’,N:A+T+C+G;R:A+G;H:A+C+T;Y;T+C;D:T+A+G;M:A+C。由於L1基因為同源保留序列,因此該前置與反置引子可用來偵測不同型HPV中的各種L1基因。此處所描述的引子位於L1基因的開放閱讀框架中。由於各型HPV L1蛋白具有序列同源性(homology,相似性),因此L1基因的出現可以被用來偵測各型的HPV。
取出約20 pmol的前置和反置引子並與1μl之濃度約10mmol/L從待測檢體分離出的DNA混合,並使最終反應容積約10μl;其中包含Tris-HCI、pH9.0、50mmol/L的氯化鉀、2.5mmol/L的氯化鎂、0.1%的Triton X-100、0.01%的明膠(gelatin)、每種去氧核苷三磷酸各200mmol/L和0.25 U的SuperTaq(Sphaero Q,Cambridge,UK)。PCR反應條件如下:在94℃預熱約一分鐘,隨後以94℃約一分鐘45℃約一分鐘、約72℃約一分鐘的步驟進行40個循環,最後在約72℃下進行約5分鐘的延長步驟。PCR產物用3%瓊脂膠做電泳分析。並合成一L1基因陽性控制組(65mer,序列編號:22)並且使用在PCR核酸檢驗方法中。
在另一例子中,係使用所設計的DNA前置引子(序列編號:23和序列編號:24)和反置引子(序列編號:25)藉由分析是否出現含E6基因的DNA斷片,包括一個181鹼基對的E6 DNA斷片和一個286鹼基對的E6 DNA斷片(分別為序列編號:26和序列編號:27),而偵測是否出現HPV-16。亦可額外設計DNA前置和反置引子來偵測E7基因。
購自Digene股份有限公司的雜交捕捉II HPV DNA測試試劑組也用於所獲得的臨床檢體中以做比較。此經由美國食品藥物管理局許可用來測試致癌HPV DNA的雜交捕捉II DNA測試係施行於ASCUS(不明的異常鱗狀細胞)或其他異常抹片結果之後。於經認證的臨床實驗室中依照製造商所提供的說明書實行來使用該試劑組,其係使用微量盤形式和「高致癌風險」型HPV探針。當檢體讀值比陽性控制組(每一測試1pg/mL HPV DNA或5000複製數之HPV基因體)高出一倍或一倍以上時被認為含有高風險型HPV的DNA。
雜交捕捉測試牽涉到使用非放射性探針與將偵測到的雜交利用化學發光物質做放大的分子雜交反應。將欲分析的材料做變性處理並且和特定探針做反應而形成雜合的RNA/DNA,並且該雜合的RNA/DNA被覆蓋於管壁上的抗體所捕捉到。對RNA/DNA具有特異性的抗體上耦合有鹼性磷酸酶,並且使該抗體與固定住的RNA/DNA雜合物做反應。RNA/DNA雜合物被抗體捕獲而形成一個穩定的鹼性磷酸酶受質複和物,並且利用光譜儀偵測化學冷光來偵測該RNA/DNA雜合物。
人類受測者對於HPV感染的其中一項最早的反應就是產生抗E6和E7致癌蛋白的抗體。目前,並沒有商業化的免疫檢驗診斷方法可以用來偵測這樣的免疫反應。因為不同HPV型之各種E6和E7蛋白的氨基酸序列(見表1)彼此有不同程度的同源相似性,宿主因為前一種HPV型致癌蛋白而產生的抗體會與因其他型HPV感染所產生的抗體非常不同。例如,宿主體內由一種致癌型或種系的HPV(如HPV-16、HPV-18等)的致癌蛋白(如E6、E7等)所產生抗體可能和其他型HPV相關的其他蛋白所產生的抗體有顯著不同。
此處欲測試在血漿、體液或子宮頸組織中初期基因編碼的致癌蛋白,例如高風險型HPV E6或E7蛋白的抗體或抗原偵測,以顯示此人類受測者是否具有發展成子宮頸癌的高風險。此外,還可在相同或不同的免疫檢驗診斷方法中合併或獨立偵測來自高風險型HPV晚期基因編碼的病毒蛋白(如外殼蛋白L1、L2)的抗體或抗原,來進一步證實受測者發展出子宮頸癌的風險。
因此,本發明的實施例也提供可合併或獨立使用一臨床檢體上以於一或多種免疫試驗法中直接偵測任何HPV-相關蛋白、致癌蛋白和/或外殼蛋白的免疫檢驗方法系統。
第5圖顯示利用西方墨點法偵測三種示範的HPV初期基因編碼的純化重組蛋白質。第1行(Lane 1)顯示HPV-16-E7-His重組蛋白質的偵測結果,因此其顯示出此重組蛋白係與抗-HPV-16-E7單株抗體(MAb2-1)結合。第2行顯示HPV-16-E7-His重組蛋白質的偵測結果,其顯示此重組蛋白與抗-HPV-16-E7單株抗體(MAb2-2)結合。第3行顯示HPV-16-E7-His重組蛋白質的偵測結果,因此顯示出此重組蛋白會與抗-HPV-16-E7單株抗體(MAb2-3)結合。
第6圖顯示利用西方墨點法偵測一種示範的HPV晚期基因編碼的純化重組蛋白質。第1行放入受HPV16 L1重組桿狀病毒感染72小時後的SF9細胞溶胞液。第2行係放入受到不含HPV16 L1基因之重組桿狀病毒感染72小時後的SF9細胞溶胞液。使用抗-his標籤抗體進行西方墨點法並於NBT和BCIP物質反應後可看見單一條主要蛋白質帶,其顯示重組L1蛋白全長分子量為64.2 kDa.
將來自所收集之檢體的細胞懸浮液離心後,取上層液以樣本稀釋緩衝液稀釋成1:10的比例以進行檢驗。本發明的檢驗方法為非侵入性,並需要極少設備或不需要設備。一般來說,本發明實施例提供之體外酵素免疫檢驗方法是非放射性的,用於直接偵測HPV相關蛋白和/或抗體,以顯示是否感染HPV。本文中所述的檢驗方法適合作為如抹片檢查、組織切片和其他臨床測試等臨床生理檢查以外的輔助測試。
可以數種不同的方式來執行一免疫檢驗方法。可使用各種針對抗體的抗體(抗-抗體)或其他跟抗體有結合力的物質,例如蛋白質A或蛋白質G來偵測結合於特定抗原上的抗體。這些抗原可用很多不同方式加上標籤,例如放射性標籤(放射免疫檢驗法)、螢光(螢光免疫檢驗法)或酵素(酵素連結免疫檢驗法,ELISA或EIA)。一特定的酵素免疫檢驗方法的例子是在臨床檢體或組織切片中偵測到抗原-抗體複合物。這樣的步驟實際上屬於免疫染色或免疫組織染色法,然而其中的原理則類似於ELISA法。此外,免疫檢驗方法的形式可以改變,包含了微孔盤形式(各種數目的孔)、簡單快速測試、蛋白質晶片和其他形式。
在一替代性實施例中,純化的重組蛋白質可用在類似的免疫檢驗方法中以偵測因HPV免疫治療(如正接受抗-HPV疫苗治療的人)而提高血清、其他體液或組織中的抗體。對於那些正接受疫苗治療的人來說,使用文中所述之多種檢驗方法和重組蛋白偵測其檢體為陽性結果者是有利的,例如,此結果可用來半定量地滴定接受抗-HPV疫苗之受測者血清檢體中的抗體價數並調整疫苗劑量。
至少有三種免疫檢驗方法係依賴偵測標的蛋白質,包括抗原測試、抗體測試和抗原/抗體免疫複合物測試。例如,其一方法係用來偵測人類檢體中是否出現抗HPV蛋白的抗體、免疫球蛋白,例如抗E6、E7和/或L1抗體。這裡所說的純化重組蛋白質可用於偵測抗HPV E6、E7和/或L1蛋白的抗體。該方法通常包括使純化的重組蛋白與檢體接觸,並偵測已純化之重組蛋白與檢體的任何結合作用;其中重組蛋白與檢體的結合作用表示檢體中存在有HPV-誘導或HPV-相關抗體,因此受測者有可能在過去或目前受到HPV感染。
出現在檢體中的抗體可能是抗E6、E7、L1和抗其他來自相同型或種系HPV之純化重組蛋白質的抗體。或者,在該檢體中任一種對抗該純化重組蛋白質之抗體的交叉結合反應可能導致偵測到不同HPV型或株的抗體,因而推論出具有不同型或株的HPV感染。然而,由於某些來自不同型HPV之HPV蛋白的序列同源性(相似性)很低,故需證實此種交叉反應性存在,如表1所示。
類似地,本文中提供數種方法,以用來偵測在人類受測者之檢體中是否出現抗原的,該些抗原包括HPV-相關蛋白、HPV-引致蛋白,如E6、E7、L1、L2、p53和/或Rb蛋白等。本文中所描述的純化重組蛋白可用於,例如三明治檢驗方法中以偵測這些標的蛋白質或抗原。或者,亦可取得並純化出抗該些已純化重組蛋白的單株抗體、多株抗體及抗血清以用於抗原測試、抗體測試和抗原/抗體免疫複合物測試中,來顯示該受測者過去或目前可能受到相同或不同種或株的HPV感染。
一般來說,ELISA依據標準程序實施。例如,將約50μl的純化重組蛋白加入96孔盤中在4℃下反應隔夜以進行塗覆純化重組蛋白的步驟,之後用200μl的阻隔緩衝液覆蓋微孔盤底部並於室溫放置兩個小時。加入50μl含有抗血清、單株抗體、多株抗體和其他目標HPV-引致抗體的檢體與重組蛋白於室溫下進行反應,之後再用沖洗緩衝液沖洗數次。使用可以結合到目標抗體上的二級抗體,例如抗-人類或抗-老鼠等二級抗體,以與結合在微孔盤底部的抗體或免疫複合物反應。進行受質(substrate)反應並在微孔盤閱讀器中測量在450 nm波長下的OD吸收值OD450
。在山葵過氧酵素免疫檢測系統中,於微孔盤的每個孔中加入約50μl的3,3’,5,5’四甲基聯苯胺,其為一種山葵過氧酵素的酵素受質,並使混合物在室溫下反應5~30分鐘或直到明顯看見有綠-藍色物生成為止後,於每個孔中加入約50μl之1.5M的硫酸(H2
SO4
)以終止反應。
ELISA測試法一般包括準備蛋白質/抗原/抗體、使用抗原/蛋白質/抗體塗覆於96孔盤(微孔盤)的孔內、加入標的蛋白質或標的抗體或結合了如酵素性物質(如山葵過氧酶或鹼基磷酸酶)等可供偵測物質的蛋白或抗體到孔中並反應一段時間,以及偵測抗原/蛋白質/抗體的存在(見如Harlow and Lane(antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989))。在某些情況裡,標的抗體不用與可供偵測的化合物接合;取代的是,可將一種結合有可偵測化合物的二級抗體(可辨識標的抗體)加到小孔中。另外,除了可將抗原塗覆在小孔中以外,亦可將抗體塗覆於小孔中。在此範例中,在將標的抗原加到孔中之後,可將一種跟可供偵測的化和物耦合的二級抗體加入到該孔中。如同其他種類的ELISAs,習知技藝者知道如何進行修飾以提高所測得的訊號。
ELISA程序也可以各種形式來執行。在該領域中已有數種利用多層抗-抗體、卵白素-維生素H複合物(avidin-biotin complexes)和酵素-抗-酵素抗體複合物來提高ELISA敏感度的方法。如文中所說用來固定抗原的固相支撐或表面通常是塑膠,但有好幾種其他固相支撐例如乳膠或洋菜膠也都有被描述過。亦可無需將抗原直接固定到固相支撐/表面。常用ELISA形式的範例,其係藉由一種抗該抗原的固相固定抗體而將該特定抗原固定至一固相支撐物,就是所說的捕捉抗體ELISA或三明治ELISA。一個特別的免疫檢驗方法的例子是將抗原點漬(轉換)到一個固相支撐薄片上,稱為免疫轉漬。傳統上,固相支撐物是硝化纖維素或尼龍膜/薄片,但也敘述了其他的支撐物。各種結合、混合、反應、塗覆或轉漬步驟都牽涉在ELISA檢驗方法中。在ELISA檢驗方法之前,可利用膠體電泳或類似的方法依分子大小來分離抗原或抗體。可以用於其他免疫檢驗法的類似方式來偵測該些與薄片上之特異性抗原結合的抗體。
96孔形式是一種高速篩選形式,有助於使測試步驟和條件最佳化。亦可使用其他具有不同孔數的形式。陽性控制組和陰性控制組也執行於,例如,來自受HPV感染之捐贈者和未受HPV感染之處女的血清檢體。在偵測E6、E7和L1抗體上,免疫檢驗方法可以產生高敏感度。建立起始滴定曲線而且使ELISA試劑使用條件最佳化。
第7圖是一圖式,其顯示於微孔盤底部上塗覆純化重組HPV-16 E6蛋白來偵測抗E6蛋白之各種單株抗體的示範性免疫ELISA檢驗方法的結果。用於塗覆在微孔盤底部的重組HPV-16 E6蛋白濃度為每孔分別約750 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng,,顯示E6重組蛋白利用不同的鍵結力與不同的單株抗-E6抗體作用。結果顯示純化的E6重組蛋白能夠專一的結合到抗E6蛋白之抗體,因此適合在抗體測試中作為捕捉試劑,用來偵測臨床檢體中的抗體及用於HPV感染檢驗方法中。
如第7圖所示,HPV-16 E6重組蛋白的劑量依賴性結合檢驗顯示出,在三種測試抗體中,該HPV-16 E6重組蛋白與MAb1-1抗體之間有最高的親和力。結合親和力的差異可能是因為該三種抗體來自於不同免疫抗原來源。所獲得的純化重組蛋白是比胜肽或其他純化HPV蛋白為更好的免疫抗原。結合親和力的差異也可能表示,不同的臨床檢體或不同的HPV感染受測者可能導致不同的免疫反應,因此可能與本文中所描述的純化重組蛋白有不同的反應。如第7圖中所見,由於E6重組蛋白會與該三種抗體中的其中兩者結合,因此本文中所描述的E6重組蛋白在於其結構表面上應該包含至少兩個或更多的活性抗原表位,並可偵測到此結合作用。第7圖中的結果顯示純化的E6重組蛋白可以用來捕捉來自HPV感染之受測者的目標抗體。
第8圖是一個圖式,顯示使用其他示範性純化重組蛋白「重組HPV-58 E6蛋白」塗覆在微孔盤底部而在微孔盤上進行ELISA試驗法以偵測抗E6致癌蛋白之單株抗體的結果。所用來塗覆在微孔盤底部的純化重組HPV-58 E6蛋白濃度每孔分別約為8μl/ml、4μl/ml、2μl/ml,並且相較於沒有結合反應的MBP控制蛋白而言,其顯示E6重組蛋白可特異性地結合到抗-E6單株抗體「MAb1-1」上。線性的滴定曲線顯示試驗敏感度範圍落在微克到毫微克(nanogram)之間,或甚至到微微克(picogram)或更小的範圍。第8圖中的結果證實純化的重組HPV-58 E6蛋白活性地接合到抗-E6抗體上,因此適合作為用來偵測HPV感染受測者檢體中之抗體的捕捉試劑。
第9圖是個示範圖式,顯示使用其他示範性純化重組蛋白「重組HPV-16 E6蛋白」塗覆在微孔盤底部而在微孔盤上進行ELISA試驗來偵測抗E6致癌蛋白之單株抗體MAb1-1、MAb1-2、和MAb1-4的結果。所用來塗覆在微孔盤底部的純化重組HPV-16 E6蛋白濃度,每孔分別約為8μl/ml、4μl/ml、2μl/ml、1μl/ml、0.5μl/ml等,以顯示E6重組蛋白對不同單株抗-E6抗體具有不同的結合親和力。第9圖中的結果指出純化的E6重組蛋白可以特異性地與抗E6蛋白之抗體結合,因此適合做為抗體測試中的補抓試劑,用來偵測HPV感染受測者之臨床抗體中出現的抗體。線性的滴定曲線顯示試驗敏感度範圍落在微克到毫微克之間,或甚至達到微微克或更小的範圍。
第10圖是另個示範圖式,顯示使用塗覆在微孔盤底部的重組HPV-16 E7融合蛋白來進行ELISA測試以在微孔盤上偵測抗E7致癌蛋白的單株抗體(MAb2-1)和多株抗體(PAb2-1)的結果。所使用塗覆在微孔盤底部的數種純化重組HPV-16 E7蛋白濃度係每孔分別為約8μg/ml、4μl/ml、2μl/ml、1μl/ml與0.5μl/ml,顯示E7重組蛋白對不同的單株抗-E7抗體具有不同的結合親和力。
第11圖是另一個示範圖式,顯示使用塗覆在微孔盤底部的純化重組蛋白「重組HPV-16-E7蛋白」進行免疫ELISA測試法以偵測抗E7致癌蛋白單株抗體(MAb2-1)的結果。所使用塗覆在微孔盤底部的數種純化重組HPV-16-E7蛋白濃度係每孔分別為約4μl/ml、1μl/ml、0.25μl/ml、0.125μl/ml、62.5 ng/ml和31.25 ng/ml。
第10和11圖中的結果顯示純化的E7重組蛋白可以特異性地結合到抗E7蛋白抗體上,因此適合在抗體測試中當作捕捉試劑,用來偵測受測者的臨床檢體中的抗體並分析是否受HPV感染。線性的滴定曲線(titration curve)顯示試驗敏感度介於微克到毫微克的範圍之間,或甚至可達微微克或更小程度。由於純化E7重組蛋白可結合到多於一種的測試抗體上,此處描述的E7重組蛋白在其結構表面應該包含至少兩種或兩種以上可被測得結合活性的活性抗原表位(active epitopes)。
表2顯示對所選出之臨床人類檢體進行ELISA抗體測試的結果。其顯示E6抗體測試和E7抗體測試的OD450
讀值結果。
可使用一對抗體作為抗原測試中的捕捉抗體(capture antibody)和偵測抗體(detection antibody)。例如三明治型ELISA檢驗方法。諸如單抗ABs/單抗ABs、多抗ABs/單抗ABs、MABs/多抗ABs或多抗ABs/多抗Abs等不同組合形式的不同配對抗體可作為捕捉抗體和偵測抗體來進行測試,而且使三明治型ELISA檢驗方法的使用條件最佳化。依據欲與所產生的免疫複合物結合的二級抗體,來選擇不同單株/多株組合的捕捉抗體和偵測抗體。如果最佳化的捕捉抗體與偵測抗體都是多株抗體或均為單株抗體,則捕捉抗體或偵測抗體之其中一者將與一辨識物耦合,而與一免疫試劑-衍伸偵測物質共同使用,例如該抗體可與山葵過氧酵素和用於免疫檢驗方法中的其他物質耦合。一般來說,抗原測試的三明治型ELISA都依據標準程序實行。
藉由將純化的重組蛋白注射到動物身上來誘發抗血清、多株抗體和單株抗體並使用該重組蛋白來盡行特異性結合的篩選。許多合用的動物種類可以用來製備適當的抗血清,而且這些抗血清可以直接使用。適當的動物種類包括小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠或甚至更大的哺乳類,例如羊。為了將重組蛋白施用至這些動物身上,重組蛋白通常與輔佐物一起施用,通常是弗氏完全佐劑;並依照標準技術定期收集多株血清。
可以使用科樂-麥爾斯坦方法(Kohler & Milstein)或更新的方法來製造單株抗體,就是使已注射過重組蛋白的動物的脾臟或其他抗體產生細胞不死化,以獲得可產生單株抗體的細胞株。HPV陽性和陰性人類血清檢體可用於篩選出可產生單株抗體的細胞融合瘤,以確保該單株抗體細胞株的特異性。取得多個可與已純化E6、E7和L1蛋白反應的陽性細胞株,並進一步將這些培養細胞株注射到老鼠或其他動物來源體內,可生產腹水,並可使用諸如蛋白質A親合管柱層析法從腹水中純化出單株抗體。純化的抗體可當作本發明之ELISA中的捕捉探針或偵測探針,或與諸如HRP、AP等偵測酵素結合,以在波長吸收、螢光或化學發光偵測系統中用於ELISA受質偵測。
所獲得的多株抗體和單株抗體可用於子宮頸組織切片、血清或生殖道拭樣中以診斷HPV感染,並判斷人體上或其他受測對象的患病程度。明確而言,利用本發明的抗體做診斷,可以鑑定出病患是否具有罹患惡性轉型的風險以及判定出CIN的特別階段。抗體也可以用於血清分析以偵測HPV病毒,或偵測在感染組織轉移中的病毒,也可以監控HPV免疫治療、抗-HPV疫苗或其他控制HPV感染和/或子宮頸腫瘤之其他藥物治療的進程。
96孔盤形式是一種快速篩選形式,有助於最佳化檢驗步驟和使用條件。亦對例如,從HPV感染陽性的捐贈者和沒有遭受HPV感染的處女捐贈者的血清檢體執行陽性控制組和陰性控制組測試。並完成起始滴定曲線且使ELISA檢驗條件最佳化。並發現在偵測E6、E7、L1蛋白質上,此免疫檢驗方法擁有高度敏感度。
第12圖是一圖式,顯示在示範性免疫三明治ELISA檢驗方法中,使用抗E7致癌蛋白的一種兩單株抗體(MAb2-1、MAb2-3)組合和一種多株-單株抗體(PAb2-1、MAb2-1)組合作為捕捉抗體和偵測抗體,以偵測純化重組蛋白質「重組HPV-16-E7融合蛋白」的實驗結果。
先將抗-E6、抗-E7和抗-L1捕捉抗體接合到微孔盤底部作為塗覆層,隨後加入該純化重組蛋白。然後使用一偵測抗體來偵測該些已被捕捉至該捕捉抗體上的重組蛋白。並且決定出最佳化的捕捉和偵測抗體濃度。在用於抗原偵測的ELISA檢測反應中呈線性的的重組蛋白濃度也已被決定。在同一天以及不同天中重覆執行數次這些三明治ELISA檢驗方法,來測定檢驗方法的可重複性和可靠性。每個檢驗方法的特異性(專一性)和敏感度都被決定出。進一步,相對於其他癌症,在偵測子宮頸癌上,ELISA檢驗方法顯示有選擇能力;例如,顯示出來自卵巢或子宮內膜癌症的檢體不具有交叉反應性。由於已經知道HPV被發現在大多數的子宮頸癌細胞內,但通常與其他癌症沒有相關,故此處所提到的抗原測試就不應偵測與其他癌症相關的抗原。為了測試此種選擇性,例如,可對來自卵巢組織和子宮內膜癌細胞株的萃取物進行測試,並且作為抗原測試中的陰性控制組。
因為本文中受檢驗的檢體都是來自受測者的生殖道拭樣,此受測者可能有數種性傳染病,因此可能感染有諸如衣原體/淋病(細菌)與假絲酵母(真菌)等微生物。測試結果發現與其他性傳染微生物或非HPV病毒的抗原間並無交叉反應。取自HPV感染病患和HPV陰性受測者的人類血清檢體亦接受抗原測試。例如,對該些檢體進行抗原測試以偵測臨床檢體中是否出現HPV E6、E7和L1蛋白質。
表3顯示得自ELISA免疫檢驗方法的OD450
資料,以比較所選擇檢體之不同HPV蛋白的抗原測試結果和抗體測試結果。
此處所述單步驟迅速免疫檢驗方法是種非侵入性而且容易使用的方法,如同不用處方簽即可買的驗孕試劑,並且不需任何特殊的測試設備。此單步驟迅速免疫檢驗方法可以是試管內(體外,in vitro)免疫層析法,用於直接定量偵測一般HPV抗原、特殊高風險型HPV抗原或HPV相關抗體。此單步驟迅速免疫檢驗方法可以當作子宮頸抹片檢查的輔助測試、重點照護診斷和/或用於小型診所或實驗室。此單步驟迅速免疫檢驗方法適合於室溫狀態下使用,簡單地加入稀釋或無需稀釋的檢體,靜置一段時間使反應發生,然後紀錄結果,例如目測的結果。
此單步驟迅速免疫檢驗方法可以是一種接合了諸如純化HPV抗體、重組蛋白或HPV相關抗體和蛋白質等捕捉試劑的測試膜或棒,該些捕捉試劑例如文中所述用來捕捉臨床檢體中如HPV相關抗體和HPV相關蛋白等目標物的捕捉試劑,隨後進行免疫檢驗偵測系統。
此單步驟迅速免疫檢驗法可以於直立式的膜或橫向式的長條上執行。橫向流過或擴散式的單步驟迅速免疫檢驗方法也可稱為免疫層析條狀測試法,花費約5-15分鐘便可獲得結果而且容易使用,只需要有限的訓練並不需設備。此檢驗方法的基本原理包括固相的硝化纖維素膜或長條(strip),該膜或長條上上含有用於與從抹片檢體進行反應的捕捉試劑。如果病患檢體包含目標物,硝化纖維素膜上的捕捉試劑會與此目標物發生反應而形成一複合物,該複合物藉由擴散或毛細孔作用在硝化纖維素膜上移動。
將結合有抗-人類免疫球蛋白或用於偵測抗原之抗-老鼠或抗-兔子免疫球蛋白的上色粒子置於在硝化纖維素膜或長條上的多個固定位置處。如果檢體含有抗-HPV抗體,與上色粒子結合的抗-人類免疫球蛋白(或用於抗原偵測的抗-老鼠或抗-兔子免疫球蛋白)會與抗-HPV抗體反應,並在固相的硝化纖維素膜或長條上形成三明治型免疫複合物,而產生肉眼可見的帶狀物。如果檢體中沒有目標物,則不會形成肉眼可見的帶狀物。所有測試可以包括或不包括一種內部程序的陽性或陰性控制帶,用以證實測試結果的有效性。因此,當出現反應色帶時,顯示陽性結果;陰性結果僅產生一條線或無任何線。因此,可快速偵測出檢體中是否含目標物。此試驗法可以非常敏銳,而且硝化纖維素膜、長條或其他適合的膜或長條通常非常穩定,例如如果保持乾燥和遠離火源的話可以存放好幾個月。
此膜或長條可獨立採樣或合併使用棉花棒進行採樣時用於接受檢測的人類對象,例如,在將窺視鏡和棉棒置入接受測試的人類對象體內後即刻使用該膜與長條,使得設計的免疫反應開始而且立即獲得檢測結果。因此,單一步驟迅速免疫檢驗方法可以當成主要的篩檢測試。可在進行本文中所提及的其他HPV確認測試,例如傳統的抹片細胞學測試、免疫檢驗和核酸雜交測試或這些檢驗的組合之前執行此單步驟迅速免疫檢驗方法。
在此處所述的抗原測試和抗體測試的類似步驟和反應條件可以使用在單步驟迅速免疫檢驗方法上。在硝化纖維素膜或硝化纖維素棒上含浸本文中所提供的已純化重組蛋白。在棒另一端可放置與抗-人類免疫求蛋白抗體結合的上色粒子。加入檢體並且使反應條件最佳化。陰性控制組可以是棒或薄膜上不含純化重組蛋白或只含BSA、血清蛋白或其他陰性控制組蛋白的一個或多個位置。可決定出試驗特異性(專一性)和敏感度並且偵測出目標試劑(ng/ml)的範圍為適合商業化的好範圍。
蛋白質晶片免疫檢驗法係使用純化重組HPV蛋白來偵測抗體。此外,直接利用已純化的多株或單株抗體或抗血清或使用捕捉抗體和偵測抗體的三明治法來執行蛋白質晶片免疫檢驗,以偵測HPV相關蛋白、HPV引致抗原或HPV蛋白。
例如,測試已點漬了純化重組蛋白的蛋白質晶片,所點漬的純化重組蛋白包例如HPV-16 E6、HPV-16 E7、HPV-16 L1、HPV-18 E6、HPV-18 E7、HPV-18 L1、HPV-58 E6等,以及控制組蛋白,如BSA。一開始,使用所獲得的抗體,例如mAB1-1、mAB1-4、mAB1-2、mAB2-1、mAB2-2、mAB2-3、polyAB1-1、polyAB2-1等抗體並將條件最佳化;並將各種濃度的已純化重組蛋白點漬在蛋白質晶片上來達到最大的結合效果。可將一種結合有諸如Cys5的二級抗體添加於蛋白質晶片的表面上。而得以獲得試驗專一性和敏感度。亦對來自細胞培養檢體或臨床檢體的陽性控制組和陰性控制組進行測試。此外,可使用市售抗體配對來測試檢體中的p53和RB。於此,蛋白質晶片免疫檢驗方法提供了一種簡單和容易讀取HPV相關蛋白的方式(HPV初期基因和晚期基因蛋白、L1、E6、E7以及HPY誘導性p53、RB、p16INK41蛋白和其他蛋白),來瞭解HPV感染在宿主中引起細胞調控因子的表現變化,而可當成一種可能導致子宮頸癌的高風險型HPV的感染特徵。
第13圖顯示使用固定在蛋白質晶片上的已純化重組蛋白來偵測偵測抗E6致癌蛋白單株抗體的示範性免疫蛋白質晶片分析結果。如圖13所示,點漬在玻璃玻片上的純化重組HPV-16-E6蛋白質(P4行)和HPV-58-E6蛋白質(P1行)濃度約100μg/ml,而且欲測試檢體溶液也被點漬於玻上進行反應約兩小時。至於控制組,純化重組HPV-16-E7蛋白(P2行)、BSA控制組蛋白(BSA行)和HPV-58-E6表現系統的重組標籤蛋白(P3行)也被固定在玻片上。使玻片與阻隔緩衝液(PBA/BSA)作用30分鐘然後與抗-E6單株抗體、mAB1-1(約5μgs/ml)反應兩小時。在結合反應後,沖洗玻片然後乾燥,並與抗-老鼠抗體Cy5(約4μgs/ml)作用2小時來偵測鍵結的mAB1-1。如圖13所示,mAB1-1抗體選擇性地與純化重組HPV-16-E6蛋白和純化重組HPV-58-E6蛋白反應(分別顯示於P4和P1行中);但不與BSA蛋白、純化重組HPV-16-E7蛋白、重組標籤蛋白控制組反應(分別顯示於BSA行、P3行和P2行中)。此結果顯示出,本文中所提供的已純化重組HPV蛋白在各種固態相中可保持其對抗體的特異性結合力,因此適合進一步用來發展蛋白質晶片技術以偵測可與目標試劑結合的抗體。
收集大量的臨床檢體來實行免疫檢驗法和/或核酸雜交檢驗法以篩檢HPV感染;並從合作醫院獲得該些臨床檢體的細胞學分析結果和/或組織分析結果(如內視鏡檢查和組織切片)。
表4顯示子宮頸抹片檢查分數和相關的細胞學或組織狀態解說。抹片評分從一(1)到三(3)視為正常,而四(4)以上視為異常。ASCUS:重要性不明之非典型鱗狀細胞;在抹片檢查中出現異常或非典型細胞,可能不重要且本質尚未確定。AGUS:未定義的非典型腺體細胞。LSIL:低度鱗狀上皮細胞病變。HSIL:高度鱗狀上皮細胞病變。SCC:鱗狀細胞腫瘤。CIN 1:子宮頸上皮內贄瘤,輕度細胞異常。CIN 2:子宮頸上皮內贄瘤,較具侵襲性的病變。CIN 3:子宮頸上皮內贄瘤,侵襲性的細胞異常病變。
第14圖顯示E6抗體測試與E7抗體測試的結果。HPV-16-E6抗體測試結果與HPV-16-E7抗體測試的結果高度相符,顯示可能受到HPV感染。此外,這些結果與抹片篩檢分數相符。抹片檢驗結果異常的檢體在E6抗體測試和E7抗體測試中也出現陽性反應。某些抹片篩檢正常的檢體也在E6檢體測試和E7檢體測試中出現陽性反應,顯示曾受HPV感染或目前正處於HPV感染初期或早期。
第15圖顯示抗體測試與抗原測試的結果比較。E6抗體測試的結果符合E7抗體測試與E6抗原測試的結果。編號107與195號的受測者在E6抗原測試中並未得到陽性反應,可能表示過去曾受HPV感染。
表5是總共896個受測者的子宮頸抹片篩檢結果整理。在896個測試的臨床檢體中,876個受測者的檢體其抹片結果正常,另外20個受測者的檢體被測出抹片結果異常。因此,在採樣群中約97.8%的檢體為抹片正常,2.2%為抹片異常,顯示一般族群中的代表性抹片篩檢率。
除了對HPV初期基因和晚期基因編碼的蛋白質進行抗體測試和抗原測試外,也進行PCR核酸雜交分析法。對總共442個受測者進行HPV-16 E6抗體測試/檢驗,該442個受測者包括282個抹片正常且PCR L1陰性的受測者以及160個抹片正常但PCR L1陽性的受測者。該決定值(cutoff)取決於PCR陽性群對PCR陰性群間的OD分佈。關於OD450
決定值的結果,從282個抹片結果正常且PCR L1結果陰性之受測者獲得OD450
平均值,將該些其OD450
值比OD450
平均值高出兩倍以上的個體當作陽性;否則為陰性。
例如,表6顯示對896受測者之檢體進行PCR核酸雜交分析以測定是否出現L1基因的結果。在所獲得的896檢體中,164個檢體(18%、164/896)檢測出PCR HPV-L1陽性,作為一般族群HPV感染的指標。在所獲得的896檢體中,67個檢體(7.5%、67/896)在HPV-16-E6抗體測試中檢測出陽性,作為一般族群HPV感染篩檢指標,且在該67個檢體中,有58個(7.5%、58/67)在PCR L1測試中被證實為陽性。在收集的896檢體中,164檢體(18%、164/896)在PCR L1測試中測出陽性,作為一般族群HPV感染篩檢的指標。
表7顯示對選出之80個PCR測試結果陽性的檢體進行初期和晚期HPV蛋白質特異性抗體測試的比較結果。
表8顯示從94個PCR結果陰性的檢體進行初期和晚期HPV蛋白質特異性抗體測試的比較。整體而言,HPV-16-E6抗體測試陽性結果與HPV-16-L1抗體測試結果相符,暗示/證實可能受HPV感染。
表9顯示對160個抹片結果正常且PCR陽性的檢體進一步進行抗體測試以檢測檢體中是否出現抗-E6抗體的結果。
表10顯示對160個抹片正常和PCR陽性的檢體進一步進行抗原測試和抗體測試以測定檢體中是否出現病毒E6抗原和抗體的結果。E6抗原測試與E6抗體測試的結果密切相關與強烈的一致性。
表11顯示從896個收集檢體中選出164個PCR陽性的檢體進一步利用抗體測試來測定檢體中是否出現病毒E6抗體的結果。
表12顯示從896個收集檢體中選出164個PCR陽性的檢體進一步利用抗原測試和抗體測試來測定檢體中是否出現病毒E6抗原與抗體的結果。
表12:針對所選出之160個檢體中的E6初期HPV蛋白做抗體測試與抗原測試之結果
表13顯示對80個抹片結果正常和PCR呈陽性的檢體進一步進行抗體測試的結果以測試檢體中是否出現抗HPV初期蛋白和晚期蛋白的抗體。此80個檢體進行抗體測試以偵測E6和L1。在E6抗體測試和L1抗體測試上觀察到強烈相關性,並且不同檢驗方法間有相同類似結果(between-assay agreement,即檢驗方法認同度)。因此,這兩種檢驗方法的其中一種可以用來確認檢查另外一種檢驗方法的結果,反之亦然。例如,在80個檢體中,47個受測者(58.8%)對於兩種檢驗是雙重陽性結果,而11個受測者(13.8%)是雙重陰性結果。在這80個檢體中,69個檢體(86.2%)對於L1或E6測試呈陽性反應。80個檢體中,47個檢體在E6和L1抗體測試中呈陽性反應,顯示非常相符合的檢驗結果並且確認出HPV感染的病例。此外,在E6陽性且L1陽性的47個檢體中的27個檢體也測定出E6抗原陽性。整體來說,L1抗原測試可以偵測92%(51個中的47個)的E6抗體陽性檢體(51個檢體),而且E6抗體測試可以偵測出72%(65個中的47個)的L1抗體陽性檢體(65個檢體)。
表14顯示對所選出的80個檢體進一步進行E6抗原(Ag)測試與E6抗體(Ab)測試的結果,以測試這些檢體中是否出現E6抗原和抗體。
此外,對選出的PCR陰性檢體進行E6、E7和/或L1的抗體測試和抗原測試。表15顯示出該些PCR陰性和抹片結果正常之282個檢體的抗體((Ab))測試結果。該282個檢體大部分((約85%))在E6抗體測試上也是陰性。
表16顯示在282個PCR陰性和抹片結果正常的檢體中,選出94個檢體進行初期病毒蛋白和晚期病毒蛋白的抗體(Ab)測試,以偵測檢體中是否出現E6和L1抗體的結果。在這些PCR陰性和抹片結果正常的檢體中,大部分的檢體在E6抗體測試和/或L1抗體測試上均呈現陰性。只有相當低比率的7個檢體(7.4%)在E6抗體測試和/或L1抗體測試上呈現雙陽性。此外,在這些抹片結果正常且PCR陰性的檢體中,只有28個檢體(7+9+12=28/94;29.8%)在E6抗體測試和/或L1測試上呈現陽性。所有收集的896個臨床檢體,隨機挑選檢體以進行測定HPV初期E6蛋白和HPV晚期L1蛋白特異性抗體之交互作用/結合能力的抗體測試,以及進行PCR核酸雜交測試。
表17顯示對所選出173個(79+94)抹片評分結果正常的檢體進行E6和L1抗體測試和PCR測試的結果。第16圖顯示對所選出173個抹片結果正常之受測者進行E6抗體測試、L1 Ab測試和PCR測試的結果。在這些173個抹片結果正常的檢體中,46個檢體(26.6%)在三種測試上呈現陽性,53個檢體(30.6%)在E6抗體測試和L1抗體兩種測試上是陽性,顯示高度的結果相符和檢驗特異性與敏感度,而且顯示或進一步證實有HPV感染,因此即使抹片檢查結果是陰性的(正常),如果此HPV感染沒有治療的話,在未來將有發展為子宮頸癌的高危險性。
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173個抹片正常檢體中,79個檢體(45.7%)在三個測試中均顯示陰性,而108個檢體(62.4%)在E6抗體測試和L1抗體兩種測試上均是陰性,顯示所發展出的分析方法結果高度相符且具有專一性與敏感度。這些結果進一步證實無HPV感染,因此未來發展為子宮頸癌的風險很低,與陰性(正常)的抹片結果相符。
表18顯示在比較對初期和晚期HPV蛋白特異性抗體測試結果後一些可能的解讀。
在所獲得的896個臨床檢體中,對20個抹片異常檢體做進一步抗體測試、抗原測試與PCR測試。表19顯示這20個抹片異常檢體的PCR分析與E6抗體測試結果。
第17圖顯示對20個抹片結果異常的受測者進行E6抗體測試、E6抗原測試、E7抗體測試與PCR L1測試的結果。空白顯示尚未獲得測試結果。E6抗體測試陽性結果與E6抗原測試陽性結果相符。所有目前已做E7抗體測試的5個檢體都是陽性結果,並且在E6抗體測試上也出現陽性結果。
在PCR陽性檢體(80/164)方面,在E6 Ab測試與L1 Ab測試之間的整體檢驗方法認同度(overall assay agreement)是72.5%(58/85)。陽性和陰性認同度分別是92%(47/51)和38%(11/29),陽性預測值(PPV)約72.3%(47/65)和陰性預測值(NPV)約73.3%(11/15).
在PCR陰性檢體(94/282)方面,在E6抗體測試與L1抗體測試之間的整體檢驗方法認同度是78%(73/94)。陽性和陰性認同度分別是47%(7/15)和84%(66/79),陽性預測值約35%(7/20)和陰性預測值約89%(66/74).
在抹片結果正常的檢體(442/876)方面,在E6抗體測試與PCR L1測試之間的整體檢驗方法認同度是66.5%(294/442)。陽性和陰性認同度分別是34%(55/160)和85%(239/282),陽性預測值約56%和陰性預測值約70%。
可發展出用來執行本文所提供之分析法與檢驗法的檢驗試劑套組。也可以提供重組蛋白、抗血清(antiserum)和抗體來發展這些檢驗試劑套組和篩檢HPV-16、18、31、33、35、45、52、58、59、66、68b、69、70、73、82等型的HPV感染。這裡所說的檢驗試劑套組、免疫檢驗方法、重組蛋白、抗血清和抗體等係用於各種診斷分析,例如診斷一個體是否受非致癌性或致癌性HPV型或HPV株的感染、以判斷是否有子宮頸癌傾向、判斷病患對於HPV治療的反應、判斷個體的HPV感染嚴重性以及監控HPV在個體身上的發展情形等。這裡所述的檢驗試劑套組、免疫檢驗方法、重組蛋白、抗血清和抗體等可用於診斷與癌症,包括子宮頸、卵巢、***、肛門、陰莖、***、喉頭和口腔、扁桃腺、鼻腔、皮膚、膀胱、頭頸部鱗狀細胞、偶發性腹腔腫瘤(occasional periungal carcinomas)以及良性外生殖器病疣相關之致癌性HPV型或HPV株的感染。這裡所說的檢驗試劑套組、免疫檢驗方法、重組蛋白、抗血清和抗體等有用於診斷與內瑟頓氏病(Netherton's syndrome)、疣狀表皮鬆懈(epidermolysis)、子宮內膜組織異位和其他疾病相關之HPV致癌型或非致癌型或株的感染。這裡所述的檢驗試劑套組、免疫檢驗方法、重組蛋白、抗血清和抗體等可用於診斷成年女性、成年男性、胎兒、新生兒、兒童和免疫缺陷的個體體內之致癌型或或非致癌HPV型或HPV株的感染。
如果需要的話,此處所描述之檢驗試劑套組可以進一步包括一種或更多種的傳統成分,例如包含一種或多種緩衝液、偵測試劑或抗體的容器。不論是附加品形式或標籤形式用以顯示使用內容物數量及使用方法的說明書也可以被包含在此檢驗試劑套組內。這點應該被瞭解到,就本文揭露內容來說,該些特別提到的材料和使用條件對實行本發明來說是重要的,但並不排除那些未曾提到的材料和條件,只要該些於本文中未提及的材料與條件不會阻礙實行本發明益處即可。本發明診斷方法的示範性實施例已經詳述如上。
在一檢驗試劑套組中,可使用液態或固態試劑來實行HPV E6、E7和/或L1偵測反應,檢驗試劑可以包含用配合數種分離和偵測平台使用的試劑,例如用在檢驗條或三明治分析法上的反應試劑。在許多檢驗條套組的實施例中,檢驗條結合有重組蛋白或抗HPV蛋白的抗體,並且將HPV引致或HPV相關蛋白或抗體捕捉在固態支撐物上。此檢驗試劑套組通常包括一種或多種偵測用的第一或第二抗體,該些抗體可被直接或間接偵測到。此檢驗試劑套組可包含執行西分墨點方法的組成(如預製的膠體、膜、轉型系統等)、實行ELISAs的組成(如96-孔盤)、實行免疫沈澱的成分(如蛋白質A)、管柱,特別是離心管柱,以用於依照親合力或大小來分離檢體中的蛋白質或抗體。此檢驗試劑套組可以包含多個含有致癌或非致癌性E6和/或E7的控制組檢體和/或一系列致癌性E6和/或E7的稀釋物。此一系列稀釋物一適當標準範圍,此檢驗試劑套組的使用者可將其檢驗結果與該系列稀釋物比較,並估計致癌性E6和/或E7在檢體中的量。此系列的稀釋物可以提供評估病患體內各種癌症的發展。螢光、顏色或放射線的顯影結果也可以拿來與檢驗試劑套組提供的標準螢光、顏色或底片強度曲線做比較。
適合用於結合反應的分析條件(也就是鹽濃度、pH、清潔劑、蛋白質濃度、溫度等)允許在固態支撐物或在溶液中發生諸如捕捉劑和標的物間、第一抗體和第二抗體間、重組蛋白和可與此重組蛋白結合的蛋白或抗體間之結合反應的條件。此類反應條件,特別是有關抗體與抗原間之反應方面均為該領域中的熟知技術(見如Harlow與Lane的著作(Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor、N.Y.,1989))。適合於特殊結合反應的條件通常允許擁有解離常數(KD)小於10-6
M的結合對象或配對能選擇性地結合至彼此。
雖然已於先前敘述多個本發明實施例,然而不脫離本發明範圍的情況下,仍可做出其他或進一步本發明實施例,本發明範圍決定於後述的申請專利範圍。
100...方法
110、120、130、140、150...步驟
可以參照繪示於附圖中的實施例與整理如上的本發明詳細描述內容而更清楚了解上述本發明的特色。然而值得注意的是,後附圖式中的內容係說明本發明的代表性實施例,而非限制本發明範圍,本發明可允許其他等效實施例。
第1圖繪示依據本發明一個或多個實施例的方法範例。
第2A圖示範純化的E6初期基因編碼之重組蛋白質經SDS-PAGE膠體電泳分析與考瑪斯藍(commassie blue)染色下呈現的結果。
第2B圖顯示依據本發明一個或多個實施例利用西方墨點法偵測一已純化的重組蛋白質「HPV-16 E6重組蛋白質」。
第2C圖顯示該已純化之重組E6蛋白質的膠體過濾管柱層析結果。證實已純化的重組蛋白質HPV-16-E6是一種單體可溶性蛋白質。已純化的重組E6蛋白質比BSA還要晚被沖提出。
第3圖是一SDS-PAGE膠體,其顯示依據一或多個本發明實施例之示範性已純化的重組HPV-16-E7蛋白質。
第4圖說明依據一或多個本發明實施例,經考瑪斯藍(commassie blue)染色後的三種初期基因重組蛋白質之SDS-PAGE結果。P1:HPV-58-E6-MBP融合蛋白;P3:MBP蛋白;P2:HPV-16-E7-His融合蛋白;CP:HPV-16-E6-His融合蛋白。
第5圖說明利用不同抗體進行西方墨點法來偵測三種示範性的已純化HPV初期基因重組蛋白質。第1道:HPV-16-E7-His和MAb2-1(抗-HPV-16-E7抗體);第2道:HPV-16-E7-His和MAb2-2(抗-HPV-16-E7抗體);第3道:HPV-16-E7-His和MAb2-3(抗-HPV-E16-E7抗體)。
第6圖說明根據一或多個本發明實施例,利用抗-his標籤抗體和化學發光性物質進行西方墨點法偵測一示範性已純化的HPV晚期基因L1重組蛋白質,其中在該化學發光物質可藉由NBT與BCIP反應而發光。
第7圖是一曲線圖,其說明利用塗覆在微孔盤底面上的已純化重組蛋白質「HPV-16 E6重組蛋白」,以免疫ELISA方法偵測抗E6致癌蛋白質之單株抗體的結果。
第8圖是一曲線圖,說明利用塗覆在微孔盤底面上的已純化重組蛋白質「重組HPV-58 E6蛋白」進行免疫ELISA方法偵測抗E6致癌蛋白質之單株抗體的結果。
第9圖是一個示範圖式,說明利用塗覆在微孔盤底面上的已純化重組蛋白質「重組HPV-16 E6蛋白」以ELISA方法偵測抗E6致癌蛋白質之各種單株抗體(MAb1-1、MAb1-2和MAb1-4)的結果。
第10圖是另一示範圖式,說明利用塗覆在微孔盤底面上的已純化重組蛋白質「重組HPV-16-E7融合蛋白」以免疫ELISA方法偵測抗E7致癌蛋白質之單株抗體(MAb2-1)和多株抗體(PAb2-1)的結果。
第11圖是另一示範圖式,說明利用塗覆在微孔盤底面上的已純化重組蛋白質「重組HPV-16-E7融合蛋白」以免疫ELISA方法偵測抗E7致癌蛋白質之單株抗體(MAb2-1)的結果。
第12圖是另一示範圖式,說明使用抗E7致癌蛋白的兩單株抗體的組合(MAb2-1、MAb2-3)和一多株抗體與一單株抗體的組合(PAb2-1、MAb2-1)作為用來捕捉重組蛋白且可被偵測系統所察覺的捕捉和偵測抗體配對,以免疫三明治式ELISA方法偵測已純化重組HPV-16-E7融合蛋白的結果。
第13圖是一示範圖式,說明使用塗覆固定在蛋白質晶片上的已純化重組蛋白質進行免疫蛋白質晶片分析法來偵測抗E6致癌蛋白質之單株抗體的結果。P1代表重組HPV-58 E6-MBP融合蛋白。P3代表作為控制組的MBP蛋白。P2代表重組HPV-16 E7-his標籤蛋白。P4代表重組HPV-16 E6-his標籤蛋白。
第14圖顯示依照一或多個本發明實施例,以人類子宮頸癌檢體進行E6抗體測試和E7抗體測試比較的結果。
第15圖顯示根據一或多個本發明實施例,以人類子宮頸癌檢體進行抗體測試和抗原測試比較的結果。
第16圖顯示出依照一或多個本發明實施例,利用173個抹片檢查結果正常的人類子宮頸檢體做E6抗體測試、L1抗體測試以及PCR L1測試的結果。
第17圖顯示依照一或多個本發明實施例,利用20個抹片檢察結果異常的人類子宮頸檢體做E6抗體測試、L1抗體測試以及PCR L1測試的結果。
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100...方法
110、120、130、140、150...步驟
Claims (4)
- 一種製造包含一重組人類乳突病毒(HPV)蛋白的一組合物之方法,該重組HPV蛋白係選自由乳突病毒E6基因產物、乳突病毒E7基因產物、乳突病毒L1基因產物以及乳突病毒L2基因產物所組成的群組,該方法包含以下步驟:提供一重組構築體(recombinant construct),該重組構築體編碼包含該乳突病毒基因產物與一親和性標籤的一融合蛋白,該親和性標籤係選自由HIS標籤、GST標籤以及MBP標籤所組成的群組,其中該重組構築體不編碼一伴隨蛋白(chaperone);將該重組構築體表現於一宿主細胞中;將由該宿主細胞所製備的一萃取物與一親和性樹脂在該親和性樹脂可專一地結合該親和性標籤的條件下反應;以及由該親和性樹脂沖提出該重組HPV蛋白,其中將該重組構築體表現於該宿主細胞中的該步驟產生一蛋白表現量,使得該沖提步驟產生包含濃度為1mg/L至10mg/L的該重組HPV蛋白的一組合物,其中藉由十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)所測得的該組合物中的該重組HPV蛋白的純度至少為90%,以及其中藉由分子篩選層析法所測得的該組合物中的該重組HPV蛋白為實質可溶性的單體型式。
- 如請求項1所述之方法,其中該重組HPV蛋白以一自 然型態存在於該組合物中。
- 如請求項1所述之方法,其中該重組蛋白能夠專一地與取自一哺乳動物受測者的一檢體中的一抗體結合,該哺乳動物受測者已感染一乳突病毒,該乳突病毒編碼該E6基因產物、該E7基因產物、該L1基因產物或該L2基因產物。
- 如請求項1所述之方法,其中該乳突病毒係選自由下列所組成的群組中:HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-54、HPV-55、HPV-56、HPV-58、HPV-59以及HPV-66。
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