CN107868127A - 一种用于检测病理组织切片中癌蛋白表达的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于***辅助诊断的单克隆抗体及其应用，具体地，本发明提供了一种识别高危型(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV58等)人***瘤病毒阳性宫颈组织的兔源单克隆抗体及其应用，该抗体能够高特异性地检测到组织(包括***和宫颈病变)中的生物标志HPVE7蛋白，从而能够区分与HPV持续感染相关的***变组织和宫颈异常或非癌变宫颈上皮组织，可准确诊断高危HPV感染所导致的***，病理医生可以根据HPV E7蛋白的表达情况对患者的病情给予更加准确的分析结果。可有效降低宫颈病变的漏诊率，并改善过度治疗对病人带来的伤害及资源浪费。

Description

一种用于检测病理组织切片中癌蛋白表达的单克隆抗体
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地本发明涉及用于癌症病理切片癌蛋白检测的单克隆抗体及其应用,更具体地本发明涉及由高危HPV导致的癌症中HPV E7蛋白表达的检测。
背景技术
***是女性生殖***的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位，晚期癌5年生存率低，在世界范围内具有较高的发病率和死亡率。1976年zur Hansen提出人***瘤病毒(HPV)可能是性传播致癌因素，并开始研究HPV与***之间的关系。目前，许多流行病学已证实HPV是导致***的元凶，还可以引起多种其它肿瘤,包括生殖道、乳腺、消化道及呼吸道癌症。zur Hansen也因此于2008年获得诺贝尔生理学或医学奖。HPV近年来在我国人群中的传播有增无减，故***预防、治疗的研究工作非常重要。
80％的女性在其一生中都会感染HPV病毒，大多数HPV感染在1-2年内会被自身免疫***所清除，而持续存在的HPV感染将会演变为高度宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)损伤，如CIN II和CIN III，甚至进一步演变为***。据统计，约20％的低度宫颈损伤将转变为高度损伤，如果不及时治疗，其中30％将会进一步转为恶性肿瘤。多数中晚期子***的病理形态显而易见，诊断并不困难。但是，对于早期子***，及其癌前病变的诊断至今依然是研究的重点。在正常宫颈上皮→CIN→***这一进展过程中，除发生了组织学、细胞学形态的相应改变，某些基因结构、功能等都会发生变化，这些基因可作为这一进展中的分子标志，以便早期发现、诊断CIN和***。如Ki67、p16INK4A、,hTERT等随CIN级别增高而表达增加(Valentina F，Renzo B，Serena B，et al.,Detection of HPV E7Oncoviral protein in cervical lesions by a newantibody.Appl immunohistochem Mol Morphol,2013,21(4):341-350)。近年来研究显示，抑癌基因p16INK4A在大部分***和癌前病变中过表达，认为可将p16INK4A蛋白作为一种生物学标志物进行***的早期筛查。
HPV持续感染是引起宫颈上皮内癌变的主要病毒致病因素。在中国，高危型HPV16、18、31、33、52和58是***癌中检出率最高的几个亚型。新近一些研究显示，p16INK4A的过表达与HPV持续感染和***密切相关(Kalof AN,Cooper K.,p16INK4aimmunoexpression:surrogate marker of high-risk HPV and high-grade cervicalintraepithelial neoplasia.Adv Anat Pathol.2006Jul；13(4):190-4.)。癌症发生过程中病毒DNA整合入人体细胞基因组内，随着E7蛋白表达控制的缺失将持续表达病毒致癌蛋白E7，使细胞持续分化和发生癌前病变，导致细胞调控失控，发生永生化。E7蛋白可优先与视网膜母细胞癌蛋白pRB结合并使其失活。由于p16INK4A与pRB质检存在负反馈调节，HPV E7蛋白是pRB失活后，使得pRB对p16INK4A的负反馈调节作用丧失，从而导致p16INK4A在HPV感染阳性的宫颈鳞癌中有很高的阳性表达率。2012年7月，美国病理学家协会(CAP)和美国***镜和宫颈病理学会(ASCCP)指南指出，p16可作为反映HPV E6/E7影响细胞增殖的标志物，有足够证据表明能够用于低级别***-生殖道鳞状上皮病变相关推荐，建议使用特定克隆号(E6H4)的p16INK4a抗体作为检测HPV感染是否影响到细胞周期调控的生物标志物。该克隆号是全球唯一获得IVD认证的p16INK4a抗体。罗氏诊断CINtec组织学p16(包含p16抗体E6H4)已于2014年5月在中国上市。因此，在HPV感染导致的高度宫颈非典型增生和***病人的上皮细胞内持续表达的E7蛋白，在***的发病机制中位于p16INK4a的上游，其本身也可作为高度宫颈损伤和***检测的一个肿瘤标志物。
目前宫颈组织常用的诊断方法是苏木精-伊红染色法(H&E)，尽管H&E判读是目前对CIN进行分级的标准，但易受到病理医师主观因素以及宫颈上皮化生、萎缩、修复的变化等因素的影响，进而导致H&E判读的重复性差、诊断准确度不够高。临床上迫切需要更客观、更准确的诊断标准。临床HPV E7检测目前没有合适的抗体主要有两个原因：1、HPV蛋白在临床组织或细胞样本中表达量较低，需要高亲和力的抗体进行检测；2，HPV病毒在现有的标准组织培养技术下不能在实验室培养存活；3，E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采用E7蛋白免疫动物不能获得很好的免疫反应。在这种情况下我们提供一种HPV16 E7蛋白的单隆抗体及检测HPV E7过表达的方法。该单克隆抗体能够特异的结合肿瘤细胞内源的HPV16/18 E7蛋白。诊断CIN I、CIN II和CIN III必须依据H&E的形态判断，借助于本方法通过检测生物标志物E7蛋白能够准确地了解癌前病变，提高CIN等级判读的准确性，确保对患者进行准确的分流以采取适当的随访、治疗措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于***前辅助诊断的单隆抗体及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的CDR1，
SEQ ID NO.6所示的CDR2，和
SEQ ID NO.8所示的CDR3。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区，和
重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源。
本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.12所示的CDR1'，
SEQ ID NO.14所示的CDR2'，和
SEQ ID NO.16所示的CDR3'。
在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区，和
轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源。
本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述抗体为特异性抗HPV E7蛋白的抗体；更优选地，所述抗体为特异性抗HPV16 E7蛋白的抗体。较佳地，所述抗体还具有特异性抗HPV18、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58 E7蛋白的活性。
在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人兔嵌合抗体)、鼠源抗体、兔源抗体或人源化抗体。
在另一优选例中，所述“HPV16 E7蛋白”可以为野生型HPV16 E7蛋白，也可以为野生型HPV16 E7蛋白的衍生蛋白。所述“HPV18 E7蛋白”可以为野生型HPV18 E7蛋白，也可以为野生型HPV18 E7蛋白的衍生蛋白。所述“HPV31E7蛋白”可以为野生型HPV31 E7蛋白，也可以为野生型HPV31 E7蛋白的衍生蛋白。所述“HPV33 E7蛋白”可以为野生型HPV33 E7蛋白，也可以为野生型HPV33 E7蛋白的衍生蛋白，所述“HPV52 E7蛋白”可以为野生型HPV52 E7蛋白，也可以为野生型HPV52 E7蛋白的衍生蛋白，所述“HPV58 E7蛋白”可以为野生型HPV58E7蛋白，也可以为野生型HPV58 E7蛋白的衍生蛋白。
在另一优选例中，所述抗体为能够特异性结合HPV16 E7蛋白、HPV18 E7蛋白、HPV31 E7蛋白、HPV33 E7蛋白、HPV52 E7和HPV58 E7蛋白的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述抗体不与其它HPV亚型结合或者与其它HPV亚型的亲和力较低。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗HPV；优选地，特异性抗HPV E7蛋白；更优选地，特异性抗HPV16 E7蛋白。较佳地，所述重组蛋白还特异性抗高危HPV18、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58蛋白。
本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13、15、或17所示的序列。
本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明本发明第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。
本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备***的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、***癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、***、子宫内膜癌、***癌、肾上腺肿瘤、或***。
本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述试剂、检测板或试剂盒用于：
(1)检测样品中HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58E7蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58 E7蛋白；和/或
(3)检测表达HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58 E7蛋白的肿瘤细胞；
所述药剂用于治疗或预防表达HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58 E7蛋白的肿瘤。
在另一优选例中，所述样品中含有HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58 E7蛋白。
在另一优选例中，所述肿瘤包括：泌尿生殖***的肿瘤，呼吸道***的肿瘤，消化道***的肿瘤，包括：***、子宫内膜癌、***癌、小细胞肺癌、黑色素瘤或头颈肿瘤、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、***癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、或肾上腺肿瘤。
在另一优选例中，所述“泌尿生殖***的肿瘤”包括：***、膀胱癌、子宫内膜癌或***癌。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中HPV E7蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPV E7蛋白。
在另一优选例中，在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。
在另一优选例中，所述HPV E7蛋白包括HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58 E7蛋白。
在另一优选例中，在步骤(1)中，将样品与两种针对HPV E7蛋白的抗体接触，并且在步骤(2)中通过ELISA法进行检测，所述两种针对HPV E7蛋白的抗体中的至少一种为本发明第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是本发明第五方面所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述第一抗体的结合表位不同。
在另一优选例中，所述在步骤(1)中，将样品与本发明第五方面所述的抗体接触后，在反应体系中再加入抗所述第一抗体的第三抗体，并且在步骤(2)中检测“抗原-第一抗体-第三抗体”复合物的形成。
在另一优选例中，所述第一抗体、所述第二抗体或所述第三抗体上带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物酶标记、放射性核素标记、荧光素标记。
在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、脱落细胞样品。
在另一优选例中，所述方法用于非诊断性的目的。
本发明的第十四方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述的测试条还含有抗原点样区。
在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。
本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗；和/或
(3)第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；
或者，
所述试剂盒含有本发明第十四面所述的检测板。
在另一优选例中，所述第一容器中的抗体带有可检测标记。
在另一优选例中，所述第二容器中的抗体带有可检测标记。
本发明的第十六方面，提供了一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
附图说明
图1为HPV16E7单链抗体(scFv)与蛋白结合ELISA检测结果图。
图2为HPV16 E7兔单克隆抗体抗原结合特异性ELISA检测结果。RAB-016，和RAB-017只能与His-HPV16 E7结合，而不与His-HPV16 E7和His无关蛋白结合；RAB-139能同时与His-HPV16 E7和His-HPV18 E7结合，且不与His无关蛋白结合。
图3为HPV16 E7兔单克隆抗体效价ELISA检测结果。结果RAB-139抗体效价略优于其他抗体，其次是RAB-016和RAB-017。
图4为HPV16 E7兔单抗在不同亚型HPV E7蛋白中的交叉反应检测结果。RAB-016能够结合重组蛋白E7的HPV亚型为16、31、33、35、52、58、6、11，且与His无关蛋白有一定得交叉；RAB-017能够结合重组蛋白E7的HPV亚型为16、31、33(弱)、52、58(弱)、6、11；RAB-139能够结合重组蛋白E7的HPV亚型为16、18、31、33、52、58。
图5为正常宫颈组织和***组织石蜡切片采用兔单抗RAB-016、RAB-017和RAB-139的免疫组化染色结果图。图5A为兔单抗RAB-016在正常组织和***组织中的染色结果；图5B为兔单抗RAB-017在正常组织和***组织中的染色结果；图5C为兔多抗RAB-139在正常组织和***组织中的染色结果。
图6为兔单抗RAB-139在宫颈组织(慢性炎、CIN级和***)样本石蜡切片中免疫组化染色部分结果图。兔单抗RAB-139不但能检测到***中的HPV E7蛋白，还可以检测到CIN级的HPV E7蛋白，可以区分良性增生和恶性增生样本。其中图6A为慢性炎的染色结果，基本无明显染色。图6B为CIN I染色结果，左图为CIN I级特异性染色，右图为良性增生；图6C为CIN II染色结果，左图为CIN II级特异性染色，右图为良性增生；图6D中，左图为CINIII的染色结果，右图为***的染色结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，最终获得一株抗高危HPVE7兔源单克隆抗体RAB-139。实验结果表明，该针对高危型HPVE7蛋白的兔源单克隆抗体，特异性高，亲和力强，与高危型HPV16、18、31、33、58的E7蛋白有较强的亲和力。进一步研究表明，该抗体还可用于临床石蜡切片病理样本的检测。本发明提供了检测和/或鉴定高危型HPV E7蛋白的方法，该方法稳定性好，检测灵敏度高。本发明还提供了包含上述抗体的试剂盒。
具体地，本发明采用重组His-HPV16 E7融合蛋白免疫日本大耳白兔，使用His-HPV16 E7和另一种His标记无关蛋白作为筛选检测抗原，当兔血清达到一定效价后，获得***的B淋巴细胞，用于构建噬菌体总抗体库。通过噬菌体展示来制备特异性抗体技术在本领域是熟知的。将筛选获得的阳性抗体株Fv基因导入到真核表达***中，表达兔源全长抗体，在ELISA检测中呈特异性的结合HPV E7融合蛋白。
除了ELISA结合重组蛋白抗原的鉴定，阳性单克隆抗体进一步经过抗原结合表位分析，抗原亚型交叉反应分析，亲和力结合鉴定，免疫细胞化学染色法(Immunocytochemistry ICC)和免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry IHC)鉴定。通过以上鉴定试验，1株抗体克隆株RAB-139通过了检验要求，显示了蛋白分子水平、细胞水平和组织水平特异性结合高危型HPV E7癌蛋白的功能，最重要的包含了多种高危HPV亚型，增加了其应用价值。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV16 E7蛋白的氨基酸序列如下：
HGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID NO.:1)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV18 E7蛋白的氨基酸序列如下：
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID NO.:2)。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，本文中的兔单克隆抗体是通过噬菌体文库筛选后通过分子生物的方法构建全长兔单克隆抗体基因表达载体，将该载体转入真核表达***，培养后收取细胞上清而获得，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的抗高危型HPVE7蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗高危型HPVE7蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的HPV16 E7蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')2片段；抗体重链；抗体轻链。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
本发明采用常规方法对单克隆抗体RAB-034进行测序，获得了其序列信息，序列信息记载如下。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括以下三个互补决定区CDR：
CDR1，其氨基酸序列为GFSLSSYT(SEQ ID NO.:4)，其编码核苷酸序列为，ggattctccctcagtagctataca(SEQ ID NO.:3)；
CDR2，其氨基酸序列为ISTGDTT(SEQ ID NO.:6)，其编码核苷酸序列为，attagtactggtgataccact(SEQ ID NO.:5)；
CDR3，其氨基酸序列为ARGYGKSSGYSGLNL(SEQ ID NO.:8)，其编码核苷酸序列为，gcgagggggtatggtaaaagtagtggttattctggccttaacttg(SEQ ID NO.:7)。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：
QSVEESGGDLVKPGASLTLTCKASGFSLSSYTMGWFRQAPGKGLEYIGAISTGDTTDYTNWAKGRFTISKTSSTTVALQMTSLTAADTATYFCARGYGKSSGYSGLNLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.:10)；
其编码核苷酸序列为：
cagtcggtggaggagtccgggggagacctggtcaagcctggggcatccctgacactcacctgcaaagcctctggattctccctcagtagctatacaatgggctggttccgccaggctccagggaaggggctggaatacatcggagccattagtactggtgataccactgactacacgaactgggcgaaaggccgattcaccatctccaaaacctcgtcgaccacggtggctctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatttctgtgcgagggggtatggtaaaagtagtggttattctggccttaacttgtggggcccaggtaccctggtcacagtgagctct(SEQ ID NO.:9)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源、人源或兔源。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
CDR1'，其氨基酸序列为ESVYSNNY(SEQ ID NO.:12)，
其编码核苷酸序列为，gagagcgtttatagtaacaactac(SEQ ID NO.:11)；
CDR2'，其氨基酸序列为SAS(SEQ ID NO.:14)，
其编码核苷酸序列为，tctgcatcc(SEQ ID NO.:13)；
CDR3'，其氨基酸序列为LGSYDCSSTDCFG(SEQ ID NO.:16)，
其编码核苷酸序列为，ctaggcagttatgattgtagtagtactgattgttttggt(SEQ IDNO.:15)
在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：
DPVLTQTASPVSAAVGSTVTISCQSSESVYSNNYLSWFQQKPGQPPKQLIYSASSLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSSTDCFGFGGGTEVVVK(SEQ ID NO.:18)，
其编码核苷酸序列为：
gaccctgtgctgacccagactgcatcgcccgtgtctgcagctgtgggaagcacagtcaccatcagttgccagtccagtgagagcgtttatagtaacaactacttatcctggtttcagcagaaaccagggcagcctcccaagcaactgatctattctgcatccagtctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtctaggcagttatgattgtagtagtactgattgttttggtttcggcggagggaccgaggtggtcgtcaaa(SEQ ID NO.:17)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源、人源或兔源。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合HPV16 E7蛋白的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.:10的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:18的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗HPV16 E7蛋白的兔或人兔嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有HPV16 E7蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQID NO.:3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:10和/或SEQ ID NO.:18所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合HPV16 E7蛋白分子，因而可用于预防和***。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)，噬菌体展示技术或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
噬菌体展示技术是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，从而使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
本发明提供了一种针对HPV E7蛋白的单克隆抗体，特别是针对高危型HPVE7蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用噬菌体展示技术进行筛选，重组DNA方法组建真核表达***来表达抗体，再将分泌于培养基中的抗体经亲和层析柱(Protein A-Sephrose)进行纯化。
方法和样本
本发明涉及用于组织的样本检测***和风险预警的方法。该方法步骤大致如下：获得组织样本；将样本进行***固定，制备成石蜡切片；检测在所述石蜡切片的样本中高危型HPV E7癌蛋白水平。
本发明可以用于高危型HPV感染相关癌症中高危型HPV E7癌蛋白的检测，其中高危型HPV感染相关的癌症例如***、膀胱癌、子宫内膜癌、***癌等泌尿生殖***的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤以及这些癌症的前期阶段。
本发明中所采用的样本(样品)为组织样本，且***固定的石蜡切片。
试剂盒
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书等。
本发明进一步设计用于检测高危型HPV E7癌蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括识别高危型HPV E7癌蛋白的抗体，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV E7抗体，更优选是抗HPV16 E7单克隆抗体。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
本发明进一步设计开发用于对来自宫颈病变组织样本中高危型HPV感染相关情况诊断评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本中的高危型HPV16 E7癌蛋白，其中样本可以是石蜡切片或者是冰冻切片。将宫颈组织制成切片，并且被用于开发在基于非细胞学形态分析基础上对样本中的高危型HPV感染情况进行免疫学检测的检测试剂盒和体外诊断装置。
本发明的目的之一在于提供一种检测高危型HPVE7蛋白表达的方法，并且所述的方法可用于检测HPV感染相关癌症特别是***的检测。
本发明的发明人等制作了针对高危型人***瘤病毒(HPV)E7蛋白质的兔源单克隆抗体RAB-139，并研究其应用。本发明的发明人等使用所制作的抗高危型HPVE7兔单抗RAB-139对***固定的宫颈组织石蜡切片进行免疫组织化学染色。借助于兔单抗RAB-139对目的蛋白的高亲和力和高特异性，使得RAB-139不但能够特异性识别***组织中的高危型HPVE7蛋白，还能够识别宫颈早期病变中的高危型HPVE7蛋白。因此，兔多抗RAB-139既可用于中晚期子***的检测，也可用于检测有恶变可能的早期宫颈病变，为临床诊断和宫颈病变进展风险评估提供可靠的证据。根据该发现结果，本发明的发明人完成了本发明。
也就是说，本发明的方法是检测肿瘤标记物的方法，其特征在于：包括检测样本中的高危型HPVE7的步骤。
在本发明的方法中，所述检测样本优先是宫颈上皮损伤有可能宫颈病变的患者，或者是宫颈已经发生病变的患者。
所述HPV16 E7优选是HPV16 E7蛋白质或其片段。在此情况时，检测所述的HPV16E7的步骤优选是使用HPV16 E7的免疫组织化学染色法分析。所使用的抗HPV16 E7抗体优选是抗HPV16 E7兔单克隆抗体。
所述方法免疫检测所采用的来自HPV16 E7癌基因表达的蛋白作为HPV16相关的恶性或恶变前细胞发生的可靠指标。本发明最有用的方面之一是在对子***、鳞状上皮细胞损伤和腺癌及与致癌HPV16感染相关的任何上皮细胞异常的诊断中的应用；所示的致癌HPV16感染包括中空细胞病；角化过度症；包括上皮内瘤形成或上皮内病变的癌前期病症；高度发育不良；和侵染性或恶性癌症。除***外，HPV16 E7的检测对检测膀胱癌、子宫内膜癌、***癌等泌尿生殖***的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤也是有用的。
本发明的另一个目的通过本发明的方法提供一种检测试剂盒。该试剂盒可以是诊断试剂盒或研究试剂盒。
本发明的试剂盒是用以检测肿瘤标记物的试剂盒，其特征在于具有抗HPV16 E7单克隆抗体。本发明的试剂盒优先是还具有用以检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV16 E7抗体，更优选是抗HPV16 E7单克隆抗体，尤其优选是通过噬菌体展示和重组DNA技术，获得用于真核表达***的抗HPV16 E7单克隆抗体基因重组表达载体。由真核表达***产生的抗HPV16 E7兔单克隆抗体或是与该抗HPV16 E7兔单克隆抗体具同等的结合活性的单克隆抗体。
本发明提供了一种方法通过检测组织内源的HPV16 E7蛋白，区分不含HPV致癌蛋白的组织。并且当组织通过临床广泛的中性***固定，制成石蜡切片后仍能准确的检测出致癌病毒蛋白，从而能够提高CIN等级判读的准确性，确保对患者进行准确的分流以采取适当的随访、治疗措施。
进一步，本发明还提供一种采用该检测方法所形成的检测试剂盒。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明提供的针对HPV E7蛋白的抗体，特异性高，亲和力强，并且可以大量制备、价格低廉。
(2)本发明提供的针对HPV16 E7蛋白的抗体能够特异性的与HPV16 E7蛋白结合，也可与HPV18、31、33、52、59亚型的E7蛋白结合，因此该抗体能够用于HPV E7蛋白的广谱检测。
(3)本发明提供的检测HPV16 E7蛋白的方法中使用本发明提供的抗体，稳定性好，检测灵敏度极高。
(4)本发明提供的单克隆抗体以及检测方法，适用于相关癌症的早期癌变前风险预警和中晚期癌症的确诊。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
1.高危型人***瘤病毒(HPV)E7兔单抗制备
1.1单链抗体(scFv)的筛选
采用His-HPV16 E7重组蛋白免疫兔子，用His-HPV16 E7重组蛋白和His不相关蛋白进行效价检测。分离兔子B淋巴细胞获得免疫球蛋白基因。将B细胞的全套可变区基因克隆出来，组装成噬菌体抗体库。构建的噬菌体抗体库采用重组蛋白His-HPV16 E7进行淘选。经过三轮淘选的富集作用；测定噬菌体滴度；噬菌斑扩增；DNA测序；ELISA检测筛选到的靶分子结合肽。其中ELISA检测筛选选用重组蛋白His-HPV16 E7，并用His不相关蛋白设置阴性对照(N)，Anti-6×His抗体设置包被His抗原阳性对照(P)，同时设置空白对照(包被抗原直接加入酶标二抗)。His-HPV16 E7 0.1μg/ml包板，His不相关蛋白5μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，室温作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入待测抗体5μg/ml。37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再分别加入抗Flag-HRP二抗(Sigma A8592)(1:10 000)，Anti-6×His(Abcam ab1187)(1:10 000)，37℃反应60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止。ELISA筛选结果以待检抗体对重组蛋白His-HPV16E7反应OD值大于2的为阳性，并进行复检。筛选获得8株单链抗体：scFv001，scFv016，scFv017，scFv020，scFv023，scFv034，scFv133，scFv139。
初步鉴定该8株scFv的结合的表位氨基酸序列区域。采用ELISA方法进行鉴定：抗原选用重组蛋白和多肽，其中重组蛋白为His-HPV16 E7；多肽分别为HPV16E7-1(氨基酸序列SEQ ID NO.:19PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE)，HPV16E7-27(氨基酸序列SEQ IDNO.:20LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAH)，HPV16 E7-5(氨基酸序列SEQ ID NO.:21KCDSTLRLCVQSTHVDIRTLE)，His-Vac(氨基酸序列SEQ ID NO.:22DEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIV)，His18E7-1(氨基酸序列SEQ ID NO.:23SDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRH)。并根据scFv与氨基酸序列结合能力的不同对该8株scFv进行分组。结果见图1：该8株scFv均有一定得特异性，选取scFv016、scFv017和scFv139进行下一步的抗体生产。
1.2兔单克隆抗体的生产
生产兔单克隆抗体的真核体外表达技术在本领域是熟知的。首先根据兔抗体基因库Fc序列，结合上面选取的scFv抗体基因，构建全长兔单克隆抗体基因表达载体，共构建三个真核表达载体。表达载体通过脂质体瞬转HEK293F细胞，72小时后收取培养上清，并对培养上清经亲和层析柱(Protein A-Sephrose)进行纯化。共获得三株兔单克隆抗体，分别为：RAB-016，RAB-017和RAB-139。1.3兔单克隆抗体的特异性
检测时，采用间接ELISA方法：抗原选用His-HPV16 E7和His-HPV18 E7融合蛋白。并用His不相关蛋白设置待检抗体阴性对照(N)，Anti-6×His抗体设置包被His抗原阳性对照(P)，同时设置空白对照(包被抗原直接加入酶标二抗)。His-HPV16 E7和His-HPV18 E7融合蛋白0.5μg/ml包板，His不相关蛋白5μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2小时或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入待测抗体0.1μg/ml，37℃反应1小时，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:20 000)，Anti-6×His(Abcam ab1187)(1:10 000)，37℃反应1小时，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止。结果见图2：RAB-016，RAB-017，RAB-139均能与His-HPV16 E7结合，而不与His不相关蛋白结合；同时RAB-139与His-HPV18 E7有弱交叉，而RAB-016和RAB-017只能结合His-HPV16 E7重组蛋白。
2.单克隆抗体的鉴定
2.1ELISA检测兔单克隆抗体效价
融合蛋白His-HPV16E7 0.5μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2小时或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入anti-HPV16E7单抗RAB-016，RAB-017，RAB-139，初始浓度为1μg/ml，倍比稀释，共11个浓度梯度，37℃反应1小时，PBST洗涤拍干后再加入羊抗兔-HRP二抗(SigmaA0545)(1:20 000)，37℃反应1小时，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止，OD450nm处读数。结果见图3：当采用His-HPV16E7为抗原时，3株抗体均有较高的结合力。
2.2兔单克隆抗体的交叉亚型分析
鉴定单克隆抗体在不同亚型HPV E7蛋白中的交叉反应。采用ELISA方法进行鉴定：抗原选用重组蛋白，重组蛋白的HPV亚型分别为16、18、31、33、35、45、52、58、6、11。抗原以0.5μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2小时或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入anti-HPV16 E7单抗RAB-016，RAB-017，RAB-139(1μg/ml)，37℃反应1小时，PBST洗涤拍干后再加入羊抗兔-HRP二抗(SigmaA0545)(1:20 000)，37℃反应1小时，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止，OD450nm处读数。结果见图4：RAB-016能够结合重组蛋白E7的HPV亚型为16、31、33、35、52、58、6、11，且与His无关蛋白有一定得交叉；RAB-017能够结合重组蛋白E7的HPV亚型为16、31、33(弱)、52、58(弱)、6、11；RAB-139能够结合重组蛋白E7的HPV亚型为16、18、31、33、52、58。
2.3兔源单克隆抗体免疫组织化学染色法检测***组织中的HPV16 E7蛋白
分别以兔单抗RAB-016、RAB-017和RAB-139为一抗对宫颈正常组织和***组织进行免疫组织化学染色。方法如下：将病理石蜡切片先浸泡在二甲苯中两次，每次10分钟；然后依次浸泡在100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中，各5分钟，最后PBST洗三次；将组织切片放入煮沸的0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)中，高温高压2分钟。室温冷却30分钟，PBST洗三次，每次5分钟；为了使内源过氧化物酶失活加入含3％H2O2的PBS缓冲液室温处理10分钟；PBST洗涤3次，每次5分钟；加入含10％小牛血清的PBST室温封闭20分钟；弃去封闭液，分别加入3株抗体，浓度为RAB-016(20ug/ml)，RAB-017(20ug/ml)，RAB-139(0.1ug/ml)，室温孵育1小时；经充分洗涤后滴加Anti-Mouse/Rabbit IgG-HRP(DakoK5007)，室温孵育30分钟；经充分洗涤后DAB(Dako K5007)显色3-5分钟(显微镜下观察)，流水冲洗5分钟；苏木素复染1分钟，自来水冲洗干净，浸泡在自来水10分钟；分步脱水，依次70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇各浸泡5分钟；最后二甲苯浸泡两次，每次5分钟；再中性树胶封片；最后显微镜观察拍照。
结果见图5：兔单抗RAB-016和RAB-017在正常宫颈组织和***组织中均无染色；兔单抗RAB-139在正常宫颈组织中无特异染色，在***组织中有明显的棕黄色染色，且染色位于胞质中。综上所述，仅兔源单克隆抗体RAB-139能够特异的识别***组织中的HPV16 E7蛋白从而使***变部分组织呈特异性染色，且染色定位于胞质中，因此选择RAB-139作进一步研究。
实施例2兔源单克隆抗体RAB-139采用免疫组织化学染色法检测宫颈病变组织
根据抗体筛选结果，以兔源单抗RAB-139为一抗进一步探索其在检测子***前病变样本中的应用。宫颈上皮内瘤变(CIN)是子***的癌前病变，包括子宫颈轻度(CIN I级)、中度(CIN II级)、重度不典型增生及原位癌(CIN III级)。选取宫颈慢性炎，CIN-I，-II，-III病理石蜡切片和***石蜡切片，采用RAB-139进行免疫组化染色检测，具体操作参照实施例1，2.3小节。结果：宫颈慢性炎样本中，阳性率为16.7％；CIN I样本中，阳性率为28.6％；CIN II样本中，阳性率为78.6％；CINIII和***样本中，阳性率均为100％(表1，兔单抗RAB-139在宫颈组织石蜡切片的临床应用数据)。列举出各级别的样本染色情况，具体如图6所示，其中图6A为慢性炎的染色结果，基本无明显染色。图6B为CIN I染色结果，左图为CIN I级特异性染色，右图为良性增生；图6C为CIN II染色结果，左图为CIN II级特异性染色，右图为良性增生；图6D中，左图为CIN III的染色结果，右图为***的染色结果。
表1宫颈组织中各等级样本的阳性染色率
样本类型 样本总数 阳性染色 阳性染色率
宫颈慢性炎 30 5 16.7％
CINI 7 2 28.6％
CIN II 14 11 78.6％
CIN III 8 8 100％
*** 18 18 100％
讨论：
本发明人采用上述方法制备HPV16 E7兔源单克隆抗体，选用三株兔单链抗体基因进行兔抗全长基因的真核***表达，并对表达的全长兔单抗进行筛选，最终选出灵敏度高、特异性强、能识别组织切片内源HPV16 E7蛋白，同时背景最低的单克隆抗体RAB-139。本研究表明RAB-139能够通过结合***相关高危型HPV E7蛋白而有效的识别宫颈组织切片样本中的癌变细胞。进一步研究表明RAB-139不但能够识别***组织中的病毒蛋白还能识别***前病变组织(如CIN II-III级)中的病毒蛋白。CIN包括了所有的癌前病变和原位癌，反映了***发生中连续发展的病理过程，即由宫颈不典型增生(轻→中→重)→原位癌→早期***的一系列病理变化。CIN虽是一连续发展的病变，但亦存在逆转的可能性，不论是子宫颈非典型增生，或是原位癌均有逆转可能，只是原位癌逆转可能甚少。临床对于年轻、有生育要求、病变范围小的CIN I级患者可以随访观察，对于CIN II级患者采用冷冻激光等局部治疗；而对于CIN III级，国内以手术***为主，国外有主张采用局部治疗者。在临床实际操作中，对于CIN II级的判定往往由于病理医师的主观性存在较多的争议。由于高危型HPV与***的发生密切相关，90％以上的***样本中均能检出高危型HPV感染，借助于本发明提供的方法可以在CIN早期，至少是宫颈中度病变样本中检测出高危型HPV，以此作为宫颈病变是否恶化的指标，可以对CIN患者是否进行手术进行分流，为临床医师对患者诊疗提供辅助依据，既可减少由于对组织形态学的主观性判断带来的漏诊率，又可减少过度治疗造成的损失。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的CDR1，
SEQ ID NO.6所示的CDR2，和
SEQ ID NO.8所示的CDR3；
优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区，和
重链恒定区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.12所示的CDR1'，
SEQ ID NO.14所示的CDR2'，和
SEQ ID NO.16所示的CDR3'；
优选地，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区，和
轻链恒定区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
优选地，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或权利要求4所述的轻链。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；或
(2)如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
11.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
12.如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述试剂、检测板或试剂盒用于：
(1)检测样品中HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58E7蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58E7蛋白；和/或
(3)检测表达HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58E7蛋白的肿瘤细胞；
所述药剂用于治疗或预防表达HPV16和/或HPV18和/或HPV31和/或HPV33和/或HPV52和/或HPV58E7蛋白的肿瘤。
13.一种检测样品中HPV E7蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将样品与权利要求5所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPV E7蛋白。
14.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有权利要求5所述的抗体或权利要求10所述的免疫偶联物。
15.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有权利要求5所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗权利要求5所述的抗体的二抗；和/或
(3)第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；
或者，
所述试剂盒含有权利要求14所述的检测板。
16.一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求5所述的抗体或权利要求6所述的重组蛋白。
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CN110196332A (zh) * 2019-05-22 2019-09-03 艾托金生物医药（苏州）有限公司 一种检测多亚型hpv e7蛋白的方法及其应用

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