TWI385179B - 對抗β-類澱粉肽的抗體 - Google Patents

Description

對抗β-類澱粉肽的抗體

本發明有關於結合β-類澱粉肽且特別是人類β-類澱粉肽的抗體。本發明也涉及利用該抗體來治療特徵在於升高的β-類澱粉含量或β-類澱粉沉積之疾病或異常(特別是阿茲海默症)的方法，含有該抗體的醫藥組成物以及製造方法。本發明的其它方面將從下面說明來說是清楚的。

阿茲海默症(Alzheimer’s disease,AD)是年齡相關性認知退化(age-related cognitive decline)最為普遍的病因，影響世界上超過一千兩百萬的個體(Citron M(2002)Nat.Neurosci 5,Suppl 1055-1057)。該疾病的最早期階段之特徵在於帶有相關聯的認知退化以及語言和行為缺失的進行性記憶喪失(progressive loss of memory)。在疾病的較晚階段中，病患發展出全面失憶(global amnesia)並且具有大為降低的動作功能(motor function)。典型地死亡發生在診斷之後的9年且通常與其它病況有關，典型地是肺炎(Davis K.L.and Samules S.C.(1998)in Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J.and Coyle J.T.(McGraw-Hill,New York pp267-318))。現今治療代表症狀性方法(symptomatic approaches)，集中在減緩認知損傷(cognitive impairment)以及改善與進行性疾病病原學(progressing disease aetiology)相關的行為症狀。事實上這些治療被報導僅僅提供有助於認知損傷的短期認知之益處至 多只達2年。有關於減緩並且可能停止疾病的進展之疾病修飾治療的可能性是極大的。此方法對於病患的生命品質以及重要地它們的照護者來說將提供基本且持續性的改善還有此疾病的龐大全面健康看護成本。

阿茲海默症的臨床診斷是以生理與心理測試為基礎，其造成可能或可信之阿茲海默症的診斷。在死亡後(post mortem)，該疾病是透過腦部具有特徵的神經性特徵而被確認，其包括Aβ在實質斑塊(parenchymal plaques)與大腦血管(cerebral vessels)的沉積、神經元內形成神經元纖維糾結(neurofibrillary tangles)、突觸喪失(synaptic loss)以及特定腦區之神經元亞族群喪失(Terry,RD(1991)J Neural Trans Suppl 53：141-145)。

遺傳學的多血症(plethora)、組織的以及功能性證據暗示，β-類澱粉肽(Aβ)是阿茲海默症進展的主因(Selkoe,D.J.(2001)Physiological Reviews 81：741-766)。

Aβ亦被知曉為透過藉由被知曉為BACE1(亦被知曉為β-分泌酶(β-secretase)、Asp2或Memapsin-2)之天冬胺醯基蛋白酶酵素來裂解貝他類澱粉前驅物蛋白質(亦被知曉為APP)所製造(De Strooper,B.and Konig,G.(1999)Nature 402：471-472)。除了實質與血管沉積之外，Aβ的可溶性寡聚形式(oligomeric forms)已被假設為促進AD的開始且它們最初可能透過妨礙突觸功能而影響神經元功能(Lambert et.al.(1998)Proceedings of the National Academy of Science,U.S.A.95：6448-6453)。雖然不溶性類澱粉斑塊於AD早期 及MCI被發現到，可溶性Aβ的含量累積(意指為寡聚物或由Aβ所衍生的可擴散配位子(Aβ-derived diffusible ligands,ADDLs))在這些個體中也增加，而可溶性Aβ的含量較佳地是與神經元纖維退化相關，且突觸特徵的喪失甚於類澱粉斑塊(Naslund et al.(2002)J Am Med Assoc 283：1571-1577,Younkin,S.(2001)Nat.Med.Med.1：8-19)。高度類澱粉生成性(amyloidogenic)的Aβ42以及胺基末端被截斷形式Aβx-42是在擴散與老年斑(senile plaques)兩者中被發現到的Aβ優勢種類(Iwatsubo,T(1994)Neuron.13：56-53,Gravina,SA(1995)J.Biol.Chem.207：7013-7016)。Aβ42的相對含量顯示為Aβ累積成類澱粉斑塊的主要調節劑(regulator)，甚至Aβ42在活體外已被顯示為較其它Aβ形式更易於累積(Jarrett,JT(1993)Biochemistry.32：4693-4697)且就其本身來說Aβ42已被暗指為AD發病機制的啟動分子(Younkin SG,(1998),J.Physiol.(Paris).92：289-292)。雖然Aβ42是APP代謝的一個次要產物，在其製造上的小變化是與在Aβ沉積上的巨大作用為相關的，因而已被假設單獨Aβ42的降低可以是一種治療AD的有效方法(Younkin SG,(1998),J.Physiol.(Paris).92：289-292)。為了支持此，在類澱粉前驅物蛋白質(APP)與早老素(presenilin)基因的突變已被報導為顯著增加Aβ42的相對含量且因而縮短阿茲海默症(AD)的發生時間(Selkoe D.J.Podlisny M.B.(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Gemet.3：67-99)。然而應當注意到的是，沉積速率是隨代謝和Aβ清除而定。

類澱粉沉積的動物模式已透過在小鼠過度表現突變的人類轉殖(transgenes)而被產生。過度表現單一人類APP轉殖的小鼠自年齡為12個月典型地發展出大腦似斑塊β-類澱粉沉積(Games D.et al.,(1995)Nature 373：523-527；Hsiao K.et al.,(1996)Science 274：99-102)，而同時帶有突變人類APP及早老素-1(PS-1)轉殖基因的小鼠在早如年齡為2個月時典型地發展出大腦似斑塊β-類澱粉沉積(Kurt M.A. et al.,(2001)Exp.Neurol.171：59-71；McGowan E.et al.,(1999)Neurolbiol.Dis.6：231-244)。

外生性Aβ在中樞神經系統(central nervous system,CNS)與血漿之間的輸送上扮演角色來控制腦部類澱粉含量變得逐漸明顯的(Shibata,et al(2002)J Clin Invest 106：1489-1499)，其帶有CSF Aβ快速地從CSF被輸送到血漿。因此利用Aβ肽的主動免疫或特定Aβ抗體的被動投藥快速地結合至周邊Aβ而改變血漿、CSF以及最終CNS之間的動態平衡。一個新的多血症報告甚至證明了這兩種方法可以降低Aβ含量，減少Aβ病理學並且在各種不同類澱粉病變的轉殖基因模式中提供認知獲益。有限的研究亦已在較高等的物種中施行。以Aβ肽免疫加勒比海綠色猴(Caribbean vervet monkeys)(16-10歲)超過10個月。Aβ40含量在血漿中被提高2-5倍，其於第251日達到最高點，而Aβ40以及Aβ42含量在CSF中被明顯地降低達100日，並且在那之後回復至接近基線(baseline)。此在CSF的降低是伴隨著斑塊負擔(plaque burden)的顯著降低(Lemere,CA (2004)Am J Pathology 165：283-297)。在血漿Aβ含量方面的類似增加亦已在年老的恆河猴(15-20歲)免疫之後被測得(Gandy,S(2004)Alzheimer Diss Assoc Disord 18：44：46)。

標靶為腦部類澱粉的首次免疫治療是Elan/Wyeth的AN-1792，一種活性疫苗。此治療在與腦膜腦炎(meningoencephalitis)相符的臨床徵候之發展後被終止。子群分析暗示，治療減緩認知功能的衰退(Nature Clin Pract Neurol(2005)1：84-85)。在病患死亡後的分析也顯示斑塊清除(plaque-clearance)的證據(Gilman S.et al,(2005)Neurology 64(9)1553-1562)。Bapineuzumab(AAB-001,Elan/Wyeth)，一種被動MAb療法已被顯示明顯增進在一個小的第I期安全性研究的認知分數。

其它特徵在於升高的β-類澱粉含量或β-類澱粉沉積的疾病或異常包括輕微認知損傷(MCI,Blasko I(2006)Neurobiology of aging“Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease：Prediction by plasma amyloid beta 42,medial temporal lobe atrophy and homocysteine”in press,e-published 19 Oct 2006)，Dutch型之帶有β-類澱粉病變的遺傳性大腦出血(hereditary cerebral haemorrhage)、大腦β-類澱粉血管病變(angiopathy)以及各種不同類型的退化性癡呆，諸如那些與帕金森氏症、進行式核上麻痺(progressive supranuclear palsy)、皮質基底退化症(cortical basal degeneration)與阿茲海默症的泛發性路易體型(diffuse Lewy body type)(Mollenhauer B(2007)J Neural Transm e-published 23 Feb 2007,van Oijen,M Lancet Neurol.20065：655-60)以及唐氏症(Mehta,PD(2007)J Neurol Sci.254：22-7)相關者。

在本發明的一具體例中提供一種治療抗體，其為一種抗體或抗原結合片段和/或其衍生物，它以低於100 pM的平衡常數KD結合β-類澱粉肽1-12(序列辨識編號：15)但不結合至β-類澱粉肽2-13(序列辨識編號：44)，兩種決定在利用被捕獲在鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)晶片上之肽的表面電漿子共振分析來被產生。

在本發明的另一具體例中提供一種治療抗體，其為一種抗體或抗原結合片段和/或其衍生物，它以低於100 pM的平衡常數KD結合β-類澱粉肽1-12(序列辨識編號：15)但對於結合至β-類澱粉肽2-13(序列辨識編號：44)具有大於1000倍於肽1-12(序列辨識編號：15)所具有者的平衡常數KD，兩種決定在利用被捕獲在鏈黴抗生物素蛋白晶片上之肽的表面電漿子共振分析來被產生。

在本發明的另一具體例中提供一種治療抗體，其為一種抗體或抗原結合片段和/或其衍生物，它以低於100 pM的平衡常數KD結合β-類澱粉肽1-12(序列辨識編號：15)但對於結合至β-類澱粉肽2-13(序列辨識編號：44)具有大於10,000倍於肽1-12(序列辨識編號：15)所具有者的平衡常數KD，兩種決定在利用被捕獲在鏈黴抗生物素蛋白晶片之肽上的表面電漿子共振分析來被產生。

在一方面，利用被捕獲在鏈黴抗生物素蛋白晶片上的該表面電漿子共振分析是一種如下面實施例所述的表面電漿子共振分析。在另一方面，利用被捕獲在鏈黴抗生物素蛋白晶片上的該表面電漿子共振分析是一種下面SPR Biacore^TM Analysis中所述的方法A(i)。

在本發明的一任擇具體例中提供一種治療抗體，其為一種抗體或抗原結合片段和/或其衍生物，它以低於10 nM的平衡常數KD結合β-類澱粉肽1-40但不結合至β-類澱粉肽2-13(序列辨識編號：44)，兩種決定在如下面所述實施例之方法B的表面電漿子共振分析來被做出。

在本發明的另一任擇具體例中提供一種治療抗體，其為一種抗體或抗原結合片段和/或其衍生物，它以低於10 nM的平衡常數KD結合β-類澱粉肽1-40但對於結合至β-類澱粉肽2-13(序列辨識編號：44)具有大於1000倍於肽1-12(序列辨識編號：15)所具有者的平衡常數KD，兩種決定在如下面所述實施例之方法B的表面電漿子共振分析來被產生。

在本發明的另一任擇具體例中提供一種治療抗體，其為一種抗體或抗原結合片段和/或其衍生物，它以低於10 nM的平衡常數KD結合β-類澱粉肽1-40但對於結合至β-類澱粉肽2-13(序列辨識編號：44)具有大於10,000倍於肽1-12(序列辨識編號：15)所具有者的平衡常數KD，兩種決定在如下面所述實施例之方法B的表面電漿子共振分析來被產生。

在本發明的一具體例中提供一種治療抗體，其為一種結合β-類澱粉肽的抗體或抗原結合片段和/或其衍生物且其包含有下列CDRs：

CDRH1：DNGMA(序列辨識編號：1)

CDRH2：FISNLAYSIDYADTVTG(序列辨識編號：2)

CDRH3：GTWFAY(序列辨識編號：3)

在衍生自VH3基因家族的一人類重鏈可變區(human heavy chain variable region)之內以及：

CDRL1：RVSQSLLHSNGYTYLH(序列辨識編號：4)

CDRL2：KVSNRFS(序列辨識編號：5)

CDRL3：SQTRHVPYT(序列辨識編號：6)

在衍生自被揭露於GenPept項目CAA51135(序列辨識編號：24)之胺基酸序列的一人類輕鏈可變區(human light chain variable region)之內。

此通篇說明書，術語“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”依據如Kabat等人中所提出的Kabat編號系統(Sequences of proteins of Immunological Interest NIH,1987)。因此下列定義依據本發明的CDRs：

CDR：殘基

CDRH1：31-35B

CDRH2：50-65

CDRH3：95-102

CDRL1：24-34

CDRL2：50-56

CDRL3：89-97

VH3基因家族以及相關聯的免疫球蛋白基因命名是在Matsuda等人(Journal of Experimental Medicine,188：2151-2162,1998)以及Lefranc與Lefranc(The Immunoglobulin Factsbook.2001.Academic Press：London)所描述的。

在一特定具體例中，人類重鏈可變區源自於：

‧被選自於下列VH3家族成員之子集(subset)的V基因：VH3-48、VH3-21、VH3-11、VH3-7、VH3-13、VH3-74、VH3-64、VH3-23、VH3-38、VH3-53、VH3-66、VH3-20、VH3-9 & VH3-43

‧被選自於下列VH3家族成員之子集的V基因：VH3-48、VH3-21 & VH3-11

‧VH3-48基因 或其對偶基因(allele)。

該序列在基因銀行項目M99675中是VH3-48基因的對偶基因。M99675是DNA基因體片段的基因銀行核苷酸序列，包括兩個構成人類重鏈基因VH3-48(序列辨識編號：22)並且編碼被給予為序列辨識編號：21之可變區胺基酸序列的表現子(exons)。在一特別的方面，該人類受體重鏈框架(human acceptor heavy chain framework)是衍生自M99675。

為了構築完整的V區，框架4必須加入被生殖系列所 編碼的V-基因M99675。適當的框架4序列包括由人類JH4袖珍基因(minigene)(Kabat)所編碼者。

YFDYWGQGTLVTVSS(序列辨識編號：23)

其中起始四個殘基落入CDR3區，其由施者抗體(donor antibody)而來的進入CDR所取代。

習於技藝者理解：生殖系列V基因以及J基因不包括有關重鏈CDR3的全部之編碼序列。然而，在本發明的抗體中，CDR3序列是由施者免疫球蛋白所提供。因此，一VH基因(諸如VH3-48)、一JH袖珍基因(諸如JH4)，以及一系列重鏈CDRs(諸如序列辨識編號：1、序列辨識編號：2以及序列辨識編號：3)(以一種方式被集合以模擬一成熟的、完全重組的重鏈可變區)的組合足以來定義諸如以序列辨識編號：26、28、30為代表之本發明的重鏈可變區。

由Genpept ID CAA51134所編碼的可變區具有被給予為序列辨識編號：24的胺基酸序列。

被知曉為GenPept ID CAA51134的輕鏈可變區框架序列被推論為完全經重組之輕鏈可變區的胺基酸序列並相同於另一個在資料庫中帶有相同框架之胺基酸序列：Genpept讀取編號S40356，且被描述於Klein,R.等人之中(Eur.J.Immunol.23(12),3248-3262)。有關於CAA51134的DNA編碼序列，像是Genbank讀取編號X72467般可被使用的，被給予如同序列辨識編號：25。

在本發明的一特定方面，人類受體重鏈框架是衍生自M99675以及JH4袖珍基因而人類施者輕鏈框架是衍生自 CAA51135，選擇性地含有一個或多個(諸如一至四個，更特別地一至三個)，以在施者V_H領域(具有序列辨識編號：17)與V_L領域(具有序列辨識編號：19)所發現到的對應殘基為主之胺基酸殘基取代，其維持全部或基本上所有有關於β-類澱粉肽之施者抗體的結合親和力。

“基本上全部結合親和力”是意為治療抗體相較於施者抗體在結合親和力上具有至多十倍的降低。

在更特別的一方面，衍生自M99675以及JH4的人類受體重鏈框架具有一至四個選自於位置24、48、93和/或94的胺基酸殘基取代(Kabat編號)。

在本發明更特別的一方面，衍生自M99675以及JH4的人類受體重鏈框架包含下列殘基(或其守恆性取代)：(i) 或(ii) 或(iii)

在本發明的一具體例中提供一種治療抗體，其包含一具有在序列辨識編號：26、28或30中所提出的序列之V_H鏈以及一具有在序列辨識編號：32中所提出的序列之V_L區。

在本發明另一具體例中提供一種治療抗體，該抗體包含一具有在序列辨識編號：34、36或38中所提出的序列之重鏈以及一具有在序列辨識編號：40中所提出的序列之輕鏈。

在本發明的另一具體例中提供一種包含一根據本發明之治療抗體的醫藥組成物。

在本發明的又一具體例中提供一種治療受β-類澱粉肽相關聯疾病所苦的人類病患，該方法包含對該病患投予治療有效量的依據本發明之治療抗體的步驟。

亦被提供的是依據本發明之治療抗體在製造用於治療與β-類澱粉肽相關聯疾病之醫藥品的用途。

在本發明的另一具體例中提供用於製造依據本發明之治療抗體的製程，該製程包含在一宿主細胞中表現編碼該抗體之多核苷酸。

在本發明的另一具體例中提供一種編碼治療抗體重鏈的多核苷酸，該治療抗體重鏈包含一具有如序列辨識編號：26、28或30中所提出的序列之V_H鏈。

在本發明的另一具體例中提供一種編碼一治療抗體輕 鏈的多核苷酸，該治療抗體輕鏈包含一具有如序列辨識編號：32中所提出的序列之一V_L領域。

在本發明的另一具體例中提供一種編碼一治療抗體重鏈的多核苷酸，該治療抗體重鏈具有如序列辨識編號：34、36或38之中所提出的序列。

在本發明的另一具體例中提供一種編碼一治療抗體輕鏈的多核苷酸，該治療抗體輕鏈具有如序列辨識編號：40中所提出的序列。

在本發明的一更特別具體例中提供一種編碼一治療抗體重鏈之多核苷酸，該多核苷酸包含如序列辨識編號：35、37、39或42中所提出的序列。

在本發明的另一個更特別的具體例中提供一種編碼一治療抗體輕鏈的多核苷酸，該多核苷酸包含如序列辨識編號：41或43中所提出的序列。

在一特別具體例中，該治療抗體(其為一抗體或片段和/或其衍生物)基本上缺少下列功能a)活化依據典型路徑的補體；以及b)媒介抗體依賴型的細胞毒殺作用。

在本發明的另一具體例中提供一抗體或其一片段，其包含一具有序列辨識編號：17之V_H領域以及一具有序列辨識編號：19之V_L領域。

在本發明的另一具體例中提供編碼一抗體重鏈或其一片段的多核苷酸，特別是序列辨識編號：18的多核苷酸，該抗體重鏈或其一片段包含一具有序列辨識編號：17的V_H領域。

在本發明的另一具體例中提供編碼一抗體輕鏈或其一片段的多核苷酸，特別是序列辨識編號：20的多核苷酸，該抗體輕鏈或其一片段包含一具有序列辨識編號：19的V_L領域。

發明詳細說明 1.抗體結構 1.1完整的抗體

完整的抗體通常是包含至少二重鏈及二輕鏈的異多聚體(heteromultimeric)醣蛋白。IgM之外，完整的抗體是大約150 KDa的異多聚體醣蛋白，由兩個相同的輕鏈(L)以及兩個相同的重鏈(H)所組成。典型地，各個輕鏈是透過一共價雙硫鍵而被連結至一重鏈而在不同免疫球蛋白同型(isotype)之重鏈間的雙硫連結數目有變化。各重及輕鏈亦具有鏈內雙硫橋(intrachain disulfide bridges)。各重鏈在一端具有一可變領域(variable domain,V_H)隨後一些恆定區(constant region)。各輕鏈在其另一端具有一可變領域(V_L)以及一恆定區；輕鏈的恒定區與重鏈的第一恆定區並排而輕鏈可變領域與重鏈的可變領域並排。從大多數脊椎動物物種而來的抗體之輕鏈可被分成兩型中之一(依據恆定區的胺基酸序列而被稱為Kappa與Lambda)。隨著它們之重鏈恆定區的胺基酸序列，人類抗體可被分成五種不同類型，IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM。IgG與IgA可進一步被再區分為五種次子類(subclass)，IgG1、IgG2、IgG3與IgG；以及IgA與IgA。物種變異體以帶有至少IgG2a、IgG2b的小鼠與大鼠 來存在。抗體的可變區在抗體與展現特定變異性(被稱為互補決定區(complementarity determining regions)CDRs)方面給予結合專一性。該可變區的更為守恆之部分被稱為框架區(framework region,FR)。完整的重鏈與輕鏈之各個可變領域包含四個由三個CDRs所連結的FR。各鏈中的CDRs是藉由FR區呈靠近相鄰般地被抓在一起並與從其它鏈而來的CDRs促進形成抗體的抗原結合位置。恒定區並不直接涉及抗體對抗原的結合但展現各種不同效應物功能(effector functions)，諸如參與抗體依賴型細胞媒介的毒殺作用(ADCC)、經由結合至Fc γ受體的吞噬作用、經由新生Fc抗體(FcRn)的半衰期/清除以及經由補體串級之C1q補體的補體依賴型的細胞毒性。人類IgG2恆定區缺少藉由典型路徑來活化補體的能力或媒介抗體依賴型細胞毒性。IgG4恆定區缺少活化藉由典型路徑來活化補體的能力且僅不有力地媒介抗體依賴型細胞毒性。基本上缺少這些效應物功能的抗體可被稱為“非裂解性抗體(non-lytic antibodies)”。

1.1.1人類抗體

人類抗體是藉由一些為那些習於技藝者所熟知的方法來被製造。人類抗體可以藉由使用人類骨髓瘤或小鼠/人類雜骨髓瘤細胞品系的融合瘤(hybridoma)方法而被製出(參見Kozbor J.Immunol 133,3001,(1984)and Brodeur,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp51-63(Marcel Dekker Inc,1987))。替代性方法包括使用噬菌體圖書館或轉殖基因小鼠，其兩者利用人類V區存庫(repertories)(參見Winter G,(1994),Annu. Rev.Immunol 12,433-455,Green LL(1999),J.Immunol.methods 231,11-23)。

轉殖基因小鼠的數種品系現在可被利用，其中它們的小鼠免疫球蛋白座(loci)已被人類免疫球蛋白基因節段(segments)所取代(參見Tomizuka K,(2000)PNAS 97,722-727；Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol.14,845-851,Mendez MJ,1997,Nature Genetics,15,146-156)。依據抗原攻毒(antigen challenge)，此小鼠可製造由感興趣之抗體能夠被選定而來的人類抗體存庫。

特別注意的是Trimera^TM系統(參見Eren R et al,(1998)Immunology 93：154-161)，其中人類淋巴球被移植到經輻射的小鼠，選定的淋巴球抗體系統(SLAM，參見Babcook et al,PNAS(1996)93：7843-7848)，其中人類(或其它物種)淋巴球是有效地完成一大量被收集的活體外(in vitro)抗體產生步驟隨後去盤繞(deconvulated)、限數稀釋法(limiting dilution)以及選擇步驟與Xenomouse Ⅱ^TM(Abgenix Inc)。一替代性方法是可使用從Morphotek Inc所獲得的Morphodoma^TM技術。

噬菌體表現技術(phage display technology)可被應用於製造人類抗體(以及其片段)，參見McCafferty；Nature,348,552-553(1990)以及Griffiths AD et al(1994)EMBO 13：3245-3260。根據此技術，抗體V領域基因被選殖進框架至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的蛋白質基因之主要或次要外套(coat)並且如功能性抗體片段被表現在噬菌體顆粒的 表面(通常利用輔助噬菌體(helper phage)的協助)。依據抗體之功能特性的選擇造成編碼表現這些特性之抗體的基因之選擇。噬菌體表現技術可被應用於從圖書館(由自罹患如上所述之疾病或異常的個體所取出的人類B細胞或替代地未經免疫的人類施者所做出的)以選出抗原專一性抗體(參見Marks；J.Mol.Bio.222,581-597,1991)。若一完整的人類抗體被意欲為包含一Fc領域，再選殖(reclone)噬菌體表現所衍生之片段至哺乳類動表現載體(包含所欲的恒定區並且建立穩定的表現細胞品系)是需要的。

親和力成熟(affinity maturation)(Marks；Bio/technol 10,779-783(1992))可被應用於增進結合親和力，其中主要人類抗體的親和力是藉由以天然變異體連續地取代H與L鏈V區並且依據增進的結合親和力來選定而被改良。此技術的變異體(諸如’抗原決定區銘印(epitope imprinting)’)現在亦可被獲得，參見WO 93/06213。亦參見Waterhouse；Nucl.Acids Res 21,2265-2266(1993)。

1.2嵌合與人乳化抗體(chimaeric and humanized antibodies)

在治療人類疾病或異常上使用完整非人類抗體帶有現今已形成之潛在免疫原性(immunogenicity)的問題，特別是關於抗體的重複投藥，病患的免疫系統可能辨識非人類完整抗體為非自(non-self)並且發動中和反應(neutralizing response)。除了發展完全人類抗體之外(參見上面)，各種不同技術這些年已被發展以克服這些問題並且通常涉及降低完整治療抗體之非人類胺基酸序列的組成而保留從經免疫 動物(例如小鼠、大鼠或兔)獲得非人類抗體的相對簡易性。兩種廣泛的方法已被應用於達到此。第一種是嵌合抗體，其通常包含一非人類(例如齧齒動物諸如小鼠)可變區被融合至人類恆定區。由於抗體的抗原結合位置位在可變區內，該嵌合抗體保留其對於抗原的結合親和力但需要人類恆定區的效應物功能並且因而可執行諸如上文中所述的效應物功能。嵌合抗體典型地是使用重組DNA方法而被製造。編碼該抗體的DNA(例如cDNA)是被分離並且使用習知步驟而被定序(例如藉由使用專一結合編碼本發明之抗體的H與L鏈可變區的基因之寡核苷酸探針，例如上文所述序列辨識編號：18與20的序列)。融合瘤細胞作為此DNA的典型來源。一旦被分離，DNA被放入表現載體，其接著被轉染到宿主細胞(諸如不製造免疫球蛋白蛋白質的E.coli、COS細胞、CHO細胞、PerC6細胞或骨髓瘤細胞)以獲得抗體的合成。該DNA可以藉由令對應非人類(例如鼠類)H與L恆定區取代有關於人類L與H鏈之編碼序列而被修飾，參見例如Morrison；PNAS 81,6851(1984)。因此本發明的另一具體例提供一嵌合抗體，其包含有一具有序列辨識編號：17的V_H領域以及一具有融合至一人類恆定區(其可以是IgG同型，例如IgG1)之序列辨識編號：19的V_L領域。

第二種方法涉及產生人類化的抗體，其中該抗體的非人類含量是藉由人類化可變區而被降低。兩種有關於人類化的技術已獲得普及。第一種是依據CDR移植(CDR grafting)的人類化。CDRs建造出鄰近抗體N端之套環，於 該處它們形成位在由框架區所提供之鷹架(sacffold)的表面。抗體的抗原結合專一性主要是藉由形貌(topography)以及藉由其CDR表面的化學特徵來被定義。這些特徵依序根據個別CDRs的構形(conformation)、根據CDRs的相對位置，以及根據含有CDRs的殘基之側鏈的特性與位置而被決定。在免疫生成性的大量降低可能藉由只移植非人類(例如鼠類)抗體(例如“施者抗體”)的CDRs到適當的人類框架(“受體框架”)與恆定區而被達成(參見Jones et al(1986)Nature 321,522-525以及Verhoeyen M et al(1988)Science 239,1534-1536)。然而，CDR移植就其本身來說可能無法造成抗原-結合特性的完整保留且其被頻繁地發現到：若顯著的抗原結合親和力要被恢復，施者抗體的一些框架殘基在人乳化分子中需要被保護(有時被指為“回復突變(backmutation)”)(參見Queen C et al(1989)PNAS 86,10,029-10,033,Co,M et al(1991)Nature 351,501-502)。在此例中，相對非人類施者抗體表現最大序列同源性(典型地60%或更高)的人類V區可被選自於一資料庫以提供人類框架(FR)。人類FRs的選擇可以從人類同一或個別人類抗體而被做出。若需要，從施者抗體而來的主要殘基可以被取代成人類受體框架以保留CDR的構形。抗體的電腦模擬可被應用於協助鑑定諸如結構上重要的殘基，參見WO99-48523。

另擇地，人類化可以藉由“面飾(veneering)”步驟而被達成。獨特的人類與鼠類免疫球蛋白重與輕鏈可變區之統計 分析表示：被暴露的殘基之確實模式(pattern)是不同於人類與鼠類抗體，且大多數個別的表面位置具有關於少數不同殘基的強烈表現(參見Padlan E.A.et al；(1991)Mol.Immunol.28,489-498以及Pedersen J.T.et al(1994)J.Mol.Biol.235；959-973)。因此藉由取代經暴露殘基於其框架區(不同於那些通常在人類抗體中被發現的)來降低非人類Fv之免疫生成性是可能的。因為蛋白質抗原性(antigenicity)是與表面可接近性(surface accessibility)相關聯的，表面殘基的取代可能足以致使小鼠可變區對人類免疫系統來說是“看不見的(invisible)”(亦參見Mark G.E.et al(1994)in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113：The pharmacology of nomoclonal Antibodies,Springer-Verlag,pp 105-134)。因為該抗體僅有表面被改面，此人類化的程序被指為“面飾”，支持的殘基維持未被妨礙的(disturbed)。更多替代性方法包括在WO04-006955中所提出的以及Humaneering^TM(Kalobios)(其利用細菌表現系統並製造在序列上接近人類生殖系列的抗體)的程序(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007,San Diego,California)。

對於那些習於該技藝者來說，術語“被衍生(derived)”意欲定義不僅僅是有關於原料的物理來源的意思，也定義結構上相同於該物質但非衍生自參照來源的來源。因此“在施者抗體中被發現到的殘基”不必然自施者抗體被純化出。

在該技藝中被充分認知到的是：特定胺基酸取代被視 為“守恆的(conservative)”。胺基酸是依據一般側鏈特性而被區分為數群且在維持本發明之治療抗體的全部或基本上所有結合親和力的群組內的取代被視為是守恆性取代，參見下表1：

1.3雙專一性抗體(bispecific antibodies)

雙專一性抗體是一種具有關於至少兩種不同抗原決定區的抗體衍生物並且也形成本發明的一部分。做出此抗體的方法在該技藝中是被知曉的。習用地，雙專一性抗體的重組製造是依據兩種免疫球蛋白H鏈-L鏈對的共表現(coexpression)，其中兩種H鏈具有不同的結合專一性(參見Millstein et al,Nature 305 537-539(1983),WO93-08829以及Traunecker et al EMBO,10,1991,3655-3659)。由於H與L鏈的隨機搭配(random assortment)，十種不同抗體結構的可能混合物被製造出，其中只有一者具有所欲的結合專一性。一種替代性方法涉及將帶有所欲的結合專一性之可變 區融合至含有至少一部分樞紐區(hinge region)(CH2與CH3區)的重鏈恆定區。令含有需用於輕鏈結合的位置之CH1區出現在至少一融合是較佳的。編碼這些融合的DNA，以及若需要L鏈被***分開的表現載體並且接著被共轉染(cotransfected)到適當宿主生物中。雖然***有關兩種或全部三種鏈的編碼序列至一表現載體是可能的。在一較佳的方法中，雙專一性抗體是由一帶有第一結合專一性於一臂的H鏈以及提供一第二結合專一性於另一臂的一H-L鏈對所組成(參見WO94/04690)。亦參見Suresh et al Methods in Enzymology 121,210,1986。

治療蛋白質投遞到腦部已受到血腦障蔽(BBB)的存在而被阻礙。若其意欲投遞本發明之抗體或本發明之抗體片段通過BBB，若需要，各種不同策略已被提出以增強此投遞。

為了從血液獲得所需要的養分與因子，BBB具有一些特定受體，其自循環血液輸送化合物至腦部。研究已指出，一些化合物像是胰島素(參見Duffy KR et al(1989)Brain Res.420：32-38)、運鐵蛋白(transferin)(參見Fishman JB et al(1987)J.Neurosci 18：299-304)以及類胰島素生長因子(insulin-Like Growth Factor)1與2(參見Pardridge WM(1986)Endocrine Rev.7：314-330以及Duffy KR et al(1986)Metabolism 37：136-140)經由受體媒介的穿胞運輸(receptor-mediated transcytosis)而橫跨BBB。有關於這些分子的受體因而提供用於本發明之治療抗體的潛在方法以利 用被稱為是“載體化(vectored)”的抗體來接近腦部(參見Pardridge WM(1999)Advanced Drug Delivery Review 36：299-321)。舉例來說，針對運鐵蛋白的抗體已被顯示為動態地被運輸進入腦實質(brain parenchyma)(參見Friden PM et al(1991)PNAS 88：4771-4775以及Friden PM et al(1993)Science 259：373-377)。因而一種可能的方法是在製造一種諸如上文所述的雙專一性抗體或雙專一性片段，其中一第一專一性是用於？而一第二專一性是用於位在BBB的運輸受體(例如第二專一性是用於運鐵蛋白運輸受體)。

1.4抗體片段

在本發明的特定具體例中提供治療抗體，其為一種抗原結合片段。此片段可以是完整和/或人乳化和/或嵌合抗體的功能性抗原結合片段(諸如上文所述抗體之Fab、Fd、Fab’、F(ab’)₂、Fv、ScFv片段)。缺乏恆定區的片段缺少活化依照典型路徑的補體之能力或媒介抗體依賴型細胞毒殺作用。習用地，此片段是藉由透過例如木瓜酶(papain)消化完整抗體的蛋白水解消化(參見例如WO94/29348)而被製造但可以直接地從重組轉型宿主細胞製造而來。有關於ScFv的製造，參見Bird et al；(1998)Science,242,423-426。此外，抗體片段可以使用各種不同如下面描述的工程技術來被製造。

Fv片段顯現為較Fab片段具有較低的它們兩鏈交互作用能量(interaction energy)。為了穩定V_H與V_L領域的聯結(association)，它們以肽(Bird et al,(1988)Science 242, 423-426,Huston et al,PNAS,85,5879-5883)、雙硫橋(Glockshuber et al,(1990)Biochcemistry,29,1362-1367)以及“’洞中球(knob in hole)”突變(Zhu et al(1997),Protein Sci.,6,781-788)來被連結。ScFv片段能夠藉由對那些習於本技藝者來說為已知的方法而被製造，參見Whitlow et al(1991)Methods companion Methods Enzymol,2,97-105以及Huston et al(1993)Int.Rev.Immunol 10,195-217。ScFv可以在細菌細胞(諸如E.coli)被製造出，但更典型地在真核細胞中被製造出。ScFv的一個缺點是產物的單價性(monovalency)，其排除由於多價結合而增加的結合性(avidity)以及它們的短半衰期。要克服這些問題的嘗試包括藉由化學偶合從含有一個額外的C端半胱胺酸的ScFv製造雙價(ScFv’)₂(Adams et al(1993)Can.Res 53,4026-4034以及MCartney et al(1995)Protein Eng,8,301-314)或藉由含有一未配對C端半胱胺酸殘基的ScFv之自發性區位特定二聚合作用(spontaneous site-specific dimerization)(參見Kipriyanov et al(1995)Cell.Biophys 26,187-204)而來的雙價(ScFv’)₂。另擇地，ScFv可藉由縮短肽連接子(linker)到3至12個殘基之間以形成“雙功能抗體(diabodies)”而被強迫形成集合體(multimer)，參見Holliger et al PNAS(1993),90,6444-6448。降低連接子仍進一步可造成三聚體(trimer)(三功能抗體(tribodies)，參見Kortt et al(1997)Protein Eng,10,423-433)以及四聚體(四功能抗體(tetrabodies)，參見Le Gall et al(1999)FEBS Lett,453,164-168)。雙價ScFv分子的建 構物亦可藉由與蛋白質二聚體化主旨(motif)的遺傳學融合以形成“袖珍抗體(miniantibodies)”(參見Pack et al(1992)Biochemistry 31,1579-1584)以及“微型抗體(minibodies)”(參見Hu et al(1996),Cancer Res.56,3055-3061)。ScFv-Sc-Fv串連((ScFV)₂)也可以藉由透過一第三肽連接子來連接兩個ScFv單元而被製造出，參見Kurucz et al(1995)J.Immol.154,4576-4582。雙特異性雙功能抗體可以經由兩個單鏈融合產物(其由從一抗體而來的V_H領域透過一短連接子被連結至另一抗體的V_L領域所構成，參見Kipriyanov et al(1998),Int.J.Can 77,763-772)的非共價結合而被製造出。此雙特異性雙功能抗體的穩定性是透過引入如上文所述的雙硫橋或“洞中球”突變或藉由單鏈雙功能抗體(ScDb)(其中兩個雜交ScFv片段是經由一肽連接子而被連結，參見Kontermann et al(1999)J.Immunol.Methods 226179-188)而被提升。四價雙特異性分子可藉由例如透過一樞紐區令一ScFv片段融合一IgG分子的CH3領域或一Fab片段而被得到(參見Coloma et al(1997)Nature Biotechnol.15,159-163)。另擇地，四價雙特異性分子已藉由融合雙特異性單鏈雙功能抗體而被造出(參見Alt et al,(1999)FEBS Lett 454,90-94)。較小的四價雙特異性分子也可以藉由ScFv-ScFv串連與一含有螺旋-圈環-螺旋結構(helix-loop-helix)主旨(DiBi袖珍抗體，參見Muller et al(1998)FEBS Lett 432,45-49)或含有四個呈預防分子內配對的位向之抗體可變領域(V_H與V_L)的單鏈分子(串連雙功能 抗體，參見Kipriyanov et al,(1999)J.Mol.Biol.293,41-56)之雙聚體化而被形成。雙特異性F(ab’)2片段可以透過Fab’片段的化學偶合或藉由透過白胺酸拉鍊的異雙聚體化而被造出(參見Shalaby et al,(1992)J.Exp.Med.175,217-225以及Kostelny et al(1992),J.Immunol.148,1547-1553)。分離的V_H與V_L領域亦可以被利用，參見US 6,248,516；US6,291,158；US6,172,197。

1.5雜共軛抗體(heteroconjugate antibodies)

雜共軛抗體是衍生物，其亦形成本發明的一具體例。雜共軛抗體是由兩個共價連結的抗體使用任何簡便交聯方法所形成而被構成。參見US 4,676,980。

1.6其它修飾(modification)

抗體的Fc區與各種不同Fc受體(FcγR)的交互作用被相信是媒介抗體的效應物功能，其包括抗體依賴型細胞毒殺作用(ADCC)、補體的固定，吞噬作用以及抗體的半衰期/清除。對本發明抗體之Fc區的各種不同修飾可以視所欲的效應物特性而被施行。特別地，人類恆定區(基本上缺少下列功能a)藉由典型路徑活化補體；以及b)媒介抗體依賴型細胞毒殺作用)包括IgG4恆定區、IgG2恆定區以及IgG1恆定區，其含有像是例如在EPO307434(WO8807089)、EP 0629240(WO9317105)以及WO2004-014953所揭示於位置234、235、236、237、297、318、320和/或322的突變。在重鏈恆定區之CH2領域內於殘基235或237的突變(Kabat標號；EU指標系統)被分開地描述以降低對FcγR I、FcγR Ⅱ 與FcγR Ⅲ的結合並且因而減少抗體依賴型細胞毒殺作用(ADCC)(Duncan et al.Nature 1988,332；563-564；Lund et al.J.Immunol.1991,147；2657-2662；Chappel et al.PNAS 1991,88；009063-9040；Burton and Woof,Adv.Immunol.1992,51；1-84；Morgan et al.,Immunology 1995,86；319-324；Hezareh et al.,J.Virol.2001,75(24)；12161-12168)。再者，一些報導亦已描述一些這些殘基涉入徵召或媒介補體依賴型細胞毒性(CDC)(Morgan et al.,1995；Xu et al.,Cell.Immunol.2000；200：16-26；Hezareh et al.,J.Virol.2001,75(24)；12161-12168)。殘基235與237因而均被突變成丙胺酸殘基(Brett et al.Immunology 1997,91；346-353；Bartholomew et al.Immunology 1995,85；41-48；以及WO9958679)以降低補體媒介以及FcγR媒介的效應。含有這些恆定區的抗體可以被稱為“非裂解性”抗體。

吾人可將救助受體(salvage receptor)結合抗原決定區併入抗體以增加血清半衰期，參見US5,739,277。

五種目前已被鑑識出的人類Fcγ受體、FcγR(I)、FcγR Ⅱ a、FcγR Ⅱ b、FcγR Ⅲ a以及新生FcRn。Shields et al,(2001)J.Biol.Chem 276,6591-6604證實一組通常的IgG1殘基涉及結合所有FcγRs，而FcγR Ⅱ與FcγR Ⅲ使用有別於此一般組以外的位置。當被改變成丙胺酸：Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297以及Pro-239，一群IgG1被降低結合至所有FcγRs。所有是在IgG CH2領域內並且群集在鄰近接合CH1與CH2的樞紐。雖然FcγR I僅使用該一 般組的IgG1殘基供結合，FcγR Ⅱ與FcγR Ⅲ和除了該一般組以外的不同殘基交互作用。一些殘基的改變僅降低結合至FcγR Ⅱ(例如Arg-292)或FcγR Ⅲ(例如Glu-293)。一些變異體顯示對FcγR Ⅱ與FcγR Ⅲ增進的結合但不影響結合至其它受體(例如Ser-267 Ala增進結合至FcγR Ⅱ但結合至FcγR Ⅲ不受影響)。其它變異體對FcγR Ⅱ或FcγR Ⅲ展現增進的結合但降低對其它受體的結合(例如Ser-298 Ala增進對FcγR Ⅲ的結合但降低對FcγR Ⅱ的結合)。對於FcγR Ⅲ a來說，IgG1變異體具有的最佳結合是組合丙胺酸於Ser-298、Glu-333以及Lys-334的取代。新生FcRn受體被相信為涉及保護IgG分子免於分解並且因而增強血清半衰期跨過組織的穿胞運輸(參見Junghans R.P(1997)Immunol.Res 16.29-57以及Ghetie et al(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766)。被決定直接與人類FcRn交互作用的人類IgG1殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434以及His435。

本發明之治療抗體能夠併入任何上面的恆定區修飾。

在一特定具體例中，該治療抗體基本上缺乏下列功能a)藉由典型路徑活化補體；以及b)媒介抗體依賴型細胞毒性。在一更為特定具體例中本發明提供本發明的治療抗體，其具有如上面詳述任一(或更多)殘基的改變以修飾半衰期/清除和/或效應物功能，諸如ADCC和/或補體依賴型細胞毒性和/或補體裂解。

在本發明的又一方面，該治療抗體具有在位置235(例 如L235A)以及237(例如G237A)(依據Kabat中所列出的EU方案來編號)帶有丙胺酸(或其它中斷)取代的同型人類IgG1之恆定區。

本發明的其它衍生物包括本發明抗體的醣化變異體。於它們的恆定區之守恆位置的抗體醣化被知曉為在抗體功能上具有深刻的效果，特別是效應物功能諸如那些如上所述，參見例如Boyd et al(1996),Mol.Immunol.32,1311-1318。本發明治療抗體的醣化變異體(其中醫或多碳水化合物部分被加入)取代，刪除或修飾是能夠預想的。引入一天門冬胺酸-X-絲胺酸或天門冬胺酸-X-蘇胺酸主旨創造供碳水化合物酵素性接合的可能位置並且可能因而被應用於操作抗體的醣化。在Raju et al(2001)Biochemistry 40,8868-8876中，TNFR-IgG免疫粘附素(immunoadhesin)的末端唾液酸化(sialyation)是經由使用貝他(beta)-1,4-半乳糖轉移酶和/或阿伐(alpha),2,3唾液酸轉移酶的再半乳糖化(regalactosylation)和/或再唾液酸化而被增加。增加末端唾液酸化被認為是增加免疫球蛋白的半衰期。抗體，與大多數醣蛋白一樣，在自然界中是典型地被製造成醣化形式的混合物。當抗體在真核，特別是哺乳類細胞中被製造時，此混合物是尤為明顯的。各種不同方法已被發展出以製造經定義的醣化形式，參見Zhang et al Science(2004),303,371,Sears et al,Science,(2001)29,2344,Wacker et al(2002)Science,298 1790,Davis et al(2002)Chem.Rev.102,579,Hang et al(2001)Acc.Chem.Res 34,727.。因而本發明涉及 多種如此處所述之含有一被定義數目(例如7或更少，例如5或更少諸如2或單一)之抗體的醣化形式的治療抗體(其可以是IgG同型，例如IgG1)。

依據本發明的衍生物亦包括本發明偶合至非蛋白質聚合物(non-proteinaeous polymer)(諸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯(polyoxyalkylene))的治療抗體。接合至PEG的蛋白質是一種以被建立的技術以供增加蛋白質的半衰期，還有提高蛋白質的抗原性與免疫生成性。利用不同分子量與模式(直線或分支的)來使用PEG化已被以完整抗體還有Fab’片段來研究，參見Koumenis I.L.et al(2000)Int.J.Pharmaceut.198：83-95。一特別的具體例包含本發明的抗原結合片段而不帶有下列效應物功能：a)藉由典型路徑活化補體；以及b)媒介抗體依賴型細胞內細胞毒性；(諸如Fab片段或scFv)偶合至PEG。

2.製造方法

本發明的抗體可以在轉殖基因生物中被製造，諸如羊(參見Pollock et al(1999),J.Immunol.Methods 231：147-157)、雞(參見Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News 20：1-55)、小鼠(參見Pollock et al同上)或植物(參見Doran PM,(2000)Curr.Opinion Biotechnol 11,199-204,Ma JK-C(1998),Nat.Med.4；601-606,Baez J et al,BioPharm(2000)13：50-54,Stoger E et al；(2000)Plant Mol.Biol.42：583-590)。抗體也可以藉由化學合成而被製造。然而本發明的抗體是典型地使用重組細胞培養技術(對那些習於本 技藝者為熟知的)而被製造。編碼該抗體的多核苷酸被分離並且被***可複製載體(諸如用以在宿主細胞中進一步繁殖或表現的質體)。一種有用的表現系統是麩胺酸合成酶系統(諸如由Lonza Biologics所販售的)，特別該宿主細胞為CHO或NS0(見下面)。編碼該抗體的多核苷酸使用習用步驟易於被分離且定序(例如寡核苷酸探針)。可被應用的載體包括質體、病毒、噬菌體、轉位子(transposon)、袖珍染色體(minichromosomes)，其中質體是一典型的具體例。通常此載體更包括可操作地連結至輕和/或重鏈多核苷酸的一單一序列、複製原點(origin of replication)、一個或多個標記基因(marker gene)、一增強要素(enhancer element)、一啟動子(promoter)以及轉錄終止序列以促進表現。編碼該輕與重鏈的多核苷酸可以被***分開的載體並且被同時或依序地引入相同的宿主細胞(例如藉由轉形、轉染、電穿孔或轉導)，或若需要重鏈與輕鏈兩者可在此引入前被***同一載體。

對於那些習於本技藝者來說，馬上明白因為遺傳密碼的多餘性(redundancy)，對於那些在此處揭示編碼本發明之多肽的替代性多核苷酸也是可利用的。

2.1訊息序列(signal sequences)

本發明的抗體能夠被製造成如帶有異源性訊息序列(在成熟蛋白質的N端具有特定剪切位置)的融合蛋白質。訊息序列能夠被受到宿主辨識並且處理。對於原核宿主來說，訊息序列可以是鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、青黴素酶(penicillinase)或熱穩定的腸毒素Ⅱ領導子 (enterotoxin Ⅱ leaders)。為了供酵母菌分泌，該訊息序列可以是酵母菌轉化酶領導子、α因子領導子或酸性磷酸酶領導子，參見例如WO90/13646。在哺乳類細胞系統中，病毒分泌領導子諸如單純皰疹gD(herpes simplex gD)訊息與天然免疫球蛋白訊息序列(諸如人類Ig重鏈)是可利用的。典型地，訊息序列是連結在閱讀框架中至編碼本發明抗體的多核苷酸。

2.2複製原點

複製原點在該技藝中被充分知曉為適用於大多數革蘭氏陰性細菌的pBR322，2μ質體適用於大多數酵母菌與各種不同病毒起點(諸如SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV)用於大多數哺乳類細胞。通常地，SV40複製原點要素對於合併的哺乳類表現載體來說是不被需要的。然而SV40 ori可以被包括，因為它具有早期啟動子。

2.3選擇標記(selection marker)

典型的選擇基因編碼下列蛋白質(a)提供對抗生素或其它毒素(例如青黴素、新黴素、氨甲喋呤、四環素)的抗性或(b)補充營養缺陷(complement auxotrophic deficiencies)或提供在複雜培養基中無法被利用的養分或(c)兩者組合。選擇計畫可涉及停止不含有載體或載體的宿主細胞生長。由於被共投遞之選擇標記所提供的藥物抗性，已成功利用編碼本發明之治療抗體的基因所轉形的細胞存活下來。一實施例是DHFR-選擇系統，其中轉形體在DHFR陰性宿主品系中被產生(例如參見Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9：64-68)。在此系統中，DHFR基因是連同本發明的抗體多核苷酸序列被共投遞且DHFR陽性細胞接著藉由核苷停用而被選出。若需要，DHFR抑制劑氨甲喋呤也可以被使用以選擇帶有DHFR基因擴增的轉形體。藉由操作連結DHFR基因至編碼本發明序列的抗體或其功能性衍生物，DHFR基因擴增造成感興趣之所欲抗體序列的伴隨擴增。CHO細胞是一種供此DHFR/氨甲喋呤選擇之特別有用的細胞品系，且擴增與使用DHFR系統的選擇宿主細胞之方法在該技藝中是已被充分建立，參見Kaufman R.J.et al J.Mol.Bio.(1982)159,601-621，有關於回顧參見Werner RG,Noe W.,Kopp K,Schulter M,“Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”,Arzneimittel-Forschung.48(8)：870-80,1998 Aug。又一實例是麩胺酸合成酶表現系統(Bebbington et al Biotechnology 1992 Vol 10 p 169)。應用於酵母菌的一適當選擇基因是trp1基因；參見Stinchcomb et al Nature 282,38,1979。

2.4啟動子

用以表現本發明之抗體的適當啟動子是操作地連結至編碼該抗體的DNA/多核苷酸。用於原核宿主的啟動子包括phoA啟動子，貝他-內醯胺(Beta-lactamase)與乳糖啟動子系統，鹼性磷酸酶，色胺酸與雜交啟動子(諸如Tac)。適用於在酵母菌細胞中表面的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它醣解酶(glycolytic enzymes)(例如烯醇酶、甘油醛3磷酸酯去氫酶、己醣激酶、丙酮酸去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸異構酶、磷酸甘油酸激 酶以及葡萄醣激酶)。可誘導的酵母菌啟動子包括酒精去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、重金屬蛋白質以及負責氮代謝與麥芽糖/半乳糖利用的酵素。用於在哺乳類細胞系統中表現的啟動子包括RNA聚合酶Ⅱ(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、雞腫瘤病毒、細胞巨大病毒(特別是立即早期基因啟動子)，反轉錄病毒、B型肝炎病毒、肌動蛋白、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子與早期或晚期猴病毒40與非病毒啟動子諸如EF-1阿伐(Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17)：5322)。啟動子的選擇可以依據所用於表現之宿主細胞的相容性。

2.5增強要素

若適當，例如用於表現在較高等的真核生物，額外的增強要素可被含括來取代或還有那些被發現位在上述啟動子中者。適當的哺乳類增強子序列包括從血紅素、彈性蛋白酶、白蛋白、胎兒蛋白、重金屬蛋白質以及胰島素。另擇地，可以使用從真核細胞病毒而來的增強要素，諸如SV40增強子、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子、桿狀病毒增強子或鼠類IgG2a基因座(參見WO04/009823)。雖然此增強子典型地位在啟動子上游的位置，它們也可以位在它處，例如在不轉錄區(untranslated region)內或聚腺苷酸化訊號的下游。增強子的選擇與位置可以根據所用於表現的宿主細胞之相容性。

2.6聚腺苷酸化與終止

在真核系統中，聚腺苷酸化訊號是操作地連結至編碼本發明抗體的聚核苷酸。此訊號典型地位在開放閱讀框架 的3'。在哺乳類系統中，非限定實例訊號包括那些從生長激素、延伸因子-1阿伐以及病毒(例如SV40)基因或反轉錄病毒長末端重複所衍生而來的。在酵母菌系統中，聚腺苷酸化/終止訊號包括那些衍生自磷酸甘油酸激酶(PGK)以及酒精去氫酶1(ADH)基因者。在原核系統中，聚腺苷酸化訊號是典型地不需要的且取而代之地是採用較短且更被限定的終止序列。聚腺苷酸化/終止序列可以根據所用於表現的宿主細胞之相容性。

2.7其它供提高產率的方法/要素

除了上述之外，其它可以被應用於提高產率的特點包括染色質重塑要素(chromatin remodeling elements)、表現子以及宿主細胞專一的密碼子修飾。本發明抗體之密碼子使用能夠被修飾以符合宿主細胞的密碼子偏差(codon bias)俾以放大轉錄和/或產率(例如Hoekema A et al Mol Cell Biol 1987 7(8)：2914-24)。密碼子的選擇可以根據所用於表現的宿主細胞之相容性。

2.8宿主細胞

用於選殖或表現編碼本發明抗體的載體之適當宿主細胞為原核、酵母菌或更高等的真核細胞。適當的原核細胞包括真細菌，例如腸內細菌科(enterobacteriaceae)(諸如大腸桿菌屬，例如大腸桿菌，例如ATCC 31,446；31,537；27,325)、腸內桿菌屬、伊文氏桿菌(Erwinia)、克雷白變形桿菌(Klebsiella proteus)、沙氏桿菌例如鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhirnurium)、沙雷氏菌例如黏質沙雷氏菌 (Serratia marcescens)與志賀桿菌屬(Shigella)還有桿菌屬諸如枯草桿菌(B.subtilis)以及苔蘚桿菌(B.licheniformis)(參見DD 266 710)、假單胞菌屬諸如綠膿桿菌(P.aeruginosa)與鏈絲菌屬(Streptomyces)。酵母菌宿主細胞之中，啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母(Kluyveromyces)(例如ATCC 16,045；12,424；24178；56,500)、羅威亞酵母(Yarrowia)(EP402,226)、畢赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070，亦參見Peng et al J.Biotechnol.108(2004)185-192)、念珠菌屬(Candida)、里氏木黴(Trichoderma reesia)(EP244,234)、青黴菌、多孢木屬(Tolypocladium)與麴菌屬(Aspergillus)宿主諸如小巢狀麴菌(A.nidulans)與黑色麴菌(A.niger)也可以被預想到。

雖然原核與酵母菌宿主細胞是由本發明所專一地被預想到，然而典型地，本發明的宿主細胞是脊椎動物細胞。適當的脊椎動物宿主細胞包括哺乳類細胞諸如COS-1(ATCC號碼CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、人類胚胎腎品系293、PerC6(Crucell)、幼倉鼠腎細胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC編號：CRL 10314)、293(ATCC編號CRL.1573)、中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO-K1，ATCC編號：CCL 61、DHFR減去CHO細胞品系諸如DG44(Urlaub et al,Somat Cell Mol Genet(1986)Vol 12 pp555-566)，特別是那些應用於懸浮培養的CHO細胞品系、小鼠賽托利細胞、猴腎細胞、非洲綠猴腎 細胞(ATCC CRL-1587)、HELA細胞、犬腎細胞(ATCC CCL 34)、人類腎細胞(ATCC CCL 75)、Hep G2與骨髓瘤或淋巴瘤細胞例如NS0(參見US 5,807,715)、Sp2/0,Y0。

因而在本發明的一具體例中提供一被穩定轉形的宿主細胞，其包含有編碼如此處所述治療抗體的一重鏈和/或輕鏈之載體。典型地，此宿主細胞包含一編碼該輕鏈的第一載體與一編碼該重鏈的第二載體。

此宿主細胞也可以進一步被設計或被改造以修飾本發明抗體的品質、功能和/或產率。非限定實例包括特定修飾(例如醣化)酵素與蛋白質摺疊帶位子(protein folding chaperones)的表現。

2.9細胞培養方法

以編碼本發明治療抗體之載體予以轉形的宿主細胞可以透過任何為那些習於本技藝者所熟知的方法來培養。宿主細胞可以被培養在旋轉燒瓶(spinner flasks)、震盪燒瓶(shake flasks)、滾瓶反應器(roller bottles)、波動反應器(wave reactors)(例如從wavebiotech.com而來的System 1000)或中空纖維系統，但對於大規模製造來說其較佳地攪拌槽反應器(stirred tank reactors)或袋反應器(bag reactor)特別被應用於懸浮培養。典型地，攪拌槽是使用例如噴嘴(spargers)、隔板(baffles)或低修剪葉輪(low shear impellers)而被改造以供通氣(aeration)。有關於氣泡塔式(bubble column)與氣升(airlift)反應器，以空氣或氧氣泡直接通氣可被應用。若宿主細胞被培養在無血清培養基中，此可被補充以細胞保護 劑(諸如商品名為普流尼克(pluronic F-68))以協助預防通氣過程造成的細胞損傷。根據宿主細胞特性，微載體(microcarriers)可以被用於作為錨座依賴型細胞品系的生長物質或該等細胞可被適應於懸浮培養(其為典型的)。宿主細胞的培養，特別是脊椎動物宿主細胞可利用各種不同的操作模式諸如批次(batch)、饋料批次(fed-batch)、重複批次處理(參見Drapeau et al(1994)cytotechnology 15：103-109)、延伸式批次處理或灌注培養。雖然重組轉形的哺乳動物宿主細胞可被培養在含有血清的培養基中而此培養基含有胎牛血清(FCS)，此類宿主細胞較佳地是培養在不含有血清的培養基中，諸如揭露在Keen et al(1995)Cytotechnology 17：153-163，或商業上可取得的培養基諸如ProCHO-CDM或UltraCHO^TM(Cambrex NJ,USA)，若需要補充以能量來源(諸如葡萄糖與合成生長因子諸如重組型胰島素)。宿主細胞之不含有血清的培養可能需要那些適應於生長在無血清條件下的細胞。一個適應方法是要培養此宿主細胞在含有血清的培養基中並且重複地將80%的培養基交換為不含有血清的培養基，以使得宿主細胞學習適應在無血清條件中(參見例如Scharfenberg K et al(1995)in Animal Cell technology：Developments towards the 21^st century(Beuvery E.C.et al eds),pp619-623,Kluwer Academic publishers)。

被分泌到培養基中的本發明之抗體可以使用各種不同技術從培養基被回收並純化以提供一程度的純化適於所欲的用途。例如使用本發明的治療抗體供治療人類病患，典 型地如透過還原SDS-PAGE所決定般至少95%純度，更特別地98%或99%純度，當與含有治療抗體的培養基比較。在第一種狀況下，從培養基而來的細胞碎片典型地使用離心隨後上澄液的澄清步驟(使用例如微過濾、超過濾和/或深層過濾)而被移除。另擇地，該抗體可以藉由微過濾、超過濾或深層過濾而不需要先前離心來被收穫。各種不同其它技術(諸如透析或凝膠電泳與層析技術諸如羥磷灰石(hydroxyapatite,HA)、親和力層析(選擇性地涉及親和力標籤系統諸如聚組胺酸)和/或疏水***互作用層析(HIC，參見US5,429,746))可以被使用。在一具體例中，本發明的抗體，在各種不同澄清步驟之後，是使用蛋白質A或G親和力層析隨後進一步層析步驟(諸如離子交換和/或HA層析、陰離子或陽離子交換、分子大小排斥層析(size exclusion chromatography)與硫酸銨沉澱)而被捕獲。典型地，各種不同病毒移除步驟亦可以被採用(例如使用DV-20過濾器的奈米過濾)。在這些各種不同步驟之後，被提供的是含有至少10 mg/ml或更高(例如100 mg/ml)之本發明抗體的純化製備物並且因而形成本發明的一具體例。達100 mg/ml或更高的濃度基本上可以是非本發明之抗體聚集形式。細菌系統可以特別是適合於抗體片段的表現。此片段是位在細胞內或細胞間質(periplasma)。不可溶細胞間質蛋白質可以根據那些習於本技藝者之方法來被萃取並且被再摺疊以形成活性蛋白質，參見Sanchez et al(1999)J.Biotechnol.72,13-20以及Cupit PM et al(1999)Lett Appl Microbiol,29,273-277。

3.醫藥組成物

如上文所述的本發明抗體之純化製備物(特別地單株製備物)可以被併入醫藥組成物，用於治療人類疾病或異常(諸如在上面被列出的)。典型地此組成物進一步包含有像是可接受的藥學實務上所知曉並稱做為醫藥學上可接受(亦即惰性的)的載體，參見例如Remingtons Pharmaceutical Sciences,16^th ed,(1980),Mack Publishing Co.。此載體的實例包括經滅菌的載體，諸如食鹽水、任氏液(Ringers solution)或左旋糖溶液，以適當緩衝劑(諸如三水乙酸鈉)予以緩衝至一藥學上可接受的pH，諸如落在5至8的pH範圍。用於注射的醫藥組成物(例如藉由靜脈內、腹膜內、皮內、皮下、肌肉內或門脈內)或連續輸液是適當地沒有可見顆粒物並且可能包含有從1 mg至10 g的治療抗體，典型地5 mg至1 g，更特別地5 mg至25 mg或50 mg抗體。用於製備此醫藥組成物的方法對於那些習於該技藝者來說是被知曉的。在一具體例中，醫藥組成物包含有呈單位劑量形式之從1 mg至10 g的本發明治療抗體，選擇性地加上有關於使用的指示。本發明的醫藥組成物可以被凍乾(冷凍乾燥)以供在投藥之前依據對於那些習於本技藝者來說為充分知曉或明顯地來被復原。若本發明的具體例包含有帶有IgG1同型之本發明的抗體，包括銅之金屬離子螯合劑(諸如檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)或EDTA或組胺酸)可以被加入該醫藥組成物中以降低此同型抗體之金屬媒介分解的程度(參見EP0612251)。醫藥組成物也可以包含有一助溶劑(solubiliser)(諸如精胺酸 鹼、清潔劑/抗凝集劑諸如聚山梨醇酯80，以及惰性氣體諸如氮氣以取代樣本瓶的頂部空間氧)。

有關於投藥本發明之抗體的有效劑量與治療攝生法通常是依據實驗來決定並且依據諸如病患的年齡、體重與健康狀態與要被治療的疾病或異常之因子而定。這些因子在照料醫師的範圍內。在選擇適當劑量上的指導可以在例如Smith et al(1977)Antibodies in human diagnosisi and therapy,Raven Press,New York中被找到但將通常地為1 mg至10 g。在一具體例中，用於治療病患的劑量攝生法是每周或每兩周一次地被皮下投藥之1 mg至1 g，或者每1或2個月靜脈內灌注的本發明治療抗體。此一劑量對應0.014-140 mg/kg，諸如0.014-14 mg/kg。本發明之組成物也可以被預防地來使用。

4.臨床用途

將被理解的是，以升高的β-類澱粉含量或β-類澱粉沉積為特徵的疾病包括阿茲海默症、輕微認知障礙、唐氏症、Dutch型之帶有β-類澱粉病變的遺傳性大腦出血、大腦β-類澱粉血管病變以及各種不同類型的退化性癡呆，諸如那些與帕金森氏症、進行式核上麻痺、皮質基底退化症與阿茲海默症的泛發性路易體型。

最佳地，以升高的β-類澱粉含量或β-類澱粉沉積為特徵的疾病是阿茲海默症。

雖然本發明就有關於治療人類疾病與異常已大部分被描述，本發明也能夠在非人類的哺乳類具有治療類似疾病或異常的應用性。

實施例

產生小鼠單株抗體2E7

小鼠單株抗體2E7是從習用免疫小鼠而被產生。小鼠被免疫以配製於佛氏佐劑(Freund’s adjuvant)之可溶性或聚集的β-類澱粉1-40與1-42。在最後不具有佐劑的追加免疫後，脾細胞與骨髓瘤細胞融合。融合的細胞被生長在96-井平盤上，自其融合瘤上澄液被掃瞄有關於可能的鉛。被選定的抗體2E7(其從以可溶性β-類澱粉1-40免疫所獲得者)是鼠類IgG2a同型並且在下面所述的流出分析(efflux assay)中具有貝他-類澱粉結合活性且當透過Biacore^TM，方法A(i)來被測量時，對貝他-類澱粉1-40的親和力為36.1 pM(表10A)。

2E7的抗原決定區繪圖

為了精細地繪製抗體2E7對β-類澱粉肽的結合，肽套組(A)被使用。肽套組(A)由一組3112-聚體(mer)重疊肽(涵蓋β-類澱粉1-42肽的完整序列)。各個連續的肽於β-類澱粉肽內的連續胺基酸被起始，因而透過單一胺基酸來轉換被含括在連續肽之間的序列。所有套組(A)中的肽含有3個胺基酸的C端連接子(甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸)以及末端被生物素化的離胺酸殘基。此外，除了肽Aβ1 DAEFRHDSGYEVGSGK-生物素(序列辨識編號：15)以外的所有肽是N端被乙醯基化的(acetylated)。一個肽的第二套組(套組(B))由從含有胺基酸1至10的β-類澱粉序列的肽之連續一胺基酸C端刪除所組成。所有套組(B)中的肽含有3個胺基酸的C端連接子(甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸)以及末端被生物素化的離胺酸殘基，但帶有額外甘胺酸與絲胺酸殘 基以取代刪除的β-類澱粉胺基酸(表2)。因此所有套組(B)中的肽為相同長度。

表2生物素化的肽(套組(B))之序列，其含有截斷的β-類澱粉N端片段DAEFRHDSGYGSGGSK-生物素(序列辨識編號：7)DAEFRHDSG--GSGSGSK-生物素(序列辨識編號：8)DAEFRHDS--GSGSGGK-生物素(序列辨識編號：9)DAEFRHD--GSGGSGGSK-生物素(序列辨識編號：10)DAEFRH--GSGGSGGSK-生物素(序列辨識編號：11)DAEFR--GSGGSGGSGSK-生物素(序列辨識編號：12)DAEF--GSGGSGGSGGSK-生物素(序列辨識編號：13)DAE--GSGGSGGSGGSGK-生物素(序列辨識編號：14)

使用光學生物感應器(Optical Biosensors)監測2E7與β-類澱粉衍生之肽的結合

96-井SRU Bind^TM的塗覆鏈黴抗生物素蛋白之平盤(SRU Biosystems)以含有1% DMSO的PBS洗滌以移除甘油與防腐劑。50 ul/井的體積被留下平衡至室溫而提供恆定基線。生物素化的肽被稀釋成大約0.3 ug/ml配於含有1% DMSO的PBS中且每50 ul被加入井中並被培養大約歷時1小時。重複的井是使用不同的平盤部份而被製備且至少一非-肽對照井被用於各部份以參照減去數據。在肽捕獲之後，平盤以含有1% DMSO的PBS洗滌、留下每井50 ul的新鮮緩衝液以在讀取機上提供新的基線。從表面並沒有 衰變(decay)被見到。緩衝液接著以含有測試抗體(呈20-64 nM)的40 ul/井緩衝液所取代歷時2小時。被發現到抗體2E7僅結合到套組(A)中含括β-類澱粉肽之胺基酸1-12的肽(肽Aβ1，序列辨識編號：15)。此結果暗示殘基1上的天門冬胺酸對於結合至此肽來說是重要的。

為了進一步描繪出抗體2E7的結合位置之特徵，肽套組(B)被使用。使用SRU BIND^TM生物感應方法學抗體，2E7對肽(含括β-類澱粉肽之胺基酸1-3與1-4，序列辨識編號：14與13)顯示不重要的結合。結合至含括β-類澱粉肽之胺基酸1-7(序列辨識編號：10)是比得上結合至含括β-類澱粉肽之胺基酸1-12(從套組(A))。結合至含括β-類澱粉肽之胺基酸1-5或1-6的肽(序列辨識編號：12或11)被發現到，但是相較於結合至含括β-類澱粉肽之胺基酸1-7的肽(序列辨識編號：10)是弱的(像是透過在額外洗滌步驟之後的穩定性而被測量到的)。

因此其顯示，當使用此方法學來被測量時，僅有β-類澱粉肽之胺基酸1-7對完全結合來說是需要的。

表面電漿子共振分析

除了上述實驗之外，Biacore^TM 3000光學生物偵測被用以偵測2E7抗體結合至選定的β-類澱粉序列所衍生的肽。結合是透過注射測試抗體(至高達64 nM)歷時5分鐘至被捕獲在分開的鏈黴抗生物素蛋白晶片表面上的肽(130-230 RU(共振單位))。含有0.01M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3nM EDTA與0.005%界面活性劑P20^TM的工作緩衝液 (HBS-EP)以20 ul/分的流動速率被使用。所有工作被雙重參照一空白鏈黴抗生物素蛋白表面與空白注射。分析是使用Biacore^TM分析軟體BIAevaluation^TM(版本4.1)來被實行。從選定套組(A)的肽之結果進一步確認SRU BIND^TM衍生的數據暗示著：2E7只以大約50 pM之明顯的平衡常數KD結合到含括β-類澱粉肽之胺基酸1-12的肽(序列辨識編號：15)。在相同的條件下，2E7不結合到涵括β-類澱粉肽之胺基酸2-13的肽。

肽Aβ2-13 AEFRHDSGYEVHGSGK-生物素(序列辨識編號：44)。

所使用的實驗方法與條件被允許偵測高但也有較低的親和力分子-在相同的實驗建立上，對照於2E7，另一個辨識β-類澱粉肽之N端抗原決定區的抗體被顯示以7 nM的明顯KD結合至2-13肽(序列辨識編號：44)。2E7不結合至套組(A)中從β-類澱粉肽中間區而來的肽之選擇。在一個分開的實驗中，β-類澱粉1-40肽經由其N端天門冬胺酸(已經是生物素化的)而被捕獲。此肽被捕獲到一如前述之Biacore^TM鏈黴抗生物素蛋白塗覆的晶片上。以66 nM被注入歷時1分鐘的抗體2E7可以不結合至此肽。因此結論是：前述N端結合位置是藉由連接子與捕獲方法而被遮蔽(masked)，因而進一步確認最末N端為含有主要結合位置。

結合至表現類澱粉前驅物蛋白質(APP)的細胞

β-類澱粉肽是由肽所組成，該肽是透過第I型穿膜前驅物蛋白質(被稱為類澱粉前驅物蛋白質(APP))水解切割所 形成。當APP具有一大的細胞外領域，結合至此白質可能潛在性地啟動抗體依賴型細胞毒性反應(ADCC)。

為了描述抗體結合至細胞表面完整長度的APP，一個以FMAT^TM ABI8200為主的分析可以被採用。

以野生型APP DNA轉染HEK293T細胞

HEK293T細胞被維持在含有10%(v/v)FCS於1 x Glutamax的DMEM F12培養基中。在轉染之前，細胞被植種在75 cm²的組織培養燒瓶中且生長至60-80%聚集(confluency)(18-24小時)。為了供轉染，9 ug的DNA(野生型APP DNA(在PCDNA3.1(Invitrogen)載體)，或僅有載體對照)，混合以0.3 ml的Opti-MEM^TM培養基。30 ul Lipofectamine^TM轉染劑混合0.3 ml的Opti-MEM^TM培養基且兩種混合物被集中。在加入又4.8 ml的Opti-MEM^TM培養基之前，集中的混合物於室溫下被培養歷時30分鐘。最終體積被加到細胞(以Opti-MEM^TM培養基洗滌之後)歷時5小時並接著將6 ml的10%(v/v)新生胎牛血清(配於DMEM)加入。轉染48小時之後，上澄液被移除且單層在維耳新(versene)中被洗滌，接著3 ml的Versene^TM螯合劑加入各燒瓶，於37℃下培養歷時5分鐘，且以200 g令浮起的細胞沉澱歷時5分鐘。生成的細胞丸粒(pellet)被溫和地再懸浮於分析緩衝液(2%經熱處理的血清、0.5% BSA、0.1% NaN₃，配於PBS pH7.4，濾過0.2 um過濾器)中以製造出單一細胞懸浮液。

以FMAT ^TM ABI8200為主的分析

測試抗體(2E7，LN27(Zymed)小鼠IgG對於APP的細胞 外領域作為陽性對照)以及抗體G210(辨識β-類澱粉肽的x-40形式作為陰性對照)被稀釋至10 μg/ml於無菌經過濾的分析緩衝液中(2%加熱處理血清，0.5% BSA，0.1 NaN₃，配於PBS pH7.2)配於聚丙烯平盤，並且接著又一6次連續1：1稀釋在平盤下被施行。分析緩衝液僅被用作為空白。以野生型APP DNA轉染的50毫升之HEK293T細胞懸浮液(實驗1：10,000細胞；實驗2：20,000細胞)被加入一96井平盤的各井中，50 ul/井的各抗體溶液被加入重複井中。50 ul的F-MAT^TM藍色抗小鼠IgG2原液(抗體使用從ABI而來的單功能反應染色套組(4328408)標記)、稀釋的1：500(實驗1)與1：1000(實驗2)配於分析緩衝液，接著被加入各井並平盤略微震盪並被留作靜置歷時1小時。該平盤接著使用ABI8200螢光巨共焦細胞偵測系統(Applied Biosystems)來被讀取。

衍生的計數數據接著使用Excel^TM空白表格軟體來被解讀。簡言之，假轉染計數從全長APP轉染細胞計數減去以獲得有關於各抗體的特定訊號。兩種抗體濃度(曲線的線性部分)被選定(1.25與0.63 ug/ml)且在背景校正衍生出這些濃度下如LN27抗體結合之百分比所表現的數據，以及在兩種抗體間的平均。形成的數據被描述在表3(% LN27結合±SE)。

因此，在此分析系統中，2E7對細胞表面APP的結合是無法與陰性控制抗體G210所得到者有所分別。

結合至類澱粉前驅物蛋白質衍生的肽

前述抗原決定區繪製研究已顯示抗體2E7結合到-類澱粉肽的最末N端，於位置1帶有主要供結合的麩胺酸。此暗示抗體辨認一個“新”抗原決定區，其藉由於β-分泌酶位置的APP切割所形成。此發現將暗示抗體2E7理應不辨識相鄰的APP肽序列。為了測試此假設，一APP肽(肽APP1，序列辨識編號：16)被合成，其包括β-類澱粉肽的殘基1-7與五個相鄰的APP衍生之胺基酸。因而肽APP1含有從BACE-1切割位置的N-端位置5至從BACE-1切割位置的C-端位置7的連續胺基酸並且N-端被乙醯基化。抗體2E7結合至APP衍生之肽APP1以及β-類澱粉1-12肽(肽Aβ1)的能力是使用Biacore^TM方法學來被比較(如前面所述用於抗原決定區繪製)。抗體2E7顯示高親和力結合至β-類澱粉肽Aβ1，其含有鹼性抗原決定區1-7。然而，對亦含有鹼性β-類澱粉衍生的序列1-7的APP1並無結合。

肽Aβ1 DAEFRHDSGYEVGSGK-生物素(序列辨識編號)：15

APP1 AcNN-SEVKMDAEFRHDGSGK-生物素(序列辨識編號：16)

以FMAT^TM為主的細胞結合與以Biacore^TM為主的肽繪製之組合已被使用來顯示：在這些形式之中，對於全長APP蛋白質來說，2E7不具有結合親和力。假設β-類澱粉肽於位置1的麩胺酸殘基對結合來說是需要的，結論是2E7僅辨識的 “新”N-端並且因而理應不結合到表現APP之細胞表面。

活體內生物活性 I ¹²⁵ β-類澱粉流出模式

一些發表的研究已顯示，β-類澱粉抗體可以與β-類澱粉肽在血流中形成複合物(complex)。受到爭論的是周邊β-類澱粉的隔離允許CNS β-類澱粉更進一步流入血流(DeMattos RB,PNAS(2001),98(15)；8850-8855)。一個急性藥力學模式已被發展來監測抗體在它們與腦部衍生之β-類澱粉肽於血流中複合的能力。

麻醉(4%活寧(isoflurane))在雄性C57/BL6J小鼠中被誘發且被維持在100%氧氣(1.5%活寧)中。動物接著被放置在測趨性框架(stereotaxic frame)內。沿著直縫(sagittal suture)在中線切開(midline incision)之後，一個鑽孔被鑽過頭骨且一導引套管(guide cannula)被***側腦室(lateral cerebral ventricle)(對等於前後(AP)-0.5 mm，側(L)+0.7 mm，腹(V)-2.5 mm)。又兩個鑽孔被鑽過頭骨至頭釘要被放置處。導管藉由氰丙烯酸酯凝膠被錨座(anchored)於該處且切開是圍繞著該氰丙烯酸酯凝膠頭帽被縫合。手術後小鼠被皮下地給予0.3 ml食鹽水並且被放在溫暖的環境中直到從麻醉恢復。在翻正反射(righting reflex)的回復方面，小鼠被單獨地豢養並且被給予5天的標準手術後照料(standard post-op care)。無程序被允許又一個5天或直到手術前體重被恢復。恢復之後，導管置放是藉由血管收縮素Ⅱ飲用反應(angiotensin Ⅱ drinking response)來被確認。每隻小鼠被 給予腦室內(intracerebroventricular,ICV)投藥(5 μl)100 ng的血管收縮素Ⅱ(A Ⅱ)(在0.9%食鹽水中所構成)。在A Ⅱ投藥之後，攝取水被觀察歷時15分鐘。對A Ⅱ帶有陽性致飲反應(dipsogenic response)(維持飲水)的小鼠被含括在該研究中，該研究在A Ⅱ注射之後不早於5日被開始。

研究當日，為了易於注射尾靜脈所需要，小鼠被放置在溫暖的環境裡歷時5-10分鐘直到誘發血管舒張(vasodilation)。測試抗體(600 μg)或PBS載體(劑量體積不大於每公斤體重10 ml)經由尾靜脈被注射且在注射之後小鼠被返回它們各自的籠舍中。在尾靜脈注射的準確一小時之後，小鼠被緩慢地ICV注射(每分鐘2 μl)以呈5 μl劑量體積之2 ng(1 μCi)的貝他-類澱粉1-40(Amersham Biosciences,UK)。在ICV給藥的準確4小時之後，50 μl的軀體血液被收集且在閃爍計數器(scintillation counter)上測量放射性(radioactivity)。

已被注射以2E7至尾靜脈的小鼠(每處理群n=6)顯示相較於在注射載體的小鼠中所測得之CPM訊號，50 μl的軀幹血液在放射性訊號方面表現出統計上的顯著增加(CPM-載體：1339.7±496.2相對於2E7 4389.9±980.3；ANOVA：F(2,13)=4.97,p<0.05。post-hoc LSD：p=0.01 2E7相對於載體[post-hoc Duncans：p=0.02 2E7相對於載體])。

在又兩個利用2E7進行相同步驟的研究中，在類澱粉流入血液方面，當相較於注射載體的對照組，類似的增加被發現到(CPM血液：載體352+/-113相對於2E7 2397+/-353，以及載體1281+/-312相對於2E7 5291+/-885； 以post-hoc LSD測試的ANOVA p<0.01相對於載體)。

轉殖基因之CNS β-類澱粉降低模式(transgenic CNS β-amyloid lowering models) 1.2個月大TASTPM小鼠在給藥4周之後的β-類澱粉負荷

於研究開始時，雄性與雌性TASTPM轉殖基因小鼠(雙突變APPswe×PS1.M146V，Howlett DR(2004)Brain Research 1017(1-2)130-136)是介於61與65天大並且被單獨地豢養。相等數目的小鼠被分配成各處理群(每群N=12)並且依據性別與年齡被隨機分配。處理群包含有下列：A：MOPC21(具有未知專一性的抗體，Holton et al(1987)J.Immunol 139(9)3041-3049，陰性對照)，B：2E7(測試抗體)。所有抗體被溶解於PBS中且根據腹膜內途徑來給藥。與動物的體重無關，300 ug的抗體被投藥。動物每週被給藥兩次歷時四週。最後給藥之後的一天，動物藉由以過量戊巴比妥鈉被麻醉。腦部被切割並半切(hemisected)。半切的腦部樣本被收集在秤重前的2 ml離心管^TM且快速冷凍。樣本接著被解凍，再秤重且在樣本被均質化之前將含有Complete protease inhibitor^TM錠劑(Boehringer Mannheim)的1 ml之5M胍HCl加入並以恒定攪拌被培養於4℃下歷時>90分鐘。

樣本接著以1比10被稀釋成分析緩衝液(50 mM Tris HCl,pH 7.4,150 mM NaCl,0.05% Tween-20+1% BSA)，震盪並且於4℃下以20,000G旋轉歷時20分鐘。上澄液被移除且像是三重複樣本被加入分析盤。

Aβ40與Aβ42的含量是使用以敏感性平盤為主的電化 學螢光免疫分析(BioVeris^TM)來被測量，其採用被標記以Oritag^TM特定標誌之C端專一性β-類澱粉抗體(對於Aβ40與Aβ42)而被用於捕獲Aβ40或Aβ42，還有N端被生物素化之專一性Aβ抗體以促進偵測(BioVeris^TM)。抗體-Aβ複合物被塗覆在珠粒(beads)上的鏈黴抗生物素蛋白所捕獲，該珠粒結合被生物素化的抗體(Dynabeads^TM,Dynal)，它們於室溫下以劇烈混合被培養過夜並且在BioVeris^TM M8光偵檢計中被分析。標準曲線使用人類Aβ40與Aβ42肽在含有所欲濃度之胍HCl的分析緩衝液的分析中被建立。數據使用Excel Robosage^TM統計分析軟體來被分析且Aβ含量被表示為pmol/g組織。

在此範例中，利用2E7抗體的處理降低CNS Aβ42負荷達37%(p<0.001)且CNS Aβ40達23%(p<0.001)。

在類似實驗條件下的隨後研究中，當相較於以PBS處理的動物，2E7抗體降低CNS Aβ42負荷達38%(研究1，僅雄性)，22%(研究2，無顯著性)以及39%(研究3，雄性，p=0.001)以及13%(研究3，雌性，無顯著性)。在這些研究中，當相較於以PBS處理的動物，2E7也降低CNS Aβ40達18%(研究3，雄性，p=0.017)並且在CNS Aβ40提供無顯著性達25%(研究1，僅雄性)，<1%(研究2)以及3%的無顯著性增加(研究3，雌性)。

2.4個月大TASTPM小鼠在給藥4個月之後的β-類澱粉負荷

簡言之，4個月大的TASTPM轉殖小鼠經由腹膜內(i.p.)途徑被給藥300 μg的抗體每週一次或兩次。在給藥4個月之 後，CNS β-類澱粉的含量藉由ELISA被測量且斑塊負荷藉由免疫組織化學法來被測量。在年齡為4與8個月之間，CNS β-類澱粉負荷呈指數地增加並且因此，斑塊病理學快速地發展(Howlett DR(2004)Brain Research 1017(1-2)130-136)。

於研究開始時，小鼠是介於120與128天大並且被單獨地豢養。相似數目的小鼠被分配成各處理群(每群N=20或21)並且依據性別與年齡被隨機分配。處理群包含有下列：A：PBS(載體)每週給藥兩次，B：2E7每週給藥一次，C：2E7每週給藥兩次，D：PBS每週給藥一次。劑量為300微克的2E7(79微升體積)經由腹膜內途徑被給藥。以載體處理的動物被給予相同體積的PBS。動物被給藥歷時18周。TASTPM小鼠傾向於遭受自發性癲癇並且如一結果般，一些動物在研究進程中死亡。最終數目如下A：4雌性，9雄性；B：5雌性，8雄性；C：4雌性，9雄性；D：2雌性，9雄性。最後給藥之後的二或四天(每群相同數目)，動物藉由以過量戊巴比妥鈉被麻醉。尾端樣本從各小鼠取下以供確認基因型。腦部被切割並半切。右半球藉由浸潤在4%三聚甲醛中而被固定並且被處理以供組織學。左半球被收集在秤重前的2 ml離心管^TM，在乾冰上冷凍並且被儲存於-80℃下以供接下來的類澱粉含量分析。在分析之前，樣本被解凍，再秤重且在樣本被均質化之前將含有Complete protease inhibitor^TM錠劑(Boehringer Mannheim)的1 ml之5M胍HCl加入並以恒定攪拌被培養於4℃下歷時>90分鐘。

樣本接著以1配10被稀釋成分析緩衝液(50 mM Tris HCl,pH 7.4,150 mM NaCl,0.05% Tween-20+1% BSA)，震盪並且於4℃下以20,000G旋轉歷時20分鐘。上澄液又被1：1000地稀釋並且像是三重複樣本被加入分析盤。

Aβ40與Aβ42的含量是如同給藥4週研究來被測量。

變異性的分析是隨著被含括在該模式中之處理、性別與給藥計畫表而被用做為固定效果(fixed effects)。三種因子之間的所有交互作用亦被含括。在兩種給藥計畫表(每週一次或兩次)之間並無顯著差異。利用此實驗計畫，首先在給藥計畫表之間若有任何顯著差異性，它可以被進行評估，且第二，若沒有此類顯著差異性，兩種給藥計畫表而來的數據可以被組合，因而透過分析中的小鼠數目加倍來提高實驗效力。

在此範例中，利用2E7抗體的處理降低CNS Aβ42負荷達22.5%(p=0.0152)。CNS Aβ40的含量也被降低達12.1%，但未達到統計差異性(p=0.118)。

這些樣本的複合物免疫組織化學分析可以被實行已定義顯示斑塊病理學之腦部組織的區域。切片從於尾部(caudate)高度的皮層與從海馬回高度的皮層被取出。相鄰切片以Aβ40或Aβ42專一性抗體染色或選擇性地以類澱粉染料剛果紅。使用影像分析軟體，染有斑塊的切片之區域被表示為全部切片面積的百分比。

在固定之後，浸潤PFA的半腦在腦部基質(brain matrix)中被冠狀地切割成6×2 mm厚的切片。這些2 mm切片將被指為如切片A至F，A是最為前面而F最為尾部。切片A、B & C與D、E & F被放置在依據各動物被分開編號的包埋 卡匣內。卡匣被維持在PFA中直到適於處理並包埋。

包埋是在Citadel^TM1000(Shandon)組織處理器中被進行。所有組織被給予下列處理法： 70% IMS-1小時

100% IMS-3 x 1小時

100%乙醇-2小時

100%異丁淳；1 x 2小時；1 x 1.5小時

Histoclear^TM-2 x 1.5小時

石蠟-2 x 2小時

處理循環完成時，滲入蠟的組織切片被轉移到充滿融化石蠟的注塑件(base moulds)並且使用Histoclear^TM(Shandon)石蠟包埋系統來被包埋。組織被包埋以使得切片A、B & C在同一注塑件中；D、E & F在一第二注塑件中。就所有套組的切片來說這可以被施行，亦即各切半的腦形成各三個切片的兩個蠟塊中。切片被放在注塑件中以使得各片的尾面(caudal surface)變成將來的切面。小心以確保各切片被充分下推至注塑件中以各切片能夠平行地發生。穿孔的處理卡匣接著被小心地放在各注塑件上且其接著以融化的蠟淹沒。包埋塊接著在冷凍板上被冷卻直到它們可以自注塑件移除。包埋塊於室溫下被儲存直到需要用於切片。石蠟塊被隨機地裁切且5微公尺的切片被漂浮在預先標示之塗有白明膠的玻片上(Superfrost^TM,Erie Scientific Company)。兩片切片被漂浮在相同玻片上。若可能的話，連續切片被放置且玻片從1至25被連續編號。50個切片(25 片玻片)從各石蠟塊被取出。玻片在熱板上被乾燥並且接著在室溫下儲存直到被需要。

免疫組織化學在一套30個玻片上被施行。每一玻片上，頂部切片被標示以Aβ40抗體(G30，兔多株辨識x-40 β-類澱粉)，底部切片以Aβ42抗體(20G10，單株辨識x-42 β-類澱粉)。每石蠟塊每個抗體最少5個切片被標示。

標示是如下被施行。在透過Histoclear與漸次的酒精脫蠟(dewaxing)之後，切片被浸潤在85%甲酸歷時8分鐘並接著在0.3%過氧化氫中被阻斷(blocked)歷時30分鐘以阻斷內生性過氧化氫酶。抗體G30與20G10均以1：1000稀釋地被施用過夜，切片於4℃下被靜置過夜。切片的顯色(development)是利用個別的生物素化抗兔與抗小鼠二抗。呈色是伴隨著二胺基聯苯胺染色套組(DAB^TM,Vector Labs)。在脫水、清潔、覆蓋蓋玻片之前，切片被簡單地以梅氏蘇木色素(Mayer’s hematoxylin)予以對比染色(counterstain)。

在鏡檢前，切片被留置乾燥至少歷時48小時。影像在配設有數位相機的Leica DMRB^TM顯微鏡上被捕捉。影像使用Qwin^TM軟體(Leica)予以分析且結果被呈現為玻片面積(被標示以Aβ抗體)的%。

變異性的分析是隨著被含括在該模式中之處理、性別與給藥計畫表而被用做為固定效果。三種因子之間的所有交互作用亦被含括。在兩種給藥計畫表(每週一次或兩次)之間並無顯著差異。利用此實驗計畫，首先在給藥計畫表之間若有任何顯著差異性，我們可以評估，且第二，若沒 有此類顯著差異性，從兩種給藥計畫表而來的數據可以被組合，因而透過分析中的小鼠數目加倍來提高實驗效力。

在此範例中，利用2E7抗體的處理降低像是以辨識Aβ42的抗體所測量之斑塊病理學。斑塊病理學在海馬回高度的皮層中被降低達27.1%(p=0.0026)而在尾部高度的皮層中達43%(p<0.001)。當以辨識Aβ40的抗體測量，斑塊病理學在海馬回高度的皮層中亦被降低達16.6%(p=0.0421)而在尾部高度的皮層中達17.3%(p=0.0342)。

從此以載體或2E7處理而來的任何小鼠未發現任何微出血的證據。此方法藉由製造不可溶性藍色化合物來顯現鐵離子(鐵離子是一種在紅血球中攜帶氧的血紅素的主要組成)。從所有動物而來的全部腦部含量是清楚的。

認知模式

如上述在4個月大TASTPM小鼠給藥4個月之後，這些小鼠在兩種認知模式中被測試：物體辨認分析(object recognition assay)與恐懼制約分析(fear conditioning assay)。

物體辨認分析

物體辨認分析解釋動物去發現新物體的傾向並且依靠動物的能力來喚回先前曾發現過的物體(類似物體)。八個月大的TASTPM小鼠已被報導為證實缺少分辨新穎與類似物體的能力(Howlett et al.,2004)，暗示在這些動物受到損傷的認知表現。然而在此研究中，以載體予以處理之八個月大TASTPM小鼠不能證實認知障礙，亦即它們可以分別新穎與類似的物體。因而沒有研究任何從以2E7治療所造成的 潛在治療效果的可能。

恐懼制約分析

恐懼制約分析是被設計來測試動物將一先前疼痛刺激與背景或暗示的訊號之間相連結的能力，並且在隨後X小時延遲後，當以相同背景或氣氛出現時回憶起此的能力。在此研究中，以載體處理(每週1次或2次)之8個月大TASTPM小鼠在這些動物中展現缺乏認知障礙的背景差異指示(contextural differentiation indicative)。當每週被投藥1次或2次，此缺乏是不受到以2E7治療所影響。

6個月大TASTPM小鼠的給藥4個月

本研究涉及對TASTPM小鼠投藥2E7(300 μg i.p.每周2次)歷時4個月，由3個月大來起始。對照動物給予配於PBS的IgG2A。如上所述，腦部被切割並半切。右半球藉由浸潤在4%三聚甲醛中而被固定並且被處理以供組織學。左半球被收集在秤重前的2 ml離心管^TM，在乾冰上冷凍並且被儲存於-80℃下以供接下來的類澱粉含量分析。

藉由IHC從各腦部樣本的隨機選擇而來的單一切片之初步分析(n=6載體，n=7 2E7處理群)是使用如上相同的一般步驟來被進行。統計分析(學生t-檢定)顯示，在被給予2E7的小鼠中，於視丘(thalamus)(71.9%，p=0.007)以及視丘+皮層+海馬回的Aβ42斑塊負荷有明顯的降低(54.1%，p=0.022)，但在Aβ40中沒有顯著改變。

為了供腦部Aβ40與Aβ42的生化測量，樣本如上被處理與測量(稀釋因子1：10,000)。Aβ42在以2E7處理的小鼠 中被顯著地降低達29.9%(p=0.01)。Aβ40濃度亦被降低(22.6%)但此降低無法達到統計顯著性(p=0.052)。

融合瘤可變區的選殖 可變區序列

總RNA自2E7融合瘤細胞中被萃取出且重與輕可變領域cDNA序列接著藉由逆轉錄與聚合酶鏈反應(RT-PCR)被產生。用於RT-PCR的前置引子(forward primer)是專一於鼠類免疫球蛋白基因領導子序列的簡併引子(degenerate primer)混合物而反置引子(reverse primer)是專一於抗體恆定區，在此例中是有關於重鏈的鼠類同型IgG2a與有關於輕鏈的鼠類kappa。引子是依據由Jones與Bendig所描述的策略來被設計(Bio/Technology 9：88,1991)。對於V區的RT-PCR呈二重複地被施行以接下來確認正確的V區序列。由RT-PCR產生的V區產物被選殖出(Invitrogen TA Cloning Kit)且序列數據被獲得。

2E7 V_H胺基酸序列(序列辨識編號：17) EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPRKGPEWIAFISNLAYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCVSGTWFAYWGQGTLVTVSA

2E7 V_H DNA序列(序列辨識編號：18) GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCC TGAAACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACTTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTTCGACAGGCTCCAAGGAAGGGGCCTGAGTGGATAGCGTTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGATAATGCCAAGAATACCCTGTACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTACTATTGTGTAAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

2E7 V_L胺基酸序列(序列辨識編號：19) DVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTRHVPYTFGGGTKLEIK

2E7 V_L DNA序列(序列辨識編號：20) GATGTTGTGCTGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAACTAGACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

互補決定區(CDRs)在胺基酸序列被劃上底線。

2E7嵌合體的選殖與表現

由移植到人類IgG1(Fc突變的(L235A,G237A))上的親代鼠類V區作為重鏈或人類C kappa區做為輕鏈所構成的嵌合2E7抗體(2E7c)被產生以表現重組抗體原料，其可被用於確認功能性鼠類V區的正確選殖。編碼2E7鼠類重與輕鏈V區的DNA與內生性鼠類訊號序列被選殖到框架至已含有人類恆定區(分別是IgG1 Fc突變(L235A,G237A)或人類C kappa)的哺乳動物表現載體RLD-bshe(用於重鏈)以及RLN-bshe(用於輕鏈)。

供重鏈表現用的RLD-bshe表現載體之要素

(上面被給予之要素的位置與載體的整個大小僅以說明為目的並且將視抗體***鏈的大小而定)

供輕鏈表現的RLN-bshe表現載體之要素

(上面被給予之要素的位置與載體的整個大小僅以說明為目的並且將視抗體***鏈的大小而定)

帶有被正確選殖的V_H與V_L序列之選殖株被鑑定且質體被製備以供在懸浮培養CHO細胞中表現。被表現的2E7c抗體從細胞培養上澄液藉由蛋白質A層析而在FPLC系統上被純化，並且接著透過ELISA與使用Biacore^TM技術的SPR來被測試關於結合至Aβ。結果指出正確的2E7小鼠V 區被選殖並表現，導致帶有類似於親代鼠類抗體2E7之特性的功能性抗體。

輕鏈人類化

帶有Genpept ID CAA51135(序列辨識編號：24)與Genbank讀取編號X72467的人類受體序列，其在胺基酸層次上具有77%的同一性(包括CDRs)，是被選定為受體框架。建構物L1是從2E7 VL領域而來之鼠類CDRs至此受體框架的移植物。

重鏈人類化

人類序列Genbank讀取編號M99675(序列辨識編號：21)，相對於2E7小鼠可變重區在胺基酸層次上具有74%的同一性之VH3-48基因的對偶基因是被選定為人類重鏈受體框架還有人類JH4袖珍基因。三個人類化可變重鏈變異體是根據M99675序列與JH4來被設計。H1是一種使用Kabat定義之帶有兩個額外框架回復突變(於位置93及94)之鼠類CDRs的移植物。H2與H3均是衍生自H1，但併入一個額外的框架突變(在各建構物中是不相同的)(分別在位置24與48，參見表4)。

人類化重與輕鏈DNA的構築

人類化V區是藉由部分重疊之寡核苷酸與PCR擴增被重新合成。用於選殖到哺乳動物表現載體RLD-bshe與RLN-bshe的限制位(restriction site)與衍生自選定的人類受體框架之人類免疫球蛋白訊號序列被含括。編碼人乳化V區(H1(序列辨識編號：2)、H2(序列辨識編號：29)、H3(序列辨識編號：31)、L1(序列辨識編號：33))還有訊號序列及限制位的DNAs接著被選殖到框架至哺乳類表現載體：H1、H2與H3至RLD-bshe以產生編碼三種全長人類IgG1 Fc突變之重鏈的DNA，其各自含有突變L235A與G237A，全長H1(序列辨識編號：35)、全長H2(序列辨識編號：37)與全長H3(序列辨識編號：39)；L1被選殖到框架至含有編碼人類kappa恆定區的DNA之RLN-bshe以產生編碼全長人類kappa輕鏈的DNA(序列辨識編號：41)。

表現人類化重與輕鏈抗體組合物的代表例

CHOK1細胞在6井平盤中被小規模地以人類化輕與重鏈DNA建構物的所有組合暫時轉染：L1+H1、L1+H2、L1+H3(序列辨識編號：35+41、37+41、39+41)。在DMEM F12(帶有5%額外低IgG胎牛血清與2 mM麩胺酸)中被繼代的CHOK1細胞被生長至聚集。聚集的細胞在Glutamax培養基(Invitrogen)中被轉染以總的為7.5 μg DNA：30 μg Transfast lipid(Promega)。轉染的細胞於37℃下以5% CO₂被培養。於72小時，上澄液被收穫且關於抗體濃度被分析且接著利用ELISA來測試關於結合至人類Aβ。人類化L1 組合三種人類化重鏈全部表現結合至人類Aβ的完整抗體。

人類化抗體亦被大規模表現在使用脂質體DNA投遞(例如TransFast(Promega))的暫時CHOK1細胞轉染中被表現且在培養瓶中表現。為了在暫時轉染中表現最佳化含量，1：6的重鏈相對於輕鏈表現載體DNA比例被採用。從暫時轉染而來的原料使用ProSepA管柱或帶有ProSepA HiTrap管柱的FPLC來純化。

2E7人類化變異體H1L1、H2L1與H3L1在β-類澱粉結合ELISA上的評估

2E7 H1L1、H2L1與H3L1人類化變異體被評估有關於結合至於C端被生物素化的人類Aβ肽(1-40)。嵌合2E7被用為參考。表5-7顯示利用不同批次之從大規模暫時轉染而來的純化原料之結果。

這些結果指明有關於各2E7衍生的人類變異體的相似Aβ結合概況。EC50數值相對於2E7c的比較顯示Aβ結合活性的低損失已經由人類化步驟而被帶來。

藉由競爭ELISA比較2E7人類化變異體

2E7c嵌合與人類化抗體H1L1、H2L1與H3L1就它們抑制人類Aβ肽與親代小鼠2E7MAb之間在競爭ELISA的結合之能力係被評估。

兩種類型的競爭者ELISA被建立以比較三種人類化變異體相較於2E7嵌合抗體的Aβ結合活性。

1)固定化的β-類澱粉；生物素化的人類Aβ肽(1-40)經由鏈黴抗生物素蛋白被固定ELISA板上。小鼠2E7抗體呈恆定濃度沿著2E7衍生的人類化變異抗體之連續稀釋被加入。結合的小鼠2E7 MAb接著以抗-小鼠IgG綴合物(conjugate)被偵測。表8顯示兩種分析的結果。

2)配於溶液之β-類澱粉；恆定濃度的β-類澱粉以連續稀釋的人類化2E7抗體變異體被預先培養-包括複合的與自由類澱粉之混合物被加入含有固定化的小鼠2E7 MAb之井內歷時一段短時間。仍可供結合固定化親代2E7 MAb的自由β-類澱粉數量接著被偵測。表9顯示兩種分析的結果。

所有人類化抗體變異體以類似的概況抑制小鼠2E7 MAb結合至β-類澱粉。有關於H2L1與H3L1變異體所產生的IC₅₀數值是一致地接近那些2E7c嵌合體者(若使用)，其在兩種分析中具有最高抑制活性。然而H1L1卻在兩種分析中顯示降低的抑制活性，暗示對於β-類澱粉的一種可能略低的親和力。

2E7、2E7c、H1L1、H2L1、H3L1的SPR Biacore ^TM 分析

重組型小鼠2E7MAb、嵌合2E7c與人類化變異體H1L1、H2L1與H3L1結合到貝他-類澱粉肽(1-40)與(1-42) 的動力學參數係使用Biacore^TM分析在Biacore^TM 3000上被評估。兩種不同的分析模式被使用。

方法A

(i)簡要地，<20的貝他-類澱粉1-40肽(於C端被生物素化)之共振單元被捕獲在鏈黴抗生物素蛋白生物感應晶片上(如關於表10A中所用的)。抗體被稀釋於HBS-EP緩衝液中並且以落在0.001 nM-8nM的濃度(根據表10A)通過鏈黴抗生物素蛋白/貝他-類澱粉表面。分開的兩次被施行；每次在新的鏈黴抗生物素蛋白/貝他-類澱粉表面上施行。第1與2次基本上相同雖然它們在某些使用的參數上不同；第1次在使用16 RU’s的貝他-類澱粉被捕獲之晶片表面上被施行，而0.001nM-8nM的抗體濃度被使用，結合時間為4分鐘且分離時間為20分鐘係以流速為每分鐘50 μl來被使用。有關於第2次，少於10 RU’s的貝他-類澱粉被捕獲且0.003125 nM-8nM的抗體濃度被使用。流速與結合時間相同於第1次，然而分離時間被降低至15分鐘。

(ii)貝他類澱粉(1-40)與(1-42)是在CM5生物感應晶片的不同表面上是以胺偶合達<20共振單元的程度(如表10B)。抗體被稀釋於HBS-EP緩衝液並且以落在1 nM-64nM的濃度(根據表10B)通過鏈黴抗生物素蛋白/貝他-類澱粉表面。

方法B

在第二個例子中，該分析被反向，其中抗體首先被捕獲到抗-小鼠IgG多株抗體(有關重組型小鼠2E7 MAb)表面之1000-2500共振單元或CM5生物感應晶片之蛋白質A表 面(有關人類化H2L1)的程度。新鮮製備的貝他類澱粉(1-40)或(1-42)被稀釋於HBS-EP緩衝液並且以落在5-500nM的濃度通過抗體被捕獲的表面(有關於表10C與10D)。

在兩種方法中，再生是經由100 mM H₃PO₄的脈衝(pulse)且有關於表10A的數據亦隨著50 mM NaOH的脈衝。表面被顯示為穩定而不受再生影響。所有運作(run)為兩次以參照解緩衝液空白注射。分析是使用Biacore^TM分析軟體BIAevaluation版本4.1來被施行。

結果

方法A(i)被用於藉由貝他-類澱粉結合動力學數據來對抗體作評比排序。所得到的數據被顯示於表10A。此顯示親代2E7 MAb對鏈黴抗生物素蛋白-捕獲的貝他-類澱粉於具有36.1 pM的KD。嵌合小鼠-人類抗體顯示45.8 pM的較低KD而人類化建構物的範圍落在54(H2L1)至93.6(H1L1)pM。總結來說，這證實人類化操作步驟非常成功且極少親和力喪失。有關於H2與H3之額外的回復突變被引入具有小但有益之效果，雖然H2與H3建構物之間的差異性落在有關於這些實驗的標準偏差之內。

相較於貝他-類澱粉(1-40)，方法A(ii)被用於確認在貝他-類澱粉(1-42)的C端的額外兩個胺基酸殘基並未顯著地改變2E7與H2L1的結合特性。所獲得的數據被顯示在表10B中並且確認此。

方法B被用於否定在第1次分析模式中可能被看到的結合性效果(avidity effect)。結合性效果(由同時結合到生物 感應晶片上之兩個相鄰貝他-類澱粉分子或多聚體貝他-類澱粉的單一抗體分子的Fab領域)可能增加顯現的結合親和力。使用方法B所獲得的親和力測量值被顯示於表10C。

當透過類似於帶有預估為2.4 nM之KD之A(i)的方法，H2L1的Fab片段(依據木瓜酶消化所得到的)結合鏈黴抗生物素蛋白捕獲的貝他-類澱粉(1-40)，此分析提供確實的1：1結合親和力之證據被獲得。

相較於貝他-類澱粉(1-40)，方法B也被應用於確認在貝他-類澱粉(1-42)的C端的額外兩個胺基酸殘基並未顯著地改變相同序列選殖株對小鼠2E7(名為2F11)的結合特性。所獲得的數據被顯示於10D。

在類似於上述對2E7使用表面電漿子共振分析的抗原決定區繪製研究中，H2L1在結合至肽(其含括β-類澱粉肽的胺基酸1-12(Aβ1，序列辨識編號：15))表現類似於2E7 而非含括β-類澱粉肽的胺基酸2-13(Aβ2-13，序列辨識編號：44)之肽。

H2L1在I ¹²⁵ 貝他-類澱粉流出模式上的活性

為了功能性地比較人類化H2L1與親代小鼠單株2E7，兩者在同日於I¹²⁵貝他-類澱粉流出模式如上述被測試。

相較於載體對照組，H2L1與2E7兩者在血液中明顯地提高每分鐘的計數(CPM)。放射性在血液中的CPM是如下(載體：1940±166；2E7：10065±1386；H2L1：10913±1535)。所使用的統計學是利用post-hoc LSD試驗的ANOVA。n=7載體，n=6 2E7，n=6 H2L1(有關於各試驗化合物相對於載體p<0.001)。

此數據更提供證據：人類化的H2L1抗體被顯示利用小鼠2E7分子來維持功能性特質。

H2L1與2E7的藥物動力學研究

測試抗體在小鼠中的最終半衰期被研究。測試抗體是藉由1小時的靜脈內灌注而被投藥給4隻小鼠以達到每隻小鼠400 ug的目標劑量。連續血液樣本從各小鼠被取得至多達給藥後的5天(從2E7群中來的一隻小鼠未完成該研究而從H2L1群中來的一隻小鼠因為該劑量明顯地未被i.v.投藥而自接下來的分析中被剔除)。抗體含量是使用一β-類澱粉捕獲ELISA而被測量。

數據的分析表明人類化抗體H2L1在小鼠中具有大約82小時的最終半衰期(表11)，其與親代小鼠單株抗體2E7所具有者(大約75小時)相當。

#中位數與範圍Cmax 觀察到的最大血漿濃度Tmax 觀察到最大血漿濃度的時間CLp 總血漿清除；劑量/AUC_(0-inf)t½ 終期(terminal phase)半衰期如In2/z的比例被決定，其中z是終期速率常數；在目測終期log-線性期開始之後，使用未加權的線性迴歸分析在那些濃度-時間配對發生被算出(在log變換之後)Vss 於穩態的分布體積；CLp x MRT_0-inf

H2L1在老年非人類靈長類於週邊類澱粉負荷上的效應

一研究在年老的馬來猴(Cynomolgus monkeys)(大約15歲)上被實施以研究有關於類澱粉/H2L1複合物形成以及清除之暴露反應關係以及在CSF與CNS類澱粉含量方面的隨後效應。在1^st劑量的H2L1之前的3週，腰CSF(在克它明鎮靜之下被取得)與血液樣本每週地被收集。在第3週取樣之後，動物立即被給予安慰劑(n=10)、0.1 mg/kg(n=5)、1 mg/kg(n=5)或10 mg/kg(n=5)H2L1且接著每兩週歷時12 週。供H2L1與總Aβ₄₂血漿分析的血液樣本每週被取得。供定量的Aβ_40/42 CSF樣本每兩週被收集。在給藥期間完成之後，動物們被麻醉以藉由如上所述的生化分析與微出血研究來定量腦部的貝他-類澱粉。在最低劑量群中(0.1 mg/kg)，動物以一種交錯的方式被麻醉以評估在腦部含量之如同給藥中止之結果的可能時間過程效應並且因此血漿類澱粉庫(pool)的飽和。

在開始研究期之前，此研究是受到MACCINE Pte Ltd的實驗動物管理及使用委員會(IACUC)，或“Maccine”所核可。IACUC操作步驟編號為#08-2006。GSK已執行一Maccine的實地訪查報告(site visit)並且複審它們的倫理檢閱步驟並且發現到它是可接受的。

血漿樣本被連續稀釋1：10至1：50000並且加入塗覆有Aβ₄₀的ELISA平盤。範圍從0-10 μg/ml H2L1的標準曲線在稀釋液中被產生。於4℃下培養過夜之後，H2L1使用抗-人類IgG辣根(horseradish)過氧化氫酶(Amersham-被稀釋為1：2000於稀釋液中)與四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidene)偵測系統來被顯現。在單一或重複iv球劑(bolus)給藥之後，H2L1的血漿含量顯現為以劑量依賴的形式增加。沒有證據顯示在藥物動力學上有嚴重的非線性，暗示對於大多數的給藥間隔來說，血漿中H2L1的過量莫耳濃度相較於自由類澱粉含量是被達到的。

總Aβ₄₂在純血漿(neat plasma)中使用商業上可取得的Aβ1-42 ELISA套組(Irnogenetics)並利用在套組稀釋液中所 產生之範圍落在500-7 pg/ml的標準曲線而被測量。在依據套組指示呈二重複分析之前，樣本與標準品於4℃下被培養過夜。應當被注意到的是：因為提供以Aβ₄₂分析之偵測抗體的干擾，該套組不能夠被用以測量自由Aβ₄₂含量但可測量明顯的“總”Aβ₄₂。劑量與濃度隨著Aβ₄₂而增加(分別偵測到帶有大約300、125與25 pg/ml隨後10、1或0.1 mg/kgH2L1的高原含量)。

從該分析中，在“總Aβ₄₂”方面的增加可能是因為類澱粉從血漿之外明顯流出的結果所致，其顯示為依賴>1 ug/ml的H2L1濃度，並且並未顯示為缺少複合物清除的結果。這藉由總Aβ₄₂之消除速率以及總含量相對於給藥間隔之變動獲得證實。

迄今僅有血漿分析已被完成並且完整分析。然而初步分析暗示：在以10 mg/kg H2L1治療之後，有朝向在CSF降低以及在“總”Aβ₄₂的海馬回含量上增加(如上面一般所述地被測量)的趨勢。

就年老馬來彌猴方面有關於腦內的貝他類澱粉斑塊與血漿中的總貝他類澱粉之分析

人類AD的腦脊髓液(cerebral spinal fluid,CSF)以及組織參數已被展現在馬來猴身上。年老的馬來猴已被顯示具有類澱粉沉積的證據(Covance,The cynomolgus monkey as a model for Alzheimer’s disease.：Buse E,Habermann G,Friderichs-Gromoll S,Kaspereit J,Nowak P and Niggemann K,editors.Poster Presentation at the 44^th Annual Meeting of the Society of Toxicology,New Orleans,Louisiana,6 to 10 March 2005)。有關於H2L1在年老的腦部引起不恰當反應的可能性已在年老，大約20歲，異-交配(ex-breeding)的母猴上被研究。此外，在以兩週為間隔的靜脈內投藥歷時8周之後，安全性，治療相關聯的微出血、測試原料的中和/清除、過敏，以及免疫複合性疾病(immune complex disease)亦已被研究。此外CNS與血液樣本亦被分析有關於Aβ_40/42的含量。

研究設計

每個第二週歷時8週，5(第1群)、9(第2群)或10(第3群)隻的群組老年母馬來猴藉由球劑投藥被靜脈內地給予0(載體)、50或100 mg/kg/給藥日的H2L1配於載體(4 ml/kg)。該載體由三水乙酸鈉(6.81 mg/mL)、去水依地酸鈉(0.0186 mg/mL)、聚山梨醇酯80(0.2 mg/mL)以及L-精胺酸鹼(10 mg/mL)所組成，pH為5.5。劑量水準被選定為研究5與10倍意欲的臨床劑量水準之劑量水準。

下列評估是在給藥前被施行，每天(臨床徵候、體重、攝食量)、第4週與屍體解剖前的當週：存活(in-life)動物研究、體重、體溫、血液學、臨床化學(包括腦脊髓液[CSF]分析)、尿檢(urinalysis)，以及CSF中細胞介素的決定。在屍體解剖之後，器官重量、腦部的巨觀發現(macroscopic observations)以及微觀發現(microscopic observations)、頸椎與大體損傷(gross lesions)在所有動物上被實施。毒理動力學評估是在每次給藥之後被施行。

結果

沒有未計畫的死亡，沒有指明測試物以被投藥劑量對動物的一般病況之影響。在臨床病理學上僅有顯著的推論：與年齡有關而與測試物無關。

全身性暴露於H2L1(藉由AUC_0-t以及C_max來被測量)相對於劑量大致呈比例地上升。對於兩個劑量群來說，於1st劑量與4th劑量取樣期間，在全身性暴露方面並沒有明顯的變化。

依據CSF-分析所偵測的沒有腦部發炎反應的徵象，且在屍體解剖時沒有巨觀或微觀的發現暗示著測試物作用，特別是沒有微出血或腦炎(encephalitis)。

此研究符合如德國化學法案中所概述的優良實驗室操作準則(Good Laboratory Practice Regulations)，附錄1與2至§ 19a(Chemikalien Gesetz)(June 2002,the OECD Principles of Good Laboratory Practice(revised 1997,issued January 1998)ENV/MC/CHEM(98)17)、一致文件“The Application of the OECD Principles of GLP to the Organisation and Management of Multi-Site Studies”(ENV/JM/MONO(2002)9)而被施行。所施行的研究是與上述準則以及標準一致而被視為是可為美國FDA管理機構所接受。

CNS的斑塊負荷分析

從上面研究而來之以載體處理的馬來彌猴之左腦半球藉由免疫組織化學來被分析。一冠狀切片，在含有在齒狀回(dentate gyrus)與海馬回部分的中顳溝(middle temporal sulcus)之高度如上述被處理於蠟中。為供免疫組織化學，切片被標 示以泛-Aβ抗體(1E8，被增加到Aβ13-27的單株抗體)，或是以抗體(20G10，辨識Aβ x-42的單株抗體)，且標示如上被生成。有關於各切片之斑塊數目的可見計數被取得。從所有五個以載體處理的馬來猴之組織顯示實質Aβ斑塊的證據。也有大腦血管標示的Aβ與神經元內的Aβ之證據。

血漿中貝他類澱粉/抗體複合物的分析

生化分析在從兩個時間點(開始給藥之後，在第4與8週的終點)由以50 mg/kg(n=9)或100 mg/kg(n=10)H2L1予以給藥，或給予載體之對照(n=5)的動物而來的血漿樣本被施行。100 ul的重複樣本是使用商業上可取得之Innogenetics Aβ 1-42 ELISA套組來被分析，於4℃下培養過夜。對照組樣本同時純的與呈1：10稀釋(使用提供的稀釋液)來被分析，而從給藥動物而來的樣本則純的與呈1：25來被測試。之後的吸光數值被分析，使用標準曲線以未知吸光數值反算(backcalculated)成pg/ml數值，並且接著以任何分析稀釋液來校正。衍生自這些樣本的Aβ之總血漿含量被顯示在下表12(呈pg/ml±SE的數字)；所有從以H2L1處理的動物之樣本相較於對照組群含有顯著較高的Aβ42含量(依據student t-test p<0.001)。

報導的數據是自稀釋樣本所獲得。若許多數據點大於最高標準或因為樣本體積限制，從純樣本而來的結果未被使用，僅如單點(single point)來被分析。

產品製程

編碼H2L1並且操作地聯結至可擴增選擇標記(諸如DHFR或麩胺酸合成酶)的表現載體可以被用於轉染或轉導適當的CHO細胞品系(例如CHODG44或CHOK1)以適於大規模製造單株抗體的經工程之細胞品系(有關於回顧參見Beddington and Hentschel DNA Cloning Volume Ⅲ：A practical approach(edited by Glover DM)(Oxford IRL press,1987))。為增加表現含量，編碼序列可以是被最佳化的密碼子以避免順式作用(cis-acting)作用主旨以及極端的GC含量(高或低)。序列辨識編號：42及43是作為例示此有關於H2重鏈與L1輕鏈之編碼序列。大規模製造可以在使用無動物衍生的組分之培養基隨後純化的攪拌槽生物反應器中。此可包含有收穫的澄清，隨後蛋白質-A親和力層析，以及進一步使用離子(例如陽離子)交換以及混合型(例如陶瓷羥磷灰石)層析單元操作。一病毒移除奈米過濾是被隨後於一能夠使供意欲投藥途徑的適當配製物變為可能之最終超過濾/透析過濾(diafiltration)步驟。

醫藥配製物的實例

受體框架與人類化變異體的V區之胺基酸序列

M99675重鏈受體框架V區胺基酸序列(序列辨識編號：21)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

M99675重鏈受體框架V區DNA(序列辨識編號：22)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTAGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGA

CAA51135輕鏈受體框架V區胺基酸序列(序列辨識編號：24)DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPWTFGQGTKVEIK

CAA51135輕鏈受體框架V區DNA(序列辨識編號：25)GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

人類化重鏈V區變異體H1胺基酸序列(序列辨識編號：26)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLVTVSS

人類化重鏈V區變異體H1 DNA編碼序列(序列辨識編號：27)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA

人類化重鏈V區變異體H2胺基酸序列(序列辨識編號：28) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNL AYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTL VTVSS

人類化重鏈V區變異體H2 DNA(序列辨識編號：29)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTITCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA

人類化重鏈V區變異體H3胺基酸序列(序列辨識編號：30)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWISFISNLAYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLVTVSS

人類化重鏈V區變異體H3 DNA(序列辨識編號：31) GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCTCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA

人類化輕鏈V區變異體L1胺基酸序列(序列辨識編號：32)DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTRHVPYTFGGGTKVEIK

人類化輕鏈V區變異體L1 DNA(序列辨識編號：33)GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTCTCAAACTAGACATGTTCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

成熟H1重鏈胺基酸序列(Fc突變的回復突變為粗體)(序列辨識編號：34)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

H1全長DNA(序列辨識編號：35)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCGACTACGCA GACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

成熟H2重鏈胺基酸序列(Fc突變的回復突變為粗體)(序列辨識編號：36)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

H2全長DNA(序列辨識編號：37) GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

成熟H3重鏈胺基酸序列(Fc突變的回復突變為粗體)(序列辨識編號：38) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWISFISNLAYSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

H3全長DNA(序列辨識編號：39)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCTCATTCATTAGTAATTTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

成熟輕鏈胺基酸序列(序列辨識編號：40) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTRHVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

L1全長DNA(序列辨識編號：41)GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTCTCAAACTAGACATGTTCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

最佳化的H2重鏈DNA(序列辨識編號：42)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGTGTCCGGCTTCACCTTCAGCGACAACGGCATGGCCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCTTCATCAGCAACCTGGCCTACAGCATCGACTACGCCGACACCGTGACCGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTGAGCGGCACCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCAT CAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

最佳化的L1輕鏈DNA(序列辨識編號：43)GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGTAGAGTGAGCCAGAGCCTGCTGCACAGCAACGGCTACACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGACCAGACACGTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

<110> 葛蘭素集團公司(GLAXO GROUP LIMITED)

<120> 對抗β-類澱粉肽的抗體

<130> PB61927

<140> 096110663

<141> 2007-03-28

<150> US 60/787,588

<151> 2006-03-30

<160> 44

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 老鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 老鼠

<400> 2

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 老鼠

<400> 3

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 老鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 老鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 老鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至10殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 7

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至9殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 8

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至8殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 9

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至7殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至6殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222>(16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 11

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至5殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 12

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至4殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 13

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至3殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 14

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽1至12殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 15

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APP1胜肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 16

<210> 17

<211> 115

<212> PRT

<213> 老鼠

<400> 17

<210> 18

<211> 345

<212> DNA

<213> 老鼠

<400> 18

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 老鼠

<400> 19

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> 老鼠

<400> 20

<210> 21

<211> 98

<212> PRT

<213> 人類

<400> 21

<210> 22

<211> 296

<212> DNA

<213> 人類

<400> 22

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人類

<400> 23

<210> 24

<211> 112

<212> PRT

<213> 人類

<400> 24

<210> 25

<211> 336

<212> DNA

<213> 人類

<400> 25

<210> 26

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 26

<210> 27

<211> 345

<212> DNA

<213> 人類

<400> 27

<210> 28

<211> 115

<212> PRT

<213> 人類

<400> 28

<210> 29

<211> 345

<212> DNA

<213> 人類

<400> 29

<210> 30

<211> 115

<212> PRT

<213> 人類

<400> 30

<210> 31

<211> 345

<212> DNA

<213> 人類

<400> 31

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 人類

<400> 32

<210> 33

<211> 336

<212> DNA

<213> 人類

<400> 33

<210> 34

<211> 445

<212> PRT

<213> 人類

<400> 34

<210> 35

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人類

<400> 35

<210> 36

<211> 445

<212> PRT

<213> 人類

<400> 36

<210> 37

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人類

<400> 37

<210> 38

<211> 445

<212> PRT

<213> 人類

<400> 38

<210> 39

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人類

<400> 39

<210> 40

<211> 219

<212> PRT

<213> 人類

<400> 40

<210> 41

<211> 657

<212> DNA

<213> 人類

<400> 41

<210> 42

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人類

<400> 42

<210> 43

<211> 657

<212> DNA

<213> 人類

<400> 43

<210> 44

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含β-類澱粉肽2至13殘基的16單元肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> 生物素化

<400> 44

Claims (13)

1. 一種治療抗體，其為一種結合β-類澱粉肽的抗體或抗原結合片段和/或其衍生物且其包含有下列CDRs：CDRH1：DNGMA(序列辨識編號：1)CDRH2：FISNLAYSIDYADTVTG(序列辨識編號：2)CDRH3：GTWFAY(序列辨識編號：3)在衍生自VH3基因家族的一人類重鏈可變區之內以及：CDRL1：RVSQSLLHSNGYTYLH(序列辨識編號：4)CDRL2：KVSNRFS(序列辨識編號：5)CDRL3：SQTRHVPYT(序列辨識編號：6)在衍生自被揭露於GenPept項目CAA51135(序列辨識編號：24)之胺基酸序列的一人類輕鏈可變區之內。
2. 一種治療抗體，其包含一具有在序列辨識編號：26中所提出的序列之V_H鏈以及一具有在序列辨識編號：32中所提出的序列之V_L區。
3. 一種治療抗體，其包含一具有在序列辨識編號：28中所提出的序列之V_H鏈以及一具有在序列辨識編號：32中所提出的序列之V_L區。
4. 一種治療抗體，其包含一具有在序列辨識編號：30中所提出的序列之V_H鏈以及一具有在序列辨識編號：32中所提出的序列之V_L區。
5. 一種治療抗體，其為一種抗體或抗原結合片段和/或其衍生物，它以低於100 pM的平衡常數KD結合β-類澱粉肽 1-12(序列辨識編號：15)且對於結合至β-類澱粉肽2-13(序列辨識編號：44)具有大於肽1-12(序列辨識編號：15)所具有者1000倍的平衡常數KD，兩種決定是在利用被捕獲在鏈黴抗生物素蛋白晶片上之肽的表面電漿子共振分析來被做出。
6. 一種治療抗體，其為一種抗體或抗原結合片段和/或其衍生物，它以低於10 nM的平衡常數KD結合β-類澱粉肽1-40且對於結合至β-類澱粉肽2-13(序列辨識編號：44)具有大於肽1-12(序列辨識編號：15)所具有者1000倍的平衡常數KD，兩種決定是如同在實施例之方法B所述的表面電漿子共振分析來被做出。
7. 如前述申請專利範圍第1至6項中任一項之治療抗體，其為IgG1同型。
8. 如前述申請專利範圍第1至6項中任一項之治療抗體，其基本上缺少下列功能：a)藉由典型路徑活化補體；以及b)媒介抗體依賴型的細胞內細胞毒性。
9. 如申請專利範圍第7項的治療抗體，其中殘基235與237已被突變成丙胺酸。
10. 如申請專利範圍第1項的治療抗體，該抗體包含一具有如序列辨識編號：34、36或38之中所提出的序列之重鏈，以及一具有如序列辨識編號：40中所提出的序列之輕鏈。
11. 一種醫藥組成物，其包含有如前述申請專利範圍第1至10項中任一項之治療抗體。
12. 一種如申請專利範圍第1至10項中任一項的治療抗體在 製造用於治療與β-類澱粉肽相關聯疾病之醫藥品的用途。
13. 一種抗體或其片段，包含具有序列辨識編號：17的序列之V_H領域以及具有序列辨識編號：19的序列之V_L領域。