ES2338179T3 - Anticuerpos contra el peptido beta-amiloide. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo terapéutico que comprende una cadena VH que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 26 y un dominio VL que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 32.
Description
Anticuerpos contra el péptido
\beta-amiloide.
La presente invención se refiere a anticuerpos
que se unen al péptido \beta-amiloide y, en
particular, al péptido \beta-amiloide humano. La
presente invención también se refiere a procedimientos para el
tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por una
elevación de los niveles de \beta-amiloide o de
los depósitos de \beta-amiloide, particularmente
la enfermedad de Alzheimer, con dichos anticuerpos, a composiciones
farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y a procedimientos
para su fabricación. Otros aspectos de la presente invención serán
evidentes tras la descripción que se presenta más adelante.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más
común del deterioro cognitivo relacionado con la edad, que afecta a
más de 12 millones de individuos en todo el mundo (Citron M (2002)
Nat. Neurosci 5, Supl. 1055-1057). Las primeras
fases de la enfermedad se caracterizan por una pérdida progresiva de
memoria con un deterioro cognitivo asociado y déficits del lenguaje
y del comportamiento. En las últimas fases de la enfermedad, los
pacientes desarrollan amnesia global y tienen la función motora muy
reducida. La muerte se produce típicamente 9 años después del
diagnóstico y a menudo está asociada con otras afecciones,
típicamente neumonía (Davis K.L. y Samules S.C. (1998) en
Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders
eds Enna S. J. y Coyle J. T. (McGraw-Hill, Nueva
York, páginas 267-316)). Las terapias actuales
representan estrategias sintomáticas que se centran en el alivio
del deterioro cognitivo y en la mejora de los síntomas conductuales
asociados con la etiología de la enfermedad en progreso. En la
práctica, estos tratamientos sólo proporcionan un efecto
beneficioso sobre la cognición de corta duración, notificándose una
duración del nivel de deterioro cognitivo conseguido de tan sólo
hasta 2 años. El potencial de una terapia para modificar la
enfermedad que ralentice y posiblemente detenga la progresión de la
enfermedad es enorme. Tales estrategias proporcionarían mejoras
radicales y sostenidas en la calidad de vida de los pacientes y en
sus cuidadores, lo cual es muy importante, además de reducir los
enormes costes sanitarios globales de esta enfermedad.
El diagnóstico clínico de la enfermedad de
Alzheimer se basa en una combinación de ensayos físicos y mentales
que conducen al diagnóstico de una enfermedad de Alzheimer posible o
probable. Después de la muerte, la enfermedad se confirma por
signos neurológicos bien caracterizados en el cerebro, que incluyen
la deposición de A\beta en placas parenquimatosas y vasos
cerebrales, la formación intraneuronal de ovillos neurofibrilares,
pérdida sináptica y pérdida de subpoblaciones neuronales en
regiones específicas del cerebro (Terry, RD (1991) J Neural Trans
Supl. 53: 141-145).
Una gran cantidad de pruebas genéticas,
histológicas y funcionales sugieren que el péptido
\beta-amiloide (A\beta) es clave en la
progresión de la enfermedad de Alzheimer (Selkoe, D. J. (2001)
Physiological Reviews 81: 741-766).
Se sabe que A\beta se produce por medio de la
escisión de la proteína precursora de beta amiloide (también
conocida como APP) por una enzima aspartil proteasa conocida como
BACE1 (también conocida como \beta-secretasa,
Asp2 o Memapsina-2) (De Strooper, B. y Konig, G.
(1999) Nature 402: 471-472). Se ha postulado
que además de la deposición parenquimática y vascular, ciertas
formas oligoméricas solubles de A\beta contribuyen a la aparición
de EA y pueden afectar a la función neuronal inicialmente
perjudicando a la función sináptica (Lambert y col. (1998)
Proceedings of the National Academy of Science, EE.UU. 95:
6448-6453). Aunque se encuentran placas amiloides
insolubles en las primeras fases de EA y de MCI, en estos individuos
también están aumentados los niveles de agregados de A\beta
soluble (que reciben el nombre de oligómeros o ligandos difundibles
derivados de A\beta (ADDL) y los niveles de A\beta soluble se
correlacionan mejor con la degeneración neurofibrilar y la pérdida
de marcadores sinápticos que las placas de amiloide (Naslund y col.
(2000) J Am Med Assoc 283: 1571-1577, Younkin, S.
(2001) Nat. Med. 1: 8-19). El A\beta42
altamente amiloidogénico y las formas truncadas en el extremo amino
A\betax-42 son las especies predominantes de
A\beta encontradas tanto en placas difusas como en placas seniles
(Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45-53, Gravina, SA
(1995) J. Biol. Chem. 270: 7013-7016). Los
niveles relativos de A\beta42 parecen ser el regulador clave de la
agregación de A\beta en placas amiloides, de hecho se ha
demostrado que A\beta42 forma agregados más rápidamente que otras
formas de A\beta in vitro (Jarrett, JT (1993)
Biochemistry. 32: 4693-4697) y A\beta42
como tal se ha implicado como molécula iniciadora en la patogénesis
de la EA (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (París). 92:
289-292). Aunque A\beta42 es un producto
minoritario del metabolismo de APP, los pequeños cambios en su
producción están asociados con grandes efectos sobre la deposición
de A\beta, por lo tanto se ha postulado que la reducción de
A\beta42 solo puede ser una forma eficaz de tratar la EA (Younkin
SG, (1998) J. Physiol. (París). 92:
289-292). Confirmando esta teoría, se ha informado
que ciertas mutaciones en los genes de la proteína precursora de
amiloide (APP) y de la presenilina aumentan predominantemente los
niveles relativos de A\beta42 y, por lo tanto, acortan el tiempo
hasta la aparición de la enfermedad de Alzheimer (EA) (Selkoe D.J.,
Podlisny M.B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Gemet. 3:
67-99). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la
velocidad de deposición también depende del catabolismo y
eliminación de A\beta.
Se han generado modelos animales de la
deposición de amiloides por sobreexpresión de transgenes humanos
mutantes en ratones. Los ratones que sobreexpresan transgenes de
APP humanos individuales típicamente desarrollan depósitos de
\beta-amiloide del tipo de placas cerebrales desde
los 12 meses de edad (Games D. y col., (1995) Nature 373:
523-527; Hsiao K. y col., (1996) Science 274:
99-102)), mientras que los ratones que llevan
transgenes tanto de APP humana mutante como de
presenilina-1 (PS-1) típicamente
desarrollan depósitos de \beta-amiloide del tipo
de placas cerebrales tan pronto como a los 2 meses de edad (Kurt
M.A. y col., (2001) Exp. Neurol. 171: 59-71; McGowan
E. y col., (1999) Neurolbiol. Dis. 6: 231-244).
Se ha hecho cada vez más evidente que el
transporte de A\beta exógeno entre el sistema nervioso central
(SNC) y el plasma juega un papel en la regulación de los niveles de
amiloide cerebrales (Shibata, y col. (2000) J Clin Invest
106: 1489-1499), transportándose el A\beta
del LCR rápidamente desde el LCR hasta el plasma. Por lo tanto,
tras la vacunación activa con péptidos A\beta o la administración
pasiva de anticuerpos específicos contra A\beta, los anticuerpos
se unen rápidamente al A\beta periférico alterando el equilibrio
dinámico entre el plasma, el LCR y finalmente el SNC. De hecho,
ahora hay una gran cantidad de estudios que han demostrado que
estas dos estrategias pueden reducir los niveles de A\beta,
reducir la patología producida por A\beta y proporcionar
beneficios cognitivos en diversos modelos transgénicos de
amiloidosis. También se han realizado estudios limitados en
especies superiores. Se inmunizaron monos verdes caribeños (de
16-10 años de edad) con péptido A\beta durante 10
meses. Los niveles de A\beta40 se elevaron 2-5
veces en el plasma, alcanzando un máximo en 251 días, mientras que
los niveles en el LCR de A\beta40 y A\beta42 se redujeron
significativamente en 100 días y volvieron al nivel inicial a
partir de entonces. Esta reducción en el LCR estuvo acompañada de
una reducción significativa en la carga de placas (Lemere, CA (2004)
Am J Pathology 165: 283-297). También se detectaron
aumentos similares en los niveles plasmáticos de A\beta después de
la inmunización de monos Rhesus de edad avanzada (de
15-20 años de edad) (Gandy, S (2004) Alzheimer Dis
Assoc Disord 18: 44:46).
La primera terapia inmune dirigida a los
amiloides cerebrales fue AN-1792 de Elan/Wyeth, una
vacuna activa. Este tratamiento se terminó después del desarrollo
de signos clínicos coherentes con una meningoencefalitis. Los
análisis de subgrupos sugirieron que el tratamiento ralentizaba el
deterioro de la función cognitiva (Nature Clin Pract Neurol (2005)
1: 84-85). El análisis post-mortem
de los pacientes también mostró pruebas de eliminación de placas
(Gilman S. y col., (2005) Neurology 64 (9)
1553-1562). Se ha demostrado que Bapineuzumab
(AAB-001, Elan/Wyeth), una terapia pasiva de MAb,
mejora significativamente las puntuaciones de cognición en un
pequeño estudio de seguridad de fase I.
Otras enfermedades o trastornos caracterizados
por una elevación de los niveles de \beta-amiloide
o los depósitos de \beta-amiloide incluyen el
deterioro cognitivo leve (MCI, Blasko I (2006) Neurobiology of aging
"Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment
and Alzheimer's disease: Prediction by plasma amyloid beta 42,
medial temporal lobe atrophy and homocysteine" en prensa,
e-publicado el 19 de octubre de 2006), la
hemorragia cerebral hereditaria con
\beta-amiloidosis de tipo Dutch, la angiopatía
\beta-amiloide cerebral y diversos tipos de
demencias degenerativas tales como las asociadas con la enfermedad
de Parkinson, la parálisis supranuclear progresiva, la degeneración
basal cortical y la enfermedad de Alzheimer del tipo cuerpos de
Lewy difusos (Mollenhauer B (2007) J Neural Transm
e-publicado el 23 de febrero de 2007, van Oijen, M
Lancet Neurol. 2006 5: 655-60) y síndrome de Down
(Mehta, PD (2007) J Neurol Sci. 254: 22-7).
En una realización de la invención se
proporciona un anticuerpo terapéutico que comprende una cadena
V_{H} que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 26, 28 ó 30 y
un dominio V_{L} que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº:
32.
En otra realización de la invención de la
invención se proporciona un anticuerpo terapéutico, anticuerpo que
comprende una cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en SEC
ID Nº: 34, 36 ó 38 y una cadena ligera que tiene la secuencia
expuesta en SEC ID Nº: 40.
En otra realización de la invención de la
invención se proporciona una composición farmacéutica.
En otra realización de la invención, se
proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo
terapéutico de acuerdo con la invención.
También se proporciona un anticuerpo terapéutico
de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de una
enfermedad relacionada con el péptido
\beta-amiloide.
En otra realización de la invención, se
proporciona un procedimiento para la fabricación de un anticuerpo
terapéutico de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho
procedimiento expresar un polinucleótido que codifica el anticuerpo
en una célula huésped.
En otra realización de la invención, se
proporciona un polinucleótido que codifica una cadena pesada de
anticuerpo terapéutico que comprende una cadena V_{H} que tiene la
secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 26, 28 ó 30.
En otra realización de la invención, se
proporciona un polinucleótido que codifica una cadena ligera de
anticuerpo terapéutico que comprende un dominio V_{L} que tiene la
secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 32.
En otra realización de la invención, se
proporciona un polinucleótido que codifica a una cadena pesada de
anticuerpo terapéutico que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID
Nº:34, 36 ó 38.
En otra realización de la invención, se
proporciona un polinucleótido que codifica una cadena ligera de
anticuerpo terapéutico que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID
Nº: 40.
En una realización más particular de la
invención se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena
pesada de anticuerpo terapéutico, comprendiendo dicho polinucleótido
la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 35, 37, 39 ó 42.
En otra realización más particular de la
invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena
ligera de anticuerpo terapéutico, comprendiendo dicho polinucleótido
la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 41 ó 43.
En una realización particular, el anticuerpo
terapéutico que es un anticuerpo o fragmento y/o derivado del mismo
esencialmente carece de las funciones de a) activación del
complemento por la ruta clásica; y b) mediación de la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos.
En otra realización de la invención, se
proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende un
dominio V_{H} que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 17 y un dominio
V_{L} que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 19.
En otra realización de la invención, se
proporciona un polinucleótido que codifica una cadena pesada de
anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende un dominio V_{H}
que tiene la secuencia SEC ID Nº: 17, en particular el
polinucleótido de la SEC ID Nº: 18.
En otra realización de la invención, se
proporciona un polinucleótido que codifica una cadena ligera de
anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende un dominio V_{L}
que tiene la secuencia SEC ID Nº: 19, en particular el
polinucleótido de la SEC ID Nº: 20.
Las realizaciones preferidas de la invención se
describen más adelante o se definen en las
sub-reivindicaciones.
Los anticuerpos intactos normalmente son
glicoproteínas heteromultiméricas que comprenden al menos dos
cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Aparte de IgM, los
anticuerpos intactos son glicoproteínas heterotetraméricas de
aproximadamente 150 KDa, compuestas de dos cadenas ligeras (L)
idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Típicamente, cada
cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro
covalente, aunque el número de enlaces disulfuro entre las cadenas
pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina varía. Cada cadena
pesada y ligera también tiene enlaces disulfuro intracatenarios.
Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable
(V_{H}) seguido de varias regiones constantes. Cada cadena ligera
tiene un dominio variable (V_{L}) y una región constante en su
otro extremo; la región constante de la cadena ligera está alineada
con la primera región constante de la cadena pesada y el dominio
variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de
la cadena pesada. Las cadenas ligeras de anticuerpos de la mayoría
de las especies de vertebrados pueden asignarse a uno de dos tipos
denominados Kappa y Lambda basándose en la secuencia de aminoácidos
de la región constante. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos
de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos
humanos pueden asignarse a cinco clases diferentes, IgA, IgD, IgE,
IgG e IgM. IgG e IgA pueden subdividirse adicionalmente en las
subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; e IgA1 e IgA2. Existen variantes
de especie, teniendo el ratón y la rata al menos IgG2a, IgG2b. El
dominio variable del anticuerpo confiere especificidad de unión al
anticuerpo, representando ciertas regiones una variabilidad
particular y denominándose regiones determinantes de
complementariedad (CDR). Las partes más conservadas de la región
variable se denominan regiones flanqueantes (FR). Cada uno de los
dominios variables de las cadenas pesada y ligera intactas comprende
cuatro FR conectadas por tres CDR. Las CDR de cada cadena se
mantienen juntas por las regiones FR y con las CDR de la otra cadena
contribuyen a la formación de los sitios de unión a antígeno de los
anticuerpos. Las regiones constantes no están implicadas
directamente en la unión del anticuerpo al antígeno, sino que
presentan diversas funciones efectoras tales como la participación
en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos
(ADCC), la fagocitosis a través de la unión al receptor Fc\gamma,
la semivida/velocidad de eliminación a través del receptor neonatal
de Fc (FcRn) y la citotoxicidad dependiente del complemento a través
del componente C1q de la cascada del complemento. La región
constante de IgG2 humana carece de la capacidad de activar el
complemento por la ruta clásica o de mediar la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos. La región constante de IgG4
carece de la capacidad de activar el complemento por la ruta
clásica y media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
sólo débilmente. Los anticuerpos que carecen esencialmente de estas
funciones efectoras pueden denominarse anticuerpos "no
líticos".
Los anticuerpos humanos pueden producirse por
varios procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los
anticuerpos humanos pueden obtenerse por el procedimiento de
hibridoma usando líneas celulares de mieloma humano o heteromieloma
de ratón-humano, véase Kozbor J. Immunol 133, 3001,
(1984) y Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker Inc,
1987). Los procedimientos alternativos incluyen el uso de
bibliotecas de fagos o ratones transgénicos utilizando en ambos
casos repertorios de regiones V humanas (véase Winter G, (1994),
Annu. Rev. Immunol 12,433- 455, Green LL (1999), J. Immunol. methods
231, 11-23).
Actualmente se dispone de varias cepas de
ratones transgénicos donde sus loci de inmunoglobulina de ratón se
han reemplazado con segmentos de genes de inmunoglobulina humana
(véase Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild
D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ,
1997, Nature Genetics, 15,146-156). Tras la
exposición a antígenos, estos ratones pueden producir un repertorio
de anticuerpos humanos a partir de los cuales pueden seleccionarse
los anticuerpos de interés.
Debe indicarse particularmente el sistema
Trimera^{TM} (véase Eren R y col., (1998) Immunology 93:
154-161) en el que se trasplantan linfocitos
humanos en ratones sometidos a radiación, el Sistema de Anticuerpos
de Linfocitos Seleccionados (SLAM, véase Babcook y col., PNAS
(1996) 93: 7843-7848) en el que se pasan eficazmente
linfocitos humanos (o de otras especies) a través de un
procedimiento de generación masiva de anticuerpos reunidos in
vitro seguido de un procedimiento simplificado de dilución
limitante y selección y el Xenomouse II^{TM} (Abgenix Inc). En
Morphotek Inc está disponible una estrategia alternativa que usa la
tecnología Morphodoma^{TM}.
La tecnología de presentación de fagos puede
usarse para producir anticuerpos humanos (y fragmentos de los
mismos), véase McCafferty; Nature, 348, 552-553
(1990) y Griffiths EA y col. (1994) EMBO 13:
3245-3260. De acuerdo con esta técnica, se clonan
genes del dominio V de anticuerpos en fase en un gen de la proteína
principal o minoritaria de la cubierta de un bacteriófago
filamentoso, tal como M13 o fd y se presentan (normalmente con la
ayuda de un fago auxiliar) como fragmentos de anticuerpos
funcionales en la superficie de la partícula del fago. Las
selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo
tienen como resultado la selección del gen que codifica el
anticuerpo que presenta esas propiedades. La técnica de presentación
en fagos puede usarse para seleccionar anticuerpos con
especificidad de antígeno a partir de bibliotecas realizadas a
partir de células B humanas tomadas de individuos que padecen una
enfermedad o trastorno descrito anteriormente o, como alternativa,
a partir de donantes humanos no inmunizados (véase Marks; J. Mol.
Bio. 222,581- 597, 1991). Cuando se desea un anticuerpo humano
intacto que comprende un dominio Fc, es necesario volver a clonar el
fragmento derivado presentado en el fago en un vector de expresión
de mamífero que comprende las regiones constantes deseadas y
establecer líneas celulares de expresión estable.
Puede usarse la técnica de maduración por
afinidad (Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)) para
mejorar la afinidad de unión, donde la afinidad del anticuerpo
humano primario se mejora reemplazando secuencialmente las regiones
V de cadena H y L por variantes de origen natural y seleccionando
basándose en las afinidades de unión mejoradas. Ahora también se
dispone de variantes de esta técnica tales como "impronta de
epítope", véase el documento WO 93/06213. Véase también
Waterhouse; Nucl. Acids Res 21, 2265-2266
(1993).
El uso de anticuerpos no humanos intactos en el
tratamiento de enfermedades o trastornos humanos lleva asociados
los nuevos problemas bien establecidos de inmunogenicidad potencial,
especialmente tras la administración repetida del anticuerpo, es
decir, el sistema inmune del paciente puede reconocer el anticuerpo
intacto no humano como extraño y crear una respuesta
neutralizadora. Además de desarrollar anticuerpos totalmente humanos
(véase anteriormente), se han desarrollado varias técnicas a lo
largo de los años para solucionar estos problemas y generalmente
implican la reducción de la composición de secuencias de aminoácidos
no humanas en el anticuerpo terapéutico intacto mientras se
mantiene la facilidad relativa para obtener anticuerpos no humanos a
partir de un animal inmunizado por ejemplo, un ratón, rata o
conejo. En general, se han usado dos estrategias para conseguir
esto. La primera son anticuerpos quiméricos, que generalmente
comprenden un dominio variable no humano (por ejemplo, de roedor,
tal como ratón) fusionado a una región constante humana. Como el
sitio de unión a antígeno de un anticuerpo está localizado dentro
de las regiones variables, el anticuerpo quimérico mantiene su
afinidad de unión por el antígeno, pero adquiere las funciones
efectoras de la región constante humana y, por lo tanto, puede
realizar funciones efectoras tales como las descritas anteriormente.
Los anticuerpos quiméricos típicamente se producen usando
procedimientos de ADN recombinante. Se aísla el ADN que codifica
los anticuerpos (por ejemplo, ADNc) y se secuencia usando
procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas
oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que
codifican las regiones variables de cadena H y L del anticuerpo de
la invención, por ejemplo, ADN de las SEC ID Nº 18 y 20 descritas
anteriormente). Las células de hibridoma sirven como fuente típica
de este ADN. Una vez aislado, el ADN se pone en vectores de
expresión que después se utilizan para transfectar células huésped
tales como E. coli, células COS, células CHO, células PerC6
o células de mieloma que no producen de otra forma inmunoglobulinas,
para obtener la síntesis del anticuerpo. El ADN puede modificarse
sustituyendo las regiones constantes H y L no humanas (murinas) por
la secuencia codificante de las cadenas L y H humanas
correspondientes, véase, por ejemplo, Morrison; PNAS 81, 6851
(1984). De esta manera, en otra realización de la invención, se
proporciona un anticuerpo quimérico que comprende un dominio
V_{H} que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 17 y un dominio V_{L}
que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 19 fusionados a una región
constante humana (que puede ser de isotipo IgG, por ejemplo,
IgG1).
La segunda estrategia implica la generación de
anticuerpos humanizados en los que el contenido no humano del
anticuerpo se ha reducido humanizando las regiones variables. Han
conseguido popularidad dos técnicas para la humanización. La
primera es la humanización por injerto de CDR. Las CDR forman bucles
próximos al extremo N del anticuerpo, donde forman una superficie
montada en un soporte proporcionado por las regiones flanqueantes.
La especificidad de unión a antígeno del anticuerpo se define
principalmente por la topografía y por las características químicas
de su superficie de CDR. Estas características a su vez se
determinan por la conformación de las CDR individuales, por la
disposición relativa de las CDR y por la naturaleza y disposición de
las cadenas laterales de los restos que comprenden las CDR. Puede
conseguirse una gran disminución de la inmunogenicidad injertando
sólo las CDR de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos)
(anticuerpos "donadores") en regiones flanqueantes ("región
flanqueante aceptora") y contantes humanas adecuadas (véase Jones
y col. (1986) Nature 321,522-525 y Verhoeyen M y
col. (1988) Science 239, 1534-1536). Sin embargo, el
injerto de CDR per se puede no producir la retención
completa de las propiedades de unión al antígeno y a menudo se
observa que es necesario conservar algunos restos flanqueantes del
anticuerpo donador (lo cual recibe el nombre en algunas ocasiones
de "retromutaciones") en la molécula humanizada si se desea
recuperar una afinidad de unión al antígeno significativa (véase
Queen C y col. (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M
y col. (1991) Nature 351, 501-502). En este caso,
las regiones V humanas que muestran la mayor homología de secuencia
(típicamente del 60% o superior) con el anticuerpo donador no
humano pueden elegirse de una base de datos para proporcionar la
región flanqueante (FR) humana. La selección de FR humanas puede
realizarse a partir de anticuerpos humanos individuales o
anticuerpos consenso humanos. Cuando sea necesario, en la región
flanqueante aceptora humana se ponen como sustituyentes los restos
clave del anticuerpo donador para conservar las conformaciones de
CDR. Puede usarse la creación de modelos del anticuerpo por
ordenador para ayudar a identificar estos restos estructuralmente
importantes, véase el documento WO99/48523.
Como alternativa, la humanización puede
conseguirse por un procedimiento de "modificación superficial"
("veneering"). Un análisis estadístico de regiones variables
características de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana
y murina reveló que los patrones precisos de restos expuestos son
diferentes en los anticuerpos humanos y murinos, y la mayoría de
las posiciones superficiales individuales tienen una fuerte
preferencia por un pequeño número de restos diferentes (véase
Padlan E.A. y col.; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498
y Pedersen J.T. y col. (1994) J. Mol., 235;
959-973). Por lo tanto, es posible reducir la
inmunogenicidad de un Fv no humano reemplazando restos expuestos en
sus regiones flanqueantes que difieren de los que se encuentran
normalmente en los anticuerpos humanos. Como la antigenicidad de las
proteínas puede correlacionarse con la accesibilidad de la
superficie, el reemplazo de restos de la superficie puede ser
suficiente para hacer que la región variable de ratón sea
"invisible" al sistema inmune humano (véase también Mark G.E. y
col. (1994) en Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113:
The pharmacology of monoclonal Antibodies,
Springer-Verlag, páginas 105-134).
Este procedimiento de humanización se denomina "modificación
superficial" porque sólo se altera la superficie del anticuerpo,
los restos de soporte permanecen sin cambios. Otras estrategias
alternativas incluyen la indicada en el documento W004/006955 y el
procedimiento de Humaneering^{TM} (Kalobios) que hace uso de
sistemas de expresión bacterianos y produce anticuerpos próximos a
la línea germinal humana en secuencia (Alfenito-M
Advancing Protein Therapeutics enero de 2007, San Diego,
California).
Los expertos en la materia apreciarán que el
término "derivado" pretende definir no sólo la fuente en el
sentido de ser el origen físico del material, sino también definir
un material que es estructuralmente idéntico al material pero que
no procede de la fuente de referencia. De esta manera, los "restos
encontrados en el anticuerpo donador" no necesitan haberse
purificado obligatoriamente a partir del anticuerpo donador.
En la técnica está bien reconocido que ciertas
sustituciones de aminoácidos se consideran "conservativas".
Los aminoácidos se dividen en grupos basándose en las propiedades
comunes de la cadena lateral y las sustituciones dentro de grupos
que mantienen toda o sustancialmente toda la afinidad de unión del
anticuerpo terapéutico de la invención se consideran sustituciones
conservativas, véase la siguiente Tabla 1:
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Un anticuerpo biespecífico es un derivado de
anticuerpo que tiene especificidades de unión para al menos dos
epítopes diferentes y también forma parte de la invención. Los
procedimientos de fabricación de estos anticuerpos se conocen en la
técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos
biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena
H-cadena L de inmunoglobulina, donde las dos cadenas
H tienen diferentes especificidades de unión, véase Millstein y
col., Nature 305 537-539 (1983), el documento
W093/08829 y Traunecker y col. EMBO, 10, 1991,
3655-3659. Debido a la clasificación aleatoria de
las cadenas H y L, se produce una mezcla potencial de diez
estructuras de anticuerpo diferentes de las cuales sólo una tiene la
especificidad de unión deseada. Una estrategia alternativa implica
la fusión de los dominios variables con las especificidades de
unión deseadas para la región constante de cadena pesada que
comprende al menos parte de la región de bisagra, y las regiones
CH2 y CH3. Se prefiere tener la región CH1 que contiene el sitio
necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos
una de las fusiones. El ADN que codifica estas fusiones, y si se
desea la cadena L, se insertan en vectores de expresión distintos y
después de utilizan para cotransfectar un organismo huésped
adecuado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias
codificantes para dos o las tres cadenas en un vector de expresión.
En una estrategia preferida, el anticuerpo biespecífico se compone
de una cadena H con una primera especificidad de unión en un brazo
y un par de cadenas H-L, que proporcionan una
segunda especificidad de unión en el otro brazo, véase el documento
W094/04690. Véase también Suresh y col. Methods in Enzymology 121,
210, 1986.
La administración de proteínas terapéuticas en
el cerebro se ha visto obstaculizada por la presencia de la barrea
hematoencefálica (BBB). Cuando se desea administrar un anticuerpo de
la invención o un fragmento de anticuerpo de la invención a través
de la BBB, se han propuesto varias estrategias para mejorar dicha
administración en caso necesario.
Para obtener los nutrientes y factores
necesarios a partir de la sangre, la BBB posee algunos receptores
específicos que transportan compuestos desde la sangre circulante
al cerebro. Ciertos estudios han indicado que algunos compuestos
tales como la insulina (véase Duffy K. R. y col. (1989) Brain Res.
420:32-38), la transferrina (véase Fishman J. B. y
col. (1987) J. Neurosci 18:299-304) y los factores
de crecimiento semejantes a la insulina 1 y 2 (véase Pardridge WM
(1986) Endocrine Rev.7: 314-330 y Duffy K. R. y col.
(1986) Metabolism 37:136-140) atraviesan la BBB por
medio de transcitosis mediada por receptor. De esta manera, los
receptores para estas moléculas proporcionan un medio potencial
para que los anticuerpos de la invención accedan al cerebro usando
los denominados anticuerpos "vectorizados" (véase Pardridge WM
(1999) Advanced Drug Delivery Review 36: 299-321).
Por ejemplo, se ha demostrado que un anticuerpo contra el receptor
de transferrina se transporta dinámicamente al parénquima cerebral
(véase Friden PM y col. (1991) PNAS 88: 4771-4775 y
Friden PM y col. (1993) Science 259: 373-377). De
esta manera, una estrategia potencial es producir un anticuerpo
específico o un fragmento biespecífico tal como se ha descrito
anteriormente, donde una primera especificidad es hacia y una
segunda especificidad es hacia un receptor de transporte localizado
en la BBB, por ejemplo, una segunda especificidad hacia el receptor
de transporte de transferrina.
En ciertas realizaciones de la invención, se
proporciona un anticuerpo terapéutico que es un fragmento de unión
a antígeno. Tales fragmentos pueden ser fragmentos de unión a
antígeno funcionales de anticuerpos intactos y/o humanizados y/o
quiméricos tales como fragmentos Fab, Fd, Fab', F(ab')_{2},
Fv, ScFv de los anticuerpos descritos anteriormente. Los fragmentos
que carecen de la región constante carecen de la capacidad de
activar el complemento por la ruta clásica o mediar la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Tradicionalmente,
tales fragmentos se producen por la digestión proteolítica de
anticuerpos intactos, por ejemplo, por digestión con papaína
(véase, por ejemplo, el documento WO 94/29348) pero pueden
producirse directamente a partir de células huésped transformadas
de manera recombinante. Para la producción de ScFv, véase Bird y
col.; (1988) Science, 242, 423-426. Además, pueden
producirse fragmentos de anticuerpo usando una diversidad de
técnicas de ingeniería genética como las descritas más adelante.
Los fragmentos Fv parecen tener menos energía de
interacción de sus dos cadenas que los fragmentos Fab. Para
establecer la asociación de los dominios V_{H} y V_{L}, se han
asociado con péptidos (Bird y col., (1988) Science 242,
423-426, Huston y col., PNAS, 85,
5879-5883), puntes disulfuro (Glockshuber y col.,
(1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) y mutaciones de
acoplamiento ("knob in hole") (Zhu y col. (1997), Protein Sci.,
6, 781-788). Los fragmentos ScFv pueden producirse
por procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia,
véase Whitlow y col. (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2,
97-105 y Huston y col. (1993) Int. Rev. Immunol 10,
195-217. Los fragmentos ScFv pueden producirse en
células bacterianas tales como E. coli, pero más típicamente
se producen en células eucariotas. Un inconveniente de ScFv es la
monovalencia del producto, que impide el aumento de avidez debido a
la unión polivalente, y su corta semivida. Los intentos de
solucionar estos problemas incluyen (ScFv')_{2} bivalente
producido a partir de ScFV que contiene una cisteína
C-terminal adicional por acoplamiento químico
(Adams y col. (1993) Can. Res 53, 4026-4034 y
McCartney y col. (1995) Protein Eng. 8, 301-314) o
por dimerización espontánea con especificidad de sitio de ScFv que
contiene un resto de cisteína C-terminal no
emparejado (véase Kipriyanov y col. (1995) Cell. Biophys 26,
187-204). Como alternativa, puede forzarse a ScFv a
formar multímeros por acortamiento del engarce peptídico a una
longitud comprendida entre 3 y 12 restos para formar
"diacuerpos", véase Holliger y col. PNAS (1993), 90,
6444-6448. La reducción del engarce adicionalmente
puede producir trímeros de ScFV ("triacuerpos", véase Kortt y
col. (1997) Protein Eng, 10, 423-433) y tetrámetros
("tetracuerpos", véase Le Gall y col. (1999) FEBS Lett, 453,
164-168). La construcción de moléculas de ScFV
bivalentes también puede conseguirse por fusión genética con motivos
de dimerización de proteínas para formar "minianticuerpos"
(véase Pack y col. (1992) Biochemistry 31,
1579-1584) y "minicuerpos" (véase Hu y col.
(1996), Cancer Res. 56, 3055-3061). También pueden
producirse tándems ScFv-Sc-Fv
((ScFV)_{2}) uniendo dos unidades de ScFv por un tercer
engarce peptídico, véase Kurucz y col. (1995) J. Immol. 154,
4576-4582. Los diacuerpos biespecíficos pueden
producirse por medio de la asociación no covalente de dos productos
de fusión de hélice única constituidos por un dominio V_{H} de un
anticuerpo conectado por un engarce corto al dominio V_{L} de
otro anticuerpo, véase Kipriyanov y col. (1998), Int. J. Can
77,763-772. La estabilidad de tales diacuerpos
biespecíficos puede mejorarse por medio de la introducción de
puentes disulfuro o mutaciones de acoplamiento ("knob in
hole") como se ha descrito anteriormente o por la formación de
diacuerpos de hélice única (ScDb) donde dos fragmentos de ScFv
híbridos se conectan a través de un engarce peptídico, véase
Kontermann y col. (1999) J. Immunol. Methods 226
179-188. Se dispone de moléculas tetravalentes
biespecíficas, por ejemplo, fusionando un fragmento ScFv al dominio
CH3 de una molécula de IgG o a un fragmento Fab a través de la
región de bisagra, véase Coloma y col. (1997) Nature Biotechnol.
15, 159-163. Como alternativa, se han creado
moléculas tetravalentes biespecíficas por la fusión de diacuerpos
de hélice única biespecíficos (véase Alt y col., (1999) FEBS Lett
454, 90-94). También pueden formarse moléculas
biespecíficas tetravalentes por la dimerización de tándems
ScFv-ScFv con un engarce que contiene un motivo de
hélice-bucle-hélice (minianticuerpos
DiBi, véase Muller y col. (1998) FEBS Lett 432,
45-49) o una molécula de hélice única que comprende
cuatro dominios variables de anticuerpo (V_{H} y V_{L}) en una
orientación que evita el emparejamiento intramolecular (diacuerpo
en tándem, véase Kipriyanov y col., (1999) J. Mol. Biol. 293,
41-56). Los fragmentos F(ab')2 biespecíficos
pueden crearse por acoplamiento químico de fragmentos Fab' o por
heterodimerización a través de cremalleras de leucina (véase
Shalaby y col., (1992) J. Exp. Med. 175, 217-225 y
Kostelny y col. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553).
También se dispone de dominios aislados de V_{H} y V_{L},
véanse los documentos US 6.248.516; US 6.291.158; y US
6.172.197.
Los anticuerpos heteroconjugados son derivados
que también constituyen una realización de la presente invención.
Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos
unidos covalentemente formados usando cualquier procedimiento de
entrecruzamiento conveniente. Véase el documento US 4.676.980.
Se cree que la interacción entre la región Fc de
un anticuerpo y diversos receptores de Fc (Fc\gammaR) media las
funciones efectoras del anticuerpo, que incluyen la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fijación del
complemento, la fagocitosis y la semivida/eliminación del
anticuerpo. Pueden realizarse diversas modificaciones en la región
Fc de los anticuerpos de la invención dependiendo de la función
efectora deseada. En particular, las regiones constantes humanas
que carecen esencialmente de las funciones de a) activación del
complemento por la ruta clásica; y b) mediación de la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos, incluyen la región constante de
IgG4, la región constante de IgG2 y regiones constantes de IgG1 que
contienen mutaciones específicas tales como, por ejemplo,
mutaciones en las posiciones 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y/o
322 descritas en los documentos EP0307434 (W08807089), EP 0629 240
(W09317105) y WO 2004/014953. Se han descrito por separado
mutaciones en los restos 235 ó 237 dentro del dominio CH2 de la
región constante de cadena pesada (numeración de Kabat; sistema EU
Index) para reducir la unión a Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y
Fc\gammaRIII y, por lo tanto, reducir la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC) (Duncan y col. Nature 1988, 332;
563-564; Lund y col. J. Immunol. 1991, 147;
2657-2662; Chappel y col. PNAS 1991, 88;
9036-9040; Burton y Woof, Adv. Immunol. 1992,
51;1-84; Morgan y col., Immunology 1995, 86;
319-324; Hezareh y col., J. Virol. 2001, 75 (24);
12161-12168). Además, algunos informes también han
descrito la implicación de algunos de estos restos en el
reclutamiento o mediación de la citotoxicidad dependiente del
complemento (CDC) (Morgan y col., 1995; Xu y col., Cell. Immunol.
2000; 200:16-26; Hezareh y col., J. Virol. 2001, 75
(24); 12161-12168). Por lo tanto, los restos 235 y
237 se han mutado a restos de alanina (Brett y col. Immunology
1997, 91; 346-353; Bartholomew y col. Immunology
1995, 85; 41-48; y documento W09958679) para reducir
tanto los efectos mediados por el complemento como los efectos
mediados por Fc\gammaR. Los anticuerpos que comprenden estas
regiones constantes pueden denominarse anticuerpos "no
líticos".
Se puede incorporar un epítope de unión al
receptor de recuperación en el anticuerpo para aumentar la semivida
en suero, véase el documento US 5.739.277.
Actualmente hay cinco receptores Fc\gamma
humanos reconocidos, Fc\gammaR (I), Fc\gammaRIIa,
Fc\gammaRIIb, Fc\gammaRIIIa y FcRn neonatal. Shields y col.,
(2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604 demostraron que
una serie común de restos de IgG1 está implicada en la unión a
todos los Fc\gammaR, mientras que Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII
utilizan sitios distintos fuera de esta serie común. Un grupo de
restos de IgG1 redujo la unión a todos los Fc\gammaR cuando se
cambiaron por alanina: Pro-238,
Asp-265, Asp-270,
Asn-297 y Pro-239. Todos están en
el dominio CH2 de IgG y están agrupados cerca de la bisagra que une
CH1 y CH2. Aunque Fc\gammaRI utiliza sólo la serie común de
restos de IgG1 para la unión, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII
interaccionan con restos distintos además de la serie común. La
alteración de algunos restos sólo redujo la unión a Fc\gammaRII
(por ejemplo Arg-292) o Fc\gammaRIII (por
ejemplo, Glu-293). Algunas variantes mostraron una
unión mejorada a Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII, pero no afectaron
a la unión al otro receptor (por ejemplo, Ser-267Ala
mejoraron la unión a Fc\gammaRII pero la unión a Fc\gammaRIII
no se vio afectada). Otras variantes presentaron mejor unión a
Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII con reducción en la unión al otro
receptor (por ejemplo, Ser-298Ala mejoró la unión a
Fc\gammaRIII y redujo la unión a Fc\gammaRII). En el caso de
Fc\gammaRIIIa, las mejores variantes de unión de IgG1 tenían
sustituciones combinadas de alanina en Ser-298,
Glu-333 y Lys-334. Se cree que el
receptor FcRn neonatal está implicado en la protección de moléculas
de IgG de la degradación y, de esta manera, en el aumento de la
semivida en suero y la transcitosis a través de tejidos (véase
Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 y Ghetie
y col. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766). Los
restos de IgG1 humana que según se ha determinado interaccionan
directamente con FcRn humano incluyen Ile253, Ser254, Lys288,
Thr307, Gln311, Asn434 e His435.
El anticuerpo terapéutico de la invención puede
incorporar cualquiera de las modificaciones de la región constante
indicadas anteriormente.
En una realización particular, el anticuerpo
terapéutico carece esencialmente de las funciones de a) activación
del complemento por la ruta clásica; y b) mediación de la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. En una
realización más particular, la presente invención proporciona
anticuerpos terapéuticos de la invención que tienen uno (o más) de
los cambios de restos indicados con detalle anteriormente para
modificar la semivida/eliminación y/o funciones efectoras tales
como ADCC y/o citotoxicidad dependiente del complemento y/o lisis
del complemento.
En otro aspecto de la presente invención, el
anticuerpo terapéutico tiene una región constante de IgG1 de
isotipo humano con sustituciones de alanina (u otras alteraciones)
en las posiciones 235 (por ejemplo, L235A) y 237 (por ejemplo,
G237A) (numeración de acuerdo con el esquema EU indicado en
Kabat.
Otros derivados de la invención incluyen
variantes de glicosilación de los anticuerpos de la invención. Se
sabe que la glicosilación de anticuerpos en posiciones conservadas
en sus regiones constantes tiene un profundo efecto sobre la
función de los anticuerpos, particularmente las funciones efectoras
tales como las descritas anteriormente, véase, por ejemplo, Boyd y
col. (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Se
contemplan variantes de glicosilación de los anticuerpos
terapéuticos de la presente invención en las que se añaden,
sustituyen, suprimen o modifican uno o más restos de carbohidrato.
La introducción de un motivo de
asparagina-X-serina o
asparagina-X-treonina crea un sitio
potencial para la unión enzimática de restos de carbohidrato y, por
lo tanto, puede usarse para manipular la glicosilación de un
anticuerpo. En Raju y col. (2001) Biochemistry 40,
8868-8876, la sialilación terminal de una
inmunoadhesina TNFR-IgG se aumentó a través de un
procedimiento de regalactosilación y/o resialilación usando
beta-1,4-galactosiltransferasa y/o
alfa-2,3-sialiltransferasa. Se cree
que el aumento de la sialilación terminal aumenta la semivida de la
inmunoglobulina. Los anticuerpos, de la misma manera que la mayoría
de las glicoproteínas, típicamente se producen en la naturaleza como
una mezcla de glicoformas. Esta mezcla es particularmente evidente
cuando los anticuerpos se producen en células eucariotas,
particularmente de mamífero. Se han creado varios procedimientos
para fabricar glicoformas definidas, véase Zhang y col. Science
(2004), 303, 371, Sears y col., Science, (2001) 291, 2344, Wacker y
col. (2002) Science, 298 1790, Davis y col. (2002) Chem. Rev. 102,
579, Hang y col. (2001) Acc. Chem. Res 34, 727. De esta manera, la
invención se refiere a una pluralidad de anticuerpos terapéuticos
(que pueden ser de isotipo de IgG, por ejemplo IgG1) como se
describen en este documento que comprenden un número definido (por
ejemplo, 7 o menos, por ejemplo 5 o menos, tal como dos o una única)
de glicoforma o glicoformas de dichos anticuerpos.
Los derivados de acuerdo con la invención
también incluyen anticuerpos terapéuticos de la invención acoplados
a un polímero no proteico tal como polietilenglicol (PEG),
polipropilenglicol o polioxialquileno. La conjugación de proteínas
a PEG es una técnica establecida para aumentar la semivida de las
proteínas, así como para reducir la antigenicidad y la
inmunogenicidad de las proteínas. Se ha investigado el uso de la
PEGilación con diferentes pesos moleculares y estilos (lineal o
ramificado) con anticuerpos intactos así como con fragmentos Fab',
véase Koumenis I.L. y col. (2000) Int. J. Pharmaceut.
198:83-95. Una realización particular comprende un
fragmento de unión a antígeno de la invención sin las funciones
efectoras de a) activación del complemento por la ruta clásica; y
b) mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos;
(tal como un fragmento Fab o un scFv) acoplado a PEG.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
producirse en organismos transgénicos tales como cabras (véase
Pollock y col. (1999), J. Immunol. Methods 231:147- 157), pollos
(véase Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55),
ratones (véase Pollock y col. ibid) o plantas (véase Doran
PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204,
Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4;
601-606, Baez J y col., BioPharm (2000) 13:
50-54, Stoger E y col.; (2000) Plant Mol. Biol. 42:
583-590). También pueden producirse anticuerpos por
síntesis química. Sin embargo, los anticuerpos de la invención se
producen típicamente usando la tecnología de cultivo de células
recombinantes bien conocida para los expertos en la materia. Un
polinucleótido que codifica el anticuerpo se aísla y se inserta en
un vector replicable tal como un plásmido para la propagación
adicional o expresión en una célula huésped. Un sistema de
expresión útil es un sistema de glutamato sintetasa (tal como el
comercializado por Lonza Biologics), particularmente cuando la
célula huésped es CHO o NS0 (véase más adelante). El polinucleótido
que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente y se secuencia
usando procedimientos convencionales (por ejemplo, sondas
oligonucleotídicas). Los vectores que pueden usarse incluyen
plásmidos, virus, fagos, transposones y minicromosomas, siendo una
realización típica los plásmidos. Generalmente, estos vectores
incluyen además una secuencia señal, origen de replicación, uno o
más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y
secuencias de terminación de la transcripción unidas operativamente
al polinucleótido de cadena ligera y/o pesada para facilitar la
expresión. El polinucleótido que codifica las cadenas ligera y
pesada puede insertarse en vectores separados e introducirse (por
ejemplo, por transformación, transfección, electroporación o
transducción) en la misma célula huésped al mismo tiempo o
secuencialmente o, si se desea tanto la cadena pesada como la cadena
ligera pueden insertarse en el mismo vector antes de dicha
introducción.
introducción.
\newpage
Inmediatamente será evidente para los expertos
en la materia que debido a la redundancia del código genético,
también están disponibles polinucleótidos alternativos a los
descritos en este documento que codifican los polipéptidos de la
invención.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
producirse como una proteína de fusión con una secuencia señal
heteróloga que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N
de la proteína madura. La secuencia señal debe reconocerse y
procesarse por la célula huésped. Para células huésped procariotas,
la secuencia señal puede ser una fosfatasa alcalina, penicilinasa o
secuencias líder de enterotoxina II termoestable. Para la secreción
en levadura, las secuencias señal pueden ser un líder de invertasa
de levadura, el líder del factor o líderes de fosfatasa ácida,
véase, por ejemplo, el documento W090/13646. En sistemas celulares
de mamífero, se dispone de líderes de secreción virales tales como
la secuencia señal de gD del virus herpes simplex y secuencias
señal de inmunoglobulinas nativas (tales como cadena pesada de Ig
humana). Típicamente, la secuencia señal está unida en la misma
fase de lectura al polinucleótido que codifica el anticuerpo de la
invención.
Los orígenes de replicación son bien conocidos
en la técnica, siendo el de pBR322 adecuado para la mayoría de las
bacterias gram-negativas, el del plásmido 2 \mu
para la mayoría de las levaduras y diversos orígenes virales tales
como el de SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV para la mayoría de
las células de mamíferos. Generalmente, para vectores de expresión
de mamífero integrados no se necesita el componente del origen de
replicación de SV40. Sin embargo, el ori de SV40 puede incluirse, ya
que contiene el promotor temprano.
Los genes de selección típicos codifican
proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras
toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o
tetraciclina o (b) complementan deficiencias auxotróficas o
suministran nutrientes no disponibles en los medios complejos o (c)
combinaciones de las dos. El esquema de selección puede implicar
detener el crecimiento de las células huésped que no contienen el
vector o los vectores. Las células que se han transformado
satisfactoriamente con los genes que codifican el anticuerpo
terapéutico de la presente invención sobreviven debido a, por
ejemplo, resistencia a fármacos conferida por el marcador de
selección administrado conjuntamente. Un ejemplo es el sistema de
selección de DHFR en el que los transformantes se generan en cepas
de huésped negativas para DHFR (por ejemplo, véase Page y Sydenham
1991 Biotechnology 9: 64-68). En este
sistema, el gen de DHFR se administra conjuntamente con las
secuencias del polinucleótido anticuerpo de la invención y las
células positivas para DHFR después se seleccionan por retirada de
nucleósidos del medio. Si es necesario, también se emplea el
inhibidor de DHFR metotrexato para seleccionar los transformantes
con amplificación del gen de la DHFR. Por medio de la unión
operativa del gen de DHFR a las secuencias codificantes de
anticuerpos de la invención o derivados funcionales de las mismas,
la amplificación del gen de la DHFR produce la amplificación
concomitante de las secuencias de anticuerpo deseadas de interés.
Las células CHO son una línea celular particularmente útil para esta
selección con DHFR/metotrexato y en la técnica están bien
establecidos procedimientos de amplificación y selección de células
huésped usando el sistema DHFR, véase Kaufman R.J. y col. J. Mol.
Biol. (1982) 159, 601-621, como revisión, véase
Werner RG, Noe W, Kopp K, Schluter M,"Appropriate mammalian
expression systems for biopharmaceuticals",
Arzneimittel-Forschung. 48(8):
870-80, agosto de 1998. Otro ejemplo es el sistema
de expresión de glutamato sintetasa (Bebbington y col.
Biotechnology 1992 Vol 10 p169). Un gen de selección adecuado para
uso en levaduras es el gen trp1; véase Stinchcomb y col. Nature 282,
38, 1979.
Los promotores adecuados para la expresión de
anticuerpos de la invención se unen operativamente al
ADN/
polinucleótido que codifica el anticuerpo. Los promotores para hospedadores procariotas incluyen el promotor de phoA, los sistemas promotores de Beta-lactamasa y de lactosa, fosfatasa alcalina, triptófano y promotores híbridos tales como Tac. Los promotores adecuados para la expresión en células de levadura incluyen los de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, por ejemplo, enolasa, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa 6 fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa y glucoquinasa. Los promotores de levadura inducibles incluyen los de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, metalotioneína y enzimas responsables del metabolismo del nitrógeno o de la utilización de maltosa/galactosa. Los promotores para la expresión en sistemas celulares de mamífero incluyen promotores de la ARN polimerasa II incluyendo promotores virales tales como el promotor de polioma, virus de la viruela de las aves de corral y adenovirus (por ejemplo, adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (en particular el promotor del gen temprano inmediato), retrovirus, virus de la hepatitis B, actina, virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor temprano o tardío del virus de simio 40 y promotores no virales tales como EF-1alfa (Mizushima y Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17): 5322). La elección del promotor puede basarse en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.
polinucleótido que codifica el anticuerpo. Los promotores para hospedadores procariotas incluyen el promotor de phoA, los sistemas promotores de Beta-lactamasa y de lactosa, fosfatasa alcalina, triptófano y promotores híbridos tales como Tac. Los promotores adecuados para la expresión en células de levadura incluyen los de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, por ejemplo, enolasa, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa 6 fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa y glucoquinasa. Los promotores de levadura inducibles incluyen los de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, metalotioneína y enzimas responsables del metabolismo del nitrógeno o de la utilización de maltosa/galactosa. Los promotores para la expresión en sistemas celulares de mamífero incluyen promotores de la ARN polimerasa II incluyendo promotores virales tales como el promotor de polioma, virus de la viruela de las aves de corral y adenovirus (por ejemplo, adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (en particular el promotor del gen temprano inmediato), retrovirus, virus de la hepatitis B, actina, virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor temprano o tardío del virus de simio 40 y promotores no virales tales como EF-1alfa (Mizushima y Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17): 5322). La elección del promotor puede basarse en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.
\newpage
Cuando sea apropiado, por ejemplo, para la
expresión en eucariotas superiores, pueden incluirse elementos
potenciadores adicionales en lugar de o además de los que se
encuentran localizados en los promotores descritos anteriormente.
Las secuencias potenciadoras de mamífero adecuadas incluyen
elementos potenciadores de globina, elastasa, albúmina,
fetoproteína, metalotioneína e insulina. Como alternativa, se puede
usar un elemento potenciador de un virus de célula eucariota tal
como el potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano de
citomegalovirus, potenciador de polioma, potenciador de baculovirus
o locus IgG2a murino (véase el documento W004/009823). Aunque estos
potenciadores típicamente se localizan en el vector en un sitio
cadena arriba del promotor, también pueden localizarse en otros
sitios, por ejemplo, dentro de la región no traducida o cadena abajo
de la señal de poliadenilación. La elección y posicionamiento del
potenciador pueden basarse en la compatibilidad adecuada con la
célula huésped usada para la expresión.
En sistemas eucariotas, hay señales de
poliadenilación unidas operativamente al polinucleótido que codifica
el anticuerpo de esta invención. Tales señales típicamente se ponen
en posición 3' de la fase de lectura abierta. En sistemas de
mamífero, las señales ejemplares no limitantes incluyen las
procedentes de hormonas de crecimiento, factor de
elongación-1 alfa y genes virales (por ejemplo de
SV40) o repeticiones terminales largas retrovirales. En sistemas de
levadura, los ejemplos no limitantes de señales de
poliadenilación/terminación incluyen las derivadas de los genes de
la fosfoglicerato quinasa (PGK) y la alcohol deshidrogenasa 1 (ADH).
En un sistema procariota típicamente no se requieren las señales de
poliadenilación y en su lugar es habitual emplear secuencias
terminadoras más cortas y más definidas. La elección de las
secuencias de poliadenilación/terminación puede basarse en la
compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la
expresión.
Además de lo anterior, otras características que
pueden emplearse para mejorar los rendimientos incluyen elementos
de remodelación de cromatina, intrones y modificación de codones
específicos para la célula huésped. El uso de codones del
anticuerpo de esta invención puede modificarse para adaptar la
desviación de codones de la célula huésped, tal como para aumentar
la transcripción y/o el rendimiento de producto (por ejemplo Hoekema
A y col. Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24).
La elección de los codones puede basarse en la compatibilidad
adecuada con la célula huésped usada para la expresión.
Las células huésped adecuadas para la clonación
o expresión de los vectores que codifican los anticuerpos de la
invención son células procariotas, levaduras o células eucariotas
superiores. Las células procariotas adecuadas incluyen eubacterias,
por ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia, por
ejemplo, E. coli (por ejemplo ATCC 31.446; 31.537; 27.325),
Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella, por
ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo,
Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos tales
como B. subtilis y B. licheniformis (véase el
documento DD 266 710), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y
Streptomyces. Entre las células huésped de levadura, también
se contemplan Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe, Kluyveromyces (por ejemplo, ATCC 16.045; 12.424; 24178;
56.500), Yarrowia (documento EP402. 226), Pichia
Pastoris (documento EP183. 070, véase también Peng y col. J.
Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida,
Trichoderma reesia (documento EP244. 234), Penicillin,
Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans
y A. niger.
Aunque la invención contempla específicamente
células huésped procariotas y de levadura, sin embargo, típicamente,
las células huésped de la presente invención son células de
vertebrados. Las células huésped de vertebrados adecuadas incluyen
células de mamífero tales como COS-1 (ATCC Nº CRL
1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), línea de riñón
embrionario humano 293, PerC6 (Crucell), células renales de cría de
hámster (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC Nº: CRL 10314), 293
(ATCC Nº CRL 1573), células de ovario de hámster chino CHO (por
ejemplo, CHO-K1, ATCC Nº CCL 61, una línea celular
CHO DHFR-negativa tal como DG44 (Urlaub y col.,
Somat Cell Mol Genet (1986) Vol 12 páginas
555-566), particularmente las líneas de células CHO
adaptadas para cultivo en suspensión, células de sertoli de ratón,
células de riñón de mono, células renales de mono verde africano
(ATCC CRL-1587), células HELA, células de riñón
canino (ATCC CCL 34), células de pulmón humano (ATCC CCL 75),
células Hep G2 y células de mieloma o linfoma, por ejemplo, NS0
(véase el documento US 5.807.715), Sp2/0 e Y0.
De esta manera, en una realización de la
invención, se proporciona una célula huésped transformada de manera
estable que comprende un vector que codifica una cadena pesada y/o
cadena ligera del anticuerpo terapéutico como se ha descrito en
este documento. Típicamente, tales células huésped comprenden un
primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que
codifica dicha cadena pesada.
Tales células huésped también pueden modificarse
adicionalmente por ingeniería genética o adaptarse para modificar
la calidad, función y/o rendimiento del anticuerpo de esta
invención. Los ejemplos no limitantes incluyen la expresión de
enzimas específicas de modificación (por ejemplo, glicosilación) y
chaperonas de plegamiento de proteínas.
Las células huésped transformadas con vectores
que codifican los anticuerpos terapéuticos de la invención pueden
cultivarse por cualquier procedimiento conocido por los expertos en
la materia. Las células huésped pueden cultivarse en matraces
rotativos, matraces de agitación, matraces cilíndricos, reactores de
agitación por ondas (por ejemplo, System 1000 de wavebiotech.com) o
sistemas de fibras huecas, pero para la producción a gran escala se
prefiere usar reactores de depósito agitado o reactores de bolsa
(por ejemplo, Wave Biotech, Somerset, Nueva Jersey EE.UU.)
particularmente para cultivos en suspensión. Típicamente, los
depósitos agitados están adaptados para la aireación usando, por
ejemplo, rociadores, compuertas o propulsores de bajo cizallamiento.
En el caso de las columnas de burbujeo y reactores de agitación por
inyección de aire puede usarse la aireación directa con burbujas de
aire u oxígeno. Cuando las células huésped se cultivan en un medio
de cultivo sin suero, éste puede complementarse con un agente
protector de células tal como pluronic F-68 ara
ayudar a prevenir las lesiones celulares como resultado del
procedimiento de aireación. Dependiendo de las características de
la célula huésped, pueden usarse microsoportes como sustratos de
crecimiento para líneas celulares dependientes de anclaje o las
células pueden adaptarse a cultivos en suspensión (lo cual es
típico). El cultivo de las células huésped, particularmente células
huésped de vertebrados, puede utilizar una diversidad de modos de
operación tales como un procesamiento discontinuo, semicontinuo o
discontinuo repetido (véase Drapeau y col. (1994) cytotechnology
15: 103-109), un procedimiento discontinuo
prolongado o un cultivo de perfusión. Aunque las células huésped de
mamífero transformadas de manera recombinante pueden cultivarse en
medios que contienen suero tales como medios que comprenden suero
fetal bovino (FCS), se prefiere cultivar estas células en medios
sin suero tales como los descritos en Keen y col. (1995)
Cytotechnology 17:153-163, o medios disponibles en
el mercado tales como ProCHO-CDM o UltraCHO^{TM}
(Cambrex NJ, EE.UU.), complementado cuando es necesario con una
fuente de energía tal como glucosa y factores de crecimiento
sintéticos tales como insulina recombinante. El cultivo sin suero
de las células huésped puede requerir que esas células se adapten al
crecimiento en condiciones sin suero. Una estrategia de adaptación
es cultivar dichas células huésped en medio que contiene suero y
cambiar de manera repetida 80% del medio de cultivo por el medio
sin suero de manera que las células huésped aprendan a adaptarse a
las condiciones sin suero (véase, por ejemplo, Scharfenberg K y col.
(1995) en Animal Cell technology: Developments towards the 21st
century (Beuvery E.C. y col. eds), páginas
619-623, Kluwer Academic publishers).
Los anticuerpos de la invención secretados en el
medio pueden recuperarse y purificarse a partir del medio usando
una diversidad de técnicas para proporcionar un grado de
purificación adecuado para el uso para el que están destinados. Por
ejemplo, el uso de anticuerpos terapéuticos de la invención para el
tratamiento de pacientes humanos típicamente exige una pureza de al
menos el 95% determinada por SDS-PAGE reductora, más
típicamente una pureza del 98% o el 99%, en comparación con el
medio de cultivo que comprende los anticuerpos terapéuticos. En el
primer caso, los desechos celulares del medio de cultivo típicamente
se retiran usando centrifugación seguido de una etapa de aclarado
del sobrenadante usando, por ejemplo, microfiltración,
ultrafiltración y/o filtración en profundidad. Como alternativa, el
anticuerpo puede recogerse por microfiltración, ultrafiltración o
filtración en profundidad sin centrifugación previa. Se dispone de
una diversidad de técnicas distintas tales como diálisis y
electroforesis en gel y técnicas cromatográficas tales como
cromatografía en hidroxiapatita (HA), cromatografía de afinidad
(que implica opcionalmente un sistema de señalización de afinidad
tal como polihistidina) y/o cromatografía de interacción hidrófoba
(HIC, véase el documento US 5.429.746). En una realización, los
anticuerpos de la invención, después de diversas etapas de aclarado,
se capturan usando cromatografía de afinidad de Proteína A o G
seguido de etapas de cromatografía adicionales tales como
cromatografía de intercambio iónico y/o HA, intercambio aniónico o
catiónico, cromatografía por exclusión de tamaño y precipitación con
sulfato de amonio. Típicamente, también se emplean diversas etapas
de eliminación de virus (por ejemplo, nanofiltración usando, por
ejemplo, un filtro DV-20). Después de estas diversas
etapas, se proporciona una preparación purificada (típicamente
monoclonal) que comprende al menos 10 mg/ml o más, por ejemplo 100
mg/ml o más del anticuerpo de la invención y, por lo tanto,
constituye una realización de la invención. Puede generarse una
concentración de 100 mg/ml o superior por ultracentrifugación.
Convenientemente, estas preparaciones carecen sustancialmente de
formas agregadas de anticuerpos de la invención.
Los sistemas bacterianos son particularmente
adecuados para la expresión de fragmentos de anticuerpo. Estos
fragmentos se localizan dentro de la célula o dentro del periplasma.
Las proteínas periplásmicas insolubles pueden extraerse y
replegarse para formar proteínas activas de acuerdo con
procedimientos conocidos por los expertos en la materia, véase
Sanchez y col. (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 y
Cupit PM y col. (1999) Lett Appl Microbiol, 29,
273-277.
Las preparaciones purificadas de anticuerpos de
la invención (particularmente anticuerpos monoclonales) descritas
anteriormente, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas
para uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos humanos
tales como los indicados anteriormente. Típicamente, estas
composiciones además comprenden un vehículo farmacéuticamente
aceptable (es decir, inerte) conocido y requerido por la práctica
farmacéutica aceptable, véase, por ejemplo, Remingtons
Pharmaceutical Sciences, 16ª ed, (1980), Mack Publishing Co. Los
ejemplos de estos vehículos incluyen vehículos esterilizados tales
como solución salina, solución de Ringer o solución de dextrosa,
tamponados con tampones adecuados tales como acetato sódico
trihidrato a un pH farmacéuticamente aceptable, tal como un pH
dentro de un intervalo de 5 a 8. Las composiciones farmacéuticas
para inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal,
intradérmica, subcutánea, intramuscular o intraportal) o infusión
continua convenientemente carecen de materia en partículas visibles
y pueden comprender de 1 mg a 10 g de anticuerpo terapéutico,
típicamente de 5 mg a 1 g, más específicamente de 5 mg a 25 mg o 50
mg de anticuerpo. Los procedimientos para la preparación de estas
composiciones farmacéuticas son bien conocidos para los expertos en
la materia. En una realización, las composiciones farmacéuticas
comprenden de 1 mg a 10 g de los anticuerpos terapéuticos de la
invención en forma de dosificación unitaria, opcionalmente junto con
instrucciones de uso. Las composiciones farmacéuticas de la
invención pueden liofilizarse (secarse por congelación) para
reconstituirse antes de la administración de acuerdo con
procedimientos bien conocidos o evidentes para los expertos en la
materia. Cuando las realizaciones de la invención comprenden
anticuerpos de la invención con un isotipo IgG1, a la composición
farmacéutica se le puede añadir un quelante de iones metálicos
incluyendo cobre, tal como citrato (por ejemplo, citrato sódico) o
EDTA o histidina, para reducir el grado de degradación mediada por
metal de anticuerpos de este isotipo, véase el documento EP0612251.
Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender un
solubilizante tal como una base de arginina, un agente
detergente/anti-agregación tal como polisorbato 80
y un gas inerte tal como nitrógeno para reemplazar el oxígeno del
espacio superior del vial.
Las dosis eficaces y los regímenes de
tratamiento para administrar el anticuerpo de la invención
generalmente se determinan empíricamente y dependen de factores
tales como la edad, el peso y el estado de salud del paciente, y la
enfermedad o trastorno a tratar. Estos factores están dentro del
ámbito del médico a cargo del caso. Puede encontrarse una guía para
la selección de las dosis apropiadas, por ejemplo, en Smith y col.
(1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press,
Nueva York, pero en general será de 1 mg a 10 g. En una
realización, el régimen de dosificación para el tratamiento de un
paciente humano es de 1 mg a 1 g del anticuerpo terapéutico de la
invención administrado por vía subcutánea una vez a la semana o cada
dos semanas, o por infusión intravenosa cada 1 ó 2 meses. Esta
dosificación corresponde a 0,014-140 mg/kg, tal como
0,014-14 mg/kg. Las composiciones de la presente
invención también pueden usarse profilácticamente.
Se apreciará que las enfermedades caracterizadas
por una elevación de los niveles de \beta-amiloide
o por depósitos de \beta-amiloide incluyen la
enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, síndrome de Down,
hemorragia cerebral hereditaria con
\beta-amiloidosis de tipo Dutch, angiopatía
\beta-amiloide cerebral y diversos tipos de
demencias degenerativas tales como las asociadas con la enfermedad
de Parkinson, parálisis supranuclear progresiva, degeneración basal
cortical y enfermedad de Alzheimer del tipo de cuerpos de Lewy
difusos.
Más preferiblemente, la enfermedad caracterizada
por una elevación de los niveles de \beta-amiloide
o depósitos de \beta-amiloide es la enfermedad de
Alzheimer.
Aunque la presente invención se ha descrito
principalmente en relación al tratamiento de enfermedades o
trastornos humanos, también puede tener aplicaciones en el
tratamiento de enfermedades o trastornos similares en mamíferos no
humanos.
- Biacore^{TM}/Biacore 3000
- un dispositivo que permite medir las cinéticas a tiempo real de interacciones moleculares usando SPR
- SPR
- (resonancia de plasmón superficial) - fenómeno físico empleado por los instrumentos Biacore^{TM} para medir los cambios de masa en un chip de detección
- CM5
- chip de detección Biacore^{TM} con una superficie de propósitos generales recubierta con una matriz de dextrano carboximetilada
- ELISA
- ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
- SRU
- Tecnología de biosensor SRU BIND^{TM} que permite controlar las intreracciones bioquímicas sin marcador
- Integra CL1000
- Mini-biorreactores vendidos por IBS Integra Biosciences
- FMAT
- Tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico (Applied Biosystems)
- ABi8200
- Sistema de detección celular confocal macro de fluorescencia de Applied Biosystems 8200 para FMAT
- FPLC
- Cromatografía líquida de proteína rápida
- ProSepA HiTrap
- Columnas de Proteína A para FPLC vendidas por GE Healthcare
- DMSO
- dimetilsulfóxido
- HEPES
- N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfónico)
- EDTA
- ácido etilendiaminatetraacético
- Tris HCl
- - hidrocloruro de tris-(hidroximetil)aminometano
- NaCl
- - cloruro sódico
- Tween-20
- - monolaurato de polioxietilenosorbitano
- BSA
- - albúmina de suero bovino
- PBS
- - solución salina tamponada con fosfato
- PFA
- - paraformaldehído
- IMS
- - licor metilado industrial
- DAB
- - 3,3'diaminobencidina
- DMEM
- medio de Eagle modificado por Dulbecco
- FCS
- suero bovino fetal
- Opti-MEM
- medio basado en el medio de Eagle modificado de Invitrogen/Gibco
- Lipofectamine
- agente de transfección de células basado en lípidos catiónicos vendido por Invitrogen/Gibco
- Transfast
- agente de transfección liposomal vendido por Promega
- Versene
- agente quelante de iones metálicos (ácido etilendiaminatetraacético)
- Glutamax
- forma estable de glutamina añadida al medio de cultivo (complemento dipeptídico L-Ananil-L-Glutamina)
- Histoclear
- agente de aclaramiento de tejidos
- tampón HBS-EP
- Tampón Biacore^{TM} para propósitos generales que contiene HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,005%
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo monoclonal de ratón 2E7 se generó
a partir de una inmunización convencional de ratones. Se inmunizaron
ratones con \beta-amiloide 1-40 y
1-42 soluble o agregado, formulado en adyuvante de
Freund. Después del refuerzo final sin adyuvante, los esplenocitos
se fusionaron con células de mieloma. Las células fusionadas se
dejaron crecer en placas de 96 pocillos, en las que los
sobrenadantes de los hibridomas se sometieron a una investigación
para encontrar posibles indicios. El anticuerpo seleccionado 2E7,
que se obtuvo por inmunización con \beta-amiloide
1-40 soluble, era de isotipo IgG2a murino y tenía
actividad de unión a beta-amiloide en el ensayo de
salida descrito más adelante y una afinidad de 36,1 pM para el
beta-amiloide 1-40 medida por
Biacore^{TM}, Procedimiento A(i) (Tabla 10A).
Para mapear finalmente la unión del anticuerpo
2E7 al péptido \beta-amiloide, se utilizó una
serie de péptidos (A). La serie de péptidos (A) consistía en una
serie de 31 péptidos solapantes de 12 aminoácidos que cubrían la
secuencia completa del péptido \beta-amiloide
1-42. Cada péptido secuencial se inició en el
aminoácido secuencial dentro del péptido
\beta-amiloide, cambiando de esta manera la
secuencia cubierta entre péptidos secuenciales por un solo
aminoácido. Todos los péptidos de la serie (A) contenían un engarce
C-terminal de 3 aminoácidos
(glicina-serina-glicina) y un resto
de lisina biotinilado terminal. Además, todos los péptidos excepto
el péptido A\beta1 DAEFRHDSGYEVGSGK-biotina (SEC
ID Nº: 15) estaban acetilados en el extremo N. Una segunda serie de
péptidos (serie (B)) consistía en deleciones secuenciales
C-terminales de un aminoácido de un péptido que
contenía los aminoácidos 1 a 10 de la secuencia de
\beta-amiloide. Todos los péptidos de la serie
(B) contenían un engarce C-terminal de 3 aminoácidos
(glicina-serina-glicina) y un resto
de lisina biotinilado terminal, pero con restos adicionales de
glicina y serina para reemplazar los aminoácidos de
\beta-amiloide delecionados (Tabla 2). De esta
manera, todos los péptidos de la serie (B) tienen la misma
longitud.
- DAEFRHDSGYGSGGSK-biotina
- (SEC ID Nº: 7)
- DAEFRHDSG- -GSGSGSK-biotina
- (SEC ID Nº: 8)
- DAEFRHDS- -GSGGSGGK-biotina
- (SEC ID Nº: 9)
- DAEFRHD- -GSGGSGGSK-biotina
- (SEC ID Nº: 10)
- DAEFRH- -GSGGSGGSGK-biotina
- (SEC ID Nº: 11)
- DAEFR- -GSGGSGGSGSK-biotina
- (SEC ID Nº: 12)
- DAEF- -GSGGSGGSGGSK-biotina
- (SEC ID Nº: 13)
- DAE- -GSGGSGGSGGSGK-biotina
- (SEC ID Nº: 14)
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavaron placas revestidas con estreptavidina
SRU Bind^{TM} de 96 pocillos (SRU Biosystems) con PBS que
contenía DMSO al 1% para retirar el glicerol y el conservante. Se
dejó un volumen de 50 \mul/pocillo a temperatura ambiente para
proporcionar un valor basal constante. Los péptidos biotinilados se
diluyeron a aproximadamente 0,3 \mug/ml en PBS que contenía DMSO
al 1%, se añadieron 50 \mul de cada uno a los pocillos y se
incubaron durante aproximadamente 1 h. Se prepararon pocillos por
duplicado usando diferentes sectores de la placa y se usó al menos
un pocillo de control sin péptido en cada sector para restar la
referencia de los datos. Después de la captura de los péptidos, la
placa se lavó con PBS que contenía DMSO al 1%, dejando 50 \mul de
tampón reciente por pocillo para proporcionar un nuevo valor basal
en el lector. No se observó ninguna descomposición del péptido de
la superficie. El tampón después se reemplazó con 40 \mul/pocillo
de tampón que contenía anticuerpo de ensayo a una concentración
20-64 nM durante 2 horas. Se descubrió que el
anticuerpo 2E7 sólo se unía al péptido que incluía los aminoácidos
1-12 del péptido \beta-amiloide en
la serie de péptido (A) (péptido A\beta1, SEC ID Nº: 15). Este
resultado implica que el ácido aspártico en el resto 1 es crítico
para la unión a este péptido.
Para caracterizar adicionalmente el sitio de
unión del anticuerpo 2E7, se utilizó la serie de péptidos (B).
Usando la metodología del biosensor SRU BIND^{TM}, el anticuerpo
2E7 mostró una unión insignificante a los péptidos que incluían los
aminoácidos 1-3 y 1-4 del péptido
\beta-amiloide (SEC ID Nº: 14 y 13). La unión a
un péptido que incluía los aminoácidos 1-7 del
péptido \beta-amiloide (SEC ID Nº: 10) fue
comparable a la del péptido que incluía los aminoácidos
1-12 del péptido \beta-amiloide
(de la serie de péptidos (A)). Se observó la unión a péptidos que
incluían los aminoácidos 1-5 ó 1-6
del péptido \beta-amiloide (SEC ID Nº: 12 u 11),
pero fue más débil (medido por la estabilidad después de una etapa
de lavado adicional) que la unión al péptido que incluía los
aminoácidos 1-7 del péptido
\beta-amiloide (SEC ID Nº: 10).
De esta manera, se ha demostrado que sólo se
requieren los restos 1-7 del péptido
\beta-amiloide para la unión total, medido usando
esta metodología.
Además de los experimentos descritos
anteriormente, se usó el biosensor óptico Biacore^{TM} 3000 para
controlar la unión del anticuerpo 2E7 a péptidos derivados de la
secuencia de \beta- amiloide seleccionados. La unión se midió
inyectando anticuerpos de ensayo a una concentración de hasta 64 nM
durante 5 minutos sobre los péptidos capturados en distintas
superficies de chips de estreptavidina (130-230 RU
(unidades de resonancia)). Se usó un tampón de procesamiento
(HBS-EP) que contenía HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15
M, EDTA 3 mM y Surfactante P20^{TM} al 0,005% a 25ºC a un caudal
de 20 \mul/min. Todos los ensayos utilizaron una doble referencia
frente a una superficie blanco de estreptavidina e inyecciones
blanco. El análisis se realizó usando el software de análisis
Biacore^{TM} BIAevaluation^{TM} versión 4.1. Los resultados de
los péptidos seleccionados de la serie (A) confirmaron
adicionalmente los datos obtenidos con SRU BIND^{TM} indicando que
2E7 se unía únicamente al péptido que incluía los aminoácidos
1-12 (SEC ID Nº: 15) del péptido
\beta-amiloide con una constante de equilibrio
aparente KD de aproximadamente 50 pM. En las mismas condiciones, 2E7
no se unía al péptido que incluía los aminoácidos
2-13 del péptido
\beta-amiloide.
| Péptido A\beta2-13 | AEFRHDSGYEVHGSGK-biotina | (SEC ID Nº: 44) |
El procedimiento experimental y las condiciones
usadas permitieron la detección de moléculas de alta afinidad, pero
también de menor afinidad - en el mismo sistema experimental, a
diferencia de lo que ocurría con 2E7, se demostró que otro
anticuerpo que reconocía un epítope N-terminal del
péptido \beta-amiloide se unía al péptido
2-13 (SEC ID Nº: 44) con una KD aparente de 7 nM.
2E7 no se unía a una selección de péptidos de la serie (A)
procedentes de regiones intermedias del péptido
\beta-amiloide. En otro experimento, el péptido
\beta-amiloide 1-40 se capturó a
través de su resto de ácido aspártico N-terminal que
se había biotinilado. Este péptido se capturó en un chip recubierto
con estreptavidina Biacore^{TM} como se ha descrito previamente.
El anticuerpo 2E7 inyectado a una concentración 66 nM durante 1
minuto no pudo unirse a este péptido. Por lo tanto, se concluye que
el sitio de unión N-terminal descrito previamente se
enmascaraba por el engarzador y el procedimiento de captura,
confirmando adicionalmente que el extremo N contiene el sitio de
unión al núcleo.
\vskip1.000000\baselineskip
El \beta-amiloide está
compuesto por péptidos formados por la escisión proteolítica de una
proteína precursora transmembrana de tipo I denominada proteína
precursora de amiloide (APP). Como APP tiene un dominio extracelular
grande, la unión a esta proteína podría iniciar una reacción de
citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC).
Para caracterizar la unión de un anticuerpo a la
APP de longitud completa de la superficie celular, se utilizó un
ensayo FMAT^{TM} basado en ABI8200.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mantienen células HEK293T en medio DMEM F12
que contiene FCS al 10% (v/v) y 1x Glutamax. Las células se
siembran en matraces de cultivo de tejidos de 75 cm^{2} y se dejan
crecer hasta una confluencia de 60-80%
(18-24 h) antes de la transfección. Para la
transfección, se mezclan 9 \mug de ADN (ADN de APP de tipo
silvestre (en el vector PCDNA3.1 (Invitrogen)), o vector sólo en
los controles) con 0,3 ml de medio Opti-MEM^{TM}.
Se mezclan 30 \mul de agente de transfección Lipofectamine^{TM}
con 0,3 ml de medio Opti-MEM^{TM} y se reúnen las
dos mezclas. Las mezclas reunidas se incuban a temperatura ambiente
durante 30 minutos antes de la adición de 4,8 ml más de medio
Opti-MEM^{TM}. La mezcla final se añade a las
células después de lavar con medio Opti-MEM^{TM})
durante 5 h y después se añaden 6 ml de suero de ternero recién
nacido al 10% (v/v) en DMEM. 48 horas después de la transfección,
se retira el sobrenadante, la monocapa se lava en Versene y después
se añaden 3 ml de agente quelante Versene^{TM} a cada matraz, se
incuban durante 5 minutos a 37ºC, y las células separadas se
centrifugan a 200 g durante 5 minutos. El sedimento celular
resultante se resuspende suavemente en 1 ml de tampón de ensayo
(suero tratado con calor al 2%, BSA al 0,5%, NaN al 0,1% en PBS pH
7,4, filtrado a través de un filtro de 0,2 \mum) para crear una
suspensión de una sola célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron anticuerpos de ensayo (2E7, IgG de
ratón LN27 (Zymed) contra el dominio extracelular de APP como
control positivo, y un anticuerpo G210 que reconoce la forma
x-40 del péptido \beta-amiloide
como control negativo) a 10 \mug/ml en tampón de ensayo filtrado
de forma estéril (suero tratado con calor al 2%, BSA al 0,5%, NaN
al 0,1% en PBS pH 7,2) en una placa de polipropileno, y después se
realizaron seis diluciones adicionales seriadas 1:1 en la placa.
Como blanco se usó únicamente tampón de ensayo. A cada pocillo de
una placa de 96 pocillos se le añadieron 50 \mul de una
suspensión de células HEK293T transfectadas con ADN de APP de tipo
silvestre (Experimento 1: 10.000 células; Experimento 2: 20.000
células), y se añadieron 5 \mul de cada una de las soluciones de
anticuerpo a pocillos para obtener un duplicado. Después se
añadieron a cada pocillo 50 \mul/pocillo de solución madre de IgG
anti-ratón F-MAT^{TM} azul, (el
anticuerpo se marca usando el colorante reactivo monofuncional azul
F-MAT^{TM} de ABI, 4328408), diluido 1:500
(Experimento 1) y 1:1000 (Experimento 2) en tampón de ensayo, y la
placa se agitó brevemente y se dejó sedimentar durante 1 hora. La
placa después se leyó usando el sistema de detección celular
confocal macro de fluorescencia ABI 8200 (Applied Biosystems).
Los datos de recuentos obtenidos después se
interpretaron usando el software de la hoja de cálculo Excel^{TM}.
En resumen, los recuentos de las células transfectadas de forma
simulada se restaron de los recuentos de células transfectadas con
APP de longitud completa para obtener una señal específica para cada
anticuerpo. Se eligieron dos concentraciones de anticuerpo que
estaban en la parte lineal de la curva (1,25 y 0,63 \mug/ml), los
recuentos obtenidos corregidos con respecto al efecto de fondo a
esas concentraciones se expresaron como el porcentaje de unión al
anticuerpo LN27, y se calculó la media de los datos obtenidos a las
dos concentraciones de anticuerpo. Los datos resultantes se
describen en la Tabla 3 (% de unión a LN27 \pmSE)
De esta manera, dentro de este sistema de
ensayo, la unión de 2E7 a APP de la superficie celular no se puede
distinguir de la del anticuerpo de control negativo G210.
Los estudios de mapeo de epítopes descritos
anteriormente han demostrado que el anticuerpo 2E7 se une al extremo
N del péptido \beta-amiloide, siendo esencial el
resto de ácido aspártico en la posición 1 para la unión. Esto
sugiere que el anticuerpo reconoce un epítope "neo" formado por
la escisión de APP en el sitio de la
\beta-secretasa. Esta observación sugeriría que el
anticuerpo 2E7 no debe reconocer la secuencia del péptido APP
adyacente. Para ensayar esta hipótesis, se sintetizó un péptido APP
(Péptido APP1, SEC ID Nº: 16) que incluía los restos
1-7 del péptido \beta-amiloide y
los cinco aminoácidos derivados de APP adyacentes. De esta manera,
el péptido APP1 contenía aminoácidos contiguos desde la posición 5
N-terminal en el sitio de escisión
BACE-1 a la posición 7 C-terminal en
el sitio de escisión BACE-1 y estaba acetilado
N-terminalmente. La capacidad del anticuerpo 2E7
para unirse al péptido derivado de APP APP1 y el péptido
\beta-amiloide 1-12 (péptido
A\beta1) se comparó usando la metodología Biacore^{TM} (como se
ha descrito previamente para el mapeo de epítopes). El anticuerpo
2E7 mostró una alta afinidad de unión al péptido
\beta-amiloide A\beta-1, que
contiene el epítope básico 1-7. Sin embargo, no se
observó ninguna unión al péptido APP1 que también contiene la
secuencia 1-7 derivada del
\beta-amiloide básico.
| Péptido A\beta1 | DAEFRHDSGYEVGSGK-biotina | SEC ID Nº: 15 |
| APP1 | AcNH-SEVKMDAEFRHDGSGK-biotina | SEC ID Nº: 16 |
Se ha utilizado una combinación de unión celular
basada en FMAT^{TM} y mapeo de péptidos basado en Biacore^{TM}
para demostrar que, en estos formatos, 2E7 no tiene afinidad de
unión por la proteína APP de longitud completa. Dado que el resto
de ácido aspártico en la posición 1 del péptido
\beta-amiloide es necesario para la unión, se
concluye que 2E7 sólo reconoce el extremo N "neo" del péptido
\beta-amiloide y, por lo tanto, no debe unirse a
la APP expresada en la superficie celular.
Varios estudios publicados han demostrado que
los anticuerpos contra \beta-amiloide pueden
formar complejos con el péptido \beta-amiloide en
la corriente sanguínea. Se indica que esta formación de complejos de
\beta-amiloide periférico facilita además la
salida de amiloide del SNC a la corriente sanguínea (DeMattos RB,
PNAS (2001), 98(15); 8850-8855). Se creó un
modelo farmacodinámico agudo para seleccionar anticuerpos con
respecto a su capacidad de formar complejos con péptido
\beta-amiloide derivado de cerebro en la corriente
sanguínea.
Se indujo anestesia (isoflurano al 4%) en
ratones C57/BL6J macho y se mantuvieron (isoflurano al 1,5%) en
oxígeno al 100%. Después, los animales se pusieron en un marco
estereotáxico. Después de una incisión en la línea media a lo largo
de la sutura sagital, se perforó un orificio a través del cráneo y
se insertó una cánula guía en el ventrículo cerebral lateral
(coordenadas anterioposterior (AP) -0,5 mm, lateral (L) +0,7 mm,
ventral (V) -2,5 mm). Se perforaron dos orificios más a través del
cráneo en los que se pusieron tornillos corticales. La cánula se
ancló en su sitio por medio de gel de cianoacrilato y la incisión se
suturó alrededor de la tapa de gel de cianoacrilato. Después de la
operación, los ratones recibieron 0,3 ml de solución salina por vía
subcutánea y se pusieron en un medio caliente para que se
recuperaran de la anestesia. Tras la recuperación del reflejo de
enderezamiento, los ratones se encerraron individualmente y
recibieron cuidados convencionales durante los 5 días siguientes a
la operación. No se permitieron procedimientos durante los 5 días
posteriores o hasta que se recuperó el peso previo a la operación.
Después de la recuperación, se verificó la colocación de la cánula
por la respuesta de ingestión de líquido a la angiotensina II. Cada
ratón recibió una administración intracerebroventricular (ICV) (5
\mul) de 100 ng de angiotensina II (AII) (reconstituida en
solución salina al 0,9%). Después de la administración de AII, se
observó la ingesta de agua durante 15 minutos. En los estudios se
incluyeron ratones con una respuesta dipsogénica positiva a la AII
(ingestión de líquido sostenida), que comenzó no antes de cinco días
desde la inyección de AII.
En el día del estudio, los ratones se pusieron
durante 5-10 minutos en un medio caliente para
inducir la vasodilatación, necesaria para facilitar la inyección en
la vena de la cola. Se inyectó anticuerpo de ensayo (600 \mug) o
vehículo de PBS (con un volumen de dosificación no superior a 10 ml
por kg de peso corporal) a través de la vena de la cola y los
ratones se devolvieron a sus jaulas individuales después de la
inyección. Exactamente una hora después de la inyección en la vena
de la cola, en los ratones se inyectó ICV lentamente (2 \mul por
minuto) con 2 ng (1 \muCi) de I^{125}
beta-amiloide 1-40 (Amersham
Biosciences, UK) en un volumen de dosificación de 5 \mul.
Exactamente cuatro horas después de la dosis ICV, se recogieron 50
\mul de sangre del tronco y se midió el nivel de radiactividad en
un contador de escintilación.
Los ratones que habían recibido inyecciones de
2E7 en la vena de la cola (n = 6 por grupo de tratamiento)
mostraron un aumento estadísticamente significativo en la señal
radiactiva (cuenta por minuto - CPM) en 50 \mul de sangre del
tronco en comparación con la señal de CPM detectada en los ratones
inyectados con vehículo (CPM - vehículo: 1339,7 \pm 496,2 frente
a 2E7 4387,9 \pm 980,3; ANOVA:F(2,13) = 4,97, p<0,05.
Post-hoc LSD: p = 0,01 2E7 frente a vehículo
[post-hoc Duncans: p = 0,02 2E7 frente a
vehículo]).
En dos estudios adicionales con 2E7 realizados
con un protocolo idéntico, se observaron aumentos similares en la
salida de amiloide al interior de la sangre en comparación con los
controles que habían recibido inyecciones de vehículo (CPM sangre:
Vehículo 352 +/- 113 frente a 2E7 2397 +/- 353, y Vehículo 1281 +/-
312 frente a 2E7 5291 +/- 885; ANOVA con ensayo
post-hoc LSD p<0,001 frente a
vehículo).
\vskip1.000000\baselineskip
Se encerraron individualmente ratones
transgénicos TASTPM macho y hembra (APPswe x PS1.M146V
doble-mutantes, Howlett DR (2004) Brain Research
1017 (1-2) 130-136) con edades
comprendidas entre 61 y 65 días al inicio del estudio. Se asignaron
números iguales de ratones a cada grupo de tratamiento (N = 12 por
grupo) y se distribuyeron aleatoriamente de acuerdo con el sexo y
la edad. Los grupos de tratamiento comprendían lo siguiente: A:
MOPC21 (anticuerpo con especificidad desconocida, Holton y col
(1987) J. Immunol 139(9) 3041-3049, control
negativo), B: 2E7 (anticuerpo de ensayo). Todos los anticuerpos se
disolvieron en PBS y se administraron por vía intraperitoneal.
Independientemente del peso del animal, se administraron 300 \mug
de anticuerpo. Los animales recibieron la dosificación dos veces
por semana durante cuatro semanas. Un día después de la dosificación
final, los animales se sacrificaron por una sobredosis con
pentobarbital sódico. Los cerebros se diseccionaron y se
hemiseccionaron. Se recogieron muestras de cerebro hemiseccionado
en tubos eppendorf^{TM} de 2 ml pesados previamente y se
congelaron inmediatamente. Posteriormente, las muestras se
descongelaron, se volvieron a pesar y se añadió 1 ml de guanidina
HCl 5 M que contenía comprimidos de Complete protease
inhibitor^{TM} (Boehringer Mannheim), antes de homogeneizar las
muestras y de incubarlas a 4ºC durante un periodo >90 min con
agitación constante.
Después, las muestras se diluyeron 1 a 10 en
tampón de ensayo (Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM,
Tween-20 al 0,05% + BSA al 1%), se sometieron a
agitación vorticial y se centrifugaron a 20.000 G durante 20 min a
4ºC. El sobrenadante se retiró y se añadió como muestras por
triplicado a la placa de ensayo.
Los niveles de A\beta40 y A\beta42 se
midieron usando el inmunoensayo electroquimioluminiscente basado en
placas sensibles (BioVeris^{TM}) empleando anticuerpos contra
\beta-amiloide específicos del extremo C (contra
A\beta40 o A\beta42) marcados con el marcador específico
Oritag^{TM} para facilitar la detección (BioVeris^{TM}) usados
para capturar A\beta40 o A\beta42, junto con un anticuerpo
contra A\beta específico por el extremo N biotinilado. Se
capturaron complejos de anticuerpo-A\beta con
perlas revestidas con estreptavidina que se unen a los anticuerpos
biotinilados (Dynabeads^{TM}, Dynal) incubadas durante una noche a
temperatura ambiente con mezcla vigorosa y se ensayaron en un
fotodetector BioVeris^{TM} M8. Se construyeron curvas patrón
usando péptidos A\beta40 y A\beta42 humanos en tampón de ensayo
que contenía la concentración requerida de Guanidina HCl. Los datos
se analizaron usando un software de análisis estadístico Excel
Robosage^{TM} y los niveles de A\beta se expresaron como pmol/g
de tejido.
En este paradigma, el tratamiento con anticuerpo
2E7 redujo la carga de A\beta42 del SNC en el 37% (p<0,001) y
la carga de A\beta40 del SNC en el 23% (p<0,001).
En los estudios posteriores en condiciones
experimentales similares, el anticuerpo 2E7 redujo la carga de
A\beta42 del SNC en el 38% (Estudio 1, sólo machos), el 22%
(Estudio 2, no significativo) y el 39% (Estudio 3, machos, p =
0,001) y el 13% (Estudio 3, hembras, no significativo) en
comparación con los animales tratados con PBS. En estos estudios,
2E7 también redujo la carga de A\beta40 del SNC en el 18% (Estudio
3, machos, p = 0,017) y ofreció una reducción no significativa en
A\beta40 del SNC en el 25% (Estudio 1, sólo machos), <1%
(Estudio 2) y un aumento no significativo del 3% (Estudio 3,
hembras) en comparación con los animales tratados con PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
En resumen, a ratones transgénicos TASTPM de 4
meses de edad se les administraron 300 \mug de anticuerpo una o
dos veces por semana a través de la vía intraperitoneal (i.p.).
Después de 4 meses de dosificación, se midieron los niveles de
\beta-amiloide del SNC por ELISA y se midió la
carga de placas por inmunohistoquímica. Entre las edades de 4 y 8
meses, la carga de \beta-amiloide del SNC aumenta
exponencialmente y por consiguiente, se desarrolla rápidamente la
patología de las placas (Howlett DR (2004) Brain Research 1017
(1-2) 130-136).
Se encerraron individualmente ratones con edades
comprendidas entre 120 y 128 días al inicio del estudio. Se
asignaron números similares de ratones a cada grupo de tratamiento
(N=20 ó 21 por grupo) y se distribuyeron aleatoriamente de acuerdo
con el sexo y la edad. Los grupos de tratamiento comprendían lo
siguiente: A: PBS (vehículo) administrado dos veces por semana, B:
2E7 administrado una vez por semana, C: 2E7 administrado dos veces
por semana, D: PBS administrado una vez por semana. Se administró
una dosis de 300 microgramos (un volumen de 79 microlitros) de 2E7
por vía intraperitoneal. Los animales tratados con vehículo
recibieron el mismo volumen de PBS. Se administró la dosificación a
los animales durante dieciocho semanas. Los ratones TASTPM pueden
sufrir ataques espontáneos y como resultado varios animales murieron
durante el transcurso del estudio. Los números finales fueron los
siguientes A: 4 hembras, 9 machos; B: 5 hembras, 8 machos; C: 4
hembras, 9 machos; D: 2 hembras, 9 machos. Dos o cuatro días
después de la dosificación final (números iguales por grupo) los
animales se sacrificaron por sobredosis con pentobarbital sódico. Se
tomó una muestra de la punta de la cola de cada ratón para
confirmar el genotipo. Los cerebros se diseccionaron y
hemiseccionaron. El hemisferio derecho se fijó por inmersión en
paraformaldehído al 4% y se procesó para un análisis histológico. El
hemisferio izquierdo se recogió en tubos eppendorf^{TM} de 2 ml
pesados previamente, se congeló en hielo seco y se almacenó a -80ºC
para un análisis posterior del contenido de amiloide. Antes del
análisis, se descongelaron muestras, se volvieron a pesar y se
añadió 1 ml de guanidina HCl 5 M que contenía comprimidos de
Complete protease inhibitor^{TM} (Boehringer Mannheim), antes de
homogeneizar las muestras y de incubarlas a 4ºC durante un periodo
>90 min con agitación constante.
Después, las muestras se diluyeron 1 a 10 en
tampón de ensayo (Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM,
Tween-20 al 0,05% + BSA al 1%), se sometieron a
agitación vorticial y se centrifugaron a 20.000 G durante 20 min a
4ºC. Los sobrenadantes se diluyeron adicionalmente 1:1000 y se
añadieron como muestras por triplicado a la placa de
ensayo.
ensayo.
Los niveles de A\beta40 y A\beta42 se
midieron de la misma manera que en el estudio de dosificación de 4
semanas.
Se usó un análisis de varianza utilizando como
efectos fijados el tratamiento, el sexo y el programa de
dosificación incluido en el modelo. También se incluyeron todas las
interacciones entre los tres factores. No hubo diferencias
significativas entre los dos programas de dosificación (una o dos
veces por semana). Con este diseño experimental, en primer lugar
pudo evaluarse si había alguna diferencia significativa entre los
programas de dosificación y, en segundo lugar, como no había
ninguna de estas diferencias significativas, los datos de los dos
programas de dosificación pudieron combinarse, aumentando de esta
manera la potencia del experimento al duplicar el número de ratones
en el análisis.
En este paradigma, el tratamiento con anticuerpo
2E7 redujo la carga de A\beta42 del SNC en el 22,5% (p = 0,0152).
Los niveles de A\beta40 del SNC también se redujeron en el 12,1%,
pero esta cifra no alcanzó significado estadístico (p = 0,118).
Se realizó un análisis inmunohistoquímico
complejo de estas muestras para definir el área de tejido cerebral
que mostraba patología de placas. Se tomaron secciones de la corteza
al nivel del núcleo caudado y de la corteza al nivel del hipocampo.
Se tiñeron las secciones adyacentes con un anticuerpo específico
para A\beta40 o A\beta42 o, como alternativa, con el tinte de
amiloide Rojo Congo. Usando un software de análisis de imágenes, el
área de la sección teñida para las placas se expresó como un
porcentaje del área de la sección total.
Después de la fijación, se cortaron en corona
mitades de los cerebros sumergidas en PFA en una matriz cerebral en
secciones de 6 x 2 mm de espesor. Estas secciones de 2 mm se
denominarán secciones A a F, siendo A la más rostral y F la más
caudal. Las secciones A, B y C y D, E y F se pusieron en cassettes
de inclusión separados numerados para cada animal. Los cassettes se
mantuvieron en PFA hasta que estuvieron listos para el procesamiento
y la inclusión.
La inclusión se realizó en un procesador de
tejidos Citadel^{TM} 1000 (Shandon). Todos los tejidos recibieron
el siguiente régimen de procesamiento:
IMS al 70% - 1 h
IMS al 100% - 3 x 1 h
etanol al 100% - 2 h
alcohol isobutílico al 100%; 1 x 2 h; 1 x 1,5
h
Histoclear^{TM} - 2 x 1,5 h
Cera de parafina - 2 x 2 h
\vskip1.000000\baselineskip
Después de finalizar el ciclo de procesamiento,
las secciones de tejido incluidas en cera se transfirieron a moldes
de base rellenos de cera de parafina fundida y se incluyeron
utilizando un sistema de inclusión de parafina Histocentre^{TM}
(Shandon). El tejido se incluyó de tal forma que las secciones A, B
y C entraron en un molde; y las secciones D, E y F en un segundo
molde. Esto se hizo para todas las series de secciones, es decir,
cada cerebro hemiseccionado dio como resultado dos bloques de cera
de tres secciones cada uno. Las secciones se pusieron en los moldes
de tal forma que la superficie caudal de cada pieza se convirtiera
en la superficie de corte futura. Se tuvo cuidado de asegurarse de
que cada sección estaba bien apretada en el molde de forma que cada
corte de microtomo se realizara en paralelo. Después, el cassette de
procesamiento perforado se puso cuidadosamente en cada molde, que
posteriormente se llenó con cera fundida. Los bloques incluidos
después se enfriaron en la placa refrigerada hasta que pudieron
extraerse de los moldes. Los bloques se almacenaron a temperatura
ambiente hasta que se requirieron para realizar los cortes con el
microtomo. Los bloques se cortaron aleatoriamente y se pusieron
secciones de 5 micrómetros sobre portaobjetos recubiertos con
gelatina marcados previamente (Superfrost^{TM}, Erie Scientific
Company). Se aplicaron dos secciones en cada portaobjetos. Siempre
que fue posible, se montaron secciones consecutivas y los
portaobjetos se numeraron consecutivamente del 1 al 25. Se tomaron
cincuenta secciones (25 portaobjetos) de cada bloque. Los
portaobjetos se secaron en una placa caliente y después se
almacenaron a temperatura ambiente hasta que se utilizaron.
El análisis inmunohistoquímico se realizó en
series de 30 portaobjetos. En cada portaobjetos, la sección superior
se marcó con un anticuerpo A\beta40 (G30, policlonal de conejo
que reconoce x-40 \beta-amiloide),
la sección inferior con el anticuerpo A\beta42, 20G10, anticuerpo
monoclonal que reconoce x-42
\beta-amiloide. Se marcó un mínimo de 5 secciones
por anticuerpo y por bloque.
El marcaje se realizó como se indica a
continuación. Después de retirar la cera por medio de Histoclear y
alcoholes graduados, las secciones se sumergieron en ácido fórmico
al 85% durante 8 minutos y después se bloquearon en peróxido de
hidrógeno al 0,3% durante 30 minutos para bloquear las peroxidasas
endógenas. Se aplicaron anticuerpos G30 y 20G10 durante una noche a
diluciones 1:1000, dejándose las secciones a 4ºC. El revelado de
las secciones se realizó con los anticuerpos secundarios
anti-conejo y anti-ratón
biotinilados respectivos. El desarrollo de color se realizó con un
kit de tinción de tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB^{TM},
Vector Labs). Las secciones se tiñeron brevemente con un tinte de
contraste de hematoxilina de Mayer antes de hidratarse, aclararse y
taparse con un cubreobjetos.
Las secciones se dejaron secar durante al menos
48 horas antes de observarse al microscopio. Las imágenes se
capturaron en un microscopio Leica DMRB^{TM} equipado con una
cámara digital. Las imágenes se analizaron usando el software
Qwin^{TM} (Leica) y los resultados se presentaron como porcentaje
del área de sección que estaba marcada por el anticuerpo contra
A\beta.
Se usó un análisis de varianza con tratamiento,
sexo y programa de dosificación incluido en el modelo como efectos
fijados. También se incluyeron todas las interacciones entre los
tres factores. No hubo diferencias significativas entre los dos
programas de dosificación (una o dos veces por semana). Con este
diseño experimental, en primer lugar se pudo evaluar si había
alguna diferencia significativa entre los programas de dosificación
y, en segundo lugar, como no había ninguna diferencia significativa,
los datos de los dos programas de dosificación pudieron combinarse,
aumentando de esta manera la potencia del experimento al duplicar el
número de ratones en el análisis.
En este paradigma, el tratamiento con anticuerpo
2E7 redujo la patología de las placas como se mide con un
anticuerpo que reconoce A\beta42. La patología de las placas se
redujo en el 27,1% (p = 0,0026) en la corteza al nivel del
hipocampo y el 43% (p <0,0001) en la corteza al nivel del núcleo
caudado. La patología de placas también se redujo cuando se midió
con un anticuerpo que reconocía a A\beta40. La patología de placas
se redujo en el 16,6% (p = 0,0421) en la corteza al nivel del
hipocampo y el 17,3% (p = 0,0342) en la corteza al nivel del
caudado.
No se observó ningún indicio de microhemorragia
(determinada por Azul de Perls Prussian) en ningún ratón en este
estudio tratado con vehículo o 2E7. Este procedimiento visualiza el
hierro férrico (el hierro es un constituyente esencial de la
hemoglobina que lleva el oxígeno presente en los glóbulos rojos)
produciendo un compuesto azul insoluble. Todos los niveles de
cerebro de todos los animales eran transparentes.
Después de la dosificación durante 4 meses de
ratones TASTPM de 4 meses de edad como se ha descrito anteriormente,
estos ratones se sometieron a un ensayo en dos modelos de cognición:
el ensayo de reconocimiento de objetos y el ensayo de
acondicionamiento al miedo.
El ensayo de reconocimiento de objetos aprovecha
la tendencia natural de los animales a explorar nuevos objetos y se
basa en la capacidad de los animales de reconocer un objeto que han
explorado previamente (objeto conocido). Se ha notificado que los
ratones TASTPM de ocho meses de edad muestran una deficiencia en la
capacidad de distinguir entre objetos nuevos y conocidos (Howlett y
col., 2004), lo que indica un rendimiento cognitivo alterado en
estos animales. Sin embargo, en este estudio, los ratones TASTPM de
8 meses de edad tratados con vehículo no mostraron un deterioro
cognitivo, es decir, pudieron distinguir entre objetos nuevos y
conocidos. Por lo tanto, no hubo posibilidad de investigar ningún
efecto terapéutico potencial resultante del tratamiento con 2E7.
El modelo de acondicionamiento al miedo se
diseñó para ensayar la capacidad de los animales de correlacionar
un estímulo doloroso previo con una señal contextual o de entrada y
reconocerla cuando se presenta con el mismo contexto o señal
después de un retraso de x horas. En este estudio, los ratones
TASTPM de 8 meses de edad tratados con vehículo (una o dos veces
por semana) mostraron una deficiencia en la diferenciación
contextual indicativa de un deterioro cognitivo en estos animales.
Esta deficiencia no se vio afectada por el tratamiento con 2E7
cuando se administró una o dos veces por semana.
Este estudio implicó la administración de 2E7
(300 \mug i.p. dos veces por semana) a ratones TASTPM durante 4
meses, empezando a los 3 meses de edad. Los animales de control
recibieron IgG2A en PBS. Como se ha descrito anteriormente, los
cerebros se diseccionaron y hemiseccionaron. El hemisferio derecho
se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4% y se procesó para
la histología. El hemisferio izquierdo se recogió en tubos
eppendorf^{TM} de 2 ml pesados previamente, se congeló en hielo
seco y se almacenó a -80ºC para el análisis posterior del contenido
de amiloide.
Se realizó un análisis preliminar de una sola
sección de cada muestra de una selección aleatoria de muestras de
cerebro (n = 6 vehículo, n = 7 grupo tratado con 2E7) por IHC usando
el mismo protocolo general que se ha indicado anteriormente. El
análisis estadístico (ensayo t de Student) demuestra que hubo una
reducción significativa en la carga de placas de A\beta42 en el
tálamo (71,9%, p = 0,007) y en el tálamo + corteza + hipocampo
(54,1%, p = 0,022) en ratones que recibieron 2E7 pero sin cambios
significativos en A\beta40.
Para la medición bioquímica de A\beta40 y
A\beta42 en cerebro, las muestras se procesaron y se midieron
como se ha indicado anteriormente (factor de dilución 1:10.000).
A\beta42 se redujo significativamente (p = 0,01) en el 29,9% en
los ratones que recibieron la dosificación de 2E7 (n = 12 control, n
= 16 tratados). Las concentraciones de A\beta40 también se
redujeron (22,6%), pero esta reducción no pudo alcanzar un
significado estadístico (p = 0,052).
Se extrajo el ARN total a partir de células de
hibridoma 2E7 y después se generaron secuencias de ADNc del dominio
variable de las cadenas pesada y ligera por transcripción inversa y
reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). El
cebador directo para la RT-PCR fue una mezcla de
cebadores degenerados específicos para secuencias líder del gen de
inmunoglobulina murina y el cebador inverso fue específico para las
regiones constantes del anticuerpo, en este caso IgG2a de isotipo
murino para la cadena pesada y kappa murina para la cadena ligera.
Los cebadores se diseñaron de acuerdo con la estrategia descrita por
Jones y Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991). La
RT-PCR se realizó por duplicado para las dos
secuencias de la región V para permitir la verificación posterior
de las secuencias de la región V correctas. Los productos de la
región V generados por RT-PCR se clonaron
(Invitrogen TA Cloning Kit) y se obtuvieron los datos de
secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de Aminoácidos de V_{H}
de 2E7 (SEC ID Nº:
17)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de ADN de V_{H} de 2E7
(SEC ID Nº:
18)
\newpage
Secuencia de Aminoácidos de V_{L}
de 2E7 (SEC ID Nº:
19)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de ADN de V_{L} de 2E7
((SEC ID Nº:
20)
En las secuencias de aminoácidos están
subrayadas las Regiones Determinantes de Complementariedad
(CDR).
\vskip1.000000\baselineskip
Se generó un anticuerpo 2E7 quimérico (2E7c) que
contenía las regiones V murinas parentales injertadas en la IgG1
humana (Fc mutado (L235A, G237A)) para la cadena pesada o regiones C
kappa humanas para la cadena ligera para expresar material de
anticuerpo recombinante que pudiera usarse para confirmar la
clonación correcta de regiones V murinas funcionales. Se clonó ADN
que codificaba regiones V de cadena ligera y de cadena pesada
murinas de 2E7 y secuencias señal murinas endógenas en fase en los
vectores de expresión de mamífero RLD-bshe (para la
cadena pesada) y RLN-bshe (para la cadena ligera)
que ya contenían regiones constantes humanas (Fc de IgG1 mutado
(L235A, G237A) o C kappa humana, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Elementos del vector de expresión
RLD-bshe para la expresión de la cadena pesada:
(la posición de los elementos y el tamaño total
del vector indicado anteriormente sólo tienen fines ilustrativos y
dependerán del tamaño del inserto de la cadena de anticuerpo)
\newpage
Elementos del vector de expresión
RLN-bshe para la expresión de la cadena ligera:
(la posición de los elementos y el tamaño total
del vector indicado anteriormente sólo tienen fines ilustrativos y
dependerán del tamaño del inserto de la cadena de anticuerpo)
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificaron clones con las secuencias
V_{H} y V_{L} clonadas correctamente y se prepararon plásmidos
para la expresión en células CHO de cultivo en suspensión. El
anticuerpo 2E7c expresado se purificó a partir del sobrenadante de
cultivo celular por cromatografía de proteína A en un sistema FPLC,
y después se ensayó la unión a A\beta por ELISA y SPR usando la
tecnología Biacore^{TM}. Los resultados indicaron que se habían
clonado y expresado las regiones V de ratón de 2E7 correctas, dando
como resultado un anticuerpo funcional con características similares
a las del anticuerpo 2E7 murino parental.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionó una secuencia aceptora humana con
el Genpept ID CAA51135 (SEC ID Nº: 24) y el Nº de acceso del Genbank
X72467, que tenía una identidad del 77% a nivel de los aminoácidos
(incluyendo las CDR) como región flanqueante aceptora. La
construcción L1 es un injerto de las CDR murinas del dominio VL de
2E7 en esta región flanqueante aceptora.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionó la secuencia humana con el Nº de
acceso del Genbank M99675 (SEC ID Nº: 21), un alelo del gen
VH3-48 con una identidad del 74% a nivel de
aminoácidos (incluyendo las CDR 1 y 2) con la región pesada variable
de ratón de 2E7 como región flanqueante aceptora de cadena pesada
humana junto con el minigen JH4 humano. Se diseñaron tres variantes
de cadena pesada variable humanizada basándose en la secuencia de
M99675 y JH4. H1 es un injerto de las CDR murinas usando la
definición de Kabat con dos retromutaciones adicionales en la región
flanqueante en las posiciones 93 y 94. H2 y H3 procedían de H1, pero
incorporaron una mutación de región flanqueante adicional que era
diferente en cada construcción; (posiciones 24 y 48 respectivamente;
véase la Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron regiones V humanizadas de
novo por acumulación de oligos solapantes y amplificación por
PCR. Se incluyeron sitios de restricción para clonación en vectores
de expresión de mamífero RLD-bshe y
RLN-bshe y secuencias señal de inmunoglobulina
humana derivadas de las regiones flanqueantes aceptoras humana
elegidas. Después, se clonaron los ADN que codificaban las regiones
V humanizadas (H1 (SEC ID Nº: 27), H2 (SEC ID Nº: 29), H3 (SEC ID
Nº: 31), L1 (SEC ID Nº: 33)) junto con secuencias señal y sitios de
restricción en fase en vectores de expresión de mamífero: H1, H2 y
H3 en RLD-bshe para generar ADN que codificaba tres
cadenas pesadas mutadas de Fc de IgG1 humana de longitud completa
conteniendo cada una mutaciones L235A y G237A, H1 de longitud
completa (SEC ID Nº: 35), H2 de longitud completa (SEC ID Nº: 37) y
H3 de longitud completa (SEC ID Nº: 39); L1 se clonó en fase en
RLN-bshe que contenía el ADN que codificaba la
región constante kappa humana para generar ADN que codificaba una
cadena ligera kappa humana de longitud completa (SEC ID Nº: 41).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron de forma transitoria células
CHOK1 a pequeña escala con todas las combinaciones de construcciones
de ADN de cadena ligera y pesada humanizada: L1+H1, L1+H2, L1+H3
(SEC ID Nº: 35 + 41, 37 + 41, 39 + 41) en placas de 6 pocillos. Se
cultivaron hasta la confluencia células CHOK1 sometidas a pases en
DMEM F12, con 5% de suero bovino fetal con un contenido de IgG
ultra-bajo y glutamina 2 mM en placas de 6 pocillos.
Las células confluentes se transfectaron con un total de 7,5 \mug
de DNA: 30 \mug de lípido Transfast (Promega) en medio Optimem
Glutamax (Invitrogen). Las células transfectadas se incubaron a 37ºC
con 5% de CO_{2}. A las 72 horas, se recogieron los sobrenadantes
y se ensayó la concentración de anticuerpo y después se ensayó la
unión a A\beta humano por ELISA. La región L1 humanizada combinada
con las tres cadenas pesadas humanizadas expresaron el anticuerpo
completo que se unía a A\beta humano.
También se expresaron anticuerpos humanizados en
transfecciones de células CHOK1 transitorias a gran escala usando
la administración liposomal de ADN (por ejemplo, TransFast
(Promega)) y expresión en frascos de cultivo. Para la optimización
de los niveles de expresión en transfecciones transitorias, se usó
una relación de ADN de vector de expresión entre cadena pesada y
cadena ligera de 1:6. El material de la transfección transitoria se
purificó usando columnas ProSepA o FPLC con columnas ProSepA
HiTrap.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron variantes humanizadas H1L1, H2L1 y
H3L1 de 2E7 con respecto a la unión al péptido A\beta humano
(1-40) biotinilado en el extremo C. El 2E7 quimérico
se usó como referencia. Las Tablas 5-7 muestran los
resultados con diversos lotes de material purificado a partir de las
transfecciones transitorias a gran escala.
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Estos resultados indicaron perfiles de unión a
A\beta muy similares para cada una de las variantes humanizadas
derivadas de 2E7. La comparación de los valores de CE50 con el 2E7c
mostró una pequeña pérdida de actividad de unión a A\beta que se
había producido a lo largo del proceso de humanización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron anticuerpos quiméricos y
humanizados de 2E7c H1L1, H2L1 y H3L1 con respecto a su capacidad de
inhibir la unión entre el péptido A\beta humano y el MAb 2E7 de
ratón parental en un ELISA competitivo.
Se establecieron dos tipos de ELISA competitivo
para comparar la actividad de unión a A\beta de las tres variantes
humanizadas en comparación con el anticuerpo quimérico 2E7.
1) \beta-amiloide inmovilizado; Se
inmovilizó péptido A\beta (1-40) humano
biotinilado a través de estreptavidina en placas ELISA. Se añadió
anticuerpo 2E7 de ratón a una concentración constante junto con una
serie de dilución de anticuerpos variantes humanizados derivados de
2E7. Después se detectó el MAb 2E7 de ratón unido con conjugado de
IgG anti-ratón. La Tabla 8 muestra los resultados de
los dos ensayos.
2) \beta-amiloide en solución; se
preincubó una concentración constante de
\beta-amiloide con una serie de dilución de
variantes de anticuerpo 2E7 humanizado - se añadió la mezcla que
incluía amiloide complejado y libre durante un corto periodo de
tiempo a pocillos que contenían MAb 2E7 de ratón inmovilizado.
Después se detectó la cantidad de \beta-amiloide
libre que aún estaba disponible para la unión al MAb 2E7 parental
inmovilizado. La Tabla 9 muestra los resultados de los dos
ensayos.
Todas las variantes de anticuerpo humanizado
inhibían la unión del MAb 2E7 de ratón al
\beta-amiloide con un perfil muy similar. Los
valores de CI_{50} generados para las variantes H2L1 y H3L1 fueron
consistentemente próximos a los de la quimera 2E7c (cuando se usó),
que tenía la mayor actividad inhibidora en los dos ensayos. Sin
embargo, la variante H1L1 mostró una actividad inhibidora algo
reducida en los dos ensayos, indicando una posible afinidad
ligeramente menor para el \beta-amiloide.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron los parámetros cinéticos del MAb
2E7 de ratón recombinante, 2E7c quimérico y las variantes
humanizadas H1L1, H2L1 y H3L1 que se unen al péptido
beta-amiloide humano (1-40) y
(1-42) usando el análisis Biacore^{TM} en un
Biacore^{TM} 3000. Se usaron dos formatos de ensayo
diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
A
(i) En resumen, se capturaron <20 unidades de
resonancia del péptido beta-amiloide
1-40 (biotinilado en el extremo C) en un chip
biosensor de estreptavidina (como el usado para la Tabla 10A).
Los anticuerpos se diluyeron en tampón
HBS-EP y se pasaron sobre la superficie de
estreptavidina/beta-amiloide a concentraciones que
variaban de 0,001 nM-8 nM (para la Tabla 10A). Se
realizaron dos procesos separados; cada proceso se realizó en una
nueva superficie de estreptavidina/beta-amiloide.
Los procesos 1 y 2 fueron esencialmente iguales aunque hubo algunas
diferencias en los parámetros usados; el proceso 1 se realizó usando
una superficie de chip en la que se capturaron 16 Unidades de
resonancia de beta-amiloide, y se usaron
concentraciones de anticuerpo de 0,001 nM-8 nM, un
tiempo de asociación de 4 minutos y un tiempo de disociación de 20
minutos a un caudal de 50 \mul por minuto. Para el proceso 2, se
capturaron menos de 10 RU de beta-amiloide y se
usaron concentraciones de anticuerpo de 0,003125
nM-8 nM. El caudal y los tiempos de asociación
fueron iguales a los del proceso 1, sin embargo el tiempo de
disociación se redujo a 15 minutos.
(ii) Los beta-amiloides
(1-40) y (1-42) se acoplaron a amina
en diferentes superficies de un chip biosensor CM5 a un nivel de
<20 unidades de resonancia (como se usa para la Tabla 10B).
Los anticuerpos se diluyeron en tampón
HBS-EP y se pasaron sobre la superficie de
biosensor/beta-amiloide a concentraciones que
variaban de 1 nM-64 nM (como se usa para la Tabla
10B).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
B
En el segundo caso se invirtió el ensayo, ya que
primero se capturaron los anticuerpos a un nivel de
1000-2500 unidades de resonancia en una superficie
de anticuerpo policlonal de IgG anti-ratón (para el
MAb 2E7 de ratón recombinante) o una superficie con proteína A
(para H2L1 humanizado) de un chip biosensor CM5. El
beta-amiloide (1-40) o
(1-42) recién preparado se diluyó en tampón
HBS-EP y se pasó sobre la superficie con anticuerpo
capturado a concentraciones que variaban de 4-500 nM
(Tabla 10C y 10D).
En los dos procedimientos, la regeneración se
realizó por un pulso de H_{3}PO_{4} 100 mM y para la Tabla 10A
los datos también se siguieron por un pulso de NaOH 50 mM. Se
demostró que la superficie era estable y no se veía afectada por la
regeneración. Todos los procesos utilizaron dobles referencias
contra inyecciones blanco de tampón. El análisis se realizó usando
el software de análisis Biacore^{TM} BIAevaluation versión
4.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el procedimiento A(i) para
clasificar los anticuerpos por los datos cinéticos de unión al
beta-amiloide. Los datos obtenidos se muestran en
la Tabla 10A. Esto demuestra que el Mab 2E7 parental tiene una KD de
36,1 pM para el beta-amiloide capturado por
estreptavidina. El anticuerpo de ratón-humano
quimérico mostró una KD ligeramente reducida de 45,8 pM y las
construcciones humanizadas varían de 54 (H2L1) a 93,6 pM (H1L1). En
conclusión, esto demuestra que el procedimiento de humanización
había sido muy satisfactorio y se había perdido muy poca afinidad.
Las retromutaciones adicionales introducidas para H2 y H3 tenían un
efecto pequeño pero beneficioso, aunque las diferencias entre las
construcciones de H2 y H3 están dentro de las desviaciones típicas
para estos experimentos.
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El procedimiento A(ii) se usó para
confirmar que los dos restos aminoacídicos adicionales en el extremo
C del beta-amiloide (1-42) en
comparación con el beta-amiloide
(1-40) no alteraban significativamente las
propiedades de unión de 2E7 y H2L1. Los datos obtenidos se muestran
en la Tabla 10B y confirmaron esto.
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El procedimiento B se usó para negar los efectos
de avidez que podían verse en el primer formato de ensayo. Los
efectos de avidez, producidos por los dos dominios Fab de una sola
molécula de anticuerpo que se une al mismo tiempo a dos moléculas
de beta-amiloide adyacentes en la superficie del
biosensor (o en formas multiméricas de
beta-amiloide) aumentarían la afinidad aparente de
la unión. Las mediciones de afinidad obtenidas usando el
procedimiento B se muestran en la Tabla 10C.
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La prueba de que este ensayo proporcionó
afinidades de unión 1:1 verdaderas se obtuvo cuando fragmentos Fab
de H2L1, obtenidos por digestión con papaína, se unieron al
beta-amiloide (1-40) capturado con
estreptavidina por un procedimiento similar al procedimiento
A(i) con una KD estimada de 2,4 nM.
El procedimiento B también se usó para confirmar
que los dos restos aminoacídicos adicionales en el extremo C del
beta-amiloide (1-42) en comparación
con el beta-amiloide (1-40) no
alteraban significativamente las propiedades de unión de un clon de
secuencia idéntica al MAb 2E7 de ratón, denominado 2F11. Los datos
obtenidos se muestran en la Tabla 10D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En un estudio similar al estudio de mapeo de
epítopes en 2E7 usando el Ensayo de Resonancia de Plasmón
Superficial descrito anteriormente, H2L1 se comportó de forma
similar al 2E7 en la unión al péptido que incluía los aminoácidos
1-12 (A\beta1, SEC ID Nº: 15) del péptido
\beta-amiloide y no al péptido que incluía los
aminoácidos 2-13 del péptido
\beta-amiloide (A\beta2-13, SEC
ID Nº: 44).
\vskip1.000000\baselineskip
Para comparar funcionalmente el H2L1 humanizado
con el 2E7 monoclonal de ratón parental, los dos se ensayaron el
mismo día en el modelo de salida de I^{125}
\beta-amiloide descrito anteriormente.
Tanto H2L1 como 2E7 aumentaron
significativamente las cuentas por minuto (CPM) en sangre en
comparación con un control de vehículo. El recuento de CPM de
radiactividad en sangre fue el siguiente (Vehículo: 1940\pm166;
2E7 10065\pm1386; H2L1 10913\pm1535). Los parámetros
estadísticos usados fueron ANOVA con ensayo
post-hoc LSD. n = 7 vehículo, n = 6 2E7, n =
6 H2L1, (p <0,001 para cada compuesto de ensayo frente a
vehículo).
Estos datos proporcionan pruebas adicionales de
que el anticuerpo H2L1 humanizado ha retenido las propiedades
funcionales mostradas con la molécula 2E7 de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la semivida terminal del anticuerpo
de ensayo en ratones. El anticuerpo de ensayo se administró por una
infusión intravenosa de 1 h a 4 ratones para conseguir una dosis
diana de 400 \mug por ratón. Se tomaron muestras de sangre
seriadas a partir de cada ratón hasta 5 días después de la
dosificación (un ratón del grupo de 2E7 no completó el estudio y uno
del grupo de H2L1 se retiró del análisis posterior porque se hizo
evidente que la dosis no se había administrado i.v.). Los niveles
de anticuerpo se midieron usando un ELISA de captura de
\beta-amiloide.
El análisis de los datos indica que el
anticuerpo H2L1 humanizado tiene una semivida terminal de
aproximadamente 82 horas en ratones (Tabla 11), que es comparable a
la del anticuerpo monoclonal de ratón parental 2E7 (aproximadamente
75 horas).
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- # mediana e intervalo
- Cmáx
- Concentración máxima en plasma observada.
- Tmáx
- Tiempo transcurrido hasta la concentración máxima en plasma observada
- CLp
- Aclaramiento total en plasma; Dosis/AUC_{(0-inf)}.
- t^{1/2}
- La semivida de fase terminal se determinó como la relación de ln2/z donde z es la constante de la velocidad en fase terminal; calculada usando un análisis de regresión lineal no ponderado (después de la transformación logarítmica) de los pares de concentración-tiempo que se produjeron después del inicio evaluado visualmente de la fase terminal de log-lineal.
- Vss
- Volumen de distribución en estado estacionario; CLp x MRT_{0-inf}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un estudio en monos Cynomolgus de
edad avanzada (de aproximadamente 15 años) para investigar la
relación de exposición-respuesta con respecto a la
formación de complejos de amiloide/H2L1 y el aclaramiento y los
posteriores efectos sobre los niveles de amiloide del CSF y el SNC.
Se recogieron muestras de sangre y de CSF lumbar (tomadas con
sedación con ketamina) semanalmente, 3 semanas antes de administrar
la 1ª dosis de H2L1. Inmediatamente después del muestreo en la
semana 3, los animales recibieron placebo (n = 10), 0,1 mg/kg (n =
5), 1 mg/kg (n = 5) o 10 mg/kg (n = 10) de H2L1 y después cada 2
semanas durante un periodo de 12 semanas. Se tomaron semanalmente
muestras de sangre para realizar el análisis en plasma de H2L1 y
A\beta_{42} total. Se recogieron muestras de CSF para la
cuantificación de A\beta_{40/42} cada 2 semanas. Después de
terminar el periodo de dosificación, los animales se sacrificaron
para cuantificar en el cerebro el beta-amiloide por
análisis bioquímico como se ha descrito anteriormente y para
investigar las micro hemorragias. En el grupo de menor dosificación
(0,1 mg/kg), los animales se sacrificaron de forma escalonada para
evaluar el posible efecto del transcurso del tiempo en los niveles
cerebrales como consecuencia de la terminación de la dosificación y,
por lo tanto, la saturación de las reservas plasmáticas de
amiloide.
Este estudio se aprobó por el Institutional
Animal Care and Use Committee (IACUC) de MACCINE Pte Ltd, o
"Maccine" antes de iniciar la fase experimental. El número de
protocolo de IACUC fue nº 08-2006. GSK ha realizado
una visita al centro de Maccine y ha revisado su proceso ético y lo
ha considerado aceptable.
Las muestras de plasma se diluyeron en serie
1:10 a 1:50000 y se añadieron a A\beta_{40} aplicado como un
recubrimiento en placas ELISA. Se crearon curvas patrón que variaban
de 0-10 \mug/ml de H2L1 en diluyente. Después de
una incubación de una noche a 4ºC, H2L1 se visualizó usando IgG
anti-humana-peroxidasa de rábano
picante (Amersham - diluido 1:2000 en diluyente) y un sistema de
detección de tetrametilbencideno. Después de una administración iv
en bolo individual y repetida, los niveles plasmáticos de H2L1
parecían aumentar de una manera dependiente de la dosis. No hubo
indicios de ausencia de linealidad severa en la farmacocinética, lo
que indica que para la mayor parte del intervalo de dosificación, se
consiguieron concentraciones molares en exceso de H2L1 en el plasma
en comparación con los niveles de amiloide libre.
La A\beta_{42} total se midió en plasma puro
usando un kit ELISA A\beta 1-42 disponible en el
mercado (Innogenetics) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante, variando las curvas patrón de 500-7
pg/ml creado en el diluyente del kit. Las muestras y los patrones
se incuban durante una noche a 4ºC antes del ensayo por duplicado
de acuerdo con las instrucciones del kit. Debe indicarse que debido
a la interferencia del anticuerpo de detección suministrado con el
ensayo de A\beta_{42}, este kit no puede usarse para medir los
niveles de A\beta_{42} libre, sino que mide el A\beta_{42}
"total" aparente. Hubo un aumento dependiente de la
concentración y de la dosis en A\beta_{42} (niveles mantenidos
de aproximadamente 300, 125 y 25 pg/ml detectados después de 10, 1 ó
0,1 mg/kg de H2L1 respectivamente).
Por los datos del análisis, es probable que el
aumento en el "A\beta_{42} total" se deba al resultado de
una salida significativa de amiloide del exterior de las reservas
plasmáticas, que parecía dependiente de las concentraciones de H2L1
>1 \mug/ml, y no parecían ser el resultado de la ausencia de
aclaramiento del complejo. Esto fue evidente por la velocidad de
eliminación del A\beta_{42} total así como la fluctuación en los
niveles totales en un intervalo de dosificación.
Hasta la fecha sólo se han completado y
analizado totalmente los análisis en plasma. Sin embargo, los
análisis preliminares indican que había una tendencia hacia la
reducción en el CSF y hacia el aumento en el hipocampo del nivel de
A\beta42 "total" (medido como se ha descrito anteriormente en
general) después del tratamiento con 10 mg/kg de H2L1.
En algunas secciones cerebrales, se detectaron
pequeñas áreas de microhemorragia como se muestra por el
procedimiento de tinción con Azul de Perls Prussian. Este
procedimiento visualiza el hierro férrico (el hierro es un
constituyente esencial de la hemoglobina que lleva el oxígeno
presente en los glóbulos rojos) produciendo un compuesto azul
insoluble. Sin embargo, no hubo ninguna diferencia en la incidencia
entre los animales tratados con vehículo y los tratados con
fármaco.
\vskip1.000000\baselineskip
En monos cynomolgus se han presentado parámetros
en líquido cefalorraquídeo (CSF) y en tejidos de la AD humana. Se
ha demostrado que el mono cynomolgus de edad avanzada tiene indicios
de deposición de amiloides. (Covance, The cynomolgus monkey as a
model for Alzheimer's disease. En: Buse E, Habermann G,
Friderichs-Gromoll S, Kaspereit J, Nowak P y
Niggemann K, editores. Poster Presentation at the 44th Annual
Meeting of the Society of Toxicology, New Orleans, Louisiana, del 6
al 10 de marzo de 2005). La posibilidad de que H2L1 induzca una
respuesta inapropiada (tal como encefalitis) en un cerebro
envejecido se investigó en monos hembra que habían tenido crías
previamente de edad avanzada, de aproximadamente 20 años. Además,
también se investigó la seguridad, las micro hemorragias
relacionadas con el tratamiento, la neutralización/aclaramiento del
material de ensayo, la hipersensibilidad y la enfermedad por
complejos inmunes después de la administración intravenosa durante 8
semanas en intervalos de dos semanas. Además, se analizaron los
niveles de A\beta_{40/42} en muestras del SNC y de sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
A grupos de 5 (grupo 1), 9 (grupo 2) o 10 (grupo
3) monos cynomolgus hembra geriátricos se les administraron 0
(vehículo), 50 ó 100 mg/kg/dosificación al día de H2L1 en vehículo
(4 ml/kg) una semana sí y otra no durante un periodo de 8 semanas,
por vía intravenosa, por medio de una administración en embolada
lenta. El vehículo consistía en acetato sódico trihidrato a 6,81
mg/ml, edetato disódico dihidrato a 0,0186 mg/ml, polisorbato 80 a
0,2 mg/ml y base L-Arginina a 10 mg/ml, y el pH fue
de 5,5. Los niveles de dosificación se eligieron para investigar
niveles de dosificación que eran 5 y 10 veces los niveles de
dosificación clínica deseada.
Las siguientes evaluaciones se realizaron antes
de la dosificación, diariamente (signos clínicos, peso corporal,
consumo de alimentos), en la semana 4 y en la semana previa a la
necropsia: observaciones en el animal vivo, peso corporal,
temperatura corporal, hematología, química clínica (incluyendo el
análisis del líquido cefalorraquídeo [CSF]), urianálisis y
determinación de citoquinas en CSF. Después de la necropsia, se
determinaron los pesos de los órganos, observaciones macroscópicas
y observaciones microscópicas del cerebro, médula espinal cervical y
lesiones generales en todos los animales. Después de cada
dosificación se realizó una evaluación toxicocinética.
\vskip1.000000\baselineskip
No hubo muertes no programadas, y no se
produjeron signos que indicaran una influencia del artículo de
ensayo sobre el estado general de los animales a las dosis
administradas. Las únicas observaciones destacadas en la patología
clínica (hematología y química del suero), según se concluyó,
estaban relacionadas con la edad y no con el artículo de ensayo.
La exposición sistémica a H2L1 (medida por
AUC_{0-\tau} y C_{máx}) aumentó aproximadamente en proporción a
la dosis. Para los dos grupos de dosificación, no hubo un cambio
marcado (\geq2 veces) en la exposición sistémica entre la 1ª dosis
y la 4ª dosis de los periodos de muestreo.
No se detectó ningún signo de reacciones
inflamatorias en el cerebro detectadas por análisis del CSF, y no
hubo ningún hallazgo macroscópico o microscópico en la necropsia que
sugiriera la influencia del artículo de ensayo, específicamente no
se produjeron microhemorragias ni encefalitis.
Este estudio se realizó de acuerdo con las
regulaciones de la Buena Práctica de Laboratorio como se indica en
la Ley Alemana sobre Productos Químicos, anexo 1 y 2 en el artículo
19a Chemikalien Gesetz, junio de 2002, los Principios de OECD de la
Buena Práctica de Laboratorio (revisado en 1997, expedido en enero
de 1998) ENV/MC/CHEM (98) 17 y el Documento Consenso "The
Application of the OECD Principles of GLP to the Organisation and
Management of Multi-Site Studies"
ENV/JM/MONO(2002)9. Los estudios realizados de acuerdo
con las regulaciones y normas anteriores se consideraron aceptables
para las autoridades reguladoras de la FDA de Estados Unidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los hemisferios cerebrales izquierdos de los
macacos cynomolgus tratados con vehículo del estudio anterior se
analizaron por inmunohistoquímica. Una sección en corona, a nivel
del surco temporal medio que contenía partes del giro dentado y del
hipocampo se procesó en cera como se ha descrito anteriormente. Para
la inmunohistoquímica, las secciones se marcaron con un anticuerpo
pan-A\beta (1E8, anticuerpo monoclonal inducido
contra A\beta 13-27) o con el anticuerpo
A\beta42 (20G10, anticuerpo monoclonal que reconoce a A\beta
x-42) y el marcaje se realizó como se ha indicado
anteriormente. Para cada sección se realizó un recuento visual del
número de placas. Los tejidos de los cinco monos cynomolgus
tratados con vehículo mostraron indicios de placas de A\beta
parenquimáticas. También hubo indicios de A\beta marcado
cerebrovascular y A\beta intraneuronal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un análisis bioquímico en muestras
plasmáticas a partir de dos momentos (al final de las semanas 4 y 8
después de iniciar la dosificación) de animales que recibieron 50
mg/kg (n = 9) o 100 mg/kg (n = 10) de H2L1 o controles que
recibieron vehículo (n = 5). Se analizaron muestras duplicadas de
100 \mul usando el kit ELISA de A\beta 1-42
Innogenetics disponible en el mercado, incubadas durante una noche a
4ºC. Las muestras de control se analizaron tanto puras como a una
dilución 1:10 (usando el diluyente suministrado), mientras que las
muestras de los animales que recibieron la dosificación se ensayaron
puras y a 1:25. Se analizaron los valores de absorbancia
posteriores, deduciéndose los valores de absorbancia desconocidos en
pg/ml usando curvas patrón, y después se corrigieron para cualquier
dilución del ensayo. Los niveles plasmáticos totales de A\beta42
obtenidos a partir de estas muestras se proporcionan en la Tabla 12
que se presenta más adelante (las cifras están en pg/ml \pm SE);
todas las muestras de los animales tratados con H2L1 contenían
niveles significativamente mayores de A\beta42 (p <0,001 por
ensayo t de student) que en los grupos de control.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados se obtuvieron a partir de
muestras no diluidas. Los resultados de las muestras puras no se
usaron, ya que muchos puntos de datos eran mayores que el patrón
superior o debido a la limitación del volumen de la muestra, sólo se
ensayaron como un solo punto.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden usarse vectores de expresión que
codifican H2L1 y unirse operativamente a marcadores de selección
amplificables tales como la DHFR o la glutamina sintetasa para
transfectar o transducir líneas de células CHO parentales
apropiadas (por ejemplo, CHODG44 o CHOK 1) para producir líneas
celulares modificadas por ingeniería genética adecuadas para la
producción de anticuerpos monoclonales a gran escala (como revisión,
véase Bebbington and Hentschel DNA Cloning Volume III; A practical
approach (editado por Glover DM) (Oxford IRL press, 1987). Para
aumentar los niveles de expresión, la secuencia codificante puede
optimizarse con respecto a sus codones para evitar motivos de
secuencia de actuación cis y contenidos extremos de GC (altos o
bajos). Las SEC. ID Nº: 42 y Nº: 43 ilustran esta secuencia
codificante para la cadena pesada H2 y la cadena ligera L1. La
producción a gran escala puede realizarse en biorreactores de
depósito de agitación usando medio sin componentes de origen
animal, seguido de purificación. Esto puede comprender la
clarificación del material recogido, seguido de cromatografía de
afinidad en proteína A, y la purificación adicional usando
intercambio iónico (por ejemplo, catiónico) y operaciones en
unidades de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, hidroxiapatita
cerámica). La nanofiltración para la eliminación de virus se
continúa por una etapa de ultrafiltración/diafiltración final que
permite una formulación adecuada para la vía de administración
deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Región V flanqueante aceptora de
cadena pesada de M99675, secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:
21)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de región V flanqueante
aceptora de cadena pesada de M99675 (SEC ID Nº:
22)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de región
V flanqueante aceptora de cadena ligera de CAA51135 (SEC ID Nº:
24)
\newpage
ADN de región V flanqueante
aceptora de cadena ligera de CAA51135 (SEC ID Nº:
25)
\vskip1.000000\baselineskip
Variante H1 de región V de cadena
pesada humanizada, secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:
26)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia codificante de ADN de
variante H1 de región V de cadena pesada humanizada (SEC ID Nº:
27)
\vskip1.000000\baselineskip
Variante H2 de región V de cadena
pesada humanizada, secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:
28)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de variante H2 de región V de
cadena pesada humanizada (SEC ID Nº:
29)
\newpage
Variante H3 de región V de cadena
pesada humanizada, secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:
30)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de variante H3 de región V de
cadena pesada humanizada (SEC ID Nº:
31)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de
variante L1 de región V de cadena ligera humanizada (SEC ID Nº:
32)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de variante L1 de región V de
cadena ligera humanizada (SEC ID Nº:
33)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de cadena
pesada de H1 madura (Fc mutado, mutación doble en negrita) (SEC ID
Nº:
34)
\newpage
ADN de longitud completa de H1 (SEC
ID Nº:
35)
\newpage
Secuencia de aminoácidos de cadena
pesada de H2 madura (Fc mutado, doble mutación en negrita) (SEC ID
Nº:
36)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de longitud completa de H2 (SEC
ID Nº:
37)
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de cadena
pesada de H3 madura (Fc mutado, mutación doble en negrita) (SEC ID
Nº:
38)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de longitud completa de H3 (SEC
ID Nº:
39)
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de cadena
ligera madura (SEC ID Nº:
40)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de longitud completa de L1 (SEC
ID Nº:
41)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de cadena pesada de H2
optimizada (SEC ID Nº:
42)
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de cadena ligera L1 optimizada
(SEC ID Nº:
43)
Claims (14)
1. Un anticuerpo terapéutico que comprende una
cadena V_{H} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 26 y
un dominio V_{L} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº:
32.
2. Un anticuerpo terapéutico que comprende una
cadena V_{H} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 28 y
un dominio V_{L} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº:
32.
3. Un anticuerpo terapéutico que comprende una
cadena V_{H} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 30 y
un dominio V_{L} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº:
32.
4. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con
cualquier reivindicación anterior que es del isotipo IgG1.
5. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con
cualquier reivindicación anterior, que carece de las funciones de a)
activación del complemento por la ruta clásica y b) mediación de la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
6. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que los restos 235 y 237 se han mutado a
alanina.
7. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la
reivindicación 1, el cual comprende una cadena pesada que tiene la
secuencia indicada en la SEC ID Nº: 34, 36 ó 38 y una cadena ligera
que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 40.
8. Una composición farmacéutica que comprende un
anticuerpo terapéutico de acuerdo con cualquier reivindicación
anterior.
9. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para usar en el tratamiento
de una enfermedad relacionada con el péptido
\beta-amiloide.
10. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que la enfermedad relacionada con el péptido
\beta-amiloide es la enfermedad de Alzheimer.
11. Un anticuerpo o fragmento de este que
comprende un dominio V_{H} que tiene la secuencia SEC ID Nº:17 y
un dominio V_{L} que tiene la secuencia SEC ID Nº: 19.
12. Un polinucleótido que codifica una cadena
pesada del anticuerpo terapéutico, en el que el polinucleótido
comprende la secuencia indicada en las SEC ID Nº: 35, 37, 39 ó
42.
13. Un polinucleótido que codifica una cadena
ligera del anticuerpo terapéutico, en el que el polinucleótido
comprende la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 41 ó 43.
14. Un procedimiento para preparar un anticuerpo
terapéutico como se reivindica en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho procedimiento comprende la
expresión de un polinucleótido que codifica dicho anticuerpo en una
célula huésped.
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