TWI356428B - - Google Patents

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1356428 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係提供一種超順磁性粒子之製造方法，以 及利用該方法所製造的超順磁性粒子。前述超順磁 子可應用於化學或生化物質的純化與反應，並可應 大規模反應與自動化磁珠操作平台。 【先前技術】

具有超順磁性之磁性粒子（superparamagnetic particles)’在外加磁場的條件下，會受到磁場的誘導而 產生磁性，t集到磁％的]Sf極或s極；將磁場移離後， 其磁性瞬間消失，回復到不具有磁性的狀態，重新分 散。由於氡化鐵粒子具有生物相容性、且無細胞毒性， 所以是所有磁性粒子中最被廣為使用的材料。 在具有超順磁性之磁性粒子的早期應用與研丨 中，其粒役等級是以微米為主，且其應用是以體外應) 為主，在分離純化領域的應用尤其如此，僅有少數 内應，，究其原因，在於微米粒子的大小相對於細微| 織仍是較大的，故無法有效地進入細微組織區域。近] 來，/由於奈米粒子的開發，粒徑大幅縮小，而得以進, 早期微米粒子無法進人的區域，因此開始大量開發與; J+ii!範圍已經可達微血管區域等’並廣泛二 在生物醤予領域上，例如磁共振造影、溫熱治療等.丨 ^ 之奈米粒子也具有可控制化載體咖 性，故▼動了整個生醫產業自動化的新里程。 、常用於合成具有超順磁性之氧化鐵粒子的: 式’疋簡單的共沈澱法（ co_precipitation )。共外資、本 _ 在同時具有二價鐵離子與三價鐵離子的溶 液’將酸鹼值調整到9至14之間，如此即可得到四」 5 1356428

化三鐵的沈殿物。但此傳統方式需將三價與二價鐵離子 的莫耳比例控制在Fe3+ : Fe2+ = 2 : 1，且需在無氧環境 下進行，否則將影響氧化鐵粒子的結晶型態’而且氧化 鐵粒子會在製備過程中持續氧化，進而影響到氧化鐵粒 子的飽和磁化1 ( saturation magnetization)大小。目前 的解決方式是在氮氣下進行反應、或改在有機相中反 應，以便減緩氧化；但二價鐵離子易氧化成三價鐵離 子，需新鮮配置，且不易精準控制反應中的莫耳比例， 這都會增加大量合成的困難度。此外，四氧化三鐵粒子 中的鐵離子並非全數處於最高的氧化態，所以這些鐵離 ^會在空氣中慢慢氧化成不具順磁性或磁性較弱的三 ^化二鐵。一般來說，會在四氧化三鐵粒子表面包覆高 分子聚合物或二氧化矽的無機氧化物，但這類粒子常會 出現無法長時間耐高溫與耐酸性差的缺點，使其應用受 到限岳ΐί。 ~1^±先前技術的缺點，本發明利用尿素特殊的高 性’在單純只需二價鐵離子存在的情況下， S有ί飽和磁化量的超順磁性氧化鐵粒子，並在表

/ 二私化矽來形成核-殼結構，使磁性氧化鐵粒子的 強，並可接受高溫高壓滅菌處理。前述有二氧 氧ϊ鐵粒子可經進一步酸處理，來作為吸附 ^蛋白亦可進—步經帶有官能基的雜修飾，而 ^鐵他化合物進行化學鍵結，增加超順磁性氧 化鐵粒子的應用層面。 【發明内容】 子之此’本發明之目的係提供-種超順磁性粒 用單彳較於傳統的磁性粒子，本發明只需使 、-貝鐵離子來源’ g己合尿素特殊的高溫熱分解 6 1356428 特性’即可在常壓高溫的開放系統下 化量及超順磁性的氧化鐵粒子， 二j-、有向飽和磁 並利用改進的二氧化矽包覆技術’將發明 溶、水和驗液的混合溶液中進行在j·機醇 勻的二氧化梦，此-核-殼結構耐高溫一層均 抗酸性佳，在酸性溶液中不I有=錢理，且其 本發明的方法中，只需屬離子釋出。在 不同粒徑的粒子，而

石夕層可進行多種表面料，來進行純=㈡一乳化 枋r本^^之另一目的係提供一種超順磁性粒子，盆 核心乳化，粒子的主要成分是具有超順磁性的四氧^ 二鐵’士軋化鐵粒子的表面有均勻的二氧化石夕包覆層， 可抗強酸，並可進行高溫高壓滅菌處理。 u之又—目的係提供—種表面經過酸處理而 使矽烷醇基（Si-OH)增加的超順磁性粒子， 環境下具有吸附核酸的能力。

本發明之再一目的係提供一種表面經過具有官能 基之矽烷（silane)修飾而使其表面具有胺基、羧基、醛 基等官能基的超順磁性粒子，再利用活化劑或連結劑， 使之與蛋白質或化合物鍵結，而成為具有專一性的吸附 載體’可應用於例如抗體之純化。 為達上述目的’本發明提供一種超順磁性粒子之 製造方法，其包含下列步驟： (a) 將二價鐵化合物粉末、尿素和水混合攪拌，在 80°C至110°C的常壓環境下進行迴流反應1至 24小時’生成氧化鐵粒子； (b) 清洗前述氧化鐵粒子後再加入水、氨水和有機 醇溶劑混合攪拌，進行超音波震盪； 7 1356428 (c) 在前述混合物中加入石夕酸四乙醋（tetraethyl orthosilicate，TEOS)，在 50°C 至 70°C 的溫度 下反應0.5小時至12小時；及 (d) 將溫度降至25°C至30°C後，另外加入矽酸四 乙酯，反應1小時至12小時，形成有二氧化 矽包覆之氧化鐵粒子，其具有超順磁性。 在本發明之較佳實施態樣中，前述製造方法進一 步包括下列步驟以製得一活化之超順磁粒子： (e) 將前述步驟(d)之有二氧化矽包覆之氧化鐵粒 • 子與pH值小於6之酸性緩衝液混合攪拌。 在本發明之較佳實施態樣中，前述酸性緩衝液為 磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、MES緩衝液（2-(N-嗎 琳基）乙烧續酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)) 或Bis-Tris緩衝液（雙(2-羥基乙基)亞胺基-參(羥基曱基) 曱烧 (bis(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl) methane)) ° 在本發明之較佳實施態樣中，前述製造方法進一 步包括下列步驟’以製得表面具有官能基之超順磁粒 • 子： (f) 將前述步驟（d)之有二氧化矽包覆之氧化鐵粒 子移入極性有機溶劑中； (g) 加入具有官能基之矽烷化物混合攪拌，使前述 有二氧化矽包覆之氧化鐵粒子表面具有官能 基。 在本發明之較佳實施態樣中，前述極性有機溶劑 為丙酮、DMS0 (二甲亞颯（dimethyl sulfoxide) )、DMF (N，N-—甲基曱醯胺（N，N-dimethylformamide) )、NMP (N-曱基-2-0比略咬酮（N_methyl-2-pyrrolidone))或異丙 醇。 8 1356428 在本發明之較佳實施態樣中，前述官能基係選自 由胺基、氫硫基、氫氧基、甲基、辛基、十八基和苯基 所組成之經群。 在本發明之較佳實施態樣中，前述矽烷化物包含γ-胺基丙基二乙氧基發烧（<y_amjn〇pr〇pyl

triethoxysilane )、（3-氫硫基丙基）三甲氧基矽烷 ((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane)、環氧丙氧基丙基 二甲氧基石夕炫（glycidoxypropyl trimethoxysilane)、曱基 二乙氧基石夕烧（methyl triethoxysilane)、正辛基三乙氧 基石夕烧（n-octyl triethoxysilane)、十八基三曱氧基石夕院 (octadecyl trimethoxysilane )或苯基三乙氧基矽烧 (phenyl triethoxysilane ) ° 本發明另提供一種超順磁性粒子，其係藉由前述 相關方法製得，其中前述超順磁性粒子的主要成分為四 氧化三鐵，二氧化矽的含量為0,05重量％至4〇重量％， 且其粒控範圍為l〇〇nmi l〇pm。 在本發明之較佳實施態樣中，前述超順磁性粒子 之飽合磁化量大於35 emu/g。

本發明並提供一種活化之超順磁性粒子，其係藉 由前述相關方法製得，在高鹽環境下對核酸分子具有^ 吸附力。其中高鹽環境較佳係指〇.5厘至8M的N^C1、 Nal、GuHCl 或 GuSCN。 本發明又提供一種表面具有官能基之超順磁性粒 子，其係由前述相關方法製得。 在本發明之較佳實施態樣中，若前述超川貝磁性粒 子表面所具有的官能基是胺基，則其可進一步 活化劑修飾，使其可與具有絲官能基 = 物鍵結。 負次化口 在本發明之較佳實施態樣中，前述經基活化劑係 9 1356428 EDAC、CMC ( 1-環己基-3-(2-嗎啉基乙基）碳化二亞胺 (l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide) )' DCC (二環己基碳化二亞胺（dicyclohexyl carbodiimde))或 DIC(二異丙基碳化二亞胺（diisopropyl carbodiimide))。 在本發明之較佳實施態樣中，前述經羥基活化劑 修飾後之超順磁性粒子進一步與蛋白質鍵結後，係可用 以純化抗體。 在本發明之較佳實施態樣中，前述蛋白質係蛋白 質 A (Protein A)、蛋白質 G (Protein G)、抗體、酶或 鲁 鍵徽親合素（Streptavidin)。 在本發明之較佳實施態樣中，前述表面具有官能 基之超順磁性粒子的表面係進一步利用螯合劑修飾，使 其可與過渡金屬離子螯合，純化帶有組胺酸之蛋白或磷 酸化蛋白。 在本發明之較佳實施態樣中，前述螯合劑為三乙 酸基氨（nitrilotriacetic acid )、IDA (亞胺基二乙酸 (iminodiacetic acid))或 EDTA(乙底酸 ethylenediamine-tetraacetic acid) 〇 • 综上所述，本發明提供一種超順磁性粒子之製造 方法，相較於傳統的共沈澱法，本發明只需使用單一鐵 離子源’即可合成高飽和磁化量的超順磁性氧化鐵粒 ，，並利用改良的二氧化矽包覆技術，使所製得之有二 氧化矽包覆的氧化鐵粒子除了極佳的磁反應性外，更異 有絕佳的抗酸性’且可耐高溫高壓處理。而利用本方法 所製得之超順磁性粒子用途廣泛，可應用於如核酸與蛋 白質的純化。 【實施方式】 本發明利用尿素特殊的高溫熱分解特性，在單純 只需二價鐵離子存在的情況下，產生具有高飽和磁化量 10 磁性氧化鐵粒子。將二價鐵化合物粉末、尿素和 ^混合授掉’ 18〇°C至110°c的常壓環境下進行迴流反 二至24】、4 ’其中二價鐵離子在水中會慢慢氧化成 ^貝，離子三同時尿素在熱水中會分解成氨水與二氧化 石！1 ^/、中^氧化碳會從迴流管排出，而氨水則會提供氫 乳基’使溶液的酸鹼值慢慢升高，產生以下的顏色反應： 里 4 色 ! _黃 槁 紅 頁 深 色'^濁邕-管〇赞->褐 vJ匕巴色色色

Fe2+ Fe 3+

Fe304 當酸鹼度達到9以上時，二價鐵離子與三價鐵離 f·會產生共沈殿反應，開始生成黑色的四氧化三鐵粒子 晶核；而水中未反應的二價鐵離子繼續反應，在前述晶 核，面形成四氧化三鐵沈澱，使粒徑逐漸增加。因此， 可藉由，整尿素與二價鐵離子的莫耳比，來控制晶核生 成的數量·’或調整四氧化三鐵生成後的反應時間，將氧 化鐵粒子的粒徑範圍控制在100 nm至10 μιη。 本發明製成超順磁粒子之反應機制如下： 1) 4 Fe2++〇2 + 2 h204 Fe3++ 4 ΟΗ' 2) CO(NH2)2 + h2〇 —加熱(80至110oC) > 2 NH3 + C〇2 2 NH3 + 2 H2〇 2 NH4OH ^ 2 NH4+ + 2 OH* 3) Fe2++2Fe3+ + 8 0H、Fe304 + 4H20 全反應式如下： 3 FeCl2 + 3 0〇(ΝΗ2)2 + ^ (¾ + 6 H20 ^ Fe304 + 6 NH4CI + 3 0¾ 四氧化三鐵粒子在空氣中會漸漸氧化成不具順磁 性或磁性較弱的三氧化二鐵。本發明利用改良的二氧化 U56428 $包覆技術在四氧化三鐵粒子表面形成包覆層，降低其 氧化程度。首先在高溫下反應，生成厚實的二氧化矽 層’然後在低溫下反應，將表面空隙填補完整’並在表 面生成具有活性的矽烷醇基。由前述方法所製得的有二 氧化矽包覆之氧化鐵粒子’其核-殼結構的抗酸性增強， 並可接受高溫高壓滅菌處理。

前述有二氧化矽包覆之氧化鐵粒子可經進一步酸 處理’增加其表面的矽烷醇基，如此可在高鹽環境下作 為吸附核酸的載體，但卻不會吸附蛋白質與其他污染 物；亦可進一步經帶有官能基的矽烷修飾，使氧化鐵粒 子表面具有官能基，而與蛋白質或其他化合物進行化學 鍵結，增加超順磁性氧化鐵粒子的應用層面。此類磁性 材料漸漸成為自動化分子生物檢驗分析之前處理步驟 中不可或缺的載體。

一般認為，粒徑大於50 nm的磁性粒子不具超順 磁性’或有磁遲滞現象（remanent magnetism )。但在本 發=的製造方法中，首先生成奈米級的氧化鐵晶核，再 I"曼t艾在晶核表層繼續成長，因此，即便氧化鐵粒子的粒 徑已達10 μιη，仍保有超順磁性，且其飽和磁化量大於 35 emu/g。另一方面’可藉由增加氧化鐵粒子的粒徑、 或藉由二氧化矽的包覆來增加單顆粒子中的氧化鐵粒 子數目，縮短磁反應時間。本發明的超順磁性粒子在外 加磁場的吸引下，磁反應時間小於2秒。如此強的磁力 不僅可以縮短磁反應時間，也可以在丨 公升的大反應_中進行操作。 d _ 具有超順磁性的粒子在外加磁場移離後，不需加 ^ 性便即消失，而㈣重新分散在溶液中，繼續反 應。运項特性能夠增加異相反應的均句性。 二 氧化石夕的包覆須在氧化鐵粒子製備完成後馬上 12 1356428

進行’以防止四氧化三鐵繼續氧化。首先將氧化鐵粒子 分散在水與醇類（如甲醇、乙醇、異丙醇、1-丙醇、L 丁醇、2-丁醇、第三丁醇、異丁醇等）的混合液中，再 加入氨水或其他驗性溶液（如氫氧化鈉、氫氧化卸、氫 氧化四曱基銨、氫氧化四乙基銨）’將反應環境控制在 驗性’進行超音波振盪。在前述混合物中加入發酸四乙 酯’在50°C至70°C的溫度下反應〇.5小時至12小時； 藉由控制石夕酸四乙酯的添加量，可將二氧化石夕包覆層的 厚度限制在從1 nm到1 μπι。之後將溫度降至25°C至 3〇°C ’另外加入矽酸四乙酯，反應1小時至12小時， 其係藉由較慢的反應速率，將表面空隙填補完整。 本發明之氧化鐵粒子-二氧化矽的改良式核-殼結 構，在2M的濃鹽酸下可耐酸超過60分鐘；且高溫高壓 滅菌不會影響氧化鐵的超順磁性與其表面的二氧化 結構。 ^ 包覆氧化鐵粒子的二氧化矽表面具有矽烷醇基， 若浸泡在pH值小於6之酸性緩衝溶液中，可使二氧化 矽表面活化，矽烷醇基的數量增加，而這類活化的超順

磁=粒子在 0.5M 至 8M 之 NaCl、NaI、GuHCl 或 GuSCN 的同鹽環境下，對核酸分子有很強的吸附力，且超順磁 粒子之結果不會被破壞，至於蛋白質分子與其他污染 丨可藉由簡單的清洗步驟去除。可對所得之純化核 ^ 進f 聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction， 來將它放大’其結果如第四圖所示，純化核酸中 、蛋白質和其他會抑制pCR反應的物質存在。 劑c如將^包覆之氧化鐵粒子移至極性有機溶 胺美丙美-I ^萁再加入具有官能基的矽烷化物（如γ-基使氧化鐵粒子表面具有官能 ’又後可利用羥基活化劑（如EDAC)做 13 1356428 進一步修飾’使超順磁性粒子與蛋白質（如蛋白質A (Protein A)、蛋白質G (Protein G)、抗體、酶或鏈黴親合 素（Streptavidin))鍵結，之後用以純化抗體；其亦可利 用螯合劑（如三乙酸基氨）做進一步修飾，使超順磁性 粒子與二價或三價的過渡金屬離子螯合，之後用以純化 帶有組胺酸（histidine)之蛋白或磷酸化蛋白。 實施例 實施例ί :超順磁往氧化鐵粒子的小量製備 • 將0.25克二氣化鐵粉末與6克尿素結晶顆粒溶解 在100宅升去離子水中，在裝有冷凝管的玻璃反應器中 快速攪拌10分鐘，形成黃綠色澄清溶液，移入9〇。〇的 油鍋進行迴流反應12小時，生成黑色氧化鐵粒子，靜 置沈澱後，將接近澄清的上清液倒出’沉澱物用去離子 水清洗三次，去除反應剩下來的銨離子與氯離子。進行 二氧化矽包覆前，將前述沉澱物保持在水溶液中，避免 乾燥。 φ 實施例2 :超順磁性氧化鐵粒子的大量製備 將60克二氯化鐵粉末與9〇克尿素結晶顆粒溶解 在1公升去離子水中，在裝有冷凝管的玻璃反應器中快 速攪拌3分鐘，並將混合物移入溫度設定為95它的油鍋 進行迴流反應12小時，生成黑色氧化鐵粒子，靜置沈 澱後’將接近澄清的上清液吸出，沉澱物用去離子水清 洗三次，去除反應剩下來的銨離子與氯離子。進行二氧 化石夕包覆前’將前述沉殿物保持在水溶液中，避免乾燥。 實施例3:二氧化矽的包覆 14

八畔*將30 ί由實施例1或實施例2製得的氧化鐵粒子 1扯,225毫升去離子水中，再加入22.5毫升μ%的氨 二二後;^入900毫升異丙醇，將此溶液封閉在玻璃反 窃中持縯攪拌，並進行超音波震盪1〇分鐘。加入4 $ 的矽酸四乙酯，並將水溫升高至5(TC，持續反廄2 小時，之後將水溫降至室溫（約25。〇，再加入45毫^升 =矽酸四乙醋，持續反應丨小時。反應完成後，靜置沈 澱，將透明上清液吸出，並用去離子水清洗至無氨 異丙醇的味道為止。實施例3製成之有二氧化 超順磁粒子之影像圖如第一圖所示。 實施例4 :表面活化處理

將實施例3的有二氧化矽包覆之氧化鐵粒子 去除上清液後’從中取30克加入3〇()毫升1〇mM ，鹽緩衝液（ΡΗ5·5)，清洗兩次，之後在相同的緩 持續搜拌5小時，再以去離子水清洗，重新分散 驗值8的缓衝液中，即可製得具有活化之二氧化 二 的超順磁性粒子。 面

實施例5:表面官能基的修飾 將實施例3的有二氧化矽包覆之氧化鐵粒子 去除上清液後’從中取30克加入250毫升無水内胸置 清洗兩次’之後將前述粒子分散在500毫升丙_中，技 續攪拌10分鐘，再加入3.5毫升γ-胺基丙基三乙氧基， 烷，在室溫下反應4小時。反應完成後，靜置沈澱，矽 透明上清液吸出，並用去離子水清洗至無丙酮的$、曾$ 止，即可製得表面具有胺基官能基的超順磁性粒子"7為 實施例6 :核酸的纯化 15 1356428

取分散在100微升中的lxl〇5個TSGH-8301細胞加 入400微升的細胞裂解液㈠2〇g guscN，100ml 0.1M

Tris-HCl PH6.4，22ml 0.2M EDTA pH8.〇，2.4ml Triton X-100)，反應10分鐘。之後加入50微升15〇 mg/mi由 實施例4製備而得之具有活化之二氧化矽表面的超順磁 性粒子’並加入1〇〇微升的連結液（異丙醇），均勻混 合10分鐘，使磁性粒子與細胞裂解後產生的核酸產生 連結。將昆合物置於磁座上’將上清液吸出，加入8〇〇 微升的清洗液（120g GuSCN，100ml 0.1M Tris-HCl pH6·4)，清洗兩次；再加入800微升70%乙醇，清洗兩 次。之後將氧化鐵粒子靜置丨〇分鐘，使清洗液中的酒 精揮發；再加入1〇〇微升的沖提液（10niMTrispH8)， 均勻混合10分鐘’接著將反應物置於磁座上，將上清 液吸出’置入乾淨的容器中’此即純化後的核酸，結果 如第四圖所示，其中Μ為1 kb的核酸標準液；E1至E3 為lxlO5個細胞的三次重複實驗；C1至C3為不同數目 之細胞的比較，其中C1為lxl〇5個細胞，C2為2xl〇5 個細胞’ C3為5xl〇5個細胞。由第四圖之結果可知，利 用本發明之活化後之超順磁粒子來純化之核酸並無蛋 白質和其他會抑制PCR反應的物質存在。 實施例7:抗想的純化 取10微升的血清，加入900微升的連結液（10 mM 磷酸鹽，15〇1^价(：1，？117.5)，再加人20微升5〇11^/1111 鍵結有蛋白質A的超順磁性粒子（利用實施例5之表面 修飾胺基之超順磁粒子進一步利用經基活化劑修飾 後’再與蛋白質A鍵結），均勻混合30分鐘。將混合物 置於磁座上，將上清液吸出，加入500微升的清洗液（1〇 mM鱗酸鹽，i5〇mMNaa，pH7.5)，清洗兩次；再加 1356428 入100微升的沖提液（0.5 Μ甘胺酸，0.15 M NaC卜pH 2.5)，均勻混合1〇分鐘，接著將反應物置於磁座上，將 上清液吸出，置入乾淨的容器中，再加入5微升的中和 液（1 M Tris ’ pH 9.0) ’移動磁性粒子，重複進行一次 沖提步驟，即得純化後的抗體，結果如第五圖所示，其 中Μ為蛋白質標準液，S為稀釋20倍的血清，F為未被 磁性粒子吸附的蛋白質’ W1為第一次清洗液的產物， W2為第二次清洗液的產物，Ε1為第一次沖提液的產 物，其產量大約占總量的60至70%，Ε2為第二次沖提 液的產物，其產量大約占總量的30至40%。由第五圖 之結果顯示，利用本發明製備之超順磁粒子，經表面官 能基修飾後可作為抗體純化之用。 血清中各種免疫球蛋白（IgG [約70%]、IgM [約 6%]、IgA [約 10 至 20°/〇]、IgE [約 0.001%]和 IgD [約 0.2%])的分子量分佈在15〇 kDa至900 kDa，在進行電 泳確認前，須將各樣本加熱沸騰，使蛋白能在電泳膠片 中移動。加熱沸騰後的免疫球蛋白會分成重鏈（heavy chain)和輕鏈（light chain)兩部分，其中各免疫球蛋 白的重鏈大小係在50 kDa至75 kDa範圍内，而數量最 多之IgG的輕鏈大小為25 kDa ’這兩個大小的蛋白會在 E1與E2上形成兩條明顯的主帶，此外，其他數量較少 之免疫球蛋白（IgM、IgA、IgE和IgD)的輕鏈，會在 25 kDa上下形成較弱的帶。而電泳片上大於75 kDa的 帶’主要是熱分解片段重新結合而成的半產物或完整的 免疫球蛋白。 實施例8:本發明舆市售磁性粒子的比較 1)耐酸性的測定 在1 ml的紫外光等級的塑膠比色管中，分別加入 17 1356428 12.5 mg本發明與兩種市售磁性粒子，再分別加入5〇〇 的2 M HC1，混合均勻後，將磁性粒子磁吸至底 旦 ，上清液於290 nm的吸光值（α29(^在0至1〇分°鐘時里 每2分鐘量測^次；在10至6〇分鐘時，每5分鐘量測 久。由於Fe離子的吸收蜂在290 nm，因此，若前述

土J液，A29。值*鐘内有上升，則表示該磁性粒 子的二氧化矽層被酸破壞，使氧化鐵裸露並 ，成Fe'故在前述測定中，a29。值未上d匕 「佳」’❿A29。值上升者則判定為「不佳」， 第二圖所示。 2)对高溢高屋處理的測定

在2 ml聚丙稀的樣品管中’分別加入1^5 本發 明與兩種市售磁性粒子，再分別加入1 mi去離子水，混 合均勻後，半鎖緊上蓋，放入滅菌鍋中，進行言二言^ 度設定12(TC，持續4〇分鐘，之後在&=下 進仃觀察磁性粒子表面二氧化石夕層脫落的情形，其结果 如下表1和第二圖所示。在下表1中，「佳/代^面 二氧化矽層未有脫落的情形，「可」代表表面二^化矽 ^有些微脫落的情形，而「差」代表表面二氧化矽層有 嚴重脫洛的情形；而在第二圖中，A-1和八_2分別為本 發明之超順磁性粒子在高溫高壓處理前後的外型，表面 二氧化矽層未有脫落的情形；Β-1和Β-2分別為〇ia2en 之磁性粒子在高溫高壓處理錢的外型，表 層有些微脫落的情形：C-1和02分別為Invitr〇gen之 磁性粒子在高溫高壓處理前後的外型，表面二氧化石夕層 有嚴重脫落的情形。 曰 此外’磁性粒子是否而ί高溫高壓處理，亦可配合下 文所述’而由處理後的磁反應時間變化來觀察；若磁反 應時間變慢，表示高溫高壓處理會造成磁性粒子氧化或 18 1356428 使其磁性結構改變’表示該磁性粒子不耐高溫高壓處 理’如表1所示。 3)磁吸時間的測定

磁吸時間的測定係在25至30°C下進行，將磁珠置 於1 ml或40 ml的去離子水卜若去離子水的體積為i ml，則利用小磁鐵進行測試；若其體積為4〇 mi，則利 ^大磁鐵進行顺。在磁座上安裝大/小磁鐵再把裝有 磁性粒子和反應液體的容器放到磁座上，進行磁吸時間 =，測試結果如下表i所示。與市售產品比較，在反 應體積大小額的測試中可明顯看出，若反應體積愈 大，則磁性愈強的磁性粒子，其反應操作的時間越短。 表1，本發明與市售;^性粒子的特性比較

2) *磁: ) 【圖式簡單說明】 第一圖：本發明有二氧化矽包覆之超順磁性粒子 (粒徑約500 nm)的電子顯微鏡圖（4〇〇,〇〇〇χ放大圖）。 第二圖：本發明之超順磁性粒子與市售磁性粒子經 高溫高壓處理前後在顯微鏡下的_Χ放大圖。 19 1356428 第三圖：本發明與市售磁性粒子的抗酸性比較圖。 第四圖：使用本發明之超順磁性粒子進行核酸純化 的DNA電泳圖。 第五圖：使用本發明之超順磁性粒子進行抗體純化 的蛋白質電泳圖。 【主要元件符號說明】

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Claims (1)

1. υ^ϋ428 十、申請專利範圍： 1. -種超順雜粒子之製造方法，其包含下列步驟： ⑷物粉末、尿素和水混合㈣，在8代 (b)=====水、氨水和有機醇溶 ⑷ΐΐϊΐί物中加入石夕酸四乙醋’在5〇°CS7〇°C的 ^度下反應0.5小時至12小時；及 (d) ϊ;ΐΤ;25。至和吏，另外加入石夕酸四乙醋， Lfnii2㈣，形成有二氧化矽包覆之氧化 鐵粒子’其具有超順磁性。 2. 凊專利範圍第1項所述之方法’其進-步包括下列 (e) ^述步驟⑷之有二氧切包覆之氧化鐵粒子食 3. pH值小於6之酸性緩衝液混合攪拌。 /、 Ϊ 圍衝第液2、項gfgf ί =;其中前述酸性緩衝 Bis-Tris緩^衝液醋酸鹽緩衝液、贿緩衝液或 4. ^請專利範圍第1項所述之方法，其進—步包括下列 ⑺步驟⑷之有二氧化矽包覆之氧化鐵粒子移 入極性有機溶劑中； 秒 (g)加入具有官能基之矽烷化物混合攪拌， 氧化矽包覆之氧化鐵粒子表面具有官能基。 一 圍第4項所述之方法，其中前述極性有機 冷月彳為丙酿I、DMSO、DMF、ΝΜΡ或異而醇。 6.如申請專利範圍第4項所述之方法，其中前述官能基係 21 1356428 選自由胺基、氫硫基、氫氧基、甲基、辛基、十八基和 苯基所組成之組群。 a 7·如申請專利範圍第4項所述之方法，其中前述矽烷化物 包s y-胺基丙基二乙氧基％烧、（3-氫硫基丙基)三甲氧基 矽烷、環氧丙氧基丙基三甲氧基石夕烷、甲基三乙氧^矽烷: 正辛基二乙氧基矽烷、十八基三甲氧基石夕烷、或二 氧基矽烷。 +土一Q 8. —種超順磁性粒子，其係藉由申請專利範圍第丨至7項 令任:項所述之方法所製得，纟中前述超順磁性粒子的 主要成分為四氧化三鐵，二氧化矽的含量為〇 〇5重量％ 至40重量％，且其粒徑範圍為1〇〇11111至 9. 如申請專利範圍第8項所述之超順磁性粒子，豆飽合磁 化量大於35emu/g。 '、 1〇馆^化的超順磁性粒子，其係由如申請專利範圍第2 吸附f方法製得，其在高鹽環境下雜酸分子具有強 u.巧表面具有官能基之超順磁性粒子，其 利範圍第4項所述之方法製得。 ^ ° 第11項所述之超順磁性粒子，若前述超 利用面所具有的官能基是胺基，則其可進一步 質物=料’使其可與具錢基官能基之蛋白 i3tm範圍第12項所述之超順磁性粒子，其中前述 i432，edac、cmc、dc(^dic。 經經^、、舌n，第12項所述之超順磁性粒子，其中前述 15結後三係可順磁性粒子進一步與蛋白質鍵 申°月專利範圍第14項所述之超順磁性粒子，其令前述 22 1356428 蛋白質係蛋白質A、蛋白質G、抗體、酶或鏈黴親合素 (Streptavidin ) ° 16. 如申請專利範圍第11項所述之超順磁性粒子，其表面係 進一步利用螯合劑修飾，使其可與過渡金屬離子螯合， 純化帶有組胺酸之蛋白或磷酸化蛋白。 17. 如申請專利範圍第16項所述之超順磁性粒子，其中前述 螯合劑為三乙酸基氨、IDA或EDTA。

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