TWI290147B - Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof - Google Patents

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1290147 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於對抗類胰島素生長因子I受體（IGF-IR)的抗 體、其生產方法、含該等抗體之醫藥組合物，及其用途。 【先前技術】 類胰島素生長因子I受體（IGF-IR，EC 2.7.112，CD 221抗 原）屬於跨膜蛋白酪胺酸激酶之家族（LeRoith，D·等人， Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163 ;及 Adams，T.E.等人，Cell· Mol· Life Sci_ 5 7 (2000) 1050-1063)。IGF-IR以高親合力結 合IGF-I且引起在活體内對該配體的生理反應。IGF-IR亦結 合至IGF_II，但是親合力稍低。IGF-IR過度表達促進細胞的 瘤轉化並有證據表明：IGF-IR涉及細胞的惡性轉化且因此 其係研發癌症治療之治療劑的有用目標（Adams，T.E.等 人，Cell. Mol· Life Sci· 57 (2000) 1050-1063)。 對抗IGF-IR的抗體在所屬技術中衆所熟知並研究了其在 活體外及在活體内的抗腫瘤作用（Benini，S.等人，0：1111· Cancer Res· 7 (2001) 1790-1797 ; Scotlandi，K·等人，Cancer Gene Ther.9 (2002) 296-307 ； Scotlandi, K.等人，Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16 ; Brunetti，A.等人，丑1〇(：1^111·

Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218 ； Prigent, S.A. 等人，J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977 ; Li，S.L.等人， Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252； Pessino, A. 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243 ; Surinya，Κ·Η·等人，J· Biol. Chem· 277 (2002) 94026.doc 1290147

16718-16725 ; Soos，Μ.Α·等人，J. Biol. Chem.，267 (1992) 12955-12963 ; Soos，M.A.等人，Proc. Natl. Acad· Sci· USA

86 (1989) 5217-5221 ; O’Brien，R.M.等人，EMBO J· 6 (1987) 4003-4010 ； Taylor，R.等人，Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos，M.A.等人，Biochem. J. 235 (1986) 199-208 ; Li，S.L.等人，Biochem· Biophys. Res· Commun· 196 (1993) 92-98 ; Delafontaine，P·等人，J. Mol. Cell. Cardiol· 26(1994)1659-1673 ; Kull，F.C· Jr·等人，J· Biol· Chem· 258 (1983) 6561-6566; Morgan，D.O·，及 Roth，R.A·，Biochemistry 25 (1986) 1364-1371 ; Forsayeth，J.R·等人，？]：〇(：.\31:1.八。&(1· Sci. USA 84 (1987) 3448-3451 ； Schaefer, E.M.f A ^ J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253 ； Gustafson, T.A.,及 Rutter, W.J·，J. Biol· Chem. 265 (1990) 18663-18667 ; Hoyne，Ρ·Α· 等人，FEBS Lett· 469 (2000) 57-60 ; Tulloch，Ρ·Α.等人，J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18 ; Rohlik，Q.T.等人，Biochem· Biophys. Res· Comm. 149 (1987) 276-281 ;及 Kalebic，T·等 人，Cancer Res· 54 (1994) 5531-5534 ; Adams，Τ· Ε·等人， Cell. Mol· Life Sci. 57 (2000) 1050-1063 ; Dricu，A.等人， Glycobiology 9 (1999) 571-579; Kanter-Lewensohn，L·等 人，Melanoma Res· 8 (1998) 389-397 ; Li，S.L·等人，Cancer Immunol. Immunother· 49 (2000) 243-252)。在許多其它出 版物中亦描述了對抗IGF-IR的抗體，例如Arteaga，C.L.等 人，Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) 101-106 ;及 94026.doc 1290147

Hailey，J.等人，Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353。 尤其是，稱作cdR3的對抗IGF-IR的單株抗體廣泛用於 IGF-IR介導之過程及IGF-Ι介導之疾病（例如癌症）的調查研 究。Kull，F.C·，J. Biol. Chem_ 258 (1983) 6561-6566描述了 a-IR-3。在此期間，出版了上百種出版物，論及aIR3關於 其單獨及與細胞生長抑制劑（例如阿黴素（doxorubicin)及長 春新驗（vincristine)) —起的抗腫瘤作用的研究及治療用 途。cdR3係鼠科單株抗體，已知其抑制IGF-I結合至IGF受 體但不抑制IGF-II結合至IGF-IR。aIR3以高濃度刺激腫瘤細 胞增殖及IGF-IR鱗酸化（Bergmann，U·等人，CancerRes.55 (1995) 2007-2011 ; Kato, Η.等人，J. Biol· Chem. 268 (1993) 2655-2661)。存在抑制IGF-II結合至IGF-IR比抑制IGF-I結合 更有效的其它抗體（例如，1H7，Li，S_L·等人，Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252) 〇 Adams，Τ·Ε·等 人，Cell· Mol. Life Sci· 57 (2000) 1050-1063描述了 抗體之 所屬技術概要及其特性及特徵。 在所屬技術中所述的大多數抗體係來源於鼠科。正如所 屬技術中所熟知，在未進一步變更（如嵌合或人源化）情況 下，該等抗體不可用於人類患者之治療。基於該等缺點， 將人類抗體作為治療人類患者之治療劑明顯較佳。人類抗 體在所屬技術中衆所熟知（van Dijk，M.A·及van de Winkel， J.G.，Curr. Opin. Pharmacol· 5(2001)368-374)。基於該技 術，可生產對抗各種目標的人類抗體。在WO 02/053 596中 描述了對抗IGF-IR之人類抗體的實例。 1290147 然而，仍然需求對需要抗腫瘤療法之患者具有令人信服 之益處的對抗IGF_IR之抗體。簡言之，對患者之相應益處 係由抗腫瘤發生劑治療所引起的腫瘤生長之減少及進展時 間之顯著延長。 【發明内容】 本發明包括一種結合至IGF-IR且抑制IGF-I及IGF-II至 IGF-IR之結合的抗體，其特徵在於該抗體 a) 係IgGl同種型， b) 顯示出IGF-I至IGF-IR之結合抑制與IGF-II至IGF-IR之結 合抑制的IC5〇值比率為1:3至3:1， c) 若與不存在該抗體的細胞磷酸化分析相比，在含有0.5% 經熱鈍化之胎牛血清（FCS)的培養基中之談分析中，在 5 nM之濃度下抑制了至少80%(較佳至少90%)IGF-IR磷 酸化，及 d) 若與不存在該抗體的細胞磷酸化分析相比，在含有0.5% 經熱鈍化之胎牛jk清（FCS)的培養基中之為每個細胞提 供400,000至600,000個分子IGF-IR的該分析中，在10 μΜ 之濃度下未顯示出作為pkB磷酸化所量測到的IGF-IR刺 激活性。 根據本發明之抗體對需要抗腫瘤療法之患者顯示出益處 並提供腫瘤生長之減少及進展時間之顯著延長。根據本發 明之抗體具有對正遭受與IGF異常相關之疾病（尤其是腫瘤 疾病）之患者產生益處的新的及創造性特性。根據本發明之 抗體的特徵為上述特性。因此該等特徵為：尤其特異結合 94026.doc 1290147 至IGF-IR ;以上述比率抑制IGF_I及IGF-ΙΙ至IGF-IR之結 合；與IgGl同種型；及在其IC5G值之200倍濃度時即使在 IGF-IR過度表達細胞中亦不激活IGF-IR發訊息。當用作治 療劑時，不具有"IGF-I模仿活性”之抗體提供強大優勢。 較佳地，根據本發明之抗體在100 nM濃度之該抗體濃度 下在24小時之後藉由ADCC額外誘發IGF-IR表達細胞製備 物之2 0 %或更多細胞的細胞死亡。 此外，根據本發明之抗體較佳在100 nM抗體濃度下在4 小時之後藉由CDC較佳地誘發IGF-IR表達細胞製備物之 2 0 %或更多細胞的細胞死亡。 較佳地，在5 nM之濃度時，根據本發明之抗體完全抑制 了腫瘤細胞中IGF-I介導的IGF-IR的訊息轉導。 本發明亦包括核酸。該等經編碼之多肽能夠與下文中定 義之各自其他抗體鏈相組合： a) 包含 SEQ ID ΝΟ:1 或 3之 CDRl(aa 31-35)、CDR2(aa 50-66) 及CDR3(aa 99-107)作為CDR之抗體重鏈； b) 包含 SEQ ID NO:2 或 4之 CDRl(aa 24-34)、CDR2(aa 50-56) 及CDR3(aa 89-98)作為CDR之抗體輕鏈。 該抗體較佳為單株抗體及，另外為嵌合抗體（人類恒定 鏈），人源化之抗體及尤其較佳為人類抗體。 該抗體與抗體18競爭而結合至IGF-IR人類（EC 2.7丄 112，SwissProt P08069) ° 該抗體之另外特徵為1〇_9 M(KD)或小於1(Τ9 Μ之親合 力，較佳為約10_9至10_13 Μ。 94026.doc -10· 1290147 該抗體較佳未顯示出可偵測之依賴濃度的對於IGF-ΙΙ至 受體之結合的抑制。 本發明較佳提供了包含具有以下序列作為互補決定區 (CDR)之抗體·· a) 包含 SEQ ID ΝΟ:1 或 3之 CDRl(aa 31-35)、CDR2(aa 50-66) 及〇〇113(33 99-107)作為〇〇11之抗體重鏈； b) 包含 SEQ ID NO:2 或 4之 CDRl(aa 24_34)、CDR2(aa 50-56) 及CDR3(aa 89-98)作為CDR之抗體輕鏈。 該抗體較佳為IgGl類型且因而提供Clq補體結合並誘發 CDC。該抗體之另外特徵為結合IgGFc受體及誘發ADCC的 能力。 與經媒劑治療之動物比較，在相關的異種移植腫瘤模型 中根據本發明之抗體顯著延長進展時間並減少腫瘤生長。 該抗體抑制在活體外及活體内IGF-I及IGF-II至IGF-IR之結 合，較佳為對IGF-I及IGF-II以大致等同之方式。 本發明另外提供對該等抗體編碼之核酸，含有該等核酸 之表達載體，及用於該等抗體之重組產生的宿主細胞。 本發明另外提供用於該等抗體之重組產生之方法。 本發明另外提供用於治療癌症之方法，其包括向已診斷 為具有癌症（並因此需要抗腫瘤療法）的患者施用有效量之 根據本發明的針對IGF-IR的對抗性抗體。該抗體可以醫藥 組合物形式單獨施用，或者與細胞毒素治療（例如放射線療 法）或細胞毒素劑或其前藥組合施用。 本發明另外包含根據本發明之抗體於治療癌症及製造本 94026.doc -11 - 1290147 發明之醫藥組合物的用途。另外，本發明包括—種用於製 造根據本發明之醫藥組合物的方法。 、 本發明另外包括-種醫藥組合物，其含有醫藥上有效量 之根據本發明之抗體，視情況連同可用於醫藥目的之抗體 調配的緩衝劑及/或佐劑。 — 本發明另外提供包含處在醫藥上可接受的載劑中之該等 抗體的醫藥組合物。在一實施例中，該醫藥組合物可包括 於製品或套組中。 本發明另外包括一種含有根據本發明之核酸的載體，其 能夠在原核或真核宿主細胞中表達該核酸。 、 本發明另外包括含有根據本發明之載體的原核或真核宿 主細胞。 本發明另外包括一種用於生產根據本發明之重組人類抗 體的方法，其特徵為：在原核或真核宿主細胞中表達根據 本發明之核酸並自該細胞回收該抗體。本發明另外包括可 藉由該重組方法獲得之抗體。 本發明另外包括一種用於自複數個對抗IGF-IR之抗體中 選擇一個對抗IGF-IR之抗體的方法，其特徵在於··以該等 抗體執行在含有〇·5%經熱純化之胎牛血清（Fcs)之培養基 中為每個細胞（較佳為3Τ3細胞）提供400,000至600,000個分 子IGF_IR的細胞磷酸化分析，且選擇當與不存在該抗體之 分析對比時在1 ο μ]ν[之濃度下未顯示出作為pkB填酸化所量 測到之IGF-IR刺激活性的抗體。該抗體較佳具有一個或多 個上述額外特性。 94026.doc -12 - 1290147 本發明另外包括一種用於製備醫藥組合物的方法，其特 徵在於：自複數個對抗IGF-IR之抗體中選擇一個對抗 IGF-IR之抗體，以該抗體執行在含有0.5%經熱鈍化之胎牛 血清（FCS)之培養基中為每個細胞（較佳為3T3細胞）提供 400,000至600,000個分子IGF-IR的細胞磷酸化分析，且選擇 當與不存在該抗體之分析對比時在10 μΜ之濃度下未顯示 出作為pkB磷酸化所量測到之IGF-IR刺激活性的該抗體，藉 由重組表達產生該抗體，回收該抗體並使該抗體與醫藥上 可接受的緩衝劑及/或佐劑進行組合。該抗體較佳具有一個 或多個上述額外特性。 【實施方式】 術語”抗體”包括各種形式之抗體，其包括（但不限於）：完 整抗體、抗體片斷、人類抗體、人源化之抗體及基因工程 化之抗體，其條件係保留了根據本發明之特有性質。 ，，抗體片斷，，包括全長抗體之一部分，通常為至少抗原結 合部分或其可變區。抗體片斷之實例包括形成自抗體片斷 之雙功能抗體、單鏈抗體分子、免疫毒素及多特異性抗體。 另外，抗體片斷包括單鏈多肽，該多肽具有VH鏈之特徵’ 即能夠與VL鏈一起組合，或具有結合至IGF-1R的VL鏈之特 徵，即能夠與VH鏈一起組合至功能性抗原結合凹點 (pocket)，且因而提供抑制IGF-I及IGF-II至IGF-IR之結合的 特性。 ’’抗體片斷’’亦包括該等片斷：其本身不能夠提供效應功 能（ADCC/CDC)但是在與（多個）合適抗體恒定區域組合之 94026.doc -13- 1290147 後以根據本發明之方式提供該功能。 文中所用術語”單株抗體，，或，，單株抗體組合物，，係指單一 胺基酸組合物之抗體分子的製備物。因此，術語，，人類單株 抗體’f係指展示出單一結合特異性之抗體，其具有衍生自人 類種系免疫球蛋白序列之可變區及恒定區。在一實施例 中，該等人類單株抗體係藉由包含自轉基因非人類動物（例 如轉基因小鼠）獲得之B細胞的雜交瘤來產生，其具有融合 至永生、，’田胞的包含人類重鏈轉基因（transgene)及人類輕鏈 轉基因之基因組。 術#”嵌合抗體”係指包含自一種來源或物種之可變區 (即，結合區）及衍生自不同來源或物種的至少部分之恒定區 的單株抗體，其通常藉由重組DNA技術來製備。包含鼠科 可變區及人類恒定區的嵌合抗體尤其較佳。該等鼠科/人類 後合抗體係經表達的免疫球蛋白基因之產物，該等基因包 含對鼠科免疫球蛋白可變區編碼之DN A片斷及對人類免疫 球蛋白恒定區編碼之DNA片斷。本發明所包括之其它形式 的肷合抗體’’為其中自原始抗體已修飾或改變該類別或亞 類的抗體。該等π嵌合抗體”亦被稱為”類別轉換抗體”。用於 產生喪合抗體之方法包括習知的重組DNA及目前在所屬技 術中衆人熟知之基因轉染技術。參看，例如，Morrison，s.L. 等人，Proc· Natl· Acad Sci· USA 81 (1984) 6851-6855 ;美 國專利第 5,202,238 及 5,204,244 號。 術語π人源化之抗體，，係指其中框架或，》互補決定區"（cdr) 已被修飾以包含與母體免疫球蛋白相比不同特異性之免疫 94026.doc -14- 1290147 球蛋白的CDR之抗體。在一較佳實施例中，將鼠科CDR移 植入人類抗體之框架區以製備”人源化之抗體”。參看，例 如，Riechmann，L.等人，Nature 332(1988)323-327 ;及 Neuberger，M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。尤其較佳 之CDR對應於表示辨認以上對於嵌合及雙功能抗體所指出 之抗原的序列之CDR。 文中所用術語”人類抗體π旨在包括具有衍生自人類種系 免疫球蛋白序列之可變區及恒定區的抗體。可變重鏈較佳 衍生自種系序列DP-50(GenBank L06618)且可變輕鏈較佳 衍生自種系序列L6(GenBank X01668)。該抗體之恒定區係 人類IgGl類型之恒定區。該等區可為異型且由（例如） Johnson，G.及 Wu，T.T·，Nucleic Acids Res. 28(2000)214-218 及其引用之資料庫描述，並係有用的，只要保留了根據本 發明誘發ADCC及較佳為CDC的特性。 文中所用術語”重組的人類抗體"旨在包括藉由重組手段 製備的、表達的、創造的或單離的所有人類抗體，例如自 諸如SP2_0、NS0或CHO細胞之宿主細胞或自轉基因為人類 免疫球蛋白基因之動物（例如小鼠）所單離的抗體，或者使用 經轉染成宿主細胞之重組表達載體所表達的抗體。該等重 組的人類抗體具有衍生自呈重新排列之形式的人類種系免 疫球蛋白序列之可變區及恒定區。根據本發明之重組人類 抗體已在活體内經受了體細胞超突變（somatic hypermutation)。因此，該等重組抗體之VH及VL區的胺基 酸序列儘管衍生自人類種系VH及VL序列並與其有關，但可 94026.doc -15- 1290147 非天然存在於活體内人類抗體種系抗體庫（repertoire)之 内。 文中所用術語”結合”係指以約1〇-13至1(T8 m(kd)較佳約 1〇-13至10_9M之親合力結合至IGF-IR的抗體。 文中所用術語”核酸分子”旨在包括DNA分子及RNA分 子。核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。 ”恒定區域”不直接涉及抗體至抗原之結合但涉及效應功 能（ADCC、補體結合及CDC)。根據本發明抗體之恒定區域 係 IgGl 類型。Kabat 等人，Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)，及 Brtiggemann，M·，等人，J· Exp· Med. 166 (1987) 1351-1361; Love，T.W·等人，Methods Enzymol· 178(1989)5 15-527詳細 描述了具有該等特徵之人類恒定區域。實例顯示於SEQ ID NOS:5至8中。其它可用及較佳之恒定區域係獲自為本發明 而保存在DSMZ中之雜交瘤細胞系的抗體之恒定區域。可用 於本發明之恒定區域提供補體結合。可變區域及恒定區域 之組合提供ADCC及視情況為CDC。 文中所用術語”可變區”（輕鏈可變區（VL)，重鏈可變區 (VH))表示直接涉及抗體至抗原之結合的輕鏈及重鏈對的 每一個。可變的人類輕鏈及重鏈之該等區域具有相同的總 體結構且每個區域包含四個框架（FR)區，該等框架區之序 • 列被三個f’超可變區’’（或互補決定區，CDR)廣泛保護、鏈 接。該等框架區採取/5片層構型及該等CDR可形成鏈接該沒 94026-doc -16 - 1290147 片層結構之環。在每個鏈中之CDR經由該等框架區以其立 體結構被固定並與來自其它鏈之CDR—起形成抗原結合位 點。該等抗體重鏈及輕鏈CDR3區在根據本發明抗體之結合 特異性/親合力方面發揮尤其重要的作用且因此提供本發 明之另一目標。 文中所用術語”超可變區”或”抗體之抗原結合部分”係指 對抗原結合起作用之抗原的胺基酸殘基。該超可變區包含 來自”互補決定區”或"CDR”之胺基酸殘基。π框架”區或"FR” 區係除如文中所定義之超可變區殘基外之可變域區。因 此，抗體之輕鏈及重鏈自N末端至C末端包含區域FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。尤其是，該重鏈 之CDR3係對抗原結合貢獻最多的區。根據Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版. Public Health Service， National Institutes of Health， Bethesda，MD.(1991))之標準定義及/或來自於n超可變環" 之殘基來測定CDR及FR區。 文中所用術語π結合至IGF-IR”意謂在活體外分析中抗原 至IGF-IR之結合，尤其是在該抗體結合至表面之結合分析 中，且藉由表面電漿共振（SPR)來量測IGF-IR之結合。結合 意謂1(Τ8 Μ或小於1(Γ8 Μ較佳為10_13至1(Γ9 Μ之結合親合力 (KD)。 可藉由 BIAcore 分析（Pharmacia Biosensor AB，烏普薩 拉，瑞典）研究至IGF-IR之結合。藉由術語ka(來自於抗體/ 抗原錯合物之抗體的缔合速率常數）、kd(解離常數）及 94026.doc •17- 1290147 KD(kd/ka)來定義該結合之親合力。根據本發明之抗體顯示 出 1(T1G Μ或小於 1〇·1() Μ的 KD。 根據本發明之抗體亦抑制IGF-I及IGF-II至IGF-IR之結 合。該抑制可作為在對於IGF-I/IGF-II至腫瘤細胞上至 IGF-IR之結合的分析中的IC5〇來量測。該分析在實例7中有 所描述。在該分析中，於不增加或增加該抗體濃度之情況 下，量測結合至在該等腫瘤細胞（例如HT29)表面所提供的 IGF-IR之經放射性同位素示蹤之IGF-I或IGF-II或其IGF-IR 結合片斷的量。用於IGF-I及IGF-II至IGF-IR之結合的根據 本發明之抗體的IC5〇值不大於2 nM且IGF-I/IGF-II至IGF-IR 之結合的IC5Q值之比率為約1:3至3:1。IC5G值作為至少三次 獨立量測之平均值或中間值來量測。單個IC50值可能超出該 範圍。 文中所用術語，，抑制IGF-I及IGF-II至IGF-IR之結合π係指 在活體外分析中抑制經I125示蹤之IGF-I或IGF-II至呈現在 腫瘤細胞（較佳為ΗΤ29細胞）表面上之IGF-IR的結合。抑制 意謂2 ηΜ或低於2 ηΜ之IC5G值。 術語，’IGF-IR表達細胞”係指過度表達IGF-I受體至每個細 胞約至少20,000個受體之該等細胞。該等細胞為（例如）：諸 如NCI H322M、3T3或HT29之腫瘤細胞系，或在對IGF-IR 以表達載體轉染之後過度表達IGF-IR之細胞系。根據 Lammers等人，EMBOJ，8(1989)1369-1375來量測每個細胞 之受體的量。 術語"IGF-IR磷酸化之抑制”係指當與不存在該抗體之細 94026.doc -18- 1290147 胞磷酸化分析相比時，在含有0.5%經熱鈍化之胎牛血清 (FCS)的培養基中為每個細胞（較佳為3T3細胞）提供400,000 至600,000個分子IGF-IR的細胞磷酸化分析。可使用對經酪 胺酸磷酸化之蛋白質特異的抗體藉由西方墨點法（Western blotting)偵測磷酸化作用。該分析在實例11中有所描述。藉 由短期加熱至攝氏56度執行FCS之熱鈍化以用於鈍化補體 系統。 術語npkB磷酸化之抑制”係指當與不存在該抗體之細胞 磷酸化分析相比時，在含有0.5%經熱鈍化之胎牛血清（FCS) 之培養基中為每個細胞（較佳為3T3細胞）提供400,000至 600,000個分子IGF-IR的細胞填酉复化分析。使用對在pkB(Akt 1，Swiss Prot Acc.編號：P31749)之絲胺酸473處構酸化的 pkB特異之抗體藉由西方墨點法偵測磷酸化作用。該分析在 實例11中有所描述。 術語’’依賴抗體的細胞之細胞毒性（ADCC)”係指在效應細 胞存在下藉由根據本發明之抗體溶解（lysis)人類腫瘤目標 細胞。較佳係藉由在效應細胞（例如新近自白血球層（buffy coat)單離之PBMC或純化效應細胞，如單核細胞或NK細胞） 存在下以根據本發明之抗體治療IGF-IR表達細胞之製備物 來量測ADCC。若該抗體在100 nM之濃度下在24小時後誘發 該等腫瘤細胞之20%或20%以上的溶解（細胞死亡），則斷定 為ADCC。若斷定ADCC在4小時比在24小時更顯著，則在4 小時時進行量測。較佳以經51Cr或Ειχ示蹤之腫瘤細胞及特 定釋放的51Cr或Eu之量測來執行該分析。對照物包括培育 94026.doc -19- 1290147 具有效應細胞但不具有該抗體的腫瘤目標細胞。 術語”依賴補體的細胞毒性（CDC)”係指在補體存在之下 藉由根據本發明之抗體溶解人類腫瘤目標細胞。較佳係藉 由在補體存在下以根據本發明之抗體治療IGF-IR表達細胞 之製備物來量測CDC。若該抗體在100 nM之濃度下在4小時 後誘發該等腫瘤細胞之20%或20%以上之溶解（細胞死 亡），則斷定為CDC。較佳以51Cr或Eu示蹤之腫瘤細胞及特 定釋放的51Cr或Eu之量測來執行該分析。對照物包括培育 具有效應細胞但不具有該抗體的腫瘤目標細胞。 術語’’IGF-I介導之訊息轉導的完全抑制”係指IGF-IR之 IGF_I介導的磷酸化之抑制。對於該分析，以IGF-I刺激並以 根據本發明之抗體（可用5 nM或高於5 nM濃度之抗體）治療 IGF-IR表達細胞，較佳為H322M細胞。其後，執行SDS PAGE 並以對經磷酸化之酪胺酸特異的抗體藉由西方點墨分析法 量測IGF-IR之磷酸化作用。若在西方墨點上明顯沒有帶可 被偵測（其係指經磷酸化之IGF-IR)，則斷定該訊息轉導之完 全抑制。 根據本發明之抗體顯示出至與抗體18相同之IGF-IR抗原 決定部位的結合或者由於抗體18之結合位阻而在結合至 IGF-IR中受到抑制。可使用固定之抗體18及20-50 nM濃度 之IGF-IR及100 nM濃度之待偵測抗體藉由SPR分析來偵測 結合抑制。50%或50%以上之訊息減少表明：該抗體與抗體 ^ 18進行競爭。藉由使用抗體22作為固定抗體以相同方式執 行該分析。 94026.doc -20- 1290147 術語”抗原決定部位”（epitope)意謂能夠特異結合至抗體 的蛋白質決定子。抗原決定部位通常由諸如胺基酸或糖側 鏈之分子的化學活性表面基團組成且通常具有特定之立體 結構特徵以及特定之電荷特徵。可區分構象 (Conformational)抗原決定部位與非構象抗原決定部位，因 為在變性溶劑存在下損失至前者之結合但不損失至後者之 結合。 根據本發明之抗體另外包括具有"保守序列修飾”、核苷 酸及胺基酸序列修飾之抗體，該等修飾不影響或不改變本 發明抗體之上述特徵。可藉由所屬技術中已知之標準技術 引入修飾，例如定位突變發生或PCR介導之突變發生。保 守胺基酸取代基包括其中以具有相似側鏈之胺基酸殘基置 換該胺基酸殘基的取代基。在所屬技術中已經定義了具有 相似側鏈的胺基酸殘基之家族。該等家族包括具有以下側 鏈之胺基酸：鹼性側鏈（例如賴胺酸、精胺酸、組胺酸），酸 性側鏈（例如天門冬胺酸、穀胺酸），不帶電的極性側鏈（例 如甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺 酸、半胱胺酸、色胺酸），非極性側鏈（例如丙胺酸、纈胺酸、 亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、***酸、蛋胺酸），卢分枝 側鏈（例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸）及芳族側鏈（例如酪 胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸）。因此，較佳可以來自 於相同側鏈家族之另一胺基酸殘基來置換人類抗ZGFjr抗 體中經預測之次要胺基酸殘基。 可藉由如 Riechmann，L_ 等人，Nature 332(1988)323-327 94026.doc -21 - 1290147 及Queen，C·等人，Proc· Natl· Acad· Sci. USA 86 (1989) 10029-10033所述基於分子模型之突變發生來執行胺基酸 取代。 在本發明之較佳實施例中，根據本發明之抗體之另外特 徵包括選自由以下特徵組成之群的一個或多個特徵：結合 參數ka、kd及KD，結合至與抗體18及22所結合之相同的抗 原決定部位，抑制IGF-I及IGF-II至腫瘤細胞上之IGF-IR的 結合之IC5〇值，及在腫瘤細胞中於IGF-I之刺激的基礎上抑 制IGF-IR之磷酸化的IC5〇值。IGF-IR之磷酸化的抑制導致下 游元件（例如pkB)之磷酸化抑制，腫瘤細胞中IGF-IR之下 調，及影響活體外腫瘤細胞之立體生長。該等抗體之另外 較佳特徵在於其藥物代謝動力學及藥物動力學價值，及對 其它物種之交叉反應性。 根據本發明之抗體抑制酪胺酸之IGF-IR磷酸化且較佳亦 在相似程度上抑制酿胺酸之pkB鱗酸化。 根據本發明之抗體較佳下調在腫瘤細胞及腫瘤（例如異 種移植腫瘤）中的IGF-IR蛋白質含量。 根據本發明之抗體较佳抑制在集落形成分析中腫瘤細胞 之立體生長以及IGF-IR表達細胞（例如NIH 3T3細胞）之增 殖。 在使用200 nmol/1濃度之抗體於胰島素受體過度表達3T3 細胞上進行的結合競爭分析中，根據本發明之抗體較佳不 抑制胰島素至胰島素受體之結合。 根據本發明之抗體較佳藉由重組手段產生。該等方法在 94026.doc -22- 1290147 所屬技術中衆所周知且包括在原核及真核細胞中之蛋白質 表達，隨後單離該抗體多肽並通常純化至醫藥上可接受之 純度。為了蛋白質表達，藉由標準方法將對輕鏈及重鏈編 碼的核酸或其片斷***表達載體。表達係在適當之原核或 真核宿主細胞中執行，如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、 HEK293細胞、COS細胞、酵母或E.coli細胞，並自該等細 胞（上清液或溶解後的細胞）回收該抗體。 抗體之重組產物在所屬技術中衆所熟知並（例如）在 Makrides, S.C.5 Protein Expr. Purif. 17(1999)183-202 ； Geisse，S·等人，Protein Expr. Purif. 8(1996)271-282 ; Kaufman，R.J·，Mol. Biotechnol· 16(2000)151-161 ; Werner， R.G.，Drug Res. 48( 1998)870-880之評論文章中有所描述。 該等抗體可以完整細胞、以細胞溶解產物或以經部分純 化或大致上純的形式存在。藉由包括鹼性/SDS處理、CsCl 顯帶（CsCl banding)、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及所屬技 術中熟知之其它方法之標準技術來執行純化以除去其它分 子組份或其它污染物，例如，其它分子核酸或蛋白質。參 看 Ausubel，F.等人編。Current Protocols in Molecular

Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 〇 例如 Barnes，L.M.等人，Cytotechnology 32(2000) 109-123 ;及 Barnes，L.M.等人，Biotech· Bioeng. 73(2001)261-270描述了在NS0細胞中之表達。例如Durocher， Υ·等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9描述 了短暫表達 94026.doc -23· 1290147 (Transient expression) ° Orlandi，R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter，P.等人，Proc· Natl. Acad· Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ;及 Norderhaug，L·等 人，J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87描述了可變區域 之選殖。Schlaeger， E._J·及 Christensen， K·， in Cytotechnology 30(1999)71-83 及 Schlaeger，E，J·，in J· Immunol. Methods 194(1996)191-199 描述了 一較佳之短暫 表達系統（HEK 293)。 適合於原核生物之對照序列（例如）包括啓動子、視情況之 操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞以利用啓動 子、增強子及聚腺苷醯化訊息。 當將核酸放入與另一核酸序列之功能關係中時，其被”可 操作性地鏈接”。舉例而言，若用於前序列或分泌前導之 DNA被表達為參與多肽分泌的前蛋白質，則其可操作性地 鏈接至用於該多肽之DNA ;若啓動子或增強子影響譯碼序 列之轉錄，則其可操作性地鏈接至該序列；或者若安置核 糖體結合位點以促進翻譯，則其可操作性地鏈接至譯碼序 列。一般而言，"可操作性地鏈接”意謂：所鏈接之DNA序 列係鄰接的且在分泌前導情況下係鄰接的且處於閱讀框架 中。但是，增強子沒必要鄰接。藉由於便利限制位點之接 合作用（ligation)完成鏈接。若該等位點不存在，則根據習 知規範使用該等合成之寡核苷酸接合物（adaptor)或鏈接物 (linker) 〇 藉由習知免疫球蛋白純化程序自該培養基中合適地分離 94026.doc -24- 1290147 該等單株抗體，該等程序諸如（舉例而言）：蛋白質a瘦脂糖 凝膠、經麟灰石層析法、凝膠電泳、透析或親合層析法。 使用習知程序容易地單離且定序對該等單株抗體編碼之 DNA及RNA。該等雜交瘤細胞可充當該dna& rna之來 源。該DNA-旦得以單離，則可將其插人表達載體，接著 將表達載體轉染至不另外產生免疫球蛋白（immun〇gl〇buiin protein)之宿主細胞（例如HEK 293細胞、CH〇細胞或骨髓瘤 細胞）以在該等宿主細胞中獲得重組之單株抗體的綜合物 (synthesis) 〇 藉由將適當核苷酸變化引入人類IGF_IR抗體dna或藉由 肽合成法製備該抗體之胺基酸序列變異體。但是僅在極有 限之範圍内（例如，如上所述）可執行該等修飾。舉例而言， 該等修飾不改變上述之抗體特徵（例如IgG同種型及抗原決 定部位結合），但可提高重組產物之產量、蛋白質穩定性或 促進純化。 通常亦可以絲胺酸取代未涉及保持該抗IGF_IR抗體之適 當構象的任何半胱胺酸殘基來提高該分子之氧化穩定性並 防止異常交聯。相反而言，可將（多個）半胱胺酸鍵添加至該 抗體以提高其穩定性（尤其是若該抗體為諸如Fv片斷之抗 體片斷時）。 該抗體之另一類型胺基酸變異體改變該抗體之原始糖基 化作用模式。改變意謂：消除在該抗體中所發現之一個或 多個碳水化合物部分，及/或添加在該抗體中不存在的一個 或多個糖基化作用位點。抗體之糖基化作用通常為N鏈接。 94026.doc -25- 1290147 N鏈接係指該碳水化合物部分至天冬醯胺殘基之側鏈的附 著。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸（其 中X為除脯胺酸外之任何胺基酸）係用於該碳水化合物部分 至該天冬胺酸側鏈之酶促附著的識別序列。因此，在多肽 中該等三肽序列中任一個之存在造成可能的糖基化作用位 點。藉由改變胺基酸序列使得其含有一個或多個上述三肽 序列（用於N鏈接之糖基化作用位點）來方便地完成對該抗 體的糖基化作用位點之增加。 藉由所屬技術中已知之各種方法製備對抗IGF-IR抗體之 胺基酸序列變異體的核酸編碼分子。該等方法包括（但不限 於）：自天然來源（在自然發生胺基酸序列變異體情況下）單 離或經早期製備之人源化抗IGF-IR抗體的變異體或非變異 體形式之寡核苷酸介導的（或定位的）突變發生、PCR突變發 生及盒式突變發生製備。 本發明亦關於免疫共軛體，其包含共軛至細胞毒素劑（例 如，化學治療劑）、毒素（例如，細菌、真菌、植物或動物來 源之酶促活性毒素或其片斷）、放射線同位素（即，射線共軛 體）或細胞毒素劑之前藥的本發明之抗體。上面已描述了用 於生成該等免疫共軛體之試劑。可用之酶促活性毒素及其 片斷包括：白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片斷、外毒素 A鏈（來自綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒A 鏈、相思豆毒素（abrin)A鏈、莫迪素（modeccin)A鏈、α -次 黃σ票呤（a -sarcin)、油桐（Aleuritesfordii)蛋白、康乃馨 (dianthin)蛋白、洋商陸（Phytolaca americana)蛋白（PAPI、 94026.doc -26- 1290147 PAPII、及PAP-S)、苦瓜（momordica charantia)抑制劑、麻 楓樹蛋白（curcin)、巴豆毒素（crotin)、肥皂草（sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白（gelonin)、有絲***素 (mitogellin)、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素 (tricothecene) 〇 使用各種雙功能蛋白偶合劑製備該抗體與細胞毒素劑之 共軛體，該等偶合劑例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫 醇）丙酸酷（SPDP)、亞胺硫煉（iminothiolane)(IT)、驢亞胺酉旨 之雙功能衍生物；（例如二甲基己二醯亞胺酯HCL)、活性酯 (例如，辛二酸二琥 ίό 醯亞胺酯（disuccinimidyl suberate))、 醛（例如，戊二醛）、雙疊氮化合物（例如雙（對-疊氮苯甲醯 基）己二胺）、雙-重氮衍生物（例如雙·（對-重氮苯甲醯基）-乙 二胺）、二異氰酸酯（例如，2,6-二異氰酸曱苯）及雙活性氟化 合物（例如1，5-二氟-2,4-二硝基苯）。舉例而言，可如Vitetta， E.S·等人，Science 238(1987)(1098-1104)所述來製備蓖麻毒 免疫毒素。經碳14示蹤之1-異硫氰酸苄基-3-甲基二伸乙基 三胺五乙酸（MX-DTPA)係用於放射性核苷酸至抗體之共軛 的典型螯合劑。參看WO 94/11026。 另一類型之共價修飾涉及以化學方法或酶促方法將糖苷 偶合至該抗體。該等程序具有優勢，因為其不需要在宿主 細胞中產生具有糖基化作用能力之抗體以用於N或Ο鏈接 的糖基化作用。依所用偶合方式而定，可將該（該等）糖附著 至（a)精胺酸及組胺酸，（b)游離羧基，（c)游離硫氫基，例如 半胱胺酸之游離硫氫基，（d)游離羥基，例如絲胺酸、蘇胺 94026.doc -27- 1290147 酸或羥脯胺酸之游離羥基，（e)芳族殘基，例如***酸、 酪胺酸或色胺酸之芳族殘基，或（0穀胺醯胺之醯胺基。在 WO 87/05330 及在 Aplin，J.D.及 Wriston，J.C· Jr·，CRC Crit· Rev. Bio chem. (1981) 259-306 中描述 了該等方法。 可以化學方法或酶促方法完成存在於該抗體上之任何碳 水化合物部分的移除。化學去糖基化作用需要將該抗體曝 露於化合物三敦甲烧績酸或等效化合物之下。該治療導致 大部分糖或除鏈接糖（linking sugar)(N·乙醯葡萄糖胺或N-乙醯半乳糖胺）外之所有糖的***，同時保留該抗體完好。 Sojahr，H.T.及 Bahl，0·Ρ·，Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57及 Edge，A.S·等人 Anal· Biochem· 118 (1981) 13 1-137描述了化學去糠基化作用。可藉由如丁11〇131〇11^，>1.11· 及 Bahl，0·Ρ·，Meth· Enzymol· 138 (1987) 350-359 所述使用 多種内糖苷酶或外糖苷酶完成抗體上之碳水化合物部分的 酶促***。 該抗體之另一類型共價修飾包括：以美國專利第 4,640,835號、第 4,496,689號、第 4,301，144號、第 4,670,417 號、第4,791，192號或第4，179,337號中所提出之方式將該抗 體鏈接至各種非蛋白聚合物中的一種，例如’聚乙二醇、 聚丙二醇或聚烷二醇（P〇ly〇xyalkylene)。 在另一態樣中，本發明提供了自轉基因非人類動物（例如 轉基因小鼠）單離之B細胞，其表達根據本發明之人類抗 IGF-IR抗體。該等經單離之B細胞較佳係獲自轉基因非人類 動物（例如轉基因小鼠），該動物已以1GF-IR抗原及/或表達 94026.doc -28 - 1290147 IGF-IR之細胞的經純化或濃縮之製備物進行免疫。該轉基 因非人類動物（例如轉基因小鼠）較佳具有包含對本發明抗 體的全部或一部分進行編碼的人類重鏈轉基因及人類輕鏈 轉基因的基因組。然後使該等單離之B細胞永生以提供人類 抗IGF-IR抗體之來源（例如，雜交瘤）。因此，本發明亦提供 一種能夠產生根據本發明之人類單株抗體的雜交瘤。在一 實施例中，該雜交瘤包括獲自轉基因非人類動物（例如轉基 因小鼠）之B細胞，該動物具有包含對本發明抗體的全部或 一部分進行編碼的人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基 因組，該B細胞經融合至永生細胞。 在特定實施例中，該轉基因非人類動物係轉基因小鼠， 其具有包含對本發明抗體之全部或一部分進行編碼之人類 重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因的基因組。可以IGF-IR抗原 及/或表達IGF-IR之細胞的經純化或濃縮之製備物來使該 轉基因非人類動物免疫。該轉基因非人類動物（例如轉基因 小鼠）較佳能夠產生對於IGF-IR的IgGl同種型之人類單株 抗體。 可藉由以IGF-IR抗原及/或表達IGF-IR之細胞的經純化或 濃縮之製備物使轉基因非人類動物（例如轉基因小鼠）免疫 來產生根據本發明之人類單株抗體，其中該動物具有包含 對本發明抗體之全部或一部分進行編碼之人類重鏈轉基因 及人類輕鏈轉基因的基因組。然後獲得該動物之B細胞（例 如脾的B細胞）並使其與骨髓瘤細胞融合以形成分泌出針對 IGF-IR的人類單株抗體之永生雜交瘤細胞。 94026.doc -29- 1290147 在一較佳實施例中，可使用攜帶了部分之人類免疫系統 而不是小鼠系統的轉基因小鼠生成針對igf_ir之人類單株 抗體。文中稱為’’HuMAb"小鼠之該等轉基因小鼠含有人類 免疫球蛋白基因微型基因座（miniloci)，其對未重新排列之 人類免疫球蛋白基因進行編碼，該等基因包含重鏈及T) 及/C輕鏈（恒定區基因），連同鈍化内生//及/C鏈位置 (Lonberg，N·等人，Nature 368 (1994) 856-859)之目標突 變。因此，該等小鼠展示出小鼠IgM或K之減少的表達，且 回應於免疫反應，該等所引入之人類重鏈及輕鏈轉基因經 受了類別轉換及體細胞突變以生成高親合力人類IgG單株 抗體（Lonberg，N·等人，Nature 368 (1994) 856-859 ;在 Lonberg, N·，Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101 中有所評述；Lonberg，Ν·及 Huszar，D·，Intern· Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93;及 Harding，F_ 及 Lonberg，N·， Ann· N. Acad· Sci 764 (1995) 536-546)。在 Taylor，L·等人， Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295 ; Chen，J.等 人，International Immunology 5 (1993) 647-656; Tuaillon，N. 等人，Proc. Natl· Acad. Sci USA 90 (1993) 3720-3724; Choi， Τ·Κ·等人，Nature Genetics 4 (1993) 117-123 ; Chen，J.等人， EMBO J. 12 (1993) 821-830; Tuaillon，Ν·等人，Immunol· 152 (1994) 2912-2920; Lonberg，N.等人，Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg， N·， Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Taylor，L.等人，Int. Immunol. 6 (1994) 579-591; Lonberg，N.及 Huszar，D·，Intern· 94026.doc -30- 1290147

Rev. Immunol· 25 (1995) 65-93 ; Harding，F·及Lonberg，N·， Ann. N. Acad· Sci 764 (1995) 536-546; Fishwild，D.M·等 人，Nat· Biotechnol· 14 (1996) 845-851(所有文章之全文以 引用的方式併入本文）中描述了 HuMAb小鼠之製備。另外參 看，美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625，126 號、第 5,633,425 號、第 5,789,650 號、第 5,877,397 號、第 5,661，016號、第 5,814,318號、第 5,874,299號、第 5,545,807 號、第 5,770,429 號；WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645及 WO 92/03918。

為生成對IGF-IR的完全人類單株抗體，可依據普通方法 如 Lonberg，N.等人，Nature 368 (1994) 856-859 ; Fishwild， D.M.等人，Nat. Biotechnol· 14 (1996) 845-851 及 WO 98/24884所述，以IGF-IR抗原及/或表達IGF-IR之細胞的經 純化或濃縮之製備物來使HuMAb小鼠免疫。在第一次免疫 時該等小鼠較佳為6-16週齡。舉例而言，可使用可溶解之 IGF-IR抗原的經純化或濃縮之製備物（例如自表達IGF-IR 之細胞純化）經腹膜内使該等HuM Ab小鼠免疫。在使用 IGF-IR抗原之經純化或經濃縮之製備物免疫不導致抗體的 情況下，亦可以表達IGF-IR之細胞（例如腫瘤細胞系）使小鼠 免疫以促進免疫反應。以各種抗原之累積經驗顯示：當起 初以處在弗氏完全佐劑（complete Freund’s adjuvant)中之抗 原經腹膜内（i.p.)免疫，繼而以處在弗氏不完全佐劑中之抗 原每隔一週經腹膜内免疫（例如，達到總數6)時，該等 HuMAb轉基因小鼠反應最好。在以藉由後眼窩出血所獲得 94026.doc -31 - 1290147 之血漿樣品進行的免疫方案之整個過程中可監視該免疫反 應。可藉由ELISA篩選該血漿，並可將具有足夠滴定度之 抗IGF-IR人類免疫球蛋白的小鼠用於相應B細胞之永生 化。在小鼠犧牲及除去脾及淋巴結3至4天之前，可以抗原 經靜脈激發（boost)小鼠。吾人預期：可能需要對每種抗原 執行2-3次融合。對於每種抗原而言，均使幾隻小鼠免疫。 舉例而言，可免疫總共12只HuMAb小鼠之HCo7及HCo 12菌 株。 該等HCo7小鼠具有：在其内生輕鏈（/c )基因中之JKD破 壞（如在 Chen，J·等人，EMBO J_ 12 (1993) 821_830 中所述）， 在其内生重鏈基因中之CMD破壞（如在WO 01/14424之實例 1中所述），KCo5人類/c輕鏈轉基因（如在Fishwild，D.M.等 人，Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 中所述），及 HCo7 人類重鏈轉基因（如在美國專利第5,770,429號中所述）。 該等HCo 12小鼠具有：在其内生輕鏈（/c )基因中之JKD 破壞（如在 Chen，J·等人，EMBO J· 12(1993)821-830 中所 述），在其内生重鏈基因中之CMD破壞（如在WO 01/14424之 實例1中所述），KCo5人類/c輕鏈轉基因（如在Fishwild，D.M· 等人，Nat· Biotechnol· 14 (1996) 845-851 中所述），及 HCol2 人類重鏈轉基因（如在WO 01/14424之實例2中所述）。 可單離該小鼠淋巴細胞並在標準方案基礎上使用PEG使 其與小鼠骨髓瘤細胞系相融合生成雜交瘤。然後篩選該等 所得雜交瘤以用於產生抗原特異之抗體。舉例而言，將來 自於免疫小鼠之脾及淋巴結衍生的淋巴細胞之單個細胞懸 94026.doc -32- 1290147 浮液融合至具有50% PEG之SP 2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞 (ATC C ’ C RL 1581)數目之六分之一。將細胞以大約2xl〇5 沈積（plate)在平底微量滴定盤中，繼而在選擇培養基中培 育約兩週。 然後藉由ELISA篩選個體孔以用於人類抗IGF-IR單株 IgM及IgG抗體。一旦發生大量的雜交瘤生長，則分析培養 基，此通常在10-14天之後。再沈積（replate)、再次筛選該 等抗體分泌之雜交瘤，且若仍然對人類IgG(抗IGF-IR單株 抗體）呈陽性，則可藉由極限稀釋法進行次選殖至少兩次。 然後在活體外培養該等穩定的次選殖體以在組織培養基中 產生抗體用於特徵化。 因為CDR序列負責抗體-抗原相互作用，因此可能藉由在 來自於不同人類抗體之框架序列上構建包含根據本發明之 CDR序列的表達載體來根據本發明表達重組抗體（參看，例 如，Riechmann，L.等人，Nature 332 (1998) 323-327 ; Jones， Ρ·等人，Nature 321 (1986) 522-525 ;及 Queen，C·等人，Proc· Natl. Acad· See· U.S·A. 86 (1989) 10029-1003 3)。該等框架 序列可獲自包括種系人類抗體基因序列的公共DNA數據 庫。該等種系序列會不同於成熟抗體基因序列，因為其不 會包括完全經組合之可變基因，該等可變基因係在B細胞成 熟期間藉由V(D)J連接（joining)而形成。種系基因序列亦會 不同於以個體平均地橫跨該可變區之高親合力第二抗體庫 (repertoire)抗體之序列。 本發明較佳包括對結合至IGF-IR之多肽編碼的核酸片 94026.doc -33- 1290147 斷，其中該多肽抑制IGF-Ι及IGF-ΙΙ至IGF-IR之結合，該核 酸片斷選自由以下各鏈組成之群： a) 包含 SEQ ID N0:1 或 3之 CDRl(aa 31-35)、CDR2(aa 50-66) 及CDR3(aa 99-107)作為CDR的抗體重鏈； b) 包含 SEQ ID NO:2 或 4之 CDRl(aa 24-34)、CDR2(aa 50-56) 及CDR3(aa 89-98)作為CDR的抗體輕鏈。 將該等再構建之重鏈及輕鏈可變區與啓動子、翻譯起 始、恒定區、3’未翻譯、聚醯苷化、及轉錄終止之序列相組 合以形成表達載體構型。可將該等重鏈及輕鏈表達構型組 合至單個載體，共轉染、連續轉染或分別轉染至宿主細胞， 接著將該等宿主細胞進行融合以形成表達兩種鏈之單個宿 主細胞。 因此，本發明提供一種用於產生根據本發明之重組人類 抗體之方法，其特徵在於表達對以下各鏈編碼之核酸： a) 包含 SEQ ID NOH 或 3之 CDRl(aa 31-35)、CDR2(aa 50-66) 及CDR3(aa99_107)作為CDR的抗體重鏈； b) 包含 SEQ ID NO:2 或 4之 CDRl(aa 24-34)、CDR2(aa 50-56) 及CDR3(aa 89-98)作為CDR的抗體輕鏈。 本發明另外包括根據本發明之抗體用途，其較佳藉由免 疫學分析法測定IGF-IR樣品與本發明抗體之間之結合而用 於活體外IGF-IR的診斷。 在另一態樣中，本發明提供一種組合物（例如醫藥組合 物），其含有人類單株抗體之一種或人類單株抗體之組合， 或本發明人類單株抗體之抗原結合部分，該等抗體與醫藥 94026.doc -34- 1290147 上可接受的載劑一起調配。 本發明之醫藥組合物亦可以組合療法（即，與其它試劑組 合）進行施用。舉例而言，該組合療法可包括具有至少一種 抗腫瘤劑或其它的習知療法的本發明之組合物。 •’化學治療劑·’係可用於治療癌症之化學化合物。化學治 療劑之實例包括：亞德裏亞黴素（Adriamycin)、阿黴素 (Doxorubicin)、5-氟脲癌唆（5_Fluorouracil)、阿糠胞苷 (Cytosine arabinoside)("Ara-Cn)、環膦醯胺（Cyclophosphamide)、 嗟替派（Thiotepa)、克癌易（Taxotere)(多西他賽 (docetaxel))、白消安（Busulfan)、吉西他濱（Gemcitabine)、 細胞毒素（Cytoxin)、紅豆杉醇（Taxol)、氨曱蝶呤 (Methotrexate)、順氣氨鉑（Cisplatin)、苯丙酸氮芬 (Melphalan)、長春驗（Vinblastine)、博來黴素（Bleomycin)、 足葉乙甙（Etoposide)、異環膦醯胺（Ifosfamide)、絲裂黴素 C(Mitomycin C)、米托蒽 g昆（Mitoxantrone)、長春新驗 (Vincreistine)、長春瑞賓（Vinorelbine)、卡波始 (Carboplatin)、替尼泊甙（Teniposide)、道諾黴素 (Daunomycin)、洋紅黴素（Carminomycin)、胺嗓吟 (Aminopterin)、更生黴素（Dactinomycin)、絲裂黴素 (Mitomycin)、厄泊黴素（Esperamicin)(參看美國專利第 4,675，187號）、美法侖（Melphalan)及其它相關氮芥（nitr〇gen mustard) 〇 文中所用術語”細胞毒素劑π係指抑制或防礙細胞之功能 及/或引起細胞之破壞的物質。該術語旨在包括：放射性同 94026.doc -35- 1290147 位素、化學治療劑及諸如細菌、真菌、植物或動物來源之 酶促活性毒素或其片斷的毒素。 本申請案中所用術語"前藥”係指與母藥（parent drug)相 比對腫瘤細胞具有更小細胞毒性且能夠以酶促方法激活或 轉變成更具活性之母體形式的醫藥活性物質之前體或衍生 物形式。參看，例如，Wilman，’’Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14，第 375-382 頁，615th Meeting Belfast(1986)，及 Stella等人， ’’Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug

Delivery，’’ Directed Drug Delivery，Borchardt等人，（編），第 247-267頁，Humana Press(1985)。本發明之前藥包括（但不 限於）：含有磷酸鹽之前藥、含有硫代磷酸鹽之前藥、含有 硫酸鹽之前藥、含有肽之前藥、D胺基酸修飾之前藥、已糖 基化之前藥、/3-内醯胺環前藥、含有視情況經取代之苯氧 基乙醯胺之前藥或含有視情況經取代之苯乙醯胺之前藥、 5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine)及其它5-氟脲嘧啶核苷 (5-fluorouridine)前藥，其可轉變為更具活性細胞毒素的游 離藥物。可衍生為用於本發明之前藥形式的細胞毒素藥物 之實例包括（但不限於）上述化學治療劑。 文中所用術語”醫藥上可接受的載劑”包括：任何及所有 溶劑、分散介質、塗層、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收 延緩劑及生理學上可相容的類似試劑。該載劑較佳係適合 於經靜脈内、經肌肉内、經皮下、非經腸、經脊柱或經表 皮投藥（例如，藉由注射或灌輸（infusion))。 94026.doc -36- 1290147 ”醫藥上可接受的鹽”係指保留了該抗體之所要生物活性 且不給予任何非所要毒物學效應的鹽（參看，例如，Berge， S.M.等人，J· Pharm· Sci· 66 (1977) 1-19)。本發明包括了該 等鹽。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽 包括衍生自無毒無機酸之酸加成鹽，例如鹽酸鹽。 可藉由所屬技術中已知之各種方法施用本發明之組合 物。如熟悉此技術者所瞭解，該投藥路線及/或模式會依所 要結果而變化。 為藉由某些投藥路線施用本發明之化合物，可能需要塗 覆一種材料或將其與該化合物共投藥以防止該化合物失 活。舉例而言，可以適當載劑（例如，脂質體或稀釋劑)來將 該化合物投予受治療者。醫藥上可接受的稀釋劑包括鹽水 及水性缓衝溶液。 醫藥上可接受的載劑包括用於臨時製備無菌注射溶液或 分散液之無菌水溶液或分散液及無菌粉末。該等介質及試 劑用於醫藥活性物質之用途在所屬技術中係已知的。 經表 經硬 文中所用短語"腸外投藥"及”非經腸投藥，，意言胃除腸内及 局部投藥外通常藉由注射之投藥模式，且包括（但不限於）·· 經靜脈内、經肌肉0、經動脈内、經_、經囊内、經眶 内、經心内、經皮内、經腹膜内、經氣管、經皮下 皮下、經關節内、經囊下、經蛛網膜下、經脊柱内 膜外及經膜内注射及灌輸。 該等化合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、濕潤劑、乳化 劑及分散劑。可藉由前述之滅菌程序，及藉由各種抗細菌 94026.doc -37- 1290147 劑及抗真菌劑（例如，對祕苯甲酸則啊㈣、氯丁醇、 苯酚、山梨酸及類似物)之内含物來確保防止存在微生物。 亦可能f要將㈣劑（例如，糖、氣钱及類似物）包括於該 等組合物中。另外，可藉由延遲吸收之試劑内含物（例如單 更月曰酉夂銘及明I)來產生延長吸收之可注射的醫藥形式。 不考慮所選擇之投藥路線，可藉由熟悉此項技術者已知 之習知方法來將可以合適水合形式使用之本發明化合物及/ 或本發明之醫藥組合物調配成醫藥上可接受的劑型。 可改變該等活性成份在本發明醫藥組合物中之實際劑量 含量以獲得對達到適合於特殊患者、組合物及投藥^二: 對該患者無毒性之所要治療反應之有效量的活性成份。所 選擇之劑量含量將取決於各種藥物代謝動力學因素，其包 括·所用本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投 藥路線、投藥時間、所用特定化合物之***速率、治療持 、’’只日τ間、與所用特定組合物相組合使用之其它藥物、化人 物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、重量、狀況、全 身健康及先前病史，及在醫療技術中衆所熟知之類似因素。 該組合物必須無菌且呈流體以達到該組合物可藉由注射 器輸送之程度。除水之外，該載劑可為：等滲緩衝鹽水溶 液、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇及液態聚乙二醇及 類似物）及其適當之混合物。 例如，可藉由使用塗層（如卵磷脂）、藉由保持分散情況下 之所需粒子尺寸及藉由使用界面活性劑來保持合適的流動 性。在許多情況下，較佳為在該組合物中包括：等參劑， 94026.doc -38- 1290147 例如，糖；多元醇，例如甘露醇或山梨醇；及氯化鈉。可 藉由在組合物中包含延遲吸收之試劑（例如單硬脂酸紹或 明膠）來產生該可注射組合物之長期吸收。 提供以下實例、文獻、序列表及圖式以幫助理解本發明， 其真實範圍陳述在附加之申請專利範圍中。應瞭解，在不 偏離本發明精神之情況下，可修改所陳述之該等程序。 序列表之描述 SEQ ID NO: 1-4抗體18及22之輕及重可變區區域的核苷酸 及胺基序列 SEQIDNO:5及6人類恒定區區域之核苷酸及胺基序列 實例1 產生抗IGF-IR抗體的雜交瘤細胞系之生成 雜交瘤之培養 在於37°C及5% C02下補充了 2 mM L穀胺醯胺 (BioWhittaker)及 4% Origen Cloning Factor(Igen，法國）之雜 交瘤表達培養基（PAA Laboratories GmbH，奥地利）中培養 所生成的HuMAb雜交瘤。 轉基因小鼠之免疫程序 以lxlO6 NIH 3T3細胞（以適於IGF-IR之表達載體進行轉 染）及IGF-IR之20 /xg可溶的細胞外區域來交替免疫十隻 HCo7轉基因小鼠（4只雄性及6只雌性），菌株 GG2201 (Medarex，San Jos6, CA，美國）。總共執行 6次免疫， - 三次以IGF-IR表達細胞經腹膜内（IP)免疫及三次以重組蛋 白在尾巴底部經皮下（SC)免疫。對於第一次免疫，將100 μΐ 94026.doc -39- 1290147 之lxio6 NIH 3T3 IGF-IR細胞與100 μΐ弗氏完全佐劑（CFA; Difco Laboratories，Detroit，美國）相混合。對於所有其它 免疫，使用100 μΐ處在PBS中之細胞或者將重組蛋白與100 μΐ弗氏不完全佐劑（ICFA; Difco)相混合。

抗原特異ELISA 藉由抗原特異ELISA測定在免疫小鼠之血清中的抗 IGF-IR滴定度。以在PBS中1 Mg/ml之濃度將IGF-IR可溶細 胞外區域於4°C隔夜或於37°C兩小時塗覆至96孔盤。其後， 在室溫下以PBSTC(補充了 0.05% Tween®-20及2%小雞血清 (Gibco BRL)之PBS)阻塞該等孔1小時（h)。第一支管血清係 在PBSTC中稀釋1/50,所有其他支管之血清係在PBSTC中先 稀釋1/100並連續稀釋至1/6400。將經稀釋之血清添加至該 等孔中並於37°C培育1小時。將前支管血清用作陰性對照 物。將200 ng/ml山羊抗人類IGF_IR(100 jicg/ml)用作陽性對 照物。隨後，以PBST洗滌盤兩次且以辣根過氧化酶（horse radish peroxidase)(HRP)·共輛之老鼠抗人類 IgG F(ab’）2(DAKO)(已在 PBSTC 中稀釋 1/2000)於 37°C 培育 1 小 時。以PBST洗滌孔兩次且在暗處於室溫下（RT)以新近製備 之ABTS®溶液（1 mg/ml)(ABTS: 2,2’_連氮基雙（3-乙基苯幷 σ塞唾琳-6-績酸）顯影分析30分鐘。測定在405 nm處之吸光 度。 FACS分析 除藉由抗原特異ELISA測定之外，亦藉由FACS分析測定 了在免疫小鼠之血清中的抗IGF-IR滴定度。在4°C以經稀釋 94026.doc -40- 1290147 之血清培育NIH 3T3 IGF-IR細胞及該等未經轉染之NIH 3T3 IGF-IR細胞30分鐘。將前支管血清用作陰性對照物。 起初，將200 ng/ml山羊抗人類IGF-IR用作陽性對照物。以 補充了 1%牛血清蛋白及〇_〇1%疊氮化物之PBS洗滌細胞三 次。隨後，於4°C以在FACS緩衝液中稀釋1/100之老鼠抗人 類IgG的螢光素異硫氰酸酯（FITC)共軛之抗原結合片斷 (F(ab’）2片斷）培育細胞30分鐘。以FACS緩衝液洗滌細胞兩 次且在 FACSCalibur(Becton Dickinson，Erembodegem-Aalst，比利時）上分析樣品。 小鼠之激發（boosting) 當斷定抗IGF_IR之血清滴定度充足時，則在融合之前4及 3曰，經靜脈（i.v.)以處在200 μΐ PBS中之15 jug IGF-IR細胞 外區域額外激發小鼠兩次。 雜交瘤生成 犧牲小鼠並採集位於腹部主動脈及腔靜脈之側面的脾及 淋巴結。根據標準操作程序使脾細胞及淋巴結細胞與融合 夥伴（partner)SP 2·0細胞相融合。

/c -ELISA

執行/c -ELISA以測定由該融合所得之雜交瘤是否生成人 類抗體。藉由於4°C隔夜培育以在PBS中稀釋1/10000之老鼠 抗人類IgG /c-輕鏈抗體（DAKO)塗覆ELISA盤。在丟棄該等 孔之後，藉由在室溫下以PBSTC培育1小時來阻塞盤。其 後，以雜交瘤培養物上清液（以PBSTC稀釋1/2)培育孔。以 在PBSTC中稀釋1/2之培養基用作陰性對照物，以在PBSTC 94026.doc -41 - 1290147 中稀釋1/100之κ-輕鏈陽性小鼠血清充當陽性對照物。隨 後，洗滌孔三次並於37°c以在PBSTC中稀釋1/2000的HRP共 軛之老鼠抗人類IgG F(ab’）2(DAKO)培育1小時。洗滌孔三次 且在暗處於室溫（RT)下以新近製備之ABTS®溶液（1 mg/ml) 顯影分析30分鐘。在ELISA盤閱讀器中於405 nm處量測吸 光度。 製備了單株抗體18及22。 實例2 抗IGF-IR抗體至IGF_IR之親合力的測定

儀器： BIACORE® 3000 晶片· CM5 偶合： 胺偶合 緩衝液： HBS(HEPES，NaCl)，pH 7.4，25〇C 為親合力量測，將抗人類FCy抗體（來自兔子）偶合至該晶 片表面以用於呈現針對IGF-IR之抗體。以處於溶解狀態中 之各種濃度添加IGF-IR細胞外區域。藉由3分鐘之IGF-IR注 射量測締合；藉由以緩衝液洗滌該晶片表面5分鐘量測解 離。對於抗體18及22之親合力數據顯示於表1中。 表1 藉由SPR(BIACORE® 3000)量測之親合力數據 抗體 Ka(l/Ms) kd(l/s) Kd(M) 18 1.49x10^ 1.03X10'7 6.95xl0'13 22 1.47χ105 9·64χ1〇-5 6.56X10'10 實例3 腫瘤細胞之立體生長及IGF-I受體在細胞·細胞接觸處之過 94026.doc -42- 1290147 度表達（3D培養物） 材料及方法： 在光學等級玻璃載玻片上以低密度或超匯合 (superconfluent)於RPMI介質中培養NCI H322M細胞以研究 對IGF-IR表面表達之影響。同時，將單離自該對照組（未經 治療小鼠）之H322M異種移植組織驟冷凍於異戊烷中且在5 μιη厚處切割冰冷部分（kryosection)。使用小鼠抗IGF-IR單 株抗體（aIR3，5 jitg/ml)或根據本發明之抗體，繼而使用山 羊抗小鼠抗體或以Cy3(Amersham Biosciences，英國）或 Alexa Fluor® 488(Molecular Probes，Inc_，美國）標記之山羊 抗小鼠抗體來執行免疫螢光示縱。使樣品成像在Leica SP2 共焦顯微鏡上或者藉由FACS進行分析。 結果： 當藉由共焦顯微鏡來使以高密度培養之H322M細胞成像 時，明顯的是IGF-IR尤其聚集在細胞·細胞接觸位點處。若 與在活體内生長之H322M細胞（即，異種移植組織）相比，則 就表面IGF-I受體之有機體而言與在活體外經密集填裝之 培養物存在驚人的相似性。 · 亦藉由FACS量化了在H322M細胞之超匯合培養物中的 表面IGF-I受體之上調。當細胞在高密度條件下生長時，與 無顯著細胞-細胞接觸之低密度相比IGF-I受體表面表達辦 加了 10倍以上。 * 其它腫瘤細胞（例如，HT29、MDA231及MCF_7)顯示了相 似行為，此表明：在建立細胞-細胞接觸位點時處在細胞表 94026.doc -43- 1290147 面上之IGF-Ι受體的上調不是H322M細胞之獨有特點，而是 更多組織（如亦在活體内發現之有機體）之通用特性（圖丨）。 實例4 在以抗體18治療條件下，在3D培養物中表達IGF-IR的 H322M腫瘤細胞之生長抑制（WST分析） 在經聚HEMA(聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯））塗覆之器皿上 於RPMI1640/0.5% FCS介質中培養H322M細胞以防止至該 塑料表面之附著。在該等條件下H322M細胞形成立體生長 (稱其為固著非依賴性之特性）之稠密球狀體。該等球狀體在 原位緊密組成實性腫瘤之立體組織構造（histoarchitecture) 及有機體。在自0-240 nM漸增量之抗體存在下培育球狀培 養物5天。使用該WST轉換分析（conversion assay)量測生長 抑制。當以不同濃度之抗體18(1-240 nM)治療H322M球狀培 養物時，可觀察到在生長上的依賴劑量之抑制（圖2)。 實例5 在3D培養物中表達IGF-IR之H322M腫瘤細胞的生長抑制 (集落形成分析） 在經聚HEMA塗覆的器皿上於RPMI 1640/10% NCS介質 中培養H322M細胞以防止至該塑料表面之附著。在該等條 件下H322M細胞形成立體生長（稱其為固著非依賴性之特 性）之稠密球狀體。該等球狀體代表在原位實性腫瘤之立體 組織構造及有機體。在自〇-7·5 gg/ml漸增量之抗體存在下 培育球狀培養物5-10天。將<116¥>單株抗體用作陰性對照 物。使用相差（phase contrast)在反向顯微鏡（Zeiss Axiovert) 94026.doc -44- 1290147 上使集落成像並使用自動化的成像系統（MetaMorph)進行 計數。當以不同濃度（0.5-7.5Mg/ml)之抗體18治療H322M球 狀培養物時，可觀察到在生長上的依賴劑量之抑制，而該 對照抗體<HBV>幾乎無作用或無作用。在以7.5 gg/ml之抗 體1 8治療之培養物中該等集落的數目及尺寸明顯減小（圖 3) 。 直徑大於100 μπι之集落的定量分析顯示··在以〇·5 /ig/ml 之抗體18治療的培養物中該等集落之數目減小了約66%(圖 4) 〇 實例6 抑制IGF-I及IGF-II至表達IGF-IR之腫瘤細胞的結合 為測定本發明抗體阻止配體IGF-I及IGF-II至IGF-I受體 (IGF-IR)之結合的能力，執行了具有經放射性示蹤之配體肽 的競爭實驗。 將人類腫瘤細胞（HT29，NCI H322M，0.5-lxl05/ml)沈積 在補充了 2mML-穀胺醯胺、lx非本質胺基酸（Gibco，編號 11140-035)、1 mM丙酮酸納（Gibco，編號 11360-039)及 10% 熱鈍化之FCS(PAA，編號A15-771)之RPMI 1640培養基 (卩八八，編號£15-039)中。以2〇1111處在用於每個實驗之各自 培養基中的細胞灌輸T175規格之六個瓶子並於37°C及5% C02下培育兩天以獲得匯合的細胞單層。 為採集個體細胞，每個T175燒瓶添加2ml之lx胰蛋白酶/ • EDTA(Gibco ’ 編號 25300-054)並用 Zeiss Axiovert25顯微鏡 監視細胞之分離。採集该專細胞並添加如上述之具有10 % 94026.doc -45- 1290147 FCS之培養基至50 ml總體積。藉由以1000 rpm離心10分鐘 來再單離細胞（Heraeus sepatech，Omnifuge 2·0 RS)且再懸 浮於 50 ml 結合緩衝液（120 mM NaCl、5 mM KC1、1·2 mM MgS04、1 mM EDTA、10 mM D(+)葡萄糖、15 mM NaAc、 100 mM Hepes pH 7.6、1% BSA)中。計數細胞，藉由離心 來再單離並以結合緩衝液調節至lxlO6個細胞/ml。 以結合緩衝液稀釋已溶解在0.1% CH3COOH的經I125示蹤 之 IGF-I及 IGF-II肽（Amersham，〜2000 Ci/mmol，編號 IM172 及IM238)至4xl05計數/(分鐘xml)之最終活性。將特定濃度 之75 μΐ抗體連同25 μΐ預稀釋之I125示蹤的IGF-I或IGF-II肽 添加至200 μΐ細胞懸浮液並於4°C培育3.5小時。藉由以2000 rpm離心5分鐘來再單離細胞（Eppendorf，5415C)且除去上清 液。在以1 ml結合緩衝液洗滌兩次後，將細胞再懸浮於1 ml 結合懸浮液中並轉移至閃爍管（scintillation tube)。在閃爍 計數器上量測結合至該等細胞表面受體之放射性肽的量。 圖5及6顯示了展示本發明抗體抑制IGF-Ι及IGF_II肽至該 IGF-I受體之結合的能力之所得ic5〇曲線。對抗體18之平均 IC5G值為0·3ηΜ。對於該抗體，未偵測到IGF-II結合至該受 體的依賴濃度之抑制。抗體cdR3之結果顯示於圖7。未觀察 到對IGF-II結合的可偵測之抑制。 實例7 用於IGF-IR結合之抗體競爭分析 為抗IGF-IR單株抗體之抗原決定部位定位，選擇關於親 合力量測之相似格式（實例2)，但是以處在溶解中之抗體於 94026.doc -46- 1290147 RT下預培育IGF-IR至少0.5小時。注射該混合物並偵測 IGF-IR結合（或抑制）。該分析允許量測單株抗體對於IGF-IR 結合的交互抑制活性。吾人發現：本發明抗體為結合至 IGF-IR而與cdR3競爭，已知aIR3結合至aa 217-274(Gustafson, Τ·Α·及 Rutter，W.J·，J· Biol· Chem. 265(1990)18663-18667) 〇 實例8 抑制IGF-IR及Akt/pkB之IGF_I介導的構酸化 為測定本發明抗體抑制IGF-I受體（IGF-IR)之活化及磷酸 化的能力，以IGF-I肽執行競爭實驗且隨後以對磷酸化酪胺 酸特異之抗體執行西方點墨分析法。 將人類腫瘤細胞（HT29，NCI H322M，5xl04/ml)沈積在補 充了 2 mM L-穀胺醯胺、1 X非必須胺基酸（Gibco，編號 11140-035)、1 mM丙酮酸鈉（Gibco，編號 11360-039)及 0.5% 熱鈍化之FCS(PAA，編號A15-771)之RPMI 1640培養基 (PAA，編號E15-039)中。為測定IC50值，以處在用於每個實 驗之各自培養基中的1 ml細胞接種12孔盤並於37°C及5% C02下培育兩天。 在以低血清培養基培育48小時後，小心地除去該培養基 並置換為以各自培養基稀釋的不同濃度抗體。在於37°C及 5% C02下培育5分鐘後，以2 nM之最終濃度添加IGF-I肽且 於上述條件下再次培育細胞10分鐘。藉由抽吸小心除去該 培養基並為每個孔添加100 μΐ冷的溶解緩衝液（50 mM Hepes pH 7.2、150 mM NaC卜 ImM EGTA、10%甘油、1% 94026.doc -47- 1290147

Triton^-XlOO、100 mM NaF、10 mM Na4P2〇7、Complete® 蛋白酶抑制劑）。使用細胞刮具（Corning，編號3010)分離該 等細胞並將孔内含物轉移至Eppendorf反應管。藉由以 13000 rpm及4°C時離心10分鐘除去細胞片斷並將一半上清 液以1:1 (v/v)比率添加至2x Laemmli樣品緩衝液中。為 IGF-IR之免疫沈澱反應，恰好在添加1 μΐ之針對IGF-IRJ3的 多株抗體（C-20，Santa Cruz Biotechnologies)或在人類 IGF 1 型受體之細胞外區域（α鏈）的胺基酸440-586範圍内辨別抗 原決定部位之鼠科單株抗體（IgGl)之前（mAb 24-55, GroPep)，使細胞溶解產物之剩餘上清液經受淨化旋轉 (clearifying spin)(13000 rpm及4°C，10分鐘）。在旋轉式 Eppendorf反應管中於4°C培育2小時後，添加25 μΐ Protein G Sepharose®小珠（Amersham Biosciences，編號 17-0618-01)， 隨後於4°C另外培育1小時。藉由離心（2000 rpm及4°C下1分 鐘）單離具有已結合之抗體-蛋白質錯合物的該等小珠且以 洗滌緩衝液（具有僅〇· 1% Triton®_X100之溶解緩衝液）洗滌 三次。煮沸處在Laemmli樣品緩衝液中之該等小珠之後，藉 由SDS-PAGE分離細胞蛋白質並藉由半乾式西方墨點法將 其轉移至硝化纖維膜 （PROTRAN® BA 85, Schleicher&Schuell) 〇 使用構酸絡胺酸特異抗體（Upstate，clone 4G10，編號 05-321)測定經免疫純化之IGF-IR的磷酸化狀況。為偵測磷 酸化之 Akt/pkB，應用 了對磷酸化之 Ser473(Cell Signalling， 編號9271)具有特異性的抗體。 94026.doc •48- 1290147 在圖8中顯示了所觀察到之IGF_IR及Akt/pkB的IGF-Ι誘發 之磷酸化的阻塞。 實例9 活體内誘發抗體介導之IGF-IR下調 為偵測本發明抗體對腫瘤細胞中IGF-I受體（IGF-IR)之量 的影響，以IGF_IR特異性抗體執行了時程實驗及隨後的西 方點墨分析法。 將人類腫瘤細胞（HT29，5xl04細胞/ml)沈積在補充了 2 mM L-穀胺醯胺、lx非本質胺基酸（Gibco,編號11140-035)、 1 mM丙酮酸納（Gibco，編號11360-039)及10%熱鈍化之 FCS(PAA，編號 A15-771)之 RPMI 1640 培養基（PAA，編號 E15-039)中。對於每個培養期，以處在用於每個實驗之各 自培養基中的1 ml細胞灌輸一個12孔盤並於37°C及5% C02 下培育24小時。 小心除去該培養基並置換為以各自培養基稀釋之不同濃 度的抗體。在兩個對照孔中，以不存在抗體之培養基或具 有對照抗體（AB-1，Oncogene，編號GR11)之培養基置換培 養基。於37°C及5% C02下培育細胞並取出個別盤以用於15 分鐘、24小時及48小時後之另外處理。 藉由抽吸小心除去該培養基並為每個孔添加100 /xl之冷 的溶解緩衝液（50 mM Hepes pH 7.2、150 mM NaCn、1 mM EGTA、10%甘油、P/oTritoi^-XlOO、lOOmMNaF、lOmM . Na4P207、Complete®蛋白酶抑制劑）。使用細胞刮具 (Corning，編號3010)分離該等細胞並將細胞内含物轉移至 94026.doc -49· 1290147

Eppendorf反應管。藉由以13000 rpm及4°C離心10分鐘除去 細胞片斷並將該上清液以1:1 (v/v)比率添加至2x Laemmli樣 品緩衝液。藉由SDS-PAGE分離細胞蛋白質並藉由半乾式西 方墨點法將其轉移至硝化纖維膜（PR0TRAN⑧BA 85, Schleicher&Schuell，編號 10 401196) 〇 使用對IGF-IR特異之抗體（C_20， Santa Cruz Biotechnologies，編號sc-713)測定IGF-IR之蛋白質含量。 觀察到了加入本發明抗體之後，在小於24小時後藉由該 抗體誘發之IGF-IR下調。 實例10 抑制胰島素結合至表達人類胰島素受體之3T3細胞 為測定本發明抗體亦阻止胰島素至胰島素受體（IR)之結 合，以經放射性示蹤之配體肽執行競爭實驗。 將表達重組高數目（>1〇5)人類IR之3T3細胞（lxl05/ml)沈 積在補充了 2 mM L-穀胺醯胺（Gibco，編號25030-024)及 10%熱鈍化之FCS(PAA，編號A15-771)的具有高葡萄糖 (PAA，編號 E15-009)之 MEM Dulbecco 培養基（DMEM)中。 以處在用於每個實驗之各自培養基中的20 ml細胞灌輸 T175規格之六個瓶子並於37°C及5% C02下培育兩天以獲得 匯合的細胞單層。 為採集個體細胞，為每個T175燒瓶添加2 ml之lx胰島素/ EDTA(Gibco，編號25300-054)並以顯微鏡監視細胞之分 離。採集該等細胞並添加具有如上所述10% FCS之培養基 至50 ml總體積。藉由以1〇〇〇 rpm離心10分鐘來再單離細胞 94026.doc -50- 1290147 且再懸浮於50 ml結合緩衝液（120 mM NaCl、5 mM KCl、 1.2 mM MgS04、1 mM EDTA、10 mM D(+)葡萄糖、15 mM NaAc、100 mM Hepes pH 7.6、1% BSA)中。計數細胞，藉 由離心來再單離並以結合緩衝液調節至1 χ 106個細胞/ml。 以結合緩衝液稀釋已溶解在0·1% CH3COOH中的經I125示 蹤之胰島素肽（Amersham，編號IM166，〜2000 Ci/mmol)至4 xlO5計數/(分鐘xml)之最終活性。將75 μΐ抗體連同25 μΐ預豨 釋之I125示蹤的胰島素肽添加至200 /d細胞懸浮液（最終抗 體濃度200 ηΜ)並於4°C培育3·5小時。藉由以2000 rpm離心5 分鐘來再單離細胞且除去上清液。在以1 ml結合緩衝液洗 滌兩次後，將細胞再懸浮於1 ml結合懸浮液中並轉移至閃 爍管。在閃爍計數器上量測結合至該等細胞表面受體之放 射性肽的量。 結果顯示：本發明抗體不干擾胰島素配體至該胰島素受 體之結合（圖9)。 實例11 不刺激IGF_IR及Akt/pkB磷酸化 為排除本發明抗體之IGF-IR刺激活性，在不存在IGF-I 配體但存在本發明抗體及參考抗體01113, Oncogene， Germany)之情況下測定IGF-IR之磷酸化。此係以填酸化狀 態特異性抗體藉由西方點墨分析法來執行。將以IGF-IR(5x 104 細胞/ml，Pietrzkowski，Ζ·等人，Cell Growth Differ. 4(1992)199-205)轉染之 3T3 細胞（ATCC CRL 1658)沈積在補 充了 2mM L-榖胺醯胺（Gibco，編號25030-024)及0.5%熱鈍 1290147

化之FCS(PAA，編號A15-771)的具有高葡萄糖（PAA，編號 E15-009)之MEM Dulbecco培養基（DMEM)中或將人類腫瘤 細胞（HT29，NCI H322M，5xl04/ml)沈積在補充了 2 mM L-穀胺醯胺、lx非本質胺基酸（Gibco，編號11140-035)、1 mM 丙酮酸鈉（Gibco，編號11360-039)及0.5%熱鈍化之 FCS(PAA，編號 A15-771)之 RPMI 1640 培養基（PAA，編號 E15-039)中。為測定IC50值，以處在用於每個實驗之各自培 養基中的1 ml細胞灌輸12孔盤並於37°C及5% C02下培育兩 天。

在以低血清培養基培養48小時後，小心地除去該培養基 並置換為以各自培養基稀釋之不同濃度的抗體。在上述條 件下培育細胞15分鐘。藉由抽吸小心地除去該培養基並為 每個孔添加100 μΐ之冷的溶解緩衝液（50 mM Hepes pH 7·2、150 mM NaCl、1 mM EGTA、10% 甘油、1% Triton-X100、100 mM NaF、10 mM Na4P2〇7、Complete™ 蛋白酶抑制劑）。使用細胞刮具（Corning，編號3010)分離該 等細胞並將孔内含物轉移至Eppendorf反應管。藉由以 13000 rpm及4°C時離心1〇分鐘來除去細胞片斷（Eppendorf 離心機5415R)並將一半上清液以l:l(v/v)比率添加至2x Laemmli樣品緩衝液中。為IGF-IR之免疫沈殿反應，恰好在 添加1 μΐ之針對IGF-IR之抗體之前（C-20，Santa Cruz Biotechnologies，編號sc-713 或 mAb 24-55，GroPep，編號 MAD1)，使細胞溶解產物之剩餘上清液經受淨化旋轉 (clearifying spin)(13000 rpm及4°C，10分鐘）。在旋轉式 94026.doc -52- 1290147

Eppendorf反應管中於4°C培育2小時後，添加25 μΐ Protein G SepharoseTM 小珠（Amersham Biosciences，編號 17-0618-01)，隨後於4°C另外培育1小時。藉由離心（2000 rpm及4°C 下1分鐘）單離具有已結合之抗體-蛋白質錯合物的該等小珠 且以洗滌緩衝液（具有僅0.1% Triton-ΧΙΟΟ之溶解緩衝液）洗 滌三次。煮沸處在Laemmli樣品緩衝液中之該等小珠之後， 藉由SDS-PAGE分離細胞蛋白質並藉由半乾式西方墨點法 將其轉移至硝化纖維膜（PROTRAN BA 85，Schleicher & Schuel卜編號 10 401196)。 使用磷酸酪胺酸特異性抗體（Upstate，clone 4G10，編號 05-321，辨別酪胺酸磷酸化之蛋白質）測定經免疫純化之 IGF-IR的磷酸化狀況。為偵測磷酸化之Akt/pkB，應用了對 磷酸化之Ser473(Cell Signalling，編號9271)具有特異性之 針對Aktl的抗體。 據觀察：高於5 nM濃度之參考抗體而非高達10.000 nM濃 度之本發明抗體顯著激活了在IGF-IR之發訊息通道下游的 Akt/pkB激酶。結果顯示在圖10及11中（HM =具有0.5% FCS 之低血清培養基，HM+IGFI =具有0.5% FCS及10 nM hIGF-I 之低血清培養基）。 實例12 在H322M異種移植模型中誘發受體下調 在裸鼠中誘發腫瘤並以不同濃度之本發明抗體進行一次 治療。治療後24小時在液氮條件下萃取該等腫瘤並均質 化。以緩衝液體積與腫瘤之3:1重量比添加冷的溶解緩衝液 94026.doc -53- 1290147 (50 mM Hepes pH 7·2、150 mM NaCH、1 mM EGTA、10% 甘油、1% Triton-X100、100 mM NaF、1 mM Na3V04、10 mM Na4P2〇7、Complete™蛋白酶抑制劑、1 mM PMSF)且與該融 化之腫瘤勻漿徹底混合。在於冰上溶解該組織15分鐘後， 藉由以13000 rpm及4°C下離心10分鐘（Eppendorf離心機 5415R)來除去不可溶片斷。以Micro BCA™ Reagents(Pierce) 測定該等樣品之蛋白質濃度並添加溶解緩衝液以調節均等 濃度。以1:1 (v/v)比率將部分上清液添加至2x Laemmli樣品 緩衝液中。藉由SDS-PAGE分離細胞蛋白質並藉由半乾式西 方墨點法將其轉移至硝化纖維臈（PROTRAN BA 85， Schleicher&Schuell，編號 10 401196)。使用 IGF-IR特異性 抗體（C-20，Santa Cruz Biotechnologies，編號 sc-713)偵測 IGF-IR 〇 當以本發明抗體進行治療時，吾人觀察到依賴濃度的 IGF-IR含量降低，其在0.6 mg/kg時具有所估計之EC50(圖 12)。 實例13

Clq 結合 ELISA 引言 為測定根據本發明抗體固定C1 q之能力，使用了 ELIS A方 法。C1 q係適應性免疫系統之一部分，且一旦結合至免疫錯 合物，就引發幾種酶原之相繼活化。反過來，該等酶引起 C3分子之***，其導致開始發炎反應、外來粒子或異常粒 子之調理作用（opsonization)及細胞膜之溶解。 94026.doc -54- 1290147 原則上，以抗體之濃度範圍塗覆該ELISA盤，向盤中添 加人類Clq。藉由針對人類Clq之抗體、繼而藉由過氧化物 酶示蹤之共輛體彳貞測C 1 q結合。 材料及方法 以10、5、1及0.5 /xg/ml之濃度測試了抗體18、8及23及對 照抗體。表1顯示了所測試樣品之特異性。作為陰性對照 物，使用了極弱地結合Clq的人類IgG4(CLB，儲備 0.5 gg/ml)。併入人類IgGl作為陽性對照物。使用了具有2 Mg/ml濃度之人類Clq儲備溶液。為偵測Clq，使用了已與辣 根過氧物酶（Sigma)共軛之針對C1 q的兔子抗體（Dako)及抗 兔子IgG抗體。 計算及曲線擬合 使用Graphpad Prism軟體利用非線性回歸曲線擬合（一個 位點結合）來確定關於所測試HuMAb之最大結合值（Bmax) 的計算。 結果 根據本發明之抗體顯示了依賴劑量的人類C1 q蛋白質之 結合。針對HuMAb濃度繪製405 nm(OD 405 nm)處之光學密 度並利用非線性回歸擬合該等曲線。在表2中列出了對於最 大結合值（Bmax)的最佳擬合值，亦列出了該曲線之相關係 數（R2)及每個值的標準偏差。最低相關係數具有0.950之值 (IgG4)。具有0.279之最大結合值，人類IgG4(陰性對照）顯 示出Clq的最小結合。陽性對照IgG 1及IgG3都結合Clq，如 分別所顯示的1.729及2.223之最大結合值。 94026.doc -55- 1290147 表2 在Clq結合ELISA中所測試HuMAb之最大結合值 (Bmax)(n = 3) 最佳擬 合值 Bmax 標準偏 差 Bmax 擬合度 R2 標準偏 差 R2 IgGl 1.729 0.166 0.983 0.010 IgG3 2.223 0.947 0.995 0.005 IgG4 0.279 0.280 0.950 0.041 抗體18 1.670 0.601 0.988 0.005 亦列出了相關係數（R2)及標準偏差。 與人類IgG4(陰性對照，O.D.為0.279)之Clq結合相比，所 測試之所有抗體均能夠固定Clq。 實例14 藉由抗IGF-IR HuMAb測定抗趙介導之效應功能 為測定該等所生成HuMAb抗體引起免疫效應機能的能 力，執行了依賴補體的細胞毒性（CDC)及依賴抗體的細胞細 胞毒性（ADCC)的研究。 為研究 CDC(National Cancer Institute，肺腺癌細胞系）， 以 100 jitCi 51Cr(Amersham Pharmacia Biotech，英國，編號 CJS11)示蹤 H322M、H460 及 NIH 3T3 細胞（2-6x106)45-120 分鐘。示蹤之後，以40 ml PBS洗務兩次並以1500 rpm旋轉3 分鐘。接著在圓底盤之每個孔中沈積5,000個該等細胞，體 積為50 μΐ。將在50 μΐ細胞培養基中25-0.1 gg/ml範圍内之最 終濃度的抗體添加至50 μΐ細胞懸浮液中並培育30-60分 鐘。培育之後，藉由以PBS洗滌兩次來除去過量抗體。添加 100 μΐ經1/3-1/30之間稀釋之活性或非活性（56°C，30分鐘） 94026.doc -56- 1290147 的經集中之人類血清、豚鼠血清、兔子血清或裸鼠血清， 並培育該等細胞3小時，其後，以1500 rpm旋轉該等細胞3 分鐘。收穫了 100 μΐ上清液，將其轉移至聚丙烯管並以γ計 數器計數。 為研究該等抗體在ADCC中之影響，以100 /iCi 51Cr (Amersham Pharmacia Biotech，英國，編號CJS11)示蹤 H322M、H460及NIH 3T3或其它合適的IGF-IR表達細胞（2-6 xl06)45-120分鐘，以40 ml之PBS洗滌兩次並以1500 rpm旋 轉3分鐘。在圓底盤之每個孔中沈積5,000個該等細胞，體 積為50 μΐ。將在50 μΐ細胞培養基中25-0.1 jLtg/ml範圍内之最 終濃度的HuMAb抗體添加至50 μΐ細胞懸浮液中並培育15 分鐘。隨後，以100:1至5:1範圍内之Ε:Τ比率添加50 μΐ的效 應細胞、新近單離自白血球層之PBMC或純化之效應細胞。 以500-700 rpm離心該等盤2分鐘，且於37°C隔夜培育。培育 之後，以1500 rpm旋轉該等細胞3分鐘並收穫了 100 μ1上清 液，將其轉移至聚丙烯管中且以γ計數器計數。 藉由CDC或ADCC之細胞溶解的量表示成：將自藉由潔淨 劑溶解之目標細胞釋放之放射能最大值校正為自各自目標 細胞自發釋放之放射能的百分數。 實例15 Η322Μ腫瘤之生長抑制 藉由根據所建立之方法在無胸腺裸鼠中誘發腫瘤來研究 抗體18在活體内之作用。將人類Η322Μ NSCLC細胞連同 Matrigel經皮下共注射至6-7週齡無胸腺裸鼠（nu/nu)中。為 94026.doc -57- 1290147 此目的，將5xl06 H322M細胞濃縮在100 μΐ培養基中並與100 μΐ Matrigel相混合。將200 μΐ該混合物注入該等小鼠之右肋 腹。藉由以Vernier測徑規一週兩次量測腫瘤直徑，根據 Geran 等人（’’Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems’’，Cancer Chemother. Rep. 11.301，1972)首次出版之 公式（其中，腫瘤體積[mg]=(長x(寬）2))來計算腫瘤體積。 以10 ml/kg經腹膜内（i.p.)施用抗體。以在雙倍體積中所施 用之抗體的雙倍劑量開始治療。如上所述在裸鼠中誘發了 腫瘤。在腫瘤生長至160 mg之平均體積後，以在第一天一 次治療所給定之12、1.2及0.12 mg/kg作為負荷劑量開始， 以6、0.6及0.06 mg/kg之抗體作為連續劑量一週一次經腹膜 内治療小鼠六次。圖13描繪了在治療期間所量測到的腫瘤 體積直到67天，此時犧牲該等動物並終止實驗。該實驗顯 示··當以6及0.6 mg/kg作為單一藥劑施用時，藉由rhu抗 IGF-IR mAb 18之IGF-IR軸（axis)的阻塞導致了抗腫瘤功 效。相反，0.06 mg/kg未影響腫瘤生長。 另外，在相同模型中與吉西他濱組合測試了抗體1 8。如 上所述誘發腫瘤且當腫瘤建立並生長至所有群體之平均 170 mm3時發起治療。以6及0·6 mg/kg及在0.6 mg時與62 mg/ kg吉西他濱組合經腹膜内一週一次施用抗體。施用吉西他 濱一個週期，即每隔兩天，總共四次。此外，以施用雙倍 劑量之抗體開始治療。圖14顯示了隨時間之腫瘤尺寸與各 種治療的關係。該實驗顯示：每七天一次施用抗體18之治 94026.doc -58- 1290147 療藉由自身抑制了腫瘤生長且提高了吉西他濱（已知的抗 代謝性化合物）之效能。 實例16 3T3腫瘤之生長抑制 除使用過度表達人類IGF-IR的鼠科3T3成纖維細胞外，基 本上如實例15所述在裸鼠中誘發了腫瘤。以18、6或0.6 mg/kg之抗體18每週一次經腹膜内治療大約180 mg具有所 建立之腫瘤的小鼠七次。此外，以所給定之雙倍劑量抗體 作為負荷劑量（36、12及1.2 mg/kg)開始治療。該實驗顯示： 當每週一次以18及6 mg/kg施用時，藉由該抗體之治療延遲 了腫瘤生長（圖I5)。 文獻列表

Adams, T.E.5 et al., Cell. Mol. Life Sci. 57(2000)1050-1063

Aplin, J.D., and Wriston, J.C. Jr.5 CRC Crit. Rev. Biochem.( 198 1)259-306

Arteaga, C.L., et al., Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992)101-106

Ausubel，F·，et al·，ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)

Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73(2001)261-270 - Barnes, L.M., et al.5 Cytotechnology 32(2000)109-123

Benini, S., et al.5 Clin. Cancer Res. 7(2001)1790-1797 94026.doc -59- 1290147

Berge, S.M., et al.5 J. Pharm. Sci. 66(1977)1-19 Bergmann，U·，et al·，Cancer Res. 55(1995)2007-2011 Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166(1987)1351-1361 Brunetti, A., et al.3 Biochem. Biophys. Res. Commun.165 (1989)212-218

Carter, P·， et al·， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289

Chen，J·，et al·，EMBO J. 12(1993)821-830 Chen, J·，et al·，International Immunology 5(1993)647-656 Delafontaine, P.? et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 26(1994) 1659-1673

Dricu，A.，et al·，Glycobiology 9(1999)571-579 Durocher，Y·，et al·，Nucl· Acids· Res· 30(2002)E9 Edge，A.S·，et al· Anal· Biochem. 118(1981)131-137 Fishwild，D.M·，et al·，Nat. Biotechnol· 14(1996)845-851 Forsayeth, J.R., et al.5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(1987) 3448-3451

Geisse，S.，et al·，Protein Expr. Purif. 8(1996)271-282 Gustafson, T.A., and Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265(1990) 18663-18667

Hailey，J·，et al·，Mol· Cancer Ther· 1(2002)1349-1353 Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764(1995) 536-546

Hoyne, P.A., et al., FEBS Lett. 469(2000)57-60 94026.doc -60- 1290147

JohNSOn，G·，and Wu，Τ·Τ·，Nucleic Acids Res. 28(2000) 214-218

Jones，P·，et al·，Nature 321(1986)522-525 Kabat et al·，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)

Kalebic，T·，et al·，Cancer Res. 54(1994)5531-5534 Kanter-LeweNSOhn, L·， et al·， Melanoma Res, 8(1998)389- 397

Kato, H·，et al·，J. Biol· Chem. 268(1993)2655-2661 Kaufman，R.J·，Mol· Biotechnol. 16(2000)151-161 Kull, F.C. Jr., et al. J. Biol. Chem. 258(1983)6561-6566 LeRoith, D.5 et al.? Endocrin. Rev. 16(1995)143-163 Li, S.L·，et al·，Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98

Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49(2000) 243-252

Lonberg，N.，and Huszar，D·，Intern. Rev. Immunol. 25 (1995)65-93

Lonberg，N·，et al·，Nature 368(1994)856-859 Lonberg，N·，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101

Love，T.W·，et al·，Methods Enzymol· 178(1989)515-527 Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17(1999)183-202 94026.doc •61 - 1290147

Morgan，D.O·，and Roth，R.A·，Biochemistry 25(1986) 1364-1371

Morrison，S.L·，et al·，Proc· Natl· Acad Sci. USA 81(1984)6851-6855

Neuberger，M.S·，et al·，Nature 314(1985)268-270 Norderhaug，L·，et al.，J. Immunol. Methods 204(1997) 77-87 0，Brien，R.M·，et al·，EMBO J. 6(1987)4003-4010 Orlandi，R·，et al·，Proc· Natl. Acad· Sci. USA 86(1989) 3833-3837

Pessino, A.3 et al.5 Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989)1236-1243

Pietrzkowski, Z.， et al.， Cell Growth Differ. 4(1992)199-205

Prigent, S.A., et al.5 J. Biol. Chem. 265(1990)9970-9977 Queen, C., et al.5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989) 10029-10033

Riechmann，L·，et al·，Nature 332(1988)323-327 Rohlik，Q.T·，et al·，Biochem. Biophys. Res. Comm. 149(1987)276-281

Schaefer，E.M·，et al.，J. Biol· Chem. 265(1990)13248-13253

Schlaeger，E. -J” and Christensen，K·，Cytotechnology 30 (1999)71-83 94026.doc -62- 1290147

Schlaeger, E. -J., J. Immunol. Methods 194(1996)191-199 Scotlandi，K·，et al·，Cancer Gene Ther. 9(2002)296-307 Scotlandi，K·，et al·，Int· J· Cancer 101(2002)11-16 Sojahr，Η·Τ·，and Bahl，O.P_，Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987)52-57

Soos，M.A·，et al·，Biochem. J· 235(1986)199-208 Soos，M.A.，et al·，J. Biol. Chem· 267(1992)12955-12963 Soos，M.A·，et al·，Proc. Natl。Acad· Sci. USA 86(1989) 5217-5221

Stella et al·，’’Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，” Directed Drug Delivery, Borchardt et al.? (ed.)? pp. 247-267, Humana Press(1985)

Surinya，K.H·，et al·，J. Biol. Chem. 277(2002)16718-16725

Taylor, L·，et al·，Int. Immunol. 6(1994)579-591 Choi, T.K., et al.5 Nature Genetics 4(1993)117-123

Taylor， L·， et al·， Nucleic Acids Research 20(1992)6287-6295

Taylor，R.，et al·，Biochem· J· 242(1987)123-129 Thotakura，N.R·，and Bahl，O.P·，Meth· Enzymol. 138 (1987)350-359

Tuaillon，N·，et al·，Immunol· 152(1994)2912-2920 Tuaillon, N.? et al.5 Proc. Natl. Acad. Sci USA 90(1993) 3720-3724 94026.doc -63- 1290147

Tulloch，Ρ·Α·，et al_，J. Struct. Biol· 125(1999)11-18 US Patent No. 4,179,337 US Patent No. 4,301,144 US Patent No. 4,487,603 US Patent No. 4,496,689 US Patent No. 4,640,835 US Patent No. 4,670,417 US Patent No. 4,675,187 US Patent No. 4,791,192 US Patent No. 5,202,238 US Patent No. 5,204,244 US Patent No. 5,545,806 US Patent No. 5,545,807 US Patent No. 5,569,825 US Patent No. 5,625,126 US Patent No. 5,633,425 US Patent No. 5,661,016 US Patent No. 5,770,429 US Patent No. 5,789,650 US Patent No. 5,814,318 US Patent No. 5,874,299 US Patent No. 5,877,397 van Dijk，Μ·Α·，and van de Winkel，J.G_，Curr. Opin.

Pharmacol. 5(2001)368-374 94026.doc -64- 1290147

Vitetta，E.S·，et al_，Science 238(1987)1098-1104 Werner，R.G·，Drug Res. 48(1998)870-880 Wilman，’’Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14，pp. 375-382，615th Meeting Belfast(1986) WO 01/14424 WO 02/053596 WO 87/05330 WO 92/03918 WO 92/22645 WO 93/1227 WO 94/11026 WO 94/25585 WO 98/24884 【圖式簡單說明】 圖1在低密度及高密度細胞培養物中之IGF_IR表面表達。 圖2用於3D培養物中增殖抑制之WST分析（NCI H322M細 胞）。 圖3用於3D培養物中增殖抑制之集落形成分析（微管影 像）。 圖4用於3D培養物中增殖抑制之集落形成分析（定量），ctr =對照物；Cl 18=抗體18。 圖5藉由抗體18及22對於I125-IGF-I至HT29細胞之結合的 抑制（IC5〇值）。 94026.doc -65- 1290147 圖6藉由抗體18對於I125-IGF-II至HT29細胞之結合的抑 制。 圖7藉由抗體aIR3對於I125-IGF-II至HT29細胞之結合的抑 制。 圖8由IGF-I之阻塞誘發的IGF-IR及Akt/PkB之磷酸化。 圖9藉由抗hlGF-lR抗體未抑制I125-胰島素至3T3-IR細胞 的結合。（MAX w/o Ab: I125·胰島素之最大結合；MIN :與1 μΜ胰島素競爭後之最小結合）。 圖10 ΑΚ18對IGF_IR過度表達3Τ3細胞無刺激活性。 圖11 AK18對人類腫瘤細胞（HT29)無刺激活性。 圖12在活體外藉由抗體18之所曝露於H322N細胞表面上 的IGF-IR之下調。 圖13以AK1 8之治療，原發腫瘤體積。 圖14以具有或不具有吉西他濱之AK1 8之治療。 圖15以AK1 8之治療，原發腫瘤體積。 94026.doc 66- 1290147' 序列表 <110> F* Hoffmann-La Roche 對抗類胰島素生長因子丨受體之抗體及其用途 <130> 21695 ' <140〉 093120782 <141> 2004-07-12 <150> 03015526 ' <151> 2003-07-10 <160> 8 <170> Patentln version 3·2

<210> 1 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 1

Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Gin Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala lie lie Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 94026.doc 1290147

Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110

Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 2

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> 智人 <400> 3 -2- 94026.doc 1290147

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Ala lie lie Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4

<211> 108 <212> PRT <213>智人 <400〉 4

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45 94026.doc I290147-

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 5 <211> 990 <212> DNA <213>智人 <220> <221> CDS <222> (1).. (990) <400> 5 gcc tcc acc aag ggc cca teg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15 age acc tet ggg ggc aca geg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg aeg gtg teg tgg aac tea ggc gcc ctg acc age Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg get gtc eta cag tcc tea gga etc tac tcc Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 48 96 144 192 etc age age gtg gtg acc gtg ccc tcc age age ttg ggc acc cag acc Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 240 94026.doc -4- 1290147 tac ate tgc aac gtg aat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aaa gtt gag ccc aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 cca gca cct gaa etc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc etc ttc ccc cca 384 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc etc atg ate tee egg acc cct gag gtc aca tgc 432 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg egg gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac age aeg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg 576 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tee aac 624 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc etc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tee aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tee egg gat gag 720 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 94026.doc 1290147 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc

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<212> PRT <213>智人 <400> 6

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Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 94026.doc 1290147

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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys · 100 105 94026.doc 1290147 <210> 8 <211> 107 . <212> PRT <213> 智人 <400> 8

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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 94026.doc 9-

Claims (1)

1290 M^120782 號專•靜本------- 中文申請專利範圍部6.明< I日修（更)正本 十、申請專利範圍： ---------------------- 1. 一種人類抗體，其與IGF-IR結合並以2 nM或更低之IC50 值抑制IGF-I及IGF_II與IGF-IR結合，其特徵在於該抗體： a) 係人類IgGl同種型， b) 顯示出對IGF-I至IGF-IR之結合抑制與IGF-II至IGF-IR 之結合抑制的IC5G值之比率為1··3至3··1， c) 若與不存在該抗體的細胞磷酸化分析相比，在含有 0.5%經熱去活化之胎牛血清（FCS)的培養基中之該分 析中，在5 ηΜ之濃度下抑制了至少80% IGF-IR磷酸化， 及 d) 若與不存在該抗體的細胞磷酸化分析相比，在含有 0.5%經熱去活化之胎牛血清（FCS)的培養基中之為每 個細胞提供400,000至600,000個分子IGF-IR的該分析 中，在10 μΜ之濃度下未顯示出作為IGF-IR磷酸化所量 測到的IGF-IR刺激活性，且 其特徵為具有下列序列： i) 包含SEQ ID NO: 1或3之抗體重鏈； ii) 包含SEQ ID NO: 2或4之抗體輕鏈。 2. 如請求項1之抗體，其特徵在於：該抗體藉由依賴抗體的 細胞毒殺（ADCC)在該抗體之100 ηΜ濃度下24小時之後誘 發了 IGF-IR表現細胞之製備物的20%或更多細胞之細胞 死亡。 3. 如請求項1或2之抗體，其特徵在於：該抗體藉由依賴補 94026-960914.doc 1290147 體的細胞毒殺（CDC)在該抗體之100 nM濃度下4小時之後 誘發了 IGF-IR表現細胞之製備物的20%或更多細胞之死 亡。 4·如請求項1或2之抗體，其特徵在於約1(Τ13至1(T9M(Kd)2 結合親合力。 5. 一種如請求項1或2之抗體之用途，其係用於製造抑制腫 瘤細胞之醫藥組合物。 6· —種用於抑制腫瘤細胞之醫藥組合物，其含有醫藥上有 效量的如請求項1或2之抗體。 7· —種製造用於抑制腫瘤細胞之醫藥組合物之方法，該組 合物包含醫藥上有效量的如請求項1或2之抗體。 8 · —種經單離之核酸，其編碼能夠與下面所定義之另一抗 體鏈各自組合之多肽，而該多肽為 a) 包含SEQ ID ΝΟ:1或3之抗體重鏈； b) 包含SEQ ID NO:2或4之抗體輕鏈。 9. 一種用於產製與IGF_IR結合並抑制IGIM及igf_h與 IGF-IR結合的多肽之方法，其特徵在於：將如請求項8之 編碼重鏈之核酸及編碼輕鏈之核酸***真核表現載體， 在CHO細胞、NSO細胞、SP2/〇細胞、HEK293組胞或c〇s 細胞中表現該重鏈及輕鏈，及自該細胞回收該多肽。 10. —種用於治療需要抗腫瘤療法之患者的醫藥組合物，其 包含治療上有效量的如請求項丨或2之抗體。 11·如请求項10之醫藥組合物，其係與細胞毒性劑、其前藥 或細胞毒性放射線療法併用。 94026-960914.doc