CN103502273A

CN103502273A - 用于pH依赖性通过血脑屏障的方法和构建体

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Publication number: CN103502273A
Application number: CN201280018897.XA
Authority: CN
Inventors: 贝恩德·博尔曼; 佩尔-奥拉·弗雷斯克加德; 阿德里安·胡根马特; 埃哈德·科佩茨基; 埃克哈德·默斯纳; 延斯·涅沃纳; 哈达萨·苏穆·萨德; 巴勃罗·乌马纳
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2014-01-08
Also published as: US20170174776A1; AU2012244816A1; RU2013150331A; AU2012244816B2; JP2017081988A; US20120282176A1; EP2699600A1; MX2013012071A; BR112013026423A2; CA2828662A1; BR112013026306A2; AU2012244816A8; JP2014514313A; WO2012143379A1; KR20140031217A

Abstract

本文报道了融合多肽，所述融合多肽包含：i)至少一个结合位点，例如，其包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，和ii)至少一个药学活性化合物，由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC₅₀-值高于该相同结合对在pH 7.4确定的EC₅₀-值，并且报道了该融合多肽用于递送药物活性化合物通过血脑屏障的应用。

Description

用于pH依赖性通过血脑屏障的方法和构建体

本文报道了融合多肽，所述融合多肽包含至少一个结合位点和至少一个药学活性化合物，由此与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH5.5确定的EC₅₀-值高于该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值，并且报道了该融合多肽用于递送药物活性化合物通过血脑屏障的应用。

发明背景

通过紧密连接相互连接的内皮或上皮细胞层代表大的极性分子(特别是蛋白)扩散到这些屏障后的组织中的主要障碍。尽管小分子可以通过专门的通道蛋白转运穿过这些屏障，但是蛋白的转运机制仍然是未充分了解的，不过认为生理学最重要的机制是受体介导的胞吞转运作用(receptor-mediated transcytosis,RMT)。

在RMT过程中，蛋白配体与表达在屏障细胞的腔侧的受体结合，然后其通过内吞作用内在化。内体内容物的分拣在专门的囊泡隔室中完成，并且取决于由受体序列所编码的信号，其介导该受体进入再循环、降解或胞吞转运途径的运输。一个已知的最好的RMT实例是在啮齿动物中通过新生的Fc受体将IgG转运穿过肠上皮细胞。

对于血脑屏障(BBB)，其由被周细胞和星形细胞围绕的紧密密封的脑内皮细胞组成，也已经描述了一些RMT途径，特别是关于转铁蛋白、胰岛素或低密度脂蛋白的受体。已经表明这些受体的配体包括促进胞吞转运作用的特性，这些特性之一是与其受体的pH-依赖性结合。例如，胰岛素在内在化后当内体内容物被酸化时从其受体中释放出来。

研究者已经尝试研究受体的胞吞转运作用，以通过将治疗剂与针对这些受体的抗体偶联而将治疗性分子递送通过血脑屏障。然而，这些抗体尚没有一种用在市售药物中，这可能是由于其不充分的转运潜能所致。事实上，还没有关于在多于一种药效学模型中独立地显示的功能性治疗性蛋白穿过BBB胞吞转运的明确证明。

Kobayashi,等人(Kobayashi,N.，等人，Am.J.Physiol.Renal.Physiol.282(2002)F358-F365)报道了FcRn-介导的免疫球蛋白G在人肾近曲小管上皮细胞的胞吞转运作用。Weksler,B.B.，等人在FASEB J.19(2005)1872-1874中报道了人成体脑内皮细胞系(human adult brain endothelialcell line)的血脑屏障特异性性质。

在US 6,030,613中，报道了免疫原的受体特异性跨上皮转运。在WO02/060919中，报道了具有延长的半衰期的分子、组合物及其应用。WO93/010819中报道了制备转铁蛋白受体特异性抗体-神经药剂或诊断剂缀合物的方法。在WO 2008/119096中，报道了胞吞转运的免疫球蛋白。WO 2006/056879中报道了人血脑屏障模型。

EP 1 975 178中报道了胞吞转运模块抗体(transcytotic modularantibody)。US 2008/019984中报道了靶向血脑屏障的抗体。Friden,PM.，等人报道针对人转铁蛋白受体的抗体的表征、受体定位和血脑屏障胞吞转运(J.Pharmacol.Exp.Therap.278(1996)1491-1498)。Pardridge等人.(Pharm.Res.12(1995)807-816)报道人胰岛素受体单克隆抗体在体外进行与人脑毛细管的高亲和力结合并且在灵长类动物中在体内快速胞吞转运通过血脑屏障。

发明概述

本文报道pH-依赖性结合模式能够使得针对内在化的细胞表面受体(特别是胞吞转运受体)的抗体有效穿过屏障细胞的紧密层，尤其是血脑屏障。例如，已经显示在pH 5.5的结合亲和力(EC₅₀值较高)低于其在pH 7.4的亲和力(EC₅₀值较低)的抗体，例如，结合人转铁蛋白受体(作为内在化的细胞表面受体的实例)的抗体，被胞吞转运穿过血脑屏障内皮细胞，而在两种pH值处表现出大致相等的亲和力(结合效率大致相等，并且因此，EC₅₀值大致相等)的不同抗体却在细胞内降解。因此，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值高于(大于)该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值。这一标准允许产生并选择针对内在化的细胞表面受体和/或胞吞转运受体的抗体，所述抗体由于对这些受体pH-依赖性的、可逆的结合导致的改变的分拣行为而不在内皮或上皮屏障细胞中被胞内降解。

一方面，本文报道了融合多肽，所述融合多肽包括：

-至少一个结合位点，所述结合位点结合内在化的细胞表面受体，和

-至少一个效应器部分，

由此与内在化的细胞表面受体结合的所述至少一个结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值高于针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值。

在全部方面的一个实施方案中，所述融合多肽特征在于，i)与内在化的细胞表面受体结合的所述结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值与ii)针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值的比率至少为5。在一个实施方案中，所述比率为10或更大。在一个实施方案中，所述比率为15或更大。在一个实施方案中，所述比率约为15。

在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值是针对该相同受体的该相同结合位点在pH7.4确定的EC₅₀-值的至少5倍。在一个实施方案中，在pH 5.5确定的EC₅₀-值是在pH 7.4确定的EC₅₀-值的至少10倍。在一个实施方案中，在pH 5.5确定的EC₅₀-值约为在pH 7.4确定的EC₅₀-值的15倍.

在全部方面的一个实施方案中，所述效应器部分是标记、或细胞毒素、或酶、或生长因子、或转录因子、或药物、或放射性核素、或配体、或抗体、或抗体片段、或脂质体、或纳米粒子、或病毒粒子或细胞因子。

在全部方面的一个实施方案中，所述效应器部分是药学活性化合物。在一个实施方案中，所述药学活性化合物是抗-Aβ抗体、或抗-tau抗体或抗-α突触核蛋白抗体。

在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值为100ng/ml以上、或500ng/ml以上或1000ng/ml以上。

在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值为100ng/ml以下、或85ng/ml以下或70ng/ml以下。

在全部方面的一个实施方案中，所述结合位点是结合对，其包括抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。在一个实施方案中，所述结合对选自Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)₂、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体、全长重链、全长轻链、完整抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体或六特异性抗体。在一个实施方案中，所述结合对是完整的单克隆抗体。在一个实施方案中，结合对至少是完整抗体的片段、免疫球蛋白超家族的成员或具有免疫球蛋白样结构的多肽，其保留对其抗原的结合特异性。

在全部方面的一个实施方案中，所述结合位点选自纤连蛋白，TCR，CTLA-4，单链抗原受体，例如与T-细胞受体相关的单链抗原受体，抗体模拟物，转铁蛋白，载脂蛋白，adnectin，基于anticalin的分子，phylomer，avimer，affibody，锚蛋白重复，Kunitz结构域，PDZ-结构域，蝎毒素免疫性蛋白(scorpio toxin immunity protein)，Knottin，Versabody，绿色荧光蛋白和其他具有结合特性的非抗体蛋白支架。

一方面，本文报道了编码本文所报道的融合多肽的核酸。

一方面，本文报道了包含本文所报道的核酸的宿主细胞。

一方面，本文报道了制备融合多肽的方法，所述方法包括培养本文所报道的宿主细胞从而产生所述融合多肽。

一方面，本文报道了一种药物制剂，所述药物制剂包含本文所报道的融合多肽和任选的药用载体。

一方面，本文报道了本文所报道的融合多肽用作药物。

一方面，本文报道了本文所报道的融合多肽用于治疗CNS-相关的疾病。

一方面，本文报道了本文所报道的融合多肽用于递送药物活性化合物穿过血脑屏障。

一方面，本文报道了本文所报道的融合多肽在制备药物中的应用。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗CNS-相关的疾病。

一方面，本文报道了一种治疗患有CNS-相关的疾病的个体的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的本文所报道的融合多肽。

一方面，本文报道了一种递送药学活性化合物穿过个体中的血脑屏障的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的本文所报道的融合多肽，从而递送药学活性化合物穿过血脑屏障。

一方面，本文报道了一种递送药学活性化合物穿过个体中或受试者的脑中的血脑屏障的方法，所述方法包括施用与结合对融合的药学活性化合物，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC₅₀-值高于该相同结合对在pH 7.4确定的EC₅₀-值。

在全部方面的一个实施方案中，所述融合多肽特征在于与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值与针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值的比率至少是5。在一个实施方案中，所述比率是10以上。

本文报道的一个方面是融合多肽用于递送药学活性化合物穿过血脑屏障的应用，所述融合多肽包含：

-至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，和

-至少一个药学活性化合物，

由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC₅₀-值与针对该相同受体的该相同结合对在pH 7.4确定的EC₅₀-值的比率为10以上。

本文报道的一个方面是对受试者的上皮细胞进行胞吞转运的方法，所述方法包括给所述受试者施用融合多肽，所述融合多肽包含：

-至少一个药学活性化合物，

由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC₅₀-值与针对该相同受体的该相同结合对在pH7.4确定的EC₅₀-值的比率为10以上。

本文报道了一种递送药学活性化合物穿过个体中的血脑屏障的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的融合多肽，所述融合多肽包含：

-至少一个药学活性化合物，

由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC₅₀-值与针对该相同受体的该相同结合对在pH 7.4确定的EC₅₀-值的比率为10以上，从而使得所述融合多肽递送药学活性化合物穿过血脑屏障。

一方面本文报道了融合多肽在制备药物中的应用，所述融合多肽包含：

-至少一个药学活性化合物，

一方面，本文报道了一种相对于非缀合形式的一个或多个药学活性化合物穿过血脑屏障的转运而言增加至少一个药学活性化合物穿过个体中的血脑屏障的转运的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的融合多肽，所述融合多肽包含：

-至少一个药学活性化合物，

由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC₅₀-值与针对该相同受体的该相同结合对在pH 7.4确定的EC₅₀-值的比率为10以上，从而使得所述融合多肽转运所述药学活性化合物穿过血脑屏障。

一方面，本文报道了一种选择用于一个或多个药学活性化合物的有效血脑屏障转运的结合对的方法，所述方法包括测量一个或多个结合对与内在化的细胞表面受体在pH 5.5和pH 7.4的结合的EC₅₀-值的比率，并且选择其中比率为10以上的一个或多个结合对。

在全部方面的一个实施方案中，所述融合多肽特征在于与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值与针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值的比率为15以上。在还有一个实施方案中，所述比率约为15。

在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC₅₀-值是与针对该相同受体的该相同结合对在pH7.4确定的EC₅₀-值的至少5倍。在一个实施方案中，在pH 5.5确定的EC₅₀-值是在pH 7.4确定的EC₅₀-值的至少10倍。在一个实施方案中，在pH 5.5确定的EC₅₀-值约是在pH 7.4确定的EC₅₀-值的15倍。

一方面，本文报道如本文所报道的融合多肽用于递送药学活性化合物穿过血脑屏障的应用。

一方面，本文报道一种对受试者的上皮细胞进行胞吞转运的方法，所述方法包括给所述受试者施用如本文所报道的融合多肽。

一方面，本文报道一种用于选择抗体或融合多肽的方法，所述抗体或融合多肽包含至少一个结合位点，其中所述抗体或融合多肽关于与内在化的细胞表面受体结合在pH 5.5确定的EC₅₀-值高于针对该相同受体的该相同抗体或该相同融合多肽在pH 7.4确定的EC₅₀-值。

在全部方面的一个实施方案中，所述抗体或融合多肽特征在于与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值与针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值的比率至少为5。在一个实施方案中，所述比率为10以上。在一个实施方案中，所述比率为15以上。在一个实施方案中，所述比率约为15。

在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值是针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值的至少5倍。在一个实施方案中，在pH 5.5确定的EC₅₀-值是在pH 7.4确定的EC₅₀-值的至少10倍。在一个实施方案中，在pH 5.5确定的EC₅₀-值约是在pH 7.4确定的EC₅₀-值的15倍。

在本文所报道的全部方面的一个实施方案中，所述CNS-相关的疾病选自：(i)神经变性疾病或病症，如帕金森病、阿尔茨海默病或亨廷顿病，或(ii)精神病，如抑郁症、焦虑症、精神***症(schizophrenia)，或(iii)神经炎症和其他神经病症，如多发性硬化(multiple sclerosis)、肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis)、孤独症(autism)或疼痛，或(iv)CNS的肿瘤，或(v)CNS的病毒和细菌感染。

发明详述

本发明证明了pH-依赖性结合模式能够使得包含至少一个结合位点的融合多肽多肽和针对胞吞转运受体的抗体有效地穿过屏障细胞的紧密层。例如，表明针对人转铁蛋白受体的抗体，与其在pH 7.4的亲和力相比，其在pH 5.5结合亲和力低，该抗体被胞吞转运穿过血脑屏障内皮细胞，而在这两个pH值处表现出相等的对转铁蛋白受体的有效结合的另一种抗体在细胞内被降解。本发明允许选择和产生针对胞吞转运受体的抗体，所述抗体由于针对这些受体的pH-依赖性的、可逆的结合引起的改变的分拣行为而避免内皮或上皮屏障细胞中的胞内降解。

I.定义

术语“亲和力”表示分子(例如，多肽或抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，靶标或抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，当用在本文中时，“结合亲和力”是指反映结合对的成员之间(例如，以多肽-多核苷酸-复合物中，或在多肽与其靶标之间，或在抗体与其抗原之间)的1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的的常用方法测量，诸如表面等离子体共振，并且还包括本文所报道的那些方法。分子X对齐结合配偶体Y的较高的亲和力可见于较低的Kd和/或EC₅₀值。

术语“抗体”包括各种形式的抗体结构，包括完整抗体和抗体片段。本文所报道和应用的抗体可以是人抗体、人源化的抗体、嵌合抗体或T细胞抗原消耗的抗体(T cell antigen depleted antibody)。术语“抗体”是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。识别的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及众多的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在，包括，例如，Fv、Fab和F(ab)₂以及单链(scFv)或双抗体。全长抗体通常包括两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。重链和轻链多肽中的每一个包含可变结构域(可变区)(通常是所述多肽链的氨基端部分)，所述可变结构域包含能够与抗原相互作用的结合区。重链和轻链多肽中的每一个包含恒定区(通常是羧基端部分)。重链的恒定区介导i)抗体与携带Fcγ受体(FcγR)的细胞(如吞噬细胞)的结合，或ii)抗体与携带新生Fc受体(FcRn)(也已知为Brambell受体)的结合。其还介导与一些因子的结合，所述因子包括经典补体***的因子，如补体(Clq)。

免疫球蛋白的轻链或重链的可变结构域又包含不同的节段，即，四个构架区(FR)和三个超变区(CDR)。

术语“结合对(binding pair)”表示多肽，其包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。可变结构域可以通过适当的方式如肽键、接头、或连接非肽成分彼此连接。在一个实施方案中，所述结合对选自Fv,Fab,Fab′,Fab’SH,F(ab′)₂，双抗体，线性抗体，单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体，全长重链，全长轻链，完整抗体，双特异性抗体，三特异性抗体，四特异性抗体，或六特异性抗体。在一个实施方案中，所述结合对是单克隆抗体。在一个实施方案中，结合对至少是完整抗体的片段，免疫球蛋白超家族的成员，或保留对其抗原的结合特异性的具有免疫球蛋白样结构的多肽。

术语“结合位点”表示能够特异性结合另一多肽的多肽。在一个实施方案中，所述结合位点是结合对。在一个实施方案中，所述结合位点是具有免疫球蛋白样模块结构的多肽，其可以选自由下列各项组成的组：纤连蛋白，TCR,CTLA-4，单链抗原受体，例如，与T细胞受体和抗体相关的那些，抗体模拟物，转铁蛋白，载脂蛋白，adnectins，基于anticalins的分子，phylomers,avimers,affibodies，锚蛋白重复，Kunitz结构域，PDZ-结构域，蝎毒素免疫性蛋白，Knottins,Versabodies，绿色荧光蛋白和其他具有抗原结合特性的非抗体蛋白支架。

术语“CNS-相关的疾病”表示中枢神经***(CNS)的疾病或病症。CNS-相关的疾病为，但不限于，特别是(i)神经变性疾病或病症，如帕金森病、阿尔茨海默病或亨廷顿病，(ii)精神病，如抑郁症、焦虑症、精神***症，(iii)神经炎症和其他神经病症，如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、孤独症或疼痛，(iv)CNS的肿瘤，或(v)CNS的病毒和细菌感染。

“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)CYTOXAN^TM；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimines)和methylamelamines，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、塞替哌(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、葸霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、carabicin、去甲柔红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿物如frolinic acid；醋葡醛内酯(aceglatone)；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托葸醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；***糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxanes)，例如，紫杉醇(TAXOL

Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，新泽西)和多西他赛(docetaxel)(TAXOTERE

Rh6ne-PoulencRorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycins C)；米托葸醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-II；35拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine)(DMFO)；视黄酸(retinoic acid)；烯二炔葸环类抗生素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；以及任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。该定义中还包括抗激素剂，其作用调节或抑制对肿瘤的激素作用，如抗***药，例如，包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，抑制芳香酶的4(5)-咪唑类(4(5)-imidazoles)，4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素药，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。

“抗血管生成剂”是指阻断或在某种程度上干扰血管发展的化合物。例如，抗血管生成剂可以是与参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。在一个实施方案中，所述抗血管生成剂是与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。

术语“细胞因子”是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个细胞起细胞间调节剂作用的蛋白。此种细胞因子的实例是淋巴细胞因子(lymphokines)、单核细胞因子(monokines)和传统的多肽激素。细胞因子中包括的是生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原(proinsulin)；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如***(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和促***(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-a和-P；苗勒氏管抑制物质(mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠***相关肽；抑制素(inhibin)；活化素(activin)；血管内皮生长因子；整联蛋白(integrin)；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-p；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF-a和TGF-p；***-I和-II；***(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-a、-p和-y，集落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(GCSF)；白细胞介素(ILs)如IL-I、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-II、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-P；和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。当用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。

术语“fMLP”表示由N-甲酰甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽。在一个实施方案中，效应子部分为fMLP或其衍生物。

术语“融合多肽”表示这样的多肽，所述多肽包含至少两个离散的肽或多肽(在天然多肽中不以这种方式一起存在，即，这些部分不天然存在于同一种多肽中或以相同的顺序存在)，或由至少两个离散的肽或多肽(在天然多肽中不以这种方式一起存在，即，这些部分不天然存在于同一种多肽中或以相同的顺序存在)组成。所述融合多肽的各部分通过肽键连接。

术语“肽接头”表示天然的和/或合成来源的接头，其包含彼此通过肽键连接的氨基酸残基。其由线性氨基酸链组成，其中20种天然存在的氨基酸是单体结构单元。链的长度为1至50个氨基酸残基，在一个实施方案中，3-28个氨基酸残基，在另一个实施方案中，4-20个氨基酸残基。接头可以包含重复的氨基酸序列或天然存在的多肽的序列。接头的功能是确保通过所述接头连接的两种元件可以正确折叠并且由于空间和旋转自由度而正确呈现。在一个实施方案中，接头是“合成的肽接头”，其设计为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。例如，这些残基排列为多至五个氨基酸的小重复单位，如(G)GGGS,(Q)QQQG,或(S)SSSG(SEQ IDNO∶1,2和3)。这种小的重复单位可以重复两次至五次，以形成多聚体单位。其他合成的肽接头包含重复10-20次的单一氨基酸，诸如例如，在接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO∶4)中的丝氨酸。在一个实施方案中，接头选自[GQ₄]₃GNN(SEQ ID NO∶5),LSLSPGK(SEQ ID NO∶6),LSPNRGEC(SEQ ID NO∶7),LSLSGG(SEQ ID NO∶8),LSLSPGG(SEQID NO∶9),G₃[SG₄]₂SG(SEQ ID NO∶10)或G₃[SG₄]₂SG₂(SEQ ID NO∶11)。

术语“前体药物”用在本申请中是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其较亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒性更小并且能够被酶活化或转化为更具活性的亲本形式。例如，参见Wilman,″Prodrugs in CancerChemotherapy(癌症化疗中的前体药物)″Biochemical SocietvTransactions(生物化学学会学报)，14，第375-382页，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人，″Prodrugs∶A Chemical Approach to Targeted DrugDelivery，(前体药物：靶向药物递送的化学方法)″Directed DrugDelivery(定向药物递送)，Borchardt等人，(编辑)，第247-267页，HumanaPress(1985)。可以用作效应子部分的前体药物包括，但不限于，含磷酸盐的前体药物，含硫代磷酸盐的前体药物，含硫酸盐的前体药物，含肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化前体药物，含β-内酰胺的前体药物，任选取代的含苯氧基乙酰胺的前体药物或任选取代的含苯基乙酰胺的前体药物，可以被转化为更具活性的无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟胞嘧啶前体药物。可以被衍生成用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括，但不限于，本文所述的那些化疗剂。

术语“细胞毒性部分”是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞破坏或死亡的物质。细胞毒性剂包括，但不限于，放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、p³²、pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药(例如，甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂(intercalating agents))；生长抑制剂；酶及其片段，如核水解酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及本文所公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。

药剂、例如药物制剂的“有效量”是指以需要的剂量并且持续所需的时间阶段有效获得需要的治疗结果或预防结构的量。

术语“EC₅₀-值”表示多肽(例如抗体)在确定***(例如ELISA)中诱导在基线值和最大值之间的50％的反应的半最大有效浓度。这是对治疗性药物功效的量度。因此，EC₅₀-值为基于与导致50％效果的药物物质的浓度相对应的实验数据计算的浓度。减小的EC₅₀-值表示较高的药物亲和力和功效。

“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的抗体或利用人抗体全体成员或其他编码人抗体的序列而来源于非人资源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化的抗体。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定的实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常两个如下可变结构域，其中所有或基本上所有HVRs(例如CDRs)对应于非人抗体的HVRs，且所有或基本上所有FRs对应于人抗体的FRs。人源化抗体任选还将包含至少部分来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

“免疫缀合物”是与一个或多个非抗体来源的分子缀合的抗体或抗体片段，所述非抗体来源的分子包括，但不限于，结合对成员，核酸或效应子部分。

“个体”或受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化的动物(如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴子)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

术语“内在化的细胞表面受体”表示一组细胞表面受体，其包括至少下述成员：脱唾液酸糖蛋白受体，α(2,3)唾液酸糖蛋白受体，白喉毒素受体(DTR，其为肝素-结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的膜结合的前体)，叶酸受体，谷氨酸受体，谷胱甘肽受体，胰岛素受体，***(IGF)受体，瘦蛋白受体，低密度脂蛋白(LDL)受体，LDL-相关蛋白1受体(LRP1,B型)，LRP2受体(也已知为megalin或糖蛋白330)，LRP4受体，LRP5受体，LRP6受体，LRP8受体，甘露糖6-磷酸盐受体，清除受体(A或B类，I、II或III型，或CD36或CD163)，P物质受体，硫胺素转运蛋白，转铁蛋白-1和-2受体，和维生素B12受体。

术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(例如，该变体抗体包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)之外，构成群体的各个抗体相同并结合相同的表位。与多克隆抗体制剂相反，所述多克隆抗体制剂典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同的抗体，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，要用于本文所报道的融合多肽中的单克隆抗体或单克隆抗体片段可以通过多种技术制备，所述技术包括，但不限于，杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和使用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，所述方法和其他示例性的用于制备单克隆抗体的方法在本文中描述。

术语“药物制剂”是指一种制备物，其以允许其中包含的活性成分的生物活性有效的形式存在，并且其不包含对将要给药所述制剂的受试者有不可接受的毒性的另外的成分。

“药用载体”是指药物制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“跨细胞转运”表示分子、特别是大分子或生物聚合物如抗体转运穿过细胞的细胞质的多步骤过程。在跨细胞转运的第一步中，胞外空间物质/分子或细胞表面-缔合或-结合的分子被包绕在囊泡中。该步骤称为胞吞。囊泡扩散穿过细胞的细胞质。然后，胞吞步骤倒转，即，囊泡与细胞膜融合并且囊泡内部被释放到胞外空间中。例如，跨细胞转运发生在上皮细胞、血脑屏障的细胞、神经元或肠细胞中。

当用于本文时，“治疗”(及其语法变化，如“进行治疗”或“正在治疗”)是指尝试改变被治疗的个体的天然进程的临床干预，并且可以为预防的目的进行或在临床病理学的病程过程中进行。需要的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发，症状减轻，消除疾病的任何直接或间接的病理学后果，防止转移，减慢疾病进展速度，改善或减轻疾病状况，和缓和或改善预后。在一些实施方案中，本文所报道的融合多肽用于减缓疾病的发生或减慢疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链参与抗体与其抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FRs)和三个超变区(HVRs)(例如，参见T.J.，等人.，Kuby Immunology,6^thed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以用VH或VL结构域分别筛选互补VH或VL结构域的文库从结合抗原的抗体中分离(例如，参见Portolano,S.，等人.，J.Immunol.(免疫学杂志)150(1993)880-887，Clackson,T.，等人.，Nature(自然)352(1991)624-628)。

术语“载体”用在本文中是指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括自复制核酸结构的载体以及结合到已经引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

冠词“一个”(″a″和″an″)用在本文中是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法宾语。例如，“一个抗体”意指一个抗体或多于一个抗体。

“多肽”是由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，而不管是天然产生的还是合成产生的。少于约20个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”，而由两个或更多个多肽组成的分子或包含一个多于100个氨基酸残基的多肽的分子可以称为“蛋白”。多肽还可以包含非氨基酸成分，诸如碳水化合物基团，金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以由表达多肽的细胞加入，并且可以随细胞类型而变化。多肽在本文中根据其氨基酸骨架结构或编码其的核酸定义。诸如碳水化合物基团的添加通常不指定，但是也可以存在。

术语“特异性结合”表示结合位点或多肽或抗体或抗体片段与其靶标以10^-5M以下的解离常数(Kd)结合，在一个实施方案中，以10^-7M-10^-13M的解离常数(Kd)结合，在另一个实施方案中，以10^-7M-10^-9M的解离常数(Kd)结合。该术语还用于表明所述多肽不与其他存在的生物分子结合，即，其以10^-4M以上的解离常数(Kd)结合其他生物分子，在一个实施方案中，以10^-4M至1M的解离常数(Kd)结合其他生物分子。

术语“药学活性化合物”表示其活性需要被递送至作用位置的任意分子或分子组合。药学活性化合物包括，但不限于，药物(例如，多肽、抗体)，标记，细胞毒素(例如，假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素，蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，白喉毒素等)，酶，生长因子，转录因子，放射性核素，配体，脂质体，纳米颗粒，病毒颗粒，细胞因子等。

II.组合物和方法

本文报道的是融合多肽，使用其可以将治疗剂(生物活性化合物)如多肽、抗体或毒素转运穿过细胞膜，特别是穿过血脑屏障。因此，本文所报道的融合多肽利用一种通用的转运机制，即，受体介导的胞吞作用和利用内在化的细胞表面受体的胞吞转运作用。

在一个实施方案中，本文报道融合多肽，所述融合多肽包含：

-至少一个药学活性化合物，

由此与内在化的细胞表面受体结合的所述结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值与针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC₅₀-值的比率为10以上。

在一个实施方案中，所述比率为15以上。

在一个实施方案中，所述比率为100以上。

在一个实施方案中，所述比率为10-100。

在一个实施方案中，所述结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值为700ng/ml以上。在一个实施方案中，所述结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值为850ng/ml以上。在一个实施方案中，所述结合位点在pH 5.5确定的EC₅₀-值为1000ng/ml以上。

在一个实施方案中，所述结合位点为结合对，其包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。在一个实施方案中，所述结合对选自Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)₂、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体、全长重链、全长轻链、完整抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体或六特异性抗体。在一个实施方案中，所述结合对是完整的单克隆抗体。在一个实施方案中，所述结合对至少是完整抗体的片段、免疫球蛋白超家族的成员或具有免疫球蛋白样结构的多肽，其保留对其抗原的结合特异性。

在一个实施方案中，所述结合位点选自纤连蛋白，TCR，CTLA-4，单链抗原受体，例如，与T细胞受体和抗体相关的那些，抗体模拟物，转铁蛋白，载脂蛋白，adnectins，基于anticalins的分子，phylomers，avimers，affibodies，锚蛋白重复，Kunitz结构域，PDZ-结构域，蝎毒素免疫性蛋白，Knottins，Versabodies，绿色荧光蛋白和其他具有结合特性的非抗体蛋白支架。

在一个实施方案中，所述结合位点是特异性结合转铁蛋白受体的全长抗体或抗体片段。

不希望受理论束缚，图1显示pH-依赖性胞吞转运机制的示意图。负载铁的完整的转铁蛋白(holo-transferrin)(中间图)用来自脑内皮细胞的顶侧膜的转铁蛋白受体胞吞转运。当内体酸化时，铁从所述完整的转铁蛋白释放，这由该受体的转铁蛋白-结合结构域的构象变化起始。Apo-转铁蛋白保持与所述受体结合。在穿过分拣内体后，该受体再循环到顶侧膜或胞吞转运到底外侧膜中。在囊泡膜融合后，在pH 7.4对所述受体无亲和性的apo-转铁蛋白从所述受体解离并且离开细胞。相反(左图)，转铁蛋白-受体抗体mAb 128.1，其在pH 7.4和在pH 5.5以高亲和力与受体结合，即，具有小于5的EC₅₀值比率(1.3)，其与所述受体形成紧密的复合物，该复合物在内体中在该pH值也是稳定的。pH-稳定的复合物的存在防止再循环和胞吞转运，而不是诱导该受体重新进入到CD63-阳性晚期内体中。具有pH依赖性结合特性的抗-转铁蛋白-受体抗体(由抗体MEM-189示例，其在内体pH的减少的(酸性)pH值表现出减少的受体结合；右图，大于10的EC₅₀值比率(15.6))能够进行胞吞转运和再循环，不受理论束缚，可能通过在内体隔室中与转铁蛋白-受体的可逆的、低亲和力相互作用进行。

图3中，显示本文所用的胞吞转运测定的验证，其通过胞吞转运¹²⁵I-转铁蛋白穿过hCMEC/D3脑内皮细胞进行。将在胶原-包被的滤器***物上的hCMEC/D3细胞用¹²⁵I-标记的转铁蛋白装载1小时。然后，洗涤该***物并且在37℃(图3A)或4℃(图3B)转移到新平板中。在所示的时间点，通过在TCA沉淀后的γ计数(CPM)测量细胞裂解物(黑色正方形)、顶侧(灰色柱)和底外侧(白色柱)介质隔室中的放射性活性。每个时间点的放射性活性的总和显示为白色三角形。尽管在37℃，转铁蛋白以相等的量离开细胞层进入顶侧或底外侧介质隔室(A)，但是在4℃，其停留在细胞内(B)，这证明转运过程是能量依赖性的。

在图4中，显示针对人转铁蛋白受体的mAb 128.1不离开hCMEC/D3细胞。¹²⁵I-标记的mAb 128.1允许被hCMEC/D3细胞摄入，并且如上述在细胞、顶侧和底外侧介质隔室中确定放射性活性(图3)。没有完整的抗体离开细胞进入顶侧或底外侧隔室。相反，细胞内放射性活性缓慢降低，这提供抗体胞内降解的提示。

在图5中，显示针对人转铁蛋白受体的mAb 128.1，与转铁蛋白不同，在内在化后于晚期内体标记CD63共同定位。将在胶原包被的盖玻片上生长的hCMEC/D3细胞用mAb 128.1或FITC-标记的转铁蛋白温育十分钟，然后处理用于免疫荧光。mAb 128.1用Alexa-488-标记的二级抗体检测(A)，图C显示转铁蛋白-FITC荧光。两种制备物都用针对晚期内体标记CD63的抗体和Alexa-594-标记的二级抗体复染色(B，D)。尽管mAb 128.1显示与CD63共同定位，但是在晚期内体/溶酶体隔室中没有发现转铁蛋白，这表明通过mAb 128.1转铁蛋白受体离开再循环/胞吞转运重新进入降解交通途径。

在图6中，显示针对人IGF-1受体的抗体(抗-IGF-1R抗体)不被胞吞转运，而是再循环到胞外介质中。胞吞转运实验如上述(参见图2和3)进行，不同之处在于抗体定量不通过放射性活性计数进行而是通过使用高灵敏性的人IgG ELISA进行。可以看出，抗-IGF-1R抗体不被胞吞转运，而是再循环到顶侧隔室中，这证明IGF-1受体专有地在血脑屏障内皮细胞中再循环。

在图7中，显示针对人转铁蛋白受体的mAb MEM-189，与mAb 128.1不同，被再循环并被胞吞转运。实验按上述(见图6)进行，使用小鼠IgGELISA进行定量。与mAb 128.1相反，mAb 128.1不存在于顶侧或底外侧隔室中(见上述，图4)，mAb MEM-189以相等的量再循环和胞吞转运，其转运速率略低于转铁蛋白的转运速率(也参见图3A)。

在图8中，显示mAb MEM-189以pH-依赖性方式与转铁蛋白受体结合，而mAb 128.1不显示pH-依赖性的结合。通过ELISA测量抗体128.1和MEM-189与人转铁蛋白受体胞外结构域在pH 7.4(胞外pH)或pH 5.5(内体pH)的结合。尽管mAb 128.1在这两个pH值处与该受体以相似的亲和力结合(pH 7.4为三角形，pH 5.5为十字形)，但是mAb MEM-189在pH 5.5(倒三角形)表现出与pH 7.4(圆形)相比强烈减少的结合。在pH 7.4，mAb MEM-189与受体的结合比mAb 128.1与受体的结合弱(见下表中的EC₅₀-值)。在下表中，显示针对细胞表面受体的各种抗体的EC₅₀值及其各自的EC₅₀值比率。

表

在图9中，显示mAbs 128.1与MEM-189竞争转铁蛋白受体上的同一表位。将转铁蛋白受体胞外结构域包被到微量滴定平板上，并且在检测各种其他mAb的结合之前，用mAbs 128.1或MEM-189预先温育。与在不存在mAb 128.1条件下的结合(圆形)相比，通过mAb 128.1预先温育完全阻断mAb MEM-189与受体的结合(倒三角形)。相反，mAb 128.1与受体的结合不被mAb MEM-189预先温育所抑制(分别为三角形和十字形)。综上所述，mAb MEM-189与mAb 128.1竞争人转铁蛋白受体上的同一表位。mAb MEM-189不能防止mAb 128.1结合的事实可由mAb 128.1的显著更高的亲和力来解释。

在图10中，显示针对人转铁蛋白受体的抗体M-A712和13E4(二者都不展现出pH-依赖性的结合)不被胞吞转运穿过hCMEC/D3细胞。

上述数据清楚证明关于抗体胞吞转运的基本特征不是受体表位，而是对受体的结合亲和力和结合亲和力的pH-依赖性变化。

1.亲和力

在一些实施方案中，本文所提供的融合多肽的结合位点具有≤10μM,≤1μM,≤100μM,≤10nM或≤1nM的解离常数(Kd)(例如，在一个实施方案中，约10^-5M至约10^-9M，或者在另一个实施法案中，约10^-7M或更小，例如，10^-7M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)。

在一个实施方案中，Kd通过如下述测定所述进行放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量，其中结合位点是抗体与其抗原的Fab片段。FABs对抗原的溶液结合亲和性通过在存在滴定系列的未标记的抗原的条件下用最低浓度的(¹²⁵I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体-包被的平板捕获结合的抗原而测量(例如，参见Chen,Y，等人.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293(1999)865-881)。为了确定测定的条件，将MICROTITER

多孔平板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，然后用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目的Fab的系列稀释液混合(例如，与抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致，在Presta,L.G.，等人.，Cancer Res.(癌症研究)57(1997)4593-4599中)。然后，将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续更久的时间阶段(例如，约65小时)，以确保达到平衡。然后，将混合物转移到捕获平板上，用于在室温温育(例如，一小时)。然后，去除溶液，并且将平板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20

洗涤八次。当平板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20^TM；Packard)，将该平板在TOPCOUNT^TMγ计数仪(Packard)上计数十分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定。

按照另一个实施方案，Kd是通过表面等离子体共振测定法使用BIACORE

-2000或BIACORE

-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在～10个应答单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE，Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE

Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293(1999)865-881。如果根据上文表面等离子体共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(stop-flow equipped spectrophometer)(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirred cuvette)的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文所报道的融合多肽包含抗体片段作为结合位点。抗体片段包括，但不限于，Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)₂,Fv，和scFv片段，以及下文所述的其他片段。对于特定的抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.，等人.，Nat.Med.(自然医学)9(2003)129-134。对于scFv片段的综述，例如，参见Plueckthun,A.，在：The Pharmacology of MonoclonalAntibodies(单克隆抗体的药理学)，Vol.113,Rosenburg和Moore(编)，Springer-Verlag,New York(1994)，第269-315页；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894与5,587,458。关于包含补救受体(salvage receptor)结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性。例如，参见EP 0 404 097；WO 1993/01161;Hudson,P.J.，等人.，Nat.Med.(自然医学)9(2003)129-134;和Holliger,P.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)6444-6448。Hudson,P.J.，等人.，Nat.Med.(自然医学)9(2003)129-134中还记述了三价抗体和四价抗体。

单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分的轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。

抗体片段可以通过多种技术制备，所述技术包括，但不限于，蛋白水解消化完整的抗体和通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)制备，如本文所述。

3.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文所报道的融合多肽是多特异性融合多肽，例如，双特异性融合多肽。多特异性融合多肽具有针对至少两个不同位点的结合特异性。在某些实施方案中，所述结合特异性中的一种使针对内在化的细胞表面受体，另一种是针对治疗性靶标。在某些实施方案中，双特异性融合多肽可以结合所述内在化的细胞表面受体的两个不同的表位。双特异性融合多肽可以制备为全长融合多肽或融合多肽片段。

在一个实施方案中，所述融合多肽的结合位点是完整的抗体。

用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.，Nature(自然)305(1983)537-540),WO 93/08829，和Traunecker,A.，等人.，EMBO J.10(1991)3655-3659)，和“凸起-入-孔洞”改造(例如，参见美国专利号5,731,168)。也可通过以下方法制得多特异性抗体：改造用于制备抗体Fc-异二聚分子的静电导引效应(WO 2009/089004A1)；将两种以上抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980，及Brennan,M.，等人.，Science(科学)，229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.，等人.，J.Immunol.(免疫学杂志)148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”技术来制得双特异性抗体片段(参见例如Holliger,P.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber,M.，等人.，J.Immunol.(免疫学杂志)，152(1994)5368-5374)；及如例如Tutt,A.，等人.，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。

本文中也包括具有三个以上功能性抗原结合位点的经改造的抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见，例如US 2006/0025576A1)。

所述抗体或片段也包括包含结合至内在化的细胞表面受体以及另一种不同的抗原的抗原结合位点的“双重作用FAB”或“DAF”(例如参见US2008/0069820)。

本文的抗体或片段还包括WO 2009/080251,WO 2009/080252,WO 2009/080253,WO 2009/080254,WO 2010/112193,WO 2010/115589,WO 2010/136172,PCT申请号PCT/EP2010/003559或PCT申请号PCT/EP2010/003560中所述的多特异性抗体。

4.衍生物

在某些实施方案中，本文所报道的融合多肽可以被进一步修饰以包含本领域已知的和易于获得的另外的非蛋白样部分。适于用于融合多肽的衍生的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚丙烯氧/乙烯氧共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇，以及它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性在制备中可能具有优点。聚合物可以似乎任意分子量的，并且可以是分支的或无分支的。连接到抗体上的聚合物的数目可以变化，并且如果连接多于一种聚合物，则其可以是相同的或不同的分子。通常，可以基于下述考虑确定用于衍生的聚合物的数目和/或类型：所述考虑包括，但不限于，要改善的抗体的特定的特性或功能，抗体衍生物是否要用在限定条件下的治疗中，等等。

在另一个实施方案中，提供融合多肽与可以通过暴露于射线而选择性加热的非蛋白样部分的缀合物。在一个实施方案中，所述非蛋白样部分是碳纳米管(Kam,N.W.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)102(2005)11600-11605)。射线可以是任意波长的，并且包括，但不限于，不伤害普通细胞但是其加热所述非蛋白样部分至杀死邻近所述抗体-非蛋白样部分的细胞的温度的波长。

5.测定

本文所报道的融合多肽或其成分可以通过本领域已知的各种测定来鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

5.1结合测定和其他测定

在一个方面中，检测本文所报道的融合多肽的结合位点的细胞表面受体结合活性，例如，通过已知的方法，如ELISA、蛋白质印迹等方法检测。

在一个方面中，可以使用竞争测定来鉴定其他结合位点，特别是与mAb MEM-189竞争结合转铁蛋白受体的抗体或抗体片段。在某些实施方案中，所述竞争性抗体与mAb MEM-189结合的相同的表位(例如，线性或构象表位)。Morris,G.E.,(ed.),“Epitope Mapping Protocols(表位绘图方法),”在：Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)，Vol.66，Humana Press,Totowa,NJ(1996)中提供关于绘制表位图谱的详细的示例性方法。

作为参照抗体的“与相同表位结合的抗体”是指在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合的抗体，并且相反地，所述参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的所述抗体与其抗原的结合。

例如，人转铁蛋白受体胞外结构域与人IgGl Fc连接的融合蛋白可以通过在RT温育50μl在PBS中的1μg/ml的溶液1h而包被到96孔平板上。在用PBS/1％(w/v)BSA封闭1h和用PBS/0.1％(w/v)吐温洗涤四次后，可以向该平板中加入在调节至pH 7.4或pH 5.5的PBS/0.1％(w/v)BSA中的不同浓度的待测抗体，并且在RT温育1.5h。在用PBS/0.1％(w/v)吐温洗涤四次后，结合的抗体可以用HRP-偶联的二级抗体(30min.,RT)和50μl TMB底物检测。可以通过加入50μl 1N盐酸(HCl)终止显色，并且可以在平板读数仪中在450nm测量吸光度。

5.2活性测定

用于hCMEC/D3的培养基和补充物(参见WO 2006/056879和Weksler,B.B.，等人.，FASEB J.19(2005)1872-1874)可以从Lonza获得。hCMEC/D3细胞(第26-29代)可以在胶原包被的盖玻片上(显微镜)或烧瓶中在含有2.5％FBS、四分之一并且与补充的氢化可的松完全互补的供应的生长因子、庆大霉素和抗坏血酸的EBM2培养基中培养至汇合。

对于所有的胞吞转运测定，可以在12-孔细胞培养板中使用高密度孔(1×10⁸个孔/cm²)PET膜滤器***物(0.4μm孔尺寸，12mm直径)。用于顶侧室和底外侧室的培养基体积分别计算为400μl和1600μl。滤器***物的顶侧室可以用大鼠尾胶原I(7.5μg/em²)包被，然后用纤连蛋白(5μg/ml)包被，每次温育在RT持续1h。在EBM2培养基中10-12天，hCMEC/D3细胞可以生长至汇合的单层(～2×10⁵个细胞/cm²)。在测定前，可以将空滤器在含有1％BSA的PBS中封闭1h或过夜(o/n)，然后在测定前在EBM2中校正至少1h。

测定(关于测定方案参见图2)可以在不含血清的EBM2培养基(其另外如本文所述重构)中进行。在测定那天，将细胞进行血清-饥饿60min，以消耗尽待检测的内在化的细胞表面受体的天然配体。有或无(但是在完全培养基中封闭过夜)细胞的滤器***物在顶侧用所述待测的内在化的细胞表面受体的放射性标记的天然配体，即，¹²⁵I-标记的或未标记的单克隆抗体在37℃温育1h。之后，收集全部的顶侧体积和底外侧体积。可以由所确定的值计算细胞旁流量。在RT在不含血清的培养基中顶侧(400μl)和底外侧(1600μl)洗涤单层三次，每次3-5min。收集所有的洗涤体积，以监测去除未结合的配体或抗体的效率。向顶侧室中加入预先温育的培养基，并且将滤器转移至含有1600μl预先温育的培养基的新的12孔平板(用含有1％BSA的PBS封闭过夜)中。在该点，将有或无细胞的滤器在500μl RIPA缓冲液中裂解，以确定特异性配体或抗体摄入。其余滤器在37℃或在4℃温育，并且在多个时间点收集样品以确定配体或抗体的顶侧和/或底外侧的释放。使用三氯乙酸(TCA)沉淀法评估完整的和降解的¹²⁵I-标记的天然配体或¹²⁵I-标记的抗体。可以通过γ射线计数而确定上清或裂解物中的放射活性的天然配体或抗体的量。样品中未标记的抗体的含量可以使用高选择性IgG ELISA量化(参见实施例3)。对于每个时间点，数据应该从两个空白滤器和三个滤器细胞培养物产生。

6.重组方法和组合物

融合多肽可以使用重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供编码本文所报道的融合多肽的分离的核酸。在另一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经转化)一个或多个载体，所述载体包含编码含有所述融合多肽的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0,NS0,SP2/0细胞)。在一个实施方案中，提供制备本文所报道的融合多肽的方法，其中所述方法包括在适于所述融合多肽表达的条件下培养如上文提供的包含编码所述融合多肽的核酸的宿主细胞，并且任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述融合多肽。

对于本文所报道的融合多肽的重组生产，分离编码本文所报道的融合多肽的核酸，例如，如上文所述，并且***到一个或多个载体中，用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。所述核酸可以易于使用常规步骤分离并测序。

适用于多肽-编码载体的克隆或表达的宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。对于抗体片段和多肽的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237,5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,K.A.，在：Methods in MolecularBiology(分子生物学方法)，Vol.248,Lo,B.K.C.,(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2003)，第245-254页，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，多肽可以以可溶级分与细菌细胞浆分离，并且可以进一步纯化。

除了原核生物，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母菌，也是用于多肽-编码载体的合适的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌菌株，导致产生具有部分或完全的人糖基化模式的融合多肽。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.(自然生物技术)22(2004)1409-1414,和Li,H.，等人.，Nat.Biotech.(自然生物技术)24(2006)210-215。

适于表达糖基化多肽的宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了多种杆状病毒毒株，其可以与这些昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

植物细胞培养物也可以用作宿主。例如，参见美国专利号5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是转化了SV40的猴肾CVl细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(293或293细胞，如例如在Graham,F.L.，等人.，J.Gen.Virol.36(1977)59-74中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如在Mather,J.P.，等人.，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub,G.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0,NS0和Sp2/0。对于适用于抗体制备的特定的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.，在Methods inMolecular Biology(分子生物学方法)，Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2004)第255-268页中。

7.免疫缀合物

本文还提供融合多肽，其中成分中的至少一个，如效应子部分，例如是细胞毒性剂，如化疗剂或化疗药，生长抑制剂，毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素、或其片段)或放射活性同位索。

在一个实施方案中，所述效应子部分是药物或药学活性化合物，包括，但不限于，美坦生类化合物(参见US 5,208,020,US 5,416,064,EP 0 425235),auristatin，如单甲基auristatin药物部分DE和DF(MMAE和MMAF，参见US 5,635,483,US 5,780,588,US 7,498,298)，多拉司他汀(dolastatin)，加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374,US5,714,586,US 5,739,116,US 5,767,285,US 5,770,701,US 5,770,710,US5,773,001,US 5,877,296,Hinman,L.M.,等人.，Cancer Res.(癌症研究)53(1993)3336-3342,Lode,H.N.，等人.，Cancer Res.(癌症研究)58(1998)2925-2928)，葸环类抗生素如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz,F.，等人.，Current Med.Chem.(现代药物化学)13(2006)477-523,Jeffrey,S.C.，等人.，Bioorg.Med.Chem.Letters(生物有机医学化学通信)16(2006)358-362,Torgov,M.Y.，等人.，Bioconjug.Chem.(生物缀合物化学)16(2005)717-721,Nagy,A.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国家科学院学报)97(2000)829-834,Dubowchik,G.M.，等人.，Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机医学化学通信)12(2002)1529-1532,King,H.D.，等人.，J.Med.Chem.(医学化学杂志)45(2002)4336-4343，和US 6,630,579)，甲氨蝶呤，长春地辛，紫杉烷如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛(1arotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)，单端孢霉烯族化合物(trichothecene)和CCl065。

在另一个实施方案中，所述效应子部分是酶活性毒素或其片段，包括，但不限于，白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。

在另一个实施方案中，所述效应子部分是放射活性原子。多种放射活性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，p³²，pb²¹²和Lu的放射活性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，可以包括用于闪烁法研究的放射活性原子，例如，Tc⁹⁹m或I¹²³，或用于核磁共振(NMR)成像(还已知为磁共振成像，MRI)的自旋标记，同样如I¹²³，I¹³¹，In¹¹¹，F¹⁹，C¹³，N¹⁵，O¹⁷，钆，锰或铁。

可以使用多种双官能蛋白偶联剂将效应子部分融合到本文所报道的融合多肽的结合位点，所述双官能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物成分(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta,E.S.，等人，Science(科学)238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与融合多肽缀合的示例性螯合剂(参见WO 94/11026)。用于将毒性部分缀合到本文所报道的融合多肽上的接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari，R.V.，等人，Cancer Research(癌症研究)52(1992)127-131，US 5,208,020)。

可以通过接头将效应子部分融合到本文所报道的融合多肽的结合位点，例如其为，但不限于，用交联接头试剂制备的所述缀合物，所述交联接头试剂包括，但不限于，BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP,SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，硫代-EMCS，硫代-GMBS，硫代-KMUS，硫代-MBS，硫代-SIAB，硫代-SMCC，和硫代-SMPB，以及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，这些是可商购的(例如，购自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，IL.，USA)。

可以通过肽接头将效应子部分融合到结合位点。在一个实施方案中，所述肽接头具有4-20个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述接头在重复-基序-分子之间是相同，在另一个实施方案中，缀合物包含具有两种以上不同氨基酸序列的接头。在另一个实施方案中，所述接头选自(G₃S)，(G₃S)₂，(G₃S)₃，(G₃S)₄，(G₃S)₅，(G₄S)，(G₄S)₂，(G₄S)₃，(G₄S)₄，(G₄S)₅(SEQ IDNO∶1和SEQ ID NO∶12to20)，特别选自(G₄S)₃和(G₄S)₄(SEQ ID NO∶18与SEQ ID NO∶19)。

8.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文提供的任意融合多肽可用于检测生物样品中由所述融合多肽中的结合位点特异性结合的靶标的存在。术语“检测”用在本文中涵盖定量或定性检测。

在一个实施方案中，提供所述融合多肽用于诊断或检测方法。在另一个方面中，提供检测生物样品中本文所报道的融合多肽的结合位点或效应子部分的靶标的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使生物样品与本文所报道的融合多肽在允许结合位点或效应子部分预期靶标结合的条件下接触，并且检测是否在所述融合多肽与所述靶标之间形成复合物。所述方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，本文所报道的所述融合多肽用于选择适合使用所述融合多肽中所包含的分离的多肽治疗的受试者，例如，其中靶标是用于选择患者的生物标记。

在某些实施方案中，提供标记的融合多肽，即，其中效应子部分为标记的融合多肽。标记包括，但不限于，直接检测的标记(如荧光标记、发光标记、电子密度标记、化学发光标记和放射活性标记)以及间接检测的标记(例如，通过酶反应或分子相互作用)，如酶或配体。示例性的标记包括，但不限于，放射性同位素p³²，C¹⁴，I¹²⁵，H³和I¹³¹，荧光团，如稀土螯合剂或荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US 4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶，如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢的酶耦合从而氧化染料前体如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

III.药物制剂

通过将具有需要的纯度的所述融合多肽与一个或多个任选的药用载体混合而制备本文所报道的融合多肽的药物制剂(Osol，A.，(ed.)Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition(1980))，其采取冻干制剂或水性溶液的形式。药用载体在所采用的剂量和浓度通常对接受者是无毒的，所述药用载体包括，但不限于，缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵，氯化己烷双胺，苯扎氯铵，苯索氯铵，酚，丁醇或苯甲醇，对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，邻苯二酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇和间甲酚)，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸，单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂，诸如EDTA，糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇，成盐平衡离子，诸如钠，金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)，和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用载体还包括间质药物分散剂，如可溶的中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶的PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(

BaxterInternational，Inc.)。某些示例性的sHASEGPs和使用方法，包括rhuPH20，记述在US 2005/0260186和US 2006/0104968中。在一个方面中，sHASEGP与一个或多个另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体制剂记述在US 6,267,958中。水性抗体制剂包括US 6，171,586和WO 2006/044908中所述的那些，后一种制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的制剂还可含有超过一种所治疗具体适应证所必需的活性成分，特别是彼此没有不利影响的具有互补的活性的那些活性成分。所述活性成分适当地以对预定目的有效的量组合存在。

活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、包载在胶状药物递送***中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包载在粗滴乳状液中。此类技术披露于Osol，A.，(ed.)Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition(1980)。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当的实例包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质采取定型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊的形式。

要用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，通过经由无菌过滤膜过滤可以容易地实现无菌性。

IV.治疗方法和组合物

本文所报道的任意融合多肽(其中效应子部分是治疗活性化合物或可检测标记)可以用在治疗方法中。

在一个方面中，提供本文报道的融合多肽用作药物。在另一个方面中，提供用于治疗CNS-相关的疾病的融合多肽。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的融合多肽。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有CNS-相关的疾病的个体的方法中的融合多肽，所述方法包括给所述个体施用有效量的所述融合多肽。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括给所述个体施用有效量的至少一个另外的治疗剂。在其他实施方案中，本发明提供本文所报道的融合多肽用于逆转或稳定CNS-相关的疾病。在某些实施方案中，本发明提供用于逆转或稳定个体中的CNS-相关的疾病的融合多肽，其包括给所述个体施用有效量的所述融合多肽，从而逆转或稳定CNS-相关的疾病。上述实施方案中任一个所述的“个体”特别是人。

CNS-相关的疾病包括，例如，病毒或细菌疾病(如脑炎，脑膜炎)，癌症(如脑癌)，神经变性病(neurodegenerative diseases)(如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS，Lou Gehrig′s病)、多发性硬化)，急性病(如中风、物理创伤、脊髓损伤)，精神病(如焦虑症、抑郁症、癫痫症、发作病症(seizuredisorder)、精神***症、睡眠障碍)，认知疾病(如记忆力病、认知疾病)，脑血管病症(缺血性发作(ischemic stroke)、脑内出血、蛛网膜下出血(subarachnoid hemorrhage))，疼痛相关的疾病，朊病毒病(如克-雅病(Creutzfeldt Jakob disease)、牛海绵状脑病(bovine spongiformencephalopathy))或瘾病(如酒精中毒)。

如果本文所报道的融合多肽导致CNS-相关的疾病的逆转或稳定，则其是治疗有效的。

在一个实施方案中，效应子部分是治疗活性化合物，其结合脑来源的亲神经因子(BDNF)、睫状亲神经因子(CNTF)、神经胶质细胞亲神经因子(GDNF)、***(IGF)或神经生长因子(NGF)，或者修饰上述因子的活性。

在一个实施方案中，所述效应子部分是选自下述的治疗活性化合物：胆囊收缩素(CCK)，多巴胺，内啡肽，脑啡肽，γ-氨基-丁酸(GABA)，神经肽Y，物质P，促甲状腺激素释放激素(TRH)或血管活性肠肽(VIP)。

在一个实施方案中，所述效应子部分是选自下述的治疗活性化合物：抗惊厥药，抗焦虑剂，细胞因子，或多核苷酸，如siRNA。

在本文报道的其他方面中，提供本文所报道的融合多肽在制造或制备药物中的应用。在一个实施方案中，所述药物用于治疗CNS-相关的疾病。在另一个实施方案中，所述药物用在治疗CNS-相关的疾病的方法中，所述方法包括给患有CNS-相关的疾病的个体施用有效量的所述药物。在另一个实施方案中，所述药物用于逆转或稳定CNS-相关的疾病。在另一个实施方案中，所述药物用在逆转或稳定个体中的CNS-相关的疾病的方法中，所述方法包括给所述个体施用有效量的所述药物，以逆转或稳定CNS-相关的疾病。根据上述实施方案中任一个所述的“个体”可以是人。

在本文报道的其他方面中，提供用于治疗CNS-相关的疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向具有所述疾病的个体施用有效量的本文所报道的融合多肽。根据上述实施方案中任一个所述的“个体”可以是人。

在本文报道的其他方面中，提供用于逆转或稳定个体中的CNS-相关的疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给所述个体施用有效量的本文所报道的融合多肽，以逆转或稳定CNS-相关的疾病。在一个实施方案中，“个体”是人。

在本文报道的其他方面中，提供包含本文提供的任一种融合多肽的药物制剂，例如，所述药物制剂用于上述治疗方法中的任一种中。在一个实施方案中，所述药物制剂包含本文提供的融合多肽中的任一种和药用载体。在另一个实施方案中，所述药物制剂包含本文所报道的任一种融合多肽和至少一个另外的治疗剂。

本文所报道的融合多肽可以单独或与其他药剂组合用在治疗中。例如，本文所报道的融合多肽可以与至少一个另外的治疗剂共同施用。

上文所述的这样的组合治疗包括组合施用(两种以上的治疗剂包含在同一制剂中或分开的制剂中)，和分开的施用，在这种情形中，本发明的抗体的施用可以在另一种治疗剂和/或辅药的施用之前发生、同时发生和/或之后发生。本文所报道的融合多肽还可以与放射治疗组合使用。

本文所报道的融合多肽可以通过适当的方法施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果局部治疗需要，进行病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何适当的途径进行，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑多种给药时间方案，包括，但不限于在多个时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

本文所报道的融合多肽以与良好的医学实践一致的方式配制、给药和施用。在这种情形中考虑的因素包括治疗的具体疾病、治疗的具体的哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂的递送位点、施用方法、施用时间方案和医学医师已知的其他因素。融合多肽不需要，但是任选地与同时用于预防或治疗讨论的病症的一个或多个药剂一起配制。所述其他药剂的有效量取决于该制剂中存在的融合多肽的量、病症或治疗的类型和上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量使用，或用本文所述的施用途径使用，或本文所述的剂量的约1％至99％，或以任意的剂量并且通过经验/临床确定为适当的任意途径使用。

为了预防或治疗疾病，本文所报道的融合多肽的适当的剂量(当单独使用或与一个或多个另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型、融合多肽的类型、疾病的严重性和病程、融合多肽是否为预防或治疗目的施用、之前的治疗、患者的临床病史和对所述融合多肽的反应以及主治医师的判断。融合多肽在一次或一系列的治疗适当地施用给患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的融合多肽可以是施用给患者的起始候选剂量，例如，不管是通过一次或多次分开的施用还是通过连续的输注施用。一个典型的每日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg的范围内或者更多，这取决于上文提及的因素。对于在数天或更长的时间的重复施用，取决于病况，治疗通常将持续至发生对疾病症状的需要的抑制。融合多肽的一个示例性的剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以给患者施用一次或多次约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的剂量。所述剂量可以间断施用，例如，每周或每三周(例如，以使患者接受约2-约20次、或者例如约6次剂量的融合多肽)。可以施用较高的起始负载剂量，然后施用一次或多次较低的剂量。这种治疗的进展可以容易地通过常规技术和测定进行监测。

制品

在本文报道的另一个方面中，提供包含用于治疗、预防和/或诊断上文所述的病症的物质的制品。该制品包含容器和在所述容器上或与所述容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适当的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有自身或与另一种组合物组合有效用于治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一个活性试剂是本文所报道的融合多肽。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗选择的病症。此外，所述制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文所报道的融合多肽；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或另外的治疗剂。在本发明这一实施方案中的制品可以进一步包括标明该组合物可以用于治疗特定的病症的包装说明书。备选地或另外地，所述制品可以进一步包括第二(或第三)容器，该容器包含药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场出发的其它材料，包括其它的缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。

提供下述实施例、序列表和附图以辅助对本发明的理解，本发明的真正的范围在后附的权利要求书中列出。应该理解可以在不背离本发明的精神的前提下在描述的方法中进行修改。

附图描述

图1 pH-依赖性胞吞转运机制的示意图。

图2 hCMEC/D3胞吞转运测定的设置。

图3 ¹²⁵I-转铁蛋白胞吞转运穿过hCMEC/D3脑内皮细胞的测定验证。

图4 针对人转铁蛋白受体的mAb 128.1不离开hCMEC/D3细胞。

图5 针对人转铁蛋白受体的mAb 128.1，与转铁蛋白不同，在内在化后于晚期内体标记CD63共同定位。

图6 针对人IGF-1受体的抗-IGF-1R抗体不被胞吞转运，而是再循环。

图7 针对人转铁蛋白受体的mAb MEM-189，与mAb 128.1不同，再循环并且被胞吞转运。

图8 mAb MEM-189以pH-依赖性方式结合转铁蛋白受体，而mAb128.1不以pH-依赖性方式结合转铁蛋白受体。

图9 mAbs128.1与MEM-189竞争同一表位。

图10 针对人转铁蛋白受体的mAbs 13E4和M-A712不被胞吞转运。

序列描述

实施例

实施例1

用于胞吞转运测定或荧光显微镜检的hCMEC/D3细胞培养物

用于hCMEC/D3(参见WO 2006/056879和Weksler，B.B.，等人.，FASEB J.19(2005)1872-1874)的培养基和补充物从Lonza获得。hCMEC/D3细胞(第26-29代)可以在胶原包被的盖玻片上(显微镜)或烧瓶中在含有2.5％FBS、四分之一并且与补充的氢化可的松完全互补的供应的生长因子、庆大霉素和抗坏血酸的EBM2培养基中培养至汇合。

对于所有的胞吞转运测定，可以在12-孔细胞培养板中使用高密度孔(1×10⁸个孔/cm²)PET膜滤器***物(0.4μm孔尺寸，12mm直径)。用于顶侧室和底外侧室的培养基体积分别计算为400μl和1600μl。滤器***物的顶侧室可以用大鼠尾胶原I(7.5μg/cm²)包被，然后用纤连蛋白(5μg/ml)包被，每次温育在RT持续1h。在EBM2培养基中10-12天，hCMEC/D3细胞生长至汇合的单层(～2×10⁵个细胞/cm²)。在测定前，可以将空滤器在含有1％BSA的PBS中封闭1h或过夜(o/n)，然后在测定前在EBM2中校正至少1h。

实施例2

¹²⁵I-转铁蛋白和单克隆抗体的胞吞转运测定

¹²⁵I-转铁蛋白(Tfn)获自Perkin Elmer(Perkin Elmer，Rodgau，德国，#NEX212050UC)。针对人转铁蛋白受体的mAb 128.1和针对小鼠转铁蛋白受体的mAb 8D3分别在转染了包含人IgG1重链和轻链恒定区的编码序列的连续的开放阅读框的载体和包含小鼠抗人转铁蛋白受体抗体128.1(关于可变区序列见WO 93/10819和SEQ ID NO∶21与22)或大鼠抗小鼠转铁蛋白受体抗体8D3的载体的HEK细胞中瞬时表达(Boado等人.(2009)，Biotechnol.Bioeng.102，1251-1258)，并且如之前报道那样纯化。mAb 128.1也用¹²⁵I标记。如US 7,572,897所述表达并且纯化针对人IGF-1受体的单克隆抗体。针对人转铁蛋白受体的小鼠单克隆mAbs MEM-189和13E4获自Abcam(Cambridge，England，分别为#ab1086和#ab38171)，mAb M-A712获自BD Biosciences(Heidelberg，德国，#555534)。整个测定(测定方案见图2)在不含血清的EBM2培养基中进行，其另外如实施例1所述重构。在测定那天，将细胞进行血清-饥饿60min，以消耗尽转铁蛋白(仅用于转铁蛋白胞吞转运)。有或无(但是在完全培养基中封闭过夜)细胞的滤器***物在顶侧用放射性标记的转铁蛋白，即¹²⁵I-标记的或未标记的单克隆抗体在37℃温育1h。之后，收集全部的顶侧体积和底外侧体积。可以由所确定的值计算细胞旁流量和放射性碘标记的配体的稳定性。在RT在不含血清的培养基中顶侧(400μl)和底外侧(1600μl)洗涤单层三次，每次3-5min。收集所有的洗涤体积，以监测去除未结合的配体或抗体的效率。向顶侧室中加入预先温育的培养基，并且将滤器转移至含有1600μl预先温育的培养基的新的12孔平板(用含有1％BSA的PBS封闭过夜)中。在该点，将有或无细胞的滤器在500μl RIPA缓冲液(Sigma，Munich，德国，#R0278)中裂解，以确定特异性配体或抗体摄入。其余滤器在37℃或在4℃温育，并且在多个时间点收集样品以确定配体或抗体的顶侧和/或底外侧的释放。使用三氯乙酸(TCA)沉淀法评估完整的和降解的¹²⁵I-转铁蛋白或¹²⁵I-mAb 128.1。可以通过γ射线计数而确定上清或裂解物中的放射活性的转铁蛋白或mAb 128.1的量。样品中未标记的抗体的含量使用高选择性IgG ELISA量化(参见实施例3)。对于每个时间点，数据应该从两个空白滤器和三个滤器细胞培养物产生。

实施例3

胞吞转运测定后灵敏的IgG ELISA

整个程序在RT进行，其中洗涤步骤使用自动化洗涤仪。将384孔平板用30μl/孔的在磷酸盐缓冲的盐水溶液(PBS)中的1μg/ml抗-人/小鼠-IgG、Fcγ-特异性的(Dianova，Hamburg，德国，分别为#109-005-098或#115-005-164)包被2h，然后在含有1％(w/v)BSA(Sigma，Munich，德国，#A2153)的封闭缓冲液PBS中温育1h，以分别用于人和小鼠IgG测定。将来自胞吞转运测定的连续稀释的样品和标准浓度的用于胞吞转运测定的抗体加入到平板中并且温育2h。四次洗涤后，加入30μl/孔的在封闭缓冲(见上)中的50ng/ml抗-人/小鼠-F(ab)₂-生物素-缀合物(Dianova，Hamburg，德国，分别为#109-066-097或#115-066-072)并且再温育2h。六次洗涤后，加入30μl/孔的50ng/ml(huIgG测定)或100ng/ml(mIgG测定)聚-HRP40-链霉抗生物素蛋白(Fitzgerald，Acton(MA)，USA，#65R-S104PHRPx；在含有1％(w/v)BSA和0.05％(w/v)吐温-20的PBS中)并且温育30min。四次洗涤后，通过加入30μl/孔的BM化学发光底物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)检测免疫复合物。使用发光平板读数仪测量发光信号并且使用拟合的标准曲线计算浓度。测定的范围在10pg/ml至10ng/ml。

实施例4

共聚焦荧光显微镜检

为了研究128.1抗体和完整的转铁蛋白的定位，在胶原包被的盖玻片上生长至汇合的hCMEC/D3细胞单层用5μg/ml FITC-标记的完整的转铁蛋白(Invitrogen，Darmstadt，德国，#T-2871)或1μg/ml mAb128.1温育10min。然后，去除培养基并且更换为新鲜培养基。在37℃1h后，将单层在4％低聚甲醛(PFA)中在RT固定15min，透化处理10min(PBS/0.1％(w/v)Triton X-100(Sigma，Munich，德国，#93443)，并且用针对晚期内体/溶酶体标记CD63的抗体(R&D Systems，Wiesbaden，德国，#MAB5417)在RT温育45min。细胞在PBS/0.1％(w/v)Triton X-100中进行洗涤15min，必要时继续用二级抗体(山羊抗-人IgG-Alexa Fluor 488和/或鸡抗-小鼠IgG-Alexa Fluor 594(Invitrogen，Darmstadt，德国，分别为#A11013或#A21201))在RT温育45min。细胞在PBS/0.1％(w/v)TritonX-100中洗涤30min。然后在封固介质中封固盖玻片。使用共聚焦显微镜获得荧光图像。所有的共聚焦图像显示出通过完整细胞的z-系列的单一、代表性的切片。

实施例5

pH-依赖性结合和竞争ELISA

通过在RT温育50μl在PBS中的1μg/ml的溶液1h，将人转铁蛋白受体胞外结构域连接到人IgGl Fc(R&D Systems，Wiesbaden，德国，#2474-TR-050)或连接到小鼠转铁蛋白受体(SinoBiological，Beijing，中国，#50741-M07H)或人胰岛素受体(R&D Systems，Wiesbaden，德国，#1544-IR/CF)的胞外结构域的融合蛋白包被到96孔平板上。在用PBS/1％(w/v)BSA封闭1h后和用PBS/0.1％(w/v)吐温20洗涤四次后，向平板中加入在调节至pH 7.4或pH 5.5的PBS/0.1％(w/v)BSA中的不同浓度的下列抗体：MEM-189，128.1，13E4，M-A712，LT-71，MEM-75(二者购自Abcam，分别为#ab9179和#ab38446)，OKT-9(eBioscience，Frankfurt，德国，#16-0719；全部针对人TfR)，8D3，R17217(Santa Cruz，Heidelberg，德国，#sc-52504；二者针对小鼠TfR)，83-13(Invitrogen，Darmstadt，德国，#AHR0221)和243524(R&D Systems，#MABl544；二者针对人胰岛素受体)，并且在RT温育1.5h。备选地，各孔用固定浓度为5μg/ml的mAbMEM-189或mAb 128.1作为封闭抗体温育，洗涤四次，然后在RT用不同浓度的不用于封闭的其他抗体温育30min。在用PBS/0.1％(w/v)吐温20再洗涤四次后，用HRP-偶联的二级抗体(Dianova，Hamburg，德国，#109-036-097或GE Healthcare，Freiburg，德国，#NA9310V)(30min.，RT)和50μl TMB(10min.，RT)底物检测结合的抗体。通过加入50μl 1N盐酸(HCl)终止显色，并且在平板读数仪中在450nm测量吸光度。