TWI237026B - Fucose sulfuric acid-containing polysaccharide, the preparing method thereof and the anti-cancer agent and preventing agent for inducement of cancer - Google Patents
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1237026 玖、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於可利用作爲醫藥品之細胞自滅誘發劑、制 癌劑及致癌預防劑。又,本發明爲提供於細胞自滅機構之 解明、細胞自滅誘發阻礙劑篩選當中有用的細胞自滅誘發 方法。更且提供依據本發明所純化之含岩藻糖硫酸多醣及 其分解物,並提供含岩藻糖硫酸之多醣分解物之製造,和 構造硏究中有用的含岩藻糖硫酸多醣分解酵素。 【先前技術】 近年,關於細胞組織之死亡,係注目於所謂的細胞自滅 (apoptosis,亦稱爲脫噬作用;自我暴死或細胞自滅)。 此細胞自滅,與病理性的細胞死亡不同,乃被認爲係由 細胞本身之基因於最初所被重組入的死亡。即任何的外部 或內部的主要原因乃成爲板機使策劃(p r 〇 g r a m )細胞自滅之 基因被活化,且使用此基因將策劃死基因之蛋白質被生物 合成,並經由生成之策劃死蛋白質將細胞本身分解,而死 亡。 此種細胞自滅若可令在所欲的組織、細胞中表現,則可 使不要的或病原的細胞以自然型態由生物中排除,爲極具 深遠意義。 本發明之目的爲開發具有誘發細胞自滅作用之安全性高 之化合物,且提供含有該化合物之細胞自滅誘發劑、制癌 劑、致癌預防劑、及使用該化合物作爲有效成分之細胞自 滅誘發方法。又提供在本發明化合物之分解物製造上之有 7 1237026 用的該化合物分解酵素。 【發明内容】 若槪述本發明’則本發明之第丨發明爲關於細胞自滅誘 發劑,其特徵爲含有含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物。 本發明之第2發明爲關於細胞自滅誘發方法,其特徵爲 使用含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物作爲有效成分。 本發明;έ第3發明爲關於制癌劑,其特徵爲含有本發明 第5或第6發明之含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物。 本發明之第4發明爲關於致癌預防劑,其特徵爲含有含 岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物。 本發明之第5發明係關於具有下述理化性質之含岩藻糖 硫酸多醣。 (1 )構成糖;含有糖醛酸。 (2)經由產黃菌屬(Flavobacterium)sp.SA-0082(CCRC 910069)生產之岩藻依聚糖(fucoidan)分解酵素而低分子 化,且生成至少由下述式(I )、( I I )、( I I I )所示化合物所 選出之一種以上之化合物。 8 1237026 CH2 Oil
OH
o=s=o I OH
OH 9 1237026
10
L 1237026 本發明之第6發明係關於具有下述理化性質之含岩藻糖 硫酸多醣。 (1 )構成糖:實質上不含有糖醒酸。 (2)貝貝上無法經由產 0082 (CCRC 9 1 0069 )生產之岩藻依聚糖分解酵素低分子化。 本發明之第7發明爲關於本發明第5發明之含岩藻糖 硫酸多醣之製法’其特徵爲包含將含岩藻糖硫酸多醣混合 物於鹽類存在下’以具有酸性多醣凝集能力之藥劑處理, 並除去沈澱物之工程。 本發明之第8發明爲關於本發明第5發明之含岩藻糖 硫酸多醣之製法’其特徵爲包含將含岩藻糖硫酸多醣混合 物於2價陽離子之混合存在下,以陰離子交換樹脂處理並 採集目的多醣之工程。 本發明之第9發明爲關於本發明第5發明之含岩藻糖 硫酸多醣之製法,其特徵爲包含在製造本發明第5發明之 含岩藻糖硫酸多醣時,將共存之著色性物質使用多醣性物 質或具有陰離子交換基之物質予以除去之工程。 本發明之第1 0發明爲關於本發明第6發明之含岩藻糖 硫酸多醣之製法,其特徵爲包含將含岩藻糖硫酸多醣混合 物’以具有分解含糖醛酸之含岩藻糖硫酸多醣能力之分解 酵素,或者以具有該分解酵素之微生物處理並採集目的多 醣之工程。 本發明之第1 1發明爲關於本發明第6發明之含岩藻糠 1237026 硫酸多醣之製法’其特徵爲包含將含岩藻糖硫酸多醣混合 物於鹽類存在下,以具有酸性多醣凝集能力之藥劑使目的 多醣沈澱之工程。 本發明之弟12發明爲關於本發明第6發明之含岩藻糖 硫酸多醣之製法,其特徵爲包含將含岩藻糖硫酸多醣混合 物於2價陽離子之混合存在下,以陰離子交換樹脂處理並 採集目的多醣之工程。 本發明之第13發明爲關於本發明第6發明之含岩藻糖硫 酸多醣之製法,其特徵爲包含在製造本發明第6發明之含 岩藻糖硫酸多醣時,將共存之著色物質使用多醣性物質或 具有陰離子交換基之物質予以除去之工程。 本發明之第1 4發明爲關於含岩藻糖硫酸多醣混合物之製 法,其特徵爲由海藻萃取本發明第7、8、1 〇、1 1或1 2發 明中所使用之含岩藻糖硫酸多醣混合物時,使醋酸離子與 鈣離子共存。 本發明之第1 5發明爲關於具有下述理化性質爲其特徵之 末端(end)型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素。 (i )作用:對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醣作 用’且令該含石澡糖硫酸多醋低分子化。 (a)構成糖:實質上不含有糖醛酸。 (1))貫負上無法經由產黃菌屬(Flavobacterium)sp. SA· 0082(CCRC 910069)生產之岩藻依聚糖分解酵素低分子化。 對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醣無作用。 (c )構成糖:含有糖醛酸。 12 1237026 (d)經由產黃菌屬(Flavobacterium)sp.SA-0082(CCRC 9 1 0069 )生產之岩藻依聚糖分解酵素低分子化,且生成至少 由下述式(I )、( I I )、( I I I )所示化合物所選出之一種以上 之化合物。
CH2 OH
OH
〇
13 1237026
/ OH 0 ( 111 14 1237026 (11)最適pH:本酵素之最適pH爲在7〜8附近。 (iii)最適溫度:本酵素之最適溫度爲在30-35 °C附近。 本發明之第1 6發明爲關於含有鈣源與本發明第1 5發明 之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之酵素組成的。 本發明之第1 7發明爲關於本發明第1 5發明之末端型含 岩藻糖硫酸多醣分解酵素之製法,其特徵爲將具有本發明 第1 5發明末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素生產能力之互 生單胞菌屬細胞予以培養,並由其培養物採集該酵素。 本發明之第1 8發明爲關於含岩藻糖硫酸多醣之低分子化 物,其特徵爲令本發明第15發明之末端型含岩藻糖硫酸多 醣分解酵素作用於本發明第6發明之含岩藻糖硫酸多醣所 取得者。 本發明者等人成功地取得各種經純化之含岩藻糖硫酸多 醣和其分解物,且其次檢討其生物活性,並發現此等物質 令癌細胞誘發細胞自滅且顯示出強的制癌作用。又發現含 岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物顯示出強的致癌抑制作 用。更且將本發明分解物調製上有用之含岩藻糖硫酸多醣 分解酵素成功地單離,因而完成本發明。 【實施方式】 以下,具體說明本發明。 本發明中所使用之含岩藻糖硫酸多醣並無特別限定,例 如可使用來自檜華叉之物質、來自高果美(GAGOME)海帶之 物質、來自真海帶之物質、來自裙帶菜之物質以外,其他 15 1237026 全部來自褐藻植物之物質亦可使用。又,已知於海參體壁 亦具有含岩藻糖硫酸多醣,故於本發明中亦使用來自海參 之含岩藻糖硫酸多醣。又於本發明中亦可使用含岩藻糖硫 酸多醣之分解物。含岩藻糖硫酸多醣之分解方法可列舉以 酸處理等之化學性分解方法、超音波處理等之物理性分解 方法、或酵素分解方法等。 本發明者等人發現將如上述各種含岩藻糖硫酸多醣和/ 或其分解物添加至癌細胞之培養液時,於添加後1日至數 曰中引起細胞自滅。又,亦確認對正常細胞不顯示出毒性。 於本發明中,所謂之含岩藻糖硫酸多醣,爲分子中含藻 糖硫酸之多醣,並無特別限定,例如爲褐藻植物、海參等 中所含有者〔左右田德郎監修、江上不二夫編集、共立出 版股份有限公司、昭和3 0年1 2月1 5日發刊、多醣類化學、 第3 1 9頁、第3 2 1頁〕。尙來自褐藻植物之含岩藻糖硫酸 多醣通稱爲岩藻依聚糖、岩藻多醣、藻聚糖,且已知數個 分子種類但其多總稱地稱爲岩藻依聚糖。例如,已報導市 售SIGMA公司製之岩藻依聚糖可分成13種物質之分子種類 (Carbohydrate research、第 255 卷、第 213〜224 頁 (1994)〕,其中有以岩藻糖作爲主成分之一群,與含數% 糖醛酸之構成糖中多含有岩藻糖和甘露糖之一群之分子種 類。對於其生物活性中之巨噬細胞活性增強、癌轉移抑制、 抗凝血等之各種情況已被報導,但由於在含岩藻糖硫·酸多 醣中具有分子種類故爲了調查活性本身爲在何種分子種 16 1237026 類,乃必需將含岩藻糖硫酸多醣予以分離精製並調查。於 含岩藻糖硫酸多醣中,有實質上不含糖醛酸之構成糖之主 成分爲岩藻糖者,及含數%糖醛酸之構成糖中含有岩藻糖 和甘露糖等者。以下,於本說明書中實質上不含糖醛酸者 記爲含岩藻糖硫酸多醣-F,含有糖醒酸之含岩藻糖硫酸多 醣者記爲含岩藻糖硫酸多醣-U,而兩者之混合物記載爲含 岩藻糖硫酸多醣混合物。 迄今已知之分離含岩藻糖硫酸多醣-F和含岩藻糖硫酸多 醣-U之方法爲依分子量分級和陰離子交換樹脂予以分離, 由於其分離不夠充分故難以大量調製,以作爲藥品和機能 性食品。 又,已知由含岩藻糖硫酸多醣將著色性物質完全除去乃 爲困難,於市售之岩藻依聚糖等中亦含有著色性物質。通 常此著色性物質爲聚苯酚聚合而成之物質,以極強之反應 性阻礙各種酵素反應並阻礙細胞生長,又,例如對接觸之 樹脂和樹脂性容器等不可逆地吸附。因此爲了正確調查含 岩藻糖硫酸多醣之生物活性,又,爲了防止容器和樹脂等 之污染,乃必需由含岩藻糖硫酸多醣除去反應性強的著色 性物質。 又,已知由褐藻類或褐藻類之乙醇洗淨殘渣等中萃取含 岩藻糖硫酸多醣混合物時,因使用可溶性醋酸鋇和氯化鋇 和氯化鈣可抑制藻酸的混入,有利於其後的精製,但可溶 性鋇鹽於廢液處理等並非容易,又由於氯化鈣若與海藻混 17 1237026 合則pH變動,而在取得非分解性之含岩藻糖硫酸多醣中pH §周整乃爲必要。於pH調整時由於海藻粉末爲帶有黏性而凝 集’故其後之萃取效率降低且分取回液分離之過濾變得困 難。 即’儘管現在期待含岩藻糖硫酸多醣之產業上的有用性, 但不僅無分子種類充分分級之含岩藻糖硫酸多醣_ F和含岩 藻糖硫酸多醣-U之市售品,且亦無有關其效率性製法之報 告。更且於市售之含岩藻糖硫酸多醣中含有如上述反應性 的著色性物質。 雖然含岩藻糖硫酸多醣有各種活性,但如前述由於其之 分級調製困難,故仍未取得實質上經純化之含岩藻糖硫酸 多醣-F和含岩藻糖硫酸多醣_ u。 然而依據本發明,可提供實質上經純化之含岩藻糖硫酸 多醣-U,其簡便的萃取方向及含岩藻糖硫酸多醣_ u之製法。 又依據本發明,提供通常由含岩藻糖硫酸多醣難以除去並 造成酵素反應阻礙和樹脂污染等之反應性強之著色性物質 被予以除去之含岩藻糖硫酸多醣_ U。 更且依據本發明’提供實質上經純化之含岩藻糖硫酸多 醣-F、其簡便的萃取方法及含岩藻糖硫酸多醣_ F之製法。 又依據本發明’提供通常由含岩藻糖硫酸多醣難以除去 並造成酵素反應阻礙和樹脂污染等之反應性強之著色性物 質被予以除去之含岩藻糖硫酸多醣_ F。 本發明中所使用之含岩藻糖硫酸多醣,可爲褐藻植物、 18 1237026 海參等含岩藻糖硫酸多醣含有物,例如就以此予以乾燥' 粉碎供使用亦可’或使用來自含岩藻糖硫酸多醣含有物之 含岩澡糖硫酸多醣萃取液、由該萃取液之精製物亦可。含 岩澡糖硫酸多醣萃取液之調製方法,由萃取液之精製方法 可依公知方法進行即可,並無特別限定。 又’本發明中使用之所謂的含岩藻糖硫酸多醣分解物, 爲含岩藻糖硫酸多醣以酵素化學性方法、化學性方法、物 理學方法分解所取得之物質,可使用公知之酵素化學性方 法、化學性方法、物理學方法。 又’本發明中使用之含岩藻糖硫酸多醣、含岩藻糖硫酸 多醣分解物包含其藥理容許鹽。 含有含岩藻糖硫酸多醣之褐藻植物,例如爲山回幸雄序、 瀨川宗吉著、保育社、昭和5 2年發刊之原色日本海藻圖鑑、 第22〜52頁中記載之褐藻植物,例如使用檜葉尖(Fucus evanescens)、局果美海帶(Kjellmaniella crassifolia)、 真海帶(Laminaria japonica)、裙帶菜(Undaria pi nna t i f i da )等,可調製含岩藻糖硫酸多醣。 含有含岩藻糖硫酸多醣之海參,例如爲日本特開平4-9 1 02 7號公報記載之海參,例如可使用,真海參(S t丨chopus japonicus)、假黑海參(Holothuria leucospilota)等,並 依該公報記載之方法,可調製含岩藻糖硫酸多醣。 含岩藻糖硫酸多醣爲在分子中具有硫酸基,該基爲與各 種鹼形成反應鹽。此些含岩藻糖硫酸多醣、其分解物爲呈 19 1237026 鹽之狀態而爲安定,通常以鈉和/或鉀等鹽之型態被單離。 此等物質之鹽經Dowex 50W等陽離子交換樹脂處理而游離 含岩藻糖硫酸多醣,並可能導至游離其分解物。又,其更 且視需要可進行公知慣用之鹽交換,與所欲之各種鹽進行 交換。含岩藻糖硫酸多醣、其分解物之鹽,可使用製藥容 許鹽,可列舉例如鉀、鈉等之鹼金屬鹽、鈣、鎂、鋇等之 鹼土金屬鹽與吡啶等之有機鹼之鹽、及銨鹽。 含有含岩藻糖硫酸多醣之褐藻植物、海參等經進行乾燥 後,粉碎處理,可調製含岩藻糖硫酸多醣粉末體。 由含岩藻糖硫酸多醣粉末體經進行熱水萃取。稀酸萃取 而可調製含岩藻糖硫酸多醣萃取液。 含岩藻糖硫酸多醣之含有物的萃取溫度、時間可在0〜200 °C、1〜360分鐘之範圍中依目的選擇即可,通常爲10〜150 °C、5〜240分鐘,較佳爲選擇50〜130 °C、10〜180分鐘之 範圍而進行爲較佳。 爲了提高含岩藻糖硫酸多醣含有率之萃取物之精製手段 有,使用氯化鈣、醋酸鋇等之含岩藻糖硫酸多醣之分級方 法,使用氯化鯨蠟基吡啶等酸性多糖凝集劑之含岩藻糖硫 酸多醣之分級方法,於鹽類存在下使用酸性多醣凝集劑之 含岩藻糖硫酸多醣之分級方法、凝膠過濾、離子交換層析 等,且視需要可將其組合,進行精製。 含岩藻糖硫酸多醣之分解方法,可爲使用含岩藻糖硫酸 多醣分解酵素之方法,進行酸分解之方法,進行超音波處 20 1237026 理之方法等之含岩藻糖硫酸多醣分解方法之公告方法,分 解物之精製可以上述方法進行。 通常’於褐藻類中存在有多種含岩藻糖硫酸多醣,但本 發明所使用之褐藻類的種類並無特別限定,例如可使用來 自檜葉尖者、來自高果美海帶者、來自真海帶者、來自裙 帶菜者、其他來自全部褐藻類者。 於含岩藻糖硫酸多醣的製造上,首先以褐藻類之水系溶 劑取得萃取液。 又’供萃取之海藻即使是生海藻亦可,於取得萃取液前 若一邊將褐藻乾燥、一邊作成乾燥粉末、以6 0〜1 0 〇 %乙醇 和丙酮等洗淨,並浸於含有甲醛、乙醛、戊二醛、氨水等 之水溶液中則由於可大幅減少著色性物質混入含岩藻糖硫 酸多醣而爲有利。 又’於由褐藻類或褐藻類之乙醇洗淨殘渣等萃取含岩藻 糖硫酸多醣時,若使用可溶性醋酸鋇、氯化鋇、或氯化鈣 則由於可抑制藻酸的混入而有利其後的精製,而依上述理 由於萃取時,以1 mM〜1 Μ左右之醋酸鈣溶液於5 0〜1 3 0 °C下 萃取爲較佳。 · 於海藻較厚且粉末(粒子)大之情形中,因由最初使用〇 . 2 Μ 以上之醋酸鈣乃使萃取效率變差,故首先以水萃取,再加 入醋酸鈣,除去所生成之藻酸沈澱即可。 然而於欲將含岩藻糖硫酸多醣與藻酸同時萃取之情形, 和欲取得萃取時具某程度分解之情形等中則對溶劑及萃取 21 1237026 條件並無特別限定,可使用水或者食鹽,氯化鎂等各種濃 度之中性鹽類水溶液、檸檬酸、磷酸、鹽酸等各種濃度之 酸性水溶液、檸檬酸、磷酸、鹽酸等各種濃度之酸性水溶 液、氫氧化鈉、氫氧化鉀等各種濃度之鹼性水溶液,且亦 可加入緩衝劑和防腐劑。萃取液之pH和萃取溫度、萃取時 間等亦無特別限定,一般由於含岩藻糖硫酸多醣對酸和鹼 爲弱,故使用酸性溶液和鹼性溶液時則易進行低分子化。 藉由調整加熱溫度、時間、pH等,而可調製任意的分解物, 例如藉由凝膠過濾處理,分子量分級膜處理等,而可調整 分解物之平均分子量、分子量分布等。 即本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U及含岩藻糖硫酸多醣-F 之分子量及糖組成爲依含岩藻糖硫酸多醣原料之收獲期, 該原料之乾燥方法、該原料之保存方法而異,又依含岩藻 糖硫酸多醣萃取時之加熱條件、pH條件等而異。 例如以酸令含岩藻糖硫酸多醣水解,並於鹼性條件下由 糖醛酸之/3 -脫離,而進行低分子化。因此本說明書中記載 之含岩藻糖硫酸多醣-U,含岩藻糖硫酸多醣-F之分子量, 分子量分布不過僅爲其一例,可依含岩藻糖硫酸多醣之處 理條件,而輕易地變化其分子量、分子量分布。例如,於 弱鹼性1 0 0 °C、加熱1小時脫鹽時’若使用孔徑大小3 0 0 之分子篩膜,則可調製分子量分布由1 000至1萬左右之含 岩藻糖硫酸多醣-U、含岩藻糖硫酸多醣-F ’且依使用條件 可調製任意分子量分子量分布之本發明之含岩藻糖硫酸多 22 1237026 醣-u及含岩藻糖硫酸多醣-F。 爲由前述之褐藻類萃取液除去藻酸及中性糖等,例如可 在〇·2〜0.6M濃度食鹽等之鹽類存在下,加入不會令其再 產生沈澱之氯化鯨躐基吡啶等之酸性多醣凝集劑,並以集 沈澱即可。 視需要此沈澱以0 · 2〜0 · 6Μ濃度之食鹽等鹽類溶液洗淨 後,將沈澱中之氯化鯨蠟基吡啶以食鹽飽和乙醇洗掉,取 得含岩藻糖硫酸多醣混合物。爲由經此處理所得之含岩藻 糖硫酸多醣混合物中除去色素,可將此沈澱溶解後以陰離 子交換樹脂和多醣性樹脂處理進行超過濾即可。又若於脫 鹽後冷凍乾燥亦可取得乾燥樣品。 本發明者等人發現於0.6〜3Μ之1種或2種以上鹽類存 在下’本發明之含岩澡糖硫酸多醋-F與本發明之含岩藻糖 硫酸多醣-U爲對酸性多醣凝集劑顯示出完全不同的舉動。 例如使用本發明之方法,可由含岩藻糖硫酸多醣混合物 之水溶液分離出本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U。 首先於含岩藻糖硫酸多醣混合物之水溶液中添加1種或 2種以上之鹽類並使其總濃度爲〇 · 6〜2 Μ。添加之鹽類例 如爲氯化鈉、氯化鈣等並無特別限定。 通常於分離本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F與本發明之含 岩藻糖硫酸多醣-U時,以1 · 5Μ左右鹽濃度可達成目的(參 照後述第1圖之說明)。例如上述鹽類之鹽濃度調整至1 . 5 Μ 後若將氯化鯨鱲基吡啶等酸性多醣凝集劑令以不會再產生 23 1237026 沈源爲止地添加,則因含岩藻糖硫酸多醣_ F形成沈澱,故 若除去沈澱則取得本發明之含岩藻糖硫酸多醣-u之溶液。 視需要將此溶液濃縮後,以4倍量之乙醇等令溶液中之含 岩藻糖硫酸多醣-U沈澱,並將沈澱中之氯化鯨鱲基吡啶以 食鹽飽和乙醇洗掉,取得本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U。 爲由經此處理所得之含岩藻糖硫酸多醣_ U中除去色素,亦 可將此沈澱溶解後進行超過濾等。又若於脫鹽後冷凍乾燥 亦可得取得乾燥樣品。又,亦可於工程中添加防腐劑等。 其次於僅欲效率地製造本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F之 情形中,於以氯化鯨蠟基吡啶等令以凝集時,不以〇 . 2〜0 . 6 N 之鹽濃度,而若例如以2M之鹽濃度則可僅含有本發明之含 岩藻糖硫酸多醣-F。 本發明者等人亦發現含岩藻糖硫酸多醣以陰離子交換樹 脂精製時若有2價陽離子共存則每單位樹脂量吸附之含岩 藻糖硫酸多醣量增加,且含岩藻糖硫酸多醣之分離變佳。 即’使用本發明之方法製造本發明之含岩藻糖硫酸多醣_ U 時,首先於含岩藻糖硫酸多醣混合物中作爲2價陽離子來 源之藥品較佳添加以1 mM以上。其次,陰離子交換樹脂以 含有較佳ImM以上2價陽離子之液體平衡化,並令上述含 岩藻糖硫酸多醣混合物吸附。此陰離子交換樹脂以平衡化 之液充分洗淨後,例如以氯化鈉梯度令含岩藻糖硫酸多醣 溶出。使用本方法時,添加之2價陽離子濃度若爲1 mM以 上即可,但,令本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U吸附於柱上 24 1237026 爲目的時則期望爲未滿0 . 5 Μ。又本方法使用作爲2價陽離 子來源之藥品特別以鈣鹽和鋇鹽之效果優異,但並非特別 限定,硫酸鎂、氯化鐘等亦可使用。 又,若由褐藻類以通常之方法製造含岩藻糖硫酸多醣混 合物,則如上述混入反應性強的著色性物質,其不僅污染 接觸之樹脂和樹脂性容器,且亦阻礙酵素反應和細胞生長。 發現此著色性物質若令以結合或吸附至多醣性物質或具有 陰離子交換基之物質則可輕易地除去。即,於含有含岩藻 糖硫酸多醣之溶液中例如添加C e 1 1 u 1 〇 f i n e、GCL - 2 0 0 0 (生 化學工業公司製)和 Sephacryl S-500、Sephadex G-200、 Sepharose CL-2B(同爲PHARMAICA公司製)等之多醣性樹 脂、或DEAE-Cellulofine A-800(生化學工業公司製)、 DEAE-Sepharose FF、 DEAE-Sephadex A-50、 QAE_Sephadex A-50、DEAE-Sephacel (同爲 PHARMA CIA 公司製)、TSK-凝 膠 DEAE-Toyopearl 6 5 0、TSK-凝膠 DEAEToyopearl 5 5 0 (TOS〇 公司製)、Amberlite系之陰離子交換樹脂(0RGAN0公司販 售)Kitopearl系之陰離子交換樹脂(富士紡績公司製)等之 具有陰離子交換基之物質攪拌後除去,或者於充塡其之柱 中令含有含岩藻糖硫酸多醣之溶液通過則可輕易地除去此 反應性強的著色性物質。但,於陰離子交換樹脂之情形中 因亦可結合含岩藻糖硫酸多醣,故在令著色性物質吸附時 其鹽濃度以2M左右爲較佳。 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U例如可如實施例6記載般 25 1237026 調製。以下,示出此含岩藻糖硫酸多醣-u之理化性質,但 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-u並不被此例所限定。 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U、及實施例8所得之本發 明之含岩藻糖硫酸多醣-F之在各氯化鈉濃度中,過量之氯 化鯨蠟吡啶存在下的沈澱形成性示於第1圖。 第1圖之縱軸表示沈澱形成率(% ),橫軸表示氯化鈉濃 度(Μ)。圖中,實線及白圈表示本發明之含岩藻糖硫酸多醣 -U於各氯化鈉濃度下之沈澱形成率,且圖中,點線及白三 角爲表示本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F於各氯化鈉濃度(Μ ) 下之沈澱形成率。 沈澱形成率之測定爲,在溶劑溫度3 7 °C下,如下進行。 將本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U及含岩藻糖硫酸多醣-F 分別以2 %之濃度溶解於水及4M氯化鈉中,其經由以各種 比例混合而調製溶解於各種濃度氯化鈉中之含岩藻糖硫酸 多醣-U及含岩藻糖硫酸多醣-F溶液各125微升。 其次,將氯化鯨蠟基吡啶以2 . 5 %之濃度溶解於水及4M 之氯化鈉中,並經由混合而調製溶解於各種濃度氯化鈉中 之1 . 2 5 %氯化鯨蠟基吡啶溶液。 令溶解於水中之2 %本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U及含 岩藻糖硫酸多醣-F於1 . 2 5 %之氯化鯨鱲基吡啶中完全沈澱 需要3 . 2倍容量。於是,相對於溶解於各濃度氯化鈉之2 % 含岩藻糖硫酸多醣-U及含岩藻糖硫酸多醣-F之各125微 升,將溶解於各濃度氯化鈉之氯化鯨蠟基吡啶溶液添加4 0 0 26 1237026 微升後,充分攪拌,放置3 0分鐘後,離心分離並將上淸液 之糖含重依苯硫酸法〔Analytical Chemistry、第28 卷、第3 5 0頁(1 95 6 )〕測定,可算出在各氯化鈉濃度下之 各含岩藻糖硫酸多醣的沈澱形成率。 所侍之本發明之含岩藻糖硫酸多釀-U之分子量於使用 Sephacry 1 S- 500之凝膠過濾法計算時,示出以約19萬爲 中心之分子量分布(參照第2圖)。尙,於第2圖中,縱 軸爲依苯酚-硫酸法測定試料中之糖含量以480nm吸光度表 示,橫軸爲表示溶離份編號。 尙,凝膠過濾之條件示於下。 柱尺寸:3.08X162.5公分 溶劑:含有0 · 2M氯化鈉與含1〇%乙醇之i〇mM磷酸鈉緩 衝液(pH6 · 0) 流速:1 . 5毫升/分鐘 樣品濃度:0 . 2 5 % 樣品液量:20毫升 分子量標準物質:Shodex STANDARD P-82(昭和電工公司 製) 其次,分析所得之本發明含岩藻糖硫酸多醣-U之成分。 首先’依 Journal of Biological Chemistry,第 175 卷、第595頁(1948)之記載定量岩藻糖量。 其次,將所得之含岩藻糖硫酸多醣-U之乾燥樣品於1當 量之鹽酸中以0 · 5 %濃度溶解,並於1 1 〇 °c下處理2小時, 27 1237026 將構成單糖予以水解。其次,將使用以^0了切及GlycoTAG 試藥套組(同爲寶酒造公司製)水解所得之單糖的還原性末 端予以Pit D定基-(2卜胺基化(PA化),以hPLC調查構成糖的 比率。尙,HPLC之條件爲如下述。 裝置·· L-6200型(日立製作所製)
柱:PERPACK類型A |4.6mmXl5〇nim:寶酒造公司製) 洗提液:7〇〇mM硼酸緩衝液(pH9.〇):乙腈=9 ··工 檢測··以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製)於激發波長 3 1 0 n m、螢光波長3 8 0 n m下檢測 流速:0 . 3毫升/分鐘 柱溫·· 6 5 °C 其次:依 Analytical Biochemistry、第 4 卷、第 330 頁(1 96 2 )之記載定量糖醛酸量。 其次,依 Biochemical Jouorna 卜第 84 卷、第 1〇6 頁( 1962) 之記載定量硫酸含量。 以上之結果,所得之含岩藻糖硫酸多醣-U之構成糖爲岩 藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸。 其他之中性糖爲實質上不含有。又,主要成分之岩藻糖: 甘露糖:半乳糖:糖醛酸:硫酸基的莫耳比約10 ·· 7 : 4 : 5 : 20 ° 其次,含岩藻糖硫酸多醣-U鈣鹽之IR光譜以傅里葉 (Fourier)變換紅外線分光光度計JIR-DIAMOND 20(日本電 子公司製)測定時取得第3圖所示之光譜。尙,第3圖中 28 1237026 縱軸表示透過率(% ),橫軸表示波數(c m · 1 )。 其次,本發明之含岩藻糖硫酸多醣_ U鈣鹽之NMR光譜以 500MHz之核磁共振裝置)ΝΜ·α 500型核磁共振裝置(日本電 子公司製)測定時取得第4圖所示之光譜。 第4圖中,縱軸表示訊號強度、橫軸表示化學位移値 (ΡΡη〇。尙,於1H-NMR中之化學位移値爲以HOD之化學位 移値視爲4.65ppm表示。 1H-NMR(D20) δ 5.27(甘露糖1位之H)、5.07(岩藻糖1位之Η)、 4.49(岩藻糖3位之H)、4.37(葡糖醛酸1位Η)、4.04(岩 藻糖4位之Η)、3·82(岩藻糖2位之H)、3.54(葡糖醛酸 3位之H)、3.28(葡糖醛酸2位之Η)、1.09(岩藻糖5位 之CH3之H) 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U之冷凍乾燥物的比旋光度 以高度-高感度旋光計SEPA- 300 (堀場製作所製)測定時爲· 53.6 度。 本發明者等人如以下所述決定所取得之本發明含岩藻糖 硫酸多醣-U之構造。 經由具有分解含岩藻糖硫酸多醣-U能力之分解酵素將含 岩藻糖硫酸多醣-U分解及分解物之精製。 令精製之含岩藻糖硫酸多醣_U以下述末端型岩藻依聚糖 分解酵素作用,進行分解物之精製。
即,將1 %之含岩藻糖硫酸多醣_U溶液1 6毫升,與50mM 29 1237026 之磷酸緩衝液(PH8.0)12毫升與4M之氯化鈉4毫升與 3 2mU / m 1之末端型岩藻依聚糖分解酵素溶液8毫升混合, 並於2 5 °C下反應4 8小時。可確認隨反應進行於2 3 Q nm之吸 光度增加,可判定經由本酵素乃令含岩藻糖硫酸多醣-U分 解。此反應液以MICR0ACILIZER-G3(旭化成公司製)脫鹽後, 以DEAE- Sepha ros e FF可分灕精製3個溶離份(a )、( b )、 及(c ) 〇 尙,上述之末端型岩藻依據糖分解酵素爲經以下之方法 調製。 該末端型岩藻依聚糖分解酵素之生產上所用的菌株,若 爲具有該末端型岩藻依聚糖分解酵素生產能力之菌株則爲 任何菌株均可,具體例可列舉例如產黃菌屬 (Flavobacterium)sp. SA-0082 株(CCRC 910069)。 本菌株爲由青森縣之海水中由本發明者等人所新檢索取 得之菌株,其菌學性質如下。 1 .產黃菌屬sp . SA- 0082株 a .型態性質 (1 )本菌爲短桿菌 寬 0 _ 8 〜1 · 0 // m 長度1 . 0〜1 . 2 μ m (2 )孢子之有無 無 (3 )革蘭氏染色 陰性 b .生理性質 30 1237026 3月29開始以FERM P-14872寄存,並在前述通商產業省 工業技術院生命工學工業技術硏究所中以FERM BP- 5 40 2 (於 國際寄存之移管申請日:平成8年2月15日)寄存,且 在貴國食品工業發展硏究所菌種保存及硏究中心中於1 996 年12月24曰以CCRC第910069號寄存。 於本菌株培養基中所加入之營養源若爲使用之菌株可利 用,且產生末端型岩藻依聚糖分解酵素者即可,碳源例如 可利用岩藻依聚糖、海藻粉末、藻酸、岩藻糖、葡萄糖、 甘露糖醇、甘油、蔗糖、麥芽糖、乳糖、澱粉等、氮源以 酵母萃取物、蛋白腺、酪蛋白胺基酸、玉米漿、肉萃取物、 脫脂大豆、硫酸銨、氯化銨等爲適當。其他將鈉鹽、磷酸 鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋅鹽等無機質、及金屬鹽類添加亦可。 於培養本末端型岩藻依聚糖分解酵素之生產菌時,生產 量雖依培養條件而變動,但一般於培養溫度爲1 5 °C〜3 0 °C, 培養基之pH爲5〜9爲佳,於5〜7 2小時之通氣攪拌培養 下,本末端型岩藻依聚糖分解酵素之生產量到達最高。培 養條件當然依使用之菌株、培養基組成等,將本末端型岩 藻依聚糖分解酵素之生產量設定成爲最大。 本末端型岩藻依聚糖分解酵素在菌體中存在,亦在培養 物上淸液中存在。 上述的產黃菌屬sp. SA-0082株若以適當的培養基培養, 並收集其菌體,以通常所用的細胞破壞手段,例如以超音 波處理等將菌體弄碎,則可取得無細胞萃取液。 33 1237026 其次,由此萃取液以通常所用之精製手段可取得精製酵 素樣品。例如,以鹽析、離子交換柱層析、疏水鍵柱層析、 凝膠過濾等進行精製,可取得不含其他岩藻依聚糖分解酵 素之經純化的本末端型岩藻依聚糖分解酵素。 又,由上述培養液除去菌體之培養液上淸液中因亦大量 存在本酵素(菌體外酵素),故可經由與菌體內酵素同樣之 精製手段將其精製。 示出末端型岩藻依聚糖分解酵素之精製例。 將產黃菌屬sp. SA- 0082 (CCRC 9 1 0069 )接種至由分注含 有葡萄糖0.25%、蛋白腺1.0%、酵母萃取物0.05%之人 工海水(Germaline Laboratory製)ρΗ7.5所組成之培養基 600毫升並殺菌(120 °C、20分鐘)之2公升三角燒瓶中, 並於2 4 °C下培養2 4小時作成種培養液。將含有葡萄糖0 . 2 5 %、蛋白腺1.0%、酵母萃取物0.05%、及消泡劑(信越化 學工業製 070)0.01% 之人工海水(Germalin Laboratory 製)PH7 . 5所組成之培養基20公升置入30公升容量之醱酵 缸中並於120 °C下殺菌20分鐘。冷卻後,接種以上述之種 培養液6 0 0毫升,並於2 4 °C下2 4小時,每分鐘1 0公升通 氣量與每分鐘1 2 5轉之攪拌速度之條件下培養。培養終了 後,將培養液離心分離可得菌體。 將此菌體懸浮於含200mM氯化鈉之20mM醋酸-磷酸緩衝 液(PH7 · 5 ),並以超音波弄碎後、離心分離可得菌體萃取液。 於測定此菌體萃取液中之本末端型岩藻依聚糖分解酵素之 34 1237026 活性時,於培養1毫升中檢測出5mU之活性。 於本萃取液中,加入終濃度爲9 0 %飽和之硫酸銨,攪拌 溶解後離心分離,並將沈澱於上述菌體萃取液相同之緩衝 液中懸浮,以含有50mM食鹽之20mM醋酸-磷酸緩衝液(pH7 . 5 ) 充分透析。由透析所產生之沈澱以離心分離除去後,令以 吸附至事先以含有50mM食鹽之20mM醋酸·磷酸緩衝液 (ρΗ7·5)平衡化之DEAE-Sepharose FF柱,並將吸附物以相 同緩衝液充分洗淨後,以50mM至600mM之氯化鈉梯度令其 溶出’並收集活性溶離份。其次,於此活性溶離份中加入 終濃度爲4M之食鹽,令以吸附至事先以含有4M食鹽之20mM 磷酸緩衝液(pH8 . 0 )平衡化之苯基- Sepharose CL-4B柱吸 附’並將吸附物以相同緩衝液充分洗淨後,以4M至1 Μ之 食鹽梯度令其溶出,並收集活溶離份。其次將此活性溶離 份以超濾器濃縮後,以事先以含有50mM食鹽之10mM磷酸 緩衝液平衡化之Sephacryl S- 3 00進行凝膠過濾並收集活 性溶離性。此酵素之分子量由Sephacryl S-300滯留時間 算出爲約46萬。其次將此活性溶離份以含有25 ΟιώΜ食鹽之 10mM磷酸緩衝液(ρΗ7)透析。將此酵素液令以吸附至事先以 含有2 50mM食鹽之10mM磷酸緩衝液(ΡΗ7)平衡化之Mono Q HR 5 / 5柱,並將吸附物以相同緩衝液充分洗淨後,以250mM至 4 5 OmM之食鹽梯度令其溶出,並收集活性溶離份,取得精製 酵素。以上之精製工程示於表1。 35 1 1237026
工程 總蛋白量 (mg) 總活性 (毫單位) 比活性 (毫單位 /mg) 收率 (%) 菌體萃取液 61,900 101,000 1.63 100 硫酸銨鹽析 33,800 88,600 2.62 87.7 DEAE-Sepharose FF 2,190 40,400 18.4 40.0 苯基-Sepharose CL-4B 48.2 29,000 601 28.7 Sephacryl S-300 7.24 19,600 2,710 19.4 Mono Q 0.824 15,000 18,200 14.9 本酵素之活性測定爲如下述進行。 將2.5%來自高果美海帶之岩藻依聚糖溶液50微升、與 10微升之本酵素、與60微升之含有66 7mM氯化鈉之83mM 磷酸緩衝液PH7 . 5混合,並令於37°C、反應3小時後,將 反應液105微升與水2毫升混合攪拌,並測定其在230nm 之吸光度(AT)。準備僅用於溶解本酵素之上述緩衝液代替 本酵素並令以同樣條件反應者,及僅使用水代替岩藻依聚 糖溶液並進行反應者作爲對照組,並分別同樣地測定吸光 度(AB1 及 AB2)。 1單位之酵素,爲在上述反應系中於1分鐘將1 V mo i 之甘露糖與糖醛酸之間的糖苷鍵脫離性切斷之酵素量。 所切斷鍵之定量爲,將脫離反應時所產生之不飽和糖醛 酸之毫莫耳分子吸光係數視爲5 . 5進行計算。尙,酵素之 活性爲由下述式算出。 (AT-AB1-AB2 ) X 2 . 1 0 5 X 1 20 / 5 . 5 X 1 0 5 X 0 . 0 1 X 1 80 = U/ ml 36 1237026 2 · 1 05 :測定吸光度之樣品液量(毫升) 120 :酵素反應液之液量(微升) 5 · 5 ··不飽和糖醛酸在2 3 0ηπι之毫莫耳分子吸光係數(/mM) 105 :稀釋所用之反應液液量(微升) 0.01:酵素液量(毫升) 180 :反應時間(分) 蛋白質之定量爲,由測定酵素液於280nm之吸光度而進 行。此時1毫克/毫升之蛋白質溶液的級光度以1 . 〇計算。 尙,受質之來自高果美海帶之岩藻依聚糖爲如下調製。 將乾燥高果美海帶以自由粉碎機Μ - 2型(奈良機械製作所 製)予以弄碎,並於10倍量之85%甲醇中,以70°C、處理 2小時後,過濾,殘渣於1 〇倍量之甲醇中以7 0 °C、處理2小 時,過濾。於殘渣中加入2 0倍量水,於1 〇 〇 °C、處理3小 時並經過濾而取得萃取液。萃取液之鹽濃度使與40ΟπιΜ之 氯化鈉溶液相同後,將氯化鯨蠟基吡啶以不會令其再產生 沈澱爲止地添加,並離心分離。此沈澱以乙醇充分洗淨, 並以可完全除去氯化鯨鱲基吡啶之超濾器(過濾膜之排除分 子量10萬(AM ICON公司製)進行脫鹽及除去低分子,且此時 產生之沈澱以離心分離予以除去。將此上淸液冷凍乾燥可 得精製的高果美海帶岩藻依聚糖。 酵素反應產物之構造解析 上述之末端型岩藻依聚糖分解酵素,將含岩藻硫酸多醣-U中存在之D -甘露糖與D -葡糖醛酸間之α 1— 4鍵予以脫離 37 1237026 性分解之酵素,若令作用於所得之含岩藻糖硫酸多醣-U貝11 可生成具有下式(I)、(II)、及(III)構造之募糖。
OH
OH 11 38 1237026 ch2〇h
39 1237026 以下,詳細說明。 以上述之DEAE-Sepharose FF分離精製之3個溶離份 (a)、(b)、及(c)分別僅一部分使用 GlycoTAG 及 GlycoTAG 試藥套組將還原性末端予以吡啶基-(2 )-胺基化(pa化),可 得各 PA 化糖(PA-a)、(PA-b)、及(PA-c)。(PA-a)、(PA-b)、 及(PA-c )以HPLC進行分析。 尙,HPLC之條件爲如下。 (1 )使用分子量分級柱之HPLC分析 裝置:L-6200型(日立製作所製)
柱·· SHODEX SB- 803 ( 4.6 X 2 5 0mm)(昭和電工公司製) 洗提液:0 . 2M氯化鈉:二甲基亞碾二9 : 1 檢測:以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製)於激發波長、 320nm、螢光波長400mm下檢測 流速:1毫升/分鐘 柱溫:5 0 °C (2)使用逆相柱之HPLC分析 裝置:L-6200型(日立製作所製) 柱:L-柱(4 . 6 X 2 50mm)〔(財)化學藥品檢查協會〕 洗提液:50mM醋酸-三乙胺(ρΗ5·5)
檢測:以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製)於激發波長 3 20nm、螢光波長400mm下檢測 流速:1毫升/分鐘 柱溫:40°C 40 1237026 於第5、6、及7圖中示出各吡啶基-(2 )-胺基化之糖化 合物(PA-a)、(PA-b)、及(PA-c)之HPLC的溶出圖式,且圖 中縱軸表示相對螢光強度、橫軸表示滯留時間(分鐘)。 下述二出式(I )、式(I I )、及式(I丨ί )所示化合物,即(a )、 (b )、及(c )之物性。 第8圖中示出(a)、第9圖中示出(b)、第(10)中示出(c) 之質量光譜,於第11圖中示出(a)、第12圖中示出(1})、 第13圖中示出(c)之質量-質量光譜,且各圖中縱軸表示相 對強度(% )、橫軸表示m / z値。 更且在第14圖中示出(a)、第15圖中示出(b)、第u圖 中示出(c)之1H-NHR光譜,各圖中縱軸表示訊號強度,橫 軸表示化學位移値(P P m )。 尙,於1H-NHR中之化學位移値爲以H0D之化學位移値視 爲4.65ppm表示。 (a )之物性 分子量 564 MS m/z 563[M-H+]- MS/MS m/z 97[HS04] -、157[不飽和 D-葡糖醛酸 _H2〇_h+] -、 1 75 [不飽和D-葡糖醛酸- H+] -、225 [L-含岩藻硫酸·H2〇-H+] -、243[L -岩藻糖硫酸- H+ ]-、319[不飽和D-蔔糖醒酸與 D-甘露糖結合者之- H2〇_h+]-、405[M-不飽和D-葡糖醛酸-H+]-、4 8 3 [M-S〇3,H+] - 41 1237026 1H - NMR (D2 〇) (55· 78(1H, d, J=3· 7Hz, 4" - Η)、5· 26(1H,d, J = 1 . 2Hz, 1 - H)、5. 12 (1H, d, J=4· OHz, 1' - Π)、 5. 03 (1H, d , J = 6 . 1Hz, 4· 4 7 ( 1 H, d — d, J = 3 . 4, 1 0 . 4 H z , 3' - H)、4. 21 (1H,br — s,2 - H)、 4 · 12 ( 1 H, m, 5' — H)、4· 10(1H, d - d,J=3· 7,5·
8 H z , 3"-H)、4. 03 (1H, d, J = 3 . 4 Hz, 4' -Π)、3· 86(1H, m, 3 - H)、3. 83(1H, d — d, J = 4. 0, 1.0. 4 H z , 2 ' — H )、3 · 7 2 ( 1 H,m,4 一 H )、3 · 7 2 ( 1 Π,m , 5 - Π ) f 、3· 70 (2H,m, 5-CH2 之 H2)、3〆 6 5 ( 1 H, d-d , J = 5 . 8, 6· 1Hz, 2" - Η)、1. 08(3H, d, J = 6 · 7Hz, 一 C H3 之H3 ) 糖組成L -岩藻糖:不飽和D -葡糖醛酸:D -甘露糖=1 : 1 = 1(各1分子) 硫酸鹽1分子(L -岩藻糖之3位) 尙,於1H-NMR中尖峰所歸屬之編號爲如下述式(IV)。
CHZ OH
42 1237026 _( b )之物性 分子量724 MS m/z 723[M-H+]- 、 361[M-2H+]2-、 MS/MSm/z97[HS04 卜、175[不飽和 D -葡糖醛酸- H+]-、243[L-含岩藻硫酸- H+]-、321[M-S〇3-2H+]2_、405[M-不飽和 D-葡 糖醛酸-2S〇3-H+]-、417[M-L 岩藻糖-2S03-H+]-。 1H-NMR(D20) 55· 6 6 ( 1 Η, d, J = 3. 4 Hz, 4" - Η) > 5 . 2 7 ( 1 H, d , J=7· 3 Η ζ , 1"—Η)、5· 22 (111, d, J = l· 8Ηζ, ' -Η )、5 · 2 1 ( 1 Η , d,J = 3 · 7 Η ζ , 1,一 Π )、4 · 5 Ο ( 1 Η,d , J = 3 . 1 Η ζ , 4' 一 Η)、4· 32 (1 Η, q , J = 6 · 7Ηζ, 5,-Η )、4· 27 (1Η,d - d,J = 3 . 7 , 10. 4 Η ζ , 2, - Η) Ν 4. 2 1 (1Η, d-d, J =3· 4, 6. 7 II ζ , 3"-Η)、4. 1 8 ( 1 Η, d -d, J = 1 . 8,1 i . Ο Η ζ, 5 - CH:tH)、4· 1 5 ( 1 Η, br-s, 2 - Η )、4 · 10(1 Η, d - d , J = 5. 8 , 1 1 · Ο Η ζ ν 5 - C Η 之Η )
、3. θ 9 ( 1 Η, d - d , J = 3 . 1,1 0. 4 Η ζ , 3' - Π)、3.9 0 (lH,pi,5 — H)、3.82(lH,m,3 — H)、3.82(lH,m, 4 一 Η)3· 54(1Η,br-t,J=7· 3 H ζ , 2 ^ - Η) > 1· 11 ( 3 Η, d , J = 6 . 7 Η ζ , 5'-CH3 之Η3 ) 糖組成L -岩藻糖:不飽和D -葡糖醛酸:D -甘露糖二1 : 1 : 1(各1分子) 硫酸鹽3分子(L -岩藻糖之2位和4位及D -甘露糖之6位) 尙,於1 Η - N M R中尖峰所歸屬之編號爲如下述式(V )。 43 1237026 〇
(c )之物性 分子量 1 1 2 8 MS m/z 1127[M-H+]- MS/MSm/z97[HS04]-、175[不飽和 D-葡糖酉 含岩藻硫酸- H20-H+] -、24 3 [L-岩藻糖硫酸 飽和D-葡糖醛酸岩藻糖-S03-2H2+]2_、 藻糖與D-甘露糖結合者之- H+] -、721 [M-D 糖-S03-H2〇-H+] 答酸1+]-、225 [1^ -H+]- 、 371[M-不 4 0 5 [硫酸化L -岩 -甘露糖-L-岩藻 44 1237026 1H- NMR (〇2 O) (55·69(1Η, d,J=3.7Hz,(4)"_Η)、5·34(1 s, (1) - H)、5· 16(1H, s, 1 - H)、5· 10(1H,d, 4 . 0Hz,(1)' - Η)、5· E30 ("i,d,J=3· 7 11 z ^ 1 )、4· 93 (1H,d, J=6· 4 Hz,(1)" - H)、4· 50 (1 d - d, J=3· 4, 10· 7 Hz, 3, - H)、4· 47 (1H, d - d =3· 4,10· 4Hz, (3)' - H)、4· 39(1H,d, J=7· z, 1"-H)、4· 33 (1H, br - s, (2) - H)、4· 14(1 m, 2 - H)、4· 1 2 ( 1 H, m, (3),- H)、4· 1 2 ( 1 H,m ,-H)、4· 1 2 ( 1 H, m, (5)' - H)、4· 04 (1H,m,4 H) > 4. 0 3 ( 1 H, m, ( 4 ) ^ - H) , 3 . 8 5 ( 1 H, m, 2 ^ -3 . 8 5 ( 1 H, m, (2), - H)、3· 82(1H, m, 3 - H)、3 2(1H, m, (3) - H)、3.73UH,m,4-H)、3.73( m, 5 — H)、3· 73 (1H, m, (4) — H)、 3· 70 (2H, m, CH2 之 H2 )、3· 7 Ο (2H, ( 5 ) - C 1忉之 H2 )、3 · 6 7 H,m,5广-H)、3· 6 2 ( 1 H, m, 4" - Π)、3· 6 2 ( 1 H, (2)"-H)、3· 62 (iH, m,(5) - H)、3· 51(1H,t ,J = 8· 9Hz, 3" - H)、3· 28UH, t , J = 7. 9 H z , 2 H)、1 · 0 9 ( 3 H, d , J = 6· 7H z, ( 5 ) ' - C H3 之 H3 )、 07(1H, d,J=6. 7Hz,5,一 CH3 之H3 ) 糖組成L -岩藻糖:不飽和D -葡糖醛酸:D -葡糖醛酸: D -甘露糖=2: 1: 1: 2(L -岩藻糖與D -甘露糖各 子及不飽和D -葡糖醛酸與D -葡糖醛酸各1分子 硫酸鹽2分子(各L -岩藻糖之3位) 尙,於1 Η - NMR中尖峰所歸屬之編號爲如下述式(V I ) Η, J = 一 11 Π, ,J 9 Η Η, ,5 # Η)、 .8 1 Η, 5 -(1 m, i · 2分 45 1237026 CH2〇h
Oil VI ) 46 1237026 所得之含岩藻糖硫酸多醣-U若令上述之末端型岩藻依聚 糖分解酵素作用則隨著反應進行由脫離反應所引起之2 3 0nm 吸光度增加,由於脫離反應產物之不飽和己糖醛酸基成爲 主要反應產物之全部,故可稱在所得之含岩藻糖硫酸多醣-U之分子內,存在己糖醛酸與甘露糖交互結合之糖鏈。由於 所得之含岩藻糖硫酸多醣-U之構成糖多爲岩藻糖,故含含 岩藻糖硫酸多醣-U較一般的多醣易被分解成酸,另一方面, 已知己糖醛酸和甘露糖之鍵爲比較強的酸。本發明者等人 爲了明瞭高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醣混合物分子內存 在之己糖醛酸與甘露糖爲以交互結合之糖鏈中的己糖醛酸 之種類,乃參考 Carbohydrate Research、第 125 卷、第 283 〜290頁(1 9 84 )之方法,首先將含岩藻糖硫酸多醣混合物溶 解於0 . 3M之草酸並於100°C處理3小時者予以分子量分 級、收集分子量爲3 000以上之溶離份,再以陰離子交換樹 脂收集吸附部分。此物質於冷凍乾燥後以4N鹽酸予以酸水 解,並調整至pH 8後,PA化,以HPLC進行糖醛酸之分析。 尙HPLC之條件爲如下述。 裝置:L-6200型(日立製作所製) 柱:PERPACK類型N (4.6mmX250_)(寶酒造社製) 洗提液:200mM醋酸-三乙胺緩衝液(PH7.3) ·•乙腈=25 : 75 檢測:以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製)於激發波長 3 20nm、螢光波長400mm下檢測 流速:0 . 8毫升/分鐘 47 1237026
柱溫:4 (TC 尙,PA化己糖醛酸之標準物質葡糖醛酸爲s I GMA公司製、 半乳糖酸酸爲和光純藥公司製、艾杜糖醛酸爲S I G Μ A公司 製之4 -甲基傘形基-a - L -艾杜糖醒酸化物經水解者、甘露 糖酉I酸及葡糖醒酸爲依Acta Chemica Scandinavica、第15 卷、第1 3 9 7〜1 3 9 8頁(1 9 6 1 )記載之方法,將和光純藥公司 製的藻酸水解後以陰離子交換樹脂分離者經PA化而取得。 其結果,可判定上述含岩藻糖硫酸多醣混合物之糖鏈中 所含的己糖醛酸僅爲葡糖醛酸。 更且上述糖鏈水解物中之葡糖醛酸經由陰離子交換樹脂 與D -甘露糖分離並冷凍乾燥後測定其比旋光度時,可判定 爲右旋性葡萄醛酸之D -葡糖醛酸。 又’對於來自高果美之含岩藻糖硫酸多醣混合物事先以 上述之末端型岩藻依聚糖分解酵素處理者即使與上述同樣 地以草酸予以酸水解,亦未檢測出D -葡糖醛酸與D _甘露糖 爲交互結合之聚合物。由此可判定,上述之末端型岩藻依 聚糖分解酵素經脫離分離切斷之含岩藻糖硫酸多醣之骨架 構造爲具有D_葡糖醛酸與D-甘露糖爲交互結合之構造。 更且,爲了調查D -葡糖醛酸與D -甘露糖之各結合位置與 糖22.結合之異頭(anomer : c)配置,將經由草酸分解所得之 聚合物進行N M R分析。 聚合物之NMR測定結果示於下。但,於1H-NMR中之化學 位移値爲以三乙胺之甲基之化學位移値定爲1 . 1 3,且於 48 1237026 "C-NMR中之三乙胺之甲基之化學位移値定爲9 . 32ppm 不 ° 而表 1H - NMR (D2 〇) <55· 25(1H, br - s, 1 - Η)、4· 32(1 H, d, J-7. z, i, - Η)、4· 〇〇 (1H,br - s, 2 - 1"、3· 71 (111, 5, - Η)、3· 69 (1Η,m, 5 - CH 之 Η)、3· (58 (1Π, m, Η)、3· 63 (1Η, m,5 - CH 之Η )、3· 63(lH,m,4 3· 57(1Η, m, 4 -Η)、3· 54UH,m,3’ -Η)、3· !1Η, m, 5 - Η)、3· 25UH, t,J=8· 5Ηζ、2' - Η) nc — NMR (D2 〇) 5175· 3 (5' - COO Η之C )、10 2. 5(1' - C)、99 l-C)、78.5(2 - C)、77· 9(4' - C)、77· 0(3' ),7 6. 7(5' - C)、73. 9(5 - C)、73· 7 (2/ -〇 > 6 (3 — C)、67. 4 (4 -C) > 6 1. 0 (5 — CH2 OH 之C) 6 Η m · 3 — Η)、 3( 6( C 7 0. 尙,尖峰所歸屬之編號爲如下述式(V丨丨):
由於D -葡糖醛酸1位之立體配置其連位結合定數爲 7 · 6Hz,故決定爲/S -D-葡糖醛酸。 49 1237026 又,由於甘露糖1位之立體配置其化學位移値爲由 5.25ppm,故決定爲a -D -甘露糖。 構成糖之結合方式使用1Η檢測異種核檢測法之HMBC法 進行。 於1H-NMR之歸屬中使用DQF-C0SY法及Η0ΗΑΗΑ法,於 13C-NMR之歸屬中使用HSQC法。 由HMBC光譜可確認在1-H與V-C之間及4’-H與1-C之 間、1 ’ - Η與2 - C之間及2 - Η與1 ’ - C之間分別有交錯尖峰。 由此可得知D -葡糖醛酸爲以/3 -鍵結合於D _甘露糖之2位, D -甘露糖爲以X鍵結合於D -蔔糖醛酸之4位。 若合倂考慮上述之結果,則可判定(a )係在作爲還原末端 殘基之D -甘露糖中具有不飽和D -葡糖醛酸與結合有硫酸基 之L -岩藻糖結合之構造、(b )係在作爲結合有硫酸基之還原 性末端殘基的D -甘露糖中具有不飽和D -葡糖醛酸、與結合 有2個硫酸基之L_岩藻糖之構造、(c)係在作爲有還原末 端殘基之D -甘露糖中具有D -葡糖醛酸、與結合有硫酸基之 L -岩藻糖結合,且在其D -葡糖醛酸中結合D -甘露糖,更且 在其D -甘露糖中具有不飽和D -葡糖醛酸、與結合有硫酸基 鍵之L -岩藻糖結合之構造。 以上,所得之含岩藻糖硫酸多醣-U爲具有D -葡糖醛酸與 D-甘露糖交互結合之構造,且在至少1個以上之D_甘露糖 中具有L -岩藻糖鍵之構造。 又,具有下述一般式(V I I I )所示之部分構造(但,式中之 50 1237026 至少1個乙醇性氫氧化基爲被硫酸酯化,又η爲1以上之 整數)
C-OH CH2 OH
依據本發明,爲提供與本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F分 離’且純化之含岩藻糖硫酸多醣-U。本發明之含岩藻糖硫 酸多醣-U爲含有糖醛酸作爲構成糖,且經由產黃菌屬3?· SA- 00 8 2 (CCRC 910069)生產之岩藻依聚糖分解酵素而低分 子化,且生成至少由上述式(I )、( I I )、( I I I )所示化合物 所選出之1種以上之化合物。其分子量,分子量分布、糖 組成若爲本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U則無任何限定,且 可調製任意的分子量,分子量分布之含岩藻糖硫酸多醣-U, 並可提供糖組成等理化性質明確的含岩藻糖硫酸多醣。 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U爲不具有含岩藻糖硫酸多 醣_ F所具有的強抗凝血活性,故可提供實質上不顯示抗凝 51 /;I23702«1 ~ 血活性之含岩藻糖硫酸多醣。本發明之含岩藻糖硫酸多醣-ϋ可以經純化之含岩藻糖硫酸多醣型式使用爲制癌劑、抗轉 移劑、致癌預防劑等,又亦可用於作爲抗含岩藻糖硫酸多 醣抗體之抗原。更且由此含岩藻糖硫酸多醣-U,可製造具 有上述式(I )、( I I )、( I I I )等構造之寡糖,且於此些新穎 化合物之製造中亦爲有用。 其次,記載本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F及其製法。
於使用本發明方法製造本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F 時’若令具有分解含岩藻糖硫酸多醣-U能力之分解酵素作 用於含岩藻糖硫酸多醣混合物亦可,且於酵素反應終了後 將低分子化之含岩藻糖硫酸多醣-U以超過濾等予以除去即 可。上述之分解酵素若爲可將含岩藻糖硫酸多醣-U選擇性 地分解之酵素則爲任何酵素均可,其具體例可列舉例如產 黃菌屬(?1&¥(^3(^6]^11111)8?.3六-0082 株((^1^ 9 1 0069 )生 產之上述的末端型岩藻依聚糖分解酵素。
令本酵素作用時可於有利酵素反應進行下設定受質濃度 和溫度、pH等即可,受質濃度通常由〇 . 1至1 〇 %左右、溫 度爲由20至40°C附近、pH爲由6至9附近爲令人所望。 又,將含岩藻糖硫酸多醣混合物添加至培養基,並將具 有分解含岩藻糖硫酸多醣· U能力之分解酵素生產能力的微 生物於此培養基中培養,由培養後之培養基精製亦可。使 用之微生物若爲可生產具有分解含岩藻糖硫酸多醣-U能力 之分解酵素之微生物則爲任何微生物均可,具體可列舉上 52 1237026 述記載之產黃菌屬sp. SA- 0082株(CCRC 9 1 0069 )或 Fucoidanobacter mar inns SI-0098 株(FERM BP-5403)。
培養基中添加之營養源若爲使用之菌株可利用,並生產 該分解酵素者即可,碳源例如可利用岩藻依聚糖、海藻粉 末、藻酸、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麥 芽糖、乳糖、澱粉等,氮源以酵母萃取物、蛋白腺、酪蛋 白胺基酸、玉米漿、肉萃取物、脫脂大豆、硫酸銨、氯化 銨等適當。其他將鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋅鹽等無 機質、及金屬鹽類添加亦可。 又,培養條件當然爲依使用之菌株、培養基組成等,將 含岩藻糖硫酸多醣-U之分解活性設定成爲最大,一般若於 培養溫度爲1 5〜3 0 °C、培養基之pH爲5〜9,於5〜7 2小 時之通氣攪拌下進行培養即可。培養終了後,低分子化之 含岩藻糖硫酸多醣-U和培養基中之含岩藻糖硫酸多醣-p1以 外之成分以超過濾除去即可。
尙,上述之 Fucoidanobacter marinus SI-0098 株爲由 青森縣的海水中,由本發明者等人所新檢索取得之菌株, 其菌學性質爲如下。 1 .Fucoidanobacter marinus SI- 009 8 a .型態性質 (1 )本菌爲短桿菌(短桿菌) 寬 0.5 〜0.7//IT1 長度0 . 5〜0 · 7 μ m 53 1237026 (2 )孢子之有無 無 (3 )革蘭氏染色 陰性 b .生理性質 (1 )生長之溫度範圍 於37°C以上可生長。適當的生長溫度爲15〜28°C。 (2 )對氧之態度 好氧性 (3)觸酶(catalase) 陽性 (4 )氧化酶 陰性 (5)脲酶 陰性 (6 )水解 澱粉 陰性 明膠 陰性 酪蛋白 陰性 七葉樹苷 陽性 (7 )硝酸鹽的還原 陰性 (8 )吲哚之生成 陰性 (9 )硫化氫的生成 陽性 (1 0 )牛奶的凝固 陰性 (1 1 )鈉的要求性 陽性 (1 2 )鹽類要求性 於0 %食鹽培養基中的生長 陰性 於1 %食鹽培養基中的生長 陰性 於海水培養基中的生長 陽性 54 1237026 (13) 醒•系 甲基萘醒7 (14) 菌體內DNA之GC含量 61% (1 5 )細胞壁之二胺基庚二酸 陰性 (1 6 )乙醇醯試驗 陰性 (1 7 )羥基脂肪酸的存在 陽性 (18)0F-試驗 〇 (1 9 )菌落的色調 不生成特徵性地菌落色素 (2 0 )運動性 有 (2 1 )滑走性 無 (22)鞭毛 極單毛 本菌株若依據 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology、第9卷( 1 994 )記載之基本分類則被分類至 第4群(革蘭氏陰性好氣性桿菌及球菌)。然而本菌株於電 子傳遞鏈中具有甲基萘醌7,且GC含量爲61%之方面與第 4群所屬之菌大爲不同。基本上革蘭氏陰性細菌在電子傳 遞鏈中具有泛醌,而革蘭氏陽性細菌具有甲基萘醌。 作爲革蘭氏陰性細菌,產黃菌屬及噬纖維菌屬(Cy to phag a) 例外地於電子傳遞鏈中具有甲基萘醌,但屬於此些屬之細 菌的GC含量,於土壤細菌Cytophaga arvensicola等43〜 46%,海洋細菌 Cytophaga diffluens、Cytophaga fermentans、 Cytophaga marina 及 Cytophaga uliginosa 爲42%,與本菌株之性質完全相異。更且,將本菌株與已 鑑定株之1 6S r DNA序列之相同性進行比較時,即使於相同 55 1237026 性最高之已鑑定株Verrucomicrobium spinosum中其相同 性爲76.6%。由於一般泛知16Sr DNA序列之相同性爲90 %以下時,兩細菌之屬乃爲不同,故本發明者等人斷定本 菌株爲不屬於既存屬中之新屬細菌,依此將本菌株命名爲 Fucoidanobacter marinus SI-0098。 本發明者等人如前述亦發現在0.6〜3M之1種或2種 以上鹽類存在下,本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F與含岩藻 糖硫酸多醣-U對酸性多糖凝集劑顯示出完全不同的舉動。 例如使用本發明之方法,可由含岩藻糖硫酸多醣混合液 之水溶液中分離本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F。 首先在含岩藻糖硫酸多醣混合液之水溶液中添加1種或 2種以上之鹽類並使其總濃度爲0 . 6〜3M。添加之鹽類例 如可爲氯化鈉、氯化鈣等,並無特別限定。如此調整鹽濃 度後,若將氯化鯨蠟基吡啶等酸性多醣凝集劑以不會令其 再產生沈澱爲止地添加,且收集沈澱則可取得本發明之含 岩藻糖硫酸多醣-F。 然而上述鹽濃度若超過2M,則因本發明之含岩藻糖硫酸 多醣-F難經由氯化鯨蠟基吡啶形成沈澱,故需要注意。於 分離本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F與含岩藻糖硫酸多醣-U 之目的下,通常以1 · 5 Μ左右之鹽濃度即可達成目的(參照 第1圖之說明)。 其次視需要,將此沈澱洗淨後,沈澱中的氯化鯨蠟基吡 啶以經食鹽飽和之醇洗落,並取得本發明之含岩藻糖硫酸 56 1237026 多醣-F。爲了由此所得之本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F中 除去色素,可在此沈澱溶解後進行超過濾等即可。又若在 脫鹽後冷凍乾燥亦可取得乾燥樣品。又,於工程中亦可添 加防腐劑等。 本發明者等人如前所述亦發現含岩藻糖硫酸多醣以陰離 子交換樹脂精製時若有2價陽離子共存,則每單位樹脂量 吸附之含岩藻糖硫酸多醣增加,且含岩藻糖硫酸多醣之分 離變佳。即,使用本發明之方法製造本發明之含岩藻糖硫 酸多醣-F時,首先於含岩藻糖硫酸多醣混合物中較佳添加 1 mM以上作爲2價陽離子來源之藥品。其次,陰離子交換 樹脂以含有較佳lmM以上2價陽離子之液體平衡化,並令 上述含岩藻糖硫酸多醣混合物吸附。此陰離子交換樹脂以 平衡化之液充分洗淨後,例如以氯化鈉梯度令含岩藻糖硫 酸多醣-F溶出。使用本方法時,添加之2價陽離子濃度若 爲1 mM以上即可。又本方法使用作爲2價陽離子來源之藥 品特別以鈣鹽和鋇鹽之效果優異,但並非特別限定,硫酸 鎂、氯化錳等亦可使用。 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F例如可依實施例8之記_ 而取得。以下,示出此含岩藻糖硫酸多醣之理化性質,但 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F並非被限定於此例。 所得之本發明含岩藻糖硫酸多醣-F之分子量於使用 S e p h a c r y 1 S - 5 0 0之凝膠過濾法計算時,示出約1 9萬爲中 心之分子量分布(參照第1 7圖)。尙,於第1 7圖中,縱軸 57 1237026 爲依苯酣-硫酸法測定試料中之糖含量以480nm吸光度表 示’橫軸爲表示溶離份編號。 尙,凝膠過濾之條件示於下。 柱尺寸:3.08X162.5公分 溶劑:含有0 · 2M氯化鈉與含10%乙醇之10mM磷酸鈉緩 衝液(PH6 · 0) 流速:1.5毫升/分鐘 樣品濃度:0 . 2 5 % 樣品液量:2 0晕;升 分子量標準物質:Shodex STANDARD P-82(昭和電工公司 製) 其次,分析所得之本發明含岩藻糖硫酸多醣-F之成分。 首先,依 Journal of Biological Chemistry,第 175 卷、第595頁(1948)之記載定量岩藻糖量。 其次,將所得之含岩藻糖硫酸多醣-F之乾燥樣品於1當 量之鹽酸中以0 . 5%濃度溶解,並於1 10°C下處理2小時, 將構成單糖予以水解。其次,將使用Glyco TAG及Glyco TAG 試藥套組(同爲寶酒造公司製)水解所得之單糖的還原性末 端予以吡啶基- (2)-胺基化(PA化),以HPLC調查構成糖的 比率。尙,HPLC之條件爲如下述。 裝置·· L- 6200型(日立製作所製) 柱:PERPACK類型A (4.6mmXl50mm:寶酒造公司製) 洗提液:700mM硼酸緩衝液(PH9 · 0);乙腈=9 : 1 58 1237026 檢測··以螢光檢測器F-11 50(日立製作所製)於激發波長 3 1 0 n m、螢光波長3 8 0 n m下檢測 流速:0 . 3毫升/分鐘
柱溫:6 5 °C 其次··依 Analytical Biochemistry、第 4 卷、第 330 頁(1962)之記載定量糖醛酸量。 其次,依 Biochemical Jouornal、第 84 卷、第 106 頁(1962) 之記載定量硫酸含量。 以上之結果,所得之含岩藻糖硫酸多醣-F之構成糖爲岩 藻糖、半乳糖、其莫耳比爲約1 0 : 1。實質上不含糖醛酸及 其他之中性糖。又,岩藻糖與硫酸基之莫耳比爲約1 : 2。 將1%之岩藻依聚糖-F溶液16毫升、與50mM之磷酸緩 、衝液(ρΗ8·0)12毫升與4M之氯化鈉4毫升與32πιμ/ιη1之 前述來自產黃菌屬sp· SA-0082(CCRC 910069)之末端型岩 藻依聚糖分解酵素溶液8毫升混合,並令於2 5 °C下反應4 8 小時。經反應無分解物之生成,且亦確認其無低分子化。 其次,含岩藻糖硫酸多醣-F鈣鹽之IR光譜以傅里葉 (Fourier)變換紅外線分光光度計〗IR-DIAMOND 20(日本電 子公司製)測定時取得第1 8圖所示之光譜。尙,第1 8圖中 縱軸表不透過率(%),橫軸表不波數(cm·1)。 其次,本發明之含岩藻糖硫酸多醣_ F鈣鹽之NMR光譜以 5 0 0MHz之核磁共振裝置JNM - α 5 00型核磁共振裝置(日本電 子公司製)測定時取得第1 9圖所示之光譜。 59 1237026 第1 9圖中,縱軸表示訊號強度、橫軸表示化學位移値 (ppm )。尙,於1Η - NMR中之化學位移値爲以H0D之化學位 移値視爲4 . 65ppm表示。 5.30(岩藻糖1位之H)、1.19(岩藻糖5位之CH3之Η) 其次,所得之含岩藻糖硫酸多醣-F之冷凍乾燥物的比旋 光度以高速高感度旋光計SEPA- 3 00 (堀場製作所製)測定時 爲-135度。 依據本發明,爲提供與本發明之含岩藻糖硫酸多醣-ϋ分 離,且純化之含岩藻糖硫酸多醣-F。本發明之含岩藻糖硫 酸多備-F爲實質上不含有糖醛酸作爲構成糖,且不經由產 黃菌屬sp. SA- 0082 (CCRC 9 1 0069 )生產之岩藻依聚糖分解 酵素而低分子化。其分子量、分子量分布、糖組成若爲本 發明之含岩藻糖硫酸多醣-F則無任何限定,且可調製任意 的分子量、分子量分布之含岩藻糖硫酸多醣-F,並可提供 糖組成、還原末端等理化性質明確、硫酸化度極高之含岩 藻糖硫酸多醣-F。 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F,因與實質上不具有抗凝 血活性之含岩藻糖硫酸多醣-U分離,故具有強的抗凝血活 性,該含岩藻糖硫酸多醣-F和/或其分解物可以經純化之 含岩藻糖硫酸型式使用作爲抗凝血劑,又亦可用於作爲抗 含岩藻糖硫酸多醣抗體之抗原。 本發明之含岩藻糖硫酸多醣,其分解物若於癌細胞之培 60 1237026 養液中添加1微克/毫升以上之濃度,則自添加後1曰起 至數日使癌細胞引起細胞自滅。即,本發明之含岩藻糖硫 酸多醣、其分解物具有強的細胞自滅誘發作用。尙,此些 物質對於正常細胞不誘發細胞自滅,且亦無毒性。特別以 來自食用褐藻植物、海參之含岩藻糖硫酸多醣、其分解物 之安全性高。 於將本發明之細胞自滅誘發劑予以製劑化中,可將含岩 藻糖硫酸多醣和/或其分解物作爲有效成分,並與公知之 醫藥用載體組合即可。一般,本發明之含岩藻糖硫酸多醣 和/或其分解物與藥學容許之液狀或固體狀載體配合,且 視需要加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、安定劑、賦 形劑、結合劑、崩散劑、潤滑劑等,並作成錠劑、顆粒劑、 散劑、粉末劑、膠囊劑等之固型劑、通常之液劑、懸浮劑、 乳劑等液劑。又其可作成在使用前經由添加適當載體而呈 液狀之乾燥品。 本發明之細胞自滅誘發劑可爲經口劑,或者注射劑、點 滴用劑等之非經口劑之任一種投予均可。 醫藥用載體,可依上述投予型態及劑型而選擇,於經口 劑之情形,可利用例如澱粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧 甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。又,於經口劑之調製 時’亦可再配合結合劑、崩散劑、界面活性劑、潤滑劑、 流動性促進劑、矯味劑、著色劑、香料等。其具體例可列 舉以下所示物質。 61 1237026 <結合劑 > 澱粉、糊精、***膠粉末、明膠、羥丙基澱 粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉,羥丙基纖維素、結晶 纖維素、乙基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇。 <崩散劑 > 澱粉、羥丙基澱粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基 纖維素鈣、羧甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素。 <界面活性劑 > 月桂基硫酸鈉、大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸 酯、聚山梨糖醇酯80。 <潤滑劑 > 滑石、蠟類、添加氫之植物油、蔗糖脂肪酸酯、 硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋁、聚乙二醇。 <流動性促進劑 > 輕質無水矽酸、乾燥氫氧化鋁膠、合成 矽酸鋁、矽酸鎂。 又,經口用之液劑,可作成懸浮液、乳劑、糖漿劑、酏 劑。於此各種劑型中亦可配合矯味、矯臭劑、著色劑。 另一方面,非經口劑之情形可依常法將本發明之有效成 分含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物溶解或懸浮於作爲稀 釋劑之注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水溶液、注射 用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、 聚乙二醇等,且視需要,可加入殺菌劑、安定劑、等張化 劑、無痛化劑等而調製。 本發明之細胞自滅誘發劑,可依製劑型態以適當的投予 途徑進行投予。投予方法亦無特別限定,可經由內用、外 用及注射。注射劑,例如可投予至靜脈內、肌肉內、皮下、 皮內等,且於外用劑中亦可包含浣腸劑等。 62 1237026 本發明之細胞自滅誘發劑之投予量可依其製劑型態、投 予方法、使用目的及其所適用之患者年齡、體重、症狀而 適當設定、並無一定、一般上爲製劑中所含有之有效成分 之量爲每成人1天以1〜1000毫克,較佳爲10〜200毫克。 當然投予量爲依各種條件而變動,故亦有比上述投予量還 少之量而爲充分之情形,或者亦有必需超過範圍之情形。 若將具有制癌作用之本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U、含 岩藻糖硫酸多醣-F和/或其分解物作爲有效成分,並與公 知之醫藥用載體製劑化則可製造制癌劑。制癌劑之製造可 依上述方法爲準而進行。一般,本發明之含岩藻糖硫酸多 醣和/或其分解物與藥學容許之液狀或固體狀載體配合, 且視需要加入溶劑、分散劑、乳化劑' 緩衝劑、安定劑、 賦形劑、結合劑、崩散劑、潤滑劑等,並作成錠劑、顆粒 劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等之固型劑、通常之液劑、懸 浮劑、乳劑等液劑。又其可作成在使用前經由添加適當載 體而呈液狀之乾燥品。 制癌劑可爲經口劑,或者注射劑、點滴用劑等之非經口 劑之任~種投予均可。 醫藥用載體,可依上述投予型態及劑型而選擇,且若以 上述之細胞自滅誘發劑之準供使用即可。 制癌劑,可依製劑型態以適當的投予途徑進行投予。投 予方法亦無特別限定,可經由內用、外用及注射。注射劑, 例如可投予至靜脈內、肌肉內、皮下、皮內等,且於外用 63 1237026 劑中亦可包含浣腸劑等。 制癌劑之投予量可依其製 及其所適用之患者年齡、體 無一定但一般上爲製劑中所 天1〜1000毫克,較佳爲 各種條件而變動,故亦有比 之情形,或者亦有必需超過 了可就此經口投予以外,亦 日常攝取。 若將具有致癌抑制作用之 解物作爲有效成分,·並與公 造致癌預防劑。致癌預防劑 行。一般,含岩藻糖硫酸多 之液狀或固體狀載體配合, 乳化劑、緩衝劑、安定劑、 滑劑等,並作成錠劑、顆粒 之固型劑、通常之液劑、懸 成在使用前經由添加適當載 致癌預防劑可以經口劑, 口劑之任一種投予均可。 醫藥用載體,可依上述投 上述之細胞自滅誘發劑爲準 制癌預防劑,可依製劑型_ 劑型態、投予方法、使用目的 重、症狀而適當設定,雖然並 含有之有效成分之量爲每成人 )〜200毫克。當然投予量爲依 上述投予量還少之量而爲充分 範圍之情形。本發明之藥劑除 可添加至任意之飮食品中令以 含岩藻糖硫酸多醣和/或其分 知之醫藥用載體製劑化則可製 之製造可依上述方法爲準而進 醣和/或其分解物與藥學容許 且視需要加入溶劑、分散劑、 賦形劑、結合劑、崩散劑、潤 劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等 浮劑、乳劑等液劑。又其可作 體而呈液狀之乾燥品。 和注射劑、點滴用劑等之非經 予型態及劑型而選擇,且若以 供使用即可。 以適當的投予途徑進行投予。 64 1237026 投予方法亦無特別限定,可經由內用、外用及注射。注射 劑,例如可投予至靜脈內、肌肉內、皮下、皮內等,且於 外用劑中亦可包含浣腸劑等。 制癌預防劑之投予量可依其製劑型態、投予方法、使用 目的及其所適用之患者年齡、體重、症狀而適當設定,雖 然並無一定但一般上爲製劑中所含有之有效成分之量爲每 成人1天1〜1000毫克,較佳爲10〜200毫克。當然投予 量爲依各種條件而變動,故亦有比上述投予量還少之量而 爲充分之情形’或者亦有必需超過範圍之情形。本發明之 藥劑除了可就此經口投予以外,亦可添加至任意之飮食品 中令以日常攝取。 本發明之含岩藻糖硫酸多醣,其分解物爲來自天然物質, 即使對鼠經口投予亦不認爲有毒性。 本發明之藥劑被期待使用作爲免疫機能降低或亢進、或 者癌疾病、病毒性疾病等之治療劑。可作爲致癌預防劑保 持健康。又,本發明之細胞自滅誘發方法可用於生體防禦 機構、免疫機能或者與癌、病毒性疾病等之關係之硏究、 細胞自滅誘發阻礙劑之開發等。特別地,若由食用褐藻植 物、食用海參,調製本發明之含岩藻糖硫酸多醣,其分解 物’因其作爲食品已有長的歷史,故由其所調製之含岩藻 糖硫酸多醣、其分解物於經口投予之情形中,爲安全性極 高之物質。 其次,含岩藻糖硫酸多醣之分子量極大之硫酸化多醣, 65 1237026 故爲了比將其就此作爲醫藥品供使用,更加改善抗原性、 均勻性、抗凝血活性等’乃必要將含岩藻糖硫酸多醣進行 某程度分解,依據本發明,爲提供僅將含岩藻糖硫酸多醣-F選擇性分解之酵素,及令該酵素作用所取得之含岩藻糖硫 酸多醣-F之低分子化物。 本發明中所使用之菌株,若爲屬於互生單胞菌屬 (Alteromonas)屬細菌,且具有本發明之末端型含岩藻糖硫 酸多醣分解酵素生產能力之菌株則爲任何菌株均可。又, 該具有末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素生產能力之菌株 之具體例可列舉例如互生單胞菌屬s p · SN - 1 0 0 9株。若令 來自該菌株之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素作用於含 岩藻糖硫酸多醣,則可取得本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F 之低分子化物。 本菌株爲由青森縣之海水中由本發明者等人所新檢索取 得之菌株,其菌學性質爲如下。 a .型態性質 (1 )本菌爲桿菌 寬 約1 // m 長度 約2 A m (2 )孢子之有無 無 (3 )革蘭氏染色性 陰性 b .生理性質 (1 )生長之溫度範圍 66 1237026 合適的生長溫度爲15〜3(TC。於或40t下無法生長。 (2 )對氧之態度 好氧性 (3 )觸酶 陽性 (4 )氧化酶 陽性 (5 )脂酶 陽性 (6 )資化性 葡萄糖 陽性 甘露糖 陰性 蔗糖 陽性 乳糖 陰性 纖維二糖 陽性 蜜二糖 陰性 甘露糖醇 陽性 甘油 陽性 甲醇 陰性 DL-蘋果酸 陰性 琥珀酸 陰性 反丁烯二酸 陰性 檸檬酸 陰性 水楊苷 陰性 (7 )水解 澱粉 陰性 明膠 陰性 67 1237026 (8 )硝酸鹽之還原 陰性 (9 )脫氮反應 陰性 (1 0 )藻酸之分解 陽性 (1 1 ) /3 -羥基丁酸之利用 陰性 (12)聚羥基丁酸之蓄積 陰性 (1 3 )鈉的要求性 陽性 (1 4 )鹽類要求性 於ο %食鹽培養基中的生長 陰性 於1 %食鹽培養基中的生長 陰性 於海水培養基中之生長 陽性 (1 5 )醌系 泛醌 (16 )菌體內DNA之GC含量 36% (17)0F-試驗 0 (1 8 )菌落之色調 (1 9 )發光性 (2 0 )運動性 (21 )鞭毛 不生成特徵性地菌落色素 陰性 陽性 極單毛 本菌株被鑑定爲 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology、第 1 卷'第 343 〜352 頁、及 Bergey’sManual of Determinative Bacteriology、第 9 卷、第 75 頁、第 13 2 〜133頁(1 994 )中所記載之互生單胞菌屬細菌。然而,本細 菌之生理性狀與所記載之任一菌種均無一致,且GC含量亦 爲低値。於是,將本菌株命名爲互生單胞菌屬sp. SN-1009。 68 1237026 尙,上述菌株以互生單胞菌屬sp· SN- 1 009表示,於通 商產業省工業技術院生命工學工業技術硏究院〔曰本莰城 縣筑波市東1 丁目1番3號(郵遞編號3 0 5 )〕中由平成8年 2月1 3日開始以FERM P-15436寄存,並在前述通商產業 省工業技術院生命工學工業技術硏究所中以FERM BP-5747(於國際寄存之移管申請日:平成8年11月15日)寄 存,且在貴國食品工業發展硏究所菌種保存及硏究中心, 於1996年12月24日以CCRC第910070號寄存。 於本菌株培養基中所加入之營養源若可爲使用之菌株利 用,且可產生末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素者即可, 碳源例如可利用含岩藻糖硫酸多醣、海藻粉末、藻酸、岩 藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麥芽糖等,氮源 以酵母萃取物、蛋白腺、酪蛋白胺基酸、玉米漿、肉萃取 物、脫脂大豆、硫酸銨、氯化銨等爲適當。其他將鈉鹽、 磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋅鹽等無機質、及金屬鹽類添加亦 可。 又本菌株在含有上述營養源之海水或人工海水中生長地 非常良好。 於培養本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之生 產菌時,生產量雖依培養條件而變動’但一般於培養溫度 爲1 5 t:〜3 0 °C,培養基之pH爲6〜9爲佳,於5〜7 2小時 69 1237026 之通氣攪拌培養下,本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分 解酵素之生產量到達最局。 培養條件當然依使用之菌株、培養基組成等,將本發明 之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之生產量設定成爲最 本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素在菌體中存 在,亦在培養物上淸液中存在。 上述的互生單胞菌屬sp. SN- 1 009若以適當的培養基培 養,並收集其菌體,以通常所用的細胞破壞手段,例如以 超音波處理等將菌體弄碎,則可取得無細胞萃取液。 其次,由此萃取液以通常所用之精製手段可取得精製酵 素樣品。例如,以鹽析、離子交換柱層析、疏水鍵柱層析、 凝膠過濾等進行精製,可取得不含其他岩藻依聚糖分解酵 素之經純化的本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵 素。 又,由上述培養液除去菌體之培養液上淸液中因亦大量 存在本酵素,故經由與菌體內酵素同樣之精製手段可將其 精製。 本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之化學及理 化性質爲如下。 (i )作用:對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醣,即 70 Ϊ237026 含岩藻糖硫酸多醣-F作用’則令該含岩藻糖 硫酸多醣-F被低分子化。 (a )構成糖··實質上不含有糖醛酸。 (b) 實質上不經由產黃菌屬(Flavobacterium)sp.SA_ 0082 (CCRC 9 1 0069 )生產之岩藻依聚糖分解酵素低 分子化。 不對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醣、即含 岩藻糖硫酸多醣-U作用 (c) 構成糖:含有糖醛酸。 (d) 經由產黃菌屬(Flavobac ter ium)sp.SA- 0082 (CCRC 910069)生產之岩藻依聚糖分解酵素而低分子化,並 生成至少由下述式(I)、(II)、(III)選出至少一種 以上之化合物。 71 1237026
CH2 OH
OH t 0
CH2 0 — S-OH
〇 A
0 = 5 = 0
OH
OH 72 1237026
OH 〇 II Ho— s— o II 〇
OH
73 1237026 (ii)最適pH:本酵素之最適PH爲在7〜8附近(第20圖)。 即第20圖爲示出本酵素之pH與相對活性之關係圖,縱 軸表示相對活性(% )、橫軸表示pH。實線爲,還原性末端 使用P A化之含岩澡糖硫酸多醣-f ( p a _ f p1)作爲受質之曲線, 點線爲使用下述(V ) - ( 2 )記載之含岩藻糖硫酸多醣_ F作爲受 質時之曲線。 (i i i )最適溫度:本酵素之最適溫度爲在3 〇〜3 5它附近(第 2 1 圖)。 即第21圖爲示出本酵素之溫度與相對活性之關係圖,縱 軸表示相對活性(% )、橫軸表示溫度(t )。實線爲,還原 性末端使用使用PA化之含岩藻糖硫酸多醣-ρ ( PA - FF )作爲 受質時之曲線、點線爲使用下述(V ) - ( 2 )記載之含岩藻糖硫 酸多醣_ F作爲受質時之曲線。 (iv)分子量:本酵素之分子量,以使用sephacryl S-2 00 (PHARMACIA公司製)之凝膠過濾法計算時,爲約1〇萬。 (v )酵素活性之測定方法: 本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素活性之測定 爲如下進行。 首先,作爲本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素 受質之含岩藻糖硫酸多醣—F、及PA-FF爲由下述(1)至(3) 之工程調製。 (1 )高果美海帶含岩藻糖硫酸多醣混合物之調製 將乾燥高果美海帶2公斤以自由粉碎機Μ - 2型(奈良機 74 1237026 械製作所製)弄碎,並於4 . 5倍量之80%乙醇中8(TC、2小 時處理後,過濾。殘渣以上述80%乙醇萃取、過濾之工程 再重覆3次,取得乙醇洗淨殘渣1 870克。於殘渣中加入36 公升水,於1 00 °C處理2小時,並過濾可得萃取液。萃取 液之鹽濃度使與400mM氯化鈉溶液相同後,將5%氯化鯨蠟 基吡啶以不會令其再產生沈澱爲止地添加,並離心分離。
此沈澱以80%乙醇重覆洗淨,將氯化鯨蠟基吡啶完全除去 後,溶解於3公升之2M氯化鈉中,將不溶物以離心分離 除去,並懸浮於以2M氯化鈉平衡化之100毫升DEAE-Cellulofine A- 800,攪拌後過濾,並除去樹脂。將此濾液 置入以2M氯化鈉平衡化之100毫升DEAE-Cellulofine A-800粒中,通過之溶離份以超濾器(過濾膜之排除分子量1〇 萬)進行脫鹽及低分子除去,此時所產生之沈澱以離心分離 予以除去。將此上淸液冷凍乾燥可得精製高果美海帶含岩 藻糖硫酸多醣混合物82 . 2克。
(2)含岩藻糖硫酸多醣-F之調製 將上述來自高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醣混合物6克 於600毫升含有0.2M氯化鈣之20mM醋酸鈉(pH6.0)中溶解 後,置入事先以含有0 · 2M氯化鈣之20mM醋酸鈉(pH6 . 0)平 衡化之3600毫升DEAE-Sepharose FF柱中,以含有0.2M 氯化鈣之20mM醋酸鈉(pH6.0)充分將柱洗淨後,以0〜2M 之氯化鈉梯度令其溶出。 收集氯化鈉濃度爲〇 . 7 5M以上所溶出之含岩藻糖硫酸多 75 1237026 醣-F溶離份,並以裝有排除分子量1 〇萬超濾膜之超濾器濃 縮脫鹽後冷凍乾燥,可得含岩藻糖硫酸多醣_ F之冷凍乾燥 樣品3 . 3克。 (3 )PA-FF之調製 將上述之含岩藻糖硫酸多醣-F之冷凍乾燥樣品1 2毫克 溶解於水4 8 0微升中,並以各1 2微升分注3 6份後,使用 冷凍乾燥之Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將還原性末 端PA化,取得PA-FF。所得之PA-FF,溶解於1 5毫升含有 10%甲醇之lOmM醋酸銨溶液中,且以CellulofineGCL-300 柱(40 X 9 00 mm)進行凝膠過濾,並收集高分子溶離份。所得 之高分子溶離份以孔徑大小3 500之透析膜充分透析並脫 鹽,其次以蒸發器濃縮至5毫升可得本發明之末端型含岩 藻糖硫酸多醣-F分解酵素之受質用PA-FF。 又,如此處理所得之PA - FF,經由與市售之吡啶基-(2 )-胺基化岩藻糖(寶酒造公司製)之螢光強度(激發波長 320nm,螢光波長400nm)比較定量爲約40nmol。 使用由上述(1 )及(2 )工程所得之含岩藻糖硫酸多醣-F測 定本發明末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之活性時,以 下述要領進行。 即,將2 . 5 %含岩藻糖硫酸多醣-F溶液1 2微升、與6微 升之1 Μ氯化鈣溶液與1 2微升之1 Μ氯化鈉溶液、與7 2微 升5 0mM含有醋酸和咪唑和Ti· i s -鹽酸之緩衝液(ρΗ7 . 5 )、與 1 8微升之本發明末端型含岩藻糖硫酸多醣-F分解酵素混 76 1237026 合,並於3 0 °C、反應3小時後,反應液以1 〇 〇 °c處理,離 心分離後,其1 0 0微升以HPLC進行分析,測定低分子化之 程度。 準備用以溶解本發明末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素 之緩衝液代替本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素 並令以同樣條件反應者,及使用水代替含岩藻糖硫酸多醣-F溶液進行反應者作爲對照組,並分別同樣地以HPLC進行 分析。 1單位之酵素,爲在上述反應系中於1分鐘將mol之 含岩藻糖硫酸多醣-F之岩藻糖基鍵切斷之酵素量。所切斷 之岩藻糖基鍵之定量爲由下述式算出。 { ( 1 2 X 2 . 5 ) / ( 1 00 X MF) } X { (MF/ M) - 1 } X { 0. 12/ ( 180X0.01 }二 U/ml (12X2.5)/100:反應系中添加之含岩藻糖硫酸多醣-F(毫 克) MF:受質含岩藻糖硫酸多醣-F之平均分子量 Μ :反應產物之平均分子量 (MF/ Μ) - 1 : 1分子之含岩藻糖硫酸多醣-F經酵素所切斷之 數目 1 8 0 :反應時間(分鐘) 0.01:酵素液量(毫升) 0 . 1 2 ··反應液總量(毫升) 尙,HPLC之條件爲如下述。 77 1237026 裝置:L-6200型(日立製作所製) 柱:OHpak KB- 804 ( 8mmX 3 00mm)(昭和電工公司製) 洗提液:含有5mM疊氮化鈉、25mM氯化鈣、及5〇mM氯 化鈉之2 5 mM咪唑緩衝液(pH 8 ) 檢測:視差折射率檢測器(S h 〇 d e X R I - 7 1、昭和電工公司 製) 流速:1毫升/分鐘
柱溫:2 5 °C 爲了測定反應產物之平均分子量,將市售已知分子量之 聚三葡萄糖(STANDARD P-82、昭和電工公司製)以同上述之 HPLC分析之條件下進行分析,並將聚三葡萄糖分子量與 OHp ak KB- 8 04滯留時間之關係以曲線表示,作爲用以測定 上述酵素反應產物分子量之標準曲線。 使用由上述(1 )〜(3 )工程所得之PA - FF測定本發明末端 型含岩藻糖硫酸多醣酵素之活性時,以下述之要領進行。 即,將8pmol / μ 1之PA-FF溶液2微升、與5微升之1M 氯化鈣溶液與1 0微升之1 Μ氯化鈉溶液、與2 3微升水、與 5 0微升之5 OmM含有醋酸和咪唑和T r i s -鹽酸之緩衝液 (pH 8 .2)、與10微升之本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣 分解酵素混合,並於30°C、反應3小時後,反應液以1〇〇 °C處理10分鐘,離心分離後,其80微升以HPLC進行分析, 測定低分子化之程度。 準備用以溶解本發明末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素 78 1237026 之緩衝液代替本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素 並令以同樣條件反應者。及使用水代替PA - FF溶液進行反 應者作爲對照組,並分別同樣地以HPLC進行分析。 1單位之酵素,爲在上述反應系中於1分鐘將1 # m0 1之 含岩藻糖硫酸多醣之岩藻糖基鍵切斷之酵素量。所切斷之 岩藻糖基鍵之定量爲由下述式算出。 16X10-6(MF/M)-1} X { 1/(180X0.01)} = U/ml 16 X 10·6 應系中添加之 PA-FF( // mol ) MF :受質PA-FF之平均分子量 M :反應產物之平均分子量 (MF/M)-1 : 1分子之含岩藻糖硫酸多醣_f經酵素所切斷之 數目 180 :反應時間(分鐘) 0 · 0 1 :酵素液量(毫升) 尙,HPLC之條件爲如下述。 裝置:L-6200型(日立製作所製) 柱:OHpak SB-803(8mmX300mm)(昭和電工公司製) 洗提液:含有5mM疊氮化鈉及10%二甲基亞楓之2〇〇mM 氯化鈉溶液 檢測:以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製)於激發波長 3 20nm、螢光波長400nm下檢測。
流速:1毫升/分鐘 柱溫:5 0 °C 79 1237026 爲了測定反應產物之平均分子量,將市售已知分子量之 聚三葡萄糖(STANDARD P-82、昭和電工公司製)使用Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將還原性末端予以PA化,取得 各種分子量之PA化聚三葡萄糖。將所得之各種分子量之PA 化聚三葡萄糖以同上述之HPLC分析條件下進行分析,並將 聚三葡萄糖分子量與〇Hp a k SB- 803滯留時間之關係以曲線 表示,作爲用以測定上述酵素反應產物分子量之標準曲線。 蛋白質之定量,爲經由測定酵素液之280nm吸光度而進 行。此時1毫克/毫升之蛋白質溶液的吸光度以1 . 〇計算。 本發明者等人,如下所述,決定本發明之末端型含岩藻 糖硫酸多醣分解酵素之作用機制。 (1 )經由末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之含岩藻糖硫 酸多醣-F之分解及分解物的調製令精製之來自高果美海帶 之含岩藻糖硫酸多醣-F以本發明之末端型含岩藻糖硫酸多 醣分解酵素作用,進行分解物的調製。 首先,進行含岩藻糖硫酸分解酵素之生產。即,將互生 單胞菌屬sp· SN- 1 009(CCRC 9 1 0070 )接種至由分注含有蔔 萄糖0.25%、蛋白腺1.0%、酵母萃取物0.05%之人工海 水(Germaline Laboratory 製)pH8.2 所組成之培養基 600 毫升並殺菌(120°C、20分鐘)之2公升三角燒瓶中,並於 2 5 °C下培養2 6小時作成種培養液。將含有蔔萄糖〇 . 2 5 %、 蛋白腺1.0%、酵素萃取物0.02%、前述之來自高果美海 帶之含岩藻糖硫酸多醣0.2%、及消泡劑(信越化學工業製 80 1237026 KM70)0.01% 之人工海水(Germalin Laboratory 製)pH8.0 所組成之培養基20公升置入30公升容量之醱酵缸中並於 1 20 °C下殺菌20分鐘。冷卻後,接種以上述之種培養600 毫升,並於24°C下24小時,每分鐘10公升通氣量與每分 鐘1 2 5轉之攪拌速度之條件下培養。培養終了後,將培養 液離心分離可得菌體及培養上淸液。將所得之培養上淸液, 以分級分子量1萬之超濾器濃縮後以8 5 %飽和硫酸銨鹽 析,所產生之沈澱以離心分離收集,並對含有1/ 1 〇濃度 人工海水之20mM Tris-鹽酸緩衝液(pH8.2)充分透析,可 得600毫升之粗製酵素。 、將如此處理所得之粗製酵素中之40毫升、與人工海水44 毫升、與前述之含岩藻糖硫酸多醣-F 510毫克與水36毫 升混合,並將pH調整至8,於25°C下反應48小時後,以 Cellulofine GCL- 3 00進行凝膠過濾,分成4個部份,由 分子量大量者之順序,定爲F-Fd-Ι(分子量超過25000)、 F-Fd-2(分子量 25000 〜超過 12000)、F-Fd-3(分子量 12000 〜超過6500)、及F-Fd-4(分子量6500以下)。將此4個 溶離份脫鹽後冷凍乾燥,各取得乾燥品170毫克、270毫 克、300毫克、及340毫克。 含岩藻糖硫酸多醣-F之酵素分解物,即低分子化經由 Cel 1 ulof ine GCL- 3 00凝膠過濾之結果示於第22圖。於圖 22中縱軸表示480nm之吸光度(依苯酚-硫酸法之呈色量)、 橫軸表示溶離份編號,1溶離份爲10毫升。柱體積爲107 5 81 1237026 毫升,洗提液爲含有10%甲醇之0.2M醋酸銨溶液。 第22圖中,白圈標記爲表示含岩藻糖硫酸多醣-F之酵 素分解物之凝膠過濾結果,黑三角標記爲表示酵素分解前 之含岩藻糖硫酸多醣-F之凝膠過濾結果。 由上述之Cellulofine GCL- 3 00之結果,可判定本發明 之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之反應產物之分子量分布爲 約1 0 0 0〜3萬左右。 (2 )酵素反應產物之還原末端糖及中性糖組成之分析 將上述之 F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3、及 F-Fd-4 之一部 分使用Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將還原性末端予 以PA化,並將所得之各PA化糖(PA-F-Fd- 1 )、(PA-F-Fd-2)、 (PA-F-Fd-3)及(PA-F-Fd-4)以 4 當量之鹽酸、l〇〇°C 處理 3 小時將其水解,並以HPLC調查還原末端糖。 尙,HPLC之條件爲如下述。 裝置:L-6200型(日立製作所製) 柱:Per Pack類型A (4.6_xi50mm)(寶酒造公司製) 洗提液:700mM硼酸緩衝液(pH9):乙腈=9: 1 檢測:以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製)於激發波長 310nm、螢光波長380nm下檢測。 流速:0 . 3毫升/分鐘
柱溫:6 5 °C 其結果 ’(PA-F-Fd-1)、(PA-F-Fd-2)、(PA-F-Fd-3)及 (PA-F-Fd-4)之還原末端糖爲岩藻糖。 82 Ϊ237026 又,F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3 及 F-Fd-4 之中性糖組成 &下述方法測定。尙,受質所用之含岩藻糖硫酸多醣-F於 硫酸水解後,使用Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將構 成糖之還原性末端予以PA化,並在相同於上述分析酵素反 應產物還原性末端時之HPLC條件下分析時,僅檢測出岩藻 糖與半乳糖,且因其立體配位分別爲L及D,故關於產物 亦僅測定出L -岩藻糖及D -半乳糖。 即,爲了調查構成糖之一之D -半乳糖的含量,使用F -套 組’乳糖/半乳糖(百靈佳山之內公司製),依據說明書構 築僅可測定D -半乳糖之反應系,將另外以4當量鹽酸於1 〇〇 °C、水解 2 小時之 F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3、及 F-Fd-4 於中和後,以此反應系測定。 更且,爲了定量另一者構成糖之L -岩藻糖,依據Clinical Chemistry、第36卷、第474 - 476頁( 1 990 )記載之方法, 將另外以4當量鹽酸於l〇〇°C、水解2小時之F-Fd - 1、F-Fd-2、F-Fd-3、及F-Fd-4於中和後,以此反應系測定。 以上結果,L-岩藻糖與D-半乳糖之比例爲分別對卩^心 1、F-Fd-2、F-Fd-3、及 F-Fd-4 以約 100: 44,100: 27、100 : 5 及 100 : 1。 右歸納以上之結果’則可判定本發明之末端型含岩藻糖 硫酸多醣分解酵素,爲對含岩藻糖硫酸多醣-F作用並水解 其岩藻糖基鍵,生成分子量約1000〜3萬左右之低分子化 物,且此低分子化物於分子量大者爲半乳糖含量高。尙, 83 1237026 低分子化物之還原性末端全部爲L -岩藻糖。 其次,爲了調查本酵素之受質專一性,含岩藻糖硫酸多 醣_ U以本發明之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素予以作用。 即’將2 . 5 %之含岩藻糖硫酸多醣_ u溶液1 2微升、與6 微升之1M氯化鈣溶液與微升之1M氯化鈉溶液、與72 微升之50mM咪唑緩衝液(PH 7.5)、與18微升之本發明之末 端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素(1 . 6mU/ml )混合,並於30 °C反應3小時後,將反應液於1 〇 〇 °c處理1 〇分鐘,離心分 離後,其100微升以HPLC進行分析,測定低分子化之程度。 對照組爲準備,以用於溶解本發明末端型含岩藻糖硫酸 多醣分解酵素之緩衝液代替本發明之末端型含岩藻糖硫酸 多醣分解酵素且令以同樣條件反應者,並同樣地以HPLC進 行分析。 尙,HPLC之條件爲如下述。 裝置:L-6200型(日立製作所製) 柱:OHpak KB-804(8mmX300mm)(昭和電工公司製) 洗提液:含有5mM疊氮化鈉、25mM氯化銘、及50mM氯 化鈉之25mM咪唑緩衝液(pH8) 檢測:視差折射率檢測器(Shodex RI -71、昭和電工公司 製) 流速:1毫升/分鐘
柱溫:2 5 °C 其結果,本發明之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素,完全無 84 1237026 法將含岩藻糖硫酸多醣-U予以低分子化。 如其所述,本發明爲關於含有上述之本發明之含岩藻糖 硫酸多醣分解酵素,與鈣源之酵素組成物。 可使用之鈣源,於固型組成物中,可列舉例如氯化鈣、 碳酸鈣、醋酸鈣之鈣鹽、氧化鈣、氫氧化鈣、或其水合物 等。另外,於水、乙醇等溶劑中令其溶解、懸浮、乳化之 液狀組成物中,鈣源可爲如前述之單體,或者爲經溶解等 而呈離子化狀態者亦可。
此些鈣源,因可將該酵素賦活或安定化而爲有效。 因此,上述酵素組成物於不阻礙上述鈣源作用效果之範 圍下,亦可依用途含有常用的添加劑。
藉由令本發明之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素作用於含岩 藻糖硫酸多醣-F含有物,則可調製含岩藻糖硫酸多醣-F之 低分子化物。含岩藻糖硫酸多醣-F含有物,例如可爲含岩 藻糖硫酸多醣-F精製品、或可爲前述之含岩藻糖硫酸多醣 混合物,更且可爲褐藻類海藻之水性溶劑萃取物。含岩藻 糖硫酸多醣-F含有物之溶解可於通常之方法下進行即可, 且溶解液中之含岩藻糖硫酸多醣濃度雖以其最高溶解濃度 亦可,但通常以考慮其操作性,酵素力價而選定爲較佳。 含岩藻糖硫酸多醣-F溶解液可由水、緩衝液等依目的而 選擇即可。溶解液之pH通常爲中性,酵素反應通常於3 0 °C附近進行。藉由調整酵素量、反應時間等,而可調整低 分子化物之分子量。 85 1237026 其次將低分子化物進行分子量分級,則可調製更加均勻 之分子量分布之含岩藻糖硫酸多醣-F低分子化物。分子量 分級可應用通常所常使用之方法,例如可使用凝膠過濾法 和分子量分級膜。低分子化物,視需要亦可再進行離子交 換樹脂處理、活性碳處理等之精製操作,且可視需要進行 脫鹽處理、無菌處理,並藉由冷凍乾燥,亦可調製本發明 之低分子化物之乾燥品。 實施例 以下,列舉實施例,更具體說明本發明,但本發明並不 被此些記載所限定。尙,實施例中之%意指重量%。 實施例1 將高果美海帶充分乾燥後,乾燥物2公斤以自由粉碎機 (奈良機械製作所製)弄碎,將所得之乾燥粉末懸浮於9公 升之80%乙醇中,並於80°C處理2小時。處理後以濾紙過 濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆3次操作 可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於40公升水後,於95 °C處 理2小時,並過濾。殘渣以熱水洗淨,取得高果美海帶之 含岩藻糖硫酸多醣之萃取液3 6公升。將所得之萃取液1 . 8 公升冷凍乾燥,可得含岩藻糖硫酸多醣樣品1 5 . 4克。其次 於殘餘的萃取液中加入0 · 4M食鹽,再將5 %氯化鯨蠟基吡 啶以不會令其再產生沈澱爲止地添加並以離心分離收集沈 澱。此沈澱於3公升之0 · 4M食鹽水中懸浮後離心分離,並 洗淨。此洗淨操作重覆3次後於沈澱中加入1公升之4M食 86 1237026 鹽水,良好攪拌後將乙醇添加成8 0 %,攪拌後以離心分離 取得沈澱。此沈澱懸浮於80%乙醇中並離心分離之操作重 覆至上淸液中之260nm吸光度成爲〇爲止。此沈殿溶解於2Μ 食鹽水3公升中,且不溶物以離心分離除去後,添加2M食 鹽水平衡化之100毫升DEAE-Cellulofine A- 800(生化學工 業公司製)’攪拌後,加入之樹脂以過濾除去。將濾液置入 2M食鹽水平衡化之DEAE-Cellulofine A- 800柱中,非吸附 部分以具備排除分子量1 0萬以下空心絲之超濾裝置予以超 過濾,並將著色性物質及食鹽完全除去後,以離心分離及 過濾將不溶性物質除去,並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻 糖硫酸多醣混合物之重量爲76克。 實施例2 將真海帶充分乾燥後,乾燥物2公斤以自由粉碎機(奈良 機械製作所製)弄碎,將所得之乾燥粉末懸浮於9公升之8 0 %乙醇中,並於80°C處理2小時。處理後以濾紙過濾取得 殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆3次操作可得乙 醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於40公升水後,於9 5 °C處理2小 時,並過濾。殘渣以熱水洗淨,取得真海帶之含岩藻糖硫 酸多醣之萃取液3 6公升。於所得之萃取液中加入0.4M食 鹽,再將5 %氯化鯨蠟基吡啶以不會令其再產生沈澱爲止地 添加並以離心分離收集沈澱。此沈澱於3公升之0 · 3M食 鹽水中懸浮後離心分離,並洗淨。 此洗淨操作重覆3次後於沈澱中加入1公升之4M食鹽 87 1237026 會令其再產生沈澱爲止地添加並以離心分離收集沈澱。此 沈澱於3公升之0 · 3M食鹽水中懸浮後離心分離,並洗淨。 此洗淨操作重覆3次後於沈澱中加入1公升之4 Μ食鹽水, 良好攪拌後將乙醇添加成8 0 %,攪拌後以離心分離取得沈 澱。此沈澱懸浮於80%乙醇中並重覆離心分離之操作至上 淸液中之260nm吸光度成爲0爲止。此沈澱溶解於2Μ食 鹽水3公升中,且不溶物以離心分離除去後,添加2M食 鹽水平衡化之100毫升DEAE-Cellulofine A-800(生化學工 業公司製),攪拌後,加入之樹脂以過濾除去。將濾液置入 2M食鹽水平衡化之DEAE-Cellulofine A- 800柱中,非吸附 部分以具備排除分子量1 〇萬以下空心絲之超濾裝置予以超 過濾,並將著色性物質及食鹽完全除去後,以離心分離及 過濾將不溶性物質除去,並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻 糖硫酸多醣混合物之重量爲52克。又,此含岩藻糖硫酸多 醣混合物爲不含有吸附至多醣性樹脂之著色性物質。 實施例5 將實施例4記載之含岩藻糖硫酸多醣混合物之冷凍乾燥 物秤量4份各1克,並分別溶解於水,0 . 2M之氯化鈉、0 . 2M 之氯化鈣、0 . 2M之氯化鎂中,其次,準備4根500毫升之 DEAE-Sepharose FF柱,並於其內2根以0 · 2M之氯化鈉、1根 以0 . 2 Μ之氯化鈣、1根以0 . 2 Μ之氯化鎂分別予以平衡化。 以0 . 2Μ氯化鈉平衡化之柱之一者以柱1 〇倍量之水洗淨。 將分別溶解於水、氯化鈉、氯化錦、氯化鎂之含岩藻糖硫 1237026 酸多醣混合物分別置入以水、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂分 別平衡化之D E A E - S e p h a r 〇 s e F F柱中,分別以平衡化所用 之溶液充分洗淨,且其次,以0至4M之氯化鈉梯度令其溶 出。結果,僅在使用氯化鈣及氯化鎂之系中吸附有含岩藻 糖硫酸多醣混合物之總量。 於水及食鹽水平衡化之柱中僅相當0 . 4克之含岩藻糖硫 酸多醣被吸附。 又,於任一種柱中,均將本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F 與含岩藻糖硫酸多醣-U實質上分離。 Φ 實施例6 將高果美海帶充分乾燥後,其2公斤以自由粉碎機(奈 良機械製作所製)弄碎,將所得之乾燥粉末懸浮於9公升 之80%乙醇中,並於80°C處理2小時。處理後以濾紙過 ' 濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆3次操作 可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於36公升之0.2M醋酸鈣 溶液後,於95°C處理2小時,並過濾。殘渣以4公升之 0 0 . 2M醋酸鈣溶液洗淨,可得高果美海帶之含岩藻糖硫酸多 醣之萃取液36公升。 將此濾液以裝有排除分子量1 0萬超濾膜之超濾器濃縮至 2公升,其次,添加終濃度爲1 . 5M之食鹽並將5 %氯化鯨 蠟基吡啶以不會令其再產生沈澱爲止地添加。所產生之沈 澱以離心分離予以除去。所得之上淸液以超過濾濃度至1公 升,並添加4公升之乙醇,且產生之沈澱以離心分離予以 90 1237026 收集。於此沈澱中添加1 00毫升之4M食鹽水並良好攪拌後 將乙醇添加成8 0 %,攪拌後以離心分離取得沈澱。此沈澱 懸浮於8 0 %乙醇中並重覆離心分離之操作,至上淸液中之 26Onm吸光度爲0爲止。將此沈澱溶解於2M之食鹽水2公 升中,且不溶物以離心分離除去後,添加以2M食鹽水平衡 化之50毫升DEAE-Cellulofine A-800(生化學工業公司 製),攪拌後,加入之樹脂以過濾除去。將濾液置入2M食 鹽水平衡化之DEAE-Cellulofine A- 800柱中,非吸附部分 以具備排除分子量1 0萬以下空心絲之超濾裝置予以超過 濾,並將著色性物質及食鹽完全除去後,以離心分離及過 濾將不溶性物質除去,並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖 硫酸多醣-U之重量爲15克。又,本發明之此含岩藻糖硫酸 多醣-U不含有吸附至多醣性樹脂之著色性物質。 又此含岩藻糖硫酸多醣-U令與前述之末端型岩藻依聚糖 分解酵素作用,則生成上式(I )、( Π )、及(I I I )所示之寡 糖。 實施例7 將高果美海帶充分乾燥後,其2公斤以自由粉碎機(奈良 |幾械製作所製)弄碎,將所得之乾燥粉末懸浮於9公升之8 0 %乙醇中,並於80 °C處理2小時。處理後以濾紙過濾取得 歹袭渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆3次操作可得乙 醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於3 6公升之〇 · 2M醋酸鈣溶液後, 於9 5 °C處理2小時,並過濾。殘渣以4公升之0 · 2M醋酸 91 1237026 鈣溶液洗淨,取得高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醣之萃取 液3 6公升。於所得之過濾液中將5 %氯化餘螺基π比0定以不 會令其再產生沈澱爲止地添加並以離心分離收集沈澱。此 沈澱於3公升之0 · 4M食鹽水中懸浮後離心分離,並洗淨。 此洗淨操作重覆3次後於沈澱中加入1公升之4M食鹽水, 良好攪拌後將乙醇添加成80%,攪拌後以離心分離取得沈 澱。此沈澱懸浮於8 0 %乙醇中並重覆離心分離之操作至上
淸液中之260nm吸光度成爲0爲止。此沈澱溶解於2M食鹽 水3公升中,且不溶物以離心分離除去後,添加2M食鹽水 平衡化之100毫升DEAE-Cellulofine A-800(生化學工業公 司製),攪拌後,加入之樹脂以過濾除去。將濾液置入2M 食鹽水平衡化之DEAE-Cellulofine A- 800柱中,非吸附部 分以具備排除分子量1 〇萬以下空心絲之超濾裝置予以超過 濾,並將著色性物質及食鹽完全除去後,以離心分離及過 濾將不溶性物質除去,並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖 硫酸多醣混合物之重量爲90克。又,此含岩藻糖硫酸多醣 混合物爲不含有吸附至多醣性樹脂之著色性物質。稱量此 含岩藻糖硫酸多醣混合物之冷凍乾燥物7克,並溶解於0.2M 之氯化鉀中。其次,將4000毫升之DEAE-Sepharose FF柱 以0 · 2M之氯化鈣平衡化。將溶解於〇 . 2M氯化鈣之含岩藻 糖硫酸多醣混合物置入DEAE-Sepharose FF柱,以0. 2M之 氯化鈣充分洗淨,且其次,以0〜4M之氯化鈉梯度令其溶 出。收集溶出份之內氯化鈉濃度爲0 . 0 5〜0 . 8 Μ之溶離份並 92 1237026 以透析脫鹽後冷凍乾燥,取得實質上與含岩藻糖硫酸多醣_ F分離之含岩藻糖硫酸多醣-U 2 . 1克。 又’收集上述溶出份之內氯化鈉濃度爲〇 . 9〜1 . 5 Μ之溶 離份並以透析脫鹽後冷凍乾燥,取得實質上與含岩藻糖硫 酸多醣-U分離之含岩藻糖硫酸多醣-F 4.7克。 實施例8 含岩藻糖硫酸多醣-F之製造 秤量實施例7所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物1 . 2克, 並於1 · 5Μ之氯化鈉溶液中以終濃度爲〇 . 2%溶解,並將1 . 25 %氯化鯨蠟基吡啶之1 . 5Μ氯化鈉溶液以不會令其再產生沈 澱爲止地添加。生成之沈澱以離心分離收集,且此沈澱於500 毫升之1 . 5Μ食鹽水中懸浮後離心分離,並洗爭。此洗淨操 作重覆3次後於沈澱中加入1公升之4Μ食鹽水,良好攪拌 後將乙醇添加成80%,攪拌後以離心分離取得沈澱。此沈 蠲懸浮於80%乙醇中並重覆離心分離之操作至上淸液中之 26Onm吸光度成爲0爲止。此沈澱溶解於2Μ食鹽水500毫 升中,且不溶物以離心分離除去後,添加2M食鹽水平衡化 之1毫升DEAE-Cel lulofine A-800(生化學工業公司製), 攪拌後,加入之樹脂以過濾除去。將濾液置入2M食鹽水平 衡化之DEAE-Cellulofine A- 800柱中,非吸附部分以具備 排除分子量1 0萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾,並將 著色性物質及食鹽完全除去後,以離心分離及過濾將不溶 性物質除去,並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醣- 93 1237026 F之重量爲710克。又,此含岩藻糖硫酸多醣-F爲不含有 吸附至多醣性樹脂之著色性物質。又此含岩藻糖硫酸多醣-F爲不含糖醛酸且以岩藻糖作爲構成糖主成分之本發明含岩 藻糖硫酸多醣-F。 實施例9 含岩藻糖硫酸多醣-F之酵素性精製方法 秤量實施例7所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物1 〇克,並 於5 00毫升之人工海水中溶解後,添加前述來自產黃菌屬sp. SA- 00 82 (CCRC 910069)之末端型岩藻依聚糖分解酵素並於 2 5 °C反應5 0小時。反應液以製備排除分子量1 〇萬以下空 心絲之超濾裝置予以超過濾,並將低分子性物質完全除去 後,以離心分離及過濾將不溶性物質除去,並冷凍乾燥。 冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醣-F之重量爲6克。又,此含 岩藻糖硫酸多醣· F爲不含有吸附至多醣性樹脂之著色性物 質。又判定此含岩藻糖硫酸多醣-F爲不含糖醛酸,且以岩 藻糖作爲構成糖主成分之本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F。 實施例1 0 含岩藻糖硫酸多醣-F之培養性精製方法 秤量實施例7所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物60克, 並於20公升之人工海水中溶解後加入蛋白腺200克與酵母 萃取物4克,並置入30公升之發酵缸中並滅菌後,將前述 之產黃菌屬sp. SA- 0082株(CCRC 9 1 0069 )植菌並於25°C培 養24小時。將培養液離心分離除去菌體後,以具備排除分 94 1237026 子量1 〇萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾,將低分子性 物質完全除去後,以離心分離及過濾除去不溶性物質,並 冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醣-F之重量爲3 6 克。又此含岩藻糖硫酸多醣-F爲不含有吸附至多醣性樹脂 之著色性物質。又判定此含岩藻糖硫酸多醣-F爲不含糖醛 酸並以岩藻糖作爲構成糖主成分之本發明之含岩藻糖硫酸 多醣-F。 實施例1 1
將實施例7記載之含岩藻糖硫酸多醣混合物之冷凍乾燥 物稱量4份各1克,並分別溶解於水,0 . 2Μ之氯化鈉、0 . 2Μ 之氯化鈣、0.2Μ之氯化鎂中,其次,準備4根500毫升之 DEAE-SepharoseFF柱,並於其內2根以0.2Μ之氯化鈉、1根 以0 . 2M之氯化鈣、1根以0 . 2M之氯化鎂分別予以平衡化。 以0 . 2M氯化鈉平衡化之柱之一者以柱1 0倍量之水洗淨。 將分別溶解於水、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂之含岩藻糖硫 酸多醣混合物分別置入以水、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂分 別平衡化之DEAE-Sepharose FF柱中,分別以平衡化所用 之溶液充分洗淨,且其次,以0至4M之氯化鈉梯度令其溶 出。結果,僅在使用氯化鈣及氯化鎂之系中吸附置入柱之 含岩藻糖硫酸多醣混合物之總量。於水及食鹽水平衡化之 柱中僅相當0 . 4克之含岩藻糖硫酸多醣被吸附。 又,於任一種柱中,均將本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F 與含岩藻糖硫酸多醣-U實質上分離。 95 1237026 實施例1 2
秤量實施例1記載之含岩藻糖硫酸多醣混合物7克’並 於8 00毫升之0.2M氯化鈣中溶解。其次,4公升之DEAE-Sepharose FF柱以0.2M之氯化鈣平衡化,並將上述含岩藻 糖硫酸多醣溶液全量置入柱中,以8公升之0 . 2M氯化鈣溶 液洗淨後,以0至4 Μ之氯化鈉梯度令其溶出。分別將溶 出分內檢測出糖醛酸之溶離份(氯化鈉濃度約0 . 9Μ以下: 含岩藻糖硫酸多醣-U )、未檢測出糖醛酸之溶離份(氯化鈉 濃度約1 · 2Μ附近:含岩藻糖硫酸多醣-F )脫鹽後冷凍乾燥, 並分別取得1 . 4克及4 . 8克乾燥品。 實施例1 3 於實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物中,令產黃 菌屬sp· SA-〇〇82(CCRC 9 1 0069 )生產之末端型岩藻依聚糖 #角|_素作用則生成具有下述構造之寡糖。
96 1237026
97 1237026
/ OH ο ( in 98 1237026 本發明者等人爲進行下述之酵素反應,取得上述寡糖。 即,將2 . 5 %之實施例1之含岩藻糖硫酸多醣混合物溶 液80毫升、和50mM之磷酸緩衝液(pH7 · 5 )60毫升和4M之 氯化鈉20毫升和32mU/ml之末端型岩藻依聚糖分解酵素溶 液40毫升混合,並令於251下反應48小時。 反應液經Cellulof ine GCL- 3 0 0 (生化學工業公司製)之 柱予以分子量分級、並收集分子量2000以下之溶離份。此 溶離份以 MICR0ACILIZERG3 脫鹽後,以 DEAE-SepharoseFF 分離出3個溶離份,並再度脫鹽後,冷凍乾燥。如此處理 取得各25 0毫克、310毫克、52毫克之上述各式(1)、(11)、 (III)之寡糖。 實施例1 4
將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物1 0克溶解 於0 · 2M之檸檬酸500毫升中,將pH調整至2 · 9後,於1〇〇 °C下處理3小時。於此水解物中加入1 5 0毫升1Μ之醋酸 鈣溶液,所產生之沈澱以離心分離除去後以Cel lu lo fine GCL-25進行凝膠過濾予以分子量分級(分子量5000以上、 5000 〜超 3000、3000 〜超 2000、2000 〜超!〇〇〇、1 000 〜超 500、500以下),由分子量大者之順序,命爲GFd-01i-l、 GFd-01i-2、 GFd-01i-3、 GFd-01i-4、 GFd-〇li-5、及。?0- 〇1 i - 6。將此6部份脫鹽後冷凍乾燥,可分別取得2 . 3克、 1.7克、0·88克、1·8克、1.4克、及0.72克之乾燥品。 實施例1 5 99 1237026 秤量實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物60克, 並於20公升之人工海水中溶解後加入蛋白腺200克與酵母 萃取物4克,並置入30公升之發酵缸中並滅菌後,將前 述之產黃菌屬sp. SA- 0082株(CCRC 9 1 00 6 9 )植菌並於25°C 培養2 4小時。將培養液離心分離除去菌體後,以具備排除 分子量1 0萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾, 將低分子性物質完全除去後,以離心分離及過濾除去不 溶性物質,並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醣_F 之重重爲36克。 實施例1 6 將真海參5公斤解體,除去內臟,並收集體壁。體壁濕 重量每200克加入500毫升之丙酮,以均質器處理後過濾, 且殘渣以丙酮洗淨至再無著色物質爲止。將此殘渣抽氣乾 燥可得1 40克之乾燥物。於此乾燥物中加入0.4M之食鹽水 2 . 8公升,於10 0°C下處理1小時後、過濾、並將殘渣以〇 . 4M 食鹽水充分洗淨,取得萃取液3 . 7公升。 於此萃取液中將5 %氯化鯨蠟基吡啶以不會令其再產生 沈澱爲止地添加,且生成之沈澱以離心分離收集。此沈澱 於0 . 4M之食鹽水中懸浮後再度離心分離,並於所得沈澱中 加入1公升之4M食鹽水,以均質器處理後,一邊攪拌一邊 添加4公升之乙醇,並攪拌1小時後,過濾,取得沈澱。
對此沈澱,將80%乙醇懸浮後過濾之工程重覆至上淸液之 260ηπι吸光度成爲〇爲止。將所得之沈澱懸浮於2公升之2M 1237026 食鹽水中,且不溶物以離心分離予以除去。上淸液以具備 排除分子量3萬膜之超濾裝置予以超過濾,並完全脫鹽後, 冷凍乾燥可得3 . 7克之含岩藻糖硫酸多醣。 實施例1 7 將檜葉尖(F u c u s V e s i c u 1 〇 s u s )充分乾燥後,乾燥物2公 斤以自由粉碎機(奈良機械製作所製)弄碎,將所得之乾燥 粉末懸浮於9公升之8 0 %乙醇中,並於8 0 °C處理2小時。 處理後以濾紙過濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過 濾重覆3次操作可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於4 0公升 水後,於100 °C處理2小時,並過濾。濾液中加入0.5M氯 化鈉,再將5 %氯化鯨蠟基吡啶以不會令其再產生沈澱爲止 地添加並以離心分離收集沈澱。此沈澱於3公升之0 . 4M食 鹽水中懸浮後離心分離,並洗淨。
此洗淨操作重覆3次後於沈殿中加入2 5 0克之氯化鈉, 並於3公升之乙醇中懸浮,以離心分離取得沈澱。此沈澱 懸浮於80 %乙醇中並重覆離心分離之操作至上淸液中之 260nm吸光度成爲0爲止。此沈激溶解於2M食鹽水3公升 中,且不溶物以離心分離除去後,添加2M食鹽水平衡化之 100毫升DEAE-Cel lulofine A-800(生化學工業公司製), 攪拌後,加入之樹脂以過濾除去。將濾液置入2M食鹽水平 衡化之DEAE-Cellulofine A- 800柱中,非吸附部分以具備 排除分子量1 0萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾,並將 著色性物質及氯化鈉完全除去後,以離心分離及過濾將不 101 1237026 溶性物質除去,並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多 醣之重量爲92克。 實施例1 8
將裙帶菜(Undaria pinnatifida)充分乾燥後,其2公斤 以自由粉碎機(奈良機械製作所製)弄碎,將所得之乾燥粉 末懸浮於9公升之乙醇中,並於7 5 °C處理2小時。處理後 以濾紙過濾取得殘渣。對此殘渣添加9公升之80%乙醇, 攪拌,並於80 °C、1小時處理後,以濾紙過濾,取得殘渣。 對此殘渣,以上述之80%乙醇洗淨、過濾之操作重覆3次, 可得乙醇洗淨殘渣1 908克。將此殘渣中之684克於9公升 之0 . 2M醋酸鈣中懸浮後,於95°C、處理1小時,靜置24 小時後取得其上淸液。於除去上淸液之沈澱中添加9公升 之0 · 2M醋酸鈣並攪拌,靜置1小時後取得上淸液,與上述 之上淸液合倂。經處處理所得之上淸液以濾紙過濾後,以 具備排除分子量1 0,000空心絲之超濾裝置予以超過濾,並 濃縮至3 5 0毫升。濃縮液以離心分離,除去沈澱後,一邊 添加2mM之氯化鈉一邊予以超過濾,將醋酸鈣完全除去後, 冷凍乾燥,可得冷凍乾燥物3 . 2克。冷凍乾燥物中之含岩 藻糖硫酸多醣重量爲3.1克。 實施例1 9 (1 )高果美海帶含岩藻糖硫酸多醣混合物之調製 將乾燥高果美海帶2公斤以自由粉碎機Μ - 2型(奈良機械 製作所製)弄碎,並於4 . 5倍量之8 0 %乙醇中8 0 °C,2小時 102 1237026 處理後’過濾。殘渣以上述8 0 %乙醇萃取、過濾之工程再 重覆3次,取得乙醇取代洗淨殘渣1 8 7 〇克。於殘渣中加 入36公升水’於l〇〇°c處理2小時,並過濾可得萃取液。 萃取液之鹽濃度使與40OmM氯化鈉溶液相同後,將5%氯化 鯨蠟基吡啶以不會令其再產生沈激爲止地添加,並離心分 離。此沈澱,以80%乙醇重覆洗淨,將氯化鯨蠟基吡啶完 全除去後,溶解於3公升之2 Μ氯化鈉中,將不溶物以離 心分離除去,並懸浮於以2Μ氯化鈉平衡化之1 〇〇毫升 DEAE-Cel lulof ine Α- 800,攪拌後過濾,並除去樹脂。將 此濾液置入以2M氯化鈉平衡化之1 00毫升DEAE-Cellulofine A- 800柱中,通過之溶離份以超濾器(過濾膜 之排除分子量1 0萬)進行脫鹽及低分子除去,此時所產生 之沈澱以離心分離予以除去。將此上淸液冷凍乾燥可得精 製高果美海帶含岩藻糖硫酸多醣混合物82 . 2克。 (2)含岩藻糖硫酸多醣-F之調製 將上述來自高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醣混合物6克 於6 00毫升含有0 . 2M氯化鈣之20mM醋酸鈉(pH6 · 0 )中溶解 後,置入事先以含有0 · 2M氯化鈣之20mM醋酸鈉(pH6 . 0 )平 衡化之3 000毫升DEAE-Sepharose FF柱中,以含有0.2M 氯化鈉之20mM醋酸鈉(pH6 . 0 )充分將柱洗淨後,以0〜2M 之氯化鈉梯度令其溶出。收集氯化鈉濃度爲〇 · 7 5M以上所 溶出之含岩藻糖硫酸多醣-F溶離份,並以裝有排除分子量 1 0萬超濾膜之超濾器濃縮脫鹽後冷凍乾燥,可得含岩藻糖 1237026 硫酸多醣-F之冷凍乾燥樣品3 . 3克。 (3)末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之調製 將產黃菌屬sp . SN- 1 009 (CCRC 9 1 0070 ),於將含有葡萄 糖0 · 25%、蛋白腺1 · 〇%、酵母萃取物〇 · 05%之人工海水 (Germalin Laboratory公司製)pH8.2所組成之培養基600 毫升分注並殺菌(120 °C、20分鐘)之2公升三角燒瓶中接 種,並於25 °C下培養25小時作成種培養液。將含有蛋白腺 200克、酵母萃取物4克、及消泡劑(信越化學工業公司製 0 7 0)4毫升之人工海水pH8 · 0所組成之培養基18公升置 入30公升容量之醱酵缸中並於120 °C下殺菌20分鐘。冷卻 後,將另外於120°C、15分鐘殺菌之2公升人工海水中溶 解之20克使用實施例8方法調製之來自高果美海帶之含 岩藻糖硫酸多醣-F及上述之種培養液600毫升接種,並於 24°C下20小時,每分鐘10公升通氣量與每分鐘250轉之 攪拌速度之條件下培養。培養終了後,將培養液離心分離 可得菌體及培養上淸液。 培養上淸液中之本發明含岩藻糖硫酸多醣分解酵素活性 於使用含岩藻糖硫酸多醣-F作爲受質測定時,爲5mU / m 1培 養液。 所得之培養上淸液以分級分子量1萬之超濾器濃縮後, 所產生之沈澱以離心分離予以除去,以8 5 %飽和硫酸銨鹽 析,且產生之沈澱以離心分離予以收集,對含有1 / 1 0濃 縮人工海水(Germalin 5)之20mM Tris-鹽酸緩衝液(ρΗ8·2) 104 1237026 充分透析,可得400毫升之粗製酵素。 令所得之粗製酵素液吸附至事先以含5ιώΜ疊氮化鈉及1 /10濃度人工海水(Germalin S)之20mM Tris-鹽酸緩衝液 (PH8.2)平衡化之DEAE-Cellulofine A- 800 (生化學工業公 司製)柱,並將吸附物以相同緩衝液充分洗淨後,以相同緩 衝液中含有 l〇〇mM、2 00mM、3 00mM、400mM、及 600mM 氯化 鈉之溶液予以溶出,並收集活性溶離份。
所得之部分精製酵素之活性於使用含岩藻糖硫酸多醣-F 作爲受質測定時,爲1 0200mU( 10 . 2U)。尙,確認無其他含 岩藻糖硫酸多醣分解酵素之混入。 所得之部分精製酵素之一部分經由事先以含有1 / 1 0濃度 之人工海水(Germalin S)及5mM疊氮化鈉之10mM Tris -鹽 酸緩衝液(PH8.0)平衡化之Sephacryl S- 200進行凝膠過 濾,算出其分子量爲約1 0萬。
(4 )以上述實施例所得之部分精製酵素及pA - FF分別作爲酵 素源及受質,進行影響本酵素活性之鈣濃度之檢討。 酵素反應中所用之緩衝液爲使用含有5 OmM醋酸、咪唑、 及Tr i s-鹽酸之PH7緩衝液。又,反應液中爲令以溶存有終 濃度400mM之氯化鈉。 令反應液中之氯化鈣濃度變化以〇〜l〇〇mM爲止,並測定 酵素活性,取得如第23圖所示之結果。尙,於第23圖中, 縱軸表不相對活性(% ),橫軸表示反應液中之鈣濃度()。 此結果’可判定本酵素於鈣鹽存在下活性顯著提高。 105 1237026 (5)本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素一邊以下 述6種緩衝液透析並一邊於5°C下保持20小時後,測定其 殘存活性。 1 · 2 0 m Μ T r i s -鹽酸緩衝液(p Η 8 . 2 ) 2.含5mM疊氮化鈉之20mM Tris-鹽酸緩衝液(ρΗ8·2) 3 ·含5 m Μ疊氮化鈉及5 0 m Μ氯化鈉之2 0 m Μ T r i s -鹽酸緩衝 液(ρ Η 8 · 2 )
4. 含5mM疊氮化鈉及500mM氯化鈉之20mM Tris -鹽酸緩 衝液(ρΗ8·2) 5. 含5mM疊氮化鈉、50mM氯化鈉及10mM氯化錦之20mM T r i s -鹽酸緩衝液(ρ Η 8 · 2 ) 6. 含5mM疊氮化鈉及1/10濃度人工海水(Germalin S)之 20mM Tris-鹽酸緩衝液(ρΗ8·2)
以上之結果,以1、2及3緩衝液透析之本發明之含岩 藻糖硫酸多醣分解酵素失活性,而以4、5及6緩衝液透 析之本發明之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素保持活性。 由此可判定本酵素在500mM氯化鈉存在下或l〇mM鈣離子 存在下被安定化。 (6 )秤量上述實施例所調製之含岩藻糖硫酸多醣· F 5克’ 並混合471毫升之50mM咪唑緩衝液(pH8)、12 · 5毫升之4M 氯化鈉、6 . 2 5毫升之4M氯化鈣、及實施例1 9 - ( 3 )所得之 本發明含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之部分精製品1 〇毫升(才目 當6mU),且令於25t下反應120分鐘取得含岩藻糖硫酸多 106 1237026 醣-F之低分子化物。 所得之低分子化物的I R及NMR的分析結果分別示於第2 5 圖及第26圖。又,以Cellulofine GCL-300凝膠過濾時, 於第24圖中示出所得之結果。即,本物質爲以分子量1000 〜30000分布。 又,本物質之硫酸含量以S04(分子量46)爲46%。中性 糖組成爲岩藻糖:半乳糖=100: 4。 尙,第24圖〜第26圖中之縱軸及橫軸分別與第2圖〜 第4圖同義。 _ 實施例2 0
於含10%之56°C下處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH BIOSCIENCE公司)之PRMI 1 640培養基(GIBC0公司製)中37 艺下培養之前骨髓性白血病細胞HL-60 (ATCC CRL- 1 964 )於 ASF 104培養基(味之素公司製)中以5X105個/ 9毫升懸 浮。此懸浮液準備9毫升4份,並分別對此懸浮液,添加1 毫升實施例1、1 2、及1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣生理食 鹽水溶液(5毫克/毫升)之過濾處理液〔以孔徑〇 . 2 0 // m之 纖維素醋酸酯膜(KON I C公司製)過濾者(以下過濾處理爲以 此條件下進行)〕,並於371、5%二氧化碳存在下培養40 小時。培養之細胞經離心分離而與上淸液分離。所得之細 胞於含有1 OmM乙二胺四醋酸鹽及0 · 5 %月桂醯其肌胺酸鈉 之5 0mM Tr 1 s-鹽酸緩衝液(pH7 · 8 )20 # 1中懸浮,並添加1 // 1之10毫克/毫升核糖核酸酶A(SIGMA公司製)於50°C、 107 1237026
30分鐘處理後,添加1//1之10毫克/毫升蛋白酶K並於 5 (TC、處理1小時。將處理後之細胞作爲樣品,使用2 %瓊 脂糖凝膠於100V定電壓下進行電泳。此凝膠於溴化乙錠溶 液中浸漬3 0分鐘後,使用超照明裝置確認凝膠中之DN Α狀 態時,細胞自滅特有的DNA梯段爲被確認。更且爲了確認, 使用已知作爲誘發細胞自滅試藥之放射菌素D之1 0微克 /毫升溶液代替上述之含岩藻糖硫酸多醣進行同樣操作 時,於培養20小時下,可確認與含岩藻糖硫酸多醣情形相 同之DNA梯段。 因此結果,可得知HL-60細胞爲經實施例1、12、及15 所得之含岩藻糖硫酸多醣而誘發細胞自滅。
使用HL-60( ATCC CCL- 2 40 ),實施例1、12及15所得之 各含岩藻糖硫酸多醣溶液〔以5毫克/毫升溶解於含有 120mM氯化鈉之30mMHEPES緩衝液(pH7.2)中,並於121°C、 壓熱滅菌20分鐘處理者〕之細胞自滅誘發作用依上述爲準 測定,取得同樣之結果。 實施例2 1 於含10%之56°C下處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH BIOSCIENCE公司)之PRMI 1 640培養基(GIBCO公司製)中37 °C下培養之前骨髓性白血病細胞HL-60 (ATCC CCL- 240 )於 ASF 104培養基(味之素公司製)中以5 X 105個/ 9毫升懸 浮。對此懸浮液9毫升,添加1毫升實施例1 5所得之含岩 藻糖硫酸多醣生理食鹽水溶液(5毫克/毫升)之過濾處理 108 I237〇26 添加1毫升實施例1、2、1 2 '及1 6所得之含岩藻糖硫酸 多醣生理食鹽水溶液(5毫克/毫升)之過濾處理液,並於37 °C、5 %二氧化碳存在下培養6 〇小時。培養之細胞經離心 分離而與上淸液分離。所得之細胞懸浮於含有1 〇mM乙二胺 四醋酸鹽及0 · 5%月桂醯基肌胺酸鈉之50mM Tr i s ·鹽酸緩 衝液(pH7 · 8)20 // 1中,並添加1 // 1之l〇毫克/毫升之核 糖核酸18. A ( S I G Μ A公司製),於5 0 °C處理3 0分鐘後,添加 1 # 1之1 0毫克/毫升之蛋白酶K,於5 (TC處理1小時。將 處理後之細胞作爲樣品,使用2%瓊脂糖凝膠於100V定電 壓下進行電泳。此凝膠於溴化乙錠溶液中浸漬3 0分鐘後, 使用超照明裝置確認凝膠中之DNA狀態時,細胞自滅特有 的DNA梯段爲被確認。更且爲了確認,使用已知作爲誘發 細胞自滅試藥之放射菌素D之1〇毫克/毫升溶液代替上述 之含岩藻糖硫酸多醣進行同樣操作時,於培養20小時下, 可確認與含岩藻糖硫酸多醣情形相同之DNA梯段。 由此結果可判定實施例1、2、1 2、及1 6所得之含岩藻 糖硫酸多醣對MOLT-3細胞誘發細胞自滅。 實施例1、2、1 2及1 6所得之含岩藻糖硫酸多醣溶液〔以 5毫克/毫升溶解於PBS(將8克氯化鈉、0.2克氯化鉀、 2.9克磷酸氫二鈉12水合物、及〇·2克鱗酸二氫鉀溶解於 1公升水中),並於121 °C。壓熱滅菌處理2()分鐘者〕之 細胞自滅誘發作用依上述爲準測定’取得同樣之結果。 實施例24 111 1237026 施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣、葡聚糖硫酸爲顯示出與 實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣之情形爲實質上相同曲 線。
又,此時之死細胞顯示出細胞縮小及片斷化等細胞自滅 所特有之型態。即’由此些結果’可判定MOLT - 3細胞經由 實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣、實施例1 2所得之含 岩藻糖硫酸多醣-F、實施例1 5及1 7所得之含岩藻糖硫酸 多醣,及葡聚糖硫酸而誘發細胞自滅且細胞增殖被顯著抑 制。 實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣、實施例1 2所得之 含岩藻糖多醣-F、實施例15及17所得之含岩藻糖硫酸多 醣、及葡聚糖硫酸(分子量50萬’和光純藥公司製)之各溶 液(以0 . 5毫克/毫升溶解於PBS後’於1 2 1 °C、壓熱滅菌 處理2 0分鐘者)之細胞自滅誘發作用依上述爲準測定,取 得同樣之結果。 實施例2 5 於含10%之56 °C下處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH BIOSCIENCE公司)之PRMI 1640培養基(GIBC0公司製)中37 °(:下培養之前骨髓性白血病細胞HL-60 (ATCC CCL- 240 )於 ASF 104培養基(味之素公司製)中以5x104個/ 9毫升懸 浮。此懸浮液準備9毫升4份’並對各懸浮液’添加10 0 # 1生理食鹽水、及實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣 品、F-Fd-Ι〜F-Fd-4、及實施例13所得之3種含岩藻糖 113 1237026 硫酸寡糖之各生理食鹽水溶液(10毫克/毫升)之過濾處理 液,並於37 °C、5%二氧化碳存在下培養40分鐘。培養之 細胞以顯微鏡觀察,調查增殖程度及細胞型態。 其結果,添加含岩藻糖硫酸多醣樣品、F-Fd-Ι〜F-Fd-4 及3種含岩藻糖硫酸寡糖之HL - 6 0細胞全部呈現出細胞縮 小及細胞片斷化等之細胞自滅特徵。又,添加生理食鹽水 之HL - 6 0細胞其細胞數爲增加約4倍,但添加含岩藻糖硫 酸多醣樣品、F-Fd-Ι〜F-Fd-4及3種含岩藻糖硫酸寡糖之 HL-60細胞其細胞數完全無增加至爲1 / 10以下爲止,可判 定經由此些含岩藻糖硫酸多醣樣品、F-Fd - 1〜F-Fd-4及3種 含岩藻糖硫酸寡糖之細胞自滅誘發作用抑制HL-60細胞之 增殖。 更且爲了確認,使用已知作爲誘發細胞自滅試藥之放射 菌素D之10微克/毫升溶液代替上述之含岩藻糖硫酸寡糖 進行同樣操作時,於培養20小時下,可看見如含岩藻糖硫 酸寡糖之情形相同的細胞縮小及細胞片斷化。由此結果可 得知H L - 6 0細胞經實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣 品、F-Fd-Ι〜F-Fd-4及實施例13所得之含岩藻糖硫酸寡糖 而誘發細胞自滅。 實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品、F-Fd-1〜F-Fd-4 及實施例1 3所得之3種含岩藻糖硫酸寡糖之各溶液〔以1 〇 毫克/毫升溶解於含有120mM氯化鈉之30mM HEPES緩衝液 (pH7),於121 °C、壓熱滅菌處理20分鐘者〕之細胞自滅誘 114 1237026 發作用依上述爲準測定,取得同樣之結果。 實施例2 6
將肺癌細胞A - 549 ( ATCC CCL- 1 85 )、SV40轉形之肺細胞 WI-38VA13(ATCC CCL-75.1)、及肝癌細胞 Hep G2(ATCC HB-8065)以各104個/毫升,懸浮至含i〇%56°C、處理30分 鐘之牛胎兒血淸(JRH BIOSCIENCE)之PRMI 1 640培養基中。 將此懸浮液分注1 . 8毫升,並對各懸浮液,各癌細胞中添 加200 /z 1之生理食鹽水、及實施例1及15所得之含岩藻 糖硫酸多醣,及實施例1 4所得之6種含岩藻糖硫酸寡糖 之各生理食鹽水溶液(1毫克/毫升)之過濾處理液,並於 3 7 °C,5 %二氧化碳存在下培養6天。培養之細胞以顯微 鏡觀察,調查增殖程度及細胞型態。
其結果添加實施例1及1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣,及 實施例14所得之6種含岩藻糖硫酸寡糖中分子量200 0以 上之3溶離份的肝癌細胞A - 549、SV 40轉形之肺細胞WI -3 8VA13,及肝癌細胞Hep G2全部呈現細胞縮小及細胞片斷 化等之細胞自滅特徵。又,添加生理食鹽水之各癌細胞其 細胞數顯著增加,但添加實施例1及1 5所得之含岩藻糖硫 酸多醣、及實施例1 4所得之6種含岩藻糖硫酸寡糖中分子 量2 000以上3分劃之各種癌細胞細胞數減少,可判定經由 此些含岩藻糖硫酸多醣及寡糖之細胞自滅誘發作用可抑制 各種癌細胞之增殖。 實施例1及1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣,及實施例1 4 115 1237026 所得之6種含岩藻糖硫酸寡糖之各PBS溶液(1毫克/毫 升)之121 °C、20分鐘壓熱滅菌處理物之細胞自滅誘發作用 依上述爲準測定,取得同樣之結果。 實施例2 7 將結腸癌細胞HCT 1 16( ATCC CCL- 247 )、及胃癌細胞 AGS(ATCC CRL- 1 7 3 9 )各以1〇4個/1.8毫升,分別懸浮於含 10%56°C、處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH BIOSCIENCE)之 McCoy's 5a 培養基(GIBCO 公司製)、HanTsF12 培養基(GIBCO 公司製)。將此懸浮液分注1 . 8毫升,並對各懸浮液,各癌 細胞中添加200 // 1之生理食鹽水、及實施例1 、1 2、及1 5 所得之含岩藻糖硫酸多醣及F-Fd - 1〜F-Fd-4之4種含岩 藻糖硫酸寡糖之各生理食鹽水溶液(10毫克/毫升)之過濾 處理液,並於37°C,5%二氧化碳存在下培養48小時。培 養之細胞以顯微鏡觀察,調查增殖程度及細胞型態。其結 果添加實施例1、12及15所得之含岩藻糖硫酸多醣及F-Fd-1 〜F-Fd-4之4種含岩藻糖硫酸寡糖之結腸癌細胞HCT 1 16 及胃癌細胞AGS全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞 自滅特徵。又,添加生理食鹽水之各種癌細胞其細胞數顯 著增加,但添加實施例1、1 2及1 5所得之含岩藻糖硫酸多 醣及F-Fd-Ι〜F-Fd-4之4種含岩藻糖硫酸寡糖之各種癌 細胞細胞數減少,可判定經由此些含岩藻糖硫酸多醣及寡 糖之細胞自滅誘發作用可控制各種癌細胞之增殖。 實施例1、12、及15所得之各含岩藻糖硫酸多醣及F-Fd-1 116 1237026 〜F-Fd-4之4種含岩藻糖硫酸寡糖之各PBS溶液(10毫克 /毫升)之1 2 1 °C、20分鐘壓熱滅菌處理物之細胞自滅誘發 作用依上述爲準,取得同樣之結果。 實施例2 8
於含10% 56°C、處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH BIOSCIENCE公司)之McCoy’s 5a培養基(GIBCO公司製)中37 °C下培養之人類結腸癌細胞HCT 1 16,於McCoy ’ s 5a培養 基中以5 X 103個/毫升懸浮,並在FALCON公司製之24孔 口平板上之各孔口分注1 · 8毫升。對各懸浮液,添加〇 . 2 毫升溶解於PBS之1 0毫克/毫升實施例1所得之含岩藻 糖硫酸多醣樣品、含岩藻糖硫酸多醣混合物、實施例1 2所 得之含岩藻糖硫酸多醣-F、含岩藻糖硫酸多醣-u、F-Fd-1、 F-Fd-2、F-Fd-3、及F-Fd-4、實施例15所得之含岩藻糖硫 酸多醣之各溶液、及溶解於PBS之5毫克/毫升肝素(和光 純藥公司製)及葡聚糖硫酸(分子量50萬、和光純藥公司製) 於1 2 1 °C、2 0分鐘壓熱滅菌處理物,並於3 7 t:、5 %二氧化 碳存在下培養。尙,僅將PBS同量添加者作爲對照組,並 同樣地培養。培養開始1日、2日、3日、4日後之生細胞 數依「組織培養之技術」(第2版)(朝倉出版、日本組織 培養學會編、1 9 9 0年))記載之方法(第2 6〜2 8頁)計測。即, 以血球計算板上之台盼藍染色之方法計測。 所得之結果示於第29圖。即第29圖表示於HCT 1 1 6細 胞培養液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品、實 117 1237026 施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物、實施例1 2所得 之含岩藻糖硫酸多醣-U及含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd - 1、 F-Fd-2、F-Fd-3、及F-Fd-4、實施例15所得之含岩藻糖硫 酸多醣以1毫克/毫升,及將肝素及葡聚糖硫酸以0 · 5毫 克/毫升添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係 圖,橫軸表示培養時間(日)、縱軸表示培養液中之生細胞 數(XI 04個/ 2毫升),第29圖中,於培養基中添加之含 岩藻糖硫酸多醣或寡糖之種類爲,〇標記爲無添加(對照)、 •標記爲實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品' 標記 爲實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物。實施例1 2 所得之含岩藻糖硫酸多醣-U及含岩藻糖硫酸多醣-F'F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3、及F-Fd-4、及實施例15所得之含岩 藻糖硫酸多醣爲與實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合 物之情形爲實質上相同曲線。 其結果添加PBS之HCT 1 16細胞其細胞數爲顯著增加’ 但添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品、含岩藻糖 硫酸多醣混合物、實施例1 2所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、 含岩藻糖硫酸多醣-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3、及 F-Fd-4、實施例15所得之含岩藻糖硫酸多醣’肝素 '及葡聚糖 硫酸之HCT 1 1 6細胞其細胞數幾乎無增加’或者減少° 又,添加實施例1所得之含岩藻糠硫酸多釀樣品、含岩 藻糖硫酸多醣混合物、實施例1 2所得之含岩藻糖硫酸多醣 -F、含岩藻糖硫酸多醣-U、F-Fd-1、F-Fd·2、F-Fd_3、及 118 1237026 F - Fd - 4、實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣、肝素、及蔔 聚糖硫酸之HCT 1 1 6細胞全部呈現細胞縮小及細胞片斷化 等之細胞自滅特徵。 即’可判定經由此些含岩藻糖硫酸多醣及寡糖、肝素, 及葡聚糖硫酸之細胞自滅誘發作用可抑制HCT 1 1 6細胞之 增殖。 於PBS中溶解1 〇毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖 硫酸多醣樣品、含岩藻糖硫酸多醣混合物、實施例1 2所得 之含岩藻糖硫酸多醣-F、含岩藻糖硫酸多醣-U、F-Fd-1、 F-Fd-2、F-Fd-3、及F-Fd-4、實施例15所得之含岩藻糖硫 酸多醣之各溶液之過濾處理液,及於PBS中溶解5毫克/ 毫升之肝素、及葡聚糖硫酸之各過濾處理液之細胞自滅誘 發作用依上述爲準測定,取得同樣之結果。 實施例2 9 於含10% 56t、處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH 6103(:^化£公司)之^0(^’8 5&培養基(013(:0公司製)中37 °C下培養之人類結腸癌細胞HCT 1 16,於McCoy ’ s 5a培養 基中以5 X 1〇3個/毫升懸浮,並在FALCON公司製之24孔 口平板上之各孔口分注1 · 8毫升。對各懸浮液,添加0 · 2 毫升溶解於PBS之20毫克/毫升、30毫克/毫升、及50 毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液 於1 2 1 °C、2 0分鐘壓熱滅菌處理物,並於3 7 °C,5 %二氧化 碳存在下培養。尙’僅將PBS同量添加者作爲對照組,並 1237026 同樣地培養。培養開始後經時性之生細胞數依「組織培養 之技術」(第2版)(朝倉出版、日本組織培養學會編、199 0 年)記載之方法(第26〜28頁)計測。即,以血球計算板上 之台盼藍染色之方法計測。
其結果示於第30圖。即第30圖表示於HCT 116細胞培 養液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃 度添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係圖,橫 軸表示培養時間(時間)、縱軸表示培養液中之生細胞數(X 1〇4個/毫升)。第30圖中,於培養基中之含岩藻糖硫酸多 醣樣品之添加量爲,〇標記爲無添加(對照)、·標記爲2毫 克/毫升、標記爲3毫克/毫升、黑三角標記爲5毫 克/毫升。 其結果添加PBS之HCT 1 1 6細胞其細胞數爲顯著增加, 但添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品之HCT 1 1 6 細胞其細胞數減少。
又,添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品之HCT 1 1 6 細胞全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特徵。 即,可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品至少於 2毫克/毫升之濃度下對HCT 11 6細胞具有細胞自滅誘發 作用,並可抑制細胞增殖。 於PBS中溶解20毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫克 /毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液之過 濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述爲準測定,取得同樣 120 1237026 之結果。 實施例3 0 於含10% 56t、處理30分鐘之牛胎兒血淸(jRH BIOSCIENCE公司)之HanTs F12培養基(GIBCO公司製)中37 t:下培養之人類胃癌細胞AGS ,於Ham’s F12培養基中以 5 X 103個/毫升懸浮,並在FALCON公司製之24孔口平板 上之各孔口分注1 . 8毫升。對各懸浮液,添加〇 . 2毫升溶 解於PBS之20毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫克/ 毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液於1 2 1 °C、2 0分鐘壓熱滅菌處理物,並於3 7 °C、5 %二氧化碳存 在下培養。尙,僅將PBS同量添加者作爲對照組,並同樣 地培養。培養開始後經時性之生細胞數依「組織培養之技 術」(第2版)(朝倉出版、日本組織培養學會編、1 990年) 記載之方法(第26〜28頁)計測。即,以血球計算板上之台 盼藍染色之方法計測。 其結果示於第3 1圖。即第3 1圖表示於AGS細胞培養液 中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃度添 加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係圖,橫軸表 示培養時間(時間)、縱軸表示培養液中之生細胞數(X 1 〇4 個/ 2毫升)。第31圖中,於培養基中之含岩藻糖硫酸多醣 樣品之添加量爲,〇標記爲無添加(對照)、φ標記爲2毫 克/毫升、_標記爲3毫克/毫升、黑三角標記爲5毫 克/毫升。 121 1237026 其結果添加PBS之AGS細胞其細胞數爲顯著增加,但將 實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以終濃度3毫克 /毫升以上添加之AGS細胞其細胞數減少,且添加2毫克 /毫升者亦顯著抑制細胞增殖。 又,添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品之AGS 細胞全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特徵。 即,可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品至少 於2毫克/毫升之濃度下對AGS細胞具有細胞自滅誘發 作用,並可抑制細胞增殖。 Φ 於PBS中溶解20毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫 克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液之 過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述爲準測定,取得同 ~ 樣之結果。 ~ 實施例3 1
於含10%56°C、處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH BIOSCIENCE公司)之L-15培養基(GIBCO公司製)中37°(:下 培養之人類結腸癌細胞SW 480( ATCC CCL- 228 ),於L - 15培 養基中以5 X 103個/毫升懸浮,並在FALCON公司製之24 孔口平板上之各孔口分注1 . 8毫升。對各懸浮液,添加0 . 2 毫升溶解於PBS之10毫克/毫升、30毫克/毫升、及50 毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液 於1 21 °C、20分鐘壓熱滅菌處理物,並於37°C,5%二氧化 碳存在下培養。尙,僅將PBS同量添加者作爲對照組,並 122 1237026 同樣地培養。培養開始後經時性之生細胞數依「組織培養 之技術」(第2版)(朝倉出版、日本組織培養學會編、1990 年)記載之方法(第26〜28頁)計測。即,以血球計算板上 之台盼藍染色之方法計測。 其結果示於第32圖。即第32圖表示於SW 480細胞培養 液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃度 添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係圖,橫軸 表示培養時間(時間)、縱軸表示培養液中之生細胞數(X 1 〇4 個/毫升)。第32圖中,於培養基中之含岩藻糖硫酸多醣 樣品之添加量爲,〇標記爲無添加(對照)、春標記爲1毫 克/毫升、標記爲3毫克/毫升、黑三角標記爲5毫 克/毫升。 其結果添加PBS之SW 480細胞其細胞數爲顯著增加,但 將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以終濃度3毫克 /毫升以上添加之SW 480細胞其細胞數減少,且添加1毫 克/毫升者亦顯著抑制細胞增殖。 又,添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品之SW 480 細胞全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特徵。 即,可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品至少 於1毫克/毫升之濃度下對SW 480細胞具有細胞自滅誘 發作用,並可抑制細胞增殖。 於PBS中溶解1〇毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫 克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液之 123 1237026 過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述爲準測定,取得同 樣之結果。 實施例3 2 於含1 0 % 5 6 °C、處理3 0分鐘之牛胎兒血淸(j rh BI0SCIENCE公司)及NEAA(大日本製藥公司製)之DEME培養 基(大日本製藥公司製)中37 °C下培養之人類結腸癌細胞 WiDr ( ATCC CCL-218),於上述培養基中以5 X 103個/毫升 懸浮,並在FALCON公司製之24孔口平板上之各孔口分注1.8 毫升。對各懸浮液,添加0 . 2毫升溶解於PBS之1 0毫克/ 毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物、實施例 12所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-3及F-Fd-4、及實施 例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣之各溶液於1 2 1 °C、2 0分鐘 壓熱滅菌處理物,並於37°C,5%二氧化碳存在下培養。尙, 僅將PBS同量添加者作爲對照組,並同樣地培養。培養開 始後經時性之生細胞數依「組織培養之技術」(第2版)(朝 倉出版、日本組織培養學會編、1 990年)記載之方法(第26 〜28頁)計測。即,以血球計算板上之台盼藍染色之方法計 測。 所得之結果示於第3 3圖。即第3 3圖爲表示於W i D r細胞 培養液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物、實 施例12所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-3及F-Fd-4及 實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣以1毫克/毫升添加 時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係圖,橫軸表示 124 1237026 培養時間(時間)、縱軸表示培養液中之生細胞數(x 1 ο4個 /2毫升)。第33圖中,於培養基中之含岩藻糖硫酸多醣之 種類爲,◦標記爲無添加(對照)、_標記爲實施例1 2所得 之含岩藻糖硫酸多醣-F、·標記爲實施例1 5所得之含岩藻 糖硫酸多醣。F-Fd-3及F-Fd-4爲與實施例15所得之含岩 藻糖硫酸多醣之情形爲實質上相同曲線。 其結果添加PBS之HCT 1 1 6細胞其細胞數爲顯著增加, 但添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物,實施例 12所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-3及F-Fd-4、及實施 例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣之W i D r細胞其細胞數爲減 少〇 又,添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物、實 施例12所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-3及F-Fd-4、 及實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣之W i D r細胞全部呈 現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特徵。 即,可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物、 實施例12所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-3及F-Fd-4、 實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣對W i D r細胞具有細胞 自滅誘發作用,並可抑制細胞增殖。 於PBS中溶解10毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻 糖硫酸多醣混合物、實施例1 2所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、 F-Fd-3及F-Fd-4、及實施例15所得之含岩藻糖硫酸多醣 溶液之過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述爲準測定’ 125 1237026 取得同樣之結果。 實施例3 3
於含10% 56°C、處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH
BIOSCIENCE公司)之NEAA (大日本製藥公司製)之DMEM培養 基(大日本製藥公司製)中3 7 °C下培養之人類結腸癌細胞 WiDrUTCC CCL-218),於上述培養基中以5X103個/毫升 懸浮,並在FALCON公司製之24孔口平板上之各孔口分注1 . 8 毫升。對各懸浮液,添加0 . 2毫升溶解於PBS之1 0毫克/ 毫升、30毫克/毫升、及50毫克/毫升之實施例1所得 之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液於1 2 1 °C、2 0分鐘壓熱滅菌 處理物,並於37°C,5%二氧化碳存在下培養。尙,僅將PBS 同量添加者作爲對照組,並同樣地培養。培養開始後經時 性之生細胞數依「組織培養之技術」(第2版)(朝倉出版、 日本組織培養學會編、1990年)記載之方法(第26〜28頁) 計測。即,以血球計算板上之台盼藍染色之方法計測。
其結果示於第3 4圖。即第3 4圖表示於W i D r細胞培養 液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃度 添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係圖,橫軸 表示培養時間(時間)、縱軸表示培養液中之生細胞數(X 1 〇4 個/ 2毫升)。第34圖中,於培養基中之含岩藻糖硫酸多醣 樣品之添加量爲,〇標記爲無添加(對照)、#標記爲1毫 克/毫升、標記爲3毫克/毫升、黑三角標記爲5毫克 /毫升。 126 1237026 其結果添加PBS之HCT 1 1 6細胞其細胞數爲顯著增加, 但將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醋樣品以終濃度3毫 克/毫升以上添加之W i D r細胞其細胞數減少,且添加1毫 克/耄升者亦顯著抑制細胞增殖。 又,添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品之Wi Dr 細胞全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特徵。 即,可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品於至 少於1毫克/毫升之濃度下對HCT 1 1 6細胞具有細胞自滅 誘發作用,並可抑制細胞增殖。 Φ 於PBS中溶解10毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫 克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液之 過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述爲準測定,取得同 樣之結果。 ' 實施例3 4
於含1 0 % 5 61、處理3 0分鐘之牛胎兒血淸 (JRHBIOSCIENCE 公司)之 PRMI 1 640 培養基(GIBCO 公司製) 中37°C下培養之人類前骨髓性白血病細胞HL-60( ATCC CCL- 2 40 ),於ASF 104培養基(味之素公司製)中以5 X 104 個/ 900毫升懸浮,並在FALCON公司製之6孔口平板上之 各孔口分注4 . 5毫升。對各懸浮液’添加0 · 5毫升實施例1 9 ( 6 ) 記載之含岩藻糖硫酸多醣· F之低分子化物經冷凍乾燥者以 10毫克/毫升溶解於含有120mM氯化鈉之30mM HEPES緩衝 液(pH7 )中,並以濾器過濾處理者’並於37°C,5%二氧化 127 1237026 碳存在下培養。尙,僅將上述緩衝液同量添加者作爲對照 組,並同樣地培養。培養開始2 2小時後與4 6小時後之生 細胞數依組織培養技術(第2版)(朝倉出版、日本組織培 養學會編)記載之方法(第2 6〜2 8頁)計測。即,以血球計 算板上之台盼藍染色之方法計測。 其結果可判定HL - 60細胞爲經由上述之含岩藻糖硫酸多 醣-F低分子化物之冷凍乾燥物而誘發細胞自滅,並抑制細 胞增殖速度。 實施例3 5 將人類前骨髓性白血病細胞HL-60,於含10%之56°C、 處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRH BIOSCIENCE公司)之PRMI 1 640培養基(GIBC0公司製)中以5 X 104個/ 900毫升懸浮。 此準備6份此懸浮液,並對各懸浮液,添加1 00微升之含 有120mM氯化鈉之30mM HEPES緩衝液(pH7)及以10毫克/ 毫升溶解於同緩衝中之實施例1 9 ( 2 )記載之含岩藻糖硫酸多 醣-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3、及 F-Fd-4 之過濾處理液, 並於371、5%二氧化碳存在下培養46小時。 測定培養開始後22小時及46小時培養液中之生細胞數。 又,將人類前骨髓性白血病細胞HL-60,以5 X 104個/ 900 毫升懸浮於ASF 104培養基(味之素公司製)。準備6份此 懸浮液,並對各懸浮液,分別添加100微升之含有120mM 氯化鈉之30mM HEPES緩衝液(pH7)及以10毫克/毫升溶解 於同緩衝中之含岩藻糖硫酸多醣- F、F-Fd-1、 F-Fd-2 > F- 1237026
Fd-3、及F-Fd-4之過濾處理液,並於37°C、5%二氧化碳 存在下培養4 0小時。 測定培養開始後1 6小時及40小時培養液中之生細胞數。 又,進行上述2種培養之細胞以顯微鏡觀察,並調查增 殖程度及細胞型態。
其結果,於以ASF 104培養基培養之細胞中,添加含岩 藻糖硫酸多醣-F、F-Fd - 1、F-Fd-2、F-Fd - 3、及 F-Fd-4 之 細胞爲全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特 徵,且生細胞數爲幾乎未見增加或者大約完全死滅。於僅 添加緩衝液之培養基中細胞數增加約3倍。另一方面,於 以PRMI 1 640培養基培養之細胞中,僅添加1^冲(1-1、?彳(1-2、F - Fd - 3、及F - Fd - 4之細胞全部呈現細胞縮小及細胞片 斷化等之細胞自滅特徵,且細胞幾乎死滅。於僅添加緩衝 液之培養基中細胞數爲增加約3倍,而在添加含岩藻糖硫 酸多醣-F之培養基中細胞數爲增加約2 . 5倍。
由以上之結果,可判定含岩藻糖硫酸多醣-F於無血淸培 養基中對癌細胞具有強的細胞自滅誘發作用,但F - Fd - 1、 F-Fd-2、F-Fd-3、及F-Fd-4不論於無血淸培養基中或於血 淸培養基中均具有非常強的細胞自滅誘發作用。 更且爲了確認,將人類前骨髓性白血病細胞HL - 60,於 含10%之56°C、處理30分鐘之牛胎兒血淸(JRHBIOSCIENCE 公司)之PRMI 1640培養基(GIBCO公司製)中以5X104個/ 9 00毫升懸浮。準備此懸浮液9毫升2份,並分別添加1毫 129 1237026 升之含有120mM氯化鈉之30mM HEPES緩衝液(pH7)及以10 毫克/毫升溶解於同緩衝液之F - Fd _ 4過濾處理液,並於3 7 °C、5 %二氧化碳存在下培養1 6小時。培養之細胞經離心 分離而與上淸液分離。將所得之細胞懸浮於20微升含有 10mM乙二酸四醋酸鹽及〇 . 5月桂醯基肌胺酸鈉之50mM Tr 1 s -鹽酸緩衝液(pH7. 8)中,並添加10毫克/毫升核糖核酸酶 A( SIGMA公司製)1微升,於50°C、處理30分鐘後,添加
1微升之1〇毫克/毫升蛋白酶K,並於50 °C、處理30分 鐘。將處理後之細胞作爲樣品,使用2%瓊脂糖凝膠於1 00V 電壓下進行電泳。此凝膠於溴化乙錠溶液中浸漬30分鐘後, 使用超照明裝置確認凝膠中之DNA狀態時,細胞自滅特有 的DNA梯段爲被確認。更且爲了確認,使用已知作爲誘發 細胞自滅試藥之放射菌素D 1 0微克/毫升溶液代替上述之 F-Fd-4進行同樣操作時,於培養2〇小時下,可確認與F_Fd_4 情形相同之DNA梯段。
即’可判定若經由本發明末端型含岩藻糖硫酸多醣_ F分 解酵素將含岩藻糖硫酸多醣_F分解,則對癌細胞之細胞自 滅誘發作用變強。 實施例36 對2 1歲女性及3 2歲男性之正常人採取靜脈血,並以每 1公升含有葡甸糖1〇〇毫克、Caci2· 2H200.74毫克、MgCl2 19.92 笔克 ’ KC1 40.26 毫克、NaCl 7371 毫克、Tris-鹽酸 1 7 5 6 . 5毫克之溶液稀釋2倍後,於淋巴球分離溶液(大日 130 1237026 本製藥販售)事先以稀釋血液2倍容量置入之離心分離管 中靜置重疊層’並於18〜20 °C、400g下離心分離30分鐘。 離心後,收集淋巴球分離溶液上層之淋巴球部份。 如此處理所得之正常淋巴球以每1 . 9 X 1 05個添加至24孔 口之平板中,加入1.8毫升之含10%牛胎兒血淸(56t,處 理30分鐘者)之RPM 1-1640培養基中各添加1種0.2毫升 之5毫克/毫升上述各實施例所得之含岩藻糖硫酸多醣、 及其分解物之培養基並於3 7 °C下培養。以添加生理食鹽水 代替含岩藻糖硫酸多醣溶液者作爲對照組。培養開始後, 以顯微鏡測定各孔口細胞之型態變化及生細胞數。其結果, 於加入各種含岩藻糖硫酸多醣、其分解物之孔口亦與對照 孔口於細胞型態上差異,又生細胞數之差異亦幾乎無,且 於第1 3天任一者之細胞均亦幾乎死滅。由此結果,可判定 在含岩藻糖硫酸多醣、其分解物對癌細胞誘發強細胞自滅 之濃度中亦對正常細胞不顯示出毒性。 實施例3 7 含岩藻糖硫酸多醣-U對固型癌之制癌作用 鼠固型癌Meth A(4X 106細胞/鼠)皮下注射至8週齡之BALB / C公鼠(體重約20克)腹部。其後,連續於相同處皮下注 射10天實施例6記載之含岩藻糖硫酸-U( 100毫克/公斤/ 天)。另一方面對照群爲將食鹽水同樣地皮下注射。摘出2週 後於鼠腹部所形成之癌組織,並測定其重量。結果示於表2。 即,於對照群中平均癌重量爲1 . 25克,相對地含岩藻糖硫 131 1237026 酸多醣-U投予群爲0 · 2 8克,顯示出有意義(相對於對照群 P<0 . 01 )的制癌作用。抑制率爲77 . 6%。 表2 鼠(η) 腫瘤重里(克) 平均土 SD 抑制率 (%) 對照組(8) 1.25±0.10 含岩藻糖硫酸多醣-U投予(8) 0.28土0.07 77.6 實施例3 8
含岩藻糖硫酸多醣之致癌預防作用 (1 )對6週齡之S p r a g u r e - D a w 1 e y鼠(公)1 9隻,背部皮 下投予7.4毫克/公斤之氧化偶氮基甲烷(NAKARI TESC公 司製),並於其後1週1次,至第10週爲止背部皮下投 予。尙投予時,爲將氧化偶氮基甲烷溶解於含有0 . 9 %氯化 鈉之pH6 . 5之0 . 1M磷酸緩衝液中,並以每次1〇〇微升調整 溶液濃度。
對上述19隻中之5隻,在最初氧化偶氮基甲烷投予之 同時連日地將依實施例1記載爲準調製之高果美海帶熱水 萃取液7 0毫升以飮用水型式經口投予至第3 0週爲止。 此熱水萃取液爲含有2毫克/公斤含岩藻糖硫酸多醣混 合物,故其被連日經口投予以140毫克/公斤之含岩藻糖 硫酸多醣混合物。 尙對上述19隻中之14隻不投予含岩藻糖硫酸多醣,而 給予自來水作爲飮用水,並視爲對照群。 132 1237026 至第30週爲止對照群之外耳巢癌發生者爲在14隻中見 到有1 4隻,相對地於含岩藻糖硫酸多醣混合物投予群爲5 隻中有1隻,確認其顯著的致癌抑制作用。 尙至第30週爲止對照群爲死亡3隻,但含岩藻糖硫酸 多醣混合物投予群爲全部生存。又第3 〇週之對照群之平均 體重爲7 1 6克,相對地含岩藻糖硫酸多醣混合物投予群之 平均體重爲817克。另一方面氧化偶氮基甲烷非投予之鼠 群(5隻)平均體重爲788克,含岩藻糖硫酸多醣混合物投 予群之體重增加爲與氧化偶氮基甲烷非投予之鼠群同等。 其次,選出對照群4隻,於第3 0週開始連日將上述高 果美海帶熱水萃取液40毫升(含岩藻糖硫酸多醣混合物80 毫克)以飮用水型式經口投予。於第3 6週,4隻中之2隻 的外耳巢癌顯著退縮,確認含岩藻糖硫酸多醣之制癌作用。 經由以上含岩藻糖硫酸多醣之經口投予,確認對化學致 癌劑之致癌預防作用,化學致癌劑抑制體重增加的防止作 用’更且癌組織之退縮。 實施例3 9 注射劑 將實施例1製造之含岩藻糖硫酸多醣混合物溶解於注射 用蒸餾水作成5 %溶液。此溶液於冷凍乾燥用玻璃小瓶之1 瓶中,以含岩藻糖硫酸多醣爲50毫克充塡,並進行冷凍乾 燥。另外添加生理食鹽水2毫升作爲溶解液。 實施例40 注射劑 依下述配方調製注射劑。 133 1237026 含岩藻糖硫酸多醣-U〔實施例12〕 40毫克 生理食鹽水 適量 每1安瓿 2毫升 同樣地使用實施例1 2記載之含岩藻糖硫酸多醣· F調製 注射劑。 實施例41 錠劑 依下述配方調製錠劑。 含岩藻糖硫酸多醣樣品(實施例1 ) 10毫克 玉米澱粉 65毫克 羧甲基纖維素 20毫克 聚乙烯基吡咯烷酮 3毫克 硬脂酸鎂 2毫克
每1錠 100毫克 實施例42 注射劑
將F-Fd-Ι溶解於注射用蒸餾水作成5%溶液。此溶液於冷凍乾 燥用玻璃小瓶之1瓶中,以含岩藻糖硫酸多醣爲50毫克充塡, 並進行冷凍乾燥。另外添加生理食鹽水2毫升作爲溶解液。 實施例43 注射劑 依下述配方調製注射劑。 實施例19-(6)所得之含岩藻糖硫酸多醣-F 之低分子化物之冷凍乾燥物 40毫克 生理食鹽水 適量 每1安瓿 2毫升 134 1237026 實施例44 錠劑 依下述配方調製錠劑。 實施例19-(6)所得之含岩藻糖硫酸多醣_F 之低分子化物之冷凍乾燥物 10毫克 玉米澱粉 65毫克 羧甲基纖維素 20毫克 聚乙烯基吡咯烷酮 3毫克 硬脂酸鎂 2毫克 每1錠 100毫克 發明之效果 依據本發明提供對不要的或病原性細胞具有細胞自滅誘 發作用,且於癌等異常增殖細胞疾病和病毒性疾病中,對 病變細胞能誘發細胞自滅,且在該疾病之預防、治療上有 效的藥劑。尤其是大腸癌,胃癌等消化器系之癌之情形, 由於經口投予本發明之藥劑可令癌細胞引起細胞自滅,故 以來自天然食品之含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物作爲 有效成分之本發明樂劑非常適用於消化器系癌之制癌劑。 又經由其之致癌預防效果’亦可預防由化學致癌劑之致癌。 本發明之藥劑以食用褐藻植物、食用海參等食用物晳作爲 原料而可以廉價大量供應,且於安全性高之方面亦爲優異。 又’經由日常攝取含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物之食 品或飮料,可維持、增強健康。又,依據本發明提供簡便 135 1237026 的細胞自滅誘發方法,且使用本發明之方法,可進行細胞 自滅機械解明之硏究、細胞自滅誘發阻礙劑之開發等。 又依據本發明,提供實質上不含岩藻糖硫酸多醣-F,並 除去反應性強之著色性物質之在糖鏈工程、醫學等領域中 有用的本發明含岩藻糖硫酸多醣-U及其分解物,且亦提供 其效率性製法。 更且依據本發明,提供實質上不含有含岩藻糖硫酸多醣-U,並除去反應性強之著色性物質之在糖鏈工程、醫學等領 域中有用的本發明含岩藻糖硫酸多醣-F及其分解物,且亦 提供其效率性製法。 依據本發明,提供含岩藻糖硫酸多醣-F之構造解析和分 解’可用於製造含岩藻糖硫酸多醣-F生物活性檢索上有用 之含岩藻糖硫酸多醣-F低分子化物之末端型含岩藻糖硫酸 多醣分解酵素、其製法、及對癌細胞之細胞自滅誘發作用 強之含岩藻糖硫酸多醣-F之經由該酵素之低分子化物。 又’依據本發明可將迄今無法安定製造之本發明之末端 型含岩藻糖硫酸多醣-F分解酵素,於鈣離子存在下極爲安 定地製造。更且,依據本發明,於鈣離子存在下可使本發 明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素以極佳效率活動。 【圖式簡單說明】 第1圖不出含岩藻糖硫酸多醣之沈激形成率。 第2圖不出依使用s e p h a c r y 1 S - 5 0 0之凝膠過濾法測定 之含岩藻糖硫酸多醣-U之分子量分布。 第3圖不出含岩藻糖硫酸多醣— uiiR光譜。 136 1237026 所得之含岩藻糖硫酸多醣以1 mg / m 1添加時之培養時間與培 養液中之生細胞數之關係。 第2 8圖示出於MOLT - 3細胞培養液中添加實施例1所得 之含岩藻糖硫酸多醣、實施例1 2所得之含岩藻糖硫酸多醣 -F,實施例1 5及1 7所得之含岩藻糖硫酸多醣、及葡聚糖 硫酸時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係。 第29圖示出於HCT 1 16細胞培養液中添加實施例1所 得之含岩藻糖硫酸多醣樣品、實施例1所得之含岩藻糖硫 酸多醣混合物、實施例1 2所得之含岩藻糖硫酸多醣-U及含 岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3 及 F-Fd-4、 實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣、及肝素及蔔聚糖硫酸 時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係。 第3 0圖示出於HCT 1 1 6細胞培養液中將實施例1所得 之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃度添加時之培養時間與 培養液中之生細胞數之關係。 第3 1示出於AGS細胞培養液中將實施例1所得之含岩 藻糖硫酸多醣樣品以各種濃度添加時之培養時間與培養液 中之生細胞數之關係。 第32圖示出於SW 480細胞培養液中將實施例1所得之 含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃度添加時之培養時間與培 養液中之生細胞數之關係。 第3 3圖示出於W i D r細胞培養液中將實施例1所得之含 岩藻糖硫酸多醣混合物、實施例1 2所得之含岩藻糖硫酸多 1237026 醣-F、F-Fd - 3及F-Fd-4及實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸 多醣添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係。 第34圖示出於Wi Dr細胞培養液中將實施例1所得之含 岩藻糖硫酸多醣樣品以予以各種濃度添加時之培養時間與 培養液中之生細胞數之關係。
140
Claims (1)
- I --------------- - J2570261 一 a 拾、申請專利範圍: 第92120936號「含岩藻糖硫酸多醣-F、其製法及含其之制癌劑及致 癌預防劑」專利案 (94年〇丨月〇3日修正) 1 . 一種含岩藻糖硫酸多醣-F,其特徵爲具有下述理化性質, ⑴構成糖:岩藻糖、半乳糖,實質上不含有糖醒酸, ⑵實質上不經由產黃菌屬(FUvobacteriunOsp.SA- OOSacCCRC 910069) 生產 之石澡 依聚糖 (fucoidan) 分解 酵素低分子化, ⑶經由互生單胞菌屬(Alter omonas)sp. SN-1009(CCRC 910070)生產之末端型含岩藻硫酸多醣分解酵素及/或 該菌株之培養上淸液而低分子化,最適pH :本酵素之 最適pH爲在7〜8,最適溫度:本酵素之最適溫度爲在 3 0 - 3 5。。, ⑷在總濃度0 . 6 - 3M之1種或2種以上之鹽類的存在下, 經添加氯化鯨鱲基吡啶產生含岩藻糖硫酸多醣-F之鹽 類的沉澱。 2 . —種制癌劑,其特徵爲含有如申請專利範圍第1項之含岩 藻糖硫酸多醣-F和/或其分解物。 3 . —種致癌預防劑,其特徵爲含有如申請專利範圍第1項之 含岩藻糖硫酸多醣-F和/或其分解物。 4 . 一種如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣-F之製 法,其特徵爲包含令含岩藻糖硫酸多醣混合物,以具有分 解含糖醛酸之含岩藻糖硫酸多醣能力之由產黃菌屬 1237026 (Flavobacterium)sp· SA-0082(CCRC 910069)生產的岩藻 依聚糖分解酵素、或以具有該分解酵素之微生物處理採集 目的多醣之步驟。 5 . —種如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣-F之製 法,其特徵包含令含岩藻糖硫酸多醣混合物,於鹽類存在 下,以具有酸性多醣凝集能力之藥劑令目的多醣沈澱之步 驟。 6 . —種如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣-F之製 法,其特徵包含令含岩藻糖硫酸多醣混合物,於2價陽離 子混合存在下,以陰離子交換樹脂處理採集目的多醣之步 驟。 7 . —種如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣-F之製 法,其特徵包含在製造如申請專利範圍第1項之含岩藻糖 硫酸多醣-F時,令共存之著色性物質使用多醣性物質或 具有陰離子之交換基之物質予以除去之步驟。 8 . —種具有分解申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣- F活性之產自互生單胞菌屬sp. SN- 1 009 (CCRC9 1 0 0 70 )之 末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素,其特徵爲具有下述之 理化性質, (i )作用:作用於如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸 多醣-F,使該含岩藻糖硫酸多醣低分子化,但不作用於具 有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醣-U, ⑴構成糖:含有糖醛酸, ⑵經由產黃菌屬(Flavobacterium) sp. SA-0082(CCRC 1237026 910069)生產之岩藻依聚糖分解酵素而低分子化,並生成 至少由下述式(I )、( I I )、( I I I )所示之化合物所選出之一 種以上之化合物,OH 0 = S=0' I OHOH(11 ) 1237026OH-4- 1237026 (Π)最適pH:本酵素之最適pH爲在7〜8, (iii)最適溫度:本酵素之最適溫度爲在30-35 °C。 9 . 一種酵素組成物,其含有鈣源及如申請專利範圍第8項之 末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素。 j 〇 . —種如申請專利範圍第8項之末端型含岩藻糖硫酸多醣 分解酵素之製法,其特徵爲培養具有如申請專利範圍第8 項之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素生產能力之互生 單胞菌屬細菌,由其培養物中採集該酵素。 }丨.一種含岩藻糖硫酸多醣之低分子化物,其特徵爲令如申 請專利範圍第8項之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素與 如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣作用而取 得’且依凝膠過灑法之分子重爲1000〜30000。
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-
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- 1997-01-29 TW TW86100995A patent/TW589320B/zh not_active IP Right Cessation
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