JP3605414B2 - 糖化合物 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は糖質研究の分野において有用な糖化合物、該糖化合物の生産に有用な糖分解酵素、および該糖化合物の製造に有用なフコイダノバクター（Fucoidanobacter）属細菌に関する。
背景技術
フコイダンは褐藻類に含まれる硫酸化多糖であり抗血液凝固作用、脂血清澄作用、抗腫瘍作用、癌転移抑制作用、抗エイズウィルス感染作用等様々な生物活性が報告されており、医薬品として極めて有用な物質である。
しかしながら、フコイダンは極めて分子量が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用いるには抗原性、均一性、抗凝血活性等の問題があるので、フコイダンをある程度分解することを必要とされることが多い。
そのため、フコイダンの構造を解明し、生物活性との関係を解明することが望まれていたが、フコイダンは分岐が多い高分子であり、構成糖の種類も多く、硫酸基も様々な位置に結合しているため、構造解析は非常に困難であった。多糖の構造解析には、多糖を分解する酵素を作用させ、生成するオリゴ糖の構造を解析していく方法があるが、現在報告されているフコイダン分解酵素の中で分解生成物の糖鎖構造が判明しているものやフコイダンオリゴ糖の標準品となるものは市販品が無い。
上記のような理由で、構造が判明した糖化合物、該糖化合物の製造に有用な糖分解酵素、及び該糖化合物の製造に有用な微生物が求められていた。
本発明の目的は、フコイダンの構造解析、フコイダンの酵素分解物の同定、及び生物活性の検索に用いることができる糖化合物、フコイダンの部分分解、フコイダンオリゴ糖の生産などフコイダンに関する研究に有用な新規なエンド（endo）型のフコイダン分解酵素、及び糖化合物の製造に有用な新規微生物を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記一般式（１）又は（２）：
〔式中、ＸはＨ又は下記式（３）：
で表される基を示し、ＹはＨ又は下記式（４）、若しくは（５）：
で表される基を示すが、ＸとＹが共にＨであることはない。また、ＺはＨ又は下記式（６）：
で表される基を示す〕で表される化合物の少なくとも一つのアルコール性水酸基が硫酸エステル化している糖化合物又はその塩に関する。
前記一般式（１）又は（２）で表される化合物の例としては、下記の式（７）〜式（15）で表される化合物が挙げられる。
本発明の第２の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とするエンド型フコイダン分解酵素に関する。
（Ｉ）作用：フコイダンに作用して、少なくとも前記式（７）及び式（８）で表される化合物を遊離させる。
（II）至適pH:本酵素の至適pHは６から10である。
（III）至適温度：本酵素の至適温度は30から40℃である。
また本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明である糖化合物の製造に有用な新規微生物である、電子伝達鎖にメナキノンを有し、GC含量が約60％であるフコイダノバクター属に属する細菌に関する。
本明細書に記載の式（１）、（２）、（４）〜（15）、及び（17）〜（25）中の「〜」は、マンノース、又はガラクトースにαアノマー、βアノマーの両アノマーが存在することを意味する。
本発明者らは、本発明の第２の発明である酵素又は本発明の第３の発明である細菌の菌体抽出物又は培養液上清をフコイダンに作用させると、本発明の糖化合物が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【図面の簡単な説明】
図１は糖化合物（ａ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ａ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図２は糖化合物（ｂ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｂ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図３は糖化合物（ｃ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｃ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図４は糖化合物（ｄ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｄ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図５は糖化合物（ｅ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｅ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図６は糖化合物（ｆ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｆ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図７は糖化合物（ｇ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｇ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図８は糖化合物（ｈ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｈ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図９は糖化合物（ｉ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｉ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図10は糖化合物（ａ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図11は糖化合物（ｂ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図12は糖化合物（ｃ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図13は糖化合物（ｄ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図14は糖化合物（ｅ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図15は糖化合物（ｆ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図16は糖化合物（ｇ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図17は糖化合物（ｈ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図18は糖化合物（ｉ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図19は糖化合物（ａ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図20は糖化合物（ｂ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図21は糖化合物（ｃ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図22は糖化合物（ｄ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図23は糖化合物（ｅ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図24は糖化合物（ｆ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図25は糖化合物（ｇ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図26は糖化合物（ｈ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図27は糖化合物（ｉ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図28は糖化合物（ａ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図29は糖化合物（ｂ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図30は糖化合物（ｃ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図31は糖化合物（ｄ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図32は糖化合物（ｅ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図33は糖化合物（ｆ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図34は糖化合物（ｇ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図35は糖化合物（ｈ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図36は糖化合物（ｉ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図37は本発明の第２の発明である酵素のpHと相対活性（％）の関係を表す図である。
図38は本発明の第２の発明である酵素の反応温度（℃）と相対活性（％）の関係を表す図である。
図39は本発明の第２の発明である酵素を処理したpHと残存活性（％）の関係を表す図である。
図40は本発明の第２の発明である酵素の処理温度（℃）と残存活性（％）の関係を表す図である。
図41は糖化合物（ａ）〜（ｉ）をDEAE−セファロースFFにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図42は糖化合物（ｈ）及び（ｉ）をDEAE−セファロースFFにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
以下、本発明に関して詳細に説明する。
本発明の第２の発明に使用される菌株としてはフラボバクテリウム（Flavobacterium）属に属し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でも良い。また、該エンド型フコイダン分解酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えばフラボバクテリウムsp.SA−0082株が挙げられる。該菌株由来のエンド型フコイダン分解酵素をフコイダンに作用させれば、本発明の第１の発明である糖化合物を得ることができる。
本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
1.フラボバクテリウムsp.SA−0082株
a.形態的性質
（１）本菌は短かん菌である。
幅 0.8〜1.0μｍ
長さ 1.0〜1.2μｍ
（２）胞子の有無 なし
（３）グラム染色性 陰性
b.生理的性質
（１）生育の温度範囲
37℃以下で生育できる。好適な生育温度は15〜28℃である。
（２）酸素に対する態度 好気性
（３）カタラーゼ 陽性
（４）オキシダーゼ 陽性
（５）ウレアーゼ 弱陽性
（６）酸の生成
Ｄ−グルコース 陽性
ラクトース 陽性
マルトース 陽性
Ｄ−マンニトール 陽性
スクロース 陰性
トレハロース 陰性
（７）加水分解
デンプン 陰性
ゼラチン 陽性
カゼイン 陰性
エスクリン 陽性
（８）硝酸塩の還元 陰性
（９）インドールの生成 陰性
（10）硫化水素の生成 陰性
（11）ミルクの凝固 陰性
（12）ナトリウムの要求性 陽性
（13）塩類要求性
０％食塩培地での生育 陰性
１％食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
（14）キノン系 メナキノン６
（15）菌体内DNAのGC含量 32％
（16）OF−テスト ０
（17）集落の色調 黄色系
（18）運動性 なし
（19）滑走性 なし
本菌株は、バージーズ マニュアル オブ システィマティック バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）、第１巻（1984）、及びバージーズ マニュアル オブ ディターミネイティブ バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）、第９巻（1994）に記載のフラボバクテリウム アクアタイル（Flavobacterium aquatile）、及びフラボバクテリウム メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）の類縁細菌と考えられるが、前者とはスクロースを資化して酸を形成しない点、カゼインを分解できない点、エスクリンを分解できる点、ゼラチンを液化できる点、ウレアーゼが陽性である点が異なり、後者とはカゼインが分解できない点、37℃での生育が遅い点が異なる。そこで本菌株をフラボバクテリウムに属する細菌と同定し、フラボバクテリウムsp.SA−0082と命名した。
なお、上記菌株はFlavobacterium sp.SA−0082と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）〕にFERM BP−5402（原寄託日；平成７年３月29日、国際寄託日への移管請求日；平成８年２月15日）として寄託されている。
本発明の第２の発明に使用する菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は、15℃〜30℃、培地のpHは５〜９がよく、５〜72時間の通気かくはん培養で本発明のエンド型フコイダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明のエンド型フコイダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。
上記のフラボバクテリウムsp.SA−0082株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダン分解酵素を含まない純化された本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を得ることができる。
また、上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素（菌体外酵素）が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りであり、菌体内酵素、菌体外酵素は分子量以外は同一の性質を示す。
（Ｉ）作用：フコイダンに作用して、少なくとも前記式（７）及び式（８）で表される糖化合物を遊離させる。
（II）至適pH:本酵素の至適pHは６から10である（図37）。
すなわち図37は、本酵素のpHと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はpHを示す。
（III）至適温度：本酵素の至適温度は30から40℃である（図38）。
すなわち図38は、本酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
（IV）pH安定性：本酵素はpH6〜11.5の間で安定である（図39）。
すなわち図39は、本酵素を処理したpHと残存活性の関係を表すグラフであり、縦軸は残存活性（％）、横軸はpHを示す。
（Ｖ）温度安定性：本酵素は約30℃以下で安定である（図40）。
すなわち図40は、本酵素を処理した温度と残存活性の関係を表すグラフであり、縦軸は残存活性（％）、横軸は処理温度（℃）を示す。
（VI）分子量：本酵素の分子量を、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−200（ファルマシア製）を用いたゲルろ過法により求めたところフラボバクテリウムsp.SA−0082株の菌体外酵素の場合は約７万であり、同菌体内酵素の場合は約46万であった。
（VII）酵素活性の測定方法：
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の酵素活性の測定は次のようにして行った。
すなわち、2.5％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶液50μｌと、10μｌの本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素と、60μｌの667mM塩化ナトリウムを含む83mMリン酸緩衝液pH7.5を混合し、37℃、３時間反応させた後、反応液105μｌと水2mlを混合かくはんし、その230nmにおける吸光度（AT）を測定した。対照として、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の代りに、本発明の酵素を溶解している上記緩衝液のみを用いて同様の条件により反応させたもの及びフコイダン溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に吸光度を測定した（AB1及びAB2）。
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μmolのマンノースとウロン酸の間のグリコシド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミリモル分子吸光係数を5.5として計算し行った。なお、酵素の活性は下記式により求めた。
（AT−AB1−AB2）×2.105×120/5.5×105×0.01
×180＝U/ml
2.105:吸光度を測定するサンプルの液量（ml）
120:酵素反応液の液量（μｌ）
5.5:不飽和ウロン酸の230nmにおけるミリモル分子吸光係数（/mM）
105:希釈に用いる反応液の液量（μｌ）
0.01:酵素液量（ml）
180:反応時間（分）
タンパク質の定量は、酵素液の280nmの吸光度を測定することにより行った。その際1mg/mlのタンパク質溶液の吸光度を1.0として計算した。
本発明者らは、以下に述べるごとく、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の作用機作を決定した。
（１）ガゴメ昆布フコイダンの調製
乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、10倍量の85％メタノール中で70℃、２時間処理後、ろ過し、残渣を10倍量のメタノール中で70℃、２時間処理し、ろ過した。残渣に20倍量の水を加え、100℃、３時間処理しろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を400mMの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、エタノールで十分洗浄し、セチルピリジニウムクロリドが完全に除去できたら、限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量10万）（アミコン社製）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコイダンを得た。収率は、乾燥ガゴメ昆布粉末重量に対して約４％であった。
（２）エンド型フコイダン分解酵素によるフコイダンの分解及び分解物の精製
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を作用させ分解物の大量調製を行った。
すなわち、５％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶液600mlと、100mMのリン酸緩衝液（pH8.0）750mlと4Mの塩化ナトリウム150mlと1750mU/mlの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液3.43mlを混合し、25℃で144時間反応させた。
反応液をポアサイズ3500の透析膜を用いて透析し、分子量3500以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーG3（旭化成社製）により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより９つの画分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）に分画した。その溶出パターンを図41に示す。横軸はフラクションナンバーを示し、左の縦軸及び図中の黒丸は、フェノール硫酸法による糖含量を480nmの吸光度で示し、右の縦軸及び図中の白丸は、不飽和グルクロン酸の含量を235nmの吸光度で示し、最も右の縦軸及び図中の点線は、溶出液中の酢酸アンモニウム濃度（Ｍ）を示す。各画分のフラクションナンバーは、それぞれ（ａ）:42〜43、（ｂ）:84〜91、（ｃ）:51〜52、（ｄ）:79、（ｅ）:102〜103、（ｆ）:62〜63、（ｇ）:45、（ｈ）:75、及び（ｉ）:77であった。
画分（ｈ）及び（ｉ）については上記のフラクションナンバー64〜78を集め、DEAE−セファロースFFにより、再精製を行った。その溶出パターンを図42に示す。横軸はフラクションナンバーを示し、左の縦軸及び図中の黒丸は、フェノール硫酸法による糖含量を480nmの吸光度で示し、右の縦軸及び図中の白丸は、不飽和グルクロン酸の含量を235nmの吸光度で示し、最も右の縦軸及び図中の点線は、溶出液中の酢酸アンモニウム濃度（Ｍ）を示す。各画分のフラクションナンバーはそれぞれ（ｈ）:92〜96、及び（ｉ）:99〜103であった。
（３）酵素反応生成物の構造解析
（ア）各画分の均一性の確認
上記の９つの画分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）をそれぞれ一部だけGlycoTAGおよびGlycoTAG Reagent Kit（共に宝酒造社製）を用いて還元性末端を２−アミノピリジル化（PA化）し、各PA化糖（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、（PA−ｈ）、及び（PA−ｉ）を得た。（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、（PA−ｈ）、及び（PA−ｉ）はHPLC分析によりそれぞれ均一であることが判明した。
なお、HPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型（日立製作所製）
カラム:L−カラム（4.6 ｘ 250mm）｛（財）化学薬品検査協会｝
溶離液：前記式（７）、（８）、および（９）〔（PA−ａ）、（PA−ｂ）、及び（PA−ｃ）〕の物質に対しては50mM酢酸−トリエチルアミン（pH5.5）前記式（10）、（12）、（13）、及び（15）〔（PA−ｄ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、及び（PA−ｉ）〕の物質に対しては100mM酢酸−トリエチルアミン（pH5）前記式（11）〔（PA−ｅ）〕の物質に対しては０から10分までは200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）10から60分までは200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）と0.5％のテトラヒドロフランを含む200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）の比率を100:0から20:80に直線的に変化させた。
前記式（14）〔（PA−ｈ）〕の物質に対しては０から60分まで200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）と0.5％のテトラヒドロフランを含む200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）の比率を80:20から50:50に直線的に変化させた。
検出：蛍光検出器 Ｆ−1150（日立製作所製）にて励起波長320nm、蛍光波長400nmで検出。
流速:1ml/分
カラム温度:40℃
（イ）酵素反応生成物の還元末端等及び中性等組成の分析
また、各PA化糖（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、（PA−ｈ）、及び（PA−ｉ）を４規定の塩酸、100℃、３時間処理により加水分解し、HPLCにより還元末端糖を調べた。
また、この加水分解物をグライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコタッグリージェント キット（宝酒造社製）を用いて還元性末端をPA化しHPLCにより中性糖組成を調べた。なお、HPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（4.6mm ｘ 150mm）（宝酒造社製）
溶離液:700mMほう酸緩衝液（pH9.0）：アセトニトリル＝9:1
検出：蛍光検出器Ｆ−1150（日立製作所製）にて励起波長310nm、蛍光波長380nmで検出。
流速:0.3ml/分
カラム温度:65℃
この結果、（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、及び（PA−ｉ）の還元性末端糖はすべてマンノースであった。また中性糖組成としては（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、及び（PA−ｉ）がマンノースとフコースを等モル含んでおり、（PA−ｄ）はマンノースとフコースの比率が2:1であった。
（PA−ｇ）及び（PA−ｈ）の還元性末端糖は共にガラクトースであり、その中性糖組成としては（PA−ｇ）はガラクトースとフコースの比が1:2であり、（PA−ｈ）はガラクトースとフコースの比が2:1であった。
また、構成糖の一つであるマンノースの立体配置を調べるためにＦ−キットグルコース／フルクトース及びホスホマンノースイソメラーゼ（共にベーリンガーマンハイムヤマノウチ製）を用い、説明書に従ってＤ−マンノースのみを測定できる反応系を構築し、別に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）各100μｇを2Nの塩酸で100℃、３時間加水分解後中和したものをこの反応系で測定した。この結果（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）のすべてからＤ−マンノースが検出されたので、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）の構成糖のマンノースはすべてＤ型と判明した。
（ｇ）及び（ｈ）の構成糖の一つであるガラクトースの立体配置を調べるためにＤ型のガラクトースのみを検出できるＦ−キット 乳糖／ガラクトース（ベーリンガーマンハイムヤマノウチ製）を用いた。すなわち、（ｇ）及び（ｈ）各100μｇを2Nの塩酸で100℃、３時間加水分解後中和したものをこのキットを用いて測定した。この結果、（ｇ）及び（ｈ）からガラクトースが検出されたので（ｇ）及び（ｈ）の構成糖のガラクトースはすべてＤ型と判明した。
さらにもう一種の構成糖であるフコースの立体配置を調べるために、クリニカルケミストリー（Clinical Chemistry）第36巻、第474−476頁（1990）に記載の方法に従って、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）各100μｇを2Nの塩酸で100℃、３時間加水分解後中和したものをこの反応系で測定した。本反応系ではＤ−フコースは検出されずＬ−フコースのみが検出できる。この結果（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）からＬ−フコースが検出された。
（ウ）酵素反応生成物の分子量の分析
次に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）をAPI−III質量分析器（パーキンエルマー・サイエクス社）を用いた質量分析に供したところ、それらの分子量は、それぞれ564、724、1128、1062、1448、644、632、1358、及び1288であった。（ｂ）および（ｃ）は２価の陰イオンが主なシグナルを形成した。（ｄ）は１価のイオンとナトリウムがついた１価のイオン及び２価のイオンが検出された。（ｅ）はナトリウムイオンが４個ついた２価のイオン、ナトリウムイオンが３個ついた３価のイオン、及びナトリウムイオンが１個ついた４価のイオン等が検出された。（ｆ）はナトリウムイオンが２個ついた１価のイオンが検出された。（ｇ）は１価のイオンとナトリウムが結合した１価のイオン及び２価のイオンが検出された。（ｈ）はナトリウムイオンが４個、３個、２個、及び１個ついた、それぞれ１価、２価、３価、及び４価のイオン等が検出された。（ｉ）は硫酸基が２個はずれてナトリウムが１個ついた１価のイオン及び硫酸基が２個取れた２価のイオンが検出された。
また、ネガティブモードのマスマス（MS/MS）分析により（ａ）は一価の硫酸イオン（分子量97）、不飽和ヘキスロン酸から水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量157）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンがとれた一価イオン（分子量175）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量225）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースが結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量319）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量405）が検出された。
同様にネガティブモードのMS/MS分析により（ｂ）は一価の硫酸イオン（分子量97）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた一価イオン（分子量175）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、不飽和ヘキスロン酸とフコースとマンノースと硫酸が２個結合したものから水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量321）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量405）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量417）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｃ）は一価の硫酸イオン（分子量97）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた一価イオン（分子量175）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量225）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、マンノースとヘキスロン酸とマンノースとフコースと硫酸が結合したものから水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量371）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量405）、フコースと不飽和ヘキスロン酸とマンノースとヘキスロン酸と硫酸が結合したものから水と水素イオンが取れた一価イオン（分子量721）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｄ）の２価イオンから、１価の硫酸イオン（分子量97）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた１価イオン（分子量175）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた１価イオン（分子量225）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量243）、フコースとマンノースと硫酸基が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量405）、（ｄ）から硫酸基が２個取れ、水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量450）、（ｄ）から硫酸基が１個取れ、水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量490）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｅ）は一価の硫酸イオン（分子量97）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量225）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、フコースと２分子の硫酸基とナトリウムイオンが結合したものから水素イオンが２個取れた一価イオン（分子量345）、（ｅ）から２個の硫酸基がとれ、３個のナトリウムイオンがつき、６個の水素イオンがとれた３価イオン（分子量450）、（ｅ）から１個の硫酸基と６個の水素イオンがとれ、３個のナトリウムイオンがついた３価イオン（分子量476）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースとフコースと硫酸が結合したものから水素イオンがとれた１価イオン（分子量563）、及び不飽和ヘキスロン酸とマンノースとフコースと３分子の硫酸が結合したものから水分子と水素イオンがとれた１価イオン（分子量705）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｆ）は、一価の硫酸イオン（分子量97）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースと硫酸とナトリウムが結合したものから水と水素イオンが取れた一価イオン（分子量421）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｇ）は、フコースと硫酸とガラクトースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量405）及び、フコース２分子とガラクトース１分子と硫酸基１分子が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量551）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｈ）に３分子のナトリウムが結合し、５分子の水素イオンが取れたものから、１価の硫酸イオン（分子量97）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量225）、フコース２分子とガラクトース４分子と硫酸基３分子が結合したものから水素イオンが１分子取れた一価イオン（分子量1197）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｉ）から硫酸基が２個取れた２価イオンから、１価の硫酸イオン（分子量97）、フコースと２分子の硫酸とナトリウムが結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量345）が検出された。
（エ）酵素反応生成物の糖組成の分析
上記質量分析の結果より（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、及び（ｉ）は分子内に不飽和ヘキスロン酸を含む可能性が極めて高いことが示唆された。
酵素反応生成物の分子内に不飽和結合のあるヘキスロン酸が存在することを証明するために以下の実験を行った。不飽和結合が分子内に存在すると230〜240nmに強い吸収があることが知られている。そこで、精製した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）の各オリゴ糖の水溶液の230〜240nmの吸光度を測定すると（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）の水溶液には強い吸収があり、分子内に不飽和結合があることが示唆された。また、本酵素によるフコイダンの分解反応の進行と共に230〜240nmの吸光度が増加することも確認されたので、本酵素はフコイダン中のマンノースとヘキスロン酸の間あるいは、ガラクトースとヘキスロン酸の間のグリコシド結合を脱離反応により切断することが強く示唆された。
酵素反応生成物のほとんどが非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を持ち還元末端がマンノースであることから調製したフコイダンの中にはヘキスロン酸とマンノースが交互に並んだ分子種が存在することが示唆された。
フコイダンの構成糖の多くはフコースであるためフコイダンは一般の多糖より酸により分解され易い。一方、ヘキスロン酸やマンノースの結合は比較的酸に強いことが知られている。本発明者らはガゴメ昆布のフコイダンの分子内に存在するヘキスロン酸とマンノースが交互に結合している分子種中のヘキスロン酸の種類を明らかにするためにカーボハイドレート リサーチ（Carbohydrate Research）第125巻、第283−290頁、1984年の方法を参考にして、まずフコイダンを0.3Mのシュウ酸に溶解し100℃、３時間処理したものを分子量分画し、分子量が3000以上の画分を集め、さらに陰イオン交換樹脂により吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後4Nの塩酸で酸加水分解し、pH8に調整後、PA化し、HPLCによりウロン酸の分析を行った。なおHPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＮ（4.6mm ｘ 250mm）（宝酒造社製）
溶離液:200mM酢酸−トリエチルアミン緩衝液（pH7.3）：アセトニトリル＝25:75
検出：蛍光検出器Ｆ−1150（日立製作所製）にて励起波長320nm、蛍光波長400nmで検出。
流速:0.8ml/分
カラム温度:40℃
なお、PA化ヘキスロン酸の標準物質はグルクロン酸はシグマ社製、ガラクツロン酸は和光純薬社製、イズロン酸はシグマ社製の４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドを加水分解したもの、マンヌロン酸及びグルロン酸はアクタ・ケミカ・スカンヂナヴィカ（Acta Chemica Scandinavicaj、第15巻、第1397−1398頁、1961年記載の方法にしたがい、和光純薬製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分離したものをPA化することにより得た。
この結果、上記フコイダンの分子種中に含まれているヘキスロン酸はグルクロン酸のみであることが判明した。
さらに上記分子種の加水分解物中のグルクロン酸を陰イオン交換樹脂によりＤ−マンノースと分離し凍結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグルクロン酸はＤ−グルクロン酸であることが判明した。
また、ガゴメ昆布由来のフコイダンをあらかじめ本発明の第二の発明であるエンド型フコイダン分解酵素で処理したものについても上記と同様にシュウ酸で酸加水分解したが、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合したポリマーは検出されなかった。このことから、本発明の酵素が脱離反応により切断するフコイダンの分子種の骨格構造はＤ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を持つことが判明した。
さらに、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースのそれぞれの結合位置とグリコシド結合のアノメリック配置を調べるため、シュウ酸分解により得られたポリマーをNMR分析した。
ポリマーのNMRの測定結果を以下に示す。但し、1H−NMRでの化学シフト値はトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を1.13ppmに、13C−NMRではトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を9.32ppmとして表した。
1H−NMR（D2O）
δ5.25（1H,br−s,1−Ｈ）、4.32（1H,d,J＝7.6Hz,1′−Ｈ）、4.00（1H,br−s,2−Ｈ）、3.71（1H,m,5′−Ｈ）、3.69（1H,m,5−CHのＨ）、3.68（1H,m,3−Ｈ）、3.63（1H,m,5−CHのＨ）、3.63（1H,m,4′−Ｈ）、3.57（1H,m,4−Ｈ）、3.54（1H,m,3′−Ｈ）、3.53（1H,m,5−Ｈ）、3.25（1H,t,J＝8.5Hz,2′−Ｈ）
13C−NMR（D2O）
δ175.3（５′−COOHのＣ）、102.5（１′−Ｃ）、99.6（１−Ｃ）、78.5（２−Ｃ）、77.9（４′−Ｃ）、77.0（３′−Ｃ）、76.7（５′−Ｃ）、73.9（５−Ｃ）、73.7（２′−Ｃ）、70.6（３−Ｃ）、67.4（４−Ｃ）、61.0（５−CH2OHのＣ）
なお、ピークの帰属の番号は下記式（16）の通りである：
Ｄ−グルクロン酸の１位の立体配置はそのビシナル結合定数が7.6Hzであることからβ−Ｄ−グルクロン酸であると決定した。
また、マンノースの１位の立体配置はその化学シフト値が5.25ppmであることからα−Ｄ−マンノースであると決定した。
構成糖の結合様式は1H検出異種核検出法であるHMBC法を用いて行った。
1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及びHOHAHA法を、13C−NMRの帰属にはHSQC法を用いた。
HMBCスペクトルにより１−Ｈと4'−Ｃの間及び4'−Ｈと１−Ｃの間、1'−Ｈと２−Ｃの間及び２−Ｈと1'−Ｃの間にそれぞれクロスピークが認められた。このことからＤ−グルクロン酸はβ結合でＤ−マンノースの２位に、Ｄ−マンノースはα結合でＤ−グルクロン酸の４位にそれぞれ結合していることが明らかとなった。
（オ）酵素反応生成物の糖結合様式及び硫酸基の結合位置の分析
構成糖および硫酸基の結合様式を調べるために酵素反応生成物を500MHzの核磁気共鳴装置JNM−α500型（日本電子製）によるNMRスペクトル分析に供した。この分析結果より（ａ）は前記式（７）、（ｂ）は前記式（８）、（ｃ）は前記式（９）、（ｄ）は前記式（10）、（ｅ）は前記式（11）、（ｆ）は前記式（12）、（ｇ）は前記式（13）、（ｈ）は前記式（14）、及び（ｉ）は前記式（15）で表されるものであることが判明した、すなわち（ａ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｂ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と２個の硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｃ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースにＤ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸にＤ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｄ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸機が２分子結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、Ｄ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つこと、（ｅ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸基が２分子結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、硫酸基が結合したＤ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに、硫酸基が２分子結合したＬ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つこと、（ｆ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｇ）は、還元末端残基であるＤ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＬ−フコースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｈ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−ガラクトースを起点に２本に分岐した構造を持ち、一方の糖鎖は、Ｄ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＬ−フコースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合しており、他方の糖鎖は、硫酸基が結合したＤ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＤ−ガラクトースが結合した構造を持つこと、（ｉ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、Ｄ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに、硫酸基が２個結合したＬ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つことが判明した。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素をフコイダンに作用させることにより、本発明の第１の発明である糖化合物に含まれる化合物を得た。
下記に、本発明の第１の発明の糖化合物の例である式（７）、式（８）、式（９）、式（10）、式（11）、式（12）、式（13）、式（14）、及び式（15）で表される化合物、すなわち（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）の物性を示す。
図１、２、３、４、５、６、７、８、及び９には各ピリジル（−２−）アミノ化糖化合物（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、（PA−ｈ）、及び（PA−ｉ）、のHPLCの溶出パターンを示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。さらに図10に（ａ）の、図11に（ｂ）の、図12に（ｃ）の、図13に（ｄ）の、図14に（ｅ）の、図15に（ｆ）の、図16に（ｇ）の、図17に（ｈ）の、図18に（ｉ）のマススペクトルを示し、図19に（ａ）の、図20に（ｂ）の、図21に（ｃ）の、図22に（ｄ）の、図23に（ｅ）の、図24に（ｆ）の、図25に（ｇ）の、図26に（ｈ）の、図27に（ｉ）のマスマスのスペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％）、横軸はm/z値を示す。
更に図28は（ａ）の、図29は（ｂ）の、図30は（ｃ）の、図31は（ｄ）の、図32は（ｅ）の、図33は（ｆ）の、図34は（ｇ）の、図35は（ｈ）の、図36は（ｉ）の1H−NMRスペクトルを示し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ppm）を示す。
なお、1H−NMRでの化学シフト値はHODの化学シフト値を4.65ppmとして表した。
（ａ）の物性
分子量564
MS m/z 563［Ｍ−H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、157［不飽和Ｄ−グルクロン酸−H2O−H+］−、175［不飽和Ｄ−グルクロン酸−H+］−、225［Ｌ−フコース硫酸−H2O−H+］−、243［Ｌ−フコース硫酸−H+］−、319［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが結合したもの−H2O−H+］−、405［Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−H+］−、483［Ｍ−SO3−H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.78（1H,d,J＝3.7Hz,4″−Ｈ）、5.26（1H,d,J＝1.2Hz,1−Ｈ）、5.12（1H,d,J＝4.0Hz,1′−Ｈ）、5.03（1H,d,J＝6.1Hz,1″−Ｈ）、4.47（1H,d−d,J＝3.4,10.4Hz,3′−Ｈ）、4.21（1H,br−s,2−Ｈ）、4.12（1H,m,5′−Ｈ）、4.10（1H,d−d,J＝3.7,5.8Hz,3″−Ｈ）、4.03（（1H,d,J＝3.4Hz,4′−Ｈ）、3.86（1H,m,3−Ｈ）、3.83（1H,d−d,J＝4.0,10.4Hz,2′−Ｈ）、3.72（1H,m,4−Ｈ）、3.72（1H,m,5−Ｈ）、3.70（2H,m,5−CH2のH2）、3.65（1H,d−d,J＝5.8,6.1Hz,2″−Ｈ）、1.08（3H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−マンノース＝1:1:1（各分子）
硫酸基 １分子（Ｌ−フコースの３位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（17）の通りである。
（ｂ）の物性
分子量 724
MS m/z 723〔Ｍ−H+〕−、361〔Ｍ−2H+〕2-
MS/MS m/z 97〔HSO4〕−、175〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−H+〕−、243〔Ｌ−フコース硫酸−H+〕−、321〔Ｍ−SO3−2H+〕2-、405〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−2SO3−H+〕−、417〔Ｍ−Ｌ−フコース−2SO3−H+〕−
1H−NMR（D2O）
δ5.66（1H,d,J＝3.4Hz,4″−Ｈ）、5.27（1H,d,J＝7.3Hz,1″−Ｈ）、5.25（1H,d,J＝1.8Hz,1−Ｈ）、5.21（1H,d,J＝3.7Hz,1′−Ｈ）、4.50（1H,d,J＝3.1Hz,4′−Ｈ）、4.32（1H,q,J＝6.7Hz,5′−Ｈ）、4.27（1H,d−d,J＝3.7,10.4Hz,2′−Ｈ）、4.21（1H,d−d,J＝3.4,6.7Hz,3″−Ｈ）、4.18（（1H,d−d,J＝1.8,11.0Hz,5−CHのＨ）、4.15（1H,br−s,2−Ｈ）、4.10（1H,d−d,J＝5.8,11.0Hz、５−CHのＨ）、3.99（1H,d−d,J＝3.1,10.4Hz、３′−Ｈ）、3.90（1H,m,5−Ｈ）、3.82（1H,m,3−Ｈ）、3.82（1H,m,4−Ｈ）、3.54（1H,br−t,J＝7.3Hz,2″−Ｈ）、1.11（3H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−マンノース＝1:1:1（各１分子）
硫酸基 ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及びＤ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（18）の通りである。
（ｃ）の物性
分子量 1128
MS m/z 1127〔Ｍ−H+〕−
MS/MS m/z 97〔HSO4〕−、175〔不飽和Ｄ−ヘキスロン酸−H+〕−、225〔Ｌ−フコース硫酸−H2O−H+〕−、243〔Ｌ−フコース硫酸−H+〕−、371〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｌ−フコース−SO3−2H+〕2-、405〔硫酸化Ｌ−フコースとＤ−マンノースが結合したもの−H+〕−、721〔Ｍ−Ｄ−マンノース−Ｌ−フコース−SO3−H2O−H+〕−
1H−NMR（D2O）
δ5.69（1H,d,J＝3.7Hz,（４）″−Ｈ）、5.34（1H,s,（１）−Ｈ）、5.16（1H,s,1−Ｈ）、5.10（1H,d,J＝4.0Hz,（１）′−Ｈ）、5.05（1H,d,J＝3.7Hz、１′−Ｈ）、4.93（1H,d,J＝6.4Hz,（１）″−Ｈ）、4.50（1H,d−d,J＝3.4,10.7Hz、３′−Ｈ）、4.47（1H,d−d,J＝3.4,10.4Hz,（３）′−Ｈ）、4.39（1H,d,J＝7.9Hz,1″−Ｈ）、4.33（1H,br−s,（２）−Ｈ）、4.14（1H,m,2−Ｈ）、4.12（1H,m,（３）″−Ｈ）、4.12（1H,m,5′−Ｈ）、4.12（1H,m,（５）′−Ｈ）、4.04（1H,m,4′−Ｈ）、4.03（1H,m,（４）′−Ｈ）、3.85（1H,m,2′−Ｈ）、3.85（1H,m,（２）′−Ｈ）、3.82（1H,m,3−Ｈ）、3.82（1H,m,（３）−Ｈ）、3.73（1H,m,4−Ｈ）、3.73（1H,m,5−Ｈ）、3.73（1H,m,（４）−Ｈ）、3.70（2H,m,5−CH2のH2）、3.70（2H,m,（５）−CH2のH2）、3.67（1H,m,5″−Ｈ）、3.62（1H,m,4″−Ｈ）、3.62（1H,m,（２）″−Ｈ）、3.62（1H,m,（５）−Ｈ）、3.51（1H,t,J＝8.9Hz,3″−Ｈ）、3.28（1H,t,J＝7.9Hz,2″−Ｈ）、1.09（3H,d,J＝6.7Hz,（５）′−CH3のH3）、1.07（1H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−グルクロン酸:D−マンノース＝2:1:1:2（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基 ２分子（各Ｌ−フコースの３位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（19）の通りである。
（ｄ）の物性
分子量 1062
MS m/z 1061［Ｍ−H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、175［不飽和ヘキスロン酸−H+］−、225［Ｌ−フコースと硫酸−H2O−Ｈ］−、243［Ｌ−フコース硫酸−H+］−、405［Ｌ−フコースとＤ−マンノースと硫酸基が結合したもの−H+］−、450［Ｍ−2SO3−2H+］2-、490［Ｍ−SO3−2H+］2-
1H−NMR（D2O）
δ5.67（1H,d,J＝3.7Hz,（４）″−Ｈ）、5.32（1H,br−s,（１）−Ｈ）、5.17（1H,d,J＝3.5Hz,1′−Ｈ）、5.17（1H,br−s,1−Ｈ）、4.93（1H,d,J＝6.4Hz,（１）″−Ｈ）、4.71（1H,m,1″−Ｈ）、4.53（1H,d,J＝3.4Hz,4′−Ｈ）、4.33（1H,q,J＝6.7Hz,5′−Ｈ）、4.28（1H,d−d,J＝3.5,11.0Hz,2′−Ｈ）、4.18（1H,m,5−CH2のＨ）、4.13（1H,m,（２）−Ｈ）、4.12（1H,m,（３）″−Ｈ）、4.08（1H,m,5−CH3のＨ）、4.07（1H,m,2−Ｈ）、3.98（1H,d−d,J＝3.4,11.0,3′−Ｈ）、3.88（1H,m,5−Ｈ）、3.82（1H,m,4″−Ｈ）、3.78（1H,m,3−Ｈ）、3.78（1H,m,4−Ｈ）、3.78（1H,m,（３）−Ｈ）、3.67（2H,m,（５）−CH2のH2）、3.63（1H,m,（２）″−Ｈ）、3.60（1H,m,3″−Ｈ）、3.59（1H,m,5″−Ｈ）、3.57（1H,m,（４）−Ｈ）、3.57（1H,m,（５）−Ｈ）、3.16（1H,t,J＝7.9Hz,2″−Ｈ）、1.10（3H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−グルクロン酸:D−マンノース＝1:1:1:2（Ｌ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子とＤ−マンノース２分子）
硫酸基 ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及び還元性末端側のＤ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（20）の通りである。
（ｅ）の物性
分子量 1448
MS m/z 767［Ｍ＋4Na−6H+］2-503.7［Ｍ＋3Na−6H+］3-366.5［Ｍ＋Na−5H+］4-
MS/MS m/z 97［HSO4］−、225［Ｌ−フコース硫酸−H2O−H+］−、243［Ｌ−フコース硫酸−H+］−、345［Ｌ−フコースジ硫酸＋Na−2H+］−、450［Ｍ＋3Na−2SO3−6H+］3-、477［Ｍ＋3Na−SO3−6H+］3-、563［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースとＬ−フコースと硫酸が結合したもの−H+］−、705［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース硫酸とＬ−フコースジ硫酸が結合したもの−H2O−H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.58（1H,d,J＝3.4Hz,（４）″−Ｈ）、5.35（1H,br−s,（１）−Ｈ）、5.22（1H,d,J＝6.7Hz,（１）″−Ｈ）、5.19（1H,d,J＝3.7Hz,1′−Ｈ）、5.19（1H,d,J＝3.7Hz,（１）′−Ｈ）、5.16（1H,d,J＝1.8Hz,1−Ｈ）、4.62（1H,d,J＝7.6Hz,1″−Ｈ）、4.50（1H,m,4′−Ｈ）、4.50（1H,m,（４）′−Ｈ）、4.30（1H,m,5′−Ｈ）、4.30（1H,m,（５）′−Ｈ）、4.30（1H,m,（５）−CH2のＨ）、4.25（1H,m,2′−Ｈ）、4.25（1H,m,（２）−Ｈ）、4.25（1H,m,（２）′−Ｈ）、4.20（1H,m,（５）−CH2のＨ）、4.18（1H,m,5−CH2のＨ）、4.16（1H,m,（３）″−Ｈ）、4.08（1H,m,5−CH2のＨ）、4.07（1H,m,2−Ｈ）、4.02（1H,m,3′−Ｈ）、4.02（1H,m,（３）′−Ｈ）、3.85（1H,m,5−Ｈ）、3.85（1H,m,（５）−Ｈ）、3.78（1H,m,3−Ｈ）、3.78（1H,m,（３）−Ｈ）、3.76（1H,m,4″−Ｈ）、3.76（1H,m,5″−Ｈ）、3.75（1H,m,4−Ｈ）、3.75（1H,m,（４）−Ｈ）、3.58（1H,m,3″−Ｈ）、3.55（1H,m,（２）″−Ｈ）、3.18（1H,t,J＝8.2Hz,2″−Ｈ）、1.10（3H,d,J＝6.7Hz,（５）′−CH3のH3）、1.09（3H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−グルクロン酸:D−マンノース＝2:1:1:2（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基 ６分子（各Ｌ−フコースの２位と４位及び各Ｄ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（21）の通りである。
（ｆ）の物性
分子量 644
MS m/z 687［Ｍ＋2Na−3H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、243［Ｌ−フコース硫酸−H+］−、421［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース硫酸＋Na−H2O−2H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.60（1H,d,J＝3.4Hz,4″−Ｈ）、5.24（1H,br−s,1−Ｈ）、5.08（1H,d,J＝4.0Hz,1′−Ｈ）、4.94（1H,d,J＝6.7Hz,1″−Ｈ）、4.45（1H,d−d,J＝3.1,10.4Hz,3′−Ｈ）、4.20（1H,br−s,2−Ｈ）、4.14（2H,m,5−CH2のH2）、4.14（1H,m,5′−Ｈ）、4.09（1H,m,3″−Ｈ）、4.01（1H,d,J＝3.1Hz,4′−Ｈ）、3.91（1H,m,5−Ｈ）、3.85（1H,m,3−Ｈ）、3.85（1H,m,2′−Ｈ）、3.75（1H,t,J＝9.8Hz,4−Ｈ）、3.59（1H,t,J＝6.7Hz,2″−Ｈ）、1.06（3H,d,J＝6.4Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−マンノース＝1:1:1（Ｌ−フコースとＤ−マンノースと不飽和Ｄ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基 ２分子（Ｌ−フコースの３位及びＤ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（22）の通りである。
（ｇ）の物性
分子量 632
MS m/z 631［Ｍ−H+］−
MS/MS m/z 405［Ｄ−ガラクトースとＬ−フコース硫酸が結合したもの−H+］−、551［Ｌ−フコース硫酸とＬ−フコースとＤ−ガラクトースが結合したもの−H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.15（1H,d,J＝4.3Hz,F11−Ｈ）、4.93（1H,d,J＝3.7Hz,F21−Ｈ）、4.53（1H,d−d,J＝2.4,10.4Hz,F13−Ｈ）、4.49（1H,d,J＝7.6Hz G11−Ｈ）、4.46（1H,d−d,J＝3.1,10.7Hz,F23−Ｈ）、4.36（1H,q,J＝6.7Hz F25−Ｈ）、4.14（1H,q,J＝6.7Hz F15−Ｈ）、4.09（1H,d,J＝2.4Hz F14−Ｈ）、4.03（1H,d,J＝3.1Hz F24−Ｈ）、3.97（1H,d−d,J＝4.3,10.4Hz,F12−Ｈ）、3.90（1H,br−ｓ、G14−Ｈ）、3.81（1H,d−d,J＝3.7,10.7Hz,F22−Ｈ）、3.59（1H,m,G13−Ｈ）、3.59（1H,m,G15−Ｈ）、3.59（2H,m,G15−CH2のH2）、3.56（1H,m、G12−Ｈ）、1.19（3H,d,J＝6.7Hz,F15−CH3のH3）、1.14（3H,d,J＝6.7Hz,F25−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース:D−ガラクトース＝2:1（Ｌ−フコース２分子とＤ−ガラクトース１分子）
硫酸基 ２分子（各Ｌ−フコースの３位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（23）の通りである。
（ｈ）の物性
分子量 1358
MS m/z 1445［Ｍ＋4Na−5H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、225［Ｌ−フコース硫酸−H2O−H+］−、1197［Ｍ−2SO3−H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.19（1H,d,J＝4.3Hz,F11−Ｈ）、4.93（1H,d,J＝3.7Hz,F21−Ｈ）、4.62（1H,m,G21−Ｈ）、4.59（1H,m,G11−Ｈ）、4.54（1H,d−d,J＝2.7,10.6Hz,F13−Ｈ）、4.46（1H,m,F23−Ｈ）、4.46（1H,d,J＝7.6Hz G31−Ｈ）、4.41（1H,br−s,G14−Ｈ）、4.41（1H,d,J＝7.6Hz,G41−Ｈ）、4.37（1H,q,J＝6.4Hz F25−Ｈ）、4.27（1H,m,G13−Ｈ）、4.24（1H,br−s,G34−Ｈ）、4.21（1H,m,G33−Ｈ）、4.19（1H,m,G43−Ｈ）、4.15（1H,br−s,G44−Ｈ）、4.13（1H,q,J＝6.7Hz,F15−Ｈ）、4.09（1H,d,J＝2.7Hz,F14−Ｈ）、4.04（1H,d,J＝2.8Hz,F24−Ｈ）、3.98（1H,m,G15−CH2のＨ）、3.96（1H,d−d,J＝4.3,10.6Hz,F12−Ｈ）、3.88（1H,br−ｓ、G24−Ｈ）、3.93（1H,m,G35−CH2のＨ）、3.86（1H,m,G15−Ｈ）、3.81（1H,m,F22−Ｈ）、3.81（1H,m,G15−CH2のＨ）、3.80（1H,m,G35−Ｈ）、3.80（1H,m,G35−CH2のＨ）、3.66（1H,m,G23−Ｈ）、3.65（1H,m,G12−Ｈ）、3.64（1H,m、G25−CH2のＨ）、3.64（1H,m,G45−CH2のＨ）、3.61（1H,m,G45−Ｈ）、3.58（1H,m,G22−Ｈ）、3.56（1H,m,G25−CH2のＨ）、3.56（1H,m,G45−CH2のＨ）、3.55（1H,m,G42−Ｈ）、3.54（1H,m,G25−Ｈ）、3.54（1H,m,G32−Ｈ）、1.20（3H,d,J＝6.7Hz,F15−CH3のH3）、1.14（3H,d,J＝6.4Hz,F25−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース:D−ガラクトース＝1:2（Ｌ−フコース２分子とＤ−ガラクトース４分子）
硫酸基 ５分子（各Ｌ−フコースの３位、還元性末端のＤ−ガラクトースの３位、及び還元性末端のＤ−ガラクトースの６位に結合したＤ−ガラクトースの３位、及びそのＤ−ガラクトースの６位に結合したＤ−ガラクトースの３位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（24）の通りである。
（ｉ）の物性
分子量 1288
MS m/z 1149［Ｍ＋Na−2SO3−2H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、345［Ｌ−フコースジ硫酸＋Na−2H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.68（1H,d,J＝3.4Hz,（４）″−Ｈ）、5.34（1H,br−s,（１）−Ｈ）、5.19（1H,m,1−Ｈ）、5.19（1H,m,（１）′−Ｈ）、4.94（1H,m,1′−Ｈ）、4.94（1H,d,J＝6.4Hz,（１）″−Ｈ）、4.72（1H,d,J＝7.9Hz,1″−Ｈ）、4.54（1H,m,（４）′−Ｈ）、4.48（1H,d−d,J＝3.3,10.6Hz,3′−Ｈ）、4.38（1H,q,J＝6.4Hz,5′−Ｈ）、4.34（1H,q,J＝6.7Hz,（５）′−Ｈ）、4.29（1H,m,（２）′−Ｈ）、4.20（1H,m,5−CH2のＨ）、4.14（1H,m,（２）−Ｈ）、4.13（1H,m,（３）″−Ｈ）、4.09（1H,m,5−CH2のＨ）、4.08（1H,m,2−Ｈ）、4.05（1H,d,J＝3.3Hz,4′−Ｈ）、3.99（1H,m、（３）′−Ｈ）、3.89（1H,m,5−Ｈ）、3.83（1H,m,4″−Ｈ）、3.81（1H,m,2′−Ｈ）、3.80（1H,m,4−Ｈ）、3.78（1H,m,3−Ｈ）、3.78（1H,m,（３）−Ｈ）、3.68（2H,m,（５）−CH2のH2）、3.62（1H,m,（２）″−Ｈ）、3.60（1H,m,3″−Ｈ）、3.60（1H,m,5″−Ｈ）、3.58（1H,m,（５）−Ｈ）、3.56（1H,m,（４）−Ｈ）、3.17（1H,t,J＝7.9Hz,2″−Ｈ）、1.15（3H,d,J＝6.4Hz,5′−CH3のH3）、1.11（3H,d,J＝6.7Hz,（５）′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−グルクロン酸:D−マンノース＝2:1:1:2（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基 ４分子（還元性末端のＤ−マンノースに結合したＬ−フコースの３位ともう一方のＬ−フコースの２位と４位及び還元性末端側のＤ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（25）の通りである。
また、本発明の第１の発明である糖化合物は、本発明の第３の発明であるフコイダノバクター属に属する細菌から得られる菌体抽出物又は培養液上清をフコイダンに作用させた場合にも製造することができる。
本発明の第３の発明である菌株としては、フコイダノバクター属に属する本発明の菌株であればいかなる菌株でも良く、該菌株の具体例としては、例えば、フコイダノバクター・マリナス（Fucoidanobacter marinus）SI−0098株が挙げられる。
本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
2.フコイダノバクター マリナス SI−0098
a.形態的性質
（１）本菌は球〜短桿菌であり、時に双球菌の形態をとることがある。
幅 0.5〜0.7μｍ
長さ 0.5〜0.7μｍ
（２）胞子の有無 なし
（３）グラム染色性 陰性
b.生理的性質
（１）生育の温度範囲
37℃で生育できる。好適な生育温度は15〜28℃である。
（２）酸素に対する態度 好気性
（３）カタラーゼ 陽性
（４）オキシダーゼ 陰性
（５）ウレアーゼ 陰性
（６）加水分解
デンプン 陽性
ゼラチン 陰性
カゼイン 陰性
エスクリン 陽性
（７）硝酸塩の還元 陰性
（８）インドールの生成 陰性
（９）硫化水素の生成 陽性
（10）ミルクの凝固 陰性
（11）ナトリウムの要求性 陽性
（12）塩類要求性
０％食塩培地での生育 陰性
１％食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
（13）キノン系 メナキノン７
（14）菌体内DNAのGC含量 61％
（15）細胞壁のジアミノピメリン酸 陰性
（16）グリコリル試験 陰性
（17）ヒドロキシ脂肪酸の存在 陽性
（18）OF−テスト Ｏ
（19）集落の色調 特徴的な集落色素を生成せず
（20）運動性 あり
（21）滑走性 なし
（22）鞭毛 極単毛
本菌株は、バージーズ マニュアル オブ ディターミネイティブ バクテリオロジー、第９巻（1994）記載の基本分類によればグループ４（グラム陰性好気性かん菌及び球菌）に分類される。しかしながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、GC含量が61％の点でグループ４に属する菌と大いに異なる。基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にユビキノンを有し、グラム陽性細菌はメナキノンを有している。
グラム陰性細菌であるフラボバクテリウム属及びシトファーガ（Cytophaga）属は例外的に電子伝達鎖にメナキノンを有しているが、これらの属に属する細菌のGC含量は、土壌細菌であるシトファーガ アーベンシコラ（Cytophaga arvensicola）が43〜46％、海洋細菌であるシトファーガ ジフルエンス（Cytophaga diffluens）、シトファーガ ファーメンタンス（Cytophaga fermentans）、シトファーガ マリーナ（Cytophaga marina）、及びシトファーガ ウリギノーサ（Cytophaga uliginosa）が42％であり、本菌株の性質とは全く異なる。更に、本菌株と既同定株の16SrDNA配列の相同性を比較したところ、最も相同性の高い既同定株ベルコミクロビウム スピノサム（Verrucomicrobium spinosum）においてもその相同性は、76.6％であった。16SrDNA配列の相同性が90％以下の場合、両細菌の属が異なることは一般に広く知られていることから、本発明者らは、本菌株は既存の属に属さない新属の細菌であると断定し、よって本菌株をフコイダノバクター マリナス SI−0098と命名した。
なお、上記菌株は、Fucoidanobacter marinus SI−0098と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）〕にFERM BP−5403（原寄託日；平成７年３月29日、国際寄託日への移管請求日；平成８年２月15日）として寄託されている。
本発明の第３の発明であるフコイダノバクター属細菌を培養し、その菌体抽出物、又は培養液上清をフコイダンに作用させることにより、本発明の第１の発明の糖化合物を遊離させることができる。培養する菌株としては、フコイダノバクター属に属し、その菌体抽出物又は培養液上清をフコイダンに作用させた場合、本発明の第１の発明である糖化合物が得られる菌株であればいかなる菌株でも良く、該菌株の具体例としては、例えば、Fucoidanobacter marimus SI−0098株が挙げられる。
フコイダノバクター属細菌株の培地に加える栄養源は該菌株が利用し、該菌株がフコイダンから本発明の第１の発明である糖化合物の生成が可能な菌体内抽出物及び培養上清を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。
本発明の第３の発明であるフコイダノバクター属細菌を培養するに当り、一般に培養温度は、15℃〜30℃、培地のpHは５〜９がよく、５〜72時間の通気かくはん培養で、該菌株の菌体内抽出物及び培養上清のエンド型フコイダン分解酵素活性は最大に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成に応じ、該菌株が生産する菌体内抽出物及び培養上清のエンド型フコイダン分解活性が最大になるように設定することは当然のことである。
フコイダノバクター属 SI−0098株を適当な培地で培養し、培養終了後、遠心分離すれば菌体及び培養液上清が得られる。更に得られた菌体を通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波破砕後、遠心分離すれば菌体抽出液が得られる。
限外ろ過により濃縮した培養液上清又は菌体抽出液を塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液と混合し、これにフコイダンを加え、反応させる。
反応終了後、反応液を分子量分画用のカラムを用いて分画することにより本発明の第１の発明である糖化合物を得ることができる。
本発明の第１の発明である糖化合物は糖鎖工学用試薬として有用であり、特公平５−65108号記載の方法によりPA化を行い、PA化物を調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質が提供される。更に本発明の糖化合物は抗ガン剤、癌転移抑制剤、抗ウィルス剤としての生理活性の適用が期待される。本発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の第１の発明である糖化合物の例の製造方法を実施例をもって示すが本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１
フラボバクテリウムsp.SA−0082（FERM BP−5402）を、グルコース0.1％、ペプトン1.0％、酵母エキス0.05％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地600mlを分注して殺菌した（120℃、20分）２リットルの三角フラスコに接種し、24℃で20時間培養して種培養液とした。ガゴメ昆布由来のフコイダン0.3％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.01％、及び消泡剤（信越化学工業製KM70）0.01％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地20リットルを30リットル容のジャーファーメンターに入れ120℃で20分殺菌した。冷却後、上記の種培養液600mlを接種し、24℃で20時間、毎分10リットルの通気量と毎分125回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液1ml当り６ミリユニットの活性が検出された。
一方、本培養で得られた菌体を、200mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地1ml中に20mUの活性が検出された。
上記の培養液上清の濃縮液に、終濃度が90％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）で十分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したDEAE−セファロースFFのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、50mMから600mMの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が4Mとなるように食塩を加え、あらかじめ4Mの食塩を含む20mMのリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したフェニルセファロース CL−4Bのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、4Mから1Mの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器（アミコン社製）で濃縮後、あらかじめ50mM食塩を含む10mMリン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−200でゲルろ過を行い活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が3.5Mとなるように食塩を加え、あらかじめ3.5Mの食塩を含む10mMリン酸緩衝液（pH8）で平衡化したフェニルセファロースHPのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で洗浄後、3.5Mから1.5Mの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めて精製酵素を得た。この酵素の分子量をセファクリルＳ−200の保持時間から求めたところ約７万であった。以上の精製工程を表１に示す。
実施例２
フラボバクテリウムsp.SA−0082（FERM BP−5402）をグルコース0.25％、ペプトン1.0％、酵母エキス0.05％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地600mlを分注して殺菌した（120℃、20分）２リットルの三角フラスコに接種し、24℃で24時間培養して種培養液とした。グルコース0.25％、ペプトン1.0％、酵母エキス0.05％、及び消泡剤（信越化学工業製KM70）0.01％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地20リットルを30リットル容のジャーファーメンターに入れ120℃で20分殺菌した。冷却後、上記の種培養液600mlを接種し、24℃で24時間、毎分10リットルの通気量と毎分125回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液1ml当り1mUの活性が検出された。
一方、本培養で得られた菌体を、200mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地1ml中に5mUの活性が検出された。
本抽出液に、終濃度が90％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）で十分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したDEAE−セファロースFFのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、50mMから600mMの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が4Mとなるように食塩を加え、あらかじめ4Mの食塩を含む20mMのリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したフェニルセファロースCL−4Bのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、4Mから1Mの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ50mM食塩を含む10mMリン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−300でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分子量をセファクリルＳ−300の保持時間から求めたところ約46万であった。次にこの活性画分に25mMの食塩を含む10mMのリン酸緩衝液（pH7）で透析した。この酵素液を、あらかじめ250mMの食塩を含む10mMのリン酸緩衝液（pH7）で平衡化したモノ（Mono）Ｑ HR5/5のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、250mMから450mMの食塩のグラジエントに溶出させ、活性画分を集め、精製酵素を得た。以上の精製工程を表２に示す。
実施例３
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例１で得られたエンド型フコイダン分解酵素（菌体内酵素）を作用させ分解物の調製を行った。
すなわち、2.5％のフコイダン溶液16mlと、50mMのリン酸緩衝液（pH7.5）12mlと4Mの塩化ナトリウム4mlと32mU/mlの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液8mlを混合し、25℃で48時間反応させた。
反応液をセルロファインGCL−300（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量2000以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーG3（旭化成社製）により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより３つの画分に分離した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ41mg、69mg、及び9.6mg得た。
実施例４
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例２で得られたエンド型フコイダン分解酵素（菌体外酵素）を作用させ分解物の調製を行った。
すなわち、2.5％のフコイダン溶液16mlと、50mMのリン酸緩衝液（pH7.5）12mlと4Mの塩化ナトリウム4mlと32mU/mlの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液8mlを混合し、25℃で48時間反応させた。
反応液をセルロファインGCL−300（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量2000以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーG3（旭化成社製）により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより３つの画分を分離し、凍結乾燥した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ40mg、65mg、及び9.2mg得た。
実施例５
フコイダノバクター マリナス SI−0098株（FERM BP−5403）を、ガゴメ昆布由来のフコイダン0.3％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.05％、及び消泡剤（信越化学工業製KM70）0.01％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地600mlを２リットル容の三角フラスコに入れ120℃で20分殺菌した培地に接種し、25℃で48時間、毎分120回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清液を得た。
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液1ml当り0.2mU活性が検出された。
一方、本培養で得られた菌体を、200mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地1ml中に20mUの活性が検出された。
実施例６
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例５で得られたフコイダノバクター マリナス SI−0098株の菌体内酵素を作用させ分解物の調製を行った。
すなわち、2.5％のフコイダン溶液16mlと、800mMの塩化ナトリウムを含む100mMのリン酸緩衝液（pH8.0）20mlと20mU/mlの本発明の実施例５で得られたフコイダノバクター マリナスSI−0098株の菌体内酵素溶液4mlを混合し、25℃で48時間反応させた。
反応液をセルロファインGCL−300のカラムにより分子量画分し、分子量2000以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーG3により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより３つの画分に分離し、凍結乾燥した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ38mg、60mg、及び8.2mg得た。
本発明により、フコイダンの構造解析、フコイダンの酵素分解物の同定、及び生物活性の検索に用いることができる糖化合物、フコイダンの部分分解及びフコイダンオリゴ糖の生産などフコイダンに関する研究に有用な新規なエンド型のフコイダン分解酵素及び糖化合物の製造に有用な新規微生物が提供された。
本発明は糖質研究の分野において有用な糖化合物、該糖化合物の生産に有用な糖分解酵素、および該糖化合物の製造に有用なフコイダノバクター（Fucoidanobacter）属細菌に関する。
背景技術
フコイダンは褐藻類に含まれる硫酸化多糖であり抗血液凝固作用、脂血清澄作用、抗腫瘍作用、癌転移抑制作用、抗エイズウィルス感染作用等様々な生物活性が報告されており、医薬品として極めて有用な物質である。
しかしながら、フコイダンは極めて分子量が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用いるには抗原性、均一性、抗凝血活性等の問題があるので、フコイダンをある程度分解することを必要とされることが多い。
そのため、フコイダンの構造を解明し、生物活性との関係を解明することが望まれていたが、フコイダンは分岐が多い高分子であり、構成糖の種類も多く、硫酸基も様々な位置に結合しているため、構造解析は非常に困難であった。多糖の構造解析には、多糖を分解する酵素を作用させ、生成するオリゴ糖の構造を解析していく方法があるが、現在報告されているフコイダン分解酵素の中で分解生成物の糖鎖構造が判明しているものやフコイダンオリゴ糖の標準品となるものは市販品が無い。
上記のような理由で、構造が判明した糖化合物、該糖化合物の製造に有用な糖分解酵素、及び該糖化合物の製造に有用な微生物が求められていた。
本発明の目的は、フコイダンの構造解析、フコイダンの酵素分解物の同定、及び生物活性の検索に用いることができる糖化合物、フコイダンの部分分解、フコイダンオリゴ糖の生産などフコイダンに関する研究に有用な新規なエンド（endo）型のフコイダン分解酵素、及び糖化合物の製造に有用な新規微生物を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記一般式（１）又は（２）：
前記一般式（１）又は（２）で表される化合物の例としては、下記の式（７）〜式（15）で表される化合物が挙げられる。
（Ｉ）作用：フコイダンに作用して、少なくとも前記式（７）及び式（８）で表される化合物を遊離させる。
（II）至適pH:本酵素の至適pHは６から10である。
（III）至適温度：本酵素の至適温度は30から40℃である。
また本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明である糖化合物の製造に有用な新規微生物である、電子伝達鎖にメナキノンを有し、GC含量が約60％であるフコイダノバクター属に属する細菌に関する。
本明細書に記載の式（１）、（２）、（４）〜（15）、及び（17）〜（25）中の「〜」は、マンノース、又はガラクトースにαアノマー、βアノマーの両アノマーが存在することを意味する。
本発明者らは、本発明の第２の発明である酵素又は本発明の第３の発明である細菌の菌体抽出物又は培養液上清をフコイダンに作用させると、本発明の糖化合物が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【図面の簡単な説明】
図１は糖化合物（ａ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ａ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図２は糖化合物（ｂ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｂ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図３は糖化合物（ｃ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｃ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図４は糖化合物（ｄ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｄ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図５は糖化合物（ｅ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｅ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図６は糖化合物（ｆ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｆ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図７は糖化合物（ｇ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｇ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図８は糖化合物（ｈ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｈ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図９は糖化合物（ｉ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（PA−ｉ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図10は糖化合物（ａ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図11は糖化合物（ｂ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図12は糖化合物（ｃ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図13は糖化合物（ｄ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図14は糖化合物（ｅ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図15は糖化合物（ｆ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図16は糖化合物（ｇ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図17は糖化合物（ｈ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図18は糖化合物（ｉ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図19は糖化合物（ａ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図20は糖化合物（ｂ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図21は糖化合物（ｃ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図22は糖化合物（ｄ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図23は糖化合物（ｅ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図24は糖化合物（ｆ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図25は糖化合物（ｇ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図26は糖化合物（ｈ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図27は糖化合物（ｉ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示す図である。
図28は糖化合物（ａ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図29は糖化合物（ｂ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図30は糖化合物（ｃ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図31は糖化合物（ｄ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図32は糖化合物（ｅ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図33は糖化合物（ｆ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図34は糖化合物（ｇ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図35は糖化合物（ｈ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図36は糖化合物（ｉ）の1H−NMRスペクトルを表す図である。
図37は本発明の第２の発明である酵素のpHと相対活性（％）の関係を表す図である。
図38は本発明の第２の発明である酵素の反応温度（℃）と相対活性（％）の関係を表す図である。
図39は本発明の第２の発明である酵素を処理したpHと残存活性（％）の関係を表す図である。
図40は本発明の第２の発明である酵素の処理温度（℃）と残存活性（％）の関係を表す図である。
図41は糖化合物（ａ）〜（ｉ）をDEAE−セファロースFFにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
図42は糖化合物（ｈ）及び（ｉ）をDEAE−セファロースFFにより分離したときの溶出パターンを示す図である。
以下、本発明に関して詳細に説明する。
本発明の第２の発明に使用される菌株としてはフラボバクテリウム（Flavobacterium）属に属し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でも良い。また、該エンド型フコイダン分解酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えばフラボバクテリウムsp.SA−0082株が挙げられる。該菌株由来のエンド型フコイダン分解酵素をフコイダンに作用させれば、本発明の第１の発明である糖化合物を得ることができる。
本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
1.フラボバクテリウムsp.SA−0082株
a.形態的性質
（１）本菌は短かん菌である。
幅 0.8〜1.0μｍ
長さ 1.0〜1.2μｍ
（２）胞子の有無 なし
（３）グラム染色性 陰性
b.生理的性質
（１）生育の温度範囲
37℃以下で生育できる。好適な生育温度は15〜28℃である。
（２）酸素に対する態度 好気性
（３）カタラーゼ 陽性
（４）オキシダーゼ 陽性
（５）ウレアーゼ 弱陽性
（６）酸の生成
Ｄ−グルコース 陽性
ラクトース 陽性
マルトース 陽性
Ｄ−マンニトール 陽性
スクロース 陰性
トレハロース 陰性
（７）加水分解
デンプン 陰性
ゼラチン 陽性
カゼイン 陰性
エスクリン 陽性
（８）硝酸塩の還元 陰性
（９）インドールの生成 陰性
（10）硫化水素の生成 陰性
（11）ミルクの凝固 陰性
（12）ナトリウムの要求性 陽性
（13）塩類要求性
０％食塩培地での生育 陰性
１％食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
（14）キノン系 メナキノン６
（15）菌体内DNAのGC含量 32％
（16）OF−テスト ０
（17）集落の色調 黄色系
（18）運動性 なし
（19）滑走性 なし
本菌株は、バージーズ マニュアル オブ システィマティック バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）、第１巻（1984）、及びバージーズ マニュアル オブ ディターミネイティブ バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）、第９巻（1994）に記載のフラボバクテリウム アクアタイル（Flavobacterium aquatile）、及びフラボバクテリウム メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）の類縁細菌と考えられるが、前者とはスクロースを資化して酸を形成しない点、カゼインを分解できない点、エスクリンを分解できる点、ゼラチンを液化できる点、ウレアーゼが陽性である点が異なり、後者とはカゼインが分解できない点、37℃での生育が遅い点が異なる。そこで本菌株をフラボバクテリウムに属する細菌と同定し、フラボバクテリウムsp.SA−0082と命名した。
なお、上記菌株はFlavobacterium sp.SA−0082と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）〕にFERM BP−5402（原寄託日；平成７年３月29日、国際寄託日への移管請求日；平成８年２月15日）として寄託されている。
本発明の第２の発明に使用する菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は、15℃〜30℃、培地のpHは５〜９がよく、５〜72時間の通気かくはん培養で本発明のエンド型フコイダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明のエンド型フコイダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。
上記のフラボバクテリウムsp.SA−0082株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダン分解酵素を含まない純化された本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を得ることができる。
また、上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素（菌体外酵素）が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りであり、菌体内酵素、菌体外酵素は分子量以外は同一の性質を示す。
（Ｉ）作用：フコイダンに作用して、少なくとも前記式（７）及び式（８）で表される糖化合物を遊離させる。
（II）至適pH:本酵素の至適pHは６から10である（図37）。
すなわち図37は、本酵素のpHと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はpHを示す。
（III）至適温度：本酵素の至適温度は30から40℃である（図38）。
すなわち図38は、本酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
（IV）pH安定性：本酵素はpH6〜11.5の間で安定である（図39）。
すなわち図39は、本酵素を処理したpHと残存活性の関係を表すグラフであり、縦軸は残存活性（％）、横軸はpHを示す。
（Ｖ）温度安定性：本酵素は約30℃以下で安定である（図40）。
すなわち図40は、本酵素を処理した温度と残存活性の関係を表すグラフであり、縦軸は残存活性（％）、横軸は処理温度（℃）を示す。
（VI）分子量：本酵素の分子量を、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−200（ファルマシア製）を用いたゲルろ過法により求めたところフラボバクテリウムsp.SA−0082株の菌体外酵素の場合は約７万であり、同菌体内酵素の場合は約46万であった。
（VII）酵素活性の測定方法：
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の酵素活性の測定は次のようにして行った。
すなわち、2.5％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶液50μｌと、10μｌの本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素と、60μｌの667mM塩化ナトリウムを含む83mMリン酸緩衝液pH7.5を混合し、37℃、３時間反応させた後、反応液105μｌと水2mlを混合かくはんし、その230nmにおける吸光度（AT）を測定した。対照として、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の代りに、本発明の酵素を溶解している上記緩衝液のみを用いて同様の条件により反応させたもの及びフコイダン溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に吸光度を測定した（AB1及びAB2）。
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μmolのマンノースとウロン酸の間のグリコシド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミリモル分子吸光係数を5.5として計算し行った。なお、酵素の活性は下記式により求めた。
（AT−AB1−AB2）×2.105×120/5.5×105×0.01
×180＝U/ml
2.105:吸光度を測定するサンプルの液量（ml）
120:酵素反応液の液量（μｌ）
5.5:不飽和ウロン酸の230nmにおけるミリモル分子吸光係数（/mM）
105:希釈に用いる反応液の液量（μｌ）
0.01:酵素液量（ml）
180:反応時間（分）
タンパク質の定量は、酵素液の280nmの吸光度を測定することにより行った。その際1mg/mlのタンパク質溶液の吸光度を1.0として計算した。
本発明者らは、以下に述べるごとく、本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素の作用機作を決定した。
（１）ガゴメ昆布フコイダンの調製
乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、10倍量の85％メタノール中で70℃、２時間処理後、ろ過し、残渣を10倍量のメタノール中で70℃、２時間処理し、ろ過した。残渣に20倍量の水を加え、100℃、３時間処理しろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を400mMの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、エタノールで十分洗浄し、セチルピリジニウムクロリドが完全に除去できたら、限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量10万）（アミコン社製）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコイダンを得た。収率は、乾燥ガゴメ昆布粉末重量に対して約４％であった。
（２）エンド型フコイダン分解酵素によるフコイダンの分解及び分解物の精製
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素を作用させ分解物の大量調製を行った。
すなわち、５％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶液600mlと、100mMのリン酸緩衝液（pH8.0）750mlと4Mの塩化ナトリウム150mlと1750mU/mlの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液3.43mlを混合し、25℃で144時間反応させた。
反応液をポアサイズ3500の透析膜を用いて透析し、分子量3500以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーG3（旭化成社製）により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより９つの画分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）に分画した。その溶出パターンを図41に示す。横軸はフラクションナンバーを示し、左の縦軸及び図中の黒丸は、フェノール硫酸法による糖含量を480nmの吸光度で示し、右の縦軸及び図中の白丸は、不飽和グルクロン酸の含量を235nmの吸光度で示し、最も右の縦軸及び図中の点線は、溶出液中の酢酸アンモニウム濃度（Ｍ）を示す。各画分のフラクションナンバーは、それぞれ（ａ）:42〜43、（ｂ）:84〜91、（ｃ）:51〜52、（ｄ）:79、（ｅ）:102〜103、（ｆ）:62〜63、（ｇ）:45、（ｈ）:75、及び（ｉ）:77であった。
画分（ｈ）及び（ｉ）については上記のフラクションナンバー64〜78を集め、DEAE−セファロースFFにより、再精製を行った。その溶出パターンを図42に示す。横軸はフラクションナンバーを示し、左の縦軸及び図中の黒丸は、フェノール硫酸法による糖含量を480nmの吸光度で示し、右の縦軸及び図中の白丸は、不飽和グルクロン酸の含量を235nmの吸光度で示し、最も右の縦軸及び図中の点線は、溶出液中の酢酸アンモニウム濃度（Ｍ）を示す。各画分のフラクションナンバーはそれぞれ（ｈ）:92〜96、及び（ｉ）:99〜103であった。
（３）酵素反応生成物の構造解析
（ア）各画分の均一性の確認
上記の９つの画分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）をそれぞれ一部だけGlycoTAGおよびGlycoTAG Reagent Kit（共に宝酒造社製）を用いて還元性末端を２−アミノピリジル化（PA化）し、各PA化糖（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、（PA−ｈ）、及び（PA−ｉ）を得た。（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、（PA−ｈ）、及び（PA−ｉ）はHPLC分析によりそれぞれ均一であることが判明した。
なお、HPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型（日立製作所製）
カラム:L−カラム（4.6 ｘ 250mm）｛（財）化学薬品検査協会｝
溶離液：前記式（７）、（８）、および（９）〔（PA−ａ）、（PA−ｂ）、及び（PA−ｃ）〕の物質に対しては50mM酢酸−トリエチルアミン（pH5.5）前記式（10）、（12）、（13）、及び（15）〔（PA−ｄ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、及び（PA−ｉ）〕の物質に対しては100mM酢酸−トリエチルアミン（pH5）前記式（11）〔（PA−ｅ）〕の物質に対しては０から10分までは200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）10から60分までは200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）と0.5％のテトラヒドロフランを含む200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）の比率を100:0から20:80に直線的に変化させた。
前記式（14）〔（PA−ｈ）〕の物質に対しては０から60分まで200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）と0.5％のテトラヒドロフランを含む200mM酢酸−トリエチルアミン（pH3.8）の比率を80:20から50:50に直線的に変化させた。
検出：蛍光検出器 Ｆ−1150（日立製作所製）にて励起波長320nm、蛍光波長400nmで検出。
流速:1ml/分
カラム温度:40℃
（イ）酵素反応生成物の還元末端等及び中性等組成の分析
また、各PA化糖（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、（PA−ｈ）、及び（PA−ｉ）を４規定の塩酸、100℃、３時間処理により加水分解し、HPLCにより還元末端糖を調べた。
また、この加水分解物をグライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコタッグリージェント キット（宝酒造社製）を用いて還元性末端をPA化しHPLCにより中性糖組成を調べた。なお、HPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（4.6mm ｘ 150mm）（宝酒造社製）
溶離液:700mMほう酸緩衝液（pH9.0）：アセトニトリル＝9:1
検出：蛍光検出器Ｆ−1150（日立製作所製）にて励起波長310nm、蛍光波長380nmで検出。
流速:0.3ml/分
カラム温度:65℃
この結果、（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、及び（PA−ｉ）の還元性末端糖はすべてマンノースであった。また中性糖組成としては（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、及び（PA−ｉ）がマンノースとフコースを等モル含んでおり、（PA−ｄ）はマンノースとフコースの比率が2:1であった。
（PA−ｇ）及び（PA−ｈ）の還元性末端糖は共にガラクトースであり、その中性糖組成としては（PA−ｇ）はガラクトースとフコースの比が1:2であり、（PA−ｈ）はガラクトースとフコースの比が2:1であった。
また、構成糖の一つであるマンノースの立体配置を調べるためにＦ−キットグルコース／フルクトース及びホスホマンノースイソメラーゼ（共にベーリンガーマンハイムヤマノウチ製）を用い、説明書に従ってＤ−マンノースのみを測定できる反応系を構築し、別に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）各100μｇを2Nの塩酸で100℃、３時間加水分解後中和したものをこの反応系で測定した。この結果（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）のすべてからＤ−マンノースが検出されたので、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）の構成糖のマンノースはすべてＤ型と判明した。
（ｇ）及び（ｈ）の構成糖の一つであるガラクトースの立体配置を調べるためにＤ型のガラクトースのみを検出できるＦ−キット 乳糖／ガラクトース（ベーリンガーマンハイムヤマノウチ製）を用いた。すなわち、（ｇ）及び（ｈ）各100μｇを2Nの塩酸で100℃、３時間加水分解後中和したものをこのキットを用いて測定した。この結果、（ｇ）及び（ｈ）からガラクトースが検出されたので（ｇ）及び（ｈ）の構成糖のガラクトースはすべてＤ型と判明した。
さらにもう一種の構成糖であるフコースの立体配置を調べるために、クリニカルケミストリー（Clinical Chemistry）第36巻、第474−476頁（1990）に記載の方法に従って、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）各100μｇを2Nの塩酸で100℃、３時間加水分解後中和したものをこの反応系で測定した。本反応系ではＤ−フコースは検出されずＬ−フコースのみが検出できる。この結果（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）からＬ−フコースが検出された。
（ウ）酵素反応生成物の分子量の分析
次に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）をAPI−III質量分析器（パーキンエルマー・サイエクス社）を用いた質量分析に供したところ、それらの分子量は、それぞれ564、724、1128、1062、1448、644、632、1358、及び1288であった。（ｂ）および（ｃ）は２価の陰イオンが主なシグナルを形成した。（ｄ）は１価のイオンとナトリウムがついた１価のイオン及び２価のイオンが検出された。（ｅ）はナトリウムイオンが４個ついた２価のイオン、ナトリウムイオンが３個ついた３価のイオン、及びナトリウムイオンが１個ついた４価のイオン等が検出された。（ｆ）はナトリウムイオンが２個ついた１価のイオンが検出された。（ｇ）は１価のイオンとナトリウムが結合した１価のイオン及び２価のイオンが検出された。（ｈ）はナトリウムイオンが４個、３個、２個、及び１個ついた、それぞれ１価、２価、３価、及び４価のイオン等が検出された。（ｉ）は硫酸基が２個はずれてナトリウムが１個ついた１価のイオン及び硫酸基が２個取れた２価のイオンが検出された。
また、ネガティブモードのマスマス（MS/MS）分析により（ａ）は一価の硫酸イオン（分子量97）、不飽和ヘキスロン酸から水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量157）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンがとれた一価イオン（分子量175）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量225）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースが結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量319）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量405）が検出された。
同様にネガティブモードのMS/MS分析により（ｂ）は一価の硫酸イオン（分子量97）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた一価イオン（分子量175）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、不飽和ヘキスロン酸とフコースとマンノースと硫酸が２個結合したものから水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量321）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量405）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量417）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｃ）は一価の硫酸イオン（分子量97）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた一価イオン（分子量175）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量225）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、マンノースとヘキスロン酸とマンノースとフコースと硫酸が結合したものから水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量371）、フコースと硫酸とマンノースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量405）、フコースと不飽和ヘキスロン酸とマンノースとヘキスロン酸と硫酸が結合したものから水と水素イオンが取れた一価イオン（分子量721）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｄ）の２価イオンから、１価の硫酸イオン（分子量97）、不飽和ヘキスロン酸から水素イオンが取れた１価イオン（分子量175）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた１価イオン（分子量225）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量243）、フコースとマンノースと硫酸基が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量405）、（ｄ）から硫酸基が２個取れ、水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量450）、（ｄ）から硫酸基が１個取れ、水素イオンが２個取れた２価イオン（分子量490）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｅ）は一価の硫酸イオン（分子量97）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量225）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、フコースと２分子の硫酸基とナトリウムイオンが結合したものから水素イオンが２個取れた一価イオン（分子量345）、（ｅ）から２個の硫酸基がとれ、３個のナトリウムイオンがつき、６個の水素イオンがとれた３価イオン（分子量450）、（ｅ）から１個の硫酸基と６個の水素イオンがとれ、３個のナトリウムイオンがついた３価イオン（分子量476）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースとフコースと硫酸が結合したものから水素イオンがとれた１価イオン（分子量563）、及び不飽和ヘキスロン酸とマンノースとフコースと３分子の硫酸が結合したものから水分子と水素イオンがとれた１価イオン（分子量705）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｆ）は、一価の硫酸イオン（分子量97）、フコースと硫酸が結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量243）、不飽和ヘキスロン酸とマンノースと硫酸とナトリウムが結合したものから水と水素イオンが取れた一価イオン（分子量421）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｇ）は、フコースと硫酸とガラクトースが結合したものから水素イオンが取れた一価イオン（分子量405）及び、フコース２分子とガラクトース１分子と硫酸基１分子が結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量551）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｈ）に３分子のナトリウムが結合し、５分子の水素イオンが取れたものから、１価の硫酸イオン（分子量97）、フコースと硫酸が結合したものから水分子と水素イオンが取れた一価イオン（分子量225）、フコース２分子とガラクトース４分子と硫酸基３分子が結合したものから水素イオンが１分子取れた一価イオン（分子量1197）が検出された。
また、ネガティブモードのMS/MS分析により（ｉ）から硫酸基が２個取れた２価イオンから、１価の硫酸イオン（分子量97）、フコースと２分子の硫酸とナトリウムが結合したものから水素イオンが取れた１価イオン（分子量345）が検出された。
（エ）酵素反応生成物の糖組成の分析
上記質量分析の結果より（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、及び（ｉ）は分子内に不飽和ヘキスロン酸を含む可能性が極めて高いことが示唆された。
酵素反応生成物の分子内に不飽和結合のあるヘキスロン酸が存在することを証明するために以下の実験を行った。不飽和結合が分子内に存在すると230〜240nmに強い吸収があることが知られている。そこで、精製した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）の各オリゴ糖の水溶液の230〜240nmの吸光度を測定すると（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び（ｉ）の水溶液には強い吸収があり、分子内に不飽和結合があることが示唆された。また、本酵素によるフコイダンの分解反応の進行と共に230〜240nmの吸光度が増加することも確認されたので、本酵素はフコイダン中のマンノースとヘキスロン酸の間あるいは、ガラクトースとヘキスロン酸の間のグリコシド結合を脱離反応により切断することが強く示唆された。
酵素反応生成物のほとんどが非還元末端に不飽和ヘキスロン酸を持ち還元末端がマンノースであることから調製したフコイダンの中にはヘキスロン酸とマンノースが交互に並んだ分子種が存在することが示唆された。
フコイダンの構成糖の多くはフコースであるためフコイダンは一般の多糖より酸により分解され易い。一方、ヘキスロン酸やマンノースの結合は比較的酸に強いことが知られている。本発明者らはガゴメ昆布のフコイダンの分子内に存在するヘキスロン酸とマンノースが交互に結合している分子種中のヘキスロン酸の種類を明らかにするためにカーボハイドレート リサーチ（Carbohydrate Research）第125巻、第283−290頁、1984年の方法を参考にして、まずフコイダンを0.3Mのシュウ酸に溶解し100℃、３時間処理したものを分子量分画し、分子量が3000以上の画分を集め、さらに陰イオン交換樹脂により吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後4Nの塩酸で酸加水分解し、pH8に調整後、PA化し、HPLCによりウロン酸の分析を行った。なおHPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＮ（4.6mm ｘ 250mm）（宝酒造社製）
溶離液:200mM酢酸−トリエチルアミン緩衝液（pH7.3）：アセトニトリル＝25:75
検出：蛍光検出器Ｆ−1150（日立製作所製）にて励起波長320nm、蛍光波長400nmで検出。
流速:0.8ml/分
カラム温度:40℃
なお、PA化ヘキスロン酸の標準物質はグルクロン酸はシグマ社製、ガラクツロン酸は和光純薬社製、イズロン酸はシグマ社製の４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドを加水分解したもの、マンヌロン酸及びグルロン酸はアクタ・ケミカ・スカンヂナヴィカ（Acta Chemica Scandinavicaj、第15巻、第1397−1398頁、1961年記載の方法にしたがい、和光純薬製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分離したものをPA化することにより得た。
この結果、上記フコイダンの分子種中に含まれているヘキスロン酸はグルクロン酸のみであることが判明した。
さらに上記分子種の加水分解物中のグルクロン酸を陰イオン交換樹脂によりＤ−マンノースと分離し凍結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグルクロン酸はＤ−グルクロン酸であることが判明した。
また、ガゴメ昆布由来のフコイダンをあらかじめ本発明の第二の発明であるエンド型フコイダン分解酵素で処理したものについても上記と同様にシュウ酸で酸加水分解したが、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合したポリマーは検出されなかった。このことから、本発明の酵素が脱離反応により切断するフコイダンの分子種の骨格構造はＤ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を持つことが判明した。
さらに、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースのそれぞれの結合位置とグリコシド結合のアノメリック配置を調べるため、シュウ酸分解により得られたポリマーをNMR分析した。
ポリマーのNMRの測定結果を以下に示す。但し、1H−NMRでの化学シフト値はトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を1.13ppmに、13C−NMRではトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を9.32ppmとして表した。
1H−NMR（D2O）
δ5.25（1H,br−s,1−Ｈ）、4.32（1H,d,J＝7.6Hz,1′−Ｈ）、4.00（1H,br−s,2−Ｈ）、3.71（1H,m,5′−Ｈ）、3.69（1H,m,5−CHのＨ）、3.68（1H,m,3−Ｈ）、3.63（1H,m,5−CHのＨ）、3.63（1H,m,4′−Ｈ）、3.57（1H,m,4−Ｈ）、3.54（1H,m,3′−Ｈ）、3.53（1H,m,5−Ｈ）、3.25（1H,t,J＝8.5Hz,2′−Ｈ）
13C−NMR（D2O）
δ175.3（５′−COOHのＣ）、102.5（１′−Ｃ）、99.6（１−Ｃ）、78.5（２−Ｃ）、77.9（４′−Ｃ）、77.0（３′−Ｃ）、76.7（５′−Ｃ）、73.9（５−Ｃ）、73.7（２′−Ｃ）、70.6（３−Ｃ）、67.4（４−Ｃ）、61.0（５−CH2OHのＣ）
なお、ピークの帰属の番号は下記式（16）の通りである：
また、マンノースの１位の立体配置はその化学シフト値が5.25ppmであることからα−Ｄ−マンノースであると決定した。
構成糖の結合様式は1H検出異種核検出法であるHMBC法を用いて行った。
1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及びHOHAHA法を、13C−NMRの帰属にはHSQC法を用いた。
HMBCスペクトルにより１−Ｈと4'−Ｃの間及び4'−Ｈと１−Ｃの間、1'−Ｈと２−Ｃの間及び２−Ｈと1'−Ｃの間にそれぞれクロスピークが認められた。このことからＤ−グルクロン酸はβ結合でＤ−マンノースの２位に、Ｄ−マンノースはα結合でＤ−グルクロン酸の４位にそれぞれ結合していることが明らかとなった。
（オ）酵素反応生成物の糖結合様式及び硫酸基の結合位置の分析
構成糖および硫酸基の結合様式を調べるために酵素反応生成物を500MHzの核磁気共鳴装置JNM−α500型（日本電子製）によるNMRスペクトル分析に供した。この分析結果より（ａ）は前記式（７）、（ｂ）は前記式（８）、（ｃ）は前記式（９）、（ｄ）は前記式（10）、（ｅ）は前記式（11）、（ｆ）は前記式（12）、（ｇ）は前記式（13）、（ｈ）は前記式（14）、及び（ｉ）は前記式（15）で表されるものであることが判明した、すなわち（ａ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｂ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と２個の硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｃ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースにＤ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸にＤ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｄ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸機が２分子結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、Ｄ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つこと、（ｅ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸基が２分子結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、硫酸基が結合したＤ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに、硫酸基が２分子結合したＬ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つこと、（ｆ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｇ）は、還元末端残基であるＤ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＬ−フコースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｈ）は、硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−ガラクトースを起点に２本に分岐した構造を持ち、一方の糖鎖は、Ｄ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＬ−フコースに、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合しており、他方の糖鎖は、硫酸基が結合したＤ−ガラクトースに、硫酸基が結合したＤ−ガラクトースが結合した構造を持つこと、（ｉ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに硫酸基とＤ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸に、Ｄ−マンノースが結合し、さらにそのＤ−マンノースに、硫酸基が２個結合したＬ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸が結合した構造を持つことが判明した。
本発明の第２の発明であるエンド型フコイダン分解酵素をフコイダンに作用させることにより、本発明の第１の発明である糖化合物に含まれる化合物を得た。
下記に、本発明の第１の発明の糖化合物の例である式（７）、式（８）、式（９）、式（10）、式（11）、式（12）、式（13）、式（14）、及び式（15）で表される化合物、すなわち（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）の物性を示す。
図１、２、３、４、５、６、７、８、及び９には各ピリジル（−２−）アミノ化糖化合物（PA−ａ）、（PA−ｂ）、（PA−ｃ）、（PA−ｄ）、（PA−ｅ）、（PA−ｆ）、（PA−ｇ）、（PA−ｈ）、及び（PA−ｉ）、のHPLCの溶出パターンを示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。さらに図10に（ａ）の、図11に（ｂ）の、図12に（ｃ）の、図13に（ｄ）の、図14に（ｅ）の、図15に（ｆ）の、図16に（ｇ）の、図17に（ｈ）の、図18に（ｉ）のマススペクトルを示し、図19に（ａ）の、図20に（ｂ）の、図21に（ｃ）の、図22に（ｄ）の、図23に（ｅ）の、図24に（ｆ）の、図25に（ｇ）の、図26に（ｈ）の、図27に（ｉ）のマスマスのスペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％）、横軸はm/z値を示す。
更に図28は（ａ）の、図29は（ｂ）の、図30は（ｃ）の、図31は（ｄ）の、図32は（ｅ）の、図33は（ｆ）の、図34は（ｇ）の、図35は（ｈ）の、図36は（ｉ）の1H−NMRスペクトルを示し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ppm）を示す。
なお、1H−NMRでの化学シフト値はHODの化学シフト値を4.65ppmとして表した。
（ａ）の物性
分子量564
MS m/z 563［Ｍ−H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、157［不飽和Ｄ−グルクロン酸−H2O−H+］−、175［不飽和Ｄ−グルクロン酸−H+］−、225［Ｌ−フコース硫酸−H2O−H+］−、243［Ｌ−フコース硫酸−H+］−、319［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが結合したもの−H2O−H+］−、405［Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−H+］−、483［Ｍ−SO3−H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.78（1H,d,J＝3.7Hz,4″−Ｈ）、5.26（1H,d,J＝1.2Hz,1−Ｈ）、5.12（1H,d,J＝4.0Hz,1′−Ｈ）、5.03（1H,d,J＝6.1Hz,1″−Ｈ）、4.47（1H,d−d,J＝3.4,10.4Hz,3′−Ｈ）、4.21（1H,br−s,2−Ｈ）、4.12（1H,m,5′−Ｈ）、4.10（1H,d−d,J＝3.7,5.8Hz,3″−Ｈ）、4.03（（1H,d,J＝3.4Hz,4′−Ｈ）、3.86（1H,m,3−Ｈ）、3.83（1H,d−d,J＝4.0,10.4Hz,2′−Ｈ）、3.72（1H,m,4−Ｈ）、3.72（1H,m,5−Ｈ）、3.70（2H,m,5−CH2のH2）、3.65（1H,d−d,J＝5.8,6.1Hz,2″−Ｈ）、1.08（3H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−マンノース＝1:1:1（各分子）
硫酸基 １分子（Ｌ−フコースの３位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（17）の通りである。
分子量 724
MS m/z 723〔Ｍ−H+〕−、361〔Ｍ−2H+〕2-
MS/MS m/z 97〔HSO4〕−、175〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−H+〕−、243〔Ｌ−フコース硫酸−H+〕−、321〔Ｍ−SO3−2H+〕2-、405〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−2SO3−H+〕−、417〔Ｍ−Ｌ−フコース−2SO3−H+〕−
1H−NMR（D2O）
δ5.66（1H,d,J＝3.4Hz,4″−Ｈ）、5.27（1H,d,J＝7.3Hz,1″−Ｈ）、5.25（1H,d,J＝1.8Hz,1−Ｈ）、5.21（1H,d,J＝3.7Hz,1′−Ｈ）、4.50（1H,d,J＝3.1Hz,4′−Ｈ）、4.32（1H,q,J＝6.7Hz,5′−Ｈ）、4.27（1H,d−d,J＝3.7,10.4Hz,2′−Ｈ）、4.21（1H,d−d,J＝3.4,6.7Hz,3″−Ｈ）、4.18（（1H,d−d,J＝1.8,11.0Hz,5−CHのＨ）、4.15（1H,br−s,2−Ｈ）、4.10（1H,d−d,J＝5.8,11.0Hz、５−CHのＨ）、3.99（1H,d−d,J＝3.1,10.4Hz、３′−Ｈ）、3.90（1H,m,5−Ｈ）、3.82（1H,m,3−Ｈ）、3.82（1H,m,4−Ｈ）、3.54（1H,br−t,J＝7.3Hz,2″−Ｈ）、1.11（3H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−マンノース＝1:1:1（各１分子）
硫酸基 ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及びＤ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（18）の通りである。
分子量 1128
MS m/z 1127〔Ｍ−H+〕−
MS/MS m/z 97〔HSO4〕−、175〔不飽和Ｄ−ヘキスロン酸−H+〕−、225〔Ｌ−フコース硫酸−H2O−H+〕−、243〔Ｌ−フコース硫酸−H+〕−、371〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｌ−フコース−SO3−2H+〕2-、405〔硫酸化Ｌ−フコースとＤ−マンノースが結合したもの−H+〕−、721〔Ｍ−Ｄ−マンノース−Ｌ−フコース−SO3−H2O−H+〕−
1H−NMR（D2O）
δ5.69（1H,d,J＝3.7Hz,（４）″−Ｈ）、5.34（1H,s,（１）−Ｈ）、5.16（1H,s,1−Ｈ）、5.10（1H,d,J＝4.0Hz,（１）′−Ｈ）、5.05（1H,d,J＝3.7Hz、１′−Ｈ）、4.93（1H,d,J＝6.4Hz,（１）″−Ｈ）、4.50（1H,d−d,J＝3.4,10.7Hz、３′−Ｈ）、4.47（1H,d−d,J＝3.4,10.4Hz,（３）′−Ｈ）、4.39（1H,d,J＝7.9Hz,1″−Ｈ）、4.33（1H,br−s,（２）−Ｈ）、4.14（1H,m,2−Ｈ）、4.12（1H,m,（３）″−Ｈ）、4.12（1H,m,5′−Ｈ）、4.12（1H,m,（５）′−Ｈ）、4.04（1H,m,4′−Ｈ）、4.03（1H,m,（４）′−Ｈ）、3.85（1H,m,2′−Ｈ）、3.85（1H,m,（２）′−Ｈ）、3.82（1H,m,3−Ｈ）、3.82（1H,m,（３）−Ｈ）、3.73（1H,m,4−Ｈ）、3.73（1H,m,5−Ｈ）、3.73（1H,m,（４）−Ｈ）、3.70（2H,m,5−CH2のH2）、3.70（2H,m,（５）−CH2のH2）、3.67（1H,m,5″−Ｈ）、3.62（1H,m,4″−Ｈ）、3.62（1H,m,（２）″−Ｈ）、3.62（1H,m,（５）−Ｈ）、3.51（1H,t,J＝8.9Hz,3″−Ｈ）、3.28（1H,t,J＝7.9Hz,2″−Ｈ）、1.09（3H,d,J＝6.7Hz,（５）′−CH3のH3）、1.07（1H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−グルクロン酸:D−マンノース＝2:1:1:2（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基 ２分子（各Ｌ−フコースの３位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（19）の通りである。
分子量 1062
MS m/z 1061［Ｍ−H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、175［不飽和ヘキスロン酸−H+］−、225［Ｌ−フコースと硫酸−H2O−Ｈ］−、243［Ｌ−フコース硫酸−H+］−、405［Ｌ−フコースとＤ−マンノースと硫酸基が結合したもの−H+］−、450［Ｍ−2SO3−2H+］2-、490［Ｍ−SO3−2H+］2-
1H−NMR（D2O）
δ5.67（1H,d,J＝3.7Hz,（４）″−Ｈ）、5.32（1H,br−s,（１）−Ｈ）、5.17（1H,d,J＝3.5Hz,1′−Ｈ）、5.17（1H,br−s,1−Ｈ）、4.93（1H,d,J＝6.4Hz,（１）″−Ｈ）、4.71（1H,m,1″−Ｈ）、4.53（1H,d,J＝3.4Hz,4′−Ｈ）、4.33（1H,q,J＝6.7Hz,5′−Ｈ）、4.28（1H,d−d,J＝3.5,11.0Hz,2′−Ｈ）、4.18（1H,m,5−CH2のＨ）、4.13（1H,m,（２）−Ｈ）、4.12（1H,m,（３）″−Ｈ）、4.08（1H,m,5−CH3のＨ）、4.07（1H,m,2−Ｈ）、3.98（1H,d−d,J＝3.4,11.0,3′−Ｈ）、3.88（1H,m,5−Ｈ）、3.82（1H,m,4″−Ｈ）、3.78（1H,m,3−Ｈ）、3.78（1H,m,4−Ｈ）、3.78（1H,m,（３）−Ｈ）、3.67（2H,m,（５）−CH2のH2）、3.63（1H,m,（２）″−Ｈ）、3.60（1H,m,3″−Ｈ）、3.59（1H,m,5″−Ｈ）、3.57（1H,m,（４）−Ｈ）、3.57（1H,m,（５）−Ｈ）、3.16（1H,t,J＝7.9Hz,2″−Ｈ）、1.10（3H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−グルクロン酸:D−マンノース＝1:1:1:2（Ｌ−フコースと不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子とＤ−マンノース２分子）
硫酸基 ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及び還元性末端側のＤ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（20）の通りである。
分子量 1448
MS m/z 767［Ｍ＋4Na−6H+］2-503.7［Ｍ＋3Na−6H+］3-366.5［Ｍ＋Na−5H+］4-
MS/MS m/z 97［HSO4］−、225［Ｌ−フコース硫酸−H2O−H+］−、243［Ｌ−フコース硫酸−H+］−、345［Ｌ−フコースジ硫酸＋Na−2H+］−、450［Ｍ＋3Na−2SO3−6H+］3-、477［Ｍ＋3Na−SO3−6H+］3-、563［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースとＬ−フコースと硫酸が結合したもの−H+］−、705［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース硫酸とＬ−フコースジ硫酸が結合したもの−H2O−H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.58（1H,d,J＝3.4Hz,（４）″−Ｈ）、5.35（1H,br−s,（１）−Ｈ）、5.22（1H,d,J＝6.7Hz,（１）″−Ｈ）、5.19（1H,d,J＝3.7Hz,1′−Ｈ）、5.19（1H,d,J＝3.7Hz,（１）′−Ｈ）、5.16（1H,d,J＝1.8Hz,1−Ｈ）、4.62（1H,d,J＝7.6Hz,1″−Ｈ）、4.50（1H,m,4′−Ｈ）、4.50（1H,m,（４）′−Ｈ）、4.30（1H,m,5′−Ｈ）、4.30（1H,m,（５）′−Ｈ）、4.30（1H,m,（５）−CH2のＨ）、4.25（1H,m,2′−Ｈ）、4.25（1H,m,（２）−Ｈ）、4.25（1H,m,（２）′−Ｈ）、4.20（1H,m,（５）−CH2のＨ）、4.18（1H,m,5−CH2のＨ）、4.16（1H,m,（３）″−Ｈ）、4.08（1H,m,5−CH2のＨ）、4.07（1H,m,2−Ｈ）、4.02（1H,m,3′−Ｈ）、4.02（1H,m,（３）′−Ｈ）、3.85（1H,m,5−Ｈ）、3.85（1H,m,（５）−Ｈ）、3.78（1H,m,3−Ｈ）、3.78（1H,m,（３）−Ｈ）、3.76（1H,m,4″−Ｈ）、3.76（1H,m,5″−Ｈ）、3.75（1H,m,4−Ｈ）、3.75（1H,m,（４）−Ｈ）、3.58（1H,m,3″−Ｈ）、3.55（1H,m,（２）″−Ｈ）、3.18（1H,t,J＝8.2Hz,2″−Ｈ）、1.10（3H,d,J＝6.7Hz,（５）′−CH3のH3）、1.09（3H,d,J＝6.7Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−グルクロン酸:D−マンノース＝2:1:1:2（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基 ６分子（各Ｌ−フコースの２位と４位及び各Ｄ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（21）の通りである。
分子量 644
MS m/z 687［Ｍ＋2Na−3H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、243［Ｌ−フコース硫酸−H+］−、421［不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース硫酸＋Na−H2O−2H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.60（1H,d,J＝3.4Hz,4″−Ｈ）、5.24（1H,br−s,1−Ｈ）、5.08（1H,d,J＝4.0Hz,1′−Ｈ）、4.94（1H,d,J＝6.7Hz,1″−Ｈ）、4.45（1H,d−d,J＝3.1,10.4Hz,3′−Ｈ）、4.20（1H,br−s,2−Ｈ）、4.14（2H,m,5−CH2のH2）、4.14（1H,m,5′−Ｈ）、4.09（1H,m,3″−Ｈ）、4.01（1H,d,J＝3.1Hz,4′−Ｈ）、3.91（1H,m,5−Ｈ）、3.85（1H,m,3−Ｈ）、3.85（1H,m,2′−Ｈ）、3.75（1H,t,J＝9.8Hz,4−Ｈ）、3.59（1H,t,J＝6.7Hz,2″−Ｈ）、1.06（3H,d,J＝6.4Hz,5′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−マンノース＝1:1:1（Ｌ−フコースとＤ−マンノースと不飽和Ｄ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基 ２分子（Ｌ−フコースの３位及びＤ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（22）の通りである。
分子量 632
MS m/z 631［Ｍ−H+］−
MS/MS m/z 405［Ｄ−ガラクトースとＬ−フコース硫酸が結合したもの−H+］−、551［Ｌ−フコース硫酸とＬ−フコースとＤ−ガラクトースが結合したもの−H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.15（1H,d,J＝4.3Hz,F11−Ｈ）、4.93（1H,d,J＝3.7Hz,F21−Ｈ）、4.53（1H,d−d,J＝2.4,10.4Hz,F13−Ｈ）、4.49（1H,d,J＝7.6Hz G11−Ｈ）、4.46（1H,d−d,J＝3.1,10.7Hz,F23−Ｈ）、4.36（1H,q,J＝6.7Hz F25−Ｈ）、4.14（1H,q,J＝6.7Hz F15−Ｈ）、4.09（1H,d,J＝2.4Hz F14−Ｈ）、4.03（1H,d,J＝3.1Hz F24−Ｈ）、3.97（1H,d−d,J＝4.3,10.4Hz,F12−Ｈ）、3.90（1H,br−ｓ、G14−Ｈ）、3.81（1H,d−d,J＝3.7,10.7Hz,F22−Ｈ）、3.59（1H,m,G13−Ｈ）、3.59（1H,m,G15−Ｈ）、3.59（2H,m,G15−CH2のH2）、3.56（1H,m、G12−Ｈ）、1.19（3H,d,J＝6.7Hz,F15−CH3のH3）、1.14（3H,d,J＝6.7Hz,F25−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース:D−ガラクトース＝2:1（Ｌ−フコース２分子とＤ−ガラクトース１分子）
硫酸基 ２分子（各Ｌ−フコースの３位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（23）の通りである。
分子量 1358
MS m/z 1445［Ｍ＋4Na−5H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、225［Ｌ−フコース硫酸−H2O−H+］−、1197［Ｍ−2SO3−H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.19（1H,d,J＝4.3Hz,F11−Ｈ）、4.93（1H,d,J＝3.7Hz,F21−Ｈ）、4.62（1H,m,G21−Ｈ）、4.59（1H,m,G11−Ｈ）、4.54（1H,d−d,J＝2.7,10.6Hz,F13−Ｈ）、4.46（1H,m,F23−Ｈ）、4.46（1H,d,J＝7.6Hz G31−Ｈ）、4.41（1H,br−s,G14−Ｈ）、4.41（1H,d,J＝7.6Hz,G41−Ｈ）、4.37（1H,q,J＝6.4Hz F25−Ｈ）、4.27（1H,m,G13−Ｈ）、4.24（1H,br−s,G34−Ｈ）、4.21（1H,m,G33−Ｈ）、4.19（1H,m,G43−Ｈ）、4.15（1H,br−s,G44−Ｈ）、4.13（1H,q,J＝6.7Hz,F15−Ｈ）、4.09（1H,d,J＝2.7Hz,F14−Ｈ）、4.04（1H,d,J＝2.8Hz,F24−Ｈ）、3.98（1H,m,G15−CH2のＨ）、3.96（1H,d−d,J＝4.3,10.6Hz,F12−Ｈ）、3.88（1H,br−ｓ、G24−Ｈ）、3.93（1H,m,G35−CH2のＨ）、3.86（1H,m,G15−Ｈ）、3.81（1H,m,F22−Ｈ）、3.81（1H,m,G15−CH2のＨ）、3.80（1H,m,G35−Ｈ）、3.80（1H,m,G35−CH2のＨ）、3.66（1H,m,G23−Ｈ）、3.65（1H,m,G12−Ｈ）、3.64（1H,m、G25−CH2のＨ）、3.64（1H,m,G45−CH2のＨ）、3.61（1H,m,G45−Ｈ）、3.58（1H,m,G22−Ｈ）、3.56（1H,m,G25−CH2のＨ）、3.56（1H,m,G45−CH2のＨ）、3.55（1H,m,G42−Ｈ）、3.54（1H,m,G25−Ｈ）、3.54（1H,m,G32−Ｈ）、1.20（3H,d,J＝6.7Hz,F15−CH3のH3）、1.14（3H,d,J＝6.4Hz,F25−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース:D−ガラクトース＝1:2（Ｌ−フコース２分子とＤ−ガラクトース４分子）
硫酸基 ５分子（各Ｌ−フコースの３位、還元性末端のＤ−ガラクトースの３位、及び還元性末端のＤ−ガラクトースの６位に結合したＤ−ガラクトースの３位、及びそのＤ−ガラクトースの６位に結合したＤ−ガラクトースの３位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（24）の通りである。
分子量 1288
MS m/z 1149［Ｍ＋Na−2SO3−2H+］−
MS/MS m/z 97［HSO4］−、345［Ｌ−フコースジ硫酸＋Na−2H+］−
1H−NMR（D2O）
δ5.68（1H,d,J＝3.4Hz,（４）″−Ｈ）、5.34（1H,br−s,（１）−Ｈ）、5.19（1H,m,1−Ｈ）、5.19（1H,m,（１）′−Ｈ）、4.94（1H,m,1′−Ｈ）、4.94（1H,d,J＝6.4Hz,（１）″−Ｈ）、4.72（1H,d,J＝7.9Hz,1″−Ｈ）、4.54（1H,m,（４）′−Ｈ）、4.48（1H,d−d,J＝3.3,10.6Hz,3′−Ｈ）、4.38（1H,q,J＝6.4Hz,5′−Ｈ）、4.34（1H,q,J＝6.7Hz,（５）′−Ｈ）、4.29（1H,m,（２）′−Ｈ）、4.20（1H,m,5−CH2のＨ）、4.14（1H,m,（２）−Ｈ）、4.13（1H,m,（３）″−Ｈ）、4.09（1H,m,5−CH2のＨ）、4.08（1H,m,2−Ｈ）、4.05（1H,d,J＝3.3Hz,4′−Ｈ）、3.99（1H,m、（３）′−Ｈ）、3.89（1H,m,5−Ｈ）、3.83（1H,m,4″−Ｈ）、3.81（1H,m,2′−Ｈ）、3.80（1H,m,4−Ｈ）、3.78（1H,m,3−Ｈ）、3.78（1H,m,（３）−Ｈ）、3.68（2H,m,（５）−CH2のH2）、3.62（1H,m,（２）″−Ｈ）、3.60（1H,m,3″−Ｈ）、3.60（1H,m,5″−Ｈ）、3.58（1H,m,（５）−Ｈ）、3.56（1H,m,（４）−Ｈ）、3.17（1H,t,J＝7.9Hz,2″−Ｈ）、1.15（3H,d,J＝6.4Hz,5′−CH3のH3）、1.11（3H,d,J＝6.7Hz,（５）′−CH3のH3）
糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸:D−グルクロン酸:D−マンノース＝2:1:1:2（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸基 ４分子（還元性末端のＤ−マンノースに結合したＬ−フコースの３位ともう一方のＬ−フコースの２位と４位及び還元性末端側のＤ−マンノースの６位）
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（25）の通りである。
本発明の第３の発明である菌株としては、フコイダノバクター属に属する本発明の菌株であればいかなる菌株でも良く、該菌株の具体例としては、例えば、フコイダノバクター・マリナス（Fucoidanobacter marinus）SI−0098株が挙げられる。
本菌株は青森県の海水中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
2.フコイダノバクター マリナス SI−0098
a.形態的性質
（１）本菌は球〜短桿菌であり、時に双球菌の形態をとることがある。
幅 0.5〜0.7μｍ
長さ 0.5〜0.7μｍ
（２）胞子の有無 なし
（３）グラム染色性 陰性
b.生理的性質
（１）生育の温度範囲
37℃で生育できる。好適な生育温度は15〜28℃である。
（２）酸素に対する態度 好気性
（３）カタラーゼ 陽性
（４）オキシダーゼ 陰性
（５）ウレアーゼ 陰性
（６）加水分解
デンプン 陽性
ゼラチン 陰性
カゼイン 陰性
エスクリン 陽性
（７）硝酸塩の還元 陰性
（８）インドールの生成 陰性
（９）硫化水素の生成 陽性
（10）ミルクの凝固 陰性
（11）ナトリウムの要求性 陽性
（12）塩類要求性
０％食塩培地での生育 陰性
１％食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
（13）キノン系 メナキノン７
（14）菌体内DNAのGC含量 61％
（15）細胞壁のジアミノピメリン酸 陰性
（16）グリコリル試験 陰性
（17）ヒドロキシ脂肪酸の存在 陽性
（18）OF−テスト Ｏ
（19）集落の色調 特徴的な集落色素を生成せず
（20）運動性 あり
（21）滑走性 なし
（22）鞭毛 極単毛
本菌株は、バージーズ マニュアル オブ ディターミネイティブ バクテリオロジー、第９巻（1994）記載の基本分類によればグループ４（グラム陰性好気性かん菌及び球菌）に分類される。しかしながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、GC含量が61％の点でグループ４に属する菌と大いに異なる。基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にユビキノンを有し、グラム陽性細菌はメナキノンを有している。
グラム陰性細菌であるフラボバクテリウム属及びシトファーガ（Cytophaga）属は例外的に電子伝達鎖にメナキノンを有しているが、これらの属に属する細菌のGC含量は、土壌細菌であるシトファーガ アーベンシコラ（Cytophaga arvensicola）が43〜46％、海洋細菌であるシトファーガ ジフルエンス（Cytophaga diffluens）、シトファーガ ファーメンタンス（Cytophaga fermentans）、シトファーガ マリーナ（Cytophaga marina）、及びシトファーガ ウリギノーサ（Cytophaga uliginosa）が42％であり、本菌株の性質とは全く異なる。更に、本菌株と既同定株の16SrDNA配列の相同性を比較したところ、最も相同性の高い既同定株ベルコミクロビウム スピノサム（Verrucomicrobium spinosum）においてもその相同性は、76.6％であった。16SrDNA配列の相同性が90％以下の場合、両細菌の属が異なることは一般に広く知られていることから、本発明者らは、本菌株は既存の属に属さない新属の細菌であると断定し、よって本菌株をフコイダノバクター マリナス SI−0098と命名した。
なお、上記菌株は、Fucoidanobacter marinus SI−0098と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）〕にFERM BP−5403（原寄託日；平成７年３月29日、国際寄託日への移管請求日；平成８年２月15日）として寄託されている。
本発明の第３の発明であるフコイダノバクター属細菌を培養し、その菌体抽出物、又は培養液上清をフコイダンに作用させることにより、本発明の第１の発明の糖化合物を遊離させることができる。培養する菌株としては、フコイダノバクター属に属し、その菌体抽出物又は培養液上清をフコイダンに作用させた場合、本発明の第１の発明である糖化合物が得られる菌株であればいかなる菌株でも良く、該菌株の具体例としては、例えば、Fucoidanobacter marimus SI−0098株が挙げられる。
フコイダノバクター属細菌株の培地に加える栄養源は該菌株が利用し、該菌株がフコイダンから本発明の第１の発明である糖化合物の生成が可能な菌体内抽出物及び培養上清を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。
本発明の第３の発明であるフコイダノバクター属細菌を培養するに当り、一般に培養温度は、15℃〜30℃、培地のpHは５〜９がよく、５〜72時間の通気かくはん培養で、該菌株の菌体内抽出物及び培養上清のエンド型フコイダン分解酵素活性は最大に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成に応じ、該菌株が生産する菌体内抽出物及び培養上清のエンド型フコイダン分解活性が最大になるように設定することは当然のことである。
フコイダノバクター属 SI−0098株を適当な培地で培養し、培養終了後、遠心分離すれば菌体及び培養液上清が得られる。更に得られた菌体を通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波破砕後、遠心分離すれば菌体抽出液が得られる。
限外ろ過により濃縮した培養液上清又は菌体抽出液を塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液と混合し、これにフコイダンを加え、反応させる。
反応終了後、反応液を分子量分画用のカラムを用いて分画することにより本発明の第１の発明である糖化合物を得ることができる。
本発明の第１の発明である糖化合物は糖鎖工学用試薬として有用であり、特公平５−65108号記載の方法によりPA化を行い、PA化物を調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質が提供される。更に本発明の糖化合物は抗ガン剤、癌転移抑制剤、抗ウィルス剤としての生理活性の適用が期待される。本発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の第１の発明である糖化合物の例の製造方法を実施例をもって示すが本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１
フラボバクテリウムsp.SA−0082（FERM BP−5402）を、グルコース0.1％、ペプトン1.0％、酵母エキス0.05％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地600mlを分注して殺菌した（120℃、20分）２リットルの三角フラスコに接種し、24℃で20時間培養して種培養液とした。ガゴメ昆布由来のフコイダン0.3％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.01％、及び消泡剤（信越化学工業製KM70）0.01％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地20リットルを30リットル容のジャーファーメンターに入れ120℃で20分殺菌した。冷却後、上記の種培養液600mlを接種し、24℃で20時間、毎分10リットルの通気量と毎分125回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液1ml当り６ミリユニットの活性が検出された。
一方、本培養で得られた菌体を、200mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地1ml中に20mUの活性が検出された。
上記の培養液上清の濃縮液に、終濃度が90％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）で十分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したDEAE−セファロースFFのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、50mMから600mMの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が4Mとなるように食塩を加え、あらかじめ4Mの食塩を含む20mMのリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したフェニルセファロース CL−4Bのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、4Mから1Mの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器（アミコン社製）で濃縮後、あらかじめ50mM食塩を含む10mMリン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−200でゲルろ過を行い活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が3.5Mとなるように食塩を加え、あらかじめ3.5Mの食塩を含む10mMリン酸緩衝液（pH8）で平衡化したフェニルセファロースHPのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で洗浄後、3.5Mから1.5Mの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めて精製酵素を得た。この酵素の分子量をセファクリルＳ−200の保持時間から求めたところ約７万であった。以上の精製工程を表１に示す。
フラボバクテリウムsp.SA−0082（FERM BP−5402）をグルコース0.25％、ペプトン1.0％、酵母エキス0.05％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地600mlを分注して殺菌した（120℃、20分）２リットルの三角フラスコに接種し、24℃で24時間培養して種培養液とした。グルコース0.25％、ペプトン1.0％、酵母エキス0.05％、及び消泡剤（信越化学工業製KM70）0.01％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地20リットルを30リットル容のジャーファーメンターに入れ120℃で20分殺菌した。冷却後、上記の種培養液600mlを接種し、24℃で24時間、毎分10リットルの通気量と毎分125回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液1ml当り1mUの活性が検出された。
一方、本培養で得られた菌体を、200mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地1ml中に5mUの活性が検出された。
本抽出液に、終濃度が90％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）で十分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ50mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したDEAE−セファロースFFのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、50mMから600mMの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が4Mとなるように食塩を加え、あらかじめ4Mの食塩を含む20mMのリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したフェニルセファロースCL−4Bのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、4Mから1Mの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ50mM食塩を含む10mMリン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−300でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分子量をセファクリルＳ−300の保持時間から求めたところ約46万であった。次にこの活性画分に25mMの食塩を含む10mMのリン酸緩衝液（pH7）で透析した。この酵素液を、あらかじめ250mMの食塩を含む10mMのリン酸緩衝液（pH7）で平衡化したモノ（Mono）Ｑ HR5/5のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、250mMから450mMの食塩のグラジエントに溶出させ、活性画分を集め、精製酵素を得た。以上の精製工程を表２に示す。
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例１で得られたエンド型フコイダン分解酵素（菌体内酵素）を作用させ分解物の調製を行った。
すなわち、2.5％のフコイダン溶液16mlと、50mMのリン酸緩衝液（pH7.5）12mlと4Mの塩化ナトリウム4mlと32mU/mlの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液8mlを混合し、25℃で48時間反応させた。
反応液をセルロファインGCL−300（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量2000以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーG3（旭化成社製）により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより３つの画分に分離した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ41mg、69mg、及び9.6mg得た。
実施例４
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例２で得られたエンド型フコイダン分解酵素（菌体外酵素）を作用させ分解物の調製を行った。
すなわち、2.5％のフコイダン溶液16mlと、50mMのリン酸緩衝液（pH7.5）12mlと4Mの塩化ナトリウム4mlと32mU/mlの本発明のエンド型フコイダン分解酵素溶液8mlを混合し、25℃で48時間反応させた。
反応液をセルロファインGCL−300（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量2000以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーG3（旭化成社製）により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより３つの画分を分離し、凍結乾燥した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ40mg、65mg、及び9.2mg得た。
実施例５
フコイダノバクター マリナス SI−0098株（FERM BP−5403）を、ガゴメ昆布由来のフコイダン0.3％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.05％、及び消泡剤（信越化学工業製KM70）0.01％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）pH7.5からなる培地600mlを２リットル容の三角フラスコに入れ120℃で20分殺菌した培地に接種し、25℃で48時間、毎分120回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清液を得た。
この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、本発明のエンド型フコイダン分解酵素を測定したところ培養液1ml当り0.2mU活性が検出された。
一方、本培養で得られた菌体を、200mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中の本発明のエンド型フコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地1ml中に20mUの活性が検出された。
実施例６
精製したガゴメ昆布由来のフコイダンに本発明の実施例５で得られたフコイダノバクター マリナス SI−0098株の菌体内酵素を作用させ分解物の調製を行った。
すなわち、2.5％のフコイダン溶液16mlと、800mMの塩化ナトリウムを含む100mMのリン酸緩衝液（pH8.0）20mlと20mU/mlの本発明の実施例５で得られたフコイダノバクター マリナスSI−0098株の菌体内酵素溶液4mlを混合し、25℃で48時間反応させた。
反応液をセルロファインGCL−300のカラムにより分子量画分し、分子量2000以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーG3により脱塩後、DEAE−セファロースFFにより３つの画分に分離し、凍結乾燥した。この結果前記した物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をそれぞれ38mg、60mg、及び8.2mg得た。
本発明により、フコイダンの構造解析、フコイダンの酵素分解物の同定、及び生物活性の検索に用いることができる糖化合物、フコイダンの部分分解及びフコイダンオリゴ糖の生産などフコイダンに関する研究に有用な新規なエンド型のフコイダン分解酵素及び糖化合物の製造に有用な新規微生物が提供された。
Claims (10)
- 下記一般式（１）：
〔式中、ＸはＨ又は下記式（２）：
で表される基を示し、ＹはＨ又は下記式（３）、若しくは（４）：
で表される基を示すが、ＸとＹが共にＨであることはない。また、Ｚはアルコール性水酸基または硫酸エステルされたアルコール性水酸基を示す〕
で表される糖化合物又はその塩。 - 下記式（７）で表される糖化合物又はその塩。
- 下記式（８）で表される糖化合物又はその塩。
- 下記式（９）で表される糖化合物又はその塩。
- 下記式（10）で表される糖化合物又はその塩。
- 下記式（11）で表される糖化合物又はその塩。
- 下記式（12）で表される糖化合物又はその塩。
- 下記式（15）で表される糖化合物又はその塩。
- 下記の理化学的性質を有することを特徴とするエンド型フコイダン分解酵素。
（Ｉ）作用：フコイダンに作用して、少なくとも前記式（７）及び式（８）で表される化合物を遊離させる。
（II）至適pH:本酵素の至適pHは６から10である。
（III）至適温度：本酵素の至適温度は30から40℃である。
（IV）pH安定性：本酵素はpH6〜11.5の間で安定である。
（Ｖ）分子量：本酵素の分子量はゲルろ過法により約７万または約46万である。 - 電子伝達鎖にメナキノンを有し、GC含量が約60％である、フコイダノバクター属に属する細菌（FERM BP−5403）。
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