JP3497817B2 - 硫酸化フコガラクタン分解酵素 - Google Patents
硫酸化フコガラクタン分解酵素Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖工学用試薬と
して有用な硫酸化フコガラクタン、該硫酸化多糖由来低
分子化物、及びその製造方法、さらに糖鎖工学分野にお
いて有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、該酵素の製
造方法に関する。
して有用な硫酸化フコガラクタン、該硫酸化多糖由来低
分子化物、及びその製造方法、さらに糖鎖工学分野にお
いて有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、該酵素の製
造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】褐藻類には何種類もの硫酸化フコース含
有多糖が含まれている。例えば、フコースと硫酸基の
みからなる硫酸化フカン、グルクロン酸、マンノー
ス、フコース及び硫酸基を含有する硫酸化フコグルクロ
ノマンナン、例えばWO97/26896公報に記載の
フコース硫酸含有多糖−U(構成糖及びそのモル比がフ
コース:マンノース:ガラクトース:ウロン酸:硫酸基
=約10:7:4:5:20、以下、U−フコイダンと
称す)、フコース、ガラクトースよりなる硫酸化フコ
ガラクタン、例えば、WO97/26896公報に記載
のフコース硫酸含有多糖−F(構成糖及びそのモル比が
フコース:ガラクトース=約10:1、以下、F−フコ
イダンと称す)等の硫酸化フコース含有多糖が知られて
いる。これらの硫酸化フコース含有多糖は、おおよそ総
て高分子の陰イオンであるため、様々な精製工程におい
て理化学的に同じ挙動を取り、分離が困難であった。そ
のため褐藻類の硫酸化フコース含有多糖はそれぞれ分離
されることなく、そのまま生物活性が調べられることが
多く、見出された生物活性を担うのがどの硫酸化フコー
ス含有多糖であるのかを決定することは困難であった。
有多糖が含まれている。例えば、フコースと硫酸基の
みからなる硫酸化フカン、グルクロン酸、マンノー
ス、フコース及び硫酸基を含有する硫酸化フコグルクロ
ノマンナン、例えばWO97/26896公報に記載の
フコース硫酸含有多糖−U(構成糖及びそのモル比がフ
コース:マンノース:ガラクトース:ウロン酸:硫酸基
=約10:7:4:5:20、以下、U−フコイダンと
称す)、フコース、ガラクトースよりなる硫酸化フコ
ガラクタン、例えば、WO97/26896公報に記載
のフコース硫酸含有多糖−F(構成糖及びそのモル比が
フコース:ガラクトース=約10:1、以下、F−フコ
イダンと称す)等の硫酸化フコース含有多糖が知られて
いる。これらの硫酸化フコース含有多糖は、おおよそ総
て高分子の陰イオンであるため、様々な精製工程におい
て理化学的に同じ挙動を取り、分離が困難であった。そ
のため褐藻類の硫酸化フコース含有多糖はそれぞれ分離
されることなく、そのまま生物活性が調べられることが
多く、見出された生物活性を担うのがどの硫酸化フコー
ス含有多糖であるのかを決定することは困難であった。
【0003】現在までに活性と分子の相関関連が知られ
ているのは、アグリカルチュラルアンド バイオロジカ
ル ケミストリー (Agricultural and Biological Che
mistry )、第44巻、第8号、第1965頁〜第196
6頁(1980)記載の抗凝血作用を担う硫酸化フカン
画分、WO97/26896公報記載の癌細胞に対する
アポトーシス誘発作用を担うU−フコイダンである。
ているのは、アグリカルチュラルアンド バイオロジカ
ル ケミストリー (Agricultural and Biological Che
mistry )、第44巻、第8号、第1965頁〜第196
6頁(1980)記載の抗凝血作用を担う硫酸化フカン
画分、WO97/26896公報記載の癌細胞に対する
アポトーシス誘発作用を担うU−フコイダンである。
【0004】硫酸化フカン画分の抗凝血作用に関して
は、ヘパリンの代わりに使用することが検討されてき
た。しかし、薬品として使用する場合、予期せぬ活性す
なわち副作用を防ぐためにも、高純度の硫酸化フカンを
得る必要があり、その方法が求められていた。
は、ヘパリンの代わりに使用することが検討されてき
た。しかし、薬品として使用する場合、予期せぬ活性す
なわち副作用を防ぐためにも、高純度の硫酸化フカンを
得る必要があり、その方法が求められていた。
【0005】同様に、U−フコイダンに関しても癌細胞
に対するアポトーシス誘発作用を利用した薬品類を調製
するために高純度のフコース硫酸含有多糖−Uを簡便に
得る必要があり、その方法が求められていた。
に対するアポトーシス誘発作用を利用した薬品類を調製
するために高純度のフコース硫酸含有多糖−Uを簡便に
得る必要があり、その方法が求められていた。
【0006】一般的に、多糖の構造解析やオリゴ糖の製
造に酵素分解を利用する方法は、最も効率良い方法であ
る。また、分離が困難な多糖の混合物から一種類の多糖
だけを除去する際にも、除去したい多糖を特異的に分解
する酵素があれば、その多糖をその酵素で低分子化した
後、限外ろ過等の分子量分画を行うことにより容易にそ
の他の多糖と分離することができる。
造に酵素分解を利用する方法は、最も効率良い方法であ
る。また、分離が困難な多糖の混合物から一種類の多糖
だけを除去する際にも、除去したい多糖を特異的に分解
する酵素があれば、その多糖をその酵素で低分子化した
後、限外ろ過等の分子量分画を行うことにより容易にそ
の他の多糖と分離することができる。
【0007】硫酸化フコガラクタンに関して、硫酸化フ
コガラクタンを特異的に分解する酵素があれば、硫酸化
フコガラクタンの構造解析、硫酸化フコガラクタンオリ
ゴ糖の製造が容易である。
コガラクタンを特異的に分解する酵素があれば、硫酸化
フコガラクタンの構造解析、硫酸化フコガラクタンオリ
ゴ糖の製造が容易である。
【0008】以上のことから硫酸化フコガラクタン分解
酵素、及び酵素的に製造した硫酸化フコガラクタンオリ
ゴ糖を得る方法が求められていた。
酵素、及び酵素的に製造した硫酸化フコガラクタンオリ
ゴ糖を得る方法が求められていた。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明の目的
は、(1)糖鎖工学用試薬あるいは肝細胞増殖因子(he
patocyte growth factor;HGF)産生誘導物質として
有用な硫酸化フコガラクタン又はその塩、(2)該硫酸
化フコガラクタンに硫酸化フコガラクタン分解酵素を作
用させて得られる低分子化物又はその塩、(3)糖鎖工
学的に有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、(4)硫
酸化フコガラクタン又はその塩に該酵素を作用させて得
られる低分子化物の製造方法、及び(5)硫酸化フコガ
ラクタン分解酵素の製造方法を提供することにある。
は、(1)糖鎖工学用試薬あるいは肝細胞増殖因子(he
patocyte growth factor;HGF)産生誘導物質として
有用な硫酸化フコガラクタン又はその塩、(2)該硫酸
化フコガラクタンに硫酸化フコガラクタン分解酵素を作
用させて得られる低分子化物又はその塩、(3)糖鎖工
学的に有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、(4)硫
酸化フコガラクタン又はその塩に該酵素を作用させて得
られる低分子化物の製造方法、及び(5)硫酸化フコガ
ラクタン分解酵素の製造方法を提供することにある。
【0010】
【課題を解決するための手段】本願の発明者らは鋭意研
究の結果、褐藻類に含まれる硫酸化フコガラクタン、該
硫酸化多糖を分解する硫酸化フコガラクタン分解酵素及
びその製造方法を見出した。さらに、糖鎖工学用試薬と
して利用できる硫酸化フコガラクタンの低分子化物及び
その製造方法を見出し、本発明を完成させた。
究の結果、褐藻類に含まれる硫酸化フコガラクタン、該
硫酸化多糖を分解する硫酸化フコガラクタン分解酵素及
びその製造方法を見出した。さらに、糖鎖工学用試薬と
して利用できる硫酸化フコガラクタンの低分子化物及び
その製造方法を見出し、本発明を完成させた。
【0011】本発明の第1の発明は、下記の理化学的性
質を有することを特徴とする硫酸化フコガラクタン又は
その塩に関する。該硫酸化フコガラクタンは、構成糖と
してガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が
1:1〜6:1であり、下記一般式(XI)で表される
硫酸化糖を構成糖の必須成分とする。
質を有することを特徴とする硫酸化フコガラクタン又は
その塩に関する。該硫酸化フコガラクタンは、構成糖と
してガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が
1:1〜6:1であり、下記一般式(XI)で表される
硫酸化糖を構成糖の必須成分とする。
【化5】
(式中、RはH又はSO3Hである)
【0012】さらに、本発明の硫酸化フコガラクタン分
解酵素により低分子化され、下記一般式(I)〜(I
V)で表される化合物より選択される1種以上の化合物
が生成する。
解酵素により低分子化され、下記一般式(I)〜(I
V)で表される化合物より選択される1種以上の化合物
が生成する。
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
(式中、RはH又はSO3Hである)
【0013】本発明の第2の発明は、下記一般式(I
I)、(III’)又は(IV)から選択される化学構
造を有する糖化合物またはその塩に関する。
I)、(III’)又は(IV)から選択される化学構
造を有する糖化合物またはその塩に関する。
【化10】
【化11】
【化12】
(式中、RはH又はSO3Hである)
【0014】本発明の第3の発明は、下記の理化学的性
質を有することを特徴とする硫酸化フコガラクタン分解
酵素に関する。該酵素は、構成糖としてガラクトースと
フコースを含有し、そのモル比が1:1〜6:1である
硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フ
コガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラ
クトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成さ
せることができ、至適pHは、約7〜9の範囲であり、
至適温度は、約25〜45℃である。
質を有することを特徴とする硫酸化フコガラクタン分解
酵素に関する。該酵素は、構成糖としてガラクトースと
フコースを含有し、そのモル比が1:1〜6:1である
硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フ
コガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラ
クトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成さ
せることができ、至適pHは、約7〜9の範囲であり、
至適温度は、約25〜45℃である。
【0015】本発明の第4の発明は、上記第3の発明に
記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を褐藻類由来の硫
酸化フコガラクタン又はその塩に作用させて取得するこ
とを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物又は
その塩の製造方法に関する。該酵素によって得られる低
分子化物は、例えば、上記第2の発明に記載のオリゴ糖
又はその塩が挙げられる。
記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を褐藻類由来の硫
酸化フコガラクタン又はその塩に作用させて取得するこ
とを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物又は
その塩の製造方法に関する。該酵素によって得られる低
分子化物は、例えば、上記第2の発明に記載のオリゴ糖
又はその塩が挙げられる。
【0016】本発明の第5の発明は、硫酸化フコガラク
タン分解酵素生産能を有するフラボバクテリウム属細菌
を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴
とする上記第3の発明に記載の硫酸化フコガラクタン分
解酵素の製造方法に関する。
タン分解酵素生産能を有するフラボバクテリウム属細菌
を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴
とする上記第3の発明に記載の硫酸化フコガラクタン分
解酵素の製造方法に関する。
【0017】
【発明の実施の形態】以下本発明に関して具体的に説明
する。褐藻類に属する海藻には複数種の硫酸化フコース
含有多糖が含まれている。その分子種としては、硫酸化
フカン及び硫酸化フコグルクロノマンナン等や他にも何
種類もの分子種が報告されている。
する。褐藻類に属する海藻には複数種の硫酸化フコース
含有多糖が含まれている。その分子種としては、硫酸化
フカン及び硫酸化フコグルクロノマンナン等や他にも何
種類もの分子種が報告されている。
【0018】本発明の硫酸化フコガラクタンとは、構成
糖として主にガラクトースとフコースを含有し、そのモ
ル比が1:1〜6:1であり、以下、本発明の硫酸化フ
コガラクタンあるいはG−フコイダンと称し、例えば、
2:1の硫酸化フコガラクタンが例示される。また、平
均分子量は、例えば、HPLCゲルろ過法で約13万
(分子量分布は、約10万〜約20万)の硫酸化多糖で
ある。なお、上記硫酸化フコガラクタンの分子量、糖組
成、及び硫酸基含量は、該硫酸化フコガラクタンの原料
の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により
異なり、また硫酸化フコガラクタンの抽出時の加熱条
件、pH条件等により異なる。例えば、酸により該硫酸
化フコガラクタンは加水分解される場合がある。従っ
て、本明細書に記載した硫酸化フコガラクタンの分子
量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量はその1
例にすぎず、該硫酸化フコガラクタンの抽出処理条件に
より、その分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸
基含量は容易に変化させ得る。例えば、本明細書に記載
のフコース硫酸含有多糖−U分解酵素及びフコース硫酸
含有多糖−F分解酵素を用いて本発明の硫酸化フコガラ
クタンを調製する場合、例えば上記の糖組成と分子量を
示す本発明の硫酸化フコガラクタンが得られる。すなわ
ち、調製方法の条件によって任意の分子量、分子量分
布、糖組成、あるいは硫酸基含量の硫酸化フコガラクタ
ンを調製することができる。例えば、本発明の硫酸化フ
コガラクタンの主要な構成糖は、6糖あたりおよそ5残
基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合
している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカ
リあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性や
アルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸含量は減
少するものである。すなわち、本発明の硫酸化フコガラ
クタンから意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸
の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や
時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整すること
ができる。従って、本発明の硫酸化フコガラクタンは、
前述の特徴を備えた硫酸化フコガラクタンもしくは、本
発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化される
硫酸化フコガラクタンであればすべての褐藻類由来のも
のを包含する。
糖として主にガラクトースとフコースを含有し、そのモ
ル比が1:1〜6:1であり、以下、本発明の硫酸化フ
コガラクタンあるいはG−フコイダンと称し、例えば、
2:1の硫酸化フコガラクタンが例示される。また、平
均分子量は、例えば、HPLCゲルろ過法で約13万
(分子量分布は、約10万〜約20万)の硫酸化多糖で
ある。なお、上記硫酸化フコガラクタンの分子量、糖組
成、及び硫酸基含量は、該硫酸化フコガラクタンの原料
の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により
異なり、また硫酸化フコガラクタンの抽出時の加熱条
件、pH条件等により異なる。例えば、酸により該硫酸
化フコガラクタンは加水分解される場合がある。従っ
て、本明細書に記載した硫酸化フコガラクタンの分子
量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量はその1
例にすぎず、該硫酸化フコガラクタンの抽出処理条件に
より、その分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸
基含量は容易に変化させ得る。例えば、本明細書に記載
のフコース硫酸含有多糖−U分解酵素及びフコース硫酸
含有多糖−F分解酵素を用いて本発明の硫酸化フコガラ
クタンを調製する場合、例えば上記の糖組成と分子量を
示す本発明の硫酸化フコガラクタンが得られる。すなわ
ち、調製方法の条件によって任意の分子量、分子量分
布、糖組成、あるいは硫酸基含量の硫酸化フコガラクタ
ンを調製することができる。例えば、本発明の硫酸化フ
コガラクタンの主要な構成糖は、6糖あたりおよそ5残
基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合
している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカ
リあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性や
アルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸含量は減
少するものである。すなわち、本発明の硫酸化フコガラ
クタンから意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸
の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や
時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整すること
ができる。従って、本発明の硫酸化フコガラクタンは、
前述の特徴を備えた硫酸化フコガラクタンもしくは、本
発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化される
硫酸化フコガラクタンであればすべての褐藻類由来のも
のを包含する。
【0019】本発明の硫酸化フコガラクタンの主骨格
は、下記一般式(XII)に表される。下記一般式にお
いて、nは、1以上の整数であり、例えば、1〜100
0の範囲、さらに好ましくは1〜500の範囲のものが
本発明の硫酸化フコガラクタンに含まれる。また、本発
明の硫酸化フコガラクタンには、上記範囲であれば、下
記一般式(XII)が連続的に繰り返した構造をもつも
の及び他の構造が介在して、非連続的に下記一般式(X
II)が含有される構造をもつもののいずれもが含まれ
る。
は、下記一般式(XII)に表される。下記一般式にお
いて、nは、1以上の整数であり、例えば、1〜100
0の範囲、さらに好ましくは1〜500の範囲のものが
本発明の硫酸化フコガラクタンに含まれる。また、本発
明の硫酸化フコガラクタンには、上記範囲であれば、下
記一般式(XII)が連続的に繰り返した構造をもつも
の及び他の構造が介在して、非連続的に下記一般式(X
II)が含有される構造をもつもののいずれもが含まれ
る。
【化13】
(式中、RはH又はSO3Hである)
【0020】本発明の硫酸化フコガラクタンが由来する
褐藻類は、特に限定されるものではないが例えば、ガゴ
メ昆布、ワカメ、マ昆布、アラメ、カジメ、クロメ、レ
ッソニアニグレセンス、ジャイアントケルプ、ダービリ
ア(durvillaea)由来のものを調製することができる。
特に限定はないが、例えば、ガゴメ昆布由来フコイダン
には、U−フコイダン、F−フコイダン及び本発明のG
−フコイダンが含まれている。
褐藻類は、特に限定されるものではないが例えば、ガゴ
メ昆布、ワカメ、マ昆布、アラメ、カジメ、クロメ、レ
ッソニアニグレセンス、ジャイアントケルプ、ダービリ
ア(durvillaea)由来のものを調製することができる。
特に限定はないが、例えば、ガゴメ昆布由来フコイダン
には、U−フコイダン、F−フコイダン及び本発明のG
−フコイダンが含まれている。
【0021】本発明の硫酸化フコガラクタンの塩として
は、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えば
ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩、カルシウ
ム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、亜鉛等の
遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が挙げられる。
は、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えば
ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩、カルシウ
ム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、亜鉛等の
遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が挙げられる。
【0022】本明細書において硫酸化フコガラクタン低
分子化物とは、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発明
の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られる
オリゴ糖であり、還元性末端糖が硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースである。
分子化物とは、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発明
の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られる
オリゴ糖であり、還元性末端糖が硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースである。
【0023】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素と
は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用して該硫酸化
フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガ
ラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成
させる。また、WO97/26896公報には、フコー
ス硫酸含有多糖−Fを分解するエンド型フコース硫酸含
有多糖分解酵素が記載されているが、該酵素は、本発明
の硫酸化フコガラクタンを分解しない。また、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素は、本発明の硫酸化フコ
ガラクタンのD−硫酸化ガラクトースあるいはガラクト
ースとD−硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースの
間のβ1−6結合及びβ1−4結合をエンド的に分解す
る酵素である。
は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用して該硫酸化
フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガ
ラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成
させる。また、WO97/26896公報には、フコー
ス硫酸含有多糖−Fを分解するエンド型フコース硫酸含
有多糖分解酵素が記載されているが、該酵素は、本発明
の硫酸化フコガラクタンを分解しない。また、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素は、本発明の硫酸化フコ
ガラクタンのD−硫酸化ガラクトースあるいはガラクト
ースとD−硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースの
間のβ1−6結合及びβ1−4結合をエンド的に分解す
る酵素である。
【0024】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
基質となる本発明の硫酸化フコガラクタンを製造する際
にはまず、褐藻類から硫酸化フコース含有多糖画分を得
てから本発明の硫酸化フコガラクタンを精製する方法が
簡便である。例えば、硫酸化フコース含有多糖画分の製
造にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際
の硫酸化フコース含有多糖の低分子化を防ぐためには、
pHは4〜9、温度は100℃以下の抽出が好ましい。
基質となる本発明の硫酸化フコガラクタンを製造する際
にはまず、褐藻類から硫酸化フコース含有多糖画分を得
てから本発明の硫酸化フコガラクタンを精製する方法が
簡便である。例えば、硫酸化フコース含有多糖画分の製
造にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際
の硫酸化フコース含有多糖の低分子化を防ぐためには、
pHは4〜9、温度は100℃以下の抽出が好ましい。
【0025】当該抽出液からアルギン酸を除くには、酸
性処理によるアルギン酸の等電点沈殿を利用する方法、
カルシウム塩等、アルギン酸と沈殿を形成する塩を添加
する方法、アルギン酸分解酵素により分解する方法等が
ある。また、アミノ酸やマンニトール等の低分子を除く
には限外ろ過を用いれば効率良く除去できる。疎水性物
質の除去には活性炭処理なども有効である。
性処理によるアルギン酸の等電点沈殿を利用する方法、
カルシウム塩等、アルギン酸と沈殿を形成する塩を添加
する方法、アルギン酸分解酵素により分解する方法等が
ある。また、アミノ酸やマンニトール等の低分子を除く
には限外ろ過を用いれば効率良く除去できる。疎水性物
質の除去には活性炭処理なども有効である。
【0026】このようにして硫酸化フコース含有多糖の
混合物を得ることができる。この混合物から本発明の硫
酸化フコガラクタンを製造する際には、硫酸化フコース
含有多糖の混合物に、WO97/26896公報にエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素として記載のフコー
ス硫酸含有多糖−F分解酵素及びWO97/26896
公報にエンド型フコイダン分解酵素として記載のフコー
ス硫酸含有多糖−U分解酵素を作用させた後に、低分子
画分を限外ろ過法で除去し、本発明の硫酸化フコガラク
タンを調製すれば良い。
混合物を得ることができる。この混合物から本発明の硫
酸化フコガラクタンを製造する際には、硫酸化フコース
含有多糖の混合物に、WO97/26896公報にエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素として記載のフコー
ス硫酸含有多糖−F分解酵素及びWO97/26896
公報にエンド型フコイダン分解酵素として記載のフコー
ス硫酸含有多糖−U分解酵素を作用させた後に、低分子
画分を限外ろ過法で除去し、本発明の硫酸化フコガラク
タンを調製すれば良い。
【0027】こうして得られた硫酸化フコガラクタンに
は硫酸化フコガラクタン以外の何種類かの硫酸化フコー
ス含有多糖が含まれる場合があるが、例えば、陰イオン
交換樹脂を用いて分離精製することにより、本発明の硫
酸化フコガラクタンを単離することができる。この方法
によれば、硫酸化フコース含有多糖の混合物を直接陰イ
オン交換樹脂により分離する方法と比べて樹脂量も少な
くて済み、上記2種の硫酸化フコース含有多糖の混入が
ないため、分離が格段に向上する。
は硫酸化フコガラクタン以外の何種類かの硫酸化フコー
ス含有多糖が含まれる場合があるが、例えば、陰イオン
交換樹脂を用いて分離精製することにより、本発明の硫
酸化フコガラクタンを単離することができる。この方法
によれば、硫酸化フコース含有多糖の混合物を直接陰イ
オン交換樹脂により分離する方法と比べて樹脂量も少な
くて済み、上記2種の硫酸化フコース含有多糖の混入が
ないため、分離が格段に向上する。
【0028】前述の方法で得られた本発明の硫酸化フコ
ガラクタンは本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を
精製する際の活性測定用基質、あるいは本発明の硫酸化
フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料としても使用でき
る。また、硫酸化フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料
としては、上記の硫酸化フコース含有多糖の混合物を使
用してもよい。
ガラクタンは本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を
精製する際の活性測定用基質、あるいは本発明の硫酸化
フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料としても使用でき
る。また、硫酸化フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料
としては、上記の硫酸化フコース含有多糖の混合物を使
用してもよい。
【0029】本発明の酵素の製造に使用される菌株とし
ては、本発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する酵
素を産生する菌であれば特に限定はないが例えば、WO
97/26896公報記載のフラボバクテリウム (Flav
obacterium ) sp. SA−0082株 (通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所[日本国茨城県つく
ば市東1丁目1番3号(郵便番号305−8566)]
に平成7年(1995年)3月29日よりFERM P
−14872として寄託され、前記通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所にFERM BP−5402
[国際寄託への移管請求日:平成8年(1996年)2
月15日]として寄託)が好適に使用できる。上記菌株
はグラム染色性、DNAのGC含量、主要キノン系等の
菌学的性質から、フラボバクテリウム属であると考えら
れた。一方、最近の分類基準に16SrDNAの塩基配
列が考慮されていることが多いため、本発明者らも本細
菌の16SrDNAの塩基配列についてインターネット
National Center for Biotechnology Information (NCB
I)のAdvanced BLAST searchでホモロジー検索を行っ
た。
ては、本発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する酵
素を産生する菌であれば特に限定はないが例えば、WO
97/26896公報記載のフラボバクテリウム (Flav
obacterium ) sp. SA−0082株 (通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所[日本国茨城県つく
ば市東1丁目1番3号(郵便番号305−8566)]
に平成7年(1995年)3月29日よりFERM P
−14872として寄託され、前記通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所にFERM BP−5402
[国際寄託への移管請求日:平成8年(1996年)2
月15日]として寄託)が好適に使用できる。上記菌株
はグラム染色性、DNAのGC含量、主要キノン系等の
菌学的性質から、フラボバクテリウム属であると考えら
れた。一方、最近の分類基準に16SrDNAの塩基配
列が考慮されていることが多いため、本発明者らも本細
菌の16SrDNAの塩基配列についてインターネット
National Center for Biotechnology Information (NCB
I)のAdvanced BLAST searchでホモロジー検索を行っ
た。
【0030】上記塩基配列と相同性の高い遺伝子を持つ
細菌を検索したところ、全域に渡って相同性が最も高い
ものは、ポーラリバクター フィラメンタス(Polariba
cterfilamentus)で、その相同性は1424塩基にわた
って89%であった。その他の細菌では全域にわたって
相同性が高いものはなかった。なお、比較的相同性の高
いものとしては、ポーラリバクター イルジェンシー
(Polaribacter irgensii、1360塩基にわたって8
9%の相同性)、サイトファーガ スピーシーズ(Cyto
phaga sp.、1249塩基にわたって92%の相同
性)、フレキシバクター マリティムス(Flexibacter
maritimus、1247塩基にわたって91%の相同性)
等があった。一般的に16SrDNAの塩基配列の相同
性が90%以下の場合、同属の細菌と判断できないた
め、本細菌は、遺伝子学的分類には既知の細菌と同じ属
に帰属しないことが考えられた。即ち、本細菌の菌学的
性質がサイトファーガ(Cytophaga)目に属するフラボ
バクテリウム(Flavobacterium)属細菌とほぼ一致する
こと及び本細菌の16SrDNAの塩基配列について相
同性が高い上記4菌株が総て、サイトファーガ目細菌で
あることなどから、本細菌は、サイトファーガ目に属す
る新規細菌であると考えられる。なお、本明細書に記載
のフラボバクテリウム属細菌には、菌学的性質から分類
されるフラボバクテリウム属細菌及び遺伝子学的分類に
おいて相同性のあるサイトファーガ目細菌も含まれる。
従って、サイトファーガ目に属する細菌を培養して本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する場合は、
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方法に含
まれる。
細菌を検索したところ、全域に渡って相同性が最も高い
ものは、ポーラリバクター フィラメンタス(Polariba
cterfilamentus)で、その相同性は1424塩基にわた
って89%であった。その他の細菌では全域にわたって
相同性が高いものはなかった。なお、比較的相同性の高
いものとしては、ポーラリバクター イルジェンシー
(Polaribacter irgensii、1360塩基にわたって8
9%の相同性)、サイトファーガ スピーシーズ(Cyto
phaga sp.、1249塩基にわたって92%の相同
性)、フレキシバクター マリティムス(Flexibacter
maritimus、1247塩基にわたって91%の相同性)
等があった。一般的に16SrDNAの塩基配列の相同
性が90%以下の場合、同属の細菌と判断できないた
め、本細菌は、遺伝子学的分類には既知の細菌と同じ属
に帰属しないことが考えられた。即ち、本細菌の菌学的
性質がサイトファーガ(Cytophaga)目に属するフラボ
バクテリウム(Flavobacterium)属細菌とほぼ一致する
こと及び本細菌の16SrDNAの塩基配列について相
同性が高い上記4菌株が総て、サイトファーガ目細菌で
あることなどから、本細菌は、サイトファーガ目に属す
る新規細菌であると考えられる。なお、本明細書に記載
のフラボバクテリウム属細菌には、菌学的性質から分類
されるフラボバクテリウム属細菌及び遺伝子学的分類に
おいて相同性のあるサイトファーガ目細菌も含まれる。
従って、サイトファーガ目に属する細菌を培養して本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する場合は、
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方法に含
まれる。
【0031】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
製造方法に使用する菌株の培地は、使用する菌株が代謝
し、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する
ものであればよく、炭素源としては例えば硫酸化フコガ
ラクタン、硫酸化フコース含有多糖の混合物、海藻粉
末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコー
ス、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マル
トース等が利用でき、窒素源としては、ペプトン、酵母
エキス、肉エキス等が好適に使用できる。また、本菌株
は、上記栄養素を含んだ海水あるいは人工海水中で非常
に良く生育する。
製造方法に使用する菌株の培地は、使用する菌株が代謝
し、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する
ものであればよく、炭素源としては例えば硫酸化フコガ
ラクタン、硫酸化フコース含有多糖の混合物、海藻粉
末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコー
ス、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マル
トース等が利用でき、窒素源としては、ペプトン、酵母
エキス、肉エキス等が好適に使用できる。また、本菌株
は、上記栄養素を含んだ海水あるいは人工海水中で非常
に良く生育する。
【0032】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
生産菌を培養するに当たり、生産量は培養条件により変
動するが、培養温度は15〜30℃、培地のpHは6〜
9がよく、5〜72時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸
化フコガラクタン分解酵素の生産量は最高に達する。培
養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明の硫
酸化フコガラクタン分解酵素の生産量が最大になる様に
設定するのは当然のことである。また、当該硫酸化フコ
ガラクタン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在
する。
生産菌を培養するに当たり、生産量は培養条件により変
動するが、培養温度は15〜30℃、培地のpHは6〜
9がよく、5〜72時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸
化フコガラクタン分解酵素の生産量は最高に達する。培
養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明の硫
酸化フコガラクタン分解酵素の生産量が最大になる様に
設定するのは当然のことである。また、当該硫酸化フコ
ガラクタン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在
する。
【0033】上記のフラボバクテリウム sp.SA−
0082を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常
用いられる細胞破砕手段、例えば、超音波処理等で菌体
を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出
液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得
ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロ
マト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製
を行い、実質的に他の硫酸化フコース含有多糖分解酵素
を含まない純化された本発明の硫酸化フコガラクタン分
解酵素を得ることができる。また、上述の培養液から菌
体を除去した培養上清中にも本酵素が大量に存在するの
で、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することが
できる。
0082を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常
用いられる細胞破砕手段、例えば、超音波処理等で菌体
を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出
液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得
ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロ
マト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製
を行い、実質的に他の硫酸化フコース含有多糖分解酵素
を含まない純化された本発明の硫酸化フコガラクタン分
解酵素を得ることができる。また、上述の培養液から菌
体を除去した培養上清中にも本酵素が大量に存在するの
で、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することが
できる。
【0034】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
理化学的性質は以下の通りである。 (I)作用:構成糖としてガラクトースとフコースを
含有し、そのモル比が1:1〜6:1である硫酸化フコ
ガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタ
ンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる。 (II)至適pH:本酵素の至適pHは約7〜9付近に
ある(図1)。すなわち図1は本酵素の反応時のpHと
相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性
(%)、横軸はpHを示す。 (III)至適温度:本酵素の至適温度は約25〜45
℃付近にある(図2)。すなわち図2は、本酵素の反応
時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は
相対活性(%)、横軸は温度(℃)を示す。
理化学的性質は以下の通りである。 (I)作用:構成糖としてガラクトースとフコースを
含有し、そのモル比が1:1〜6:1である硫酸化フコ
ガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタ
ンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる。 (II)至適pH:本酵素の至適pHは約7〜9付近に
ある(図1)。すなわち図1は本酵素の反応時のpHと
相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性
(%)、横軸はpHを示す。 (III)至適温度:本酵素の至適温度は約25〜45
℃付近にある(図2)。すなわち図2は、本酵素の反応
時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は
相対活性(%)、横軸は温度(℃)を示す。
【0035】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
確認は、例えば、該酵素を硫酸化フコガラクタンに作用
させて得られる分解物をHPLCにより分析し、低分子
化の程度を測定することによって、あるいは生成する還
元末端を常法により測定することによって行なうことが
できる。活性測定は、産生菌の細胞抽出液もしくはクロ
マト精製後の酵素液のいずれにおいても可能である。
確認は、例えば、該酵素を硫酸化フコガラクタンに作用
させて得られる分解物をHPLCにより分析し、低分子
化の程度を測定することによって、あるいは生成する還
元末端を常法により測定することによって行なうことが
できる。活性測定は、産生菌の細胞抽出液もしくはクロ
マト精製後の酵素液のいずれにおいても可能である。
【0036】本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化
物又はその塩は、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵
素を本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化
フコガラクタン含有物に作用させることによって調製す
ることができる。本発明の硫酸化フコガラクタン含有物
としては、例えば本発明の硫酸化フコガラクタンの部分
精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐
藻類の水性溶媒抽出物、もしくは褐藻類藻体が好適に使
用できる。
物又はその塩は、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵
素を本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化
フコガラクタン含有物に作用させることによって調製す
ることができる。本発明の硫酸化フコガラクタン含有物
としては、例えば本発明の硫酸化フコガラクタンの部分
精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐
藻類の水性溶媒抽出物、もしくは褐藻類藻体が好適に使
用できる。
【0037】本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは
該硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行
えばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン、
若しくは該硫酸化フコガラクタン含有物濃度はその最高
溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考
慮して選定すればよい。本発明の硫酸化フコガラクタン
の溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択す
ればよい。溶解液のpHは通常中性付近で、酵素反応は
通常30℃付近で行う。酵素量や反応時間等を調整する
ことによって、低分子化物の分子量を調整することもで
きる。次に低分子化物を分子量分画することによって、
更に均一な分子量分布の本発明の硫酸化フコガラクタン
の低分子化物を調製することができる。分子量分画は通
常よく使用されている方法を適用することができ、例え
ばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子
化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭
処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処
理、無菌処理、凍結乾燥処理をすることもできる。
該硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行
えばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン、
若しくは該硫酸化フコガラクタン含有物濃度はその最高
溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考
慮して選定すればよい。本発明の硫酸化フコガラクタン
の溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択す
ればよい。溶解液のpHは通常中性付近で、酵素反応は
通常30℃付近で行う。酵素量や反応時間等を調整する
ことによって、低分子化物の分子量を調整することもで
きる。次に低分子化物を分子量分画することによって、
更に均一な分子量分布の本発明の硫酸化フコガラクタン
の低分子化物を調製することができる。分子量分画は通
常よく使用されている方法を適用することができ、例え
ばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子
化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭
処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処
理、無菌処理、凍結乾燥処理をすることもできる。
【0038】本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化
物は、特に限定はないが、例えば本発明の硫酸化フコガ
ラクタンに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作
用させて得られる低分子化物として2糖類〜6糖類が挙
げられる。本発明の低分子化物中に存在する硫酸基の置
換位置は、調製方法によって変化するが、本発明の硫酸
化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られたもので
あれば、本発明の低分子化物に含まれる。該低分子化物
の化学構造は、例えば、下記一般式(I)〜(IV)に
示される。その中で、下記一般式(III)は、前述の
硫酸化フコガラクタンの構成単位であると考えられる。
物は、特に限定はないが、例えば本発明の硫酸化フコガ
ラクタンに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作
用させて得られる低分子化物として2糖類〜6糖類が挙
げられる。本発明の低分子化物中に存在する硫酸基の置
換位置は、調製方法によって変化するが、本発明の硫酸
化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られたもので
あれば、本発明の低分子化物に含まれる。該低分子化物
の化学構造は、例えば、下記一般式(I)〜(IV)に
示される。その中で、下記一般式(III)は、前述の
硫酸化フコガラクタンの構成単位であると考えられる。
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
(式中、RはH又はSO3Hである)
【0039】また、本発明の低分子化物は、硫酸基を分
子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形
成する。これらの本発明の硫酸化フコガラクタンの低分
子化物は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウ
ム及び/又はカリウム及び/又はカルシウム等の塩の形
態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス50
W(ダウケミカル社製)等の陽イオン交換樹脂を利用す
ることによって遊離の本発明の硫酸化フコガラクタンの
低分子化物に導くことが可能である。また、これらは、
更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩
に交換することができる。
子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形
成する。これらの本発明の硫酸化フコガラクタンの低分
子化物は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウ
ム及び/又はカリウム及び/又はカルシウム等の塩の形
態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス50
W(ダウケミカル社製)等の陽イオン交換樹脂を利用す
ることによって遊離の本発明の硫酸化フコガラクタンの
低分子化物に導くことが可能である。また、これらは、
更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩
に交換することができる。
【0040】本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化
物の塩としては、薬学的に許容される塩を用いることが
でき、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の
塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の
塩、亜鉛等の遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が
挙げられる。
物の塩としては、薬学的に許容される塩を用いることが
でき、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の
塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の
塩、亜鉛等の遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が
挙げられる。
【0041】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を
用いれば任意の硫酸化フコース含有多糖画分に含まれて
いる本発明の硫酸化フコガラクタンのみを低分子化させ
ることができるので、分子量分画と組み合わせることに
よって本発明の硫酸化フコガラクタンを選択的に除去す
ることが可能である。例えば、硫酸化フカン画分には抗
凝血活性、癌転移抑制活性、ウイルス感染抑制活性等様
々な生物活性があることが報告されている。これまで、
褐藻類から得られた硫酸化フカン画分には硫酸化フカン
及びその他の多糖類が含まれている。従って、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、
当該硫酸化フカン画分から硫酸化フコガラクタンを取り
除くことができ、その結果、高純度の硫酸化フカンを得
ることができる。
用いれば任意の硫酸化フコース含有多糖画分に含まれて
いる本発明の硫酸化フコガラクタンのみを低分子化させ
ることができるので、分子量分画と組み合わせることに
よって本発明の硫酸化フコガラクタンを選択的に除去す
ることが可能である。例えば、硫酸化フカン画分には抗
凝血活性、癌転移抑制活性、ウイルス感染抑制活性等様
々な生物活性があることが報告されている。これまで、
褐藻類から得られた硫酸化フカン画分には硫酸化フカン
及びその他の多糖類が含まれている。従って、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、
当該硫酸化フカン画分から硫酸化フコガラクタンを取り
除くことができ、その結果、高純度の硫酸化フカンを得
ることができる。
【0042】さらに例えば、硫酸化フコグルクロノマン
ナンには癌細胞に対するアポトーシス誘発作用があるこ
とが報告されている。従って、本発明の硫酸化フコガラ
クタン分解酵素を利用することにより、褐藻類から得た
硫酸化フコグルクロノマンナンに共雑する本発明の硫酸
化フコガラクタンを容易に取り除くことができ、その結
果、高純度の硫酸化フコグルクロノマンナンを簡便に得
ることができる。
ナンには癌細胞に対するアポトーシス誘発作用があるこ
とが報告されている。従って、本発明の硫酸化フコガラ
クタン分解酵素を利用することにより、褐藻類から得た
硫酸化フコグルクロノマンナンに共雑する本発明の硫酸
化フコガラクタンを容易に取り除くことができ、その結
果、高純度の硫酸化フコグルクロノマンナンを簡便に得
ることができる。
【0043】本発明の硫酸化フコガラクタンを除去する
方法としては、たとえば、本発明の硫酸化フコガラクタ
ン含有物が水系溶媒に溶けた溶液を調製する。本発明の
硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行え
ばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン含有
物濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作
性、酵素力価を考慮して選定すればよい。本発明の硫酸
化フコガラクタン溶解液としては水、緩衝液等より目的
に応じて選択すればよい。溶解液のpHは通常中性付近
が好ましい。次に本発明の硫酸化フコガラクタン含有物
溶液に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素もしくは
該酵素の固定化物、あるいは両方を添加して反応させ本
発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する。酵素反応
は通常30℃付近で行い、酵素量や反応時間等は、次工
程の分子量分画能に応じて適宜調整すればよい。その
後、分子量分画すれば、本発明の硫酸化フコガラクタン
の低分子化物を容易に除去された目的物を調製すること
ができる。分子量分画は、通常よく使用されている方法
を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画
膜を利用した限外ろ過法を使用すればよい。
方法としては、たとえば、本発明の硫酸化フコガラクタ
ン含有物が水系溶媒に溶けた溶液を調製する。本発明の
硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行え
ばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン含有
物濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作
性、酵素力価を考慮して選定すればよい。本発明の硫酸
化フコガラクタン溶解液としては水、緩衝液等より目的
に応じて選択すればよい。溶解液のpHは通常中性付近
が好ましい。次に本発明の硫酸化フコガラクタン含有物
溶液に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素もしくは
該酵素の固定化物、あるいは両方を添加して反応させ本
発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する。酵素反応
は通常30℃付近で行い、酵素量や反応時間等は、次工
程の分子量分画能に応じて適宜調整すればよい。その
後、分子量分画すれば、本発明の硫酸化フコガラクタン
の低分子化物を容易に除去された目的物を調製すること
ができる。分子量分画は、通常よく使用されている方法
を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画
膜を利用した限外ろ過法を使用すればよい。
【0044】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素
は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用するため、本
発明の硫酸化フコガラクタンの構造解析に用いることが
できる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させると、前
記一般式(I)〜(IV)に示される化学構造を有する
低分子化物が得られる。
は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用するため、本
発明の硫酸化フコガラクタンの構造解析に用いることが
できる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させると、前
記一般式(I)〜(IV)に示される化学構造を有する
低分子化物が得られる。
【0045】さらに本発明の硫酸化フコガラクタン分解
酵素を用いれば、本発明の硫酸化フコガラクタンを含有
する硫酸化フコース含有多糖から本発明の硫酸化フコガ
ラクタン成分を選択的に除去することができる。例え
ば、本発明の硫酸化フコガラクタン成分を除去した後の
高純度の硫酸化フカンもしくは硫酸化フコグルクロノマ
ンナンは、医薬品の原材料としても好適に使用できる。
酵素を用いれば、本発明の硫酸化フコガラクタンを含有
する硫酸化フコース含有多糖から本発明の硫酸化フコガ
ラクタン成分を選択的に除去することができる。例え
ば、本発明の硫酸化フコガラクタン成分を除去した後の
高純度の硫酸化フカンもしくは硫酸化フコグルクロノマ
ンナンは、医薬品の原材料としても好適に使用できる。
【0046】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素
は、WO97/26896号公報に記載のフコース硫酸
含有多糖−F分解酵素及び/又はWO97/26896
号公報記載のフコース硫酸含有多糖−U分解酵素と組み
合わせて使用することができる。特に限定はないが例え
ば、ガゴメ昆布からpH4〜9、100℃以下の温度で
抽出する方法で得た硫酸化フコース含有多糖の混合物を
上記フコース硫酸含有多糖−U分解酵素及び本発明の硫
酸化フコガラクタン分解酵素で処理すると下記一般式
(XIV)で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分と
し、その繰り返し構造を有する硫酸化多糖を得ることが
できる。下記一般式においてnは、1以上の整数であ
り、例えば、1〜10,000の範囲、さらに好ましく
は1〜5,000の範囲のものが得られる。
は、WO97/26896号公報に記載のフコース硫酸
含有多糖−F分解酵素及び/又はWO97/26896
号公報記載のフコース硫酸含有多糖−U分解酵素と組み
合わせて使用することができる。特に限定はないが例え
ば、ガゴメ昆布からpH4〜9、100℃以下の温度で
抽出する方法で得た硫酸化フコース含有多糖の混合物を
上記フコース硫酸含有多糖−U分解酵素及び本発明の硫
酸化フコガラクタン分解酵素で処理すると下記一般式
(XIV)で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分と
し、その繰り返し構造を有する硫酸化多糖を得ることが
できる。下記一般式においてnは、1以上の整数であ
り、例えば、1〜10,000の範囲、さらに好ましく
は1〜5,000の範囲のものが得られる。
【化18】
(式中、Rは、H又はOSO3Hである)
【0047】上記硫酸化多糖は、構成糖としてフコース
を含有する。例えば、抽出時の処理条件が、pH6〜
8、95℃ 2時間程度の場合は、平均分子量は約20
万(分子量分布は、約1万〜約100万)である。さら
に例えば、抽出時の処理条件が、pH6〜8、25℃
24時間程度の場合は、平均分子量は約1,300万
(分子量分布は、約10万〜約2,000万)である。
このように抽出条件によって平均分子量及び分子量分布
は異なってくる。しかしながら、いずれの抽出条件にお
いても得られる硫酸化多糖は、上記フコース硫酸含有多
糖−F分解酵素で低分子化される。なお、上記硫酸化多
糖の分子量及び硫酸基含量は、該硫酸化多糖の原料の収
穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異な
り、また抽出時の加熱条件、pH条件等により異なる。
例えば、酸により加水分解される場合がある。従って、
本明細書に記載した上記硫酸化多糖の分子量、分子量分
布あるいは硫酸基含量はその1例にすぎず、該硫酸化多
糖の抽出処理条件により、その分子量、分子量分布ある
いは硫酸基含量は容易に変化させ得る。すなわち、調製
方法の条件によって任意の分子量、分子量分布あるいは
硫酸基含量の上記硫酸化多糖を調製することができる。
例えば、上記硫酸化多糖の主要な構成糖は、7糖あたり
およそ12残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖に
エステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であ
り、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。
例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばそ
の硫酸含量は減少するものである。すなわち、上記硫酸
化多糖から意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸
の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や
時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整すること
ができる。
を含有する。例えば、抽出時の処理条件が、pH6〜
8、95℃ 2時間程度の場合は、平均分子量は約20
万(分子量分布は、約1万〜約100万)である。さら
に例えば、抽出時の処理条件が、pH6〜8、25℃
24時間程度の場合は、平均分子量は約1,300万
(分子量分布は、約10万〜約2,000万)である。
このように抽出条件によって平均分子量及び分子量分布
は異なってくる。しかしながら、いずれの抽出条件にお
いても得られる硫酸化多糖は、上記フコース硫酸含有多
糖−F分解酵素で低分子化される。なお、上記硫酸化多
糖の分子量及び硫酸基含量は、該硫酸化多糖の原料の収
穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異な
り、また抽出時の加熱条件、pH条件等により異なる。
例えば、酸により加水分解される場合がある。従って、
本明細書に記載した上記硫酸化多糖の分子量、分子量分
布あるいは硫酸基含量はその1例にすぎず、該硫酸化多
糖の抽出処理条件により、その分子量、分子量分布ある
いは硫酸基含量は容易に変化させ得る。すなわち、調製
方法の条件によって任意の分子量、分子量分布あるいは
硫酸基含量の上記硫酸化多糖を調製することができる。
例えば、上記硫酸化多糖の主要な構成糖は、7糖あたり
およそ12残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖に
エステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であ
り、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。
例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばそ
の硫酸含量は減少するものである。すなわち、上記硫酸
化多糖から意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸
の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や
時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整すること
ができる。
【0048】さらに、上記硫酸化フコガラクタン分解酵
素、フコース硫酸含有多糖−F分解酵素及びフコース硫
酸含有多糖−U分解酵素を組み合わせて使用することに
より新規硫酸化糖を取得することができる。また、前述
の3種類の分解酵素の組み合わせにより従来とは異なる
硫酸化糖の分類をすることができる。特に限定はない
が、例えば、上記ガゴメ昆布のような褐藻類由来の硫酸
化フコース含有多糖の混合物に作用させて、 フコース硫酸含有多糖−F分解酵素及びフコース硫酸
含有多糖−U分解酵素で分解されず、硫酸化フコガラク
タン分解酵素で分解される硫酸化糖画分(本発明の硫酸
化フコガラクタン); フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−
F分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖−U分
解酵素で分解される硫酸化糖画分; フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−
U分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖−F分
解酵素で分解される硫酸化糖画分; フコガラクタン分解酵素、フコース硫酸含有多糖−F
分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−U分解酵素で分解
されない硫酸化糖画分;をそれぞれ得ることができる。
これらの硫酸化糖画分は、本発明のフコガラクタン分解
酵素とフコース硫酸含有多糖−F分解酵素あるいはフコ
ース硫酸含有多糖−U分解酵素を組み合わせることによ
って初めて得られる。
素、フコース硫酸含有多糖−F分解酵素及びフコース硫
酸含有多糖−U分解酵素を組み合わせて使用することに
より新規硫酸化糖を取得することができる。また、前述
の3種類の分解酵素の組み合わせにより従来とは異なる
硫酸化糖の分類をすることができる。特に限定はない
が、例えば、上記ガゴメ昆布のような褐藻類由来の硫酸
化フコース含有多糖の混合物に作用させて、 フコース硫酸含有多糖−F分解酵素及びフコース硫酸
含有多糖−U分解酵素で分解されず、硫酸化フコガラク
タン分解酵素で分解される硫酸化糖画分(本発明の硫酸
化フコガラクタン); フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−
F分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖−U分
解酵素で分解される硫酸化糖画分; フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−
U分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖−F分
解酵素で分解される硫酸化糖画分; フコガラクタン分解酵素、フコース硫酸含有多糖−F
分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−U分解酵素で分解
されない硫酸化糖画分;をそれぞれ得ることができる。
これらの硫酸化糖画分は、本発明のフコガラクタン分解
酵素とフコース硫酸含有多糖−F分解酵素あるいはフコ
ース硫酸含有多糖−U分解酵素を組み合わせることによ
って初めて得られる。
【0049】本発明の硫酸化フコガラクタン又はその塩
は、成長因子産生誘導活性、特にHGF(hepatocyte gr
owth factor)産生誘導活性を有する。
は、成長因子産生誘導活性、特にHGF(hepatocyte gr
owth factor)産生誘導活性を有する。
【0050】部分肝切除を受けた肝臓は、速やかに再生
し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長
年不明であったが、劇症肝炎患者の血漿中にHGFが見
出され、その患者血漿から、単離、精製された(J.Cl
in.Invest.,88 414−419,1988)。さらに、ヒトH
GFのcDNAもクローニングされ、HGFの1次構造
も明らかにされた(Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,163 967-973,1989)。また、細胞の運動性を亢
進させるscatter factor(SF)およ
び、腫瘍細胞障害因子であるtumor cytoto
xic factor(TCF)とHGFが同一物質で
あることも明らかになった(Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 88 7001-7005,1991:Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,180 1151-1158,1991)。
し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長
年不明であったが、劇症肝炎患者の血漿中にHGFが見
出され、その患者血漿から、単離、精製された(J.Cl
in.Invest.,88 414−419,1988)。さらに、ヒトH
GFのcDNAもクローニングされ、HGFの1次構造
も明らかにされた(Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,163 967-973,1989)。また、細胞の運動性を亢
進させるscatter factor(SF)およ
び、腫瘍細胞障害因子であるtumor cytoto
xic factor(TCF)とHGFが同一物質で
あることも明らかになった(Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 88 7001-7005,1991:Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,180 1151-1158,1991)。
【0051】HGFは、肝細胞だけでなく胆管上皮細
胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞
の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や
血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形
成を誘導するなど、HGFは極めて多彩な生理活性を示
す多機能活性物質である。つまり、様々な臓器におい
て、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖を促
進、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を
行う。また、HGFは、肝細胞増殖作用、タンパク合成
促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎
障害の予防作用などを示す。これらのことからも、重症
肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞の治療薬として期待
されている。
胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞
の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や
血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形
成を誘導するなど、HGFは極めて多彩な生理活性を示
す多機能活性物質である。つまり、様々な臓器におい
て、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖を促
進、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を
行う。また、HGFは、肝細胞増殖作用、タンパク合成
促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎
障害の予防作用などを示す。これらのことからも、重症
肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞の治療薬として期待
されている。
【0052】またHGFのmRNAは、脳、腎臓、肺等
でも合成されており、肝実質細胞、腎細尿管細胞、表皮
細胞等に対しても増殖活性がある、中胚葉性細胞成長因
子である。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン又は
その塩は、肝細胞増殖因子の産生を誘導することによ
り、肝炎、重症肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞、慢
性腎炎、肺炎、創傷の治療剤又は予防剤の成分として有
用である。
でも合成されており、肝実質細胞、腎細尿管細胞、表皮
細胞等に対しても増殖活性がある、中胚葉性細胞成長因
子である。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン又は
その塩は、肝細胞増殖因子の産生を誘導することによ
り、肝炎、重症肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞、慢
性腎炎、肺炎、創傷の治療剤又は予防剤の成分として有
用である。
【0053】本発明の硫酸化フコガラクタン又はその塩
は、そのHGF産生誘導作用により、化粧料の有効成分
として使用することができ、例えばHGF産生誘導用化
粧料として有用であり、HGF産生誘導作用を有するバ
イオ化粧品が提供できる。
は、そのHGF産生誘導作用により、化粧料の有効成分
として使用することができ、例えばHGF産生誘導用化
粧料として有用であり、HGF産生誘導作用を有するバ
イオ化粧品が提供できる。
【0054】さらに、本発明の硫酸化フコガラクタン又
はその塩を含有する成長因子産生誘導用化粧品、例えば
HGF産生誘導用化粧品は、常法に従って製造すること
ができ、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パ
ック類、浴用剤、洗顔剤、浴用洗剤、毛髪剤、育毛剤又
は洗髪剤が挙げられる。
はその塩を含有する成長因子産生誘導用化粧品、例えば
HGF産生誘導用化粧品は、常法に従って製造すること
ができ、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パ
ック類、浴用剤、洗顔剤、浴用洗剤、毛髪剤、育毛剤又
は洗髪剤が挙げられる。
【0055】本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは
該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩
は、抗原として使用することができる。抗体の作製は、
常法により行われるが、例えば、本発明の硫酸化フコガ
ラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化
物又はそれらの塩をアジュバンドとともにウサギ等の動
物に免疫することによって、ポリクローナル抗体を調製
することができる。また、モノクローナル抗体は、抗原
を免疫して得られた抗体産生B細胞とメラノーマ細胞を
融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、この細胞を培養することによって調製することがで
きる。これらの抗体は、本発明の硫酸化フコガラクタン
若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれ
らの塩の精製に使用することができる。また、海藻中の
本発明の硫酸化フコガラクタンの同定に使用することが
できる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンを認識
する抗体を使用し、海藻抽出液中の本発明の硫酸化フコ
ガラクタン含量を容易に測定でき、高含有抽出液を効率
よく調製することが可能になる。さらに、本発明の硫酸
化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの
低分子化物又はそれらの塩を認識する抗体は、本発明の
硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタ
ンの低分子化物又はそれらの塩の受精阻害作用機作、ウ
イルス感染阻害機作、生体内での代謝等の解析等に有用
である。
該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩
は、抗原として使用することができる。抗体の作製は、
常法により行われるが、例えば、本発明の硫酸化フコガ
ラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化
物又はそれらの塩をアジュバンドとともにウサギ等の動
物に免疫することによって、ポリクローナル抗体を調製
することができる。また、モノクローナル抗体は、抗原
を免疫して得られた抗体産生B細胞とメラノーマ細胞を
融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、この細胞を培養することによって調製することがで
きる。これらの抗体は、本発明の硫酸化フコガラクタン
若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれ
らの塩の精製に使用することができる。また、海藻中の
本発明の硫酸化フコガラクタンの同定に使用することが
できる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンを認識
する抗体を使用し、海藻抽出液中の本発明の硫酸化フコ
ガラクタン含量を容易に測定でき、高含有抽出液を効率
よく調製することが可能になる。さらに、本発明の硫酸
化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの
低分子化物又はそれらの塩を認識する抗体は、本発明の
硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタ
ンの低分子化物又はそれらの塩の受精阻害作用機作、ウ
イルス感染阻害機作、生体内での代謝等の解析等に有用
である。
【0056】また、本発明の硫酸化フコガラクタン又は
その塩に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用
させて得られた低分子化物即ちオリゴ糖類は、糖鎖工学
用試薬として用いることができる。例えば、特公平5−
65108号公報記載の方法によりピリジル−(2)−
アミノ化(PA化)を行い、該低分子化物のPA化物を
調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を
提供することができる。
その塩に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用
させて得られた低分子化物即ちオリゴ糖類は、糖鎖工学
用試薬として用いることができる。例えば、特公平5−
65108号公報記載の方法によりピリジル−(2)−
アミノ化(PA化)を行い、該低分子化物のPA化物を
調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を
提供することができる。
【0057】
【実施例】以下に本発明を実施例をもって具体的に示す
が、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるもの
ではない。
が、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるもの
ではない。
【0058】実施例1 硫酸化フコガラクタンの調製
(1)硫酸化フコガラクタンを下記の工程により調製し
た。 乾燥ガゴメ昆布2Kgを穴径1mmのスクリーンを装着
したカッターミル(増幸産業社製)により破砕し、20
リットルの80%エタノール中で25℃、3時間攪拌後
ろ過、洗浄した。得られた残さを50mMの塩化カルシ
ウム、100mMの塩化ナトリウム、10%のエタノー
ル、及びWO97/26896公報記載のアルテロモナ
ス sp. SN−1009株(通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁
目1番3号(郵便番号305−8566)]に平成8年
(1996年)2月13日よりFERM P−1543
6として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERMBP−5747[国際寄託へ
の移管請求日:平成8年(1996年)11月15日]
として寄託)を培養し、該培養物から得られたフコース
硫酸含有多糖−F分解酵素を1U含む20リットルの3
0mMイミダゾール緩衝液(pH8.2)に懸濁し、2
5℃で2日攪拌すると高分子の硫酸化フコース含有多糖
による強い粘弾性が完全に消失したので低分子化した硫
酸化フコース含有多糖を除去するため、穴径32μmの
ステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残さを1
00mMの塩化ナトリウム、10%のエタノール、及び
4gのアルギン酸リアーゼK(ナガセ生化学工業製)を
含む40リットルのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.
6)に懸濁し、25℃、4日攪拌後、遠心分離し上清を
得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化
物を除去するため排除分子量10万のホロファイバーを
装着した限外ろ過機により2リットルに濃縮後、10%
のエタノールを含む100mMの塩化ナトリウムで溶液
交換した。この溶液に等量の400mM酢酸カルシウム
を添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しなが
ら、1Nの塩酸でpH2とした。生じた沈殿を遠心分離
により除去し、得られた上清を1Nの水酸化ナトリウム
によりpH8.0とした。この溶液を限外ろ過により1
リットルに濃縮後、100mMの塩化ナトリウムで溶液
交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去し
た。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清
に1Mとなるように塩化ナトリウムを加えて、1Mの塩
化ナトリウムで平衡化した3リットルのフェニルセルロ
ファインカラム(生化学工業製)にかけ、素通り画分を
集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、20mM
の塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾
燥物の重量は29.3gであった。
た。 乾燥ガゴメ昆布2Kgを穴径1mmのスクリーンを装着
したカッターミル(増幸産業社製)により破砕し、20
リットルの80%エタノール中で25℃、3時間攪拌後
ろ過、洗浄した。得られた残さを50mMの塩化カルシ
ウム、100mMの塩化ナトリウム、10%のエタノー
ル、及びWO97/26896公報記載のアルテロモナ
ス sp. SN−1009株(通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁
目1番3号(郵便番号305−8566)]に平成8年
(1996年)2月13日よりFERM P−1543
6として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERMBP−5747[国際寄託へ
の移管請求日:平成8年(1996年)11月15日]
として寄託)を培養し、該培養物から得られたフコース
硫酸含有多糖−F分解酵素を1U含む20リットルの3
0mMイミダゾール緩衝液(pH8.2)に懸濁し、2
5℃で2日攪拌すると高分子の硫酸化フコース含有多糖
による強い粘弾性が完全に消失したので低分子化した硫
酸化フコース含有多糖を除去するため、穴径32μmの
ステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残さを1
00mMの塩化ナトリウム、10%のエタノール、及び
4gのアルギン酸リアーゼK(ナガセ生化学工業製)を
含む40リットルのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.
6)に懸濁し、25℃、4日攪拌後、遠心分離し上清を
得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化
物を除去するため排除分子量10万のホロファイバーを
装着した限外ろ過機により2リットルに濃縮後、10%
のエタノールを含む100mMの塩化ナトリウムで溶液
交換した。この溶液に等量の400mM酢酸カルシウム
を添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しなが
ら、1Nの塩酸でpH2とした。生じた沈殿を遠心分離
により除去し、得られた上清を1Nの水酸化ナトリウム
によりpH8.0とした。この溶液を限外ろ過により1
リットルに濃縮後、100mMの塩化ナトリウムで溶液
交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去し
た。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清
に1Mとなるように塩化ナトリウムを加えて、1Mの塩
化ナトリウムで平衡化した3リットルのフェニルセルロ
ファインカラム(生化学工業製)にかけ、素通り画分を
集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、20mM
の塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾
燥物の重量は29.3gであった。
【0059】(2)上記の凍結乾燥物15gを400m
Mの塩化ナトリウム及びWO97/26896公報記載
のフラボバクテリウム sp.SA−0082(通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所[日本国茨城県
つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305−856
6)]に平成7年(1995年)3月29日よりFER
MP−14872として寄託され、前記通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP−54
02[国際寄託への移管請求日:平成8年(1996
年)2月15日]として寄託)を培養し、該培養物から
得られたフコース硫酸含有多糖−U分解酵素を9U含む
1.5リットルの50mMトリス塩酸緩衝液に溶解し、
25℃で6日間反応後、エバポレーターで約300ml
に濃縮した。濃縮液を排除分子量3500の透析チュー
ブに入れて徹底的に透析し、低分子化された硫酸化フコ
グルクロノマンナンを除去した。透析チューブ内に残っ
た液を、50mMの塩化ナトリウムで平衡化した4リッ
トルのDEAE−セルロファインA−800(チッソ社
製)にかけ、50mM塩化ナトリウムで充分洗浄後、5
0〜650mMの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出
を行った。更に同カラムを650mMの塩化ナトリウム
で充分溶出させた。溶出画分のうち650mMの塩化ナ
トリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分と
して集め、排除分子量10万の限外ろ過機により濃縮
後、10mMの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾
燥して硫酸化フコガラクタン画分の凍結乾燥物を0.8
5g得た。この画分について、糖組成分析を行なった。
まず、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー( Journal of Biological Chemistry)、第175巻、
第595頁(1948)の記載に従い、フコース量を定
量した。
Mの塩化ナトリウム及びWO97/26896公報記載
のフラボバクテリウム sp.SA−0082(通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所[日本国茨城県
つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305−856
6)]に平成7年(1995年)3月29日よりFER
MP−14872として寄託され、前記通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP−54
02[国際寄託への移管請求日:平成8年(1996
年)2月15日]として寄託)を培養し、該培養物から
得られたフコース硫酸含有多糖−U分解酵素を9U含む
1.5リットルの50mMトリス塩酸緩衝液に溶解し、
25℃で6日間反応後、エバポレーターで約300ml
に濃縮した。濃縮液を排除分子量3500の透析チュー
ブに入れて徹底的に透析し、低分子化された硫酸化フコ
グルクロノマンナンを除去した。透析チューブ内に残っ
た液を、50mMの塩化ナトリウムで平衡化した4リッ
トルのDEAE−セルロファインA−800(チッソ社
製)にかけ、50mM塩化ナトリウムで充分洗浄後、5
0〜650mMの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出
を行った。更に同カラムを650mMの塩化ナトリウム
で充分溶出させた。溶出画分のうち650mMの塩化ナ
トリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分と
して集め、排除分子量10万の限外ろ過機により濃縮
後、10mMの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾
燥して硫酸化フコガラクタン画分の凍結乾燥物を0.8
5g得た。この画分について、糖組成分析を行なった。
まず、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー( Journal of Biological Chemistry)、第175巻、
第595頁(1948)の記載に従い、フコース量を定
量した。
【0060】次に、得られた硫酸化フコガラクタンの乾
燥標品を1規定の塩酸に0.5%の濃度で溶解し、11
0℃で2時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、
グライコタッグ(宝酒造社製)及びグライコタッグ リ
ージェント キット(宝酒造社製)を用いて加水分解し
て得られた単糖の還元性末端をピリジル−(2)−アミ
ノ化(PA化)し、HPLCにより構成糖の比率を調べ
た。なお、HPLCの条件は下記によった。
燥標品を1規定の塩酸に0.5%の濃度で溶解し、11
0℃で2時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、
グライコタッグ(宝酒造社製)及びグライコタッグ リ
ージェント キット(宝酒造社製)を用いて加水分解し
て得られた単糖の還元性末端をピリジル−(2)−アミ
ノ化(PA化)し、HPLCにより構成糖の比率を調べ
た。なお、HPLCの条件は下記によった。
【0061】装置;L−6200型(日立製作所製)
カラム;パルパックタイプA(4.6mm×150m
m;宝酒造社製) 溶離液;700mMホウ酸緩衝液(pH9.0):アセ
トニトリル=9:1 検出;蛍光検出器F−1150(日立製作所製)にて励
起波長310nm、蛍光波長380nmで検出。 流速;0.3ml/分 カラム温度;65℃
m;宝酒造社製) 溶離液;700mMホウ酸緩衝液(pH9.0):アセ
トニトリル=9:1 検出;蛍光検出器F−1150(日立製作所製)にて励
起波長310nm、蛍光波長380nmで検出。 流速;0.3ml/分 カラム温度;65℃
【0062】次に、アナリティカル バイオケミストリ
ー(Analytical Biochemistry)、第4巻、第330頁
(1962)の記載に従いウロン酸量を定量した。さら
に、バイオケミカル ジャーナル(Biochemical Journa
l)、第84巻、第106頁(1962)の記載に従い硫
酸含量を定量した。
ー(Analytical Biochemistry)、第4巻、第330頁
(1962)の記載に従いウロン酸量を定量した。さら
に、バイオケミカル ジャーナル(Biochemical Journa
l)、第84巻、第106頁(1962)の記載に従い硫
酸含量を定量した。
【0063】以上の結果、得られた硫酸化フコガラクタ
ンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、
そのモル比は、約2:1であった。ウロン酸及びその他
の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコ
ースと硫酸基のモル比は約1:2であった。
ンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、
そのモル比は、約2:1であった。ウロン酸及びその他
の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコ
ースと硫酸基のモル比は約1:2であった。
【0064】(3)硫酸化フコガラクタン分解酵素の活
性測定方法 (2)で得られた硫酸化フコガラクタン画分を用いて本
発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の活性を測定する
ときは下記の要領で行った。
性測定方法 (2)で得られた硫酸化フコガラクタン画分を用いて本
発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の活性を測定する
ときは下記の要領で行った。
【0065】すなわち、60μlの50mMのイミダゾ
ール−塩酸緩衝液(pH7.5)と、4.8μlの2.
5%の硫酸化フコガラクタン画分溶液と、6μlの4M
塩化ナトリウムと、37.2μlの水と12μlの本発
明の第1の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素とを混
合し、37℃、3時間反応させた後、反応液を100℃
で10分間処理し、遠心分離後100μlをHPLCに
より分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、
本発明の第1の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
代わりに、その酵素を溶解してある緩衝液を用いて同様
の条件により反応させたもの及び硫酸化フコガラクタン
画分の代わりに水を用いて反応を行ったものを用意し、
それぞれ同様にHPLCにより分析した。
ール−塩酸緩衝液(pH7.5)と、4.8μlの2.
5%の硫酸化フコガラクタン画分溶液と、6μlの4M
塩化ナトリウムと、37.2μlの水と12μlの本発
明の第1の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素とを混
合し、37℃、3時間反応させた後、反応液を100℃
で10分間処理し、遠心分離後100μlをHPLCに
より分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、
本発明の第1の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
代わりに、その酵素を溶解してある緩衝液を用いて同様
の条件により反応させたもの及び硫酸化フコガラクタン
画分の代わりに水を用いて反応を行ったものを用意し、
それぞれ同様にHPLCにより分析した。
【0066】1単位の酵素は、上記反応系において1分
間に1μmolの硫酸化フコガラクタン画分のガラクト
シル結合を切断する酵素量とする。切断されたガラクト
シル結合の量は下記式により求めた。
間に1μmolの硫酸化フコガラクタン画分のガラクト
シル結合を切断する酵素量とする。切断されたガラクト
シル結合の量は下記式により求めた。
【0067】{(4.8×1000×2.5/100)/MG}×{(MG/M)−1}
×{1/(180×0.012)}=U/ml 4.8×1000×2.5/100:反応系中に添加した硫酸化フコガ
ラクタン(μg) MG:基質硫酸化フコガラクタン画分の平均分子量 M:反応生成物の平均分子量 (MG/M)−1:1分子の硫酸化フコガラクタンが酵素によ
り切断された数 180:反応時間(分) 0.012:酵素液量(ml)
×{1/(180×0.012)}=U/ml 4.8×1000×2.5/100:反応系中に添加した硫酸化フコガ
ラクタン(μg) MG:基質硫酸化フコガラクタン画分の平均分子量 M:反応生成物の平均分子量 (MG/M)−1:1分子の硫酸化フコガラクタンが酵素によ
り切断された数 180:反応時間(分) 0.012:酵素液量(ml)
【0068】なお、HPLC条件は下記によった。
装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:OHpak SB−806HQ(8×300m
m、昭和電工社製) 溶離液:5mMのアジ化ナトリウムを含む50mMの塩
化ナトリウム 検出:視差屈折率検出器(Shodex RI−71、
昭和電工社製) 流速:1ml/分 カラム温度:25℃
m、昭和電工社製) 溶離液:5mMのアジ化ナトリウムを含む50mMの塩
化ナトリウム 検出:視差屈折率検出器(Shodex RI−71、
昭和電工社製) 流速:1ml/分 カラム温度:25℃
【0069】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン(STANDARD P−
82、昭和電工社製)を上記のHPLC分析と同条件で
分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に
表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲
線とした。
市販の分子量既知のプルラン(STANDARD P−
82、昭和電工社製)を上記のHPLC分析と同条件で
分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に
表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲
線とした。
【0070】蛋白質の定量は、酵素液の280nmの吸
光度を測定することにより行った。その際1mg/ml
の蛋白質溶液の吸光度を1.0として計算した。
光度を測定することにより行った。その際1mg/ml
の蛋白質溶液の吸光度を1.0として計算した。
【0071】実施例2 硫酸化フコガラクタン分解酵素
の作用機作の決定 (1)硫酸化フコガラクタン分解酵素の調製 硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産のため、フラボバ
クテリウム sp.SA−0082(FERM BP−
5402)をグルコース0.1%、ペプトン1.0%、
酵母エキス0.05%を含む人工海水(ジャマリンラボ
ラトリー製)pH7.5からなる培地600mlを12
0℃、20分間殺菌した培地に接種し、24℃で23時
間培養して種培養液とした。下記の実施例3(1)の方
法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖
画分0.2%、ペプトン2.0%、酵母エキス0.01
%、及び消泡剤(KM70、信越化学工業製)0.01
%を含む人工海水(pH7.5)からなる培地20リッ
トルを30リットル容のジャーファーメンターにいれ1
20℃で20分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液6
00mlを接種し、24℃で23時間、毎分10リット
ルの通気量と毎分125回転の攪拌速度の条件で培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
の作用機作の決定 (1)硫酸化フコガラクタン分解酵素の調製 硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産のため、フラボバ
クテリウム sp.SA−0082(FERM BP−
5402)をグルコース0.1%、ペプトン1.0%、
酵母エキス0.05%を含む人工海水(ジャマリンラボ
ラトリー製)pH7.5からなる培地600mlを12
0℃、20分間殺菌した培地に接種し、24℃で23時
間培養して種培養液とした。下記の実施例3(1)の方
法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖
画分0.2%、ペプトン2.0%、酵母エキス0.01
%、及び消泡剤(KM70、信越化学工業製)0.01
%を含む人工海水(pH7.5)からなる培地20リッ
トルを30リットル容のジャーファーメンターにいれ1
20℃で20分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液6
00mlを接種し、24℃で23時間、毎分10リット
ルの通気量と毎分125回転の攪拌速度の条件で培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
【0072】得られた菌体を、1,200mlの0.4
M塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0)に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して
菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で
充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に
終濃度が90%飽和となるように硫安を添加し生じた沈
殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を150mlの
50mM塩化ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩
衝液(pH8.0)に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析
し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化
した500mLのDEAE−セファロースFF(アマシ
ャムファルマシア社製)のカラムにかけ、同じ緩衝液で
洗浄後、50mMから600mM塩化ナトリウムの濃度
勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
M塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0)に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して
菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で
充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に
終濃度が90%飽和となるように硫安を添加し生じた沈
殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を150mlの
50mM塩化ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩
衝液(pH8.0)に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析
し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化
した500mLのDEAE−セファロースFF(アマシ
ャムファルマシア社製)のカラムにかけ、同じ緩衝液で
洗浄後、50mMから600mM塩化ナトリウムの濃度
勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
【0073】得られた活性画分を0.1M塩化ナトリウ
ムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で
充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した100mLのDE
AE−セルロファインA−800(チッソ社製)のカラ
ムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、0.1Mから0.4M
の塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分
を集めた。得られた活性画分に4Mとなるように塩化ナ
トリウムを添加し、4Mの塩化ナトリウムを含む10m
Mのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した2
0mLのPhenyl−セルロファイン(チッソ社製)
のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、4Mから1Mの
塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに1Mの
塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0)で充分溶出させ、活性画分を集めた。得
られた活性画分に3Mとなるように塩化ナトリウムを添
加し、3Mの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−
塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した10mLのPh
enyl−セルロファイン(チッソ社製)のカラムにか
け、同じ緩衝液で洗浄後、3Mから0.5Mの塩化ナト
リウムの濃度勾配により溶出後、さらに0.5Mの塩化
ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)で充分溶出させ、活性画分を集めた。この様に
して得られた精製酵素を硫酸化フコガラクタン分解酵素
として用いた。
ムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で
充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した100mLのDE
AE−セルロファインA−800(チッソ社製)のカラ
ムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、0.1Mから0.4M
の塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分
を集めた。得られた活性画分に4Mとなるように塩化ナ
トリウムを添加し、4Mの塩化ナトリウムを含む10m
Mのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した2
0mLのPhenyl−セルロファイン(チッソ社製)
のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、4Mから1Mの
塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに1Mの
塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0)で充分溶出させ、活性画分を集めた。得
られた活性画分に3Mとなるように塩化ナトリウムを添
加し、3Mの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−
塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した10mLのPh
enyl−セルロファイン(チッソ社製)のカラムにか
け、同じ緩衝液で洗浄後、3Mから0.5Mの塩化ナト
リウムの濃度勾配により溶出後、さらに0.5Mの塩化
ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)で充分溶出させ、活性画分を集めた。この様に
して得られた精製酵素を硫酸化フコガラクタン分解酵素
として用いた。
【0074】(2)硫酸化フコガラクタンの低分子化物
の調製 実施例1(2)記載の硫酸化フコガラクタン画分に上記
の精製硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させ低分子
化物を調製した。すなわち、1.94gの硫酸化フコガ
ラクタン画分を0.2Mの塩化ナトリウムを含む25m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解後、186
mUの実施例2(1)記載の硫酸化フコガラクタン分解
酵素を加え、25℃で、6日間反応させた。反応液をエ
バポレーターにより80mlに濃縮し、セルロファイン
GCL−1000(チッソ社製)のカラム(4×90c
m)による分子量分画を行った。分子量15,000以
下の画分を集め、硫酸化フコガラクタン酵素消化物画分
とした。
の調製 実施例1(2)記載の硫酸化フコガラクタン画分に上記
の精製硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させ低分子
化物を調製した。すなわち、1.94gの硫酸化フコガ
ラクタン画分を0.2Mの塩化ナトリウムを含む25m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解後、186
mUの実施例2(1)記載の硫酸化フコガラクタン分解
酵素を加え、25℃で、6日間反応させた。反応液をエ
バポレーターにより80mlに濃縮し、セルロファイン
GCL−1000(チッソ社製)のカラム(4×90c
m)による分子量分画を行った。分子量15,000以
下の画分を集め、硫酸化フコガラクタン酵素消化物画分
とした。
【0075】次に、硫酸化フコガラクタン酵素消化物画
分の一部をグライコタッグ(宝酒造社製)及びグライコ
タッグ リージェント キット(宝酒造社製)を用いて
還元性末端をPA化し、得られたPA化糖を2規定の塩
酸中で100℃、3時間処理により加水分解し、HPL
Cにより還元末端糖を調べた。HPLC条件は下記によ
った。
分の一部をグライコタッグ(宝酒造社製)及びグライコ
タッグ リージェント キット(宝酒造社製)を用いて
還元性末端をPA化し、得られたPA化糖を2規定の塩
酸中で100℃、3時間処理により加水分解し、HPL
Cにより還元末端糖を調べた。HPLC条件は下記によ
った。
【0076】装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:パルパックタイプA(4.6×150mm、宝
酒造社製) 溶離液:0.7Mホウ酸緩衝液(pH9.0):アセト
ニトリル=9:1 検出:蛍光検出器(F−1150、日立製作所製)にて
励起波長310nm、 蛍光波長380nmで検出。 流速:0.3ml/分 カラム温度:65℃
酒造社製) 溶離液:0.7Mホウ酸緩衝液(pH9.0):アセト
ニトリル=9:1 検出:蛍光検出器(F−1150、日立製作所製)にて
励起波長310nm、 蛍光波長380nmで検出。 流速:0.3ml/分 カラム温度:65℃
【0077】この結果、ガラクトースのみが検出された
ので、硫酸化フコガラクタンの酵素消化物画分の還元性
末端は総て硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースで
あることが判明した。
ので、硫酸化フコガラクタンの酵素消化物画分の還元性
末端は総て硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースで
あることが判明した。
【0078】また、硫酸化フコガラクタンの酵素消化物
画分の中性糖組成を分析するため、還元性末端糖を分析
した試料の一部を再度PA化し、上記と同じ条件でHP
LCにより分析した。その結果、硫酸化フコガラクタン
の酵素消化物画分はガラクトースとフコースからなり、
そのモル比は、約2:1であることが判明した。前述の
結果より、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、
硫酸化フコガラクタンのガラクトシル結合を切断して還
元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを
持つオリゴ糖を生成させるエンド型ガラクトシダーゼ類
であることが判明した。
画分の中性糖組成を分析するため、還元性末端糖を分析
した試料の一部を再度PA化し、上記と同じ条件でHP
LCにより分析した。その結果、硫酸化フコガラクタン
の酵素消化物画分はガラクトースとフコースからなり、
そのモル比は、約2:1であることが判明した。前述の
結果より、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、
硫酸化フコガラクタンのガラクトシル結合を切断して還
元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを
持つオリゴ糖を生成させるエンド型ガラクトシダーゼ類
であることが判明した。
【0079】実施例3
(1)ガゴメ昆布から硫酸化フコース含有多糖画分を調
製した。すなわち、市販の乾燥ガゴメ昆布2Kgを穴径
1mmのスクリーンを装着させたカッターミル(増幸産
業社製)で破砕し、20リットルの80%エタノール中
に懸濁後25℃で3時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得ら
れた残さを40リットルの100mMの塩化ナトリウム
を含む30mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.
5)に懸濁し、95℃で2時間処理後、穴径106μm
のステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に20
0gの活性炭、4.5リットルのエタノール、12,0
00Uのアルギン酸リアーゼK(ナガセ生化学工業社
製)を添加し、25℃で20時間攪拌後、遠心分離し
た。得られた上清を排除分子量10万のホロファイバー
を装着させた限外ろ過機で4リットルに濃縮後、遠心分
離により不溶物を除去し、5℃で24時間放置した。生
じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外
ろ過機により溶液交換して100mM塩化ナトリウム溶
液とした。この溶液を4℃以下に冷却後、塩酸によりp
Hを2.0とし、生じた沈殿を遠心分離により除去し
た。得られた上清のpHを水酸化ナトリウムにより8.
0とし、4リットルに濃縮後、限外ろ過機により20m
Mの塩化ナトリウムに溶液交換した。この溶液中の不溶
物を遠心分離により除去後、50%のエタノールを82
ml添加して凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来の硫酸化フコ
ース含有多糖画分の乾燥物を76g得た。
製した。すなわち、市販の乾燥ガゴメ昆布2Kgを穴径
1mmのスクリーンを装着させたカッターミル(増幸産
業社製)で破砕し、20リットルの80%エタノール中
に懸濁後25℃で3時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得ら
れた残さを40リットルの100mMの塩化ナトリウム
を含む30mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.
5)に懸濁し、95℃で2時間処理後、穴径106μm
のステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に20
0gの活性炭、4.5リットルのエタノール、12,0
00Uのアルギン酸リアーゼK(ナガセ生化学工業社
製)を添加し、25℃で20時間攪拌後、遠心分離し
た。得られた上清を排除分子量10万のホロファイバー
を装着させた限外ろ過機で4リットルに濃縮後、遠心分
離により不溶物を除去し、5℃で24時間放置した。生
じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外
ろ過機により溶液交換して100mM塩化ナトリウム溶
液とした。この溶液を4℃以下に冷却後、塩酸によりp
Hを2.0とし、生じた沈殿を遠心分離により除去し
た。得られた上清のpHを水酸化ナトリウムにより8.
0とし、4リットルに濃縮後、限外ろ過機により20m
Mの塩化ナトリウムに溶液交換した。この溶液中の不溶
物を遠心分離により除去後、50%のエタノールを82
ml添加して凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来の硫酸化フコ
ース含有多糖画分の乾燥物を76g得た。
【0080】(2)フラボバクテリウム sp.SA−
0082(FERM BP−5402)を実施例3
(1)の方法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコー
ス含有多糖画分0.2%、ペプトン1.0%、酵母エキ
ス0.01%を含む人工海水(pH7.5)からなる培
地100mlを500ml容の三角フラスコにいれ12
0℃で20分間殺菌した培地に接種し、24℃で23時
間、振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し
て菌体と培養液上清を得た。
0082(FERM BP−5402)を実施例3
(1)の方法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコー
ス含有多糖画分0.2%、ペプトン1.0%、酵母エキ
ス0.01%を含む人工海水(pH7.5)からなる培
地100mlを500ml容の三角フラスコにいれ12
0℃で20分間殺菌した培地に接種し、24℃で23時
間、振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し
て菌体と培養液上清を得た。
【0081】得られた菌体を、5mlの0.4M塩化ナ
トリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽
出液を得た。
トリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽
出液を得た。
【0082】上記の培養液上清と菌体抽出液に含まれる
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素活性を測定した
結果、培養液上清には培地1mlあたり2mU、菌体抽
出液には培地1mlあたり2mUの活性が検出された。
上記の培養条件を用いれば、本発明の硫酸化フコガラク
タン分解酵素はフラボバクテリウム属細菌の菌体内にも
菌体外にもほぼ同量含まれることが判明した。
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素活性を測定した
結果、培養液上清には培地1mlあたり2mU、菌体抽
出液には培地1mlあたり2mUの活性が検出された。
上記の培養条件を用いれば、本発明の硫酸化フコガラク
タン分解酵素はフラボバクテリウム属細菌の菌体内にも
菌体外にもほぼ同量含まれることが判明した。
【0083】実施例4
実施例3(1)で得られた硫酸化フコース含有多糖画分
7gを700mlの50mM塩化ナトリウムと10%の
エタノールを含む20mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH8.0)に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化
した、5リットルのDEAE−セルロファインA−80
0(チッソ社製)にかけ、同緩衝液で洗浄後、50〜1
550mMの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出さ
せ、溶出塩濃度550〜1550mMの硫酸化フコース
含有多糖画分を集めた。
7gを700mlの50mM塩化ナトリウムと10%の
エタノールを含む20mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH8.0)に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化
した、5リットルのDEAE−セルロファインA−80
0(チッソ社製)にかけ、同緩衝液で洗浄後、50〜1
550mMの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出さ
せ、溶出塩濃度550〜1550mMの硫酸化フコース
含有多糖画分を集めた。
【0084】上記の画分には、硫酸化フコガラクタン分
解酵素により低分子化される成分すなわち本発明の硫酸
化フコガラクタンも10%程度含まれていた。そこで、
本画分を排除分子量10万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機により脱塩し、さらに、200mMの塩化
ナトリウムを含む20mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH8.0)で溶液置換した。そこに、600mUの
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を添加し25℃
で3日間反応後、限外ろ過を行い、ろ液中に含まれる糖
の量をフェノール−硫酸法により測定し、糖が検出され
なくなるまで限外ろ過を続けた。この工程により、本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素により低分子化され
る成分すなわち本発明の硫酸化フコガラクタンを前記の
硫酸化フコース含有多糖画分から除去することができ
た。
解酵素により低分子化される成分すなわち本発明の硫酸
化フコガラクタンも10%程度含まれていた。そこで、
本画分を排除分子量10万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機により脱塩し、さらに、200mMの塩化
ナトリウムを含む20mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH8.0)で溶液置換した。そこに、600mUの
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を添加し25℃
で3日間反応後、限外ろ過を行い、ろ液中に含まれる糖
の量をフェノール−硫酸法により測定し、糖が検出され
なくなるまで限外ろ過を続けた。この工程により、本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素により低分子化され
る成分すなわち本発明の硫酸化フコガラクタンを前記の
硫酸化フコース含有多糖画分から除去することができ
た。
【0085】実施例5
(1)硫酸化フコガラクタンの酵素消化物(i)の調製
実施例3で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含
有多糖画分70gを300mMの塩化ナトリウム、20
mMの塩化カルシウム、及び10%のエタノールを含む
20mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.5)に
溶解後、排除分子量10万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に
除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に
用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。
有多糖画分70gを300mMの塩化ナトリウム、20
mMの塩化カルシウム、及び10%のエタノールを含む
20mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.5)に
溶解後、排除分子量10万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に
除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に
用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。
【0086】次に、限外ろ過内液に、WO97/268
96公報記載の方法でアルテロモナス sp.SN−1
009株(FERM BP−5747)を培養し、該培
養物から得られたフコース硫酸含有多糖−F分解酵素を
5U添加し、25℃で3日間反応させた。上記反応液を
排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ
過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖−F分解
酵素で低分子化された物質、すなわち、フコイダンの低
分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加
する緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のも
のを用いた。
96公報記載の方法でアルテロモナス sp.SN−1
009株(FERM BP−5747)を培養し、該培
養物から得られたフコース硫酸含有多糖−F分解酵素を
5U添加し、25℃で3日間反応させた。上記反応液を
排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ
過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖−F分解
酵素で低分子化された物質、すなわち、フコイダンの低
分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加
する緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のも
のを用いた。
【0087】次に、限外ろ過内液に、WO97/268
96公報記載の方法でフラボバクテリウム sp.SA
−0082株(FERM BP−5402)を培養し、
該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−U分解酵
素を20U添加し、25℃で5日間反応させた。上記反
応液を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた
限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖−
U分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フ
コグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去し
た。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に200m
Mの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝
液(pH8)に置換した。
96公報記載の方法でフラボバクテリウム sp.SA
−0082株(FERM BP−5402)を培養し、
該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−U分解酵
素を20U添加し、25℃で5日間反応させた。上記反
応液を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた
限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖−
U分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フ
コグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去し
た。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に200m
Mの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝
液(pH8)に置換した。
【0088】次に、限外ろ過内液に、実施例2(1)記
載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を2U添加し、25
℃で5日間反応させた。反応液を2等分し、一方は排除
分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機
で限外ろ過し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低
分子化された物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの
低分子化物を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時
には50mMの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス
−塩酸緩衝液(pH8)を添加した。こうして得られた
ろ過液を硫酸化フコガラクタン酵素消化物(i)とし
た。
載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を2U添加し、25
℃で5日間反応させた。反応液を2等分し、一方は排除
分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機
で限外ろ過し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低
分子化された物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの
低分子化物を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時
には50mMの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス
−塩酸緩衝液(pH8)を添加した。こうして得られた
ろ過液を硫酸化フコガラクタン酵素消化物(i)とし
た。
【0089】(2)硫酸化フコガラクタン酵素消化物
(ii)の調製 実施例5(1)で2等分した反応液のもう一方に、実施
例2(1)記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を55
0mU添加し、25℃で7日間反応させ、低分子化の進
行を確認した。反応液を、排除分子量10万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、硫酸化フ
コガラクタンの低分子化物を徹底的に限外ろ過した。な
お、限外ろ過時には50mMの塩化ナトリウムを含む1
0mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8)を添加した。こ
うして得られたろ過液を硫酸化フコガラクタン酵素消化
物(ii)とした。
(ii)の調製 実施例5(1)で2等分した反応液のもう一方に、実施
例2(1)記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を55
0mU添加し、25℃で7日間反応させ、低分子化の進
行を確認した。反応液を、排除分子量10万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、硫酸化フ
コガラクタンの低分子化物を徹底的に限外ろ過した。な
お、限外ろ過時には50mMの塩化ナトリウムを含む1
0mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8)を添加した。こ
うして得られたろ過液を硫酸化フコガラクタン酵素消化
物(ii)とした。
【0090】(3)硫酸化フコガラクタン酵素消化物
(i)の分離精製 実施例5(1)で得られた硫酸化フコガラクタン酵素消
化物(i)をエバポレーターで500mlに濃縮後、電
気透析装置により脱塩し、あらかじめ10mMの塩化ナ
トリウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH8)で平衡化した1リットルのDEAE−セルロ
ファインA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同
緩衝液で洗浄後、10mMから900mMの塩化ナトリ
ウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は62
mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸
法により測定した。130mM付近及び220mM付近
の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含量のピークを
形成していたので、それぞれを集め、130mM溶出画
分(i)及び220mM溶出画分(i)とした。
(i)の分離精製 実施例5(1)で得られた硫酸化フコガラクタン酵素消
化物(i)をエバポレーターで500mlに濃縮後、電
気透析装置により脱塩し、あらかじめ10mMの塩化ナ
トリウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH8)で平衡化した1リットルのDEAE−セルロ
ファインA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同
緩衝液で洗浄後、10mMから900mMの塩化ナトリ
ウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は62
mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸
法により測定した。130mM付近及び220mM付近
の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含量のピークを
形成していたので、それぞれを集め、130mM溶出画
分(i)及び220mM溶出画分(i)とした。
【0091】130mM溶出画分(i)を電気透析装置
により脱塩後、50mMとなるように塩化ナトリウムを
溶解させ、あらかじめ50mMの塩化ナトリウムを含む
10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)で平衡
化した100mlのDEAE−セルロファインA−80
0(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、
50mMから200mMの塩化ナトリウムのグラジエン
トにより溶出させた。溶出画分は10mlずつ分取し、
それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定し
た。55mMから75mM付近の塩化ナトリウムで溶出
される画分が糖含量のピークを形成していたので、60
mM付近の塩化ナトリウムで溶出される画分を集めた。
この画分をスピードバック(サバントインストルメンツ
社製;SAVANT Instruments Inc.)で2mlに濃縮後、
あらかじめ10%のエタノールで平衡化した200ml
のセルロファインGCL−25(チッソ社製)のカラム
にかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は2mlずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、
(A)とした。
により脱塩後、50mMとなるように塩化ナトリウムを
溶解させ、あらかじめ50mMの塩化ナトリウムを含む
10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)で平衡
化した100mlのDEAE−セルロファインA−80
0(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、
50mMから200mMの塩化ナトリウムのグラジエン
トにより溶出させた。溶出画分は10mlずつ分取し、
それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定し
た。55mMから75mM付近の塩化ナトリウムで溶出
される画分が糖含量のピークを形成していたので、60
mM付近の塩化ナトリウムで溶出される画分を集めた。
この画分をスピードバック(サバントインストルメンツ
社製;SAVANT Instruments Inc.)で2mlに濃縮後、
あらかじめ10%のエタノールで平衡化した200ml
のセルロファインGCL−25(チッソ社製)のカラム
にかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は2mlずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、
(A)とした。
【0092】一方、上記の220mM溶出画分(i)に
関しては、電気透析装置により脱塩後、100mMとな
るように塩化ナトリウムを溶解させ、あらかじめ100
mMの塩化ナトリウムを含む10mMのイミダゾール−
塩酸緩衝液(pH8)で平衡化した100mlのDEA
E−セルロファインA−800(チッソ社製)のカラム
にかけ、同緩衝液で洗浄後、100mMから350mM
の塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶
出画分は10mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェ
ノール−硫酸法により測定した。160mM付近の塩化
ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバック
(サバントインストルメンツ社製;SAVANTInstruments
Inc.)で2mlに濃縮後、あらかじめ10%のエタノー
ルで平衡化した200mlのセルロファインGCL−2
5(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させ
た。溶出画分は2mlずつ分取し、それぞれの糖含量を
フェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピークを
形成している画分を集め、(B)とした。
関しては、電気透析装置により脱塩後、100mMとな
るように塩化ナトリウムを溶解させ、あらかじめ100
mMの塩化ナトリウムを含む10mMのイミダゾール−
塩酸緩衝液(pH8)で平衡化した100mlのDEA
E−セルロファインA−800(チッソ社製)のカラム
にかけ、同緩衝液で洗浄後、100mMから350mM
の塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶
出画分は10mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェ
ノール−硫酸法により測定した。160mM付近の塩化
ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバック
(サバントインストルメンツ社製;SAVANTInstruments
Inc.)で2mlに濃縮後、あらかじめ10%のエタノー
ルで平衡化した200mlのセルロファインGCL−2
5(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させ
た。溶出画分は2mlずつ分取し、それぞれの糖含量を
フェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピークを
形成している画分を集め、(B)とした。
【0093】(4)硫酸化フコガラクタン酵素消化物
(ii)の分離精製 実施例5(2)記載の硫酸化フコガラクタン酵素消化物
(ii)をエバポレーターで500mlに濃縮後、電気
透析装置により脱塩し、あらかじめ10mMの塩化ナト
リウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(p
H8)で平衡化した1リットルのDEAE−セルロファ
インA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝
液で洗浄後、10mMから900mMの塩化ナトリウム
のグラジエントにより溶出させた。溶出画分は61ml
ずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法に
より測定した。130mM付近、220mM付近及び2
70mM付近の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含
量のピークを形成していたので、それぞれを集め、13
0mM溶出画分(ii)、220mM溶出画分(ii)
及び270mM溶出画分(ii)とした。
(ii)の分離精製 実施例5(2)記載の硫酸化フコガラクタン酵素消化物
(ii)をエバポレーターで500mlに濃縮後、電気
透析装置により脱塩し、あらかじめ10mMの塩化ナト
リウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(p
H8)で平衡化した1リットルのDEAE−セルロファ
インA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝
液で洗浄後、10mMから900mMの塩化ナトリウム
のグラジエントにより溶出させた。溶出画分は61ml
ずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法に
より測定した。130mM付近、220mM付近及び2
70mM付近の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含
量のピークを形成していたので、それぞれを集め、13
0mM溶出画分(ii)、220mM溶出画分(ii)
及び270mM溶出画分(ii)とした。
【0094】130mM溶出画分(ii)を電気透析装
置により脱塩後、20mMとなるように塩化ナトリウム
を溶解させ、あらかじめ20mMの塩化ナトリウムを含
む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)で平
衡化した200mlのDEAE−セルロファインA−8
00(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄
後、20mMから150mMの塩化ナトリウムのグラジ
エントにより溶出させた。溶出画分は13mlずつ分取
し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定
した。50mMから70mM付近の塩化ナトリウムで溶
出される画分を集め、エバポレーターで30mlに濃縮
後、あらかじめ10%のエタノールで平衡化した120
0mlのセルロファインGCL−25(チッソ社製)の
カラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は10
mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸
法により測定した。糖含量がピークを形成している画分
を集め、10mMとなるように酢酸を添加後、塩酸でp
H3.5とし、20mMの塩化ナトリウムを含む10m
Mの酢酸緩衝液(pH3.5)の導電率と同じになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ20mMの塩
化ナトリウムを含む10mMの酢酸緩衝液(pH3.
5)で平衡化した30mlのDEAE−セルロファイン
A−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で
洗浄後、20mMから120mMの塩化ナトリウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は3mlずつ分
取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測
定した。65mMから80mM付近の塩化ナトリウムで
溶出される画分を集め、40mMの塩化ナトリウムを含
む10mMの酢酸緩衝液(pH3.5)の導電率と同じ
になるように水で希釈し、あらかじめ40mMの塩化ナ
トリウムを含む10mMの酢酸緩衝液(pH3.5)で
平衡化した20mlのDEAE−セルロファインA−8
00(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄
後、40mMから80mMの塩化ナトリウムのグラジエ
ントにより溶出させた。溶出画分は3mlずつ分取し、
それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定し
た。50mMから65mM付近の塩化ナトリウムで溶出
される画分を集め、スピードバック(サバントインスト
ルメンツ社製;SAVANT Instruments Inc.)で2mlに
濃縮後、あらかじめ10%のエタノールで平衡化した2
00mlのセルロファインGCL−25(チッソ社製)
のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は2m
lずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法
により測定した。糖含量がピークを形成している画分に
ついて質量分析したところ、前半の画分には(A)と同
じ物質が存在したが、後半の画分には実質的に(A)と
同じ物質が含まれていなかったので、後半の画分を集
め、(C)とした。
置により脱塩後、20mMとなるように塩化ナトリウム
を溶解させ、あらかじめ20mMの塩化ナトリウムを含
む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)で平
衡化した200mlのDEAE−セルロファインA−8
00(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄
後、20mMから150mMの塩化ナトリウムのグラジ
エントにより溶出させた。溶出画分は13mlずつ分取
し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定
した。50mMから70mM付近の塩化ナトリウムで溶
出される画分を集め、エバポレーターで30mlに濃縮
後、あらかじめ10%のエタノールで平衡化した120
0mlのセルロファインGCL−25(チッソ社製)の
カラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は10
mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸
法により測定した。糖含量がピークを形成している画分
を集め、10mMとなるように酢酸を添加後、塩酸でp
H3.5とし、20mMの塩化ナトリウムを含む10m
Mの酢酸緩衝液(pH3.5)の導電率と同じになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ20mMの塩
化ナトリウムを含む10mMの酢酸緩衝液(pH3.
5)で平衡化した30mlのDEAE−セルロファイン
A−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で
洗浄後、20mMから120mMの塩化ナトリウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は3mlずつ分
取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測
定した。65mMから80mM付近の塩化ナトリウムで
溶出される画分を集め、40mMの塩化ナトリウムを含
む10mMの酢酸緩衝液(pH3.5)の導電率と同じ
になるように水で希釈し、あらかじめ40mMの塩化ナ
トリウムを含む10mMの酢酸緩衝液(pH3.5)で
平衡化した20mlのDEAE−セルロファインA−8
00(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄
後、40mMから80mMの塩化ナトリウムのグラジエ
ントにより溶出させた。溶出画分は3mlずつ分取し、
それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定し
た。50mMから65mM付近の塩化ナトリウムで溶出
される画分を集め、スピードバック(サバントインスト
ルメンツ社製;SAVANT Instruments Inc.)で2mlに
濃縮後、あらかじめ10%のエタノールで平衡化した2
00mlのセルロファインGCL−25(チッソ社製)
のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は2m
lずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法
により測定した。糖含量がピークを形成している画分に
ついて質量分析したところ、前半の画分には(A)と同
じ物質が存在したが、後半の画分には実質的に(A)と
同じ物質が含まれていなかったので、後半の画分を集
め、(C)とした。
【0095】一方上記の220mM溶出画分(ii)に
関しては、100mMの塩化ナトリウムを含む10mM
のイミダゾール−塩酸緩衝液の導電率と同じになるよう
に水を添加し、あらかじめ100mMの塩化ナトリウム
を含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)
で平衡化した200mlのDEAE−セルロファインA
−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗
浄後、100mMから300mMの塩化ナトリウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は13mlずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。140mMから170mM付近の塩化ナトリ
ウムで溶出される画分を集め、エバポレーターで30m
lに濃縮後、あらかじめ10%のエタノールで平衡化し
た1200mlのセルロファインGCL−25(チッソ
社製)のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分
は10mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール
−硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成してい
る画分を集め、質量分析を行ったところ、実施例5
(3)記載の(B)と同じ物質であると推定された。
関しては、100mMの塩化ナトリウムを含む10mM
のイミダゾール−塩酸緩衝液の導電率と同じになるよう
に水を添加し、あらかじめ100mMの塩化ナトリウム
を含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)
で平衡化した200mlのDEAE−セルロファインA
−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗
浄後、100mMから300mMの塩化ナトリウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は13mlずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。140mMから170mM付近の塩化ナトリ
ウムで溶出される画分を集め、エバポレーターで30m
lに濃縮後、あらかじめ10%のエタノールで平衡化し
た1200mlのセルロファインGCL−25(チッソ
社製)のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分
は10mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール
−硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成してい
る画分を集め、質量分析を行ったところ、実施例5
(3)記載の(B)と同じ物質であると推定された。
【0096】また上記の270mM溶出画分(ii)に
関しては、150mMの塩化ナトリウムを含む10mM
のイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)と同じ導電率に
なるように水を添加し、あらかじめ150mMの塩化ナ
トリウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH8)で平衡化した200mlのDEAE−セルロ
ファインA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同
緩衝液で洗浄後、150mMから300mMの塩化ナト
リウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は1
2mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫
酸法により測定した。160mMから180mM付近の
塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバッ
ク(サバントインストルメンツ社製;SAVANT Instrumen
ts Inc.)で2mlに濃縮後、あらかじめ10%のエタ
ノールで平衡化した200mlのセルロファインGCL
−25(チッソ社製)のカラムにかけ、同溶液で溶出さ
せた。溶出画分は2mlずつ分取し、それぞれの糖含量
をフェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピーク
を形成している画分を集め、(D)とした。
関しては、150mMの塩化ナトリウムを含む10mM
のイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)と同じ導電率に
なるように水を添加し、あらかじめ150mMの塩化ナ
トリウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH8)で平衡化した200mlのDEAE−セルロ
ファインA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同
緩衝液で洗浄後、150mMから300mMの塩化ナト
リウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は1
2mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫
酸法により測定した。160mMから180mM付近の
塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバッ
ク(サバントインストルメンツ社製;SAVANT Instrumen
ts Inc.)で2mlに濃縮後、あらかじめ10%のエタ
ノールで平衡化した200mlのセルロファインGCL
−25(チッソ社製)のカラムにかけ、同溶液で溶出さ
せた。溶出画分は2mlずつ分取し、それぞれの糖含量
をフェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピーク
を形成している画分を集め、(D)とした。
【0097】実施例6
(1)硫酸化フコガラクタンの酵素消化物(iii)の
調製 実施例3で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含
有多糖画分15gを1500mlの300mMの塩化ナ
トリウム、20mMの塩化カルシウム、及び10%のエ
タノールを含む20mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH7.5)に溶解後、排除分子量10万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能
な物質を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加す
る緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のもの
を用いた。限外ろ過内液に、実施例5(1)で使用した
フコース硫酸含有多糖−F分解酵素を1U添加し、25
℃で3日間反応させた。
調製 実施例3で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含
有多糖画分15gを1500mlの300mMの塩化ナ
トリウム、20mMの塩化カルシウム、及び10%のエ
タノールを含む20mMのイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH7.5)に溶解後、排除分子量10万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能
な物質を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加す
る緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のもの
を用いた。限外ろ過内液に、実施例5(1)で使用した
フコース硫酸含有多糖−F分解酵素を1U添加し、25
℃で3日間反応させた。
【0098】上記反応液を排除分子量10万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコ
ース硫酸含有多糖−F分解酵素で低分子化された物質、
すなわち、フコイダンの低分子化物を徹底的に除去し
た。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた
緩衝液と同じ組成のものを用いた。
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコ
ース硫酸含有多糖−F分解酵素で低分子化された物質、
すなわち、フコイダンの低分子化物を徹底的に除去し
た。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた
緩衝液と同じ組成のものを用いた。
【0099】該限外ろ過内液に、実施例5(1)で使用
したフコース硫酸含有多糖−U分解酵素を1U添加し、
25℃で5日間反応させた。
したフコース硫酸含有多糖−U分解酵素を1U添加し、
25℃で5日間反応させた。
【0100】上記反応液を排除分子量10万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコ
ース硫酸含有多糖−U分解酵素で低分子化された物質、
すなわち、硫酸化フコグルクロノマンナンの低分子化物
を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時には200mM
の塩化ナトリウム及び10%のエタノールを含む10m
Mのトリス−塩酸緩衝液(pH8)を添加した。
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコ
ース硫酸含有多糖−U分解酵素で低分子化された物質、
すなわち、硫酸化フコグルクロノマンナンの低分子化物
を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時には200mM
の塩化ナトリウム及び10%のエタノールを含む10m
Mのトリス−塩酸緩衝液(pH8)を添加した。
【0101】次に限外ろ過内液に、実施例2(1)記載
の硫酸化フコガラクタン分解酵素を600mU添加し、
25℃で5日間反応させた。反応液を排除分子量10万
のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過
し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化され
た物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物
を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時には20m
Mの塩化ナトリウムを含む10%のエタノールを添加し
た。こうして得られたろ過液を硫酸化フコガラクタン酵
素消化物(iii)とした。
の硫酸化フコガラクタン分解酵素を600mU添加し、
25℃で5日間反応させた。反応液を排除分子量10万
のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過
し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化され
た物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物
を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時には20m
Mの塩化ナトリウムを含む10%のエタノールを添加し
た。こうして得られたろ過液を硫酸化フコガラクタン酵
素消化物(iii)とした。
【0102】(2)硫酸化フコガラクタン酵素消化物
(iii)の分離精製 実施例6(1)で得られた硫酸化フコガラクタン酵素消
化物(iii)を電気透析装置により脱塩し、エバポレ
ーターで50mlに濃縮後、あらかじめ50mMの酢酸
アンモニウム(pH5.5)で平衡化した100mlの
DEAE−セルロファインA−800(チッソ社製)の
カラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、50mMから4Mの
酢酸アンモニウムのグラジエントにより溶出させた。溶
出画分は10mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェ
ノール−硫酸法により測定した。420mMから620
mM付近の酢酸アンモニウムで溶出される画分が糖含量
のピークを形成していたので、その画分を集め420か
ら620mM溶出画分とした。
(iii)の分離精製 実施例6(1)で得られた硫酸化フコガラクタン酵素消
化物(iii)を電気透析装置により脱塩し、エバポレ
ーターで50mlに濃縮後、あらかじめ50mMの酢酸
アンモニウム(pH5.5)で平衡化した100mlの
DEAE−セルロファインA−800(チッソ社製)の
カラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、50mMから4Mの
酢酸アンモニウムのグラジエントにより溶出させた。溶
出画分は10mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェ
ノール−硫酸法により測定した。420mMから620
mM付近の酢酸アンモニウムで溶出される画分が糖含量
のピークを形成していたので、その画分を集め420か
ら620mM溶出画分とした。
【0103】(3)420から620mM溶出画分の精
製 該画分を、電気透析装置により脱塩し、50mMの酢酸
アンモニウム溶液と同じ導電率とし、あらかじめ50m
Mの酢酸アンモニウム(pH5.5)で平衡化した10
0mlのDEAE−セルロファインA−800(チッソ
社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、100mM
の酢酸アンモニウム(pH5.5)で洗浄し、100m
Mから800mMの酢酸アンモニウムのグラジエントに
より溶出させた。溶出画分は10mlずつ分取し、それ
ぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。4
40mMから530mM付近の酢酸アンモニウムで溶出
される画分を集めた。
製 該画分を、電気透析装置により脱塩し、50mMの酢酸
アンモニウム溶液と同じ導電率とし、あらかじめ50m
Mの酢酸アンモニウム(pH5.5)で平衡化した10
0mlのDEAE−セルロファインA−800(チッソ
社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、100mM
の酢酸アンモニウム(pH5.5)で洗浄し、100m
Mから800mMの酢酸アンモニウムのグラジエントに
より溶出させた。溶出画分は10mlずつ分取し、それ
ぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。4
40mMから530mM付近の酢酸アンモニウムで溶出
される画分を集めた。
【0104】該画分を、電気透析装置により脱塩し、2
00mMの酢酸アンモニウム溶液と同じ導電率とし、あ
らかじめ200mMの酢酸アンモニウム(pH5.5)
で平衡化した100mlのDEAE−セルロファインA
−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗
浄後、200mMから700mMの酢酸アンモニウムの
グラジエントにより溶出させた。溶出画分は10mlず
つ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法によ
り測定した。420mMから470mM付近の酢酸アン
モニウムで溶出される画分を集めた。該画分について質
量分析及び核磁気共鳴スペクトル(NMR)分析を行っ
たところ実施例5(3)記載の(B)と同じ物質である
と推定された。なお、質量分析はAPI−III質量分
析器(パーキンエルマー・サイエクス社製)を用いて行
った。NMR分析は核磁気共鳴装置JMN−A500
(日本電子社製)を用いて行った。
00mMの酢酸アンモニウム溶液と同じ導電率とし、あ
らかじめ200mMの酢酸アンモニウム(pH5.5)
で平衡化した100mlのDEAE−セルロファインA
−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗
浄後、200mMから700mMの酢酸アンモニウムの
グラジエントにより溶出させた。溶出画分は10mlず
つ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法によ
り測定した。420mMから470mM付近の酢酸アン
モニウムで溶出される画分を集めた。該画分について質
量分析及び核磁気共鳴スペクトル(NMR)分析を行っ
たところ実施例5(3)記載の(B)と同じ物質である
と推定された。なお、質量分析はAPI−III質量分
析器(パーキンエルマー・サイエクス社製)を用いて行
った。NMR分析は核磁気共鳴装置JMN−A500
(日本電子社製)を用いて行った。
【0105】(4)硫酸化フコガラクタン酵素消化物の
再酵素消化及び分離精製 実施例6(2)の420から620mM溶出画分以外は
比較的分子量が大きかったので再度硫酸化フコガラクタ
ン分解酵素により分解した。すなわち、420から62
0mM溶出画分以外の溶出画分を集め、電気透析装置で
脱塩後、該溶液が200mMの塩化ナトリウム及び10
%のエタノールを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.
5)となるように調整し、実施例2(1)記載の硫酸化
フコガラクタン分解酵素を460mU添加し、25℃で
8日間反応させた。反応液を電気透析装置により脱塩
し、50mMの酢酸アンモニウム溶液と同じ導電率と
し、あらかじめ50mMの酢酸アンモニウム(pH5.
5)で平衡化した100mlのDEAE−セルロファイ
ンA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液
で洗浄後、100mMから1Mの酢酸アンモニウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は10mlずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。180mMから280mM付近の酢酸アンモ
ニウム溶出画分及び360mMから430mM付近の酢
酸アンモニウムで溶出される画分を集め、それぞれ、
(E)及び(F)とした。
再酵素消化及び分離精製 実施例6(2)の420から620mM溶出画分以外は
比較的分子量が大きかったので再度硫酸化フコガラクタ
ン分解酵素により分解した。すなわち、420から62
0mM溶出画分以外の溶出画分を集め、電気透析装置で
脱塩後、該溶液が200mMの塩化ナトリウム及び10
%のエタノールを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.
5)となるように調整し、実施例2(1)記載の硫酸化
フコガラクタン分解酵素を460mU添加し、25℃で
8日間反応させた。反応液を電気透析装置により脱塩
し、50mMの酢酸アンモニウム溶液と同じ導電率と
し、あらかじめ50mMの酢酸アンモニウム(pH5.
5)で平衡化した100mlのDEAE−セルロファイ
ンA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液
で洗浄後、100mMから1Mの酢酸アンモニウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は10mlずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。180mMから280mM付近の酢酸アンモ
ニウム溶出画分及び360mMから430mM付近の酢
酸アンモニウムで溶出される画分を集め、それぞれ、
(E)及び(F)とした。
【0106】実施例7 硫酸化フコガラクタン酵素消化
物の構造決定 実施例5及び6で得られた6つの画分(A)、(B)、
(C)、(D)、(E)、及び(F)についてそれぞれ
電気透析装置により脱塩後、凍結乾燥し、糖組成及び質
量を分析した。質量分析は、API−III質量分析機
(パーキンエルマー・サイエクス社製)を用いた。ま
た、NMR分析は、JNM−α500型核磁気共鳴装置
(日本電子社製)を用いた。分析試料は、定法により重
水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、
1H−検出異種核検出法であるHMBC法を用いて行っ
た。1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及びH
OHAHA法を、13C−NMRの帰属にはHSQC法を
用いた。
物の構造決定 実施例5及び6で得られた6つの画分(A)、(B)、
(C)、(D)、(E)、及び(F)についてそれぞれ
電気透析装置により脱塩後、凍結乾燥し、糖組成及び質
量を分析した。質量分析は、API−III質量分析機
(パーキンエルマー・サイエクス社製)を用いた。ま
た、NMR分析は、JNM−α500型核磁気共鳴装置
(日本電子社製)を用いた。分析試料は、定法により重
水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、
1H−検出異種核検出法であるHMBC法を用いて行っ
た。1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及びH
OHAHA法を、13C−NMRの帰属にはHSQC法を
用いた。
【0107】(1)低分子化物(A)の物性
質量分析及びNMRの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(A)の1H−NM
Rスペクトルを図3に、13C−NMRスペクトルを図4
に、マススペクトルを図5にそれぞれ示した。即ち、図
3は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(A)の
1H−NMRスペクトルを示す図であり、図4は本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(A)の13C−NM
Rスペクトルを示す図であり、図5は本発明の硫酸化フ
コガラクタン低分子化物(A)のマススペクトルを示す
図である。図3、図4において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図5
において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/Z値
を示す。 分子量; 632 MS m/z 653.2 [M+Na+−2H+]-、31
5.0 [M−2H+] 2- 1H−NMR(D2O) δ;5.15(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.93(1H,d,J=3.7Hz,F2−1
−H),4.53(1H,d−d,J=10.4,4.
3Hz,F1−3−H),4.49(1H,d,J=
7.6Hz,G1−1−H),4.46(1H,d−
d,J=10.7,3.1Hz,F2−3−H),4.
36(1H,q,J=6.7Hz,F2−5−H),
4.14(1H,q,J=6.7Hz,F1−5−
H),4.09(1H,d,J=2.4Hz,F1−4
−H),4.03(1H,d,J=3.1Hz,F2−
4−H),3.97(1H,d−d,J=10.4,
4.3Hz,F1−2−H),3.90(1H,br−
s,G1−4−H),3.81(1H,d−d,J=1
0.7,3.7Hz,F2−2−H),3.59(1
H,m,G1−3−H),3.59(1H,m,G1−
5−H),3.59(2H,m,G1−6−H),3.
56(1H,m,G1−2−H),1.19(3H,
d,J=6.7,F1−6−H),1.14(3H,
d,J=6.7,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表1に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(A)の1H−NM
Rスペクトルを図3に、13C−NMRスペクトルを図4
に、マススペクトルを図5にそれぞれ示した。即ち、図
3は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(A)の
1H−NMRスペクトルを示す図であり、図4は本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(A)の13C−NM
Rスペクトルを示す図であり、図5は本発明の硫酸化フ
コガラクタン低分子化物(A)のマススペクトルを示す
図である。図3、図4において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図5
において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/Z値
を示す。 分子量; 632 MS m/z 653.2 [M+Na+−2H+]-、31
5.0 [M−2H+] 2- 1H−NMR(D2O) δ;5.15(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.93(1H,d,J=3.7Hz,F2−1
−H),4.53(1H,d−d,J=10.4,4.
3Hz,F1−3−H),4.49(1H,d,J=
7.6Hz,G1−1−H),4.46(1H,d−
d,J=10.7,3.1Hz,F2−3−H),4.
36(1H,q,J=6.7Hz,F2−5−H),
4.14(1H,q,J=6.7Hz,F1−5−
H),4.09(1H,d,J=2.4Hz,F1−4
−H),4.03(1H,d,J=3.1Hz,F2−
4−H),3.97(1H,d−d,J=10.4,
4.3Hz,F1−2−H),3.90(1H,br−
s,G1−4−H),3.81(1H,d−d,J=1
0.7,3.7Hz,F2−2−H),3.59(1
H,m,G1−3−H),3.59(1H,m,G1−
5−H),3.59(2H,m,G1−6−H),3.
56(1H,m,G1−2−H),1.19(3H,
d,J=6.7,F1−6−H),1.14(3H,
d,J=6.7,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表1に示す。
【0108】
【表1】
【0109】
糖組成 L−フコース:D−ガラクトース=2:1
硫酸基 2分子
なお、1H-NMRにおけるピークの帰属の番号は、下記
式(V)の通りである。
式(V)の通りである。
【化19】
【0110】(2)低分子化物(B)の物性
質量分析及びNMRの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(B)の1H−NM
Rスペクトルを図6に、13C−NMRスペクトルを図7
に、マススペクトルを図8にそれぞれ示した。即ち、図
6は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(B)の
1H−NMRスペクトルを示す図であり、図7は本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(B)の13C−NM
Rスペクトルを示す図であり、図8は本発明の硫酸化フ
コガラクタン低分子化物(B)のマススペクトルを示す
図である。図6、図7において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図8
において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/Z値
を示す。 分子量; 1116 MS m/z 1181.2 [M+3Na+−4H+]-、
579.0 [M+2Na +−4H+]2-、378.6 [M
+Na+−4H+] 3- 1 H−NMR(D2O) δ;5.20(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.95(1H,d,J=3.7Hz,F2−1
−H),4.64(1H,HODと重複,G1−1−
H),4.60(1H,d,J=7.9Hz,G2−1
−H),4.55(1H,d−d,J=10.7,1.
8Hz,F1−3−H),4.47(1H,m,F2−
3−H),4.45(1H,d,J=7.6Hz,G3
−1−H),4.42(1H,br−s,G2−4−
H),4.38(1H,q,J=6.4Hz,F2−5
−H),4.28(1H,m,G2−3−H),4.2
0(1H,m,G3−3−H),4.17(1H,br
−s,G3−4−H),4.14(1H,q,J=6.
4Hz,F1−5−H),4.11(1H,d,J=
1.8Hz,F1−4−H),4.06(1H,d,J
=1.8Hz,F2−4−H),4.01(1H,m,
G2−6−H),3.97(1H,d−d,J=10.
7,4.3Hz,F1−2−H)、3.90(1H,b
r−s,G1−4−H),3.88(1H,m,G2−
5−H),3.83(1H,m,G2−6−H),3.
82(1H,m,F2−2−H),3.68(1H,
m,G1−3−H),3.66(1H,m,G2−2−
H),3.65(2H,m,G3−6−H),3.62
(1H,m,G3−5−H),3.61(2H,m,G
1−6−H),3.59(1H,m,G1−2−H),
3.55(1H,m,G1−5−H),3.54(1
H,m,G3−2−H),1.21(3H,d,J=
6.4,F1−6−H),1.15(3H,d,J=
6.4,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表2に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(B)の1H−NM
Rスペクトルを図6に、13C−NMRスペクトルを図7
に、マススペクトルを図8にそれぞれ示した。即ち、図
6は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(B)の
1H−NMRスペクトルを示す図であり、図7は本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(B)の13C−NM
Rスペクトルを示す図であり、図8は本発明の硫酸化フ
コガラクタン低分子化物(B)のマススペクトルを示す
図である。図6、図7において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図8
において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/Z値
を示す。 分子量; 1116 MS m/z 1181.2 [M+3Na+−4H+]-、
579.0 [M+2Na +−4H+]2-、378.6 [M
+Na+−4H+] 3- 1 H−NMR(D2O) δ;5.20(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.95(1H,d,J=3.7Hz,F2−1
−H),4.64(1H,HODと重複,G1−1−
H),4.60(1H,d,J=7.9Hz,G2−1
−H),4.55(1H,d−d,J=10.7,1.
8Hz,F1−3−H),4.47(1H,m,F2−
3−H),4.45(1H,d,J=7.6Hz,G3
−1−H),4.42(1H,br−s,G2−4−
H),4.38(1H,q,J=6.4Hz,F2−5
−H),4.28(1H,m,G2−3−H),4.2
0(1H,m,G3−3−H),4.17(1H,br
−s,G3−4−H),4.14(1H,q,J=6.
4Hz,F1−5−H),4.11(1H,d,J=
1.8Hz,F1−4−H),4.06(1H,d,J
=1.8Hz,F2−4−H),4.01(1H,m,
G2−6−H),3.97(1H,d−d,J=10.
7,4.3Hz,F1−2−H)、3.90(1H,b
r−s,G1−4−H),3.88(1H,m,G2−
5−H),3.83(1H,m,G2−6−H),3.
82(1H,m,F2−2−H),3.68(1H,
m,G1−3−H),3.66(1H,m,G2−2−
H),3.65(2H,m,G3−6−H),3.62
(1H,m,G3−5−H),3.61(2H,m,G
1−6−H),3.59(1H,m,G1−2−H),
3.55(1H,m,G1−5−H),3.54(1
H,m,G3−2−H),1.21(3H,d,J=
6.4,F1−6−H),1.15(3H,d,J=
6.4,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表2に示す。
【表2】
【0111】
糖組成 L−フコース:D−ガラクトース=2:3
硫酸基 4分子
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記
式(VI)の通りである。
式(VI)の通りである。
【化20】
【0112】(3)低分子化物(C)の物性
質量分析及びNMRの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(C)の1H−NM
Rスペクトルを図9に、13C−NMRスペクトルを図1
0に、マススペクトルを図11にそれぞれ示した。即
ち、図9は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
(C)の1H−NMRスペクトルを示す図であり、図1
0は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(C)の
13C−NMRスペクトルを示す図であり、図11は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(C)のマススペ
クトルを示す図である。図9、図10において縦軸はシ
グナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示
す。また、図11において、縦軸は相対強度(%)を、
横軸は、m/Z値を示す。 分子量;502 MS m/z 523 [M+Na+−2H+]-、 250
[M−2H+]2- 1 H−NMR(D2O) δ4.57(1H,d,J=7.9Hz,G1−1−
H),4.43(1H,d,J=7.9Hz,G2−1
−H),4.20(1H,br−s,G1−3−H),
4.20(1H,br−s,G1−4−H),4.20
(1H,br−s,G2−3−H),4.15(1H,
br−s,G2−4−H),3.95(1H,m,G1
−6−H),3.82(1H,m,G1−5−H),
3.80(1H,m,G1−6−H),3.63(2
H,m,G2−6−H),3.62(1H,m,G2−
5−H),3.55(1H,m,G2−2−H),3.
50(1H,m,G1−2−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表3に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(C)の1H−NM
Rスペクトルを図9に、13C−NMRスペクトルを図1
0に、マススペクトルを図11にそれぞれ示した。即
ち、図9は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
(C)の1H−NMRスペクトルを示す図であり、図1
0は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(C)の
13C−NMRスペクトルを示す図であり、図11は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(C)のマススペ
クトルを示す図である。図9、図10において縦軸はシ
グナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示
す。また、図11において、縦軸は相対強度(%)を、
横軸は、m/Z値を示す。 分子量;502 MS m/z 523 [M+Na+−2H+]-、 250
[M−2H+]2- 1 H−NMR(D2O) δ4.57(1H,d,J=7.9Hz,G1−1−
H),4.43(1H,d,J=7.9Hz,G2−1
−H),4.20(1H,br−s,G1−3−H),
4.20(1H,br−s,G1−4−H),4.20
(1H,br−s,G2−3−H),4.15(1H,
br−s,G2−4−H),3.95(1H,m,G1
−6−H),3.82(1H,m,G1−5−H),
3.80(1H,m,G1−6−H),3.63(2
H,m,G2−6−H),3.62(1H,m,G2−
5−H),3.55(1H,m,G2−2−H),3.
50(1H,m,G1−2−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表3に示す。
【表3】
【0113】
糖組成 D−ガラクトースのみ
硫酸基 2分子
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記
式(VII)の通りである。
式(VII)の通りである。
【化21】
【0114】(4)低分子化物(D)の物性
質量分析及びNMRの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(D)の1H−NM
Rスペクトルを図12に、13C−NMRスペクトルを図
13に、マススペクトルを図14にそれぞれ示した。即
ち、図12は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
(D)の1H−NMRスペクトルを示す図であり、図1
3は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(D)の
13C−NMRスペクトルを示す図であり、図14は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(D)のマススペ
クトルを示す図である。図12、図13において縦軸は
シグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示
す。また、図14において、縦軸は相対強度(%)を、
横軸は、m/Z値を示す。 分子量;1358 MS m/z 711.2 [M+3Na+−5H+]2-、4
66.6 [M+2Na+−5H+]3-、344.2 [M+
Na+−5H+] 4- 1 H−NMR(D2O) δ;5.19(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.93(1H,d,J=3.7Hz,F2−1
−H),4.62(1H,HODと重複,G1−1−
H),4.59(1H,HODと重複,G2−1−
H),4.54(1H,d−d,J=10.6,2.7
Hz,F1−3−H),4.46(1H,d,J=7.
6Hz,G3−1−H),4.46(1H,m,F2−
3−H),4.41(1H,br−s,G2−4−
H),4.41(1H,d,J=7.6Hz,G4−1
−H),4.37(1H,q,J=6.4Hz,F2−
5−H),4.27(1H,m,G2−3−H),4.
24(1H,br−s,G3−4−H),4.21(1
H,m,G3−3−H),4.19(1H,m,G4−
3−H),4.15(1H,br−s,G4−4−
H),4.13(1H,q,J=6.7Hz,F1−5
−H),4.09(1H,d,J=2.7Hz,F1−
4−H),4.04(1H,d,J=2.8Hz,F2
−4−H),3.98(1H,m,G2−6−H)、
3.96(1H,d−d,J=10.6,4.3Hz,
F1−2−H),3.93(1H,m,G3−6−
H),3.88(1H,br−s,G1−4−H),
3.86(1H,m,G2−5−H),3.81(1
H,m,G2−6−H),3.81(1H,m,F2−
2−H),3.80(1H,m,G3−5−H),3.
80(1H,m,G3−6−H),3.66(1H,
m,G1−3−H),3.65(1H,m,G2−2−
H),3.64(1H,m,G1−6−H),3.64
(1H,m,G4−6−H),3.61(1H,m,G
4−5−H),3.58(1H,m,G1−2−H),
3.56(1H,m,G1−6−H),3.56(1
H,m,G4−6−H),3.55(1H,m,G4−
2−H),3.54(1H,m,G1−5−H),3.
54(1H,m,G3−2−H),1.20(3H,
d,J=6.7,F1−6−H),1.14(3H,
d,J=6.4,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表4および5に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(D)の1H−NM
Rスペクトルを図12に、13C−NMRスペクトルを図
13に、マススペクトルを図14にそれぞれ示した。即
ち、図12は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
(D)の1H−NMRスペクトルを示す図であり、図1
3は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(D)の
13C−NMRスペクトルを示す図であり、図14は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(D)のマススペ
クトルを示す図である。図12、図13において縦軸は
シグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示
す。また、図14において、縦軸は相対強度(%)を、
横軸は、m/Z値を示す。 分子量;1358 MS m/z 711.2 [M+3Na+−5H+]2-、4
66.6 [M+2Na+−5H+]3-、344.2 [M+
Na+−5H+] 4- 1 H−NMR(D2O) δ;5.19(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.93(1H,d,J=3.7Hz,F2−1
−H),4.62(1H,HODと重複,G1−1−
H),4.59(1H,HODと重複,G2−1−
H),4.54(1H,d−d,J=10.6,2.7
Hz,F1−3−H),4.46(1H,d,J=7.
6Hz,G3−1−H),4.46(1H,m,F2−
3−H),4.41(1H,br−s,G2−4−
H),4.41(1H,d,J=7.6Hz,G4−1
−H),4.37(1H,q,J=6.4Hz,F2−
5−H),4.27(1H,m,G2−3−H),4.
24(1H,br−s,G3−4−H),4.21(1
H,m,G3−3−H),4.19(1H,m,G4−
3−H),4.15(1H,br−s,G4−4−
H),4.13(1H,q,J=6.7Hz,F1−5
−H),4.09(1H,d,J=2.7Hz,F1−
4−H),4.04(1H,d,J=2.8Hz,F2
−4−H),3.98(1H,m,G2−6−H)、
3.96(1H,d−d,J=10.6,4.3Hz,
F1−2−H),3.93(1H,m,G3−6−
H),3.88(1H,br−s,G1−4−H),
3.86(1H,m,G2−5−H),3.81(1
H,m,G2−6−H),3.81(1H,m,F2−
2−H),3.80(1H,m,G3−5−H),3.
80(1H,m,G3−6−H),3.66(1H,
m,G1−3−H),3.65(1H,m,G2−2−
H),3.64(1H,m,G1−6−H),3.64
(1H,m,G4−6−H),3.61(1H,m,G
4−5−H),3.58(1H,m,G1−2−H),
3.56(1H,m,G1−6−H),3.56(1
H,m,G4−6−H),3.55(1H,m,G4−
2−H),3.54(1H,m,G1−5−H),3.
54(1H,m,G3−2−H),1.20(3H,
d,J=6.7,F1−6−H),1.14(3H,
d,J=6.4,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表4および5に示す。
【表4】
【表5】
【0115】
糖組成 L−フコース:D−ガラクトース=2:4
硫酸基 5分子
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記
式(VIII)の通りである。
式(VIII)の通りである。
【化22】
【0116】(5)低分子化物(E)の物性
質量分析及びNMRの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(E)の1H−NM
Rスペクトルを図15に、13C−NMRスペクトルを図
16に、マススペクトルを図17にそれぞれ示した。即
ち、図15は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
(E)の1H−NMRスペクトルを示す図であり、図1
6は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(E)の
13C−NMRスペクトルを示す図であり、図17は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(E)のマススペ
クトルを示す図である。図15、図16において縦軸は
シグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示
す。また、図17において、縦軸は相対強度(%)を、
横軸は、m/Z値を示す。 分子量;1036 MS m/z 528.0[M+Na+−3H+]2-、34
4.0 [M−3H+] 3- 1H−NMR(D2O) δ;5.19(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.87(1H,d,J=3.7Hz,F2−1
−H),4.63(1H,HODと重複,G1−1−
H),4.59(1H,d,J=7.9Hz,G2−1
−H),4.53(1H,d−d,J=10.7,
1.8Hz,F1−3−H),4.44(1H,d,J
=7.6Hz,G3−1−H),4.40(1H,br
−s,G2−4−H),4.32(1H,q,J=6.
4Hz,F2−5−H),4.27(1H,m,G2−
3−H),4.19(1H,m,G3−3−H),4.
16(1H,br−s,G3−4−H),4.12(1
H,q,J=6.4Hz,F1−5−H),4.06
(1H,d,J=1.8Hz,F1−4−H),3.9
9(1H,m,G2−6−H),3.88(1H,br
−s,G1−4−H),3.88(1H,d−d,J=
10.7,4.3Hz,F1−2−H),3.86(1
H,m,G2−5−H)、3.81(1H,m,G2−
6−H),3.81(1H,m,F2−3−H),3.
69(1H,d,J=1.8Hz,F2−4−H),
3.66(1H,m,G1−3−H),3.65(1
H,m,G2−2−H),3.64(1H,m,F2−
2−H),3.63(2H,m,G1−6−H),3.
61(1H,m,G3−5−H),3.61(2H,
m,G3−6−H),3.60(1H,m,G1−2−
H),3.53(1H,m,G1−5−H),3.53
(1H,m,G3−2−H),1.19(3H,d,J
=6.4,F1−6−H),1.12(3H,d,J=
6.4,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表6に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(E)の1H−NM
Rスペクトルを図15に、13C−NMRスペクトルを図
16に、マススペクトルを図17にそれぞれ示した。即
ち、図15は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
(E)の1H−NMRスペクトルを示す図であり、図1
6は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(E)の
13C−NMRスペクトルを示す図であり、図17は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物(E)のマススペ
クトルを示す図である。図15、図16において縦軸は
シグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示
す。また、図17において、縦軸は相対強度(%)を、
横軸は、m/Z値を示す。 分子量;1036 MS m/z 528.0[M+Na+−3H+]2-、34
4.0 [M−3H+] 3- 1H−NMR(D2O) δ;5.19(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.87(1H,d,J=3.7Hz,F2−1
−H),4.63(1H,HODと重複,G1−1−
H),4.59(1H,d,J=7.9Hz,G2−1
−H),4.53(1H,d−d,J=10.7,
1.8Hz,F1−3−H),4.44(1H,d,J
=7.6Hz,G3−1−H),4.40(1H,br
−s,G2−4−H),4.32(1H,q,J=6.
4Hz,F2−5−H),4.27(1H,m,G2−
3−H),4.19(1H,m,G3−3−H),4.
16(1H,br−s,G3−4−H),4.12(1
H,q,J=6.4Hz,F1−5−H),4.06
(1H,d,J=1.8Hz,F1−4−H),3.9
9(1H,m,G2−6−H),3.88(1H,br
−s,G1−4−H),3.88(1H,d−d,J=
10.7,4.3Hz,F1−2−H),3.86(1
H,m,G2−5−H)、3.81(1H,m,G2−
6−H),3.81(1H,m,F2−3−H),3.
69(1H,d,J=1.8Hz,F2−4−H),
3.66(1H,m,G1−3−H),3.65(1
H,m,G2−2−H),3.64(1H,m,F2−
2−H),3.63(2H,m,G1−6−H),3.
61(1H,m,G3−5−H),3.61(2H,
m,G3−6−H),3.60(1H,m,G1−2−
H),3.53(1H,m,G1−5−H),3.53
(1H,m,G3−2−H),1.19(3H,d,J
=6.4,F1−6−H),1.12(3H,d,J=
6.4,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表6に示す。
【表6】
【0117】
糖組成 L−フコース:D−ガラクトース=2:3
硫酸基 3分子
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記
式(IX)の通りである。
式(IX)の通りである。
【化23】
【0118】(6)低分子化物(F)の物性
質量分析及びNMRの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(F)の1H−NM
Rスペクトルを図18に、13C−DEPT−135°ス
ペクトルを図19に、マススペクトルを図20にそれぞ
れ示した。即ち、図18は本発明の硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(F)の1H−NMRスペクトルを示す図
であり、図19は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子
化物(F)の13C−DEPT−135°スペクトルを示
す図であり、図20は本発明の硫酸化フコガラクタン低
分子化物(F)のマススペクトルを示す図である。図1
8、図19において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化
学シフト値(ppm)を示す。また、図20において、
縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/Z値を示す。 分子量;1278 MS m/z 660.0 [M+2Na+−4H+]2-、 432.0
[M+Na+−4H+]3 -、318.2 [M−4H+] 4 - 1 H−NMR(D2O) δ;5.19(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.87(1H,d,J=3.8Hz,F2−1
−H),4.61(1H,HODと重複,G1−1−
H),4.59(1H,J=7.9Hz、G2−1−
H),4.53(1H,d−d,J=10.6, 2.
7Hz,F1−3−H),4.46(1H,d,J=
7.6Hz,G3−1−H),4.42(1H,d,J
=7.6Hz,G4−1−H),4.41(1H,br
−s,G2−4−H),4.32(1H,q,J=6.
4Hz,F2−5−H),4.27(1H,m,G2−
3−H),4.24(1H,br−s,G3−4−
H),4.20(1H,m,G3−3−H),4.20
(1H,m,G4−3−H),4.16(1H,br−
s,G4−4−H),4.12(1H,q,J=6.7
Hz,F1−5−H),4.06(1H,d,J=2.
7Hz,F1−4−H),3.98(1H,m,G2−
6−H),3.94(1H,m,G3−6−H),3.
89(1H,d−d,J=10.6,4.3Hz,F1
−2−H)、3.88(1H,br−s,G1−4−
H),3.86(1H,m,G2−5−H),3.86
(1H,m,G2−6−H),3.82(1H,m,F
2−3−H),3.80(1H,m,G3−5−H),
3.80(1H,m,G3−6−H),3.69(1
H,d,J=2.8,F2−4−H),3.66(1
H,m,G1−3−H),3.65(2H,m,G1−
6−H),3.65(2H,m,G4−6−H),3.
64(1H,m,G2−2−H),3.64(1H,
m,F2−2−H),3.62(1H,m,G4−5−
H),3.59(1H,m,G1−2−H),3.54
(1H,m,G1−5−H),3.54(1H,m,G
3−2−H),3.54(1H,m,G4−2−H),
1.19(3H,d,J=6.7,F1−6−H),
1.12(3H,d,J=6.4,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表7および8に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物(F)の1H−NM
Rスペクトルを図18に、13C−DEPT−135°ス
ペクトルを図19に、マススペクトルを図20にそれぞ
れ示した。即ち、図18は本発明の硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(F)の1H−NMRスペクトルを示す図
であり、図19は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子
化物(F)の13C−DEPT−135°スペクトルを示
す図であり、図20は本発明の硫酸化フコガラクタン低
分子化物(F)のマススペクトルを示す図である。図1
8、図19において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化
学シフト値(ppm)を示す。また、図20において、
縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/Z値を示す。 分子量;1278 MS m/z 660.0 [M+2Na+−4H+]2-、 432.0
[M+Na+−4H+]3 -、318.2 [M−4H+] 4 - 1 H−NMR(D2O) δ;5.19(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−
H),4.87(1H,d,J=3.8Hz,F2−1
−H),4.61(1H,HODと重複,G1−1−
H),4.59(1H,J=7.9Hz、G2−1−
H),4.53(1H,d−d,J=10.6, 2.
7Hz,F1−3−H),4.46(1H,d,J=
7.6Hz,G3−1−H),4.42(1H,d,J
=7.6Hz,G4−1−H),4.41(1H,br
−s,G2−4−H),4.32(1H,q,J=6.
4Hz,F2−5−H),4.27(1H,m,G2−
3−H),4.24(1H,br−s,G3−4−
H),4.20(1H,m,G3−3−H),4.20
(1H,m,G4−3−H),4.16(1H,br−
s,G4−4−H),4.12(1H,q,J=6.7
Hz,F1−5−H),4.06(1H,d,J=2.
7Hz,F1−4−H),3.98(1H,m,G2−
6−H),3.94(1H,m,G3−6−H),3.
89(1H,d−d,J=10.6,4.3Hz,F1
−2−H)、3.88(1H,br−s,G1−4−
H),3.86(1H,m,G2−5−H),3.86
(1H,m,G2−6−H),3.82(1H,m,F
2−3−H),3.80(1H,m,G3−5−H),
3.80(1H,m,G3−6−H),3.69(1
H,d,J=2.8,F2−4−H),3.66(1
H,m,G1−3−H),3.65(2H,m,G1−
6−H),3.65(2H,m,G4−6−H),3.
64(1H,m,G2−2−H),3.64(1H,
m,F2−2−H),3.62(1H,m,G4−5−
H),3.59(1H,m,G1−2−H),3.54
(1H,m,G1−5−H),3.54(1H,m,G
3−2−H),3.54(1H,m,G4−2−H),
1.19(3H,d,J=6.7,F1−6−H),
1.12(3H,d,J=6.4,F2−6−H)13 C−NMR(D2O) 各炭素の13C−NMR分析時
のケミカルシフト値を表7および8に示す。
【表7】
【表8】
【0119】
糖組成 L−フコース:D−ガラクトース=2:4
硫酸基 4分子
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記
式(X)の通りである。
式(X)の通りである。
【化24】
【0120】実施例8
(1)本発明の硫酸化フコガラクタンの主要構造の解析
実施例1(2)で調製した硫酸化フコガラクタン画分の
全構造及び硫酸化フコガラクタン分解酵素の切断部位を
決定するために、NMR分析を行った。質量分析及びN
MRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガ
ラクタンの1H−NMRスペクトルを図21に、13C−
NMRスペクトルを図22に、赤外吸収(IR)スペク
トルを図23にそれぞれ示した。即ち、図21は本発明
の硫酸化フコガラクタンの1H−NMRスペクトルを示
す図であり、図22は本発明の硫酸化フコガラクタンの
13C−NMRスペクトルを示す図であり、図23は本発
明の硫酸化フコガラクタンの赤外吸収スペクトルを示す
図である。図21、図22において縦軸はシグナルの強
度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図
23において、縦軸は透過率(%)を、横軸は、波数
(cm-1)を示す。1H−NMR及び13C−NMRによ
る分析結果を表9および10に示す。
全構造及び硫酸化フコガラクタン分解酵素の切断部位を
決定するために、NMR分析を行った。質量分析及びN
MRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガ
ラクタンの1H−NMRスペクトルを図21に、13C−
NMRスペクトルを図22に、赤外吸収(IR)スペク
トルを図23にそれぞれ示した。即ち、図21は本発明
の硫酸化フコガラクタンの1H−NMRスペクトルを示
す図であり、図22は本発明の硫酸化フコガラクタンの
13C−NMRスペクトルを示す図であり、図23は本発
明の硫酸化フコガラクタンの赤外吸収スペクトルを示す
図である。図21、図22において縦軸はシグナルの強
度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図
23において、縦軸は透過率(%)を、横軸は、波数
(cm-1)を示す。1H−NMR及び13C−NMRによ
る分析結果を表9および10に示す。
【表9】
【表10】
【0121】表9および10に示した帰属より、本発明
の硫酸化フコガラクタンは、実施例7(4)に記載の
(D)の化合物が主骨格であり、さらに本発明の硫酸化
フコガラクタンは、該化合物が繰り返し結合している構
造である事が判明した。また、繰り返し構造間の結合
は、下記式(XIII)に示すようにG2のガラクトー
スがβ結合でG4のガラクトースの6位に結合したもの
であった。すなわち硫酸化フコガラクタンは、下記に示
す主骨格の繰り返し構造を有することが判明した。
の硫酸化フコガラクタンは、実施例7(4)に記載の
(D)の化合物が主骨格であり、さらに本発明の硫酸化
フコガラクタンは、該化合物が繰り返し結合している構
造である事が判明した。また、繰り返し構造間の結合
は、下記式(XIII)に示すようにG2のガラクトー
スがβ結合でG4のガラクトースの6位に結合したもの
であった。すなわち硫酸化フコガラクタンは、下記に示
す主骨格の繰り返し構造を有することが判明した。
【化25】
【0122】また、本発明の硫酸化フコガラクタンの化
学構造及び本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物の
化学構造から、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素
は、硫酸化フコガラクタンのD−硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースとD−硫酸化ガラクトースあるいは
ガラクトースの間のβ1−6結合及びβ1−4結合をエ
ンド的に分解する酵素であることが判明した。さらに、
本発明の硫酸化フコガラクタンの分子量は、実施例1
(3)の条件で測定したところ、その平均値は約13万
であった。またその分子量分布は約1万〜約20万であ
った。
学構造及び本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物の
化学構造から、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素
は、硫酸化フコガラクタンのD−硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースとD−硫酸化ガラクトースあるいは
ガラクトースの間のβ1−6結合及びβ1−4結合をエ
ンド的に分解する酵素であることが判明した。さらに、
本発明の硫酸化フコガラクタンの分子量は、実施例1
(3)の条件で測定したところ、その平均値は約13万
であった。またその分子量分布は約1万〜約20万であ
った。
【0123】(2)本発明の硫酸化フコガラクタンのH
GF産生誘導活性 実施例1(2)記載の方法で得られた本発明の硫酸化フ
コガラクタンのHGF産生誘導活性を測定した。HGF
産生誘導活性は、以下のようにして測定した。すなわ
ち、1×105cells/mlとなるように10%牛
胎児血清を含んだDME培地に懸濁したMRC-5細胞
懸濁液(CCL171:大日本製薬社製、code.0
2−021)500μlを48穴の細胞培養プレートに
入れ、37℃、5%CO2存在下で24時間培養後に1
%牛胎児血清を含んだDME培地に交換した。その後、
試料として実施例1−(2)に記載の方法で得られた硫
酸化フコガラクタンを最終濃度が1、10、100μg
/mlとなるように添加し、さらに24時間培養した
後、培地を回収し、Quantikine Human Hepatocyte G
rowth Factor(HGF)ELISA Kit(フナコシ社製、Co
de.RS-0641-00)を用いて、培地中のHGF
の量を測定した。一方、コントロールとして試料と同量
の蒸留水を添加した。コントロールのHGF量は4.3
ng/mlであり、この値を100%とした、各試料添
加区のHGF産生量を表11に示す。なお、実験は全て
2連で行い、その平均値を採用した。
GF産生誘導活性 実施例1(2)記載の方法で得られた本発明の硫酸化フ
コガラクタンのHGF産生誘導活性を測定した。HGF
産生誘導活性は、以下のようにして測定した。すなわ
ち、1×105cells/mlとなるように10%牛
胎児血清を含んだDME培地に懸濁したMRC-5細胞
懸濁液(CCL171:大日本製薬社製、code.0
2−021)500μlを48穴の細胞培養プレートに
入れ、37℃、5%CO2存在下で24時間培養後に1
%牛胎児血清を含んだDME培地に交換した。その後、
試料として実施例1−(2)に記載の方法で得られた硫
酸化フコガラクタンを最終濃度が1、10、100μg
/mlとなるように添加し、さらに24時間培養した
後、培地を回収し、Quantikine Human Hepatocyte G
rowth Factor(HGF)ELISA Kit(フナコシ社製、Co
de.RS-0641-00)を用いて、培地中のHGF
の量を測定した。一方、コントロールとして試料と同量
の蒸留水を添加した。コントロールのHGF量は4.3
ng/mlであり、この値を100%とした、各試料添
加区のHGF産生量を表11に示す。なお、実験は全て
2連で行い、その平均値を採用した。
【表11】
【0124】表11に示したように、本発明の硫酸化フ
コガラクタンがHGFの産生を誘導することを確認し
た。即ち、本発明の硫酸化フコガラクタンは、HGF産
生誘導物質として有用であることを確認した。
コガラクタンがHGFの産生を誘導することを確認し
た。即ち、本発明の硫酸化フコガラクタンは、HGF産
生誘導物質として有用であることを確認した。
【0125】実施例9
(1)実施例3で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコ
ース含有多糖画分70gを300mMの塩化ナトリウ
ム、及び10%のエタノールを含む20mMのイミダゾ
ール−塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解後、排除分子量
10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外
ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に除去した。なお、限
外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた緩衝液と同じ
組成のものを用いた。
ース含有多糖画分70gを300mMの塩化ナトリウ
ム、及び10%のエタノールを含む20mMのイミダゾ
ール−塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解後、排除分子量
10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外
ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に除去した。なお、限
外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた緩衝液と同じ
組成のものを用いた。
【0126】次に、限外ろ過内液に、WO97/268
96号公報記載の方法でフラボバクテリウム sp.S
A−0082株(FERM BP−5402)を培養
し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−U分
解酵素を20U添加し、25℃で5日間反応させた。上
記反応液を排除分子量10万のホロファイバーを装着さ
せた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多
糖−U分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸
化フコグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去
した。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に200
mMの塩化ナトリウムを含む10mMのイミダゾール−
塩酸緩衝液(pH8)に置換した。
96号公報記載の方法でフラボバクテリウム sp.S
A−0082株(FERM BP−5402)を培養
し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−U分
解酵素を20U添加し、25℃で5日間反応させた。上
記反応液を排除分子量10万のホロファイバーを装着さ
せた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多
糖−U分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸
化フコグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去
した。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に200
mMの塩化ナトリウムを含む10mMのイミダゾール−
塩酸緩衝液(pH8)に置換した。
【0127】次に、限外ろ過内液に、実施例2(1)記
載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を2U添加し、25
℃で5日間反応させた。反応液を排除分子量10万のホ
ロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上
記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化された物
質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物を徹
底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝
液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のものを用い
た。
載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を2U添加し、25
℃で5日間反応させた。反応液を排除分子量10万のホ
ロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上
記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化された物
質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物を徹
底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝
液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のものを用い
た。
【0128】次に、限外ろ過内液に最終濃度が20mM
になるように塩化カルシウムを添加し、さらにWO97
/26896公報記載の方法でアルテロモナス sp.
SN−1009株(FERM BP−5747)を培養
し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−F分
解酵素を5U添加し、25℃で3日間反応させた。上記
反応液を排除分子量10万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖
−F分解酵素で低分子化された物質を徹底的に限外ろ過
した。なお、限外ろ過時には水を添加した。こうして得
られたろ過液に含まれているフコース硫酸含有多糖の低
分子化物について理化学的性質を調べた。
になるように塩化カルシウムを添加し、さらにWO97
/26896公報記載の方法でアルテロモナス sp.
SN−1009株(FERM BP−5747)を培養
し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−F分
解酵素を5U添加し、25℃で3日間反応させた。上記
反応液を排除分子量10万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖
−F分解酵素で低分子化された物質を徹底的に限外ろ過
した。なお、限外ろ過時には水を添加した。こうして得
られたろ過液に含まれているフコース硫酸含有多糖の低
分子化物について理化学的性質を調べた。
【0129】(2)上記(1)で得られたろ過液を集
め、排除分子量3000のホロファイバーを装着させた
限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離
した。このろ過液をロータリーエバポレーターで約3リ
ットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上
清を排除分子量300の膜を装着させた電気透析器によ
り脱塩し、この溶液に0.1Mとなるように酢酸カルシ
ウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。
この上清をあらかじめ50mMの酢酸カルシウムにより
平衡化させたDEAE−セルロファイン(樹脂量4リッ
トル)にかけ、50mMの酢酸カルシウム及び50mM
の塩化ナトリウムで充分洗浄後、50mM〜800mM
の塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。こ
の時の分取量は1本当り500mlで行った。分取した
画分をセルロースアセテート膜電気泳動法[アナリティ
カル バイオケミストリー(Analytical B
iochemistry)、第37巻、第197〜20
2頁(1970)]により分析したところ塩化ナトリウ
ム濃度が約0.4Mで溶出される画分(以下、0.4M
溶出画分と称す。)が均一であることが判明した。ま
た、約0.6Mの濃度で溶出される画分(以下0.6M
溶出画分と称す。)も電気泳動的にほぼ均一であった。
め、排除分子量3000のホロファイバーを装着させた
限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離
した。このろ過液をロータリーエバポレーターで約3リ
ットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上
清を排除分子量300の膜を装着させた電気透析器によ
り脱塩し、この溶液に0.1Mとなるように酢酸カルシ
ウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。
この上清をあらかじめ50mMの酢酸カルシウムにより
平衡化させたDEAE−セルロファイン(樹脂量4リッ
トル)にかけ、50mMの酢酸カルシウム及び50mM
の塩化ナトリウムで充分洗浄後、50mM〜800mM
の塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。こ
の時の分取量は1本当り500mlで行った。分取した
画分をセルロースアセテート膜電気泳動法[アナリティ
カル バイオケミストリー(Analytical B
iochemistry)、第37巻、第197〜20
2頁(1970)]により分析したところ塩化ナトリウ
ム濃度が約0.4Mで溶出される画分(以下、0.4M
溶出画分と称す。)が均一であることが判明した。ま
た、約0.6Mの濃度で溶出される画分(以下0.6M
溶出画分と称す。)も電気泳動的にほぼ均一であった。
【0130】そこで、まず0.4M溶出画分の液を15
0mlに濃縮後、濃度が4Mとなるように塩化ナトリウ
ムを添加し、あらかじめ4Mの塩化ナトリウムにより平
衡化したPhenyl−セルロファイン(樹脂量200
ml)にかけ、4Mの塩化ナトリウムにより充分洗浄し
た。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量300
の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液50
5mlを得た。
0mlに濃縮後、濃度が4Mとなるように塩化ナトリウ
ムを添加し、あらかじめ4Mの塩化ナトリウムにより平
衡化したPhenyl−セルロファイン(樹脂量200
ml)にかけ、4Mの塩化ナトリウムにより充分洗浄し
た。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量300
の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液50
5mlを得た。
【0131】得られた脱塩液のうち40mlを10%の
エタノールを含む0.2Mの塩化ナトリウムによって平
衡化させたセルロファインGCL−90のカラム(4.
1cm×87cm)にかけて、ゲルろ過を行った。分取
は1フラクション当り9.2mlで行った。
エタノールを含む0.2Mの塩化ナトリウムによって平
衡化させたセルロファインGCL−90のカラム(4.
1cm×87cm)にかけて、ゲルろ過を行った。分取
は1フラクション当り9.2mlで行った。
【0132】全フラクションに対して総糖量の分析をフ
ェノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー(Analyt
ical Chemistry)、第28巻、第350頁(195
6)〕により行った。
ェノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー(Analyt
ical Chemistry)、第28巻、第350頁(195
6)〕により行った。
【0133】この結果、硫酸化糖は1つのピークを形成
したので、そのピークの中央部分を集め、排除分子量3
00の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾
燥し、112mgの本発明の硫酸化糖の乾燥品を得た。
該乾燥品の一部を取り糖組成分析及び質量分析を行っ
た。また、乾燥品のうちの10mgを常法により重水置
換し、NMR分析に供した。
したので、そのピークの中央部分を集め、排除分子量3
00の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾
燥し、112mgの本発明の硫酸化糖の乾燥品を得た。
該乾燥品の一部を取り糖組成分析及び質量分析を行っ
た。また、乾燥品のうちの10mgを常法により重水置
換し、NMR分析に供した。
【0134】糖組成分析の結果、0.4M溶出画分は、
フコースのみからなる硫酸化糖であることが判明した。
フコースのみからなる硫酸化糖であることが判明した。
【0135】また、API−III質量分析機(パーキ
ンエルマー・サイエクス社)を用いた、硫酸化糖の質量
分析の結果を図24に示し、以下に解析結果を示す。す
なわち図24は硫酸化糖の質量分析の結果を示す図であ
り、縦軸は相対強度(%)を、横軸はm/z値を示す。
その結果、分子量は、全硫酸基がナトリウム塩になって
いる状態で2264±1であった。つまり、構成糖がフ
コースだけの硫酸化糖であることから、フコースが7分
子、硫酸基が12分子結合したもので、その硫酸基がす
べてナトリウム塩になっているもので、理論的分子量は
2265であることが判明した。
ンエルマー・サイエクス社)を用いた、硫酸化糖の質量
分析の結果を図24に示し、以下に解析結果を示す。す
なわち図24は硫酸化糖の質量分析の結果を示す図であ
り、縦軸は相対強度(%)を、横軸はm/z値を示す。
その結果、分子量は、全硫酸基がナトリウム塩になって
いる状態で2264±1であった。つまり、構成糖がフ
コースだけの硫酸化糖であることから、フコースが7分
子、硫酸基が12分子結合したもので、その硫酸基がす
べてナトリウム塩になっているもので、理論的分子量は
2265であることが判明した。
【0136】つまり、本物質をMとすると、図24中の
主なシグナルは下記のように帰属することができる。 m/z 1109.05--- [M−2Na+ ]2- (理論値 1109.5) 731.45--- [M−3Na+ ]3- (理論値 732) 542.75--- [M−4Na+ ]4- (理論値 543.25) 430.05--- [M−5Na+ ]5- (理論値 430) この結果、本物質はフコース7分子、硫酸基12分子の
オリゴ糖である。
主なシグナルは下記のように帰属することができる。 m/z 1109.05--- [M−2Na+ ]2- (理論値 1109.5) 731.45--- [M−3Na+ ]3- (理論値 732) 542.75--- [M−4Na+ ]4- (理論値 543.25) 430.05--- [M−5Na+ ]5- (理論値 430) この結果、本物質はフコース7分子、硫酸基12分子の
オリゴ糖である。
【0137】次に、フコースの結合様式、及び硫酸基の
結合位置を決定するために、JNM−α500 型核磁
気共鳴装置(日本電子社製)を用い、NMR分析を行っ
た。構成糖の結合様式は1H−検出異種核検出法である
HMBC法を用いて行った。1H−NMRの帰属にはD
QF−COSY法及びHOHAHA法を、13C−NMR
の帰属にはHSQC法を用いた。
結合位置を決定するために、JNM−α500 型核磁
気共鳴装置(日本電子社製)を用い、NMR分析を行っ
た。構成糖の結合様式は1H−検出異種核検出法である
HMBC法を用いて行った。1H−NMRの帰属にはD
QF−COSY法及びHOHAHA法を、13C−NMR
の帰属にはHSQC法を用いた。
【0138】NMRの帰属の結果を以下に示し、0.4
M溶出画分の硫酸化糖の 1H−NMRスペクトルを図2
5に、13C−NMRスペクトルを図26にそれぞれ示し
た。但し、1H−NMRでの化学シフト値はジオキサン
の化学シフト値を3.53ppmに、13C−NMRでは
ジオキサンの化学シフト値を66.5ppmとして表し
た。測定は両方共に60℃で行った。すなわち図25
は、0.4M溶出画分の硫酸化糖の1H−NMRスペク
トルを示す図であり、図26は0.4M溶出画分の硫酸
化糖の13C−NMRスペクトルを示す図である。図2
5、図26において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化
学シフト値(ppm)を示す。1H−NMR及び13C−
NMRによる分析結果を表12および13に示す。
M溶出画分の硫酸化糖の 1H−NMRスペクトルを図2
5に、13C−NMRスペクトルを図26にそれぞれ示し
た。但し、1H−NMRでの化学シフト値はジオキサン
の化学シフト値を3.53ppmに、13C−NMRでは
ジオキサンの化学シフト値を66.5ppmとして表し
た。測定は両方共に60℃で行った。すなわち図25
は、0.4M溶出画分の硫酸化糖の1H−NMRスペク
トルを示す図であり、図26は0.4M溶出画分の硫酸
化糖の13C−NMRスペクトルを示す図である。図2
5、図26において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化
学シフト値(ppm)を示す。1H−NMR及び13C−
NMRによる分析結果を表12および13に示す。
【表12】
【表13】
【0139】なお、NMRのピークの帰属の番号は下記
式(XV)の通りである。
式(XV)の通りである。
【化26】
(式中、RはH又はOSO3Hである)
【0140】以上の結果より、本物質は下記式(XV
I)で表される硫酸化糖であることが判明した。
I)で表される硫酸化糖であることが判明した。
【化27】
【0141】(3)実施例9(2)に記載した、DEA
E−セルロファインの0.6M溶出画分に関しても0.
4M溶出画分と全く同様に精製して凍結乾燥品を得た。
この標品は、HPLCによる分析の結果、0.4M溶出
画分よりも分子量の大きな硫酸化糖であることが判明し
たが、NMRの分析結果によると0.4M溶出画分とほ
ぼ同じスペクトルが得られた。
E−セルロファインの0.6M溶出画分に関しても0.
4M溶出画分と全く同様に精製して凍結乾燥品を得た。
この標品は、HPLCによる分析の結果、0.4M溶出
画分よりも分子量の大きな硫酸化糖であることが判明し
たが、NMRの分析結果によると0.4M溶出画分とほ
ぼ同じスペクトルが得られた。
【0142】図27に0.6M溶出画分の1H−NMR
スペクトルを示した。但し、溶媒は重水を用い、1H−
NMRでの化学シフト値はジオキサンの化学シフト値を
3.53ppmとして表した。測定は60℃で行った。
すなわち図27は0.6M溶出画分の1H−NMRスペ
クトルを示す図であり、縦軸はシグナルの強度を、横軸
は化学シフト値(ppm)を示す。
スペクトルを示した。但し、溶媒は重水を用い、1H−
NMRでの化学シフト値はジオキサンの化学シフト値を
3.53ppmとして表した。測定は60℃で行った。
すなわち図27は0.6M溶出画分の1H−NMRスペ
クトルを示す図であり、縦軸はシグナルの強度を、横軸
は化学シフト値(ppm)を示す。
【0143】この結果、0.6M溶出画分は0.4M溶
出画分が数分子結合した構造を持つことが強く示唆され
た。そこで、0.6M溶出画分を実施例9(1)記載の
フコース硫酸含有多糖−F分解酵素によりさらに分解し
て得た分解物をHPLCにより分析したところ、反応生
成物の多くが実施例9(2)に記載したDEAE−セル
ロファインの0.4M溶出画分の硫酸化糖と同じ位置に
溶出されてきた。
出画分が数分子結合した構造を持つことが強く示唆され
た。そこで、0.6M溶出画分を実施例9(1)記載の
フコース硫酸含有多糖−F分解酵素によりさらに分解し
て得た分解物をHPLCにより分析したところ、反応生
成物の多くが実施例9(2)に記載したDEAE−セル
ロファインの0.4M溶出画分の硫酸化糖と同じ位置に
溶出されてきた。
【0144】なお、HPLCの分析条件は下記の通りで
ある。 カラム Shodex SB802.5(昭和電工社
製) カラム温度 25℃ 溶液 5mMのアジ化ナトリウムを含む50mMの塩
化ナトリウム 検出 示差屈折率検出器 Shodex RI−71 上記0.6M溶出画分、0.4M溶出画分につきプルラ
ン(昭和電工社製)を標準物質としたゲルろ過法により
分子量を測定したところ、0.4M溶出画分はプルラン
換算で分子量約8500、0.6M溶出画分は分子量約
26000であり、0.6M溶出画分は0.4M溶出画
分の硫酸化糖の3量体であることが判明した。また、7
糖残基の繰り返しの結合位置は約0.6M溶出画分の1
H−NMRスペクトルを詳細に検討することにより、式
(XV)中のFのフコースの3位にα−(1→3)結合
でつながっていることが明らかとなった。さらに、上記
の方法に準じ、上記フコース硫酸含有多糖の低分子化物
中より、(XVI)で表される硫酸化糖の5量体、すな
わち下記一般式(XIV)においてn=5で表される硫
酸化糖を得た。
ある。 カラム Shodex SB802.5(昭和電工社
製) カラム温度 25℃ 溶液 5mMのアジ化ナトリウムを含む50mMの塩
化ナトリウム 検出 示差屈折率検出器 Shodex RI−71 上記0.6M溶出画分、0.4M溶出画分につきプルラ
ン(昭和電工社製)を標準物質としたゲルろ過法により
分子量を測定したところ、0.4M溶出画分はプルラン
換算で分子量約8500、0.6M溶出画分は分子量約
26000であり、0.6M溶出画分は0.4M溶出画
分の硫酸化糖の3量体であることが判明した。また、7
糖残基の繰り返しの結合位置は約0.6M溶出画分の1
H−NMRスペクトルを詳細に検討することにより、式
(XV)中のFのフコースの3位にα−(1→3)結合
でつながっていることが明らかとなった。さらに、上記
の方法に準じ、上記フコース硫酸含有多糖の低分子化物
中より、(XVI)で表される硫酸化糖の5量体、すな
わち下記一般式(XIV)においてn=5で表される硫
酸化糖を得た。
【化28】
(式中、RはH又はOSO3Hである)
【0145】以上のことから、ガゴメ昆布のような褐藻
類から得られた硫酸化フコース含有多糖をフコース硫酸
含有多糖−U分解酵素及び本発明の硫酸化フコガラクタ
ン分解酵素で処理することにより、硫酸化フコース含有
多糖−F分解酵素によって低分子化され、下記一般式で
表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化多糖
が得られることが確認できた。また、該硫酸化多糖の分
子量は、実施例1(3)の方法で測定したところ、抽出
時の処理条件が、pH6〜8、95℃ 約2時間の場合
は、平均分子量は約20万(分子量分布は、約1万〜約
100万)であった。また、抽出時の処理条件が、pH
6〜8、25℃ 約24時間の場合は、平均分子量は約
1,300万(分子量分布は、約10万〜約2,000
万)であった。
類から得られた硫酸化フコース含有多糖をフコース硫酸
含有多糖−U分解酵素及び本発明の硫酸化フコガラクタ
ン分解酵素で処理することにより、硫酸化フコース含有
多糖−F分解酵素によって低分子化され、下記一般式で
表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化多糖
が得られることが確認できた。また、該硫酸化多糖の分
子量は、実施例1(3)の方法で測定したところ、抽出
時の処理条件が、pH6〜8、95℃ 約2時間の場合
は、平均分子量は約20万(分子量分布は、約1万〜約
100万)であった。また、抽出時の処理条件が、pH
6〜8、25℃ 約24時間の場合は、平均分子量は約
1,300万(分子量分布は、約10万〜約2,000
万)であった。
【発明の効果】本発明により糖鎖工学用試薬あるいはH
GF産生誘導物質として有用な硫酸化フコガラクタン及
びその低分子化物が提供される。また、該硫酸化フコガ
ラクタンの構造解析や分解、硫酸化フコガラクタンの低
分子化物の再現性よい製造に用いることができる新規な
硫酸化フコガラクタン分解酵素が提供される。また、該
酵素の製造方法についても提供される。また、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素により硫酸化フコース含
有多糖の混合物から硫酸化フコガラクタンを選択的に除
去する方法が提供される。さらに、本発明の硫酸化フコ
ガラクタン分解酵素と他のフコース硫酸含有多糖分解酵
素を組み合せて使用することにより、新規の硫酸化糖が
提供される。
GF産生誘導物質として有用な硫酸化フコガラクタン及
びその低分子化物が提供される。また、該硫酸化フコガ
ラクタンの構造解析や分解、硫酸化フコガラクタンの低
分子化物の再現性よい製造に用いることができる新規な
硫酸化フコガラクタン分解酵素が提供される。また、該
酵素の製造方法についても提供される。また、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素により硫酸化フコース含
有多糖の混合物から硫酸化フコガラクタンを選択的に除
去する方法が提供される。さらに、本発明の硫酸化フコ
ガラクタン分解酵素と他のフコース硫酸含有多糖分解酵
素を組み合せて使用することにより、新規の硫酸化糖が
提供される。
【図1】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
分解酵素のpHと相対活性(%)の関係を表すグラフで
ある。
分解酵素のpHと相対活性(%)の関係を表すグラフで
ある。
【図2】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
分解酵素の温度と相対活性(%)の関係を表すグラフで
ある。
分解酵素の温度と相対活性(%)の関係を表すグラフで
ある。
【図3】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物(A)の 1H−NMRスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物(A)の 1H−NMRスペクトルを示す図で
ある。
【図4】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物(A)の 13C−NMRスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物(A)の 13C−NMRスペクトルを示す図で
ある。
【図5】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物(A)の質量分析(マス)スペクトルを示す
図である。
低分子化物(A)の質量分析(マス)スペクトルを示す
図である。
【図6】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物(B)の 1H−NMRスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物(B)の 1H−NMRスペクトルを示す図で
ある。
【図7】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物(B)の 13C−NMRスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物(B)の 13C−NMRスペクトルを示す図で
ある。
【図8】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物(B)の質量分析(マス)スペクトルを示す
図である。
低分子化物(B)の質量分析(マス)スペクトルを示す
図である。
【図9】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物(C)の 1H−NMRスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物(C)の 1H−NMRスペクトルを示す図で
ある。
【図10】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(C)の13C−NMRスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物(C)の13C−NMRスペクトルを示す図
である。
【図11】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(C)の質量分析(マス)スペクトルを示
す図である。
ン低分子化物(C)の質量分析(マス)スペクトルを示
す図である。
【図12】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(D)の1H−NMRスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物(D)の1H−NMRスペクトルを示す図
である。
【図13】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(D)の13C−NMRスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物(D)の13C−NMRスペクトルを示す図
である。
【図14】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(D)の質量分析(マス)スペクトルを示
す図である。
ン低分子化物(D)の質量分析(マス)スペクトルを示
す図である。
【図15】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(E)の1H−NMRスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物(E)の1H−NMRスペクトルを示す図
である。
【図16】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(E)の13C−NMRスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物(E)の13C−NMRスペクトルを示す図
である。
【図17】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(E)の質量分析(マス)スペクトルを示
す図である。
ン低分子化物(E)の質量分析(マス)スペクトルを示
す図である。
【図18】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(F)の1H−NMRスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物(F)の1H−NMRスペクトルを示す図
である。
【図19】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(F)の13C−DEPT−135°スペク
トルを示す図である。
ン低分子化物(F)の13C−DEPT−135°スペク
トルを示す図である。
【図20】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物(F)の質量分析(マス)スペクトルを示
す図である。
ン低分子化物(F)の質量分析(マス)スペクトルを示
す図である。
【図21】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ンの1H−NMRスペクトルを示す図である。
ンの1H−NMRスペクトルを示す図である。
【図22】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ンの13C−NMRスペクトルを示す図である。
ンの13C−NMRスペクトルを示す図である。
【図23】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ンの赤外吸収スペクトルを示す図である。
ンの赤外吸収スペクトルを示す図である。
【図24】 フコース硫酸含有多糖の低分子化物の0.
4M塩化ナトリウム溶出画分の質量分析(マス)スペク
トルを示す図である。
4M塩化ナトリウム溶出画分の質量分析(マス)スペク
トルを示す図である。
【図25】 フコース硫酸含有多糖の低分子化物の0.
4M塩化ナトリウム溶出画分の1H−NMRスペクトル
を示す図である。
4M塩化ナトリウム溶出画分の1H−NMRスペクトル
を示す図である。
【図26】 フコース硫酸含有多糖の低分子化物の0.
4M塩化ナトリウム溶出画分の13C−NMRスペクトル
を示す図である。
4M塩化ナトリウム溶出画分の13C−NMRスペクトル
を示す図である。
【図27】 フコース硫酸含有多糖の低分子化物の0.
6M塩化ナトリウム溶出画分の1H−NMRスペクトル
を示す図である。
6M塩化ナトリウム溶出画分の1H−NMRスペクトル
を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
微生物の受託番号 FERM BP−5402
(72)発明者 嶋中 一夫
大阪府高槻市寺谷町14番20号
(72)発明者 猪飼 勝重
滋賀県甲賀郡甲南町希望ケ丘本町9−
421−45
(72)発明者 加藤 郁之進
京都府宇治市南陵町1−1−150
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 9/14 - 9/46
BIOSIS(DIALOG)
CA(STN)
WPI(DIALOG)
JSTplus(JOIS)
Claims (3)
- 【請求項1】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とする硫酸化フコガラクタン分解酵素: (1)作用:構成糖としてガラクトースとフコースを含
有し、そのモル比が1:1〜6:1である硫酸化フコガ
ラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタン
を低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースある
いはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる、 (2)至適pH:本酵素の至適pHは約7〜9である、 (3)至適温度:本酵素の至適温度は約25〜45℃で
ある、 (4)フラボバクテリウムsp.(Flavobacterium s
p.)SA−0082(FERM BP−5402)由来
である。 - 【請求項2】 オリゴ糖が、下記一般式(I)〜(I
V)で表される化合物より選択されるオリゴ糖である請
求項1記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素。 【化1】 【化2】 【化3】 【化4】 (式中、RはH又はSO3Hである)。 - 【請求項3】 請求項1記載の硫酸化フコガラクタン分
解酵素生産能を有するフラボバクテリウム属細菌を培養
し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする
請求項1記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000377470A JP3497817B2 (ja) | 1999-02-23 | 2000-12-12 | 硫酸化フコガラクタン分解酵素 |
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4475299 | 1999-02-23 | ||
JP11-44752 | 1999-02-23 | ||
JP23280999 | 1999-08-19 | ||
JP11-232809 | 1999-08-19 | ||
JP35011299 | 1999-12-09 | ||
JP11-350112 | 1999-12-09 | ||
JP2000377470A JP3497817B2 (ja) | 1999-02-23 | 2000-12-12 | 硫酸化フコガラクタン分解酵素 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000601042A Division JP3523597B2 (ja) | 1999-02-23 | 2000-02-21 | 硫酸化フコガラクタン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001224369A JP2001224369A (ja) | 2001-08-21 |
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ID=27461575
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000377470A Expired - Fee Related JP3497817B2 (ja) | 1999-02-23 | 2000-12-12 | 硫酸化フコガラクタン分解酵素 |
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Country | Link |
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JP (1) | JP3497817B2 (ja) |
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JP2007282571A (ja) * | 2006-04-17 | 2007-11-01 | Kao Corp | コーヒー飲料 |
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2000
- 2000-12-12 JP JP2000377470A patent/JP3497817B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Publication date |
---|---|
JP2001224369A (ja) | 2001-08-21 |
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