TW588018B - Method for preparation of water-soluble and dispersed iron oxide nanoparticles and application thereof - Google Patents

Description

玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種水溶性及分散性之氧化鐵（Fe⑹奈 米粒子之製造方法及其作為磁共振造影㈣劑及磁能導引 之相關分子生物技術及臨床檢測、診斷、治療之應用應用。 【先前技術】 j 奈米粒子（nanoparticles) 一般而言係指粒徑範圍從 lnm至l〇〇nm之間之微細粒子，由於奈米粒子微小之尺寸， =面效應與體積效應使得奈米粒子本身具有許多特殊之性 質，例如··極高的表面積與表面能量、不連續的電子能階、 特殊光的吸收、單磁區的產生…等特性，因此，奈米粒子在 新材料之開發上具有極大的潛力。每個帶磁性之奈米粒子都 有一定的磁場定向，但是當粒子變得很小時，其磁場會變得 很不穩定，美國喬治亞理工學院的科學成功發現，精確控制 ，性奈米粒子之大小及磁性，則可利用此磁性奈米粒子攜帶 藥品注射入病人體内，再利用磁力將藥品輸送至身體各部 ^，藉此協助醫生準確地治療疾病，此外，磁性奈米粒子亦 可改善目4的磁共振掃描（magnetic resonance imaging) 技術增加影像之對比度以幫助醫生檢查腫瘤細胞、動脈硬 化斑、中樞神經系統等疾病。 大多數氧化鐵奈米粒子在生物醫學使用上都會包覆一 層f質增加水溶性與分散性，這些覆蓋物質為蛋白素、親水 性问分子、殿粉和聚合葡萄糖。在靜脈注射方面，包覆了親 生物貝後的氧化鐵奈米粒子整個大小約為30到150nm都 有，而且以聚集型為主。 目m已知製造Fe3〇4的技術是在有機相中產生均勻分佈 588018 奈米粒子，而在水溶液相中則多以聚集型為主。雖然可以藉 由加入高分子或界面活性劑在粒子表面形成保護層而在水 /合液中得到分散的奈米粒子，但通常粒子表面受到高分子 或界面活性劑分子保護不易與生物分子結合作進一步的應 用另外連、，，σ後之複合結構穩定性不佳易產生沉殿等現象， 進而影響其應用性。然而，絕大部分之生物分子皆為水溶性 物質，倘若要將奈米粒子制於生醫領域巾，製備具水溶性 且均勻分散性之奈米粒子之技術將是非常重要之環節。 此外，目前市售之顯影劑係以含有Gd3+為主，為一種重 金屬，對細胞具有毒性，不當的劑量使用或劑型設計容易影 響人體健康，且使用W顯影劑有時會出現「偽訊號」的現 象，或是因體内分泌影響而稀釋其濃度造成訊號消失等缺 點。因此’藉由氧化鐵奈米粒子的特殊超順磁特性製成更適 於人體醫療診斷之顯影劑，較之有更高之安全性為一值得開 發之技術。 發明内容】

有鑑於習知製造水溶性及分散性之氧化鐵奈米粒子 各種弊端及以及料磁共振顯影劑之_，本發明 僅能在水相製程中產生具高度水溶性特質的氧化鐵，並且 超順磁性之磁導能力及作為磁共振顯景“ Resonance Imaging，MRI)的顯影劑，且由於i單純之罗 介面及水相中之製程易於生物分子及藥劑聯結，而能進： 發展為功能性造影及標的型治療策略的平△技賞 本發明之目的之-係提供—種水溶性；分:性之以 奈未粒子之製造方法’包含下列步驟:(a)將含有…及卜 6 之溶液以特定濃度比例混合；（b)加入適量之有機酸作為附 著劑，（c)將溶液pH值控制至1〇以上使沉殿物產生；（d) 收集並清洗該沉澱物；（e)再加入過量之有機酸作為附著 劑，（f)加入適當有機溶劑及水以去除前述過量之有機酸； 及（g)收集純化後之Fe3〇4奈米粒子。 其中前述步驟（a)之Fe2+及Fe3+溶液之特定濃度混合比 例並無一定限制，較佳為1:2〜1··4，最佳係為1:2。 知其中前述步驟（b)及（e)之有機酸係可選自下列群組··醋 酸、半胱胺酸（cysteine )、丙胺酸（Alanine)、甘胺酸 (glycine)及油酸，其中係以甘胺酸效果最佳。步驟及（㊀） 1可使用相同或不相同有機酸，較佳係為使用相同之有機 酸。該有機酸係作為附著劑，步驟⑻係先利 ^反應物共存之技術製得㈣4奈米粒子，步驟⑷再力= 達到奈米粒子表面覆蓋完全之目的，順 陡及刀政性之FesO4奈米粒子。 -中則ι4步驟（c)係可藉由加入驗性物質調整邱值，例 如· NaOH、NHWH或其他類似物。 ：：引述步驟⑴之有機溶劑係可選自下列群組：丙 -。、甲醇、乙醇及正己烷，其中較係為丙綱。 饥其t前述製造方法較佳料2()〜机下進行，最佳係為 本&月之$目的係提供_種f⑽氧 ^ 其特徵為：具有水溶性 孰不木拉子 2 2⑽。 /讀及刀政性，且粒子大小為6.2nm ± 本發明之另一目的在姐 係包含由前述製造方法^之"；種磁共振造影顯影劑，主要 万去衣成之水溶性及分散性之Fe3〇4奈米 粒子及水。 本發明之方法係可克服現有技術之缺點，製造出分佈均 句、可溶於水但並未添加任何高分子及界面活性劑之Fe办 奈米粒子’並可應用於作為磁共振造影之顯影劑，未來將可 廣泛地應用於生醫檢測及醫療部分。 【實施方式】 本發明之具有高度水溶性及分散性之Fe3Q4奈米粒子之 製2造方法3流程圖，如第一圖所示，包含下列步驟：將含有

Fe2及Fe3+之溶液以特定濃度比例混合；加入適量之有機酸 作為附著劑；調整溶液pH值至大於1〇之鹼性環境以產生

Fe^奈米粒子沉澱物；收集並清洗該以也奈米粒子沉澱 物；再加入過量之有機酸作為附著劑；加入適當有機溶劑及 水以去除前述過量之有機酸；及收集純化後之以也奈米粒 子。 以下仏長:供貫施例加以說明本發明之水溶性及分散性 Fe^奈米粒子之製造方法及其做為磁共振造影顯影劑之應 用，俾使更清楚本發明之優點。 實施例1 :水溶性Fe3〇4之奈米粒子之製造 首先，將0· 2M之FeCl2及〇· 1M之FeCl3分別溶於2M 之HC1水溶液，以體積比1:4 (FeCl2 : FeCl3)之比例混合， 之後加入1克之甘胺酸（較佳為〇 · 5〜1 · 5克）作為附著劑， 接著慢慢滴入5M NaOH水溶液調整混合液中的pH值大於1〇 以提供一鹼性環境使溶液中Fe3〇4沉澱出來，之後再授拌1〇 分鐘後用二次水清洗數次，收集該黑色沉殿物（p>e3Q4);接 著，加入3克甘胺酸作為附著劑，攪拌10〜15分鐘後再震盪 鐘以使附著劑可完全覆蓋Fe3〇4奈米粒子表面，之後將 所知之Fe3〇4奈米粒子加入丙酮與水的混合液中以去除過量 ^有機酸附著劑，再以8000rmp之轉速離心2〇分鐘使以也 $米粒子沉澱，即可獲得本發明之水溶性及分散性之以必 示米粒子。第一圖係頰示將本實施例之以心奈米粒子溶於 —人水中之電子顯微影像圖，其粒子大小為± 2 2 nm ’由圖中顯示本發明之奈米粒子確實具有高度水溶 性及分散性之特點，且可穩定的長時間存在於水溶液中。 貫施例2:以pe3()4奈米粒子作為磁共振造影之顯影劑—注 射於肝臟 本實施例係使用前述實施例i製成之奈米粒子作 為磁共振造影之顯影劑，其製法僅需將以心奈米粒子溶於 一次水中，亚可視需要適量添加血清等類似體液之添加物即 可製得顯影劑。 第三（A)圖係顯示肝臟中未注射以心奈米粒子顯影劑前 之磁共振造影圖；第三⑻圖係顯示肝臟中注射G 86^的 FeW奈米粒子顯影劑後之磁共振造影圖，比較第三及第 三⑻圖中箭頭所指處可清楚看出，奈米粒子顯影劑得 確可進入肝臟中達到顯影效果。 貫施例3·以pe3G4奈米粒子料磁共振造影之顯影劑—注 射於腎臟 同前述實施例2所使用之_4奈米粒子之磁共振造影 顯影劑’I實施例係將之注射於腎臟中觀察其顯影之效果。 第四(A)圖係顯示腎臟中未注射^奈米粒子顯影劑 588018 前之磁共振造影圖·，第四（B)圖係顯示肝臟中注射〇86gM 的FeA奈米粒子顯影劑後之磁共振造影圖，比較第四 及第四⑻圖中前頭所指處可清楚看出，奈米粒子顯影 劑得確可進入腎臟中達到顯影效果。 實施例4:以^〇4奈米粒子作為磁共振造影之顯影劑 之安全性測試 以大鼠為測試對象’將以分別注射5mg/Kg量的^必 奈米粒子後，分別於〇、2、4、6週後計算其存活率，結果 如第五圖所示’經注射Fe304奈米粒子之大氣皆無死亡，存 活率為1嶋，因此以Fe3〇4奈米粒子作為顯影劑係符合安全 之考量。 •综上所述’本發明之技術相較於習知技術具有以下優 黑占· 1. ^發明之技術不需藉由親水性高分子、界面活性劑 分子、蛋白素、澱粉和聚合葡萄糖等保護下即可妒 備出高水溶性、分散均勻之F e3 04奈米粒子，對於後 續之表面修飾與連結提供更大之設計空間。 2. 本？明之Fe3〇4奈米粒子可與核酸及蛋白質等生物分 子藉由共價鍵或非共價鍵形成各種結合方式，以應 用於生化醫療方面。 "" 3. 使用本發明之Fe3〇n好製成之磁隸造影顯影 劑相較於目前市售顯影劑材料，本發明之Fe3〇4夺米 粒子的大小非常小（6.2nm ±2.2nm)，並且由於太 米化而呈現之超順磁特性，其中弛緩速率n值遠低 於市售SIP 0顯影劑系統（亦為氧化鐵奈米粒子之顯 影劑)’表-是將本發明之Fe304奈米粒子，市售SIP0 10 588018 與含Gd3+之顯影劑的弛緩速率T1與T2比較。 表一 本發明之 Fe3〇4 奈 米粒子顯 影劑 市售SIPO 顯影劑 市售Gd3+ 之顯影劑 T1 34ms 176ms 74.4ms T2 23ms 0.77ms *以上皆以相同濃度4.61 mM(金屬離子濃度)之顯影劑情況 下做比較。 1. 表一所測得的T1值，本發明之Fe304奈米粒子比

SPIO與含Gd3+之顯影劑要低，但在T1顯影效果比 較，Gd3+是優於氧化鐵（在離子濃度為1E-1〜1E-2 M)，不過本發明之Fe304奈米粒子則優於SPIO，無 論是以血清（serum)或是水當作溶劑的條件下。 2. 表一所測得的T2值，本發明之Fe304奈米粒子並未 比SPIO低，但在T2的顯影效果比較，本發明之Fe304 奈米粒子在離子濃度為1E-1〜IE-2 Μ條件時與 SPIO的比較並無差別。 3. 本發明之Fe304奈米粒子顯影劑相較於市售SIP0顯

影劑系統（亦為氧化鐵奈米粒子之顯影劑）並無澱 粉和聚合葡萄糖等保護之下就能溶於水溶液並呈分 散型態，同時T1顯影效果比市售SIP0顯影劑好且 T2顯影也與市售SIP0顯影劑無太大差異。 4. 本發明之Fe304奈米粒子顯影劑相較於市售Gd3+之 顯影無高毒性問題、低免疫刺激性且不會在生物體 内產生沉殿。此外，相較於稀土族的Gd3+製程價格 更低並且不需要螯合劑保護。 雖然本發明之較佳實施例以揭露於上，然其並非用以限 11 588018 定本發明，任何熟習此項技藝者，在不脫離本發明之精神和 範圍内，皆可作各種變化，因此本發明之保護範圍係由後述 之申請專利範圍所界定。

12 588018 【圖式之簡單說明】 第〆圖係顯示本發明之Fe3〇4奈米粒子之製造方法流程 圖。 第二圖係顯示本發明製得之Fe3〇4奈米粒子溶於水中之 電子顯微鏡照片。 第三（A)圖係顯示未注射FhO4奈米粒子顯影劑前之肝臟 磁共振造影圖。 第三（B)圖係顯示已注射FesO4奈米粒子顯影劑後之肝臟 磁共振造影圖。 第四（A)圖係顯示未注射 磁共振造影圖。 示未注射F e3 04奈米粒子顯影劑前之腎臟 第四（B)圖係顯示已注射 磁共振造影圖。 第五圖係_示注射 左射FesO4奈米粒子顯影劑後之腎臟 FesO4奈米粒子顯影劑後之大鼠存活 13

Claims (1)

1. 拾、、辛請專利範圍： —種水溶性及分散性之Fe3〇4奈米粒子之製造方法，包含下列 步驟： (a) 將含有Fe2+及Fe3+之溶液以1:2〜1:4濃度比例混合； (b) 加入適量之有機酸作為附著劑，該有機酸係選自下列群 組：醋酸、半胱胺酸（cysteine)、丙胺酸（Alanine)、甘 胺酸（glycine)及油酸； (c) 將溶液pH值控制至10以上使沉澱物產生； (d) 收集並清洗該沉澱物； (e) 再加入過量之有機酸作為附著劑，該有機酸係選自下列 群組：醋酸、半胱胺酸（cysteine)、丙胺酸（Alanine)、 甘胺酸（glycine)及油酸； (f) 加入適當有機溶劑及水以去除前述過量之有機酸；及 (g) 收集純化後之Fe3〇4奈米粒子。 2·如申請專利範圍第1項所述之水溶性及分散性之Fe3〇4奈米粒 子之製造方法，其中前述Fe2+及Fe3+溶液之濃度混合比例係為 1:2。 Q •如申請專利範圍第1項所述之水溶性及分散性之Fe3〇4奈米粒 子之製造方法，其中前述有機酸係為甘胺酸。 4·如申請專利範圍第1項所述之水溶性及分散性之Fe3〇4奈米粒 子之製造方法’其中前述步驟（b)及（e)係可使用相同或不相同 有機酸。 5·如申請專利範圍第4項所述之水溶性及分散性之Fe3〇4奈米粒 6子之製造方法，其中前述步驟（b)及（e)係使用相同之有機酸。 •如申請專利範圍第5項所述之水溶性及分散性之Fe3〇4奈米粒 7子之製造方法，其中前述有機酸係為甘胺酸。 •如申睛專利範圍第1項所述之水溶性及分散性之Fe3〇4奈米粒 子之製造方法，農中鈐、+、止 8.如申請專利範圍第Μ二驟⑹，沉澱物係為F· 子之製造方法，其中前之水洛性及分散性之Μ奈米粒 組··丙酮、甲醇、乙醇及^驟⑴之有機溶劑係可選自下列群 及正己烷。 • 申凊專利範圍第§頊戶斤；十、 子之製造方法，Ιφι、 水溶性及分散性之Fe^奈米粒 ίο u 其雨述有機溶劑係為丙嗣。 粒子之ΞίΠ:項所述之水溶性及分散性之㈣4奈米 裟以方法，其係於20〜40。(：下進行。 I =申=專利範圍第10項所述之水溶性及分散性之㈣ 杻子之製造方法，其係於25tT進行。 12.如中請專利範圍第1項所述之水溶性及分散性之⑽夺米 粒子之製造方法，其中前述Fe3〇4奈米粒子之大小為6 2四+ 2· 2 nm。 ~ •種磁共振造影顯影劑，主要係包含由申請專利範圍第1 一 12 項中任一項所述之方法所製成之水溶性及分散性之Fe3〇4奈米 粒子及水。 14.如申請專利範圍第13項所述之磁共振造影顯影劑，其中前述 之Fe3〇4奈米粒子之大小為6· 2nm ± 2. 2 nm。 15